DNA en medicijnen (1)

68
DNA EN MEDICIJNEN Hoe kun je met behulp van DNA een medicijn maken? Chiara Glen Cosmicus College, 5HA

Transcript of DNA en medicijnen (1)

Page 1: DNA en medicijnen (1)

DNA en medicijnen

Hoe kun je met behulp van DNA een medicijn maken?

Chiara GlenCosmicus College, 5HA

Page 2: DNA en medicijnen (1)

1

Page 3: DNA en medicijnen (1)

2

Inhoud1.

Inleiding 3

2.

Hoe zit DNA in elkaar? 5

3.

Welke mogelijkheden zijn er binnen de wetenschap om met behulp van DNA een medicijn te maken?

8

3.1 DNA vaccinaties3.2 Moderne biotechnologie 3.3 Gentherapie 3.4 Epigenetica 3.5 Optogenetica

810121415

4.

Practica 16

4.1 Elektroforese met appels4.2 DNA isoleren

1630

5.

Conclusie 32

6.

Nawoord 35

7.

Geraadpleegde literatuur 36

Bijlage 38Tirumalai Kamala’s answer to: What is a DNA vaccine? 38

Page 4: DNA en medicijnen (1)

3

Page 5: DNA en medicijnen (1)

4

1. Inleiding

Keuze van het onderwerpOmdat ik al heel lang geïnteresseerd ben in de medische wereld, en vooral DNA, heb ik voor dit onderwerp gekozen.

Toen ik keek naar een aflevering van de serie ‘Brave new World’ met Stephen Hawkings. Dacht ik: “laat ik me hier in verdiepen.” De aflevering ging over DNA en hoe menselijk DNA met elkaar vergeleken kon worden, om uit te vinden waarom twee hele verschillende personen heel lang en gezond konden leven; en hoe ze daarmee medicijnen konden maken.

Werkwijze Ik besloot om uit te vinden welke technieken worden gebruikt om met behulp van DNA medicijnen te maken en hoe dat dan werkte. Hierbij gebruikte ik de kennis die ik al had opgedaan op school en bij mijn stage op de afdeling Pathologie in het Erasmus MC. Maar om me verder te verdiepen moest ik bronnenonderzoek doen. Ik begon bij mijn favoriete website: Quora, een forum waar je elk onderwerp kunt vinden dat je zoekt. Ok volg daar alle onderwerpen die ik leuk en interessant vindt, waaronder de onderwerpen die bij dit profielwerkstuk horen. Je kunt op dit forum vragen stellen, beantwoorden en lezen. Er zitten ook wetenschappers op dit forum, dus ik dacht, laat ik hier mijn vragen stelleen. Maar voordat ik dat deed keek ik of er andere mensen waren die mijn vragen of soortgelijke vragen al hadden gesteld. Op die manier vond ik een aantal Engelse sites die ik heb gebruikt voor mijn profielwerkstuk. Zelf heb ik ook een vraag gesteld waar ik uitgebreid antwoord op heb gekregen, wat ik in mijn profielwerkstuk heb verwerkt.

Ik wilde ook weten hoe die technieken dan werkte en het leek mij wijs om daarbij een practicum te doen, natuurlijk was het ook geweldig om uit te voeren. De twee practica die ik gedaan heb, hebben mij veel geleerd over een bepaalde techniek, namelijk de ‘elektroforese’.

Onderzoeksvraag De hoofdvraag die ik mijzelf stelde bij dit werkstuk was: “Hoe kun je met behulp van DNA medicijnen maken?”Om deze vraag te beantwoorden stelde ik de volgende drie deelvragen:

1. Hoe zit het DNA in elkaar?2. Welke mogelijkheden hebben we binnen de wetenschap om met behulp van DNA

medicijnen te maken? 3. Hoe kunnen we DNA vergelijken en zo zien welke genen de eigenschappen hebben die

we willen in een medicijn?

Page 6: DNA en medicijnen (1)

5

Opbouw van het verslagOm meer te weten te komen over DNA, besloot ik uit te zoeken hoe het in elkaar zat en schreef ik alles wat ik al wist op. Omdat DNA een groot onderwerp is en mijn werkstuk gaat over hoe je er medicijnen mee kan maken, heb ik alleen de belangrijkste dingen in mijn profielwerkstuk opgenomen.

De tweede vraag gaat over de technieken en hoe die technieken gebruik maken van DNA om er medicijnen van te maken. Deze vraag is noodzakelijk om de hoofdvraag te kunnen beantwoorden.

Als laatste heb ik met behulp van het practicum ‘elektroforese’ antwoord gegeven op de derde deelvraag. Deze vraag was meer een toevoeging aan de theorie dat was uitgelegd in deelvraag 2.

Hier heb ik dus rekening mee gehouden bij de hoofdstukindeling.

Met dit profielwerkstuk hoop ik jullie te kunnen informeren over hoe je met behulp van DNA medicijnen maakt.

Page 7: DNA en medicijnen (1)

6

2. Hoe zit DNA in elkaar?

DNA bestaat uit 2 strengen, een coderende streng (deze maakt de code die door het RNA wordt vertaald naar de structuren van de verschillende eiwitten) die wordt ook wel ‘sense’ genoemd, en een niet coderende streng, ook wel ‘antisense’.

Het DNA bestaat uit heel veel genen, die weer bestaan uit een aantal nucleotiden, en die nucleotiden bestaan weer uit 3 dingen:

- Een suikergroep- Een fosfaatgroep- Een stikstofbasen

Er zijn vier verschillende stikstofbasen, Adenine, Thymine (wordt door het RNA vertaald naar Uracil), Guanine en Cytosine.Adenine en Thymine vormen een binding en Guanine en Cytosine vormen een binding. De binding tussen de basenparen zijn waterstofbruggen gevormd tussen en NH-groep en een OH-groep. Adenine en Thymine hebben 2 waterstofbruggen die ze bijeenhouden, Guanine en Cytosine hebben er 3.

Page 8: DNA en medicijnen (1)

7

In totaal kan het DNA 20 aminozuren maken en het heeft een start- en stopcodon.De startcodon geeft aan wanneer de ribosoom moet beginnen met het aflezen van de mRNA. De stopcodon geeft aan wanneer de ribosomen daarmee moeten stoppen.

Het aantal en de volgorde van de aminozurenreeks is bepalend voor wat voor eiwit/enzym er gevormd wordt. Dat kun je zien nadat het RNA door de ribosomen is afgelezen.

De structuur van het DNA (volgorde van de verschillende eiwitten) geeft aan hoe de persoon eruit gaat zien, of hij/zij ergens allergisch voor is, erfelijke ziektes heeft, ergens aanleg voor heeft, etc.

Niet alleen het DNA speelt een rol bij de persoon die je wordt en hoe je eruit gaat zien, maar ook het milieu speelt hierbij een rol. Dat heet het fenotype.Milieu houd niet alleen in de buurt waarin je opgroeit als kind, maar ook in de baarmoeder begint dit al. Als je moeder rookt of drinkt tijdens de zwangerschap heeft dit ook gevolgen voor hoe je eruit komt te zien, en het kan ook je gedrag beïnvloeden. Net als stress en eetgewoontes.

Het DNA zit in de chromosomen, en elke cel heeft 46 chromosomen, op de geslachtscellen en de rode bloedcellen na. Rode bloedcellen hebben helemaal geen chromosomen en ook geen DNA, geslachtscellen hebben er 23. De mens heeft ± 3 ∙109 bp (basenparen) verdeeld over de chromosomen. Ook hebben DNA eiwitten eromheen zitten om het compact te houden.Elke cel bevat 2 meter aan DNA, en we hebben 75 triljoen cellen in ons lichaam. Als je dus al het DNA achter elkaar legt, uitgespreid, dan krijg je een afstand die gelijk is aan 500x de afstand van de aarde tot de zon en terug. De reden dat er 2 meter DNA in een cel kan zitten is omdat het DNA heel erg gedraaid is en daarnaast nog gespiraliseerd. Je kan dat uitproberen met een

Page 9: DNA en medicijnen (1)

8

elastiekje, als je het blijft draaien zie je dat het elastiekje steeds kleiner wordt. Dat is dus ook gebeurd met het DNA.

DNA kan ook muteren. Je hebt verschillende mutaties en mutaties kunnen verschillende dingen veroorzaken, zoals het ontstaan van tumorcellen. Een voorbeeld van een mutatie is de puntmutatie. Hierbij veranderd 1 base, waardoor zijn basepaar ook veranderd, maar hierdoor word een heel ander eiwit gemaakt. Omdat er een ander eiwit wordt gemaakt gaat de cel zich opeens anders gedragen, het kan niet meer goed doen wat hij hoort te doen, dit merkt het lichaam en die probeert dat te veranderen, maar dit is heel moeilijk en werkt niet altijd. Hieronder zie je andere types schade die het DNA kan oplopen, samen met wat voor soort reparatie ervoor nodig is en de bijzonderheden van de reparatie.

Page 10: DNA en medicijnen (1)

9

3. Welke mogelijkheden zijn er binnen de wetenschap om met behulp van DNA medicijnen te maken? Deze vraag heb ik beantwoord met behulp van Quora en de serie Brave New World, gepresenteerd door Stephen Hawking.

3.1 DNA vaccinatiesLaat ik beginnen met Quora. Deze vraag had ik daar namelijk geplaatst (in het Engels want het is een internationaal Forum met letterlijk elk onderwerp wat je maar kan bedenken) en ik kreeg er antwoord op.De vrouw die mij antwoordde heet Tirumalai Kamala, en is een Immunologist. Ze heeft een PhD. in Mycobacteriologie. Zij schreef mij het volgende:

DNA vaccinaties is er een. Voor meer details zie bijlage: Tirumalai Kamala's answer to What is a DNA vaccine?

Een goedgekeurde gentherapie is die voor Groeihormoon Releasing-Hormoon in varkens, goedgekeurd voor gebruik in Australië in 2008

Waarbij ze me een link gaf naar een uitleg die ze had gegeven op een andere vraag, dit kan je vinden in de bijlagen. Dit is een samenvatting van waar haar artikel over gaat:

Een DNA vaccinatie is een bacteriële plasmide met een of meer genen van een parasiet, bacterie, virus of tumorcel. Deze genen worden gekoppeld aan een promotor, die wordt verkregen van een zoogdier.

Nadat het vaccin in het lichaam van de mens is geplaatst worden de genen vertaald door het RNA naar eiwitten. Die eiwitten worden aangevallen door het immuunsysteem die er antistoffen tegen maakt.

We zijn al vanaf 1950 bezig om met behulp van DNA medicijnen te maken.

Bij het maken van vaccins moet je veel keuzes maken en daarbij moet je de wettelijk bepaalde richtlijnen volgen. De keuzes die je moet maken zijn belangrijk voor de uiteindelijke effectiviteit van het vaccin. Een aantal van deze keuzes zijn: “Wat voor antigenen moeten worden gebruikt? Hoe moet het worden afgeleverd? Welke dosis moeten we geven?”

Hoe DNA vaccinaties worden afgeleverd is veranderd sinds 1950. In het begin werden ze direct in de spieren gespoten. Dit zorgde echter voor een minder goede opname en de werking was minder goed. Toen kwam er een uitvinding genaamd het gen pistool. Dit pistool schoot DNA in de huid met behulp van drukgas, en het DNA had een laag met microdeeltjes goud als bescherming. Hierdoor verbeterde de opname, maar die verbetering was gering. Daarna werd de elektroporatie uitgevonden, waarbij eenvoudige elektroden elektrische pulsen genereren

Page 11: DNA en medicijnen (1)

10

over het celmembraan, dit vergrootte tijdelijk de poriën in het celmembraan, wat de opname van DNA bevorderde. Een andere verbetering voor de opname van het DNA was een variant van het gen pistool, het deeltje-bemiddelde epidermale levering (PMED). Hier werd het DNA in de huid afgeleverd, in de keratinocyten. Verder is er nog de DNA tatoeage, dit is een nieuwere lever methode. Het zorgt voor een sterke immuunrespons doordat de tatoeage naalden de huid beschadigen.

DNA vaccins hebben voordelen, maar ook nadelen. De voordelen zijn dat het makkelijker, goedkoper en veiliger is omdat er wordt gekozen voor gewone microbiële- of tumorgenen die waarschijnlijk sterke en specifieke immuun responsen veroorzaken en die zich in de plasmiden klonen. Verder is het natuurlijker omdat onze eigen lichamelijke cellen eiwitten maken die nodig zijn voor bescherming tegen de ziektes waarvoor je wordt ingeënt, en dit doen ze met behulp van de DNA vaccins. Ook is het makkelijker om deze vaccins te veranderen als het nodig is. Griep kan bijvoorbeeld snel muteren, waardoor je ook de samenstelling van het vaccin moet veranderen, dit kan gemakkelijk met de DNA vaccins. De laatste voordeel van DNA vaccins is dat ze praktischer en realistischer zijn. Plasmide DNA kan bij kamertemperatuur worden bewaard wat enorm veel kosten bespaard bij opslag en transport omdat ze geen koelkasten en gekoelde wagens hoeven te gebruiken.

De nadelen zijn dat plasmide DNA zich kan integreren in het DNA van de cel. Dit heeft op zijn minst drie negatieve gevolgen, wat afhankelijk is van de plaats waar de DNA plasmide wordt ingebracht. Het kan een oncogene aanzetten, het kan een tumor supressor gen uitzetten of het kan de chromosomale instabiliteit op gang brengen. Verder is het niet bruikbaar voor polysacharide vaccins, dus er zijn geen DNA vaccins voor ziektes zoals pneumokokken en meningokokken, waar immuun responsen noodzakelijk zijn om deze ziektes te voorkomen. De laatste nadeel van DNA vaccins is dat er een risico is van auto-immuniteit. Dit kan gebeuren als ons eigen DNA gemeenschappelijke elementen heeft met het DNA van het vaccin, het is gelukkig nog niet gezien bij de mens.

Tot nu toe werken DNA vaccinaties vooral goed bij muizen, maar hebben ze niet het gewenste resultaat bij de mens. Desondanks zijn er vier vaccinaties die wettelijk zijn toegestaan voor gebruik op mensen, dit zijn:

1. West-Nijl virus, paarden, USA2. Besmettelijke hematopoietische necrose virus, zalm, Canada3. Melanoma, honden, USA4. Groeihormoon Releasing-Hormoon, varkens, Australië

Om het gewenste resultaat van een DNA vaccin bij de mens te krijgen is nog een lange weg te gaan maar er is zeker progressie.

Page 12: DNA en medicijnen (1)

11

Verder weet ik van de serie Brave New World, gepresenteerd door Stephen Hawking, dat er een aantal andere technieken zijn. Deze zijn bijvoorbeeld:

- Moderne Biotechnologie- Gentherapie- Epigenetica - Optogenetica

Die onderwerpen ga ik ook behandelen in dit deel.

3.2 Moderne biotechnologieModerne biotechnologie is een techniek die heel recent is en door de meeste mensen nog niet helemaal wordt goedgekeurd. Het is ook een techniek die op meerdere vlakke kan worden gebruikt, namelijk: geneeskunde, landbouw, forensisch onderzoek, bioremediatie, bio-control en bio-veiligheid.

Er wordt voor deze technologie gebruik gemaakt van recombinant-DNA techniek. Hierbij wordt een gen overgeplaatst in een andere cel. Dat doen ze omdat het gen een eiwit aanmaakt die zorgt voor een bepaalde eigenschap. Om dit te kunnen doen moet je DNA knippen en plakken. Je knipt DNA met behulp van restrictie-enzymen en DNA-ligase plakt het deel wat je hebt geknipt in het DNA waar je het in wilt hebben. Het wordt dan in een bacterie-, gist- of hamstercel geplaatst en dat wordt dan op de juiste plek in het organisme (plant, dier of mens)

gebracht.

DNA-ligase werkt als het volgt: er is een breuk in beide strengen van het DNA (hier betekend dat dus de plekken waar het DNA wordt samengevoegd), de DNA-ligase maakt daar een covalente fosfodi-esterbinding tussen te breuk. Er zijn 2 soorten breuken, een schuine breuk en een rechte breuk. Een rechte breuk heeft een hogere concentratie van het enzym nodig omdat het moeilijker is te repareren. Daarnaast zijn de reactieomstandigheden heel anders.

Bij biotechnologie wordt het DNA van meerdere soorten gecombineerd. Zo kun je bij planten ervoor zorgen dat ze resistent worden tegen bepaalde ziektes die veel voorkomen bij planten. Er wordt hier gekeken naar het DNA van een plant die resistent is tegen de bepaalde ziekte, en er wordt onderzocht welke genen

Page 13: DNA en medicijnen (1)

12

hiervoor verantwoordelijk zijn. Die genen worden geknipt uit het DNA en in een vector geplaatst, die vector wordt in een plantencel geplaatst van de plant die je resistent wilt maken. En uit eindelijk krijg je de resistente plant die je wilde. Op deze manier hoeven er minder gifstoffen te worden gebruikt en wordt het eten automatisch iets gezonder.

Bij forensisch onderzoek wordt DNA-profiling gebruikt. Op deze manier kunnen ze DNA van een plaats delict onderzoeken om zo makkelijker de dader te kunnen vinden.

Bij bioremediatie wordt gebruikt gemaakt van organismen, of delen van een organisme, om vervuiling in de bodem, het water of de lucht weg te werken.

Bij bio-control en bio-veiligheid wordt met één organisme de niveaus van andere bestuurd. In Nieuw-Zeeland wordt dit gebruikt om uitheemse planten en insecten te besturen. Daarnaast willen ze het ook gaan gebruiken om het aantal buidelratten te controleren ter voorkoming van een plaag.

Bij medicijnen wordt genetische modificatie, gentherapie en xenotransplantatie gebruikt. Genetische modificatie of transgenese wordt gebruikt bij het produceren van therapeutische menselijke eiwitten in cellen of hele organismen, dat hangt af van de grootte en complexheid van het eiwit. Insuline is zo bijvoorbeeld gemaakt in een genetisch gemanipuleerde bacterie omdat het eiwit klein is. Terwijl de complexere eiwitten zoals hormonen of antilichamen worden gemaakt in cellen van zoogdieren.

Een ander voorbeeld is een vaccin of antibiotica, voor die uitleg: zie het deel over vaccins.

Gentherapie wordt gebruikt om technologieën te ontwikkelen tegen genetische ziekten, voor verdere uitleg: zie het deel gentherapie.

Xenotransplantatie is de transplantatie van cellen, weefsels of organen van de ene soort in de andere. Zo kun je van een virus-vrije populatie varkens medicijnen maken om mensen met type-1 diabetes te kunnen behandelen. Dit wordt al gedaan in Nieuw-Zeeland.

Page 14: DNA en medicijnen (1)

13

3.3 GentherapieGentherapie is een manier om een genetisch probleem op te lossen bij de bron. Dit wordt gedaan door een gecorrigeerde kopie van een defect gen toe te voegen. Gentherapie maakt vooral gebruikt van een vector, meestal een virus om het aangepaste gen in de cellen te brengen waar het nodig is. Eenmaal binnen wordt het RNA van de gen gelezen en omgezet in eiwitmoleculen, die daarna hun werk doen in de cellen.

Maar niet alle genetische aandoeningen kunnen worden behandeld met behulp van gentherapie. Om te kunnen besluiten welke aandoeningen behandeld kunnen worden met gentherapie, worden de volgende vragen gesteld:

Kan de toestand worden gecorrigeerd door één of enkele functionele genen toe te voegen?Voordat je over gentherapie gaat nadenken moet het antwoord op deze vraag “ja” zijn. Zo zijn genetische aandoeningen met een mutatie in enkele genen goede kandidaten voor gentherapie. Maar aandoeningen waar veel genen en omgevingsfactoren een rol spelen zijn juist hele slechte kandidaten voor gentherapie.

Weet je welke genen erbij zijn betrokken? Om de genetische aandoening te behandelen moet je dit weten, en je moet een kopie hebben van het DNA met het defecte gen.

Begrijp je de biologie van de aandoening? Om de beste aanpak te bedenken moet je zo veel mogelijk kunnen begrijpen van wat er gebeurd in de cellen. Je moet weten welke factoren een rol spelen in de aandoening en welke rol eiwitten spelen die worden vertaald door de defecte genen. Daarnaast moet je begrijpen welke invloed de mutaties in het gen hebben op de functie van het eiwit.

Zal de toevoeging van een verbeterde kopie van het gen het probleem in het aangetaste weefsel oplossen? Of zal het wegwerken van het defecte gen een betere oplossing zijn?Deze vraag is een toevoeging aan de vorige vraag en ook heel belangrijk om te weten of gentherapie de juiste oplossing is. Er zijn namelijk een paar mogelijkheden. Soms is het gen defect en wordt er geen functioneel eiwit van gemaakt. Wanneer dit het geval is, kun je gentherapie gebruiken om de persoon beter de maken. Maar er zijn ook gevallen waar defecte genen eiwitten maken die niet doen wat ze horen te doen, of de defecte genen verhinderen dat andere eiwitten hun werk doen. In dit geval is gentherapie geen optie en moet je het defecte gen kwijt zien te raken.

Kun je het gecorrigeerde gen in de cellen van het aangetaste weefsel brengen? Dit is de belangrijkste vraag als je antwoord hebt kunnen geven op de vorige vragen. Want je kan gentherapie wel als mogelijkheid hebben, maar hoe kun je het toepassen als het gecorrigeerde gen niet in de cel van het aangetaste weefsel kan brengen. Om antwoord te kunnen geven op deze vraag moet worden gekeken naar de bereikbaarheid van het weefsel en het moleculaire signatuur.

Page 15: DNA en medicijnen (1)

14

Er zijn ook andere mogelijkheden binnen de gentherapie om iemand te kunnen genezen. Dit doen ze met behulp van het repareren van genen, gen silencing en met behulp van genetisch gemodificeerde cellen die immuun zijn en specifieke moleculen aanvallen.

Het repareren van genen wordt gedaan met behulp van een techniek genaamd SMaRT™, wat “Spliceosome-Mediated RNA Trans-splicing” heet. Deze techniek valt het mRNA aan wat gekopieerd is van het gemuteerde gen en repareert het. Deze techniek repareert alleen het defecte gedeelte waardoor er geen poging gewaagd hoeft te worden om het hele gen te vervangen.Deze techniek maakt gebruik van enzymen de speciaal zijn gemaakt om specifieke DNA sequenties aan te vallen. De enzymen knippen het gemuteerde gen en vervangen het met een functionele kopie.

Genetisch gemodificeerde cellen die immuun zijn en specifieke moleculen aanvallen. Om dit voor elkaar te krijgen maken wetenschappers gebruik van de natuurlijke functie van het immuunsysteem. Onderzoekers hebben uitgevonden hoe je iemands immuun cellen kan isoleren en genetisch kan modificeren met behulp van gentherapie. Je kan er zo voor zorgen dat ze een specifiek antigen kunnen herkennen zoals het eiwit aan het oppervlakte van een kankercel. Als deze gemodificeerde cel dan teruggeplaatst wordt in het lichaam zal het die specifieke cellen vinden en vernietigen. Verder, om deze techniek uit te breiden, kunnen wetenschappers de witte bloedcellen zo aanpassen dat ze een product maken, zoals een medicijn, een gifstof of een signaal. Zo kunnen ze, als ze teruggeplaatst worden in het lichaam, naast het vechten en vernietigen van de specifieke cellen, ook een product loslaten die tegen de ziekte vecht.

Voor gen silencing: zie mijn uitleg bij epigenetica.

Page 16: DNA en medicijnen (1)

15

3.4 Epigenetica

Epigenetica is het deel in de cellen die bepaalde genen uitschakelen. Elke cel heeft het zelfde DNA, maar toch hebben alle cellen een andere functie. Epigenetica zorgt dus dat elke cel hun eigen functies kunnen hebben. Wetenschappers hebben ontdekt hoe dat werkt en kunnen dat nu kunstmatig. Eén manier om dat voor elkaar te krijgen word ook wel epigenetische silencing genoemd. Deze techniek verklaard ook, gedeeltelijk, waarom eeneiige tweelingen niet dezelfde fenotypen hebben.

Binnen de cellen zijn er drie systemen die met elkaar communiceren om genen uit te kunnen schakelen, dit zijn DNA methylering, histon modificaties en RNA-geassocieerde silencing. DNA methylering is een chemisch proces die een methyl groep toevoegt aan het DNA. Het is zeer specifiek en gebeurd altijd in een gebied waar een cytosine nucleotide naast een guanine nucleotide ligt en die gelinkt is met een fosfaat. Dit wordt een CpG gebied genoemd. Deze gebieden kunnen alleen worden gemethyleerd met behulp van één van de drie enzymen genaamd DNA methyltransferases (DNMTs). Door dit te doen veranderd de structuur van het DNA waardoor de genen anders communiceren met de nucleus van de cel, wat nodig is voor het maken van eiwitten. Dit wordt ook door sommige cellen gebruikt om te besluiten welke genen worden overgenomen van de moeder en welke genen worden overgenomen van de vader, dit wordt inprenting genoemd.

Een histon is een eiwit en het belangrijkste deel van chromatine, en hoort zo tot het DNA en de eiwitten die de chromosomen maken. Histonen zijn de zogenaamde “spoel” waar het DNA omheen draait om het zijn sterke structuur te geven. Op het moment dat histonen worden gemodificeerd nadat ze zijn veranderd in eiwitten, kunnen ze beïnvloeden hoe chromatine wordt aangebracht. En dat bepaald weer welk deel van het DNA in de chromosomen wordt vertaald. Als chromatine niet compact is, is het actief en betekend dat dus dat het DNA waaraan het zit wordt vertaald. Is het echter heel compact, dan krijgt het ook een andere naam, namelijk heterochromatine, dan is het inactief en word het DNA waar het aan zit niet vertaald. Histonen kunnen op twee manieren worden gemodificeerd, namelijk met behulp van acetylering en met behulp van methylering. Deze chemische reacties voegen een acetyl of methyl groep toe aan het aminozuur lysine die in de histon ligt. Bij actieve chromatine is de chemische reactie acetylering, terwijl bij inactieve chromatine het tegenovergestelde wordt gedaan met behulp van de-acetylering. Methylering kan bij allebei de soorten chromatine worden gebruikt.

Genen kunnen ook uitgezet worden door RNA. Dit kan alleen als het RNA in de vorm is van antisense transcripten, niet-coderende RNA’s or RNA interferentie. RNA kan genexpressie beïnvloeden door ervoor te zorgen dat heterochromatine wordt gevormd, of door histon modificaties en DNA methylering teweeg te brengen.

Page 17: DNA en medicijnen (1)

16

3.5 OptogeneticaDe hersenen zijn een zeer dicht bekabelde computer, gemaakt van honderden miljarden individuele cellen genaamd neuronen. Neuronen communiceren met elkaar door middel van chemische en elektrische signalen. Als een neuron wordt geactiveerd door een chemische boodschapper, produceert hij een elektrische puls. Hierdoor word de chemische reactie naar andere neuronen getransporteerd die ermee verbonden zijn.

Er zijn duizenden, zo niet tienduizenden verschillende soorten neuronen. Elke verschillende soort heeft een unieke vorm en moleculaire samenstelling en een uniek patroon met connecties in de hersenen. Als we kunnen uitvinden wat de rol is van elke celtype in de hersenen, dan kunnen we begrijpen hoe ze samenwerken bij het creëren van gedachten, emoties en gedrag. En hoe fouten in specifieke celtypes kunnen lijden tot ernstige aandoeningen in de hersenen zoals schizofrenie, Parkinson en depressie.

Nu is MIT bezig om apparaten te ontwerpen die dat kunnen doen en ze kunnen bepaalde specifieke neuronen precies controleren, waardoor ze kunnen begrijpen hoe iedere neuron deelneemt aan de functie van de hersenen. De Hightech apparaten die ze daarvoor gebruiken komen van micro-organismen zoals Chlamydomonas.

Deze organismen reageren op een bepaalde manier tegenover licht. Het beweegt namelijk met behulp van licht want dit micro-organisme heeft licht nodig voor de fotosynthese die hij maakt. De reden dat dit micro-organisme zo goed achter het licht aan kan gaan is omdat hij gebruik maakt van een eiwit dat gevoelig is voor licht namelijk channelrhodopsin. Dit eiwit zit op de grens van het oogachtige structuur van de algen, die we een oogvlek noemen.

Op het moment dat het eiwit wordt getroffen door licht gaat het zich gedragen als een zonnepaneel en zet het licht om in elektrische stroom. Dit doet hij door middel van het veranderen van zijn vorm, zodat het een kanaal vormt door de begrenzing van de oogvlek. Dit kanaal maakt het mogelijk positief geladen deeltjes door het grensgebied te leiden en de oogvlek binnen te gaan. De verkregen stroom van geladen deeltjes produceert een elektrische stroom die, via een waterval van gebeurtenissen, de algen naar het licht toe stuurt.

Wetenschappers hebben met behulp van gentherapie DNA van de Chlamydomonas bij kleine dieren in de neuronen aangebracht, waardoor ze op dezelfde manier reageren op licht. De neuronen reageren bij blauw licht, wat ervoor zorgt dat er elektrische pulsen worden gemaakt. Op deze manier kunnen wetenschappers de effecten observeren van bepaalde typen neuroncellen. Ze doen dit niet bij elke soort neuroncellen, ze doen dit maar bij één soort cel, bijvoorbeeld de basket cellen waardoor alleen die cellen worden geactiveerd door licht.

Er zijn ook eiwitten gevoelig voor oranje licht, en die zorgen ervoor dat de cellen geen elektrische pulsen versturen.

Met behulp van deze technieken kunnen wetenschappers de hersenen besturen en zo meer uitvinden over de verschillende ziektes die de hersenen beïnvloeden.

Page 18: DNA en medicijnen (1)

17

4. Practicum4.1 Elektroforese met appelsBij dit practicum heb ik gebruik gemaakt van een practicumopzet uit de NLT module ‘Door de ZOETE appel heen bijten!’.Ik heb met behulp van dit experiment antwoord geprobeerd te krijgen op de onderzoeksvraag, en de onderzoeksvraag is: Hoe kunnen we DNA vergelijken en zo zien welke genen de eigenschappen hebben die we willen in een medicijn?

Van het practicum was al wat voorbereid door de docenten, zij hadden al agarosegel gemaakt en het DNA geknipt. Met foto’s heb ik mijn resultaten vastgelegd. Zelf heb ik bij het proefstuderen ook DNA geknipt dus dat practicumverslag zit er ook bij.

Vind de juiste appel!(Bron: BioRad Laboratories, Inc.)

Inleiding Via de milieuorganisatie Greenpeace is bij de Voedsel en Waren Autoriteit (VWA) een appel terecht gekomen uit een supermarkt. Greenpeace vermoed dat deze appel afkomstig is van een appelboom die genetisch gemanipuleerd is. Deze appel zou uit een bedrijf komen dat geen vergunning van het ministerie van VROM heeft gekregen om met GGO’s (genetisch gemodificeerde organismen) te werken. Van het verlenen van vergunningen bestaan Europese richtlijnen.

Het DNA is bij ieder individu verschillend. Wanneer DNA geïsoleerd is (hoofdstuk 7) en eventueel vermeerderd is (hoofdstuk 10), kan het daarna met behulp van enzymen in stukjes worden geknipt. De enzymen knippen het DNA door op bepaalde plaatsen, dit is een bepaalde volgorde van de letters A, T, C en G. Omdat het DNA dus bij iedereen verschillend is, zullen de stukjes DNA ook een verschillende lengte hebben. Door deze stukjes met verschillende lengte op een bepaalde manier zichtbaar te maken kan men iets over het DNA van een persoon te weten komen. Dit principe noemt men DNA-fingerprint; omdat het geknipte DNA voor ieder individu net zo uniek is als zijn vingerafdruk.Aan jou de taak om met behulp van een DNA-fingerprint er achter te komen tot welk appelras de bij de VWA terecht gekomen appel behoort en genetisch gemodificeerd is.

Practicum Dit practicum bestaat uit 5 onderdelen: agarosegel maken knippen van de DNA-monsters gelelektroforese kleuren van DNA analyse van de resultaten.

Page 19: DNA en medicijnen (1)

18

Bepaalde onderdelen kunnen van tevoren al voorbereid zijn door docent en/of TOA. Wanneer dat gedaan is hoeven jullie deze onderdelen dus niet meer zelf te doen.

Agarosegel makenInleidingDe aanbevolen concentratie agarose in de gels is 1%. Deze agaroseconcentratie heeft een voldoende resolutie en een minimale looptijd voor de scheiding van de DNA-fragmenten tijdens de elektroforese. Breng de gel aan in een laag van 0,75-1,0 cm dik, zodat de monsters gemakkelijk geladen kunnen worden en de gel goed hanteerbaar is.

Let op dat de elektroforesebuffer, en dus geen water, wordt gebruikt bij het maken van de gels.

Benodigdheden elektroforesebakken, gietvormen (= gelhouder) en gelkammen elektroforesebuffer (50 x TAE) agarosepoeder 8 doorzichtige reageerbuisjes 3 liter gedestilleerd water.

Werkwijzea. Elektroforesebuffer makenDe TAE (Tris-acetaat-EDTA)-elektroforesebuffer wordt geleverd in een 50x geconcentreerde oplossing. Behalve voor de agarosegel, is er ook nog ongeveer 275 ml 1x TAE-buffer nodig in de elektroforesebakjes. Drie liter 1x TAE buffer zou voldoende moeten zijn om acht elektroforesebakjes te laten “lopen” en acht agarosegels te maken. Verdun 60 ml van het 50x-concentraat met 2,94 liter gedestilleerd water tot de drie liter 1x TAE. Om de elektroforesebakjes te vullen (zie: ‘Gelelektroforese’ stap 4) kun je ook 0,5x elektroforesebuffer gebruiken. Dus je kan de buffer nog 1:1 (v/v) verdunnen. De elektroforese kan dan bij 150 volt worden gedaan en is in 20 minuten gereed.

b. Agarose makenDeze handelingen kunnen 1 of 2 dagen van tevoren worden verricht of tijdens het practicum door de afzonderlijke werkgroepjes. Let op wanneer je met twee groepje één elektroforesebakje gebruikt, door halverwege nog een kammetje te zetten, hoeft dus niet iedere groep dit te maken. Gebruik 1 gram agarose voor elke 100 ml 1x TAE elektroforesebuffer, om een 1% agaroseoplossing te maken. Let op dat je geen water gebruikt, maar elektroforesebuffer. Als er te weinig elektroforesebakjes zijn, kan er ook een 7 x 10 cm houder worden gebruikt met twee 8-tandige kammen. Hier kan één gel in worden gegoten, waar twee werkgroepjes tegelijk gebruik van kunnen maken. Gebruik de tabel in figuur 35 om de juiste hoeveelheden gel te bepalen. Volume 1% agarose voor:

Page 20: DNA en medicijnen (1)

19

aantal gels 7 x 7 cm houder 7 x 10 cm houder 1 40 ml 50 ml 2 80 ml 100 ml 4 160 ml 200 ml

8 320 ml 400 ml Figuur 35: hoeveelheden per gel.

Doe het agarosepoeder in een geschikt vat (een 500 ml Erlenmeyer is bijvoorbeeld geschikt voor maximaal 200 ml). Voeg de juiste hoeveelheid 1x TAE-elektroforesebuffer toe en schud, zodat de agarose in de buffer oplost. Als er gebruik wordt gemaakt van Erlenmeyers, kan het handig zijn om een 25 ml Erlenmeyer omgekeerd in de opening van de 500 ml Erlenmeyer met de agarose te zetten. Op deze manier kan de oplossing worden gekookt zonder dat er veel vloeistof verloren gaat door verdamping. Gebruik een kookplaat, een warmwaterbad of een magnetron om de agarose “te smelten”.

WaarschuwingDraag altijd een veiligheidsbril, beschermende handschoenen en een laboratoriumjas tijdens het prepareren en gieten van de agarosegel. De kokende agarose en de buisjes zijn erg heet en kunnen nare brandwonden veroorzaken.

MagnetronmethodeGebruik de magnetron. Het oplossen van agarose gaat het snelst en het veiligst in een magnetron. Plaats het mengsel in de magnetron. ZORG DAT DE FLES OF BEKER NIET LUCHTDICHT AFGESLOTEN IS. Stel de magnetron in op 3 minuten op half vermogen. Neem de agarose elke 30 seconden even uit de magnetron om te zwenken, zodat alle klontjes oplossen. Kook en zwenk de oplossing net zo vaak totdat alle stukjes agarose opgelost zijn. Zet de oplossing weg en laat tot 55–60°C afkoelen voordat kan worden begonnen met gieten.

Magnetische-kookplaatmethodePlaats een roerboon (roervlo) in het agarosemengsel. Verwarm het mengsel al roerend op de magnetische kookplaat en breng het aan de kook. Laat de vloeistof niet tot de over de rand schuimen. Kook het mengsel tot alle agarosedeeltjes zijn opgelost. Zet de oplossing weg en laat tot 55–60 °C afkoelen voordat er kan worden begonnen met gieten.

c. Gels gieten In deze handleiding gaan we er vanuit dat elke gel minstens 7 gaatjes heeft. Volg bovenstaande instructies om de agarose te bereiden en de juiste hoeveelheid 1% agarose te bepalen. Giet voldoende agarose in de houder om de tanden van de kam te bedekken of tot er een laag van 0,6-0,8 cm ligt. Verplaats de houder niet voordat de gel hard is geworden. Vaste gels kunnen een dag worden bewaard bij kamertemperatuur in een afgesloten zakje (of Tupperware bakje). In de koelkast zijn ze een week houdbaar. Zorg dat je je zakje (bakje) met gel hebt gemerkt. Een hele klas is ongeveer 30 minuten bezig met het gieten van de gels. Giet zo mogelijk een of twee

Page 21: DNA en medicijnen (1)

20

extra gels voor het geval er iets misgaat. Hier behandelen we alleen de plakbandmethode voor het gieten van de gels. 1. Sluit de uiteinden van de gelhouder zorgvuldig af met laboratoriumplakband

(schilders tape kan ook, maar geen gewoon plakband, dat is niet hittebestendig en waterdicht genoeg). Druk de tape stevig aan, zodat er geen vloeistof meer langs kan lopen.

2. Zorg dat de houder waterpas staat. Gebruik bijvoorbeeld het bijgeleverde waterpasje.

3. Maak de gewenste concentratie en hoeveelheid agarose in een 1x TAE elektroforesebuffer.

4. Laat de agarose afkoelen minstens tot 60 °C voordat er kan worden begonnen met gieten. Hitte beschadigt de dure gelhouder.

5. Plaats ondertussen de kam in de daarvoor bedoelde gleuven in de gelhouder. De kam moet iets meer dan een centimeter van de korte kant worden geplaatst als je één kam in een 7 x 7 cm-bakje gebruikt. Wordt er gewerkt met een 7 x 10 cm-bakje en 2-kammen, plaats dan 1 kam aan een uiteinde en 1 kam in het midden van het bakje. De kammen zullen de gaatjes in de gel vormen waarin de DNA-monsters worden geladen.

6. Laat de gel in 10 tot 20 minuten bij kamertemperatuur hard worden. De gel is geschikt voor gebruik als hij troebel en ondoorzichtig is geworden.

7. Haal de kam rechtstandig en voorzichtig uit de gestolde gel.8. Haal het plakband weg.9. Er zijn nu twee mogelijkheden: Mogelijkheid 1Er is niet genoeg tijd om door te gaan met het practicum. Stop de gels dan in afsluitbare plastic zakjes en zorg dat de gels gemerkt zijn. De gels zijn een dag houdbaar bij kamertemperatuur en bij 4 °C kunnen ze zelfs een week worden bewaard.

Mogelijkheid 2Er is wel genoeg tijd om door te gaan. Plaats de houder in de waterpas elektroforese bak. Zorg ervoor dat de gaatjes waar de DNA-monsters in moeten, aan de zwarte (kathode) zijde van de bak zitten. De DNA-monsters zullen in de richting van de rode (anode) zijde bewegen tijdens de elektroforese.

Knippen van de DNA-monstersInleidingTijdens dit practicum krijgt jouw werkgroepje zes DNA-monsters. Jouw taak is om samen met je groepje te bepalen of deze zes monsters van verschillende appelrassen afkomstig zijn of dat er twee identiek zijn. Om verschillen in het DNA van verschillende appels te vinden moeten worden gekeken naar DNA profielen. De profielen krijgen we door het DNA van de appels in stukken te “knippen” met enzymen. Het profiel dat ontstaat na de elektroforese van de verkregen DNA-fragmenten noemt men ook wel een “DNA-fingerprint”.

Page 22: DNA en medicijnen (1)

Figuur 37: restrictie-

21

Benodigdheden elektroforese-systeem (elektroforesebak, gietvorm, gelkam met 8 tandjes) opgeloste restrictie-enzymen EcoRI/PstI (1 buisje van 80 μl) pipetpuntjes, 2–200 μl (15 stuks) micropipet, 2–20 μl gekleurde reageerbuisjes(epjes): groen, blauw, oranje, paars, rood, geel (1 van elk) watervaste stift afvalbakje schuimrubber reageerbuishouder (epjes) DNA van de verdachte appel, opgelost (1 buisje) DNA van Golden Delicious, opgelost (1 buisje) DNA van Royal Gala, opgelost (1 buisje) DNA van Elstar, opgelost (1 buisje) DNA van Granny Smith, opgelost (1 buisje) DNA van Jona Gold, opgelost (1 buisje) gesmolten 1% agarose in 1x TAE (zie 11.2.1) 70–80 ml per gel 37 °C waterbad of broedstoof (1 per klas) microcentrifuge (1 per klas).

WerkwijzeLabel reageerbuisjes.Zorg dat je van elk van de volgende gekleurde reageerbuisjes er één hebt. Label de 5 buisjes als volgt: het groene buisje VA (verdachte appel) het blauwe buisje GD (Golden Delicious) het oranje buisje RG (Royal Gala) het paarse buisje EL (Elstar) het rode buisje GS (Granny Smith) het gele buisje JG (Jona Gold).Zet verder nog je (groeps)naam en datum op de buisjes. Het knippen van de DNA-monsters gaat in deze buisjes plaatsvinden. Zet de reageerbuisjes in de schuimrubberen reageerbuishouder. Zie figuur 36.

Figuur 36: reageerbuisjes in reageerbuishouders.

Pak het doorzichtige reageerbuisje met de restrictie-enzymenmix. Dit buisje is gelabeld met “ENZ” (figuur 37).Je DNA-monsters halen.

Gebruik voor elk monster een nieuw pipetpuntje.

VA GD RG EL GS JG

Page 23: DNA en medicijnen (1)

22

Pipetteer 10 μl van elk DNA-monster in het corresponderende gekleurde reageerbuisje (zelfde kleur bij zelfde kleur!).

De DNA-monsters vind je op de centrale werkplek in gekleurde voorraadbuisjes. De docent of TOA beheert deze.

Figuur 38: DNA-monsters pipetteren.

4. Let op: Vergeet niet iedere keer pipetpuntjes te vervangen als je met een andere reagens aan de slag gaat. Pak altijd een schoon puntje als je per ongeluk met de punt de verkeerde vloeistof hebt geraakt. Als je twijfelt, vervang het pipetpuntje! Doe altijd eerst DNA in de reageerbuisjes en dan pas de enzymenmix.

Figuur 39: enzymenmix pipetteren.

Na het pipetterenJe DNA-monsters zouden uit de volgende componenten moeten bestaan na het pipetteren, zie de tabel in figuur 40.

DNA-monsters EcoRI/PstI Totale

VA GD RG EL GS JG

VA GD RG EL GS JG

Page 24: DNA en medicijnen (1)

23

(10 μl van elk genomen) Enzymenmix inhoud in buisje Verdachte appel [PD=VA] 10 μl 20 μl Golden Delicious [GD] 10 μl 20 μl Royal Gala [RG] 10 μl 20 μl Elstar [EL] 10 μl 20 μl Granny Smith [GS] 10 μl 20 μl Jona Gold [JG] 10 μ l 20 μ l_________ Figuur 40: componenten DNA-monsters.

Meng de inhoud van de buisjes. Sluit de buisjes zorgvuldig af. Meng de inhoud door voorzichtig met je vinger tegen de buisjes te tikken. Als er een centrifuge aanwezig is, centrifugeer de buisjes dan een paar tellen zodat de inhoud zich helemaal op de bodem bevindt. (Zorg wel dat je de buisjes op de juiste manier in de centrifuge plaatst! Doe dit samen met de docent of TOA). Als er geen centrifuge in het practicumlokaal aanwezig is, schud dan de buisjes, zoals je een thermometer schudt, met één of twee krachtige bewegingen. Klop nog een paar keer voorzichtig met de bodem van de reageerbuisjes op de tafel.

Page 25: DNA en medicijnen (1)

24

De DNA-monsters incuberen. Zet de buisjes in de schuimrubberen houder en incubeer gedurende 45 minuten bij 37 °C. De buisjes kunnen ook in een bak met water van 37 °C worden geplaatst die langzaam naar kamertemperatuur afkoelt. Laat de buisjes dan wel een nacht lang in het bad drijven. Zet de buisjes na de incubatie in de koelkast tot de volgende practicum les. Als er voldoende tijd is om door te gaan, ga dan direct door met de volgende stap.

GelelektroforeseInleidingDNA-fragmenten die door een restrictie-enzym zijn geknipt, kunnen op lengte worden gescheiden door een techniek genaamd agarose gelelektroforese. De term elektroforese betekent ‘gedragen door elektriciteit’. DNA-fragmenten worden aangebracht op een agarosegel. De gel bevindt zich in een bak gevuld met een geleidende buffervloeistof. Er wordt gelijkstroom op de bak gezet via twee elektroden aan de uiteinden van de bak. Omdat DNA-fragmenten negatief geladen zijn, zullen zij in een elektrisch veld richting de positieve pool worden getrokken. De structuur van de agarosegel werkt als een soort moleculaire zeef waardoor kleine DNA-fragmenten zich makkelijker bewegen dan grote fragmenten. De afstand die een DNA-fragment door de gel aflegt, is dus omgekeerd evenredig met zijn lengte. Fragmenten van dezelfde lengte zullen in bandjes bij elkaar blijven. Als het DNA gekleurd is, kun je deze bandjes zien.

Benodigdheden elektroforesesysteem agarosegel geknipte DNA-monsters (6 pipetjes) DNA-marker (HindIII-geknipt lambda DNA) laadkleurstof voor DNA-monsters watervaste stift pipetpuntjes, 2–20 μl (13 stuks) micropipet, 2–20 μl afvalbakje gel support film (als nodig) Fast Blast DNA-kleurstof, 1x of 100x (120 ml per 2 plekken) bakken om kleurstof af te spoelen (1–3 per 2 plekken) schuimrubber reageerbuishouder voedingsbron gelkleurbak (1 per 2 plekken)

Figuur 42: waterbad.

Figuur 41: inhoud buisjes mengen.

VA GD RG EL GS JG

Page 26: DNA en medicijnen (1)

25

elektroforesebuffer (1x TAE) 275 ml microcentrifuge (1 per klas) schudplatform (optioneel; 1 per klas).

WerkwijzeGebruik de agarosegel die je in ‘Agarosegel maken’ hebt gemaakt.Indien je de vorige les gestopt bent, haal dan de geknipte DNA-monsters uit de

koelkast.

Let op. Gebruik bij het pipetteren een nieuw pipetpuntje voor ieder monster.

Voeg aan elk reageerbuisje 5 μl van de laadkleurstof “LK” toe.

DNA-monsters Laadkleurstof (blauw)

Verdachte appel [VA=PD] 5 μl

Golden Delicious [GD=V1] 5 μl

Royal Gala [RG=V2] 5 μl

Elstar [EL=V3] 5 μl

Granny Smith [GS=V4] 5 μl

Jona Gold [JG=V5] 5 μ l

Figuur 43: laadkleurstof DNA-monsters.

Figuur 44: mengen laadkleurstof.

Sluit de buisjes goed af. Meng de inhoud door voorzichtig met je vinger tegen het buisje te tikken. Als er een centrifuge aanwezig is, centrifugeer de buisjes dan zodat de inhoud zich op de bodem van het buisje bevindt. Zo niet, klop dan een aantal keer zachtjes met de bodem van de reageerbuisjes op de tafel.

Plaats de houder met de gestolde gel op het platform in de gelelektroforesebak. Zet de gel zo neer dat de gaatjes zich aan de zwarte (-) zijde van de bak bevinden. Trek de

VA GD RG EL

GS JG

Page 27: DNA en medicijnen (1)

26

kam heel voorzichtig en recht omhoog uit de gel. Beschadiging van je gelslots (=gaatjes) geeft slechtere resultaten, de bandjes worden niet mooi recht.

Giet ongeveer 275 ml van de elektroforesebuffer in de elektroforesebak. Giet net zoveel buffer in de bak tot de gel zich 1-2 mm onder het vloeistofoppervlak bevindt.

Figuur 45: elektroforesebuffer in elektroforesebak gieten.

Pak nu het buisje met ‘HindIII lambda digest’ (DNA-marker).

Gebruik voor elk monster een apart pipetpuntje. Breng de DNA-fragmenten aan op de agarosegel. Een gel “lees” je van links naar rechts. Het eerste monster wordt in het meest linkse gaatje van de gel gepipetteerd.Baan 1: HindIII DNA-marker, buisje kleurloos, 8 μl Baan 2: VA, buisje groen, 8 μl Baan 3: GD, buisje blauw, 8 μl Baan 4: RG, buisje oranje, 8 μl Baan 5: EL, buisje paars, 8 μl Baan 6: GS, buisje rood, 8 μl Baan 7: JG, buisje geel, 8 μl

Page 28: DNA en medicijnen (1)

27

Figuur 46: DNA-fragmenten aanbrengen op agarosegel.

N.B. Opmerking: de hoeveelheid die in zo’n “gel slot” (‘gaatje”) past hangt af van de kam die gebruikt is. In het algemeen is 7μl monster voldoende om wat te kunnen zien.

Bevestig de deksel op de elektroforesebak. De deksel past maar op één manier op de bak: rood bij rood en zwart bij zwart. Verbind de snoertjes met de voedingsbron.

Figuur 47: elektroforesebak afsluiten en verbinden met voedingsbron.Zet de voedingsbron aan. Stel in op 100 V en elektroforeer de monsters gedurende 30–40 minuten.

Terwijl je aan het wachten bent, kun je vast beginnen met de vragen op de volgende pagina.

Schakel, wanneer de elektroforese klaar is, de voedingsbron uit en verwijder de deksel van de elektroforesebak met de gel. Haal de houder met de gel voorzichtig uit de bak. Kijk goed uit, want de gel is erg glibberig!

Kleuren van DNAInleidingOmdat DNA van nature kleurloos is, zal het niet direct zichtbaar zijn in de gel. Zonder hulpmiddelen zie je alleen de laadkleurstoffen. De DNA-fragmenten worden zichtbaar gemaakt met de blauwe kleurstof Fast Blast DNA-kleurstof. De blauwe kleurstofmoleculen zijn positief geladen en worden sterk door het DNA aangetrokken. Deze blauwe kleurstofmoleculen binden zich aan de DNA-fragmenten en zorgen er zo voor dat de fragmenten wel zichtbaar zijn. De DNA-fragmenten zijn dan als blauwe bandjes zichtbaar en kunnen overgetekend of gefotografeerd worden. Het is ook mogelijk om de gel te drogen en te bewaren.

WerkwijzeDit snelle protocol zorgt dat de DNA-bandjes in de agarosegel binnen 15 minuten zichtbaar zijn. Voor het snelle protocol moet de 500x Fast Blast kleurstof worden 5x verdund tot een 100x concentratie.De aanbevolen hoeveelheid verdunde Fast Blast om twee 7 x 7 cm of 7 x 10 cm agarosegels te kleuren is 120 ml. Als er andere kleuringsbakjes worden gebruikt dan die in de kit, zorg dan dat er voldoende kleurstof is om de gel volledig in onder te dompelen. Na de elektroforese, moeten de agarosegels eerst uit de gelhouders

Page 29: DNA en medicijnen (1)

28

worden gehaald voordat ze in de kleurstofoplossing worden geplaatst. Door zachtjes te duwen kan de gel gemakkelijk uit de houder worden verwijderd. Omdat de gel breekbaar is, moet er voorzichtig mee worden omgegaan. Ondersteun de gel met een brede spatel of iets dergelijks wanneer hij verplaatst moet worden. Bij het ontkleuren (wanneer het snelle kleuring protocol wordt gevolgd) is er op elke werkplek voor de leerlingen een vat van minstens 500 ml nodig. Leerlingen kunnen per stap in het ontkleuringsproces een nieuw vat gebruiken of na elke stap het vat legen en opnieuw vullen.

Zet je naam en klas op het kleuringsbakje. Er passen twee gels tegelijk in een kleuringsbakje.

Kleuren van de gels Haal de gel uit de houder en laat hem in het kleuringsbakje glijden. Giet ongeveer 120 ml van de 100x kleurstofoplossing in de bak. Giet er meer kleurstof op als de gel niet helemaal onder de vloeistof ligt. Laat de gels 2-3 minuten, maar zeker niet meer dan 3 minuten, in de kleurstof liggen. Giet de 100x kleurstof voor hergebruik met hulp van een trechter in een voorraadvat.

De kleurstof kan zeker 7 keer worden hergebruikt.

Spoelen van de gels Plaats de gels in een ruim vat met 500-700 ml schoon, warm kraanwater (40–55 °C). Laat de gels 5 minuten lang onder water liggen en schud ze om de minuut voorzichtig.

Wassen van de gelsHerhaal stap 3 (eventueel meerdere malen, met steeds 5 minuten wachttijd).

Resultaten noterenGiet het water weg en kijk of je DNA-bandjes ziet. De bandjes zullen er direct na de wasbeurt nog een beetje rafelig en onscherp uitzien, maar na 5-15 minuten zijn ze goed zichtbaar. Dit komt doordat er nog Fast Blast kleurstofmoleculen door de gel bewegen op zoek naar DNA-fragmenten. Voor nog scherpere bandjes, kun je stap 3 nog een aantal keer herhalen. Laat de gels echter niet te lang in het water liggen. Mochten de bandjes na een aantal wasbeurten nog niet goed zichtbaar zijn, leg de gel dan in een 1x Fast Blast kleurstofoplossing. Laat deze een etmaal staan.

a. Leg je gel op een witte ondergrond. Leg de resultaten van de proef als volgt vast: leg een transparant op de gel en trek (voorzichtig, niet hard duwen!) met een watervaste stift de gaatjes en bandjes over op het transparant. Je kunt de gel ook (fotokopiëren of) met een digitaal fototoestel vastleggen. b. De gel drogen om te bewaren. Hiervoor heb je speciaal doorzichtig dragermateriaal nodig, dat heet “gel support film”. Dit heeft een hydrofiele en een hydrofobe kant.Snijd de ongebruikte banen weg met een (scheer/ hobby/ Stanley)mes. Je hebt dan alleen baan 1-7 over. Plaats de gel op de hydrofiele zijde van een stuk gel support film (op de hydrofobe zijde kruipt het water naar elkaar toe; op de hydrofiele zijde verspreidt het water zich

Page 30: DNA en medicijnen (1)

29

over het hele vlak). Leg de gel in het midden van de folie en zorg ervoor dat het folie helemaal glad gestreken is. Leg de folie op een stuk keukenpapier en laat de gel drogen zonder hem aan direct licht bloot te stellen. Tijdens het drogen zal de gel zich aan de folie binden en niet krimpen. Als de gel 2 tot 3 dagen op kamertemperatuur heeft gelegen is het droog. Het resultaat is een platte, doorzichtige en duurzame registratie van de proef.

NB. Bij andere drogingprocedures gaat de gel omkrullen en sterk krimpen.

Verslag practicum elektroforese:Uit het resultaat blijkt dat de onbekende appel de Elstar was. Een elektroforese werkt net als een chromatografie, maar dan met geladen moleculen. DNA is negatief geladen en gaat dus naar de pluspool, zo krijg je het uiteindelijke resultaat. Maar dat is niet alles, want als alle moleculen dezelfde lading hebben kom je niet zo ver. DNA bestaat uit verschillende moleculen, die moleculen hebben een verschillende grootte. Kleine moleculen bewegen snel, grote moleculen bewegen langzaam. Zo krijg je verschillende lijnen. Elke lijn geeft aan welke moleculen er in het DNA zitten. Je kunt dus zien waaruit het DNA bestaat aan de hand van de positie van de lijnen. DNA is uniek, Daarom kun je snel zien van wie het DNA is, als je van de juiste persoon het DNA hebt genomen om het onbekende DNA te kunnen achterhalen.

Je kunt deze techniek ook gebruiken om DNA met elkaar te vergelijken van verschillende personen. Zo kun je zien welke delen overeenkomen. Zo kun je er bijvoorbeeld achter komen hoe twee totaal verschillende dames van in de 90 beide kerngezond zijn, terwijl de een bijna niet beweegt en al vanaf kind af aan rookt, en de ander alleen gezond bezig is met het juiste eten, genoeg beweging, niet roken en drinken, etc.

Hieronder zie je een aantal foto’s die ik heb gemaakt tijdens het practicum.

HindIII

VA

GD

RG

EL

GS

JG

Page 31: DNA en medicijnen (1)

30

Page 32: DNA en medicijnen (1)

31

Page 33: DNA en medicijnen (1)

32

4.2 DNA isoleren van een thymusOp 16 december ben ik gaan proefstuderen voor de studie Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek. Hier deden we een practicum waarbij we DNA moesten isoleren uit een kalfsthymus. Ik heb het verslag erbij gedaan omdat DNA isoleren ook deel was van het practicum elektroforese, alleen was het daar al gedaan door de docent.

We kregen hier een blokje van 3 gram thymus, wat uit de vriezer kwam zodat het makkelijker te snijden was. Vervolgens moesten we de volgende instructies opvolgen:

Snij de thymus in hele kleine stukjes, zo klein mogelijk, want dan kun je het DNA er makkelijker uit halen

Doe het in een blender, met 75 mL SSC per thymus, je kan 2 of 3 blokjes tegelijk doen want de mesjes van de blender moeten helemaal onder de vloeistof zitten. De SSC zorgt dat alle celmembranen opgelost worden. Blijf blenden tot er helemaal geen blokjes meer te zien zijn, het moet een mooie gladde vloeistof worden.

Doe het in een buisje voor in de centrifuge en zorg ervoor dat je het goed hebt getared met een ander buisje anders gaat de centrifuge stuk.

Zet de buisjes in de centrifuge: 20 minuten op 5000 rpm Als je het uit de centrifuge haalt zie je dat het buisje 2 componenten heeft, op de bodem zit een

vaste stof, dit heet het pellet en daar zitten de celkernen met het DNA in. Ook zie je een vloeistof, dit heet het supernatant en bevat de SSC met de opgeloste celmembranen.

Giet het supernatant met een vloeiende beweging af, dit heet decanteren, je houdt de pellet over.

Doe een klein beetje 2,2 M NaCl bij het pellet, het moet net onder de vloeistof zitten. NaCl zorgt ervoor dat de eiwitten neerslaan die om het DNA zitten.

Roer het met een lege reageerbuis of roerstaafje, uiteindelijk krijg je weer 2 delen, onderop de eiwitten, en daarboven een stroperige vloeistof waar het DNA in zit.

Haal de stroperige vloeistof eruit met een pipet en zorg ervoor dat er geen stukjes eiwit bij zitten (hele kleine stukjes kun je haast niet vermijden, maar probeer de stukjes eiwit die wat groter zijn niet bij de oplossing te krijgen).

Doe de stroperige vloeistof die je hebt gepipetteerd in een bekerglas en doe er 2x zoveel ethanol bij. Giet het er voorzichtig op zodat het niet mengt met het DNA (want dat mag niet). Aan het grensvlak tussen de ethanol en de stroperige vloeistof zie je DNA als belletjes omhoog komen. Ga met een glasstaaf voorzichtig roeren. Omdat het DNA negatief geladen is, blijft het aan de glasstaaf hangen.

Doe het vervolgens in een reageerbuis en los het op met SSC. Je mag geen stukjes meer zien (of probeer dat in ieder geval voor elkaar te krijgen)

Toen we dit hadden gedaan ging de docent met behulp van een speciaal apparaat kijken hoeveel DNA we hadden geïsoleerd en hoe zuiver het was. De zuiverheid moest tussen de 1.8 n 2.0 zitten, maar omdat het een ruwe methode was, was het ook goed als je 1.7 had gehaald.De resultaten kregen we mee naar huis en zie je hieronder.

Zoals te zien in de resultaten had mijn groepje het best goed gedaan, het was een leuke ervaring en een leuke toevoeging aan het vorige practicum met de elektroforese.

Page 34: DNA en medicijnen (1)

33

Page 35: DNA en medicijnen (1)

34

5. ConclusieDus er zijn een aantal technieken waarmee DNA wordt gebruikt in medicijnen.

Als eerste heb je een DNA vaccinatie, dat is een bacteriële plasmide met een of meer genen van een parasiet, bacterie, virus of tumorcel. Deze genen worden gekoppeld aan een promotor, die wordt verkregen van een zoogdier.

Er moeten veel keuzes gemaakt worden bij het maken van een DNA vaccinatie, hierbij moeten wettelijk bepaalde richtlijnen gevolgd worden en tegelijkertijd moet er worden gekeken naar de effectiviteit van het vaccin.

DNA vaccins hebben voordelen en nadelen, de voordelen zijn: Makkelijker, goedkoper en veiliger Natuurlijker Makkelijker Praktischer en realistischer

De nadelen zijn: Plasmide DNA kan integreren in het DNA van de cel Niet bruikbaar voor polysacharide vaccins Risico van auto-immuniteit

DNA vaccins werken nog niet zoals gewenst bij mensen, maar daar zijn de wetenschappers naartoe aan het werken.

Verder heb je moderne biotechnologie die op meerdere vlakken kan worden gebruikt, niet alleen de geneeskunde. Er wordt voor deze technologie gebruik gemaakt van recombinant-DNA techniek, waarbij een gewenst deel van het DNA geknipt wordt. Dit deel wordt dan in een bacterie-, gist-, of hamstercel geplaatst en dat wordt dan op de juiste plek in het organisme (plant, dier of mens) gebracht.

Biotechnologie combineert het DNA van meerdere soorten, wat kan zorgen voor resistentie tegen bepaalde ziektes. Dat is nu vooral bij planten het geval. Bij mensen kan er op deze manier worden gezorgd dat de cellen bijvoorbeeld insuline aan gaan maken. Vaccins maken ook gebruik van moderne biotechnologie. Je hebt ook xenotransplantatie, waarbij cellen, weefsels of organen worden getransplanteerd van de ene soort in de andere.

Page 36: DNA en medicijnen (1)

35

Ook heb je gentherapie, wat een manier is om een genetisch probleem op te lossen bij de bron. Dit wordt gedaan door een gecorrigeerde kopie van een defect gen toe te voegen. Gentherapie maakt vooral gebruikt van een vector, meestal een virus om het aangepaste gen in de cellen te brengen waar het nodig is. Eenmaal binnen wordt het RNA van de gen gelezen en omgezet in eiwitmoleculen, die daarna hun werk doen in de cellen.

Met gentherapie kunnen helaas niet alle aandoeningen worden behandeld, en om erachter te komen welke aandoeningen behandeld kunnen worden moeten een aantal vragen worden beantwoordt, die te maken hebben met textuur en structuur van de genen en de biologie van de aandoening. Verder moet je weten of je het gecorrigeerde gen in de cellen van het aangetaste weefsel kan brengen.

Andere technieken bij gentherapie zijn gen silencing, het repareren van genen en genetisch gemodificeerde cellen die immuun zijn en specifieke moleculen aanvallen.

Het repareren van genen gebruikt een techniek genaamd Spliceosome-Mediated RNA Trans-splicing (SMaRT), deze techniek valt het mRNA aan wat gekopieerd is van het gemuteerde gen en repareert het

Om genetisch gemodificeerde cellen te krijgen die immuun zijn en specifieke moleculen aanvallen, maken wetenschappers gebruik van de natuurlijke functie van het immuunsysteem. Door de immuun cellen van een persoon te isoleren en genetisch te modificeren kan je er voor zorgen dat deze cellen bepaalde cellen aanvallen, en je kan ze gebruiken om een medicijn te dragen, hierdoor kunnen ze naast het vechten en vernietigen van de specifieke cellen ook een product loslaten die tegen de ziekte vecht.

Daarnaast heb je epigenetica, het deel in de cellen die bepaalde genen uitschakelt. Elke cel heeft het zelfde DNA, maar toch hebben alle cellen een andere functie. Epigenetica zorgt dus dat elke cel hun eigen functies kunnen hebben. Wetenschappers hebben ontdekt hoe dat werkt en kunnen dat nu kunstmatig. Eén manier om dat voor elkaar te krijgen word ook wel epigenetische silencing genoemd. Deze techniek verklaard ook, gedeeltelijk, waarom eeneiige tweelingen niet dezelfde fenotypen hebben.

Genen kunnen ook uitgezet worden door RNA. Dit kan alleen als het RNA in de vorm is van antisense transcripten, niet-coderende RNA’s or RNA interferentie. RNA kan genexpressie beïnvloeden door ervoor te zorgen dat heterochromatine wordt gevormd, of door histon modificaties en DNA methylering teweeg te brengen.

Als laatste heb je Optogenetica, waarbij licht wordt gebruikt om neuronen te beïnvloeden, op deze manier kunnen bepaalde ziektes die de hersenen beïnvloeden onderzocht worden. Uiteindelijk kan deze techniek er ook voor zorgen dat de mensen met deze ziektes genezen kunnen worden. Bij deze techniek wordt DNA van een channelrhodopsin gebruikt om een eiwit te maken wat reageert op het licht. Dat DNA wordt op een bepaalde groep neuronen geplaatst

Page 37: DNA en medicijnen (1)

36

en die neuronen worden dan onderzocht door de wetenschappers, die proberen uit te vinden wat er gebeurt als je die groep uitzet, of juist aanzet.

En met behulp van de techniek ‘elektroforese’ wordt gekeken naar overeenkomsten in het DNA. Op deze manier kun je DNA van twee hele verschillende mensen vergelijken die beide een aanzienlijke leeftijd hebben bereikt maar hele verschillende leefstijlen hadden, om er zo achter te komen welke eigenschappen van het DNA overeenkomen. Die eigenschappen kunnen worden gebruikt in een medicijn.

Page 38: DNA en medicijnen (1)

37

6. NawoordTerwijl ik werkte aan mijn profielwerkstuk heb ik veel geleerd. Zo ben ik te weten gekomen welke technieken worden gebruikt om met behulp van DNA medicijnen te maken. Daarnaast weet ik nu ook hoe die technieken werken en waarvoor ze worden gebruikt.

Het was heel leuk om te doen en ik hoop in de toekomst meer van dit soort projecten te kunnen ondernemen.

Ik wil graag mevrouw Van Gameren bedanken dat ze me toestemming gaf om dit werkstuk alleen te mogen maken.

Graag wil ik ook mevrouw Blenk bedanken voor de hulp die ze mij gaf bij dit project.

Dit project was een uitdaging voor mij, een uitdaging waar ik erg naar uitzag en ik ben blij dat ik het mocht doen.

Page 39: DNA en medicijnen (1)

38

7. Geraadpleegde literatuurBiotechnologie Learning Hub, B.L.H. (2014). Modern Biotechnologie. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://biotechlearn.org.nz/themes/what_is_biotechnology/modern_biotechnology

Clinical Epigenetics, C.E. (2014). Clinical Epigenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 viawww.clinicalepigeneticsjournal.com

Discover, D. (2006). DNA Is Not Destiny: The New Science of Epigenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://discovermagazine.com/2006/nov/cover

DNA-Labs, D.L. (2014). Recombinant-DNA techniek. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 viawww.dnalabs.nl/basisinfo/dna-werk/recombinant-dna-techniek.html

Epigenetics and Chromatin, A.C. (2014). Epigenetics and Chromatin. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via www.epigeneticsandchromatin.comGenetics Home Reference, G.H.R. (2014). What is gene therapy? Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/therapy/genetherapy

GRID Arendal, G.R.I.D.A. (2008). Biotehnology and modern biotechnology defined. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://www.grida.no/graphicslib/detail/biotechnology-and-modern-biotechnology-defined_b9d8

Hogeschool Rotterdam, H.R. (2014). Profielwerkstuk voorbereiden. Geraadpleegd op 27-11-2014 via http://www.hogeschoolrotterdam.nl/studeren/profielwerkstuk/voorbereiden

Learn.Genetics, U. (2014 a). Gene Therapy. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 viahttp://learn.genetics.utah.edu/content/genetherapy/

Learn.Genetics, U. (2014 b). Epigenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 viahttp://learn.genetics.utah.edu/content/epigenetics/

Medscape, M. (2014). Hematopoietic stem cell transplantation. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://emedicine.medscape.com/article/208954-overview

MIT, M.I.T. (2014). Optogenetics: Controlling the brain with light. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://video.mit.edu/watch/optogenetics-controlling-the-brain-with-light-7659/

Nature.com, N. (2014). Gene Therapy. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via www.nature.com/gt/index.html

NZORD, N.Z.O.R.D. (2014). Modern Biotechnology. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via

Page 40: DNA en medicijnen (1)

39

www.nzord.org.nz/research/modern_biotechnology

OECD, O.E.C.D. (1999). Modern Biotechnologie and the OECD. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://www.oecd.org/science/biotech/1890904.pdf

Open Optogenetics, O.O. (2011). Open Optogenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 viawww.openoptogenetics.org

Quora, Q. (2014). DNA. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 via http://www.quora.com/search?q=DNA

Science, S. (2014). What is epigenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 viahttp://m.sciencemag.org/content/330/6004/611

Scitable, N. (2014). Epigenetic Influences and Disease. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 viawww.nature.com/scitable/topicpage/epigenetic-influences-and-desease-895

Stanford, S. (2014). Optogenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 viahttp://web.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/

Weebly, W. (2014). Optogenetics. Laatst geraadpleegd op 03-01-2015 viahttp://optogenetics.weebly.com/what-is-it.html

Page 41: DNA en medicijnen (1)

40

Bijlage

Tirumalai Kamala’s answer to: What is a DNA vaccin?At its simplest, a DNA vaccine is just a bacterial plasmid, containing one or more genes from a parasite, a bacterium, a virus or a tumor cell, coupled to a mammalian promoter for driving protein expression inside our body. Once inside our cells, the plasmid doesn't (or shouldn't) replicate but its gene(s) are transcribed and translated into protein(s), which in turn are targeted by our immune responses through mechanisms that we don't fully understand.

Where did the idea of DNA Vaccines come from?

Foreign DNA is transcribed

1. In 1950, chromatin derived from a tumor cell transfers malignancy to a normal cell (1). In 1960, naked DNA could be delivered into mammalian cells in vivo (2). 

2. Hepatitis viral DNA causes hepatitis when injected into animals (3, 4).

3. In 1983, protein is expressed in vivo when a plasmid containing its gene is injected into rats (5) or in mouse muscle (6).

Foreign DNA is immunogenic

1. In 1963, DNA or RNA from liver could induce Type I interferons from chicken cells (7).

2. In 1965, mycobacterial ribosomes and RNA are immunogenic (8).

3. In 1984, DNA from BCG has anti-tumor activity (9).

4. A 1992 study injects plasmids containing human Growth Hormone (hGH) gene into the ears of mice (10). A few weeks later, many, not all, mice have high circulating antibodies against hGH. Shortly after, in other studies, DNA plasmids encoding flu antigens protect mice against lethal flu (11, 12).

Page 42: DNA en medicijnen (1)

41

Foreign DNA could be a vaccine? What has happened since? Lots, some useful, much not.

From Reference 13

How are DNA vaccines made?Constructing a DNA vaccine entails many choices, choices tempered by regulatory guidelines (14, 15, and 16). What antigens? Wild type or mutated genes? Membrane-bound, intracellular or secreted antigens? What type of plasmid (and promoters, enhancers, and introns)? Delivered how? Where? Skin or muscle? Dose? Adjuvants? Boosted how and how often? Each of these choices greatly influence the effectiveness of the resulting DNA vaccine, effectiveness alluding to strength and type of immune responses, anything from neutralizing antibodies to cytotoxic CD8 killer cells.For illustration purposes, let's look at this graphic that describes the steps necessary in constructing a DNA vaccine for West Nile virus.

Page 44: DNA en medicijnen (1)

43

How are DNA vaccines delivered? (20, 23, 24, 25)Originally they were injected directly into muscle. This resulted in variable and less immunogenic uptake. An innovation called the gene gun shot DNA coated onto gold micro particles into the skin using pressurized gas. Improved uptake but not by much. Then came electroporation. Here simple electrodes generate electric pulses across the cell membrane to transiently induce pores in the cell membrane (cell electropermeabilization), promoting cellular uptake of DNA (17, 18). A variation of the gene gun approach, the Particle-Mediated Epidermal Delivery (PMED) directs delivery into skin, primarily into keratinocytes (19). This method also improves uptake (20). DNA tattooing is a newer delivery method (21, 22), highly immunogenic possibly due to skin damage by tattoo needles.

Advantages of DNA Vaccines (20, 23, 24, 25, 26)

1. Easier, cheaper, safer. Let's consider a bit. Targets of vaccines are usually microbes or tumors capable of terrible disease and/or mortality. With DNA vaccines, we don't work directly with a dangerous microbe or tumor. We don't have to culture it, inactivate it or purify proteins from it. We just choose microbial or tumor genes likely to drive strong and specific immune responses and clone them into a plasmid.

2. More natural. Almost counter-intuitively so compared to their closest counterpart, sub-unit vaccines. Typically, non-living vaccines require lengthy and tedious purification of the constituent proteins, processes that inherently introduce changes that could change, subvert or minimize immune responses against these proteins' natural counterparts. With DNA vaccines, our bodies own cells synthesize these proteins, replicating their native structures and essential post-translational modifications, likely mimicking their natural capacity to induce immunity.

3. Much easier to change (mutate). This is an advantage with viruses that rapidly drift, i.e. frequently change antigen coding sequences, e.g. flu.

4. More practical and realistic. Plasmid DNA is stable at room temperature hugely reducing costs for storage and shipping. Most other types of vaccines need to be kept and shipped cold. Refrigerators and refrigerated trucks, the so-called cold chain, are too expensive to be norm the world over.

Disadvantages of DNA vaccines (20, 23, 24, 25, 26)1. Plasmid DNA could integrate into the cell's DNA. Depending on the site of

such integration, at least three adverse outcomes are possible. Either the integration could turn on an oncogene, turn off a tumor suppressor gene, or induce chromosomal instability. How does plasmid DNA integration

Page 45: DNA en medicijnen (1)

44

compare with spontaneous gene mutation frequencies? The standard accepted value is 2X10-6 spontaneous gene-inactivating mutations per gene (20, 27). While there is no known human study that did such a comparison, mouse, rabbit and guinea pig model studies confirmed DNA vaccine genomic integration but at rates much lower than this standard value (28, 29, 30, 31, 32, 33, 34)

2. Not useful for polysaccharide vaccines. Genes are translated into proteins. DNA vaccines aren't useful for microbes where immune responses against polysaccharides are necessary and sufficient to prevent disease. For example, against pneumococcal and meningococcal infections.

3. Risk of auto-immunity. If the target of the immune responses against anti-DNA vaccine included common elements between it and our own DNA, it could trigger auto-immunity. However, while circulating anti-double stranded DNA antibodies increased in mice following DNA vaccination (35), same was not seen in humans (36).

DNA vaccines in humans: Disappointing results thus far. (20, 23, 24, 37, 50, 71)Nearly 20 years and counting, human clinical trials of DNA vaccines for flu, hepatitis B, HIV, malaria and cancer ended with largely disappointing results. Vaccines that worked well at earlier stages, inducing strong immune responses in mouse models, just didn't work as well in humans. Why? Insufficient expression? In hindsight, maybe these vaccines were optimized for mouse models, not for humans? At a minimum, they were safe when injected into humans, with local injection site reaction being the most commonly reported side effect (38, 39, 40, and 41). What about autoimmunity? Published reports suggest not (36).

How do DNA vaccines drive immunity?This is still a mystery. Let's first make explicit the nature of this mystery. A DNA vaccine is quite simply gene(s) encoding protein(s) derived from microbes or from tumor cells. How could proteins derived from these genes drive immunity? After all, our cells make all kinds of proteins all the time. In health, we don't make immune responses against them...unless those proteins were made in the context of death or damage, i.e. something that activated the so-called innate arm of immunity. After all, immunity is so powerful, plenty of checks and balances exist for getting it started and sustained. So what could be happening with DNA vaccines? Considered in this light, there are at least three targets.

1. One, the bacterial DNA plasmid with its abundant unmethylated CpGmotifs, itself a likely target of mammalian immunity.

Page 46: DNA en medicijnen (1)

45

2. Two, location, i.e. double-stranded DNA in the cytoplasm. Surely, that's abnormal?

3. Three, if one and two trigger immune activation of a cell, surely the protein product(s) of such DNA would automatically feed into the ongoing immunity? 

Now, let's consider the players involved.

1. Professional antigen-Presenting Cells (pAPCs). Why are they important? pAPCs are necessary for a strong CD4 T cell response. Without CD4 T cell help, B cell and CD8 T cell responses are weak and transient. Current DNA vaccines are designed to specifically target and stimulate APCs (42) but they aren't delivered into the body to do so (43). For practical and not scientific reasons, we choose to give most experimental DNA vaccines intramuscularly, i.e. inject them inside muscle cells. Muscle tissue is considered lacking in pAPCs and myocytes considered poor at driving immune responses. Less straightforward approach? Yes. Unnecessary complication? Yes. Immunological surprise? Undeniably so. At least in a mouse model, DNA vaccines encoding antigens driven by myocyte-specific promoters were similarly immunogenic compared to other, more common promoters (44). At the very least, such studies demonstrate that even when we deliver DNA vaccines into sites that current paradigms predict are unfavorable for immunity, robust immunity can and does ensue.

2. TLR9. Bacterial DNA has abundant unmethylated CpG motifs. Such motifs induce strong immune responses by triggering activation of molecules such as TLR9. However, mice lacking TLR9 respond similarly to DNA vaccines (45, 46, 47, 48, 49, and 50). 

3. Double-stranded DNA in cytoplasm: cause for alarm? When we inject DNA vaccines, we directly deliver double-stranded DNA into a cell's cytoplasm. The nucleus is the normal location for DNA. Surely the cytoplasm is an abnormal location for double-stranded DNA? Surely that must happen only when a cell is infected, distressed, damaged or dying? Surely, over evolutionary time, we must have evolved systems to sense double-stranded DNA in the cytoplasm? We are still hunting for such mystery cytoplasmic DNA sensor(s) (51, 52). Recent mouse model studies suggests we may be close with molecules such as TBK1, IRF3 and STING (53, 54, 55, and 56). Caveat being mouse studies. If past is any guide to present and future, mouse model immune responses are slightly too radically different from those in humans. As good as wishing on a shooting star.

Page 47: DNA en medicijnen (1)

46

From Reference 50

From Reference 57

4. We are still unclear how much of the immune response is against the antigen(s) encoded by the plasmid versus the plasmid itself. Maybe once inside the cytoplasm, DNA vaccines induce changes similar to those induced by Inclusion or certain viruses (58)? Such instability or imbalance inside the host cells could in turn induce metabolic changes (59) such as local accumulation of uric acid, which in turn could trigger immune responses (50, 60).

5. Cells that take up DNA vaccines could turn over faster, with more rapid cell death (61), leading to extracellular DNA release which would trigger immune responses.

Page 48: DNA en medicijnen (1)

47

Approved DNA vaccinesNot withstanding disappointing human data and the mystery about how they drive immunity, several veterinary DNA vaccines have been approved. 

From Reference 24

1. West Nile Virus, Horses, USA (62, 63). 

2. Infectious hematopoietic necrosis virus, Salmon, Canada (64, 65). 

3. Melanoma, Dogs, USA (66, 67).

4. Growth hormone releasing hormone, Pigs, Australia (68, 69, 70).

Where are DNA vaccines today?In a disappointing place, at least for humans. Full circle with so-called heterologous prime-boost vaccination protocols with DNA vaccine prime followed by viral vector boost (13, 24, and 71). All the advantages I pointed out in the beginning? Down the drain because a viral vector boost negates them all. My reading of the literature suggests that tremendous effort was expended in designing DNA vaccines that seem optimal for mouse and other non-human pre-clinical models. When the success of those models didn't translate into equally successful human data, does that not suggest at the very least that such models don't predict human immunity, at least not very well? Why not focus instead on improving DNA vaccine design exclusively for humans, using in vitro human models to guide the path? Maybe we would end up with a human DNA vaccine that worked by itself, either injected once or boosted, greater likelihood of regulatory approval, and without added bells and whistles that increase cost, artifice and difficulty, 

Page 49: DNA en medicijnen (1)

48

Page 50: DNA en medicijnen (1)

49

Bibliography

1. Production of Neoplasms by Injection of Fractions of Mammalian Neoplasms

2. A tumor-producing factor extracted by phenol from papillomatous tis...

3. Cloned HBV DNA causes hepatitis in chimpanzees.

4. Page on nih.gov

5. Page on nih.gov

6. Wolff, Jon A., et al. "Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. “Science 247.4949 (1990): 1465-1468. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo

7. Isaacs, A., R. A. Cox, and Z. Rotem. "Foreign nucleic acids as the stimulus to make interferon." The Lancet 282.7299 (1963): 113-116.

8. Page on nih.gov

9. Tokunaga, Tohru, et al. "Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG. I. Isolation, physicochemical characterization, and antitumor activity." Journal of the National Cancer Institute 72.4 (1984): 955-962.

10. Tang, De-chu, Michael DeVit, and Stephen A. Johnston. "Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response."Nature 356.6365 (1992): 152-154.

11. Page on nih.gov

12. Ulmer, Jeffrey B., et al. "Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein." Science 259.5102 (1993): 1745-1749.

13. DNA/MVA Vaccines for HIV/AIDS

14. Page on fda.gov

15. Page on ema.europa.eu

16. Page on ema.europa.eu

17. Page on nih.gov

18. Page on nih.gov

19. DNA vaccination protects against an influenza challenge in a double-blind randomised placebo-controlled phase 1b clinical trial.

20. Page on www.njmonline.nl

Page 51: DNA en medicijnen (1)

50

21. Bins, Adriaan D., et al. "A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression." Nature medicine 11.8 (2005): 899-904. https://openaccess.leidenuniv.nl/bitstream/handle/1887/11457/03.pdf?...

22. Verstrepen, Babs E., et al. "Improved HIV-1 specific T-cell responses by short-interval DNA tattooing as compared to intramuscular immunization in non-human primates." Vaccine 26.26 (2008): 3346-3351.

23. Page on nih.gov

24. From Concepts to Applications

25. Page on www.actabp.pl

26. Page on nih.gov

27. Cole, J., and T. R. Skopek. "International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens. Working paper no. 3. Somatic mutant frequency, mutation rates and mutational spectra in the human population in vivo." Mutation research 304.1 (1994): 33-105.

28. Pal, Ranajit, et al. "Definitive toxicology and biodistribution study of a polyvalent DNA prime/protein boost human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) vaccine in rabbits." Vaccine 24.8 (2006): 1225-1234.

29. Page on karger.com

30. Martin, Terrie, et al. "Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection." Human gene therapy10.5 (1999): 759-768.

31. Nichols, Warren W., et al. "Potential DNA vaccine integration into host cell genome." Annals of the New York Academy of Sciences 772.1 (1995): 30-39.

32. Page on nature.com

33. Page on nih.gov

34. Faurez, Florence, et al. "Biosafety of DNA vaccines: New generation of DNA vectors and current knowledge on the fate of plasmids after injection." Vaccine 28.23 (2010): 3888-3895. Biosafety of DNA vaccines: New generation of DNA vectors and current knowledge on the fate of plasmids after injection.

35. Page on nature.com

36. Page on nih.gov

Page 52: DNA en medicijnen (1)

51

37. Liu, Margaret A. "DNA vaccines: an historical perspective and view to the future." Immunological reviews 239.1 (2011): 62-84.

38. Page on nih.gov

39. Vardas, Eftyhia, et al. "Indicators of therapeutic effect in FIT-06, a Phase II trial of a DNA vaccine, GTU< sup>®</sup>-Multi-HIVB, in untreated HIV-1 infected subjects." Vaccine 30.27 (2012): 4046-4054. Page on osakeannit.fi

40. Page on plosone.org

41. Bagarazzi, Mark L., et al. "Immunotherapy against HPV16/18 generates potent TH1 and cytotoxic cellular immune responses." Science translational medicine 4.155 (2012): 155ra138-155ra138. Page on stanford.edu

42. Targeting Dendritic Cells to Enhance DNA Vaccine Potency

43. Page on nature.com

44. No Effect on DNA-Raised Immune Responses

45. Page on jimmunol.org

46. Page on nih.gov

47. Tudor, Daniela, et al. "TLR9 pathway is involved in adjuvant effects of plasmid DNA-based vaccines." Vaccine 23.10 (2005): 1258-1264.

48. Page on nih.gov

49. Ligtenberg, Maarten A., et al. "NF-κB activation during intradermal DNA vaccination is essential for eliciting tumor protective antigen-specific CTL responses." Human Vaccines & Immunotherapeutics 9.10 (2013): 2189-2195.

50. Page on nih.gov

51. Ishii, Ken J., et al. "A Toll-like receptor–independent antiviral response induced by double-stranded B-form DNA." Nature immunology 7.1 (2005): 40-48.

52. Extrachromosomal Histone H2B Mediates Innate Antiviral Immune Responses Induced by Intracellular Double-Stranded DNA

53. Ishii, Ken J., et al. "TANK-binding kinase-1 delineates innate and adaptive immune responses to DNA vaccines." Nature 451.7179 (2008): 725-729.

54. Ishikawa, Hiroki, Zhe Ma, and Glen N. Barber. "STING regulates intracellular DNA-mediated, type I interferon-dependent innate immunity." Nature 461.7265 (2009): 788-792.

Page 53: DNA en medicijnen (1)

52

55. Page on nih.gov

56. Page on nih.gov

57. Innate Immune Signaling by, and Genetic Adjuvants for  DNA Vaccination

58. Page on nih.gov

59. Ishii, Ken J., and Shizuo Akira. "Potential link between the immune system and metabolism of nucleic acids." Current opinion in immunology 20.5 (2008): 524-529.

60. Desmet, Christophe J., and Ken J. Ishii. "Nucleic acid sensing at the interface between innate and adaptive immunity in vaccination." Nature Reviews Immunology 12.7 (2012): 479-491.

61. http://www.nature.com/icb/journa...

62. Davidson, Ann H., et al. "Immunologic responses to West Nile virus in vaccinated and clinically affected horses." Journal of the American Veterinary Medical Association 226.2 (2005): 240-245.

63. Page on nih.gov

64. Page on int-res.com

65. Page on int-res.com

66. Long-Term Survival of Dogs with Advanced Malignant Melanoma after DNA Vaccination with Xenogeneic Human Tyrosinase

67. Bergman, P. J., et al. "Development of a xenogeneic DNA vaccine program for canine malignant melanoma at the Animal Medical Center." Vaccine24.21 (2006): 4582-4585.

68. Khan, Amir S., et al. "Effects of maternal plasmid GHRH treatment on offspring growth." Vaccine 28.8 (2010): 1905-1910.

69. Page on nih.gov

70. Plasmid-mediated growth hormone-releasing hormone efficacy in reducing disease associated with Mycoplasma hyopneumoniae and porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection

71. DNA Vaccines: Recent Developments and the Future