Introductie van DNA
description
Transcript of Introductie van DNA
• Introductie van DNA
Transformatie: vrij DNA: hoe doorheen de celwand/
celmembraan ?
Transductie: met viruspartikel: in vitro verpakking noodzakelijk
(infectie => transfectie)
Conjugatie: cel-cel contact: DNA moet in een cel aanwezig zijn
Horizontale DNA-overdracht
(nb. manipulaties beperkt tot recombinatie of andere in vivo mechanismen)
! Uiteraard “initiële” transformatie vereist ! Eventueel met donor E. coli – via conjugatieve transfer van pendelvector (“shuttle vector”) naar andere gastheer.
• Illustratie conjugatie
Horizontale DNA-overdracht
ColE1 : mobiliseerbaar door F
F zorgt voor de pili
ColE1 heeft nic/bom locus (oriT) en codeert Mob-eiwitten
pBR322 : geen mob gebied (eiwitten); wel nic/bom plaats
mobiliseerbaar in triparentaal mechanisme
F of Ia-type plasmide : pili
ColK plasmide : voor de mob-functies
(nb. belang van (kennis van) compatibiliteit)
pBR327 : heeft geen nic/bom (oriT) meer (idem voor pAT153)
niet mobiliseerbaar, tenzij door co-integraatvorming (soms conductie genoemd)
transfer m.b.v. mobiliseerbaar plasmide (co-integraat):
- recA-afhankelijk : homologe recombinatie met eenmobiliseerbaar replicon
- recA-onafhankelijk : co-integratie bij transpositie
pSUP plasmiden : (Bielefeld, 1984-1990)
verhoging van efficientie van DNA-overdracht door gebruik vanoriT van incP (RP4, RK2) of incQ (RSF1010) plasmiden(zie verder voor informatie over deze plasmiden)
- klonering van een Sau3AI oriT-bevattend fragment van RP4 in een aantal standaardvectoren
pACYC177 => pSUP301pACYC184 => pSUP101pBR325 => pSUP201, 202 en 203
- op pSUP202 werd een transposon geplaatst (Tn5)
indien suicide plasmide kan hiermee het transposon overgedragen worden naar een bacteriestam waarinhet parentale plasmide niet kan repliceren
- in pSUP5011 werd het oriT fragment in de transposonsequentiegeplaatst.Dit maakt het mogelijk dat na een eerste transfer, waarbij hettransposon (met oriT) op een genetisch element overgedragenis, dit element te mobiliseren en naar een andere stam verderte brengen (of terug te brengen naar de oorspronkelijke stam).
nb. het gebruik van de term mobis hier onnauwkeurig (misleidend)en staat door de cis-functie oriT
Integratieve klonering :
Vector niet-repliceerbaar (zelfmoordplasmide)
Circulair DNA : enkelvoudige homologe recombinatie
Gelineariseerd DNA : dubbele homologe recombinatie (uitwisseling)
Enkelvoudige recombinatie genereert een herhaling (dus ook instabiliteit)
In vitro excisie met restrictie-enzym dat niet in oorspronkelijke construct knipt
In vivo uitsplitsing identificeerbaar indien het replicon actief is
(vgl. met alleluitwisseling in hoofdstuk over S. cerevisiae)
Restrictie-enzyme splitst :
- in homoloog gebied : excisie van oorspronkelijk plasmide
- buiten het homoloog gebied : herhaling blijft behouden bij excisie
=> recA- stam vereist voor stabiliteit
- in polylinker gebied : herhaling is weg : extensie aan slechts één zijde
Recombinatie tussen homologe sequenties (enkelvoudige cross-over)
Recombinatie tussen homologe sequenties (dubbele cross-over)
Integratie via dubbele cross-overin bvb. B. subtilis genoom
(Ook methode voor het genereren van deletiemutanten via uitwisseling van actief gen, door gen onderbroken door een resistentiemerker (zie verder) )
Genomic integration of an unmarked mutation
using sacB :
The fragment, cloned in a narrow host range vector,
is mutagenized in E. coli by inserting the nptI-sacB-
sacR cassette (symbolized by a black and white dot).
The recombinant plasmid is introduced into the
Gram negative recipient and double recombination
events are isolated by selection for neomycin
resistance (expressed from the nptI gene) and
verified by loss of the vector encoded resistance
marker (marked by the black box). The insertion
mutant, generated by this gene replacement is
sucrose-sensitive (Sucs) due to the presence of the
sacB gene.
In a second step, most of the nptI-sacB-sacR
cartridge is removed from the cloned fragment,
resulting in an unmarked point mutation (or frame-
shift). The recombinant molecule is introduced
from E. coli into the insertion mutant, where a
second double recombination event can be
selected on plates containing sucrose. Only cells
which have lost the nptI-sacB-sacR cartridge by
marker exchange are able to grow on high sucrose
concentrations (Sucr, Neos).
E. coliVoordelen :• veel vectoren beschikbaar• eenvoudig transformeerbaar• geschikt voor heel wat toepassingen : o.a. DNA-sequentieanalyse, gerichte mutagenese,
recombinante eiwitexpressie, enz.
Beperkingen:• mist bepaalde ‘pathways’ (bvb. reactiewegen) noodzakelijk voor fenotypische analyse van bepaalde functies van andere bacteriën :
specifieke gastheren nodig – sommige genfuncties vereisen de “eigen” gastheer
• post-translationele modificaties van eiwitten• complementatiefuncties, enz..
Andere gastheer Vereisten:• DNA moet geïntroduceerd kunnen worden (bvb. door transformatie, conjugatie, enz.)• DNA moet stabiel behouden blijven in de cel (moet functioneren als replicon of
in chromosoom ingebouwd worden)• Expressie vanaf plasmide (expressiesignalen: transcriptie/translatie)
Klonering in andere bacteriën (niet E. coli)Waarom?
Klonering in andere bacteriën (niet E. coli)
Bijkomende vragen:
• welke resistenties als merkers te gebruiken ? Gevoeligheid van gastheer voor antibiotica ?
• vectoren: eigen plasmiden ? fagen ? andere ?
• restrictiefenomenen (op vreemd DNA) ?
• recombinatie ?
• Introductie van DNA; horizontale DNA-overdracht
Transformatie
“Natuurlijke” mechanismen
• meestal transiënt fenomeen
• sequentie-afhankelijk of sequentieonafhankelijk
• het natuurlijk mechanisme omvat nuclease splitsing van dsDNA, degradatie van
van 1 streng en opname van lineair ssDNA
Conjugatie :
- IncP plasmiden RP4, ~60 kb
- IncP plasmiden: transfer van zichzelf en compatibele vectoren
- IncP plasmiden kunnen IncQ plasmiden, bvb. RSF1010 mobiliseren
- ook transfer mogelijk van E. coli naar Gr+
- relatief groot aantal zelfoverdraagbare plasmiden bij Gr+
Bvb. plasmide pAM1, origineel Enterococcus faecalis,
ook conjugeerbaar naar E. coli.
nb. pAM1 repliceert volgens een “theta-mechanisme” (zoals ook ColE1) en is stabieler dan heel wat andere plasmiden die volgens een “rolling circle mechanisme” repliceren (hetgeen makkelijker deleties veroorzaakt).
Vectoren afgeleid van IncQ-groep plasmide RSF1010
• RSF1010 • multicopy replicon• niet-zelf conjugatief; mobiliseerbaar• resistentie t.o.v.
sulfonamide en streptomycine• unieke restrictieherkennings-
sequenties (RHS)niet bruikbaar omwille van verlies van resistentie – interferentie met expressievereiste nieuwe RHS en selectie- merkers
heel wat derivaten, inclusief pSUP vectoren
Mini-versies van de IncP-groep plasmiden
• IncP plasmide• Vb. RP4 en RK2 ~60 kb, conjugatief en mobiliseerbaar• grote plasmiden
Afgeleide mini-IncP plasmiden ~ 5-7 kb, nog steeds breed spectrum
gemeenschappelijke polylinker – lacZ’ regio – blauw/wit selectieoriT = origin of transfer replicatie – mobiliseerbaarparDE, parCBA operons: grotere stabiliteit in segregatietrfA : houdt het aantal kopijen laag ; excisie ervan (met NdeI-SfiI) verhoogt het aantal kopijen
Mini-versies van de IncP-groep plasmiden
Vectoren afgeleid van breed-gastheerspectrum plasmide pSa,Agrobacterium tumefaciens
IncW plasmide: pSa
grijs : functies nodig voor replicatiepaars (donker) : nodig voor zelf-transmissie
(tussen SstII en SalI : suppressie van tumorinductie door A. tumefaciens)
Vectoren afgeleid van breed-gastheerspectrum plasmide pSa,Agrobacterium tumefaciens
IncW plasmide: pSa
- zelfoverdraagbaar naar grote groep Gr-
- vector voor “oncogene” A. tumefaciens
- 2 regio’s voor conjugatie; 4 kb-regio voor replicatie in diverse gastheren
afgeleide vectoren met unieke RHS en insertie-inactivatie van één
resistentiemerker door klonering; ook afgeleiden met
faag cos-site : functioneert als cosmidevector.
derivaten : niet conjugatief maar mobiliseerbaar door andere
conjugatieve plasmiden.
Klonering in andere bacteriën (niet E. coli)
• Geen universele vectoren t.g.v. zeer sterke verschillen in GC-gehalte:
Range: <30% tot >70%
onderscheid hoog/laag GC-gehalte organismen
• Hoog GC-gehalte, e.g. Streptomyces spp.
• Laag GC-gehalte, e.g. Bacillus spp., Clostridium, Staphylococcus, Lactococcus …
Klonering in gram-positieven
Primrose & Twyman hoofdstuk 10
• Vaak elektroporatie (soms inefficiënt)
• Bacillus subtilis – specifieke methoden – Box 10.1
Klonering in andere gram-negatieven (niet E. coli)
• In de regel : pendelvector of breed-gastheerspectrum plasmide
• Indien klein natuurlijk plasmide beschikbaar optie pendelvector / fusie metbestaande E. coli vectoren – voordeel indien beschikbare resistentiemerkersook in de nieuwe gastheer werken
• breed-gastheerspectrum plasmide:- grootte- meerdere selectiemerkers (soms)- unieke restrictieherkenningsposities – bij voorkeur positieve selectie
• Behoud van het DNA:
• stabiel als plasmide (zie hoger – indien replicatie)• verloren gaan (geschikt voor transposon “delivery”)• integreren in ander replicon, meestal chromosoom (enkele cross-over)• recombinatie tussen homologe sequenties (dubbele cross-over)
Integreren in ander replicon, meestal chromosoom (enkele cross-over)
Optie: selectie voor integratie in geval geen stabiel replicon
pBR322 integratieve vector met neomycine resistentiemerker en gedeelte
amyE (-amylase gen van B. subtilis)
- selectie op integratie; 1 kopij per cel
- toepassing: naburige sequenties kloneren.
Fig 10.2
Laag GC-gehalte Gr+
Efficiënte transcriptie/translatie
Transcriptie / verschillend van E. coli
• RNA polymerase gelijkaardig; evenwel verschillende sigma-factoren• Naast -35 en -10 geconserveerde posities, ook veelal -16 geconserveerd TGTG-
motief weinig voorkomend bij E. coliBij mutaties in deze regio, sterk verlies van de promoteractiviteit
Translatie / verschillend van E. coli
• B. subtilis ribosomen herkennen enkel eigen mRNA (niet E. coli mRNA)In tegenstelling tot E. coli !
• Reden ? Missen het S1 ribosomaal eiwit – staat normaal in voor aspecifieke bindingaan RNA en translocatie naar 30S subeenheid (SD alignering en starttranslatie vanaf startcodon) – sterker geconserveerde SD-sequentie
Klonering in gram-positieven
Laag GC-gehalte Gr+
• Veelal plasmiden van S. aureus gebruikt – ook functioneel in andere Gr+pC194, pUB110 – eigen B. subtilis plasmide (pTA1060)
• Problemen bij directe klonering in B. subtilis (zie box-info) pendelvectoren E. coli – B. subtilis manipulaties in E. coli – plasmide-extractie, multimere plasmiden
te transformeren naar B. subtilis
Tabel 10.2 (p.192)
• Problemen bij herschikking van grotere inserties- invloed van type replicatie van plasmide – ‘thèta’ versus ‘rolling-circle’ • ColE1-gebaseerde vectoren via thèta-replicatie• pAMbeta1 = enige ‘thèta’-type replicatie
Hogere stabiliteit / pendelvectoren / mobiliseerbare
Laag GC-gehalte Gr+
Gecontroleerde expressie in gastheren met een laag GC-gehalte
Spac systeem in B. subtilis
• E. coli lacI gen• promoter van faag SPO1 – gekoppeld aan de lac operator
=> induceerbaar met IPTG
E. coli T7 systeem in B. subtilis
• T7 RNA polymerase-gen geïnsereerd in het chromosoom achter een xylose-induceerbare promoter
• Doelwitgen onder controle van T7 promoter op B. subtilis vector
Xylose-induceerbare promoter (B. subtilis, Staphylococci, Lactobacillus)
Laag GC-gehalte Gr+
Gecontroleerde expressie in gastheren met een laag GC-gehalte
nisA, nis F systemen in Lactococcus lactis
• nisA, nisF promoter• induceerbaar met nisine – expressieniveau afhankelijk van nisineconcentratie
Andere: Tabel 10.3
Secretie van vreemde eiwitten
• Exportmechanismen gelijkaardig aan E. coli • Verschillen in signaalsequentie – meer positief geladen N-terminus + langer• Probevectoren voor selectie van secretiesignaalsequenties zijn gebaseerd op
gesecreteerde reporteractiviteit (S. aureus nuclease)
Prom NucleasegenMCS
Selectie van secretiesignalen – monitoring van nuclease-activiteit in het medium
Laag GC-gehalte Gr+
Geninactivatievectoren : studie van genen uit gekende genoomsequenties
• studie van genfuncties• rechtstreekse insertionele mutagenese in het chromosoom• pMUTIN vector
Laag GC-gehalte Gr+
pMUTIN vectoren
• insertionele mutagenese – geen onafhankelijk replicon in B. subtilis• lacZ reporter voor expressiemonitoring• induceerbare Pspac promoter voor induceerbare expressie
Procedure
Kenmerken
• PCR/doelwitgen – insertie in pMUTIN• transformatie naar B. subtilis• bij integratie: * onderbreking van doelwitgen – eigen promoter wordt
gefusioneerd aan lacZ reporter (geninactivatie – ‘null mutation’)* stroomafwaartse genen onder controle van Pspac (conditionele mutatie)
• lacZ reporter voor expressiemonitoring• induceerbare Pspac promoter voor induceerbare expressie (IPTG)
Laag GC-gehalte Gr+
pMUTIN vectoren
pSPORTn3
pBR322 en derivaten bevatten nog een inverted repeat element van Tn3
Door het her-invoeren van een tweede element, kan een transponeerbaar element gecreëerd worden. Het transposase (gecodeerd door het tnpA gen) wordt voorzien vanop een additionele (compatibele) vector (bvb. pSC101).
Klonering in andere bacteriën (niet E. coli)
Hoog GC-gehalte Gr+
DNA-opname
O.a. Streptomyces spp.
Algemeen• heel wat spp. maken antibiotica aan – studie synthesewegen• G+C content: ~70-75%, A/T –rijke RHS weinig voorkomend• promotors liggen vaak behoorlijk ver voor de translatiestartplaats• complexe promotersequenties – sommige > 100 bp voor startcodon
(tandemplaatsen voor verschillende sigma-factoren)
• Transformatie van protoplasten in aanwezigheid van PEG• 106 – 107 transformanten/µg supercoiled DNA• Elektroporatie na beperkte lysozyme-behandeling (geen protoplastvorming)• Intergenerische conjugatie van mobiliseerbare plasmiden van E. coli naar
Streptomyces (tra genen in trans voorzien; oriT (nic/bom) plaats aanwezig• Antibioticumselectiemerkers vaak moeilijk wegens inherente resistentie van de cel
Hoog GC-gehalte Gr+
Vectoren
• RSF1010 repliceert ook in Streptomyces – andere niet• afgeleid van Streptomyces endogene plasmiden of fagen• plasmide: veelal afgeleid van SCP2* aanleiding tot stabiele, laag-kopij aantal
(theta-replicatie) vectoren• vectoren met hoog aantal kopijen (300) afgeleid van het "kleine" plasmide pIJ101• bijzondere loci voor integratie in chromosoom (o.a. pSAM)
• faag: getemperde faag C31 ; ook integratieve varianten• BACs waarin 100 kb DNA inbouwbaar is ; pendelvectoren naar E. coli
ook integratieve strategieën (in Streptomyces)
T
- geïsoleerd in 1955 uit een bodemstaal in New-Mexico (Streptomyces azureus) - structuur opgelost in 1970- slecht oplosbaar in water ; onstabiel in zuur en alkali - actief tegen grampositieven ; door slechte oplosbaarheid geen doorbraak niet in humane geneeskunde - mogelijks wel ook anti-malaria en antikanker eigenschappen- (topicaal) veterinair antibioticum (bij mastitis)- 10 ringen, 11 peptidebindingen, sterk onverzadigd, 17 chirale centra
(toch succesvolle chemische totaalsynthese gerealiseerd)- bindt het GTPase domein in 23S-rRNA ; inhibeert translatie - toepassing in gentechnologie van Streptomyceten (rRNA methylase als resistentiegen)