Functionele karakterisatie van een Tgfbr1 muismodel voor...

Functionele karakterisatie van

een Tgfbr1 muismodel voor een

erfelijk aorta aneurysma

syndroom

Lies Janssens

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. B. Loeys

Begeleidster: Marjolijn Renard

Vakgroep: Medische Genetica

Academiejaar 2010-2011

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk

ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder

met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het

aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

Lies Janssens Prof. Dr. B. Loeys

Voorwoord

Een thesis tot een goed einde brengen vergt inspanning en volharding. De hulp en steun van

anderen waren hierbij onontbeerlijk.

In het bijzonder betuig ik mijn dank aan mijn promotor, Prof. Dr. B. Loeys, voor de manier

waarmee hij mij heeft betrokken bij het onderzoek, en mijn begeleidster Marjolijn Renard

voor het vertrouwen die ze in mij stelde om zelfstandig te kunnen werken, voor het doorgeven

van haar inzichten en kennis, en voor haar accurate opvolging en begeleiding.

Eveneens gaat mijn dank uit naar de medewerkers van MRB1 voor hun technische

ondersteuning en hun bereidwilligheid om mij te helpen. In het bijzonder denk ik hierbij aan

Eveline Debals in verband met de qPCR experimenten.

Het interdisciplinair aspect van deze thesis zorgde voor aanvullende expertise. In dit verband

wil ik graag Prof. P. Cornillie, dierenarts, en C. Casteleyn, dierenarts, van de faculteit

Dierengeneeskunde, bedanken voor hun bijdrage.

Ten slotte een woord van dank aan mijn ouders en mijn zus, voor hun actieve interesse en

onvoorwaardelijke steun.

Lies Janssens

Gent, mei 2011

Inhoudstafel

1. Samenvatting 1

2. Inleiding 2

2.1. Aorta-aneurysma 2

2.2. Loeys-Dietz syndroom 3

2.2.1. Klinische achtergrond 3

2.2.2. Genetische achtergrond 5

2.3. TGF-β 6

2.3.1. TGF-β signalisatie pathway 6

2.3.2. TGF-β en erfelijke aorta-aneurysma aandoeningen 9

2.4. Muismodellen 10

2.4.1. Tgfbr1 muismodel 10

2.4.2. Tgfbr2 muismodel 11

3. Materiaal en methoden 13

3.1. Genotypering 13

3.1.1. Polymerase Chain Reaction 13

3.1.1.1. Doelstelling 13

3.1.1.2. Principe 13

3.1.2. Caliper LabChip GX 14



3.1.3. Sequenering 14



3.2. Embryologie 15

3.2.1. Doelstelling 15

3.2.2. Methode 16

3.3. Beeldvorming 16

3.3.1. Vascular corrosion casting 16



3.4. Aortaprelevatie 16


3.4.2. Methode 17

3.5. Paraffine coupes 17

3.5.1. Bekomen van paraffine coupes 17


3.5.2. Immunohistochemische kleuring 17



3.5.3. Lichtmicroscopische kleuring 19



3.6. Gladde spiercelculturen 19


3.6.2. Principe 19

3.7. Genexpressie analyse 20

3.7.1. RNA isolatie 20



3.7.2. DNase behandeling 21



3.7.3. cDNA synthese 22



3.7.4. qPCR 22



4. Resultaten 24

4.1. Tgfbr1 muismodel 24

4.1.1. Ontwikkeling Tgfbr1 muismodel 24

4.1.2. Ziekteverloop Tgfbr1 muidmodel 25

4.2. Embryologie 25

4.2.1. Morfologisch onderzoek en bepaling lethale fase 26

4.2.1.1. 8.5 dpc embryo’s 26

4.2.1.2. 9.5 dpc embryo’s 26

4.2.1.3. 10.5 dpc embryo’s 28

4.2.1.4. 11.5 dpc embryo’s 28

4.2.1.5. 12.5 dpc embryo’s 29

4.2.2. Histologie 30

4.3. Vascular corrosion casting 30

4.4. Genexpressie analyse 32

4.4.1. Aortaprelevatie en gladde spiercelculturen 32

4.4.2. qPCR 33

4.4.2.1. Ontwerpen van primers 33

4.4.2.2. Optimalisatie van primers 33

4.4.2.3. Genexpressie analyse van Tgfbr1 34

4.5. Kleuring van paraffine coupes 35

4.5.1. Algemene opbouw aortawand 35

4.5.2. Verhoeff-Von Gieson kleuring 35

4.5.3. Immunohistochemische kleuring 36

5. Bespreking 38

5.1. Karakterisatie van Tgfbr1-/- embryo’s 38

5.2. Karakterisatie van Tgfbr1+/- muizen 40

5.3. Toekomstperspectieven 43

6. Referentielijst 45

1

1. Samenvatting UProbleemstellingU Thoracale aorta-aneurysma’s, die vaak de onderliggende oorzaak zijn van

acute aortadissectie, kunnen geïsoleerd voorkomen of in associatie met een syndroom, zoals

het Loeys-Dietz syndroom (LDS). LDS is een autosomaal dominante aandoening gekenmerkt

door hypertelorisme, gespleten huig en/of verhemelte en algemene arteriële tortuositeit met

aorta-aneurysma en dissectie. Mutaties in TGFBR1 of TGFBR2 geven aanleiding tot LDS. De

‘loss-of-function’ mutaties in deze receptoren leiden echter tot een paradoxale toename van

TGF-β signalisatie.

UDoelstellingU De doelstelling van dit onderzoek is om na te gaan hoe mutaties in TGFBR1

kunnen leiden tot een paradoxale toename van TGF-β signalisatie en dit aan de hand van de

studie van een knock-in Tgfbr1 muismodel. Meer specifiek zullen we dit muismodel

karakteriseren door (1) de studie van het natuurlijk verloop met betrekking tot

cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit van zowel homozygote als heterozygote Tgfbr1

muizen, (2) het bekomen van paraffine coupes en van gladde spiercellijnen afgeleid van

aortaweefsel voor verdere in vitro studies van het onderliggend mechanisme en de gevolgen

van de verstoorde TGF-β signalisatie, en (3) beeldvorming van het cardiovasculair systeem.

UMethodenU Genexpressie analyses, vascular corrosion casting en (immunohistochemische)

kleuringen moeten meer inzicht bieden of het Tgfbr1 muismodel al dan niet representatief is

voor LDS en moeten helpen om het pathogenetisch mechanisme te ontrafelen. Hiervoor

worden 6 maanden en 12 maanden oude Tgfbr1 muizen onderzocht; zowel wild type als

heterozygoot mutanten. Voor de homozygoot mutante embryo’s wordt de embryonale lethale

fase bepaald, en wordt histologisch onderzoek verricht naar de morfologie met behulp van

hematoxyline-eosine kleuringen.

UResultatenU De homogygoot mutante embryo’s sterven rond 11.5 dpc. De heterozygoot

mutante muizen vertonen geen arteriële tortuositeit en er zijn geen aorta-aneurysma’s

aanwezig ter hoogte van de thoracale aorta. Er kon ook geen opregulatie van de TGF-β

pathway aangetoond worden; zoals eerder aangetoond in de aortawand van LDS patiënten.

UConclusieU Het Tgfbr1 knock-in muismodel is niet representatief voor het Loeys-Dietz

syndroom gelinkt aan TGFBR1 mutaties. Een mogelijke hypothese hiervoor is het optreden

van nonsense-mediated mRNA decay, aangezien de aangebrachte mutatie, in het Tgfbr1

muismodel, een nonsense mutatie is. Het wild type allel maakt, met andere woorden,

voldoende Tgfbr1 aan, noodzakelijk voor een normale cardiovasculaire ontwikkeling.

2

T2. Inleiding

2.1 Aorta-aneurysma

Acute aortadissectie (AAD) is de meest frequente vorm van levensbedreigende aorta-

pathologie met een prevalentie van 2 tot 4 per 100 000 mensen per jaar [1]. Aorta-aneurysma

(figuur 1) is vaak de onderliggende oorzaak van deze pathologie. Een aorta-aneurysma is een

gelocaliseerde verbreeding van de arterie [2], waarbij de diameter van de aorta minstens 1.5

maal breder is dan de oorspronkelijke diameter [3]. We onderscheiden thoracale en

abdominale aorta-aneurysma’s (TAA en AAA, respectievelijk). TAA van de ascenderende

aorta komt het meest frequent voor (40% van de TAA patiënten), gevolgd door TAA van de

descenderende aorta (35%) en aneurysma’s van de aortaboog (15%) en de thoraco-

abdominale regio’s (10%) [4]. TAAs komen twee tot vier keer vaker voor bij mannen dan bij

vrouwen en de gemiddelde leeftijd van diagnose is rond de leeftijd van 60-70 jaar [5].

Geweten is dat er verschillende omgevingsfactoren een rol spelen bij de ontwikkeling van

aorta-aneurysma’s, onder meer roken, hypertensie, atherosclerose, diabetes mellitus, en

ouderdom [3]. Belangrijk is dat ook een genetische component een rol speelt en dit

voornamelijk bij de thoracale aorta-aneurysma’s, waar bij één vijfde van alle patiënten een

positieve familiale voorgeschiedenis bestaat [6].

TAA kan geïsoleerd voorkomen of in associatie met een syndroom. Syndromale vormen van

TAA zijn het Marfan syndroom (MFS), Loeys-Dietz syndroom (LDS), Ehlers-Danlos

syndroom vasculair type (EDS type IV), arterieel tortuositeitssyndroom (ATS), cutis laxa

(CL), Turner syndroom en Noonan syndroom. Uit erfelijkheidsonderzoek werd al belangrijke

kennis verworven over de moleculaire basis en etiologie van deze erfelijke

bindweefselziekten. Niet-syndromale vormen zijn geïsoleerde familiale thoracale aorta-

aneurysma/dissectie (FTAAD) eventueel in combinatie met bicuspiede aortaklep (BAV) of

patente ductus arteriosus (PDA). In deze thesis zullen we ons beperken tot de bespreking van

het Loeys-Dietz syndroom.

3

Figuur 1: Aorta-aneurysma’s [7] b: aortawortel aneurysma, typisch bij Marfan syndroom en Loeys-Dietz sydroom c: aorta-aneurysma van de aorta ascendens d: aorta-aneurysma van de aorta descendens

2.2 Loeys-Dietz syndroom

2.2.1 Klinische achtergrond

Het Loeys-Dietz syndroom is een autosomaal dominante aandoening. Dit wil zeggen dat elk

kind van een individu met LDS, 50% kans heeft om de mutatie en bijgevolg de aandoening

over te erven. Ongeveer 25% van de patiënten, die gediagnosticeerd worden met LDS, hebben

een aangetaste ouder. In de overige 75% van de aangetaste individuen wordt LDS veroorzaakt

door een de novo mutatie [8].

Het Loeys-Dietz syndroom wordt klinisch gekenmerkt door hypertelorisme (wijd uiteen

geplaatste ogen), gespleten huig en/of verhemelte en algemene arteriële tortuositeit met aorta-

aneurysma en dissectie (Figuur 2). Andere bevindingen, zoals craniosynostosis, klompvoeten,

structurele botafwijkingen, BAV, PDA en afwijkingen van de pectus zijn ook geassocieerd

met LDS [9].

Figuur 2: typische LDS triade [9] A: hypertelorisme B: gespleten huig C: aorta-aneurysma (aangeduid met pijltje op figuur)

A B

C

4

Twee types van het LDS kunnen worden onderscheiden, met name LDS type I en II.

Ongeveer 75% van de aangetaste individuen worden gediagnosticeerd met LDS type I en 25%

met type II. De twee types onderscheiden zich in het voorkomen van belangrijke craniofaciale

manifestaties (oculair hypertelorisme, gespleten huig en/of verhemelte en craniosynotosis) in

LDS type I, die afwezig zijn in type II (Figuur 3). Bovendien hebben patiënten met LDS type

II tenminste twee bijkomende manifestaties over het algemeen kenmerkend voor het Ehlers-

Danlos syndroom vasculair type (fluwelen en translucente huid, brede atrofische littekens,

gemakkelijke vorming van blauwe plekken, uterine ruptuur,...) (Figuur 4) [8].

Figuur 3: fenotypische kenmerken LDS types I [10] A+B: blauwe sclera, hypertelorisme, proptosis (uitpuilende ogen), retrognathie C: camptodactyly en arachnodatcyly

Figuur 4: fenotypische kenmerken LDS type II [10] A: craniofaciale manifestaties B: translucente huid, met zichtbare aders C: brede atrofische littekens Dilatatie van de aorta ter hoogte van de sinussen van Valsalva, predispositie voor aorta

dissectie en ruptuur, verzakking van de mitralisklep, en verbredingen van de proximale

pulmonaire arterie zijn de voornaamste oorzaken van zowel morbiditeit als vroege mortaliteit

in patiënten met LDS. Bij de meeste patiënten, die drager zijn van een mutatie in het

Transforming Growth Factor Beta (TGF-β) Receptor 1 of 2 (respectievelijk TGFBR1 of

TGFBR2) gen, is de arteriële betrokkenheid wijdverspreid en is arteriële tortuositeit aanwezig.

Het is zelfs zo dat de meeste aangetaste individuen meerdere arteriële anomalieën vertonen

[11].

Zowel LDS type I als type II worden gekarakteriseerd door wijdverspreide en aggressieve

arteriële aneurysma’s en een hoge prevalentie aan zwangerschaps-gerelateerde complicaties.

Het verschil is dat patiënten met LDS type I vroeger een cardiovasculaire ingreep ondergaan

A

A

B C

B C

5

(gemiddelde leeftijd 16.9 jaar versus 26.9 jaar) en op jongere leeftijd sterven (gemiddeld 22.6

jaar versus 31.8 jaar); in vergelijking met LDS type II patiënten [10].

2.2.2 Genetische achtergrond

Het Loeys-Dietz syndroom wordt veroorzaakt door heterozygote mutaties in het TGFBR1 of

TGFBR2 gen [8,9,10].

Het TGFBR1 gen bestaat uit 9 exonen die coderen voor 503 aminozuren van de Transforming

Growth Factor Beta (TGF-β) Receptor 1 (TGFBR1), terwijl het TGFBR2 gen opgebouwd is

uit 7 exonen die coderen voor 567 aminozuren van de TGF-β receptor 2 (TGFBR2).

De meeste mutaties komen voor in het intracellulaire gedeelte (serine-threonine kinase

domeinen) van TGF-β receptor 1 en TGF-β receptor 2 (Figuur 5). Slechts enkele mutaties

werden in het extracellulaire gedeelte van TGFBR2 beschreven [11].

Figuur 5: Opbouw TGFBR1 (a) en TGFBR2 (b) [10] De gekleurde vlakken stellen de exonen voor. a: extracellulair domein (geel), transmembranair domein (blauw), serine-threonine kinase domein (rood), intracellulair domein zonder gespecificieerde functies (grijs), en het glycine-serine-rijk domein (groen). b: extracellulair domein (geel), transmembranair domein (blauw), serine-threonine kinase domein (rood), en het intracellulair domein zonder gespecificieerde functies (grijs). De overgrote meerderheid van de mutaties, die optreden ter hoogte van het serine-threonine

kinase domein van beide TGF-β receptoren, zijn missense mutaties [8,10]. Missense mutaties

zijn mutaties waarbij, door puntmutaties op nucleotidenniveau (verandering van C, A, G of

T), het oorspronkelijke aminozuur vervangen wordt door een ander/nieuw aminozuur.

Nonsense mutaties, waarbij door een puntmutatie een codon wordt omgezet in een stopcodon,

worden minder frequent aangetroffen, in vergelijking met missense mutaties. Opvallend is dat

nonsense mutaties in LDS tot nu toe enkel geobserveerd zijn in het TGFBR2 gen [10,12].

Recent werden echter de eerste nonsense en frameshift mutaties die leiden tot een prematuur

stopcodon in TGFBR1 geïdentificeerd in patiënten met MSSE (multiple self-healing

squamous epithelioma) [13]. MSSE wordt gekenmerkt door lokale invasieve huidtumoren die

snel groeien gedurende enkele weken en daarna spontaan regresseren waarbij een litteken

achterblijft. Het fenotypisch verschil tussen LDS en MSSE patiënten kan verklaard worden op

a

b

6

basis van het type mutatie en de locatie. Bij de MSSE patiënten werden de eerste missense,

nonsense en frameshift mutaties beschreven in het extracellulair domein van de type I

receptor en werden truncerende mutaties geïdentificeerd in het kinase domein [13]. Splice-site

mutaties en kleine deleties of inserties in TGFBR1 en TGFBR2 kunnen ook voorkomen in

LDS [10,12]. De fenotypes veroorzaakt door een bepaald type mutatie zijn niet van elkaar te

onderscheiden [11]. Meermaals werd een somatisch moscaïsisme van een mutatie in het

TGFBR2 gen geraporteerd. Deze mutatie veroorzaakt non-penetrantie van de aandoening

[8,10]. In een recente studie werd ook een duplicatie van het TGFBR1 gen beschreven, dat

aanleiding gaf tot manifestaties consistent met het Loeys-Dietz syndroom [14].

In het algemeen zijn er ook geen fenotypische verschillen waarneembaar tussen patiënten met

mutaties in het TGFBR1 gen of het TGFBR2 gen [8,10]. Het is merkwaardig genoeg ook zo

dat identieke mutaties kunnen leiden tot zowel LDS type I als LDS type II [8].

2.3 TGF-β

TGF-β is een lid van een superfamilie van liganden en receptoren, die naast TGF-β ook Bone

Morphogenic Proteins (BMPs) en activines/inhibines bevat. Deze solubele peptide

groeifactoren worden geproduceerd door multiple celtypes en nemen deel aan een breed

spectrum van cellulaire processen, zoals proliferatie, angiogenese, differentiatie, apoptose,

inflammatie, en wondheling. TGF-β is waarschijnlijk het best gekend voor zijn rol in matrix

depositie (bv. collageen synthese). Er is echter ook aangetoond dat TGF-β alternatieve

pathways reguleert die kunnen leiden tot matrix degradatie [3].

Aangezien TGF-β signalisatie een belangrijke rol speelt in vasculaire en craniofaciale

ontwikkeling, is het niet moeilijk in te zien dat een verstoring van TGF-β signalisatie

aanleiding kan geven tot meerdere humane fenotypes. Voorbeelden hiervan zijn

craniosynostosis, gespleten verhemelte, arteriële aneurysma’s, congenitale hartaandoeningen,

en mentale retardatie [9,10].

2.3.1 TGF-β signalisatie pathway

TGF-β wordt gesynthetiseerd als een pre-pro eiwit, dat proteolytische processen ondergaat in

het ruw endoplasmatisch reticulum. Via binding door disulfide bruggen gaan twee

monomeren van TGF-β dimeriseren. Het pro-TGF-β dimeer wordt gekliefd en levert een klein

latent TGF-β complex (SLC) op; in de SLC zijn het latent geassocieerd peptide (LAP) en het

mature peptide aan elkaar gebonden via non-covalente bindingen. Door een covalente binding

met het latent TGF-β binding protein (LTBP) wordt het grote latente TGF-β complex (LLC)

7

verkregen. Het N-terminale gedeelte en het scharniergebied van LTBP interageren met

fibronectine, een extracellulaire matrix (ECM) component. Het C-terminale gedeelte vormt

een non-covalente binding met het N-terminaal gedeelte van fibrilline-1. LAP beschermt de

epitopen, die interageren met de receptor, in het mature eiwit en zorgt ervoor dat TGF-β in

zijn latente vorm aanwezig blijft. Aangezien TGF-β in deze latente vorm wordt gesecreteerd

in de ECM, moet deze eerst geactiveerd worden vooraleer het kan binden aan de signalisatie

receptoren. Het mechanisme, waarbij latent TGF-β wordt omgezet naar zijn actieve vorm, is

afhankelijk van het celtype en de context. Alle activerende mechanismen richten zich

weliswaar op LAP. Een eerste mechanisme is de binding van het multifunctioneel

gesecreteerd thrombospondine-1 aan LAP. Hierdoor worden de covalente bindingen tussen

deze laatste en het mature TGF-β verbroken. Een tweede, in vivo, mechanisme, voor TGF-β

activatie, is de binding van αvβ6 en αvβ8 aan een specifieke aminozuur sequentie (arginine-

glycine-aspartaat) van LAP. Finaal kunnen proteasen, die LAP klieven, aanleiding geven tot

activatie van matuur TGF-β [7]. Eens TGF-β geactiveerd is, kan deze binden aan drie

subtypes van celoppervlakte receptoren, gekend als receptor type I, II en III. Type I en II

receptoren zijn beide serine/threonine kinase receptoren die verschillen van elkaar door de

aanwezigheid van een glycine/serine rijk juxtamembranair domein (GS domein) in het type I

receptor. Na binding van de ligand aan de constitutief actieve type II receptor, wordt de type I

receptor gerecruteerd en getransfosforyleerd in het GS domein, waardoor zijn proteïne kinase

activiteit wordt gestimuleerd. De geactiveerde type I receptor propageert het signaal doorheen

de cel door fosforylatie van receptor gereguleerde Smads (R-Smads), Smad2 of Smad3.

Geactiveerde of gefosforyleerde R-Smads vormen heteromere complexen met Smad4 (Co-

Smad) en transloceren naar de nucleus, waar ze genexpressie controleren (Figuur 6) [15]. De

klassieke TGF-β signalisatie pathway, waarbij de Smad gemedieerde signalisatie cascade is

betrokken, wordt gekarakteriseerd door signalen die de extracellulaire matrix depositie

induceren (bv. collageen, elastine) en gelijktijdig de extracellulaire matrix degradatie

onderdrukken (bv. endogene weefsel inhibitoren TIMP1, TIMP-3) [3].

8

Figuur 6: Klassieke TGF-β signalisatie pathway [3] 1: initiatie van de pathway na binding van TGF-β aan een homodimeer van het type II TGF-β receptor (TGF-βRII) 2: autofosforylatie type II receptor 3: recrutering en transfosforylatie van type I receptor (TGF-βRI) 4: de geactiveerde type I receptor fosforyleert en activeert een receptor-Smad (R-Smad) 5: R-Smad bindt aan Co-Smad en transloceert het complex naar de nucleus 6+7: binding van transcriptionele cofactoren en vorming van een geactiveerd transcriptioneel complex, dat in staat is om transcriptie van profibrotische genen te induceren

De hypothese dat TGF-β signalisatie kan gebeuren via

alternatieve mechanismen wordt meer en meer als een

mogelijkheid beschouwd. Deze alternatieve mechanismen

omzeilen de sleutelmoleculen uit de klassieke pathway en

worden daarom de Smad onafhankelijke en alternatieve

TGF-β signalisatie pathway genoemd (Figuur 7). Deze

alternatieve pathway kan de sleutelmoleculen uit de

klassieke TGF-β pathway op verschillende manieren

omzeilen. Een eerste mogelijkheid is dat de signalen

direct door de type II receptor verspreid worden, zonder

tussenkomst van de type I receptor (1). De bevinding dat

de type I receptor, in afwezigheid van Smad activiteit,

toch nog signalen kan uitsturen (2), is een tweede manier

om de sleutelmoleculen te omzeilen. Een derde

mogelijkheid is dat R-Smad signalisatie naar parallele

pathways kan plaatsvinden zonder de betrokkenheid van

co-Smad (3). Finaal kunnen R-Smads geactiveerd worden

door andere signalisatie mediatoren. Deze signalisatie

mediatoren worden geactiveerd als antwoord op TGF-β, maar zijn niet het resultaat van een

directe interactie met TGF-β receptoren (4) [3].

Het is met andere woorden mogelijk dat veel van de downstream effecten van TGF-β

Figuur 7: Alternatieve TGF-β signalisatie pathway [3] 1: signalisatie in afwezigheid van type I TGF-β receptor (TGF-βRI) 2: signalisatie via TGF-βRI, onafhankelijk van Smad functie 3: signalisatie van R-Smads naar andere parallele pathways, onafhankelijk van co-Smad interactie 4: activatie van R-Smads als antwoord op TGF-β maar in afwezigheid van directe TGF-β receptor interactie

9

gemedieerd worden door een alternatieve pathway, waarbij er geen sprake is van Smad

gemedieerde transcriptionele activiteit [3].

2.3.2 TGF-β en erfelijke aorta-aneurysma aandoeningen

Uit recente studies is gebleken dat een veranderde TGF-β signalisatie mede aan de basis ligt

van aorta-aneurysma vorming. Deze studies hebben ook gezorgd voor een toenemende

interesse in hoe een bekende profibotrische groeifactor kan deelnemen aan een pathologisch

proces, die gekenmerkt wordt door extensieve matrix degradatie [3].

Bij patiënten met LDS werden heterozygote “loss-of-function” mutaties in zowel TGFBR1 als

TGFBR2 geïdentificeerd, wat initieel suggereerde dat het verlies van TGF-β signalisatie de

onderliggende oorzaak was van LDS. Echter, aortaweefsel bekomen van aangetaste patiënten

vertoonde verhoogde niveaus van collageen en CTGF; beide zijn goed beschreven indicatoren

van actieve TGF-β signalisatie [9,10]. Daarenboven vertoonde het aortaweefsel een

verhoogde nucleaire translocatie van fosfo-Smad2 [9,10]. Deze bevindingen suggereren een

toename, en niet een repressie, van TGF-β signalisatie; men spreekt van een paradoxale

opregulatie. De hypothese hierachter is dat, hoewel de mutante TGF-β receptoren mogelijks

minder in staat zijn om signalen door te geven, de wild type receptor (ook geëxpresseerd in

een heterozygoot individu) zijn acute responsiviteit voor TGF-β behoudt. Het is zelfs zo dat

de wild type receptor een verhoogde activiteit vertoont. Hoewel het moeilijk is om in te zien

dat kinase deficiënte TGF-β receptoren kunnen resulteren in een toename van TGF-β

signalisatie, zijn er enkele mogelijke mechanismen die deze paradoxale opregulatie kunnen

verklaren. Een eerste mogelijkheid is dat de paradoxale opregulatie, geobserveerd in

aneurysma syndromen geassocieerd met heterozygote TGF-β receptor mutaties, het resultaat

is van mutante receptoren. Deze mutante receptoren functioneren als bijkomende receptoren,

die de ligand binding vergemakkelijken. Een tweede mogelijkheid is dat de cellulaire

dynamieken van de receptor stabiliteit veranderd worden. Dit kan, bijvoorbeeld, aanleiding

geven tot een verlengde activiteit van TGF-β signalisatie, doordat de receptor langer aanwezig

blijft op de celmembraan. Finaal is het mogelijk dat de kinase-deficiënte receptoren, die

opgenomen worden in de TGF-β receptor complexen en op zich niet in staat zijn om direct te

signaliseren, hun vermogen behouden om functionele signalisatie platforms te vormen. Op

deze manier kunnen de deficiënte receptoren de interactie tussen andere kritische

intracellulaire signalisatie componenten mediëren [3].

In het geval van LDS, leiden compensatiemechanismen mogelijks tot een verhoogde TGF-β

signalisatie in de aorta media, wanneer TGFBR1 of 2 niveaus gedaald zijn wegens

pathologische “loss-of-function” mutaties [7].

10

De veranderde TGF-β signalisatie veroorzaakt enerzijds fragmentatie van de elastische vezels

en zorgt anderzijds voor een verlies van elastine in de aorta media. Deze twee factoren geven

aanleiding tot dilatatie en dissectie van de aortawand. Maar TGF-beta speelt ook een

prominente rol tijdens de embryonale ontwikkeling [16]. Het feit dat de aorta betrokken is bij

deze aandoeningen kan het gevolg zijn van de twee verschillende ontwikkelingsoorsprongen

(mesenchymaal en neurale lijst) van vasculaire gladde spiercellen (vSMCs) ter hoogte van de

aortaklep; deze hebben elke een specifiek antwoord op TGF-β signalisatie. Door de

verschillende ontwikkelingsoorsprongen worden twee nauw aangrenzende ringen, bestaande

uit verschillende vSMCs populaties, verkregen. De verbinding tussen deze vSMCs populaties

duidt mogelijks een gevoelige plaats aan voor aorta dissectie (Figuur 8) [7]. Niet enkel de

verschillende vSMCs populaties [7] hebben een specifiek antwoord op TGF-β signalisatie, dit

geldt ook voor verschillende celtypes (vSMCs, fibroblasten, endotheliale cellen) van de aorta

[3].

2.4 Muismodellen

2.4.1 Tgfbr1 muismodel

Bij het knock-out muismodel (Tgfbr1P

-/-P) P

Pwerd exon 3 van het Tgfbr1 gen verwijderd. Exon 3

bevat een transmembranair domein en een glycine-serine rijk domein, die essentieel is voor de

activatie van de TGF-β receptor 1 door TGF-β receptor 2. Om deze Tgfbr1P

-/- Pmuis te

verkrijgen, werden embryologische stamcellen, waarbij exon 3 verwijderd was, geïnjecteerd

in C57BL/6 blastocysten. Op deze manier werd germline transmissie van de nul mutatie

bekomen. De heterozygote muizen (Tgfbr1P

+/-P) zijn vruchtbaar en lijken fenotypisch normaal

te zijn tijdens de ontwikkeling zelf en ook hierna. Bij het genotyperen van de nakomelingen

van heterozygote kruisingen, werd opgemerkt dat de nakomelingen enkel uit heterozygote en

Figuur 8: Mogelijke gevoelige plaatsen voor het ontstaan van aorta dissectie [7] Aorta met twee naden van vasculaire gladde spiercellen (vSMCs) ter hoogte van de aortawortel en de truncus pulmonaris (PT). Donker roze zone: cardiale neurale-lijst-gederiveerde SMCs Paars: secundaire hart-zone-gederiveerde SMCs Blauw: secundaire hart-zone-gederiveerde myocardiale cellen

11

wild type muizen bestonden. De homozygote (Tgfbr1 P

-/- P) muizen sterven met andere woorden

tijdens de embryonale fase, meer bepaald op dag 10.5 postcoitum (dpc). Op dag 8.5 dpc zijn

de Tgfbr1P

-/- Pembryo’s nog niet te onderscheiden van de andere embryo’s. Maar vanaf 9.5 dpc

is er een zware groeiachterstand merkbaar; de homozygote embryo’s zijn kleiner, hebben

minder dan 20 somieten, zijn nog niet gedraaid of nog niet in het proces van het draaien. De

primaire doodsoorzaak, van de Tgfbr1P

-/- Pembryo’s, is een gereduceerde bloedcirculatie van de

dooierzak. De aanwezigheid van bloedvaten in de dooierzak van de homozygoot mutante

embryo’s toont aan dat de vorming van een primaire capillaire plexus mogelijk is

(vasculogenese), hoewel de resulterende vasculatuur defect is. Er worden dus wel

bloedvaatachtige structuren gevormd, maar deze lijken vergroot en broos, en bevatten weinig

rode bloedcellen. Het tekort aan vertakkingen van bloedvaten, in de placenta, toont aan dat het

vertakken van reeds bestaande bloedvaten (angiogenese) geïnhibeerd wordt. Ook de

endotheliale cellen, van de Tgfbr1P

-/- Pembryo’s, vertonen verschillende defecten. Men is bijna

zeker dat deze defecten te wijten zijn aan de Tgfbr1 nul mutatie, aangezien dat de weefsels

(dooierzak, placenta en neurale buis), die voornamelijk aangetast worden door de mutatie,

allemaal TGF-β expresseren; op het moment zelf of juist voordat het fenotype zichtbaar wordt

[17].

Dit muismodel vertoont een sterk gelijkend fenotype met de Tgfbr2 deficiënte muizen (zie

2.4.2).

2.4.2 Tgfbr2 muismodel

Het knock-out muismodel (Tgfbr2 P

-/-P) werd verkregen door het introduceren van een

getrunceerde mutatie upstream van de cytoplasmatische serine/threonine kinase domein, in

embryonale stamcellen van een muis. Hierdoor treedt er wel nog ligandbinding op maar zou

het hieropvolgende ligand-gemedieerd signaal uitgeschakeld moeten worden. De

heterozygoot mutante muizen (Tgfbr2 P

+/-P) zijn vruchtbaar en vertonen een normale embryonale

ontwikkeling. Genotypering van de nakomelingen toonden ook bij dit model aan dat de

homozygoot mutante muizen sterven in de uterus. Op dag 8.5 dpc zijn de Tgfbr2 deficiënte

embryo’s (Tgfbr2P

-/-P) niet te onderscheiden van de andere embryo’s. Rond 9.5 dpc vertonen de

homozygoot mutante embryo’s ernstige anemie van de dooierzak en een milde

groeiachterstand, maar hun morfologisch uitzicht is normaal. Histologische analyse van de

dooierzak, rond dit tijdstip, heeft defecten in de hematopoëse (verminderd aantal rode

bloedcellen) en de vasculaire ontwikkeling aangetoond [18]. Deze histologische bevindingen

zijn bijna volledig hetzelfde als bij de Tgfb1 knock-out embryo’s [19]. Rond 10.5 en 11.5 dpc,

vertonen de Tgfb2P

-/-P embryo’s een duidelijke groeiachterstand; mogelijks is dit een secundaire

12

effect van de dooierzak insufficiëntie. Op dag 13.5 dpc zijn er geen levende Tgfbr2 P

-/-P

embryo’s meer aanwezig in de uterus; in plaats van deze embryo’s worden geresorbeerde

deciduas geobserveerd [18].

Er kan geconcludeerd worden dat Tgfbr2 essentieel is voor de hematopoëse en vasculogenese

in de dooierzak, en voor de ontwikkeling van verschillende organen [18].

Aangezien de Tgfbr2P

-/-P muizen embryonaal sterven, kan er niet onderzocht worden welke

mogelijke afwijkingen aanwezig zijn bij deze mutante muizen. Daarom werd een conditioneel

knock-out Tgfbr2 muismodel ontwikkeld; Wnt1cre/Tgfbr2. Dit muismodel werd verkregen

door middel van kruising van een conditioneel Tgfbr2 allel met het Wnt1cre transgen, waarbij

exon 2 in Tgfbr2 gedeleteerd is, in de neurale lijstcellen. Neurale lijstcellen ontstaan op alle

axiale niveaus van de dorsale neurale buis, juist voor de sluiting van de neurale buis, en

migreren daarna naar perifere locaties. Tgfbr2 wordt in deze cellen geëxpresseerd ter hoogte

van het ectoderm en het mesenchym van de eerste faryngeale boog; in wild type embryo’s.

Bij Wnt1cre/Tgfbr2P

-/-P embryo’s is er nog expressie van Tgfbr2 detecteerbaar in het ectoderm

maar is er een sterke daling in de neurale lijstcellen, gederiveerd van het mesenchym. De

Wnt1cre/Tgfbr2P

-/-P muizen worden op een normaal tijdstip geboren, hebben een normale

grootte, maar lijden aan ernstige cardiovasculaire [20] en craniofaciale [21] malformaties; ze

sterven hierdoor in de onmiddellijke postnatale periode. De mutant homozygote embryo’s

vertonen een normale ontwikkeling tot en met 11.0 dpc. Vanaf 11.5 dpc treedt er faling op

van de vorming van het aorticopulmonaire (A/P) septum. Wnt1cre/Tgfbr2P

-/-P embryo’s van

12.5 dpc of ouder lijden aan persistente truncus arteriosus (PTA); dit is het resultaat van het

falen van de vorming van het A/P septum. Deze cardiovasculaire afwijking wordt gekenmerkt

door één enkel uitvloei bloedvat (truncus arteriosus) die het hart verlaat; terwijl bij wild type

Wnt1cre/Tgfbr2 embryo’s een ascenderende aorta en een truncus pulmonaris aanwezig zijn.

Deze homozygoot mutante embryo’s vertonen ook een onderbreking van de aortaboog tussen

de linker arteria carotis en de linker arteria subclavia. De ascenderende aorta vertakt wel in

carotiden, maar staat niet in verbinding met de dorsale (descenderende) aorta. De

craniofaciale manifestaties die, bij Wnt1cre/Tgfbr2P

-/-P muizen, voorkomen zijn een gespleten

(secundair) verhemelte, calvaria agenesis en andere schedeldefecten [21]. Met dit conditioneel

knock-out muismodel is aangetoond geweest dat een verstoorde TGF-beta signalisatie, door

een mutatie van Tgfbr2 in de neurale lijstcellen, leidt tot ernstige cardiovasculaire en

craniofaciale afwijkingen, en waarbij de homozygoot mutante muizen kort na de geboorte

sterven [20].

3. Materiaal en Methoden

3.1 Genotypering

3.1.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

3.1.1.1 Doelstelling

Door middel van polymerase chain reaction (PCR) kan men uitgaande van een minimale

hoeveelheid DNA een specifiek DNA-fragment exponentieel amplificeren.

PCR wordt hier toegepast voor het genotyperen van muizen en embryo’s. We willen via

directe sequenering van het geamplificeerde fragment nagaan of de c.1134C>A (p.Tyr378X)

mutatie al dan niet aanwezig is.

3.1.1.2 Principe

PCR bestaat uit 3 opeenvolgende stappen, namelijk

denaturatie, annealing en elongatie (Figuur 9). Tijdens

denaturatie wordt het dubbelstrengige template DNA

(dsDNA) omgezet in twee enkelstrengige DNA

(ssDNA) moleculen. Dit gebeurt onder invloed van

hoge temperaturen (94°C) waarbij de waterstofbruggen

tussen de twee strengen worden verbroken. De tweede

stap is annealing. Bij deze stap binden gen-specifieke

primers, kleine stukjes ssDNA, aan het complementair

ssDNA en vormen zo het startpunt voor de replicatie.

Dit gebeurt bij een temperatuur, die specifiek is voor de

gebruikte primers (54°C-66°C). Elongatie is de derde

en laatste stap van de PCR-cyclus. Hierbij wordt de

sequentie overgeschreven vanaf de primer in de 5’

richting. Het DNA-polymerase zorgt vanuit de primers

voor de aanmaak van de complementaire DNA-

strengen door middel van het inbouwen van

deoxyribonucleotide trifosfaten (dNTPs). Dit enzym

werkt het meest optimaal bij een temperatuur van 72°C.

denaturatie

annealing

elongatie

Deze drie stappen vormen één cyclus van de PCR-

reactie en worden +/-30 keer herhaald.

Figuur 9: PCR reactie [22] PCR is een techniek die bestaat uit meerdere cycli,waarbij elke cyclus bestaat uit 3 opeenvolgende stappen. Stap 1: denaturatie van dsDNA bij 94°C Stap 2: annealing of hybridisatie van gen-specifieke primers (op de figuur aangeduid in het rood en groen) bij 54°C-66°C Stap 3: elongatie bij 72°C

Om een PCR te laten doorgaan, zijn naast template DNA, primers en DNA-polymerase nog

13

andere elementen nodig. MgCl2 is een katalysator die zorgt voor de binding tussen DNA,

DNA-polymerase en dNTPs. Er wordt ook nog een buffer toegevoegd die zorgt voor een

optimale pH en zoutconcentratie.

Er wordt gebruik gemaakt van een TD (=Touch Down) PCR-programma, omdat de optimale

annealing temperatuur van de forward en reverse primers meer dan 2°C van elkaar

verschillen. Protocol zie bijlage pagina 48.

3.1.2 Caliper LabChip GX


LabChip voert automatisch een agarosegelelektroforese uit. Deze techniek wordt gebruikt om

DNA te scheiden op basis van grootte en dient ter controle van de amplificatie van het PCR-

product. Dit impliceert dat bij de blanco PCR, waaraan geen DNA werd toegevoegd, geen

bandje te zien mag zijn. Indien dit wel het geval is, heeft men contaminatie en moet de PCR

opnieuw uitgevoerd worden. Verder moet het bandje specifiek zijn en de correcte grootte

hebben.

3.1.2.2 Principe

Elektroforese is een techniek die gebruik maakt van de beweging van geladen moleculen in

een elektrisch veld. Aangezien DNA-moleculen, door de aanwezigheid van fosfaatgroepen,

een negatieve lading hebben zullen ze, wanneer ze in een elektrisch veld gebracht worden,

naar de positieve pool migreren. Wanneer DNA-moleculen in een agarosegel opgelost

worden, is de snelheid van hun beweging afhankelijk van hun lading, vorm en grootte. Grote

DNA-moleculen ondervinden meer weerstand dan kleine DNA-moleculen. Hierdoor migreren

korte DNA-fragmenten sneller dan lange fragmenten. In een agarosegel wordt het DNA

zichtbaar gemaakt met ethidiumbromide. Deze stof bindt aan DNA-moleculen door

intercalatie (ethidiumbromide moleculen binden tussen de basenparen van de DNA-helix).

Wanneer men dit geheel belicht met UV-straling krijgt men een oranjerode fluorescente kleur

te zien. Op deze manier kan de kwaliteit en de grootte van het bekomen PCR-product

gecontroleerd worden.

De Labchip GX is een microchip elektroforese-systeem waarmee DNA- en RNA-fragmenten

automatisch gescheiden kunnen worden van elkaar, aan hoge snelheid. De fluorescente

detectie is zeer sensitief (meer dan 10 keer sensitiever dan ethidiumbromide) [22].

Protocol zie bijlage pagina 51.

3.1.3 Sequenering


Via directe sequenering van het geamplificeerde fragment willen we nagaan of de c.1134C>A

14

(p.Tyr378X) mutatie al dan niet aanwezig is; met andere woorden of de muizen heterozygote

of homozygote dragers zijn van de mutatie, of dat de mutatie niet aanwezig is (wild type

muizen).

3.1.3.2 Principe

Sanger sequencing, ook wel dideoxy terminatie methode genaamd, wordt gebruikt om de

precieze nucleotiden volgorde van een DNA-fragment te bepalen. Het reactiemengsel bevat

het enzyme DNA-polymerase (voor de synthese van nieuwe strengen), een forward of reverse

primer, een overvloedige hoeveelheid van de vier dNTPs en een lage concentratie van

dideoxynucleotiden (ddNTPs) of chain terminators (elke ddNTP is voorzien van een eigen

fluorescente merker). Bij ddNTPs ontbreekt het 3’-hydroxyl-uiteinde waardoor, wanneer een

ddNTP toevallig wordt ingebouwd tijdens de elongatie, de verdere synthese meteen stopt.

Wanneer dit proces een aantal cycli heeft doorlopen, ontstaat er een mengsel van korte en

lange stukken DNA. Deze fragmenten zullen via capillaire elektoforese gescheiden worden,

op basis van hun grootte, en detectie van hun fluorescente signaal is mogelijk doordat op het

einde van de kolom een laserdetector aanwezig is.

De Genetic Service Unit (GSU) is een beschikbare sequeneringsfaciliteit in het Centrum

voor Medische Genetica Gent (CMGG). In het CMGG gebeurt de DNA-sequenering door

middel van de BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit van Applied Biosystems. De

PCR-producten en de forward en reverse primer dienen aan de GSU afgegeven te worden.

De opzuivering van het PCR-product gebeurt automatisch en de fragmenten worden

geanalyseerd op de toestellen of sequencers van Applied Biosystems, meer bepaald de ABI

PRISM® 3730XL Genetic Analyzer (ABI 3730) en ABI 3130 XL® Genetic Analyzer

(ABI3130) [22].

3.2 Embryologie

3.2.1 Doelstelling

Aangezien gebleken is dat Tgfbr1 homozygote muizen sterven tijdens de embryonale

ontwikkeling, wordt een embryologische studie uitgevoerd ten einde deze muizen te kunnen

karakteriseren. Meer bepaald zal nagegaan worden wat het lethale stadium is en zullen de

muizen morfologisch en immunohistologisch onderzocht worden. Deze bevindingen worden

dan vergeleken met heterozygoot mutante en wild type muizenembryo’s.

Dit onderdeel gebeurt in samenwerking met P. Cornillie van de faculteit dierengeneeskunde

(UGent).

15

3.2.2 Methode

Bij de embryologische studie wordt de zwangere muis geëuthanaseerd door cervicale

dislocatie. Er wordt een incisie gemaakt langs de ventraallijn en de baarmoeder wordt

verwijderd. Elke hoorn van de baarmoeder wordt gecontroleerd op de aanwezigheid van

embryo’s. Van elk embryo wordt een stukje weefsel (pootje) genomen voor verdere

genotypering (zie 3.1). Sommige embryo’s worden op zijn geheel, enerzijds in Bouin

gebracht voor het bekomen van paraffine coupes (zie 3.5), en anderzijds in vloeibare stikstof

voor genexpressie analyse (zie 3.7).


3.3 Beeldvorming

2.3.1 Vascular corrosion casting


Vascular corrosion casting (VCC) is een invasieve beeldvormingsmethode die hier wordt

gehanteerd voor de studie van het arterieel systeem, meer specifiek de aorta en de A. carotis

van zowel homozygote als heterozygote Tgfbr1 muizen. We zullen, meer bepaald, nagaan of

er een verbreding optreedt in de thoracale aorta en of er arteriële tortuositeit aanwezig is.

Dit onderdeel gebeurt in samenwerking met C. Casteleyn van de faculteit dierengeneeskunde

(UGent).

3.3.1.2 Principe

Bij vascular corrosion casting wordt een vloeibaar polymeer geïnjecteerd in de abdominale

aorta van de muis om een cast te creëren. Door toevoeging van een promotor en een

katalysator aan een monomere base (Batson), zal het polymeer verharden bij

kamertemperatuur. Een promotor wordt toegevoegd aan een katalysator om zijn deelname aan

een chemische reactie te verbeteren. Op zich heeft de promotor weinig tot geen katalytisch

effect. Na maceratie wordt finaal een plastieken replica van het arterieel systeem, een cast,

verkregen.


3.4 Aortaprelevatie

3.4.1 Doelstelling

Het bekomen van paraffine coupes (zie 3.5) en van gladde spiercellijnen (zie 3.6) afgeleid van

aortaweefsel voor verdere in vitro studies naar het onderliggend mechanisme en de gevolgen

16

van de verstoorde TGF-β signalisatie.

3.4.2 Methode

De aorta wordt gepreleveerd van het ascenderende deel (net boven het hart) tot aan de aorta

descendens ter hoogte van het middenrif met behoud van een deel van de 3 vertakkingen ter

hoogte van de aortaboog (a. brachiocephalica, a. carotis communis en a. subclavia). Voor het

bekomen van de paraffine coupes, die gebruikt worden voor lichtmicroscopisch en

immunohistochemisch onderzoek, gebruikt men de adventitia en de media van de aorta.

Bij gladde spiercelculturen wordt naast het vetweefsel, ook de adventitia verwijderd. Uit de

aorta media worden dan gladde spiercellen geïsoleerd en in cultuur gebracht, om er dan qPCR

analyse en expressiestudies van relevante genen uit de TGF-β signalisatieweg op uit te

voeren.


3.5 Paraffine coupes

3.5.1 Bekomen van paraffine coupes

3.5.1.1 Principe

Het gepreleveerde weefsel wordt gefixeerd in 4% paraformaldehyde/Bouin en vervolgens

bewaard in 70% ethanol. Fixatie van de gepreleveerde aorta’s is vereist om de structuur van

het weefsel voor een langere tijd te bewaren. Dit is noodzakelijk omdat dood weefsel gevoelig

is aan afbraak door celeigen enzymen (autolyse). Andere functies van fixatie zijn het

permeabel maken van membranen, zodat kleurstofmoleculen niet worden tegengehouden, het

tegengaan van het neerslaan of de vorming van crosslinks (dwarsverbindingen) tussen alle

macromoleculen, inhibitie van de groei van bacteria en schimmels, enzomeer.

Na fixatie kan het weefsel langere tijd bewaard worden in ethanol, zonder verlies van

epitopen.

De weefsels kunnen na dehydratatie ingebed worden in paraffine. Van de bekomen paraffine

blokjes kunnen dan secties gesneden worden die gebruikt kunnen worden voor kleuringen.


3.5.2 Immunohistochemische kleuring


Via immunohistochemische kleuring willen we enerzijds specifiek aantonen dat CTGF wordt

aangekleurd in het cytoplasma van de gladde spiercellen en anderzijds dat fosfo-Smad2

(pSmad2), de actieve vorm van het Smad2 proteïne, wordt aangekleurd in de kern van de

17

gladde spiercellen. We verwachten een hogere concentratie van zowel pSmad2 als CTGF in

de heterozygoot mutante muizen te zien, ten opzichte van de wild types, op basis van

literatuurgegevens [9,10].

3.5.2.2 Principe

Immunohistochemie maakt het mogelijk om welbepaalde biomoleculen in een weefsel

zichtbaar te maken onder een lichtmicroscoop. De kleuring van deze biomoleculen is

gebaseerd op de binding tussen een antigen en zijn antilichaam. Een primair antilichaam zal

het eiwit van interesse herkennen (in dit geval pSmad2 of CTGF). Dit antilichaam is

opgewekt in een diersoort verschillend van de muis, dit omdat er anders een aspecifieke

kleuring kan bekomen worden. De primaire antilichamen gebruikt in deze thesis zijn

opgewekt in een konijn en herkennen meerdere epitopen (polyclonaal antilichaam). Het

secundair antilichaam is opgewekt in een geit en herkent specifiek alle antilichamen opgewekt

in een konijn. Het secundair antilichaam is gelabeld met een biotine. Het vitamine biotine

heeft een heel sterke affiniteit voor het proteïne avidine. Aan het antigen-antilichamen

complex wordt vervolgens een avidine-biotine complex (ABC methode) toegevoegd dat reeds

gebonden is aan een enzyme (bv horse radish peroxidase) dat de kleurreactie zal

bewerkstellingen na toevoeging van zijn substraat, diaminobenzidine (DAB) peroxidase

(Figuur 10). Tijdens formaldehyde fixatie en het inbedden van weefsel in paraffine worden

cross-links tussen proteïnes gevormd die de antigenen kunnen maskeren. Na bewerking van

de secties met hitte en een antigen retrieval reagentia (Natrium-citraat of

ethyleendiaminetetraazijnzuur; EDTA) liggen de verborgen antigenen terug vrij zodat binding

met het antilichaam mogelijk is. Om eventuele vals positieve aankleuringen door endogene

peroxidasen tegen te gaan, is het beter het weefsel gedurende enkele minuten te incuberen met

waterstofperoxide (H202).

Er wordt ook gebruik gemaakt van BSA (bovine serum albumine) om niet-specifieke

bindingen van antilichamen of eiwitten tegen te gaan, zodat de achtergrondkleuring laag blijft.

Protocol zie bijlage pagina 55 en 57.

18

Figuur 10: ABC methode [23] 1: primair antilichaam bindt met antigen 2: binding van gebiotinyleerd secundair anitlichaam aan het antigen-antilichaam complex 3:binding van avidine-biotine complex (ABC) aan het secundair antilichaam

3.5.3 Lichtmicroscopische kleuring


Er wordt gebruik gemaakt van twee klassieke lichtmicroscopische kleuringen, namelijk

hematoxyline-eosine (H&E) en Verhoeff-Van Gieson (VVG). Deze klassieke kleuringen

worden toegepast op paraffine coupes afkomstig van zowel gepreleveerde aorta’s (VVG) als

embryo’s (H&E). Met de Verhoeff-Van Gieson kleuring willen we nagaan of er fragmentatie

optreedt van de elastine vezels. Hematoxyline-eosine kleuring wordt gebruikt om de

algemene morfologie van de embryo’s te bekijken.

3.5.3.2 Principe

Door opeenvolgend een kleuring, een differentiële kleuring en een tegenkleuring uit te voeren

worden, bij H&E-kleuring, de kernen van de gladde spiercellen blauw gekleurd en het

cytoplasma roze tot rood. Bij VVG worden de kernen van de gladde spiercellen blauw-zwart

gekleurd, de elastische vezels ook blauw-zwart, het collageen rood en de andere aanwezige

weefselelementen geel.

Protocol zie bijlage pagina 58 en 59.

3.6 Gladde spiercelculturen

3.6.1 Doelstelling

Gladde spiercelculturen worden aangelegd om RNA te isoleren (zie 3.7.1) ten einde qPCR uit

te voeren om de expressie van verschillende genen, die een rol spelen in de TGF-β signalisatie

pathway, na te gaan.

3.6.2 Principe

Uit de gepreleveerde aorta’s wordt met behulp van een enzymatische behandeling

19

(collagenase behandeling) gladde spiercellen geïsoleerd uit de media van de aorta. De cellen

worden vervolgens uitgezaaid en de celculturen worden onderhouden (cultuurmedium

verversen en confluente culturen splitsen) tot er voldoende cellen zijn voor RNA isolatie en

invries.


3.7 Genexpressie analyse

Figuur 11: Schema van de te doorlopen processen voor het uitvoeren van een qPCR experiment [24] Het RN pad (rood omkaderd) zal gevolgd worden voor het uitvoeren van de qPCR experimenten

A- 1. RNA isolatie zie 3.7.1

2. DNase behandeling zie 3.7.2 3. Reverse transcriptie (cDNA synthese) zie 3.7.3

3.7.1 RNA isolatie


RNA, geïsoleerd uit de gladde spiercelculturen, wordt, na DNase behandeling en cDNA

synthese, gebruikt voor het uitvoeren van genexpressie analyses.

3.7.1.2 Principe

RNA extractie (of isolatie) is de zuivering van totaal RNA uit biologische stalen (hier gladde

spiercelculturen). In deze thesis wordt er gebruik gemaakt van de RNeasy technologie voor de

zuivering van RNA. Deze technologie bestaat uit een combinatie van selectieve

bindingseigenschappen van de silica-gebaseerde membranen en de snelheid van microspin

technologie. De gladde spiercellen worden eerst gelyseerd en gehomogeniseerd waardoor

Rnases direct geïnactiveerd worden. Ethanol wordt toegevoegd zodat in optimale

bindingscondities kan gewerkt worden. De stalen worden dan overgebracht op een RNeasy

Mini spinkolom. Hier zal het totaal RNA binden aan de membraan en worden contaminanten

op een efficiënte manier weggewassen (Figuur 12). Met de RNeasy technologie worden alle

RNA moleculen die groter zijn dan 200 nucleotiden gezuiverd.

Na isolatie wordt de RNA concentratie gemeten met behulp van de Nanodrop.

20


Figuur 12: RNA isolatie methode [25] 1: lysis en homogenisatie van de gladde spiercellen 2: toevoegen van ethanol voor het verkrijgen van optimale condities 3: overbrengen van de RNA-stalen op de RNeasy Mini spinkolom 4: wasstappen voor het verwijderen van contaminanten 5: totaal RNA

1

1

1

2

3

4

5

3.7.2 DNase behandeling


De RNA-stalen worden behandeld met TURBO DNA-freeTM (Ambion®), om eventueel

contaminerend DNA te verwijderen en voor het verwijderen van het gebruikte DNase enzyme

en divalente kationen na de behandeling.

3.7.2.2 Principe

De TURBO DNA-freeTM (Ambion®) kit zal eventueel aanwezig contaminerend DNA uit de

RNA-stalen verwijderen en zal daarna ook DNase en divalente kationen, die aanwezig zijn

door de behandeling, verwijderen. Tijdens de behandeling wordt DNase toegevoegd om

ongewild dsDNA uit de RNA-stalen te verwijderen en te degraderen. DNase

(deoxyribenuclease) is een endonuclease dat DNA splitst in 5’ fosfodinucleotide en kleine

oligonucleotide fragmenten, door het verbreken van fosfodiësterbindingen.


21

3.7.3 cDNA synthese


Om RNA naar cDNA om te zetten maken we gebruik van de iScriptTM cDNA synthesis kit

(Bio-Rad #170-8891). Deze kit bevat iScript reverse transcriptase, die het RNA zal omzetten

naar cDNA. Het cDNA dient dan als input materiaal voor het uitvoeren van qPCR.

3.7.3.2 Principe

Door gebruik te maken van iScript reverse transcriptase wordt het voordien geïsoleerde RNA

overgeschreven tot cDNA (complementair DNA). Dit gebeurt tijdens het uitvoeren van een

RT-PCR (= reverse transcriptase PCR). RT-PCR is een variant van de klassieke PCR (zie

3.1.1). Het verschil, tussen RT-PCR en PCR, is dat de eerste stap bij RT-PCR bestaat uit

reverse transcriptie, waarbij de RNA streng omgekeerd overgeschreven wordt naar cDNA. Dit

is een belangrijke stap aangezien dat DNA-polymerase enkel kan binden aan een DNA

template. De hieropvolgende stappen zijn volledig gelijklopend met deze van de klassieke

PCR (zie 3.1.1.2)


3.7.4 qPCR


Aan de hand van kwantitatieve PCR willen we genexpressie analyses uitvoeren op

embryonale stalen en mRNA geëxtraheerd uit de gladde spiercelculturen.

3.7.4.2 Principe

Kwantitatieve of real-time PCR (qPCR) is een polymerase kettingreactie waarbij tijdens de

reactie zelf de kwantiteit van het product kan gemeten worden. Dit is mogelijk doordat bij de

reactie een fluorescente kleurstof wordt toegevoegd. De sterkte van het fluorescente signaal is

proportioneel met de kwantiteit van het gevormde product en met het aantal amplificatie

cycli. Gedurende de primaire cyclus is het fluorescent signaal te zwak en kan het niet van de

achtergrond onderscheiden worden. Door amplificatie van het product wordt een signaal

gegenereerd, die initieel exponentieel toeneemt. Na een welbepaalde tijd treedt er saturatie

van het fluorescente signaal op, doordat er een tekort is aan een kritische component.

Voorbeelden van kritische componenten zijn de primers, de dNTPs, of de fluorescente

kleurstof. In een typisch real-time PCR experiment satureren alle respons curves op hetzelfde

niveau. Het vertelt met andere woorden niets over de initiële hoeveelheid target moleculen die

in het staal aanwezig zijn.

Tijdens de groeifase van de reactie, gaan de response curves van verschillende stalen

uiteengaan. Dit reflecteert het verschil in hun initiële hoeveelheid template DNA. Het verschil

22

wordt gekwantificeerd door het aantal amplificatie cycli, noodzakelijk om een welbepaalde

fluorescente threshold te bereiken, te vergelijken. Het aantal cycli die nodig zijn om deze

threshold te halen, wordt de CT-waarde genoemd (Figuur 13) [24].

Figuur 13: Real-time PCR response curves [24] Het niveau van de threshold wordt voldoende boven de achtergrond ingesteld. CT = aantal cylci die noodzakelijk zijn om de threshold te bereiken.

Voor de uitvoering van het qPCR experiment wordt gebruik gemaakt van de LightCycler 480

van Roche. De genexpressie analyse gebeurt met qbasePLUS (Biogazelle).


23

4. Resultaten

4.1 Tgfbr1 muismodel

4.1.1 Ontwikkeling Tgfbr1 muismodel

Knock-in muismodellen worden vaak gebruikt om de functie van een gen te achterhalen of

het ziektebeeld gepaard gaande met een mutatie in dit gen beter te begrijpen. Een knock-in

muismodel kan gegenereerd worden onder meer met behulp van chemische mutagenese. ENU

(N-ethyl-N-nitrosourea) mutagenese veroorzaakt, at random, enkelvoudige basenpaar mutaties

door directe alkylatie van de nucleïnezuren. ENU kan zijn ethylgroep overbrengen op zuurstof

of stikstof radicalen van het DNA. Gedurende DNA-replicatie veroorzaken deze geëthyleerde

basenparen mispairing; op deze manier worden puntmutaties geïntroduceerd (Figuur 14) [26].

Het Tgfbr1 muismodel werd ontwikkeld in samenwerking met Ingenium (INGENOtyping®

technologie). Zij beschikten over een muriene zaadcellendatabank waarin mutaties in het

Tgfbr1 gen aangebracht zijn door middel van ENU mutagenese. Uit de verschillende

mogelijkheden werd gekozen voor de p.Y378X nonsense mutatie (c.1134C>A) gelegen in

exon 7. Deze nonsense mutatie is gelocaliseerd in één van de serine-threonine kinase

domeinen van de TGF-β receptor 1. De mutatie treft een aminozuurresidu dat sterk

geconserveerd is in verschillende species. Deze mutatie werd tevens gekozen op basis van

onze kennis over het Tgfbr2 muismodel (heterozygote muizen hebben cardiovasculair

fenotype en homozygoot mutante muizen zijn lethaal) [20]. De zaadcellen werden vervolgens

aangewend voor IVF (in-vitrofertilisatie). De mutatie werd geïntroduceerd in een C3HeB/FeJ

achtergrond en deze muizen moesten vervolgens nog 7 generaties teruggekruist worden naar

een C57Bl/6J (Black6) achtergrond. Deze laatste achtergrond zou zeer permissief zijn voor de

maximale expressie van de meeste mutaties en is een veel gebruikt model voor

cardiovasculaire aandoeningen.

24

4.1.2 Ziekteverloop Tgfbr1 muismodel

De Tgfbr1 knock-in muizen worden niet ziek en vertonen geen vroegere mortaliteit. Ze

planten wel minder snel voort en hebben in het algemeen kleinere litters (maximum 8 pups;

terwijl een normale litter gemiddeld 10 tot 12 pups bevat). Om de muizen verder te kruisen,

werden deze gegenotypeerd; enkel heterozygoot mutante muizen worden met elkaar gekruist

zodat homozygoot mutante muizen kunnen onstaan. Bij het genotyperen werd geobserveerd

dat geen homozygoot mutante muizen aanwezig waren.

4.2 Embryologie

Uit het ziekteverloop was reeds gebleken dat er geen homozygoot mutante muizen geboren

worden. Bijgevolg veronderstellen we dat deze muizen sterven tijdens de ontwikkeling. Een

eerste stap is dus het bepalen van het lethale tijdstip van de homozygoot mutante embryo’s

(zie 4.2.1). Voor dit onderdeel werden initieel 5 zwangere heterozygoot mutante muizen en

nadien nog eens 3 extra muizen, ter bevestiging, gebruikt. Verder werden er nog 3 zwangere

heterozygote muizen gebruikt voor zowel morfologisch (zie 4.2.1) als histologisch (zie 4.2.2)

onderzoek van de embryo’s. De bevindingen werden vervolgens vergeleken met heterozygoot

mutante en wild type muizenembryo’s.

Het bepalen van de leeftijd van de embryo’s gaat samen met de zwangerschapsbepaling van

de muis. De aanwezigheid van een vaginale plug wijst erop dat voortplangting heeft

plaatsgevonden. Nadat de koppels gevormd worden, wordt er elke ochtend gecontroleerd of er

een vaginale plug aanwezig is; de vaginale plug is niet meer zichtbaar 12 uren na de

bevruchting. Aangezien er wordt vanuit gegaan dat de voorplanting rond middernacht heeft

Figuur 14: ENU mutagenese [27] Deze figuur toont hoe puntmutaties

staan door ENU mutagenese. or het overbrengen van de ethylgroep, omstig van ENU, op de nucleïnezuren

van het DNA ontstaat er mispairing. Indien de mispairing niet hersteld wordt, zullen

ntmutaties ontstaan.

ontDoafk

pu

25

26

plaatsgevonden, is de leeftijd van de embryo’s ’s middags (van de dag waarop een vaginale

plug werd gevonden), 0.5 dagen postcoïtum (dpc).

De embryo’s werden op verschillende tijdstippen met elkaar vergeleken; 8.5 dpc, 9.5 dpc,

10.5 dpc, 11.5dpc en 12.5 dpc. Een overzicht van een normale embryonale ontwikkeling ten

opzichte van een afwijkende ontwikkeling is terug te vinden in bijlage (pagina 68).

Het onderdeel embryologie gebeurde in samenwerking met P. Cornillie van de faculteit

dierengeneeskunde (UGent).

4.2.1 Morfologisch onderzoek en bepaling lethale fase

4.2.1.1 8.5 dpc embryo’s

Embryo’s van 8.5 dagen postcoïtum komen overeen met het Theiler stadium 13. Dit stadium

wordt gekenmerkt door het draaien van het embryo. De draaiing wordt geïnitieerd in

embryo’s met 6-8 paar somieten en is voltooid in embryo’s met 14-16 paar somieten. Tijdens

dit stadium zijn in de eerste branchiale boog reeds mandibulaire en maxilaire componenten te

zien. Ook de tweede branchiale boog is zichtbaar; dit in tegenstelling met de derde branchiale

boog die nog volledig afwezig is. Verder zou regionalisatie van het hart ook opgemerkt

kunnen worden.

De embryo’s (homozygoot mutanten -/-, heterozygoot mutanten +/- en wild types +/+), die

wij onderzocht hebben op 8.5 dpc, zijn morfologisc

15). Uitwendig lijken alle vruchtjes op elkaar.

Figuur 15: embryo’s op dag 8.5 postcoïtum (muis 10-10938-05F) A: embryo 9 (+/+); B: embryo 4 (+/-); C: embryo 5 (-/-) 1: membraan van Reichert ; 2: kop ; 3: staart ; 4: allantoïs steel


9.5 dpc embryo’s komen overeen met het Theiler stadium 14-15. Theiler stadium 14 wordt

gedefineerd door het sluiten van de rostrale uiteindes van de neurale buis; in embryo’s met

meestal 15-18 paar somieten. Verder treedt er ook vorming en sluiting op van de anterieure

neuroporus. De posterieure neuroporus wordt meer tegen het einde van Theiler stadium 15

1

2

4x A B

3 4

4x4xC

1 2

3

4

h niet van elkaar te onderscheiden (Figuur

2

3

4

27

gevormd en de voorste lidmaatknop wordt zichtbaar. Bij embryo’s met 14 somieten worden

intersomitische vaten zichtbaar. Het vertakken van deze vaten en het met elkaar in contact

komen, vindt plaats bij embryo’s met 16 somieten. Op het einde van stadium 15 zijn de

voorhersenen opgesplitst in telencephalon en diëncephalon.

Homozygoot mutante embryo’s van 9.5 dpc beginnen zich te onderscheiden van de

heterozygoot mutante en wild type embryo’s (Figuur 16). Deze embryo’s vertonen reeds een

kleine groeiachterstand, en lijken minder ontwikkeld. Bij sommige embryo’s zijn zelfs enkel

vliezen zichtbaar (Figuur 17).

Er wordt verondersteld dat de afwijkende embryo’s homozygoot mutant zijn. Toch bleek

soms, na genotypering van de embryo’s, dat het hier om een heterozygoot mutant of wild type

embryo ging. Dit is mogelijk aangezien dat sterven van sommige embryo’s een onderdeel is

van de normale ontwikkeling. Een tweede mogelijkheid is dat er contaminatie van het

materneel DNA is opgetreden bij het nemen van een embryonaal staal (ingeval

genotyperingsresultaat heterozygoot mutant was).

Figuur 16: embryo’s op dag 9.5 postcoïtum (muis 10-10267-01F) A: embryo 4 (+/+); B: embryo 7 (+/-) 1: oogblaasje; 2: 1ste kieuwboog; 3: 2de kieuwboog; 4: oorblaasje Embryo 7 is meer ontwikkeld dan embryo 4 (oogblaasje is echt een blaasje)

Figuur 17: embryo 6 (-/-) op dag 9.5 postcoïtum (muis 10-10267-01F) Bij dit embryo zijn enkel vliezen zichtbaar

5x

5x

12

4

3

A B

5x

1

23 4


10.5 dpc embryo’s komen overeen met het Theiler stadium 16-17. Kenmerkend voor het

Theiler stadium 16 is de voltooiing van de sluiting van de posterieure neuroporus. Verder

wordt de achterste lidmaatknop zichtbaar op het niveau van de 23ste-28ste somiet. Het

uitdiepen van de lensplacode is kenmerkend voor het Theiler stadium 17. Tijdens dit stadium

is de nasale placode nog niet aanwezig, maar is er een geavanceerde ontwikkeling van de

hersenbuis en wordt de staart langer en dunner.

Op 10.5 dpc zijn naast embryo’s met een grote onwikkelingsachterstand (Figuur 18B) ook

embryo’s aanwezig die reeds gestorven zijn. Bij homozygoot mutante embryo’s is een

duidelijk vergroot pericard te zien en is er over het algemeen ook minder doorbloeding; geen

roodkleurige vaten te zien. Deze embryo’s zijn in het algemeen kleiner en bevinden zich

minder ver in de ontwikkeling; er hebben zich nog geen lidmaatsknopen gevormd.

stcoïtum A: embryo 3 (+/+) (muis 10-12221-04F); normale ontwikkeling voor dit tijdstip B: embryo 2 (+/-) (muis 10-10361-06F); een normale ontwikkeling voor dit tijdstip C: embryo 6 (-/-) (muis 10-10361-06F); grote ontwikkelingsachterstand en een vergroot pericard (aangeduid met pijl)


11.5 dpc embryo’s komen overeen met het Theiler stadium 18-19. Theiler stadium 18 wordt

gekenmerkt door een snelle groei van de hersenen, de vorming van de nasale put en het feit

dat de somieten in de cervicale regio niet meer zichtbaar zijn. Tijdens stadium 19 gaat de

lensvesikel zich volledig sluiten en zich beginnen afscheiden van het ectoderm. Ook de

perifere grenzen van het toekomstige oog worden gedefinieerd. Verder worden de voorste

ledenmaten verdeeld in twee regio’s; de toekomstige ‘armen’ en ‘benen’ en de ‘hand- en

voetplaat’. 11.5 dpc embryo’s hebben 45-47 paar somieten.

De 11.5 dpc embryo’s zijn of levend en normaal ontwikkeld (heterozygoot mutante of wild

type embryo’s) of gestorven (overgrote meerderheid)/ sterk onderontwikkeld (homozygoot

B C 3.2x

2.5x

Figuur 18: embryo’s op dag 10.5 po

A 2x

28

29

mutante embryo’s) (Figuur 19). Figuur 19C toont een homozygoot mutante embryo dat een

grote ontwikkelingsachterstand heeft; het embryo is nog niet volledig gedraaid en is nog in

het proces van draaiing, het bezit een enkelvoudig buisvormig hart, maar het hart klopt wel.

Figuur 19: embryo’s op dag 11.5 postcoïtum A: embryo 3 (+/+) (muis 10-12456-05F); goed ontwikkeld (en levend) embryo met rijke doorbloeding. B: embryo 3 (+/-) (muis 10-12456-03F); goed ontwikkeld (en levend) embryo met duidelijk zichtbare bloedtoevoer naar allantoïs (1) en dooierzak (2). C: embryo 4 (-/-) (muis 10-10938-06F); embryo nog in proces van draaiing; enkelvoudig hart, buisvormig;


Embryo’s op dag 12.5 postcoïtum worden ingedeeld in het Theiler stadium 20. In dit stadium

vindt men de vroegste tekenen van ‘vingers’ terug. De anterieure voetplaat is ook niet langer

circulair en de posterieure voetplaat kan onderscheiden worden van het onderste deel van de

toekomstige achterpoot. Er treedt ook pigmentatie van de retina op en de tong en

hersenvesikels zijn zichtbaar.

De 12.5 dpc embryo’s zijn of levend en normaal ontwikkeld (heterozygoot mutante of wild

type embryo’s) (Figuur 20) of volledig geresorbeerd (homozygoot mutante embryo’s) (Figuur

21). Op de figuur 20A is een duidelijke doorbloeding van de dooierzak te zien; in

tegenstelling tot homozygoot mutanten. De ‘vingers’ van het embryo en de aflijning en

pigmentatie van de lensplacode zijn ook duidelijk zichtbaar (Figuur 20B).

Figuur 20: embryo’s op dag 12.5 postcoïtum A: embryo 3 (+/+) (muis 10-11927-00F); goed ontwikkeld (en levend) eB: embryo 2 (+/-) (muis 09-11955-05F); goed ontwikkeld (en levend) C: embryo 1 (+/-) (muis 09-11955-05F); discoïde placenta (a), amnion (b

B

a

b

c

mbryo embryo

) en dooierzak (c)

C 2.5x

A B C 3.2x1.25x1.25x

A 1.6x 2.5x

30

Figuur 21: embryo 3 (-/-) op dag 12.5 postcoïtum (muis 09-11955-05F) A: dooierzak (a), placenta (b) B: doorsnede: de vliezen zijn zichtbaar (aangeduid met pijl), maar geen embryo

4.2.2 Histologie

Histologisch onderzoek gebeurt door de paraffine coupes, bekomen van de embryo’s, te

kleuren met hematoxyline en eosine (H&E). Preliminaire resultaten toonden aan dat wild type

en heterozygoot mutante embryo’s er histologisch hetzelfde uit zien (Figuur 22A en 22B).

Een duidelijk verschil is waarneembaar met de homozygoot mutante embryo’s waar structuur

volledig ontbreekt en er duidelijk apoptose van cellen reeds optreedt (Figuur 22C).

Figuur 22: hematoxyline en eosine kleuring op 11.5 dpc embryo’s (muis 10-12456-03F) A: embryo 1 (+/+); B: embryo 2 (+/-); C: embryo 3 (-/-)

4.3 Vascular corrosion casting

Vascular corrosion casting, een invasieve beeldvormingstechniek, wordt gebruikt om het

natuurlijk verloop met betrekking tot cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit van zowel

heterozygote als wild type Tgfbr1 muizen te bestuderen. Dankzij de vascular corrosion casting

techniek kan men de arteriën onderzoeken op abnormaliteiten. Aangezien het Loeys-Dietz

syndroom voornamelijk gekenmerkt wordt door aneurysma’s ter hoogte van de carotiden en

de thoracale aorta, en door algemene arteriële tortuositeit [9,10,28], wordt er nagegaan of er

een verbreding optreedt in de thoracale aorta en of er arteriële tortuositeit aanwezig is. Voor

dit onderdeel werden 6 heterozygoot mutante en 6 wild type muizen gebruikt; de muizen

A B

ab

2.5x2.5x

A B C 4x 4x4x

waren 6 en12 maanden oud.

Na het vrijprepareren van de aortaboog, van de cast, kon deze onderzocht worden op

eventueel aanwezige aneurysma’s. Ook de carotiden werden vrijgeprepareerd, zodat deze

onderzocht konden worden op arteriële tortuositeit. Er was geen verschil waarneembaar

tussen wild type en heterozygoot mutante muizen (Figuur 23 en 24); Tgfbr1+/- muizen

vertoonden geen aneurysma’s van de aorta en er was ook geen arteriële tortuositeit

waarneembaar. De observaties zijn hetzelfde voor de 6 maanden oude muizen (Figuur 23) en

de 12 maanden oude muizen (Figuur 24).

Deze resultaten zijn representatief voor de andere casts.

Figuur 23: vascular corrosion casts van 6 maanden oude muizen A: muis 10-10064-07F; +/+ B: muis 10-10265-08M; +/- Er zijn geen aneurysma’s van de aorta aanwezig en er is geen sprake van arteriële tortuositeit bij de heterozygoot mutante muis, in vergelijking met de wildtype muis.

Figuur 24: vascular corrosion casts van 12 maA: muis 09-12063-07M; +/+ B: muis 09-11798-02F; +/- Er zijn geen aneurysma’s van de aorta aanwezig en er i heterozygoot mutante muis, in vergelijking met de wildtype muis.

anden oude muizen

s geen sprake van arteriële tortuositeit bij de

A B

A B

31

4.4 Genexpressie analyse

4.4.1 Aortaprelevatie en gladde spiercelculturen

Voor dit onderdeel werden bij 6 heterozygoot mutante (+/-) en 6 wild type muizen (+/+) de

aorta gepreleveerd en dit op een leeftijd van 6 maanden en 12 maanden. Het is belangrijk om,

tijdens de prelevatie van de aorta, zo steriel mogelijk te werken en zo contaminatie van

pathogene micro-organismen te vermijden. Voor het bekomen van gladde spiercelculturen

moet niet enkel het vetweefsel rond de aorta verwijderd worden, maar ook de adventitia.

Indien nog een deeltje van de adventitia zou aanwezig zijn bij het starten van de cultuur, is het

mogelijk dat de fibroblasten (aanwezig in de adventitia) de gladde spiercellen gaan

overgroeien. Uiteindelijk worden gladde spiercelculturen, vanuit de aorta media, opgestart.

Tijdens het onderhouden van de gladde spiercelculturen is het ook belangrijk om zo steriel

mogelijk te werken. Dit verhindert mogelijke bacteriële contaminaties maar ook de groei van

schimmels in de celculturen. Om zeker te zijn dat de bekomen gladde spiercelculturen niet

gecontamineerd waren met bacteriën, werden enkele culturen gescreend op de aanwezigheid

van mycoplasma; dit gebeurde steekproefsgewijs. Mycoplasma infecties zijn een ware plaag

bij celculturen, aangezien ze de resultaten van experimenten kunnen vertroebelen. In ons

geval toonde de test aan dat de onderzochte gladde spiercelculturen niet besmet waren met

mycoplasma.

Isolatie van RNA uit de gladde spiercelculturen werd uitgevoerd, vanaf het moment dat er van

elk staal (elke gepreleveerde aorta) minstens twee T75s ter beschikking waren. De cellen,

afkomstig van deze 2 stalen, werden gesplitst en overgebracht naar vier P60s. Deze vier stalen

werden vóór RNA isolatie elk op een verschillende manier behandeld; CHX en TGF-β

stimulatie (+/+), enkel CHX stimulatie (+/-), enkel TGF-β stimulatie (-/+), of geen

behandeling (-/-). CHX (cycloheximide) is een organische verbinding die de translatie bij

eukaroyte cellen blokkeert. Het gevolg is dat de eiwitsynthese wordt stopgezet waardoor de

celgroei wordt geïnhibeerd en uiteindelijk celdood optreedt. CHX inhibeert ook nonsense-

mediated mRNA decay (NMD); het is deze functie die van belang is in dit onderzoek.

Nonsense mutaties kunnen in sommige gevallen premature terminatie codons (PTC)

genereren. Deze PTCs kunnen degradatie van mRNA veroorzaken via een post-

transcriptioneel mechanisme, nonsense-mediated mRNA decay (NMD) genaamd. NMD

wordt beschouwd als een kwaliteitscontrole gebaseerde pathway die de expansie van

schadelijke getrunceerde polypeptiden voorkomt. De translatie inhibitor CHX is gekend om

zijn functie om NMD te onderdrukken, en wordt daarom gebruikt als bewijs voor de

32

betrokkenheid van de NMD-pathway [29]. Met TGF-β stimulatie willen we achterhalen of de

downstream gelegen genen, betrokken in de TGF- β pathway, overgeëxpresseerd worden.

Na achtereenvolgens RNA isolatie, DNase behandeling en cDNA synthese kunnen de stalen

gebruikt worden voor genexpressie analyse.

4.4.2 qPCR

4.4.2.1 Ontwerpen van primers

Vooraleer te kunnen beginnen met genexpressie analyse moeten primers ontworpen worden.

Dit kan aan de hand van twee verschillende databanken; met RTprimerDB [30] of Primer3

Input (version 0.4.0) [31]. RTprimerDB is een databank speciaal gecreëerd voor het

ontwerpen van primers voor real-time PCR. Enkel de gennaam en het organisme (in dit geval

mus musculus) moeten ingevuld worden, en de database geeft een automatisch overzicht van

mogelijke primers [30]. Bij Primer3 moeten de exonsequenties, van het gen waarvoor primers

ontworpen worden, manueel ingegeven worden. De voorwaarden, waaraan de primers moeten

voldoen, kunnen aangepast worden. Ingestelde voorwaarden zijn een GC gehalte tussen 20 en

80, een smeltemperatuur rond de 60°C, de lengte van het PCR product tussen 50 en 150

basen, een maximale 3’ stabiliteit (de laatste 5 basen) van 7, maximaal aantal mononucleotide

herhalingen van 4, en de thermodynamische parameters van Breslauer 1986. Vervolgens

selecteert Primer3 primers die voldoen aan de vooropgestelde voorwaarden [31]. Maar niet

elke voorgestelde primer is een goede primer. Goede primers moeten aan drie additionele en

belangrijke voorwaarden voldoen: ze mogen geen SNPs (single nucleotide polymorphisms)

bevatten, er mogen geen secundaire structuren aanwezig zijn en ze moeten een zo hoog

mogelijke specifiteit hebben. De primers controleren op de aanwezigheid van SNPs gebeurt

aan de hand van Ensembl Genome Browser [32]. De aanwezigheid van secundaire structuren

kan achterhaald worden via RTprimerDB; in silico evaluation [30] of via DINA melt [33].

Via NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [34] kan de specifiteit van de

primers voor de sequentie nagegaan worden.

In deze thesis werden primers met een lengte van 20 basenparen of meer, die rond de exonen

(inclusief de intron-exon grenzen) gelegen waren, ontworpen voor volgende genen: Tgfbr1,

Tgfb1, Ctgf, Eln, Mmp2, Fn1, Smad6 en Smad7 (zie bijlage pagina 69).

4.4.2.2 Optimalisatie van primers

Optimalisatie van primers gebeurt door een qPCR experiment uit te voeren met de primers op

murine referentie cDNA (protocol zie bijlage pagina 71). Er wordt gebruik gemaakt van de

LightCycler 480 van Roche. Evalutie van de amplificatie efficiëntie van de primers gebeurt

met de software qbasePLUS. Een goede primer zal een E-waarde hebben tussen 1.9 en 2.1 en

33

r2 zal zo dicht mogelijk bij 1 liggen. Als voorbeeld wordt de amplificatie efficiëntie grafiek

voor Tgfbr1 weergegeven (Figuur 25). Om de effectieve genexpressie analyse te kunnen

uitvoeren zijn naast de genen van interesse, ook referentiegenen nodig. Huishoudgenen

worden vaak gebruikt als referentiegenen. Als referentiegenen hadden wij gekozen voor

Hprt1, Gadph, Tuba1a, Ywhaz en B-line. Na analyse van de amplificatie efficiëntie bleek dat

Ywhaz geen goed referentiegen was. De overige referentiegenen werden gebruikt in de

effectieve qPCR analyses, maar enkel de B-line primers gaven de gewenste uitkomst. Deze B-

line primers werden speciaal ontworpen voor qPCR analyse op murine DNA. De B-line

primers zijn gebaseerd op de B-line repeats, sequenties die frequent in verschillende murine

genen worden teruggevonden. Deze B-line repeats zijn vergelijkbaar met de Alu-repeats bij

mensen. Dankzij de B-line primers is het mogelijk om 100 tot 500 genen, die deze B-line

repeats bevatten, tegelijkertijd te amplificeren.

k op een verschillende manier

X stimulatie (+/-), enkel TGF-β

oheximide) inhibeert

e positief gestimuleerd werden met

die niet behandeld werden met CHX zal

vermoedelijk NMD optreden, met degradatie van het getrunceerde mRNA geproduceerd door

het mutante allel tot gevolg. We verwachten dat de analyse van het qPCR experiment van

Tgfbr1, met qbasePLUS, zal aantonen dat CHX positieve stalen een normale hoeveelheid

Tgfbr1 expresseren, doordat zowel het gemuteerd als het wild type Tgfbr1 allel geëxpresseerd

4.4.2.3 Genexpressie analyse van Tgfbr1

De stalen, die gebruikt zijn voor qPCR analyse, werden el

behandeld; CHX en TGF-β stimulatie (+/+), enkel CH

stimulatie (-/+), of geen behandeling (-/-) (zie 4.4.1). CHX (cycl

nonsense-mediated mRNA decay (NMD). In de stalen di

CHX wordt NMD geïnhibeerd, in de stalen

Figuur 25: Amplificatie efficiëntie grafiek Tgfbr1 De standaard curve, bekomen via qbasePLUS, geeft de amplificatie efficiëntie weer. De E-waarde (2.059) en r2 (0,999) zijn in het rood omkaderd. Voor de andere amplificatie efficiëntie grafieken, zie bijlage pagina 74.

34

35

wordt. Bij de CHX negatieve stalen verwachten we een verminderde expressie (50% reductie)

van Tgfbr1 te zien, aangezien dat NMD het gemuteerd mRNA zal degraderen.

We konden echter bij het beëindigen van deze thesis nog geen conclusie trekken betreffende

het al dan niet optreden van NMD, aangezien dat de stabiliteit van de referentie genen (B-line

primers) onvoldoende was. Verder onderzoek dient zich aan om dit probleem verder te

verklaren en op te lossen.

4.5 Kleuring van paraffine coupes

Voor het immunohistochemisch en lichtmicroscopisch onderdeel werden 2 heterozygoot

mutante (+/-) en 2 wild type (+/+) Tgfbr1 muizen gebruikt. De muizen waren 6 maanden en

12 maanden oud.

4.5.1 Algemene opbouw aortawand

De aorta is opgebouwd uit drie lagen: de tunica intima, de tunica media en de tunica

adventitia. De tunica intima is de binnenste laag en bestaat uit een enkelvoudige laag van

endotheelcellen. De tunica media, of de middelste laag, bestaat uit gladde spiercellen en uit

een extracellulaire matrix van collageen en elastine. Het collageen zorgt voor de stevigheid

van de aorta en terwijl de elastisciteit ervan verzorgd wordt door de aanwezigheid van

elastische vezels. De buitenste laag, of de tunica adventitia, bestaat uit fibreus bindweefsel

(Figuur 26). Aangezien de aorta behoort tot de groep van de elastische arteriën, is de tunica

media omvangrijker dan bij de andere arteriën.

nagaan of er al dan niet fragmentatie

uptie van de normale opbouw van de elastische

n de aorta en kan uiteindelijk leiden tot

4.5.2 Verhoeff-Von Gieson kleuring

Met de Verhoeff-Von Gieson (VVG) kleuring willen we

van de elastische vezels optreedt. De disr

vezels zorgt voor een verminderde flexibiliteit va

Figuur 26: opbouw van de aortawand [35] De aorta bestaat uit drie verschillende lagen: 1. tunica intima 2. tunica media 3. tunica adventitia (of externa)

aorta-aneurysma vorming en aorta dissectie.

In het algemeen is er geen verschil waarneembaar tussen Tgfbr1+/+ en Tgfbr1+/- muizen

(Figuur 27). Er treedt met andere woorden geen fragmentatie op van de elastische vezels bij

heterozygoot mutante muizen.

Deze resultaten zijn representatief voor de andere aorta’s, die met VVG gekleurd werden.

Figuur 27: Verhoeff-Von Gieson kleuring van de aorta A: Tgfbr1+/+ (muis 09-12105-02) B: Tgfbr1+/- (muis 09-12105-04) De zwart gekleurde structuren, zijn de elastische vezels (aangeduid met pijl) In de linker bovenhoek van de figuur is telkens de volledige aorta te zien.

4.5.3 Immunohistochemische kleuring

Met immunohistochemische kleuringen willen we aantonen dat, ondanks een mutatie in het

Tgfbr1 gen aanwezig is, die in principe zou leiden tot een verminderde TGF-β signalisatie, er

een paradoxale opregulatie is van de TGF-β signalisatie pathway. Dit willen we aantonen

door een verhoogde expressie van zowel Ctgf als pSmad2; beide genen zijn downstream

gelegen van de TGF-β signalisatie pathway [9,10]. We verwachten met andere woorden dat

de aorta’s, gepreleveerd uit de heterozygoot mutante Tgfbr1 muizen, een toename van Ctgf (in

het cytoplasma) en pSmad2 (in de kernen van gladde spiercellen) zullen vertonen.; in

vergelijking met de wild type muizen. Naast de weefsels die gekleurd waren met Ctgf of

pSmad2 antilichamen, werden er ook negatieve controles geïncludeerd (geen antilichaam).

In het algemeen is er geen verschil, in intensiteit en hoeveelheid kleuring van Ctgf,

waarneembaar tussen de Tgfbr1+/+ en Tgfbr1+/- muizen (Figuur 28). Er is dus geen toename

van Ctgf in het cytoplasma van de gladde spiercellen van heterozygoot mutante Tgfbr1

muizen.

Deze resultaten zijn representatief voor de andere, immunohistochemisch gekleurde, aorta’s.

A B 20x 40x

36

37

Figuur 28: Immunohistochemische kleuring van de aorta met Ctgf A: Tgfbr1+/+ (muis 09-12105-02) (1/200 verdunning van Ctgf antilichaam) B: Tgfbr1+/- (muis 09-12105-04) (1/200 verdunnig van Ctgf antilichaam) Beide figuren werden genomen op een 40x vergroting. Bij immunohistochemische kleuring, van de gepreleveerde aorta’s, met pSmad2 werd er ook

geen verschil geobserveerd tussen de Tgfbr1+/+ en Tgfbr1+/- muizen (Figuur 29). Er is met

andere woorden geen toename van pSmad2 in de kern van de gladde spiercellen van de

heterozygoot mutante Tgfbr1 muizen.

Deze resultaten zijn representatief voor de andere, immunohistochemisch gekleurde, aorta’s.

Figuur 29: Immunohistochemische kleuring van de aorta met pSmad2 a

n pg.

A B

A B

A: Tgfbr1+/+ (muis 09-12105-02) (1/200 verdunning vB: Tgfbr1+/- (muis 09-12105-04) (1/200 verdunnig vaBeide figuren werden genomen op een 40x vergrotin

n pSmad2 antilichaam) Smad2 antilichaam)

5. Bespreking

Het Loeys-Dietz syndroom (LDS) wordt gekenmerkt door agressieve en wijdverspreide

vasculaire manifestaties; arteriële tortuositeit en aorta-aneurysma’s met een hoog risico op

aorta dissectie of ruptuur op jonge leeftijd. Deze autosomaal dominante aandoening wordt

veroorzaakt door heterozygote ‘loss-of-function’ mutaties in het TGFBR1 en TGFBR2 gen

[9,10]. Niettegenstaande de verwachte resulterende reductie in TGF-β signalisatie wordt in de

aortawand van LDS patiënten een toename van de TGF-β signalisatie pathway gedetecteerd

[9,10,28]. Dit uit zich als de aanwezigheid van een grotere hoeveelheid pSmad2

(gefosforyleerd Smad2) in de aortawand van LDS patiënten [9,10,36], evenals een

toegenomen expressie van CTGF (connective tissue growth factor) [9,10,37]. Een belangrijk

kenmerk van de aneurysmale aorta is het voorkomen van cystische media degeneratie [28]

met fragmentatie van de elastische vezels [9,28].

Het doel van deze thesis is het nakijken hoe verlies van functie, door een mutatie in de TGF-β

receptor 1, kan leiden tot opregulatie van downstream signalisatie. Hiervoor werd in eerste

instantie een Tgfbr1 knock-in muismodel ontwikkeld waarin met behulp van chemische

mutagenese een nonsense mutatie (p.Y378X) werd geïntroduceerd in het Tgfbr1 gen.

5.1 Karakterisatie van Tgfbr1-/- embryo’s

Om homozygoot mutante muizen te verkrijgen, worden heterozygoot mutante muizen met

elkaar gekruist. Via genotypering werd bepaald welke muizen de mutatie dragen. Bij het

genotyperen observeerden we dat er geen homozygoot mutante muizen aanwezig waren in de

bekomen litters. Bijgevolg veronderstellen we dat deze muizen tijdens de embryonale

ontwikkeling sterven. Uit embryologisch onderzoek van de wild type (+/+), de heterozygoot

mutante (+/-) en de homozygoot mutante (-/-) embryo’s, is gebleken dat de embryo’s (+/+,+/-

of -/-) op tijdstip 8.5 dpc niet van elkaar onderscheiden kunnen worden. Vanaf 9.5 dpc is er

bij de homozygoot mutante embryo’s sprake van een toenemende groeiachterstand en

afwijkende ontwikkeling ten opzichte van heterozygoot mutante en wild type muizen. Zo

worden de homozygoot mutante muizen gekenmerkt door een vergroot pericard, zijn de

embryo’s nog niet gedraaid of nog aan het draaien, is er een verminderde doorbloeding van de

dooierzak en zijn er tegen 10.5 dpc nog geen lidmaatknopen waar te nemen. Op tijdstip 11.5

dpc zijn de meeste Tgfbr1-/- embryo’s gestorven; dit is de embryonale lethale fase. Op tijdstip

12.5 zijn homozygoot mutante embryo’s reeds volledig geresorbeerd.

38

Onze bevindingen rond het morfologisch onderzoek op embryo’s zijn in overeenstemming

met deze beschreven in de literatuur voor de Tgfbr1 knock-out muis [17]. Homozygoot

mutante Tgfbr1 knock-out embryo’s sterven rond 10.5 dpc, door een gereduceerde

bloedcirculatie in de dooierzak. Op tijdstip 8.5 dpc zijn de verschillende embryo’s niet van

elkaar te onderscheiden, en tegen 9.5 vertonen de Tgfbr1-/- embryo’s een zware

groeiachterstand; ze zijn kleiner, hebben minder dan 20 somieten en ze zijn nog niet gedraaid

of zijn nog net in het proces van het draaien. Deze abnormale ontwikkeling wordt verklaard

door dooierzak anemie en een defect in de vertakking van het bloedvatennetwerk tijdens de

embryonale ontwikkeling. Een vergroot pericard wordt ook waargenomen bij deze knock-out

muizen. De aanwezigheid van bloedvaten in de dooierzak van de homozygoot mutante

embryo’s toont aan dat de vorming van een primaire capillaire plexus mogelijk is

(vasculogenese), hoewel de resulterende vasculatuur defect is. Er worden dus wel

bloedvatachtige structuren gevormd, maar deze lijken vergroot en broos, en bevatten weinig

rode bloedcellen. Het tekort aan rode bloedcellen is niet te wijten aan een intrinsiek defect in

de hematopoëse, maar onstaat doordat de omgeving van de dooierzak differentiatie en

maturatie van de hematopoëtische precursoren niet toestaat. Het tekort aan vertakkingen van

bloedvaten, in de placenta, toont aan dat het vertakken van reeds bestaande bloedvaten

(angiogenese) geïnhibeerd wordt [17]. Verschillende mechanismen kunnen deze vasculaire

defecten veroorzaken. Vooreerst is het mogelijk dat een algemene toename in de

groeisnelheid of een gebrek aan TGF-β geïnduceerde inhibitie van de groei van endhotheliale

cellen kan bijdragen tot de uitzetting van de bloedvaten tijdens vasculaire ontwikkeling. Ten

tweede treedt er verminderde fibronectine productie op [17,38]. Het gevolg hiervan is een

inadequate distributie van ECM (extracellulaire matrix) componenten die de lagen van de

dooierzak destabiliseren, waardoor de vasculaire plexus niet de correcte ondersteuning krijgt.

Dit geeft aanleiding tot gedilateerde en broze bloedvaten [17]. De veranderde ECM

compositie kan ook dysregulatie van de endotheliale precursoren veroorzaken en dit draagt bij

tot het falen van angiogenese [17,38]. Ten derde kan verstoorde migratie van endotheliale

cellen aanleiding geven tot de afwezigheid van angiogenese; dit is hoogst waarschijnlijk de

hoofdreden voor de ontwikkeling van vasculaire defecten, gezien de chemotactische migratie

van endotheliale cellen een kritische gebeurtenis is in angiogenese [17]. Finaal kunnen

sommige bloedvaten een tekort aan VSMCs (vascular smooth muscles cells) vertonen door

een defect in de capaciteit van mesenchymale cellen om te differentiëren in VSMCs, als

antwoord op TGF-β signalisatie [17]. Hoewel de TGF-β signalisatie in VSMCs eerder

noodzakelijk is voor de finale ontwikkeling van bloedvaten; daar de initiële fase van

39

angiogenese plaatsvindt in de afwezigheid van TGF-β signalisatie [39].

TGF-β signalisatie in ECs (endotheliale cellen) is essentieel voor de precieze regulatie van

bloedvatvorming, en bijgevolge normale embryonale ontwikkeling. De verstoorde VSMCs

differentiatie is een direct gevolg van de functionele defecten in ECs [39].

Er is ook enige gelijkenis tussen ons Tgfbr1 knock-in muismodel en het knock-out Tgfbr2

muismodel [18]. Op dag 8.5 dpc zijn de Tgfbr2 deficiënte embryo’s (Tgfbr2-/-) niet te

onderscheiden van de andere embryo’s. Rond 9.5 dpc vertonen de homozygoot mutante

embryo’s ernstige anemie van de dooierzak en een milde groeiachterstand, maar hun

morfologisch uitzicht is normaal. Histologische analyse van Tgfbr2-/- dooierzakken, op

tijdstip 9.5 dpc, onthulde defecten in hematopoëse en vasculaire ontwikkeling. In wild type

dooierzakken zijn twee endotheliale lagen verbonden met mesotheliale en endodermale

cellagen. Deze vormen samen een capillair-achtig bloedvat, dat bloedcellen bevat. In

tegenstelling hiermee zijn de cellagen, bij Tgfbr2-/- dooierzakken, gedeeltelijk gescheiden van

elkaar en is het contact tussen de twee endotheliale cellagen niet compleet. Deze abnormale

structuur resulteert in de vorming van een uitgezet capillair bloedvat, dat minder rode

bloedcellen bevat. Rond 10.5 en 11.5 dpc, vertonen de Tgfbr2-/- embryo’s een duidelijke

groeiachterstand; mogelijks is dit een secundaire effect van de dooierzak insufficiëntie. Op

dag 13.5 dpc zijn er geen levende Tgfbr2-/- embryo’s meer aanwezig in de uterus; in plaats

van deze embryo’s worden geresorbeerde deciduas geobserveerd [18].

Preliminaire resultaten van histo-morfologisch onderzoek van de 11.5 dpc embryo’s, tonen

aan dat wild type en heterozygoot mutante embryo’s er histologisch in grote lijnen hetzelfde

uitzien. Een duidelijk verschil is waarneembaar met de homozygoot mutante embryo’s waar

structuur volledig ontbreekt en er duidelijk apoptose van cellen reeds optreedt. Doordat de

homozygoot mutante 11.5 dpc embryo’s zich te ver in het resorptie proces bevinden, kunnen

we geen duidelijke conclusie trekken rond de afwijkingen die optreden en zorgen voor

embryonale lethaliteit. Hiervoor zullen hematoxyline en eosine kleuringen moet uitgevoerd

worden op embryo’s die zich in een vroegere ontwikkelingfase bevinden; bijvoorbeeld 9.5

dpc. We hopen dat deze resultaten een beter beeld zullen geven rond de histologische

verschillen tussen heterozygoot mutante en wild type embryo’s enerzijds, en homozygoot

mutante embryo’s anderzijds.

5.2 Karakterisatie van Tgfbr1+/- muizen

Studie van het natuurlijk verloop van de heterozygoot mutante Tgfbr1 knock-in muizen toont

40

aan dat deze muizen niet ziek worden en geen vervroegde mortaliteit vertonen. Ze planten wel

minder snel voort en hebben in het algemeen iets kleinere litters (gemiddeld 5 pups en

maximum 8 pups; versus gemiddeld 10 tot 12 pups bij wild type muizen). De knock-out

muismodellen [17,18] zijn vruchtbaar, maar uit de artikels kan niet duidelijk opgemaakt

worden als er sprake is van een vermidnerde fertiliteit.

Aangezien dat de Tgfbr1+/- muizen drager zijn van een heterozygote nonsense mutatie, in het

Tgfbr1 gen, wordt verwacht dat ze dezelfde manifestaties vertonen, geassocieerd met LDS,

als gezien wordt in de patiënten. Uit de vascular corrosion casts, die uiteindelijk plastieken

replica’s zijn van het arterieel systeem van de muizen, blijkt echter dat deze heterozygote

Tgfbr1 muizen geen arteriële tortuositeit vertonen ter hoogte van de carotiden en de thoracale

aorta, noch aorta-aneurysma’s van de aortawortel, ascenderende aorta, aortaboog of

descenderende aorta. Deze resultaten zijn in overeenstemming met de bevindingen van niet-

invasieve beeldvormingstechnieken. Echocardiografie en µCT (micro computed tomography)

van de thoracale aorta konden geen aneurysma’s aantonen.

Histologische analyse van de aorta media, van de Tgfbr1+/- muizen, kon geen kenmerkende

fragmentatie van de elastische vezels aantonen. De aorta media van Tgfbr1+/- muizen

vertoont, na immunohistochemische kleuring, geen toename van pSmad2 in de kernen van de

gladde spiercellen, noch een toename van Ctgf in het cytoplasma in vergelijking met de wild

type Tgfbr1+/+ muizen. qPCR assays werden geoptimaliseerd, maar er zijn nog geen resultaten

voorhanden. Via de qPCR assays willen we uiteindelijk nagaan welke genen , betrokken in de

TGF- β signalisatie pathway, opgereguleerd zijn; aangezien het onderliggende mechanisme

van mutaties in TGFBR1 paradoxale opregulatie is. Hierbij willen we uiteraard nagaan of

Tgfb1 zelf een verhoogde expressie toont evenals genen betrokken in de signalisatie (Smad6

en Smad7), targetgenen van de TGF-β signalisatie (Ctgf) en genen die coderen voor ECM

(extracellulaire matrix) moleculen die essentieel zijn voor de opbouw van een elastische aorta

wand (Eln, Fn1, Col1a1, Col3a1 en Col5a1), genen die betrokken zijn bij matrixdegradatie

(Mmp2) en tenslotte Id Smad target genen (Id1, Id2, Id3 en Id4), die behoren tot een groep

van transcriptiefactoren en regulators.

Heterozygote p.Y378X muizen vertonen dus geen cardiovasculaire afwijkingen en

immunohistologie toont aan dat zij geen opgereguleerde TGF-β signalisatie hebben zoals

gezien wordt in patiënten. Het ontbreken van een fenotype kan verklaart worden door het

optreden van nonsense-mediated mRNA decay (NMD) in knock-in muizen; waarin een

truncerende mutatie is aangebracht. NMD is een controlepathway die de expansie van

schadelijke getrunceerde polypeptiden, die ontstaan bij de introductie van een nonsense

41

mutatie, voorkomt [29]. Transcripten die een prematuur terminatie codon (PTC) bevatten

worden via NMD gedegradeerd [40]. In dit specifieke geval betekent dit dat in de Tgfbr1+/-

muizen het mRNA afgeschreven van het gemuteerde allel, met het PTC, zal gedegradeerd

worden en dat dus enkel translatie zal optreden van het wild type allel. Tgfbr1 wordt, met

andere woorden, maar voor de helft geëxpresseerd. Aangezien de heterozygoot mutante

muizen normaal ontwikkelen en geen cardiovasculaire malformaties vertonen, geassocieerd

met LDS, kunnen we concluderen dat ondanks het feit dat er minder Tgfbr1 aangemaakt

wordt, dit toch voldoende is voor een normale cardiovasculaire ontwikkeling te garanderen.

Tot nog toe werden nog geen PTC TGFBR1 mutaties geïdentificeerd in patiënten met LDS.

Wel werden reeds missense mutaties en splice-site mutaties geïdentificeerd, deze mutaties

zouden aanleiding geven tot de expressie van (in theorie) 50% wild type receptor en 50%

mutante receptor. Deze mutante receptor heeft een dominant negatief effect en is

verantwoordelijk voor het fenotype. Het resultaat van de ingebrachte mutaties (bij knock-in of

knock-out muizen) geeft hetzelfde eindresultaat, namelijk de translatie van slechts één allel,

het wild type allel.

Onze bedoeling was om deze hypothese, het optreden van NMD, te bewijzen aan de hand van

genexpressie analyse van het Tgfbr1 gen. De hypothese van NMD is gebaseerd op de

algemeen aanvaarde “termination codon position” regel, die voorspelt dat, als het PTC niet

gelegen is binnen 50 nucleotiden van een exon-intron grens (splice junction) of in het laatste

coderende exon van een gen, er NMD optreedt [40]. De qPCR assay, voor Tgfbr1, dient

echter nog verder op punt gesteld te worden, aangezien we nog te kampen hebben met enkele

technische problemen. Tot één van deze technische problemen behoort de mogelijkheid dat de

integriteit en de zuiverheid (afwezigheid van inhibitoren) van het RNA niet voldoet om qPCR

experimenten te kunnen uitvoeren; hoewel steekproefsgewijs verkregen quality control data,

aantoonden dat het RNA van goede kwaliteit is wat betreft de intergriteit. We beschouwen dit

als een mogelijkheid aangezien de preliminaire resultaten aantoonden dat de replicates niet

voldeden aan de vooropgestelde voorwaarde, de Cq-waarde mag slechts 0.5 cycli verschillen;

deze waarde was in onze resultaten overschreden. Naast de kwaliteit van RNA, is het ook

noodzakelijk om na te gaan of de gebruikte B-line primer combinaties wel degelijk geschikt is

voor murine gladde spiercellen.

In het algemeen kunnen we concluderen dat het knock-in Tgfbr1 muismodel geen goed

dierenmodel is voor het Loeys-Dietz syndroom, aangezien er geen enkele van de

kenmerkende manifestaties, van LDS, worden teruggevonden in Tgfbr1+/- muizen. De

vooropgestelde algemene doelstelling, hoe mutaties in TGFBR1 kunnen leiden tot een

42

paradoxale toename van TGF-β signalisatie aan de hand van de studie van een knock-in

Tgfbr1 muismodel, kan niet behaald worden. Wel zijn de meer specifieke doelstellingen van

het onderzoek geadresseerd geweest. De studie van het natuurlijk verloop met betrekking tot

de cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit van zowel homozygote als heterozygote Tgfbr1

muizen, heeft aangetoond dat Tgfbr1-/- muizen embryonaal sterven op tijdstip 11.5 dpc. De

Tgfbr1+/- muizen vertonen geen cardiovasculair gerelateerde morbiditeit noch mortaliteit.

Immunohistochemische kleuringen hebben aangetoond dat noch pSmad2 noch Ctgf

opgereguleerd is. Tot slot hebben we aan de hand van invasieve beeldvorming (vascular

corrosion casting) van het cadiovasculair systeem aangetoond dat heterozygote Tgfbr1 muizen

geen arteriële tortuositeit vertonen ter hoogte van de carotiden en de thoracale aorta, noch

aorta-aneurysma’s van de aortawortel, ascenderende aorta, aortaboog of descenderende aorta.

5.3 Toekomstperspectieven

Verder histologisch onderzoek op embryo’s is aangewezen, aangezien dat uit onze resultaten

is gebleken dat 11.5 dpc Tgfbr1-/- embryo’s geen herkenbare structuren meer vertonen en er

reeds resorptie van het embryo optreedt. Het is aangeraden om het histologisch onderzoek uit

te voeren op jongere embryo’s, bijvoorbeeld 9.5 dpc, om meer inzicht te kunnen krijgen in

wat precies de onderliggende oorzaak is van de embryonale lethaliteit.

Verder zullen, éénmaal goede referentie primers gevonden zijn, de RNA integriteit en

zuiverheid verder werden onderzocht met additionele methoden en de assays geoptimaliseerd

zijn, de qPCR experimenten verdergezet worden om te achterhalen of er al dan niet nonsense-

mediated mRNA decay optreedt; via genexpressie analyse van Tgfbr1. Daarna zal via

genexpressie analyses ook nagegaan worden welke genen, betrokken in de TGF-β signalisatie

pathway en ECM, opgereguleerd zijn.

Bij LDS patiënten werden tot nu toe nog geen nonsense mutaties in TGFBR1 geïdentificeerd.

Recent werden echter de eerste nonsense en frameshift mutaties die leiden tot een prematuur

stopcodon in TGFBR1 geïdentificeerd in patiënten met MSSE (multiple self-healing

squamous epithelioma) [13]. MSSE wordt gekenmerkt door lokale invasieve huidtumoren die

snel groeien gedurende enkele weken en daarna spontaan regresseren, waarbij een litteken

achterblijft. De age of onset (8 tot 62 jaar) en de ernst van de aandoening (aantal tumoren en

progressie van tumorontwikkeling) zijn erg variabel [41]. Het fenotypisch verschil tussen

LDS en MSSE patiënten kan verklaard worden op basis van het type mutatie en de locatie. Bij

de MSSE patiënten werden de eerste missense, nonsense en frameshift mutaties beschreven in

43

44

het extracellulair domein van de type I receptor en werden truncerende mutaties

geïdentificeerd in het kinase domein [13]. Aangezien de Tgfbr1 muizen drager zijn van een

nonsense mutatie in één van de serine-threonine kinase domeinen van de TGF-β receptor 1, is

het aangewezen om te controleren of de heterozygoot mutante muizen MSSE ontwikkelen.

Dit zal mogelijk zijn door de huid, na het ontharen van de muizen, te controleren op de

aanwezigheid van huidtumoren. Doordat MSSE gekenmerkt wordt door een spontane

regressie van deze huidtumoren, zullen de muizen ook onderzocht moeten worden op de

eventuele aanwezigheid van littekens. Gezien de grote variabiliteit in age of onset van de

aandoening, zullen muizen van verschillende leeftijden onderzocht worden. Eventueel kan er

ook retrospectief gekeken worden naar de genomen PET (positron emissie tomografie) scans,

waarop tumor ontwikkeling zichtbaar zou moeten zijn.

6. Referentielijst

[1] Clouse WD, Hallett JW Jr, Schaff HV, Spittell PC, Rowland CM, Ilstrup DM, Melton LJ 3rd (2004). Acute

aortic dissection: population-based incidence compared with degenerative aortic aneurysm rupture. Mayo Clin

Proc. 79(2):176-80.

[2] Bergqvist D (2010). Aneurysms--from traumatology to screening. Ups J Med Sci. 115(2):81-7.

[3] Jones JA, Spinale FG, Ikonomidis JS (2009). Transforming growth factor-beta signaling in thoracic aortic

aneurysm development: a paradox in pathogenesis. J Vasc Res. 46(2):119-37.

[4] Bickerstaff LK, Pairolero PC, Hollier LH, Melton LJ, Van Peenen HJ, Cherry KJ, Joyce JW, Lie JT (1982).

Thoracic aortic aneurysms: a population-based study. Surgery. 92:1103-1108.

[5] Coady MA, Rizzo JA, Goldstein LJ, Elefteriades JA (1999). Natural history, pathogenesis, and etiology of

aortic aneurysms and dissections. Cardiol Clin. 17:615-635.

[6] Albornoz G, Coady MA, Roberts M, Davies RR, Tranquilli M, Rizzo JA, Elefteriades JA (2006). Familial

thoracic aortic aneurysms and dissections--incidence, modes of inheritance, and phenotypic patterns. Ann Thorac

Surg. 2006 82(4):1400-5.

[7] ten Dijke P, Arthur HM (2007). Extracellular control of TGFbeta signalling in vascular development and

disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 8(11):857-69.

[8] Van Hemelrijk C, Renard M, Loeys B (2010). The Loeys-Dietz syndrome: an update for the clinician. Curr

Opin Cardiol. 25(6):546-51.

[9] Loeys BL, Chen J, Neptune ER, Judge DP, Podowski M, Holm T, Meyers J, Leitch CC, Katsanis N, Sharifi

N, Xu FL, Myers LA, Spevak PJ, Cameron DE, De Backer J, Hellemans J, Chen Y, Davis EC, Webb CL, Kress

W, Coucke P, Rifkin DB, De Paepe AM, Dietz HC (2005). A syndrome of altered cardiovascular, craniofacial,

neurocognitive and skeletal development caused by mutations in TGFBR1 or TGFBR2. Nat Genet. 37(3):275-

81.

[10] Loeys BL, Schwarze U, Holm T, Callewaert BL, Thomas GH, Pannu H, De Backer JF, Oswald GL,

Symoens S, Manouvrier S, Roberts AE, Faravelli F, Greco MA, Pyeritz RE, Milewicz DM, Coucke PJ, Cameron

DE, Braverman AC, Byers PH, De Paepe AM, Dietz HC (2006). Aneurysm syndromes caused by mutations in

the TGF-beta receptor. N Engl J Med. 355(8):788-98.

[11] Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, Stephens K (1993-2011). GeneReviews.

[12] Stheneur C, Collod-Béroud G, Faivre L, Gouya L, Sultan G, Le Parc JM, Moura B, Attias D, Muti C,

Sznajder M, Claustres M, Junien C, Baumann C, Cormier-Daire V, Rio M, Lyonnet S, Plauchu H, Lacombe D,

Chevallier B, Jondeau G, Boileau C (2008). Identification of 23 TGFBR2 and 6 TGFBR1 gene mutations and

genotype-phenotype investigations in 457 patients with Marfan syndrome type I and II, Loeys-Dietz syndrome

and related disorders. Hum Mutat. 29(11):E284-95.

[13] Goudie DR, D'Alessandro M, Merriman B, Lee H, Szeverényi I, Avery S, O'Connor BD, Nelson SF, Coats

SE, Stewart A, Christie L, Pichert G, Friedel J, Hayes I, Burrows N, Whittaker S, Gerdes AM, Broesby-Olsen S,

Ferguson-Smith MA, Verma C, Lunny DP, Reversade B, Lane EB (2011). Multiple self-healing squamous

epithelioma is caused by a disease-specific spectrum of mutations in TGFBR1. Nat Genet. 43(4):365-9.

[14] Breckpot J, Budts W, De Zegher F, Vermeesch JR, Devriendt K (2010). Duplication of the TGFBR1 gene

causes features of Loeys-Dietz syndrome. Eur J med Genet. 53(6):408-10.

45

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Clouse%20WD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hallett%20JW%20Jr%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schaff%20HV%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Spittell%20PC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rowland%20CM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ilstrup%20DM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Melton%20LJ%203rd%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bergqvist%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jones%20JA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Spinale%20FG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ikonomidis%20JS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Albornoz%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Coady%20MA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Roberts%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Davies%20RR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tranquilli%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rizzo%20JA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Elefteriades%20JA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22ten%20Dijke%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Arthur%20HM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Van%20Hemelrijk%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Renard%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Loeys%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Loeys%20BL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chen%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Neptune%20ER%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Judge%20DP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Podowski%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Holm%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Meyers%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Leitch%20CC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Katsanis%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sharifi%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sharifi%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Xu%20FL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Myers%20LA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Spevak%20PJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cameron%20DE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22De%20Backer%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hellemans%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chen%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Davis%20EC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Webb%20CL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kress%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kress%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Coucke%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rifkin%20DB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22De%20Paepe%20AM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dietz%20HC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Loeys%20BL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schwarze%20U%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Holm%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Callewaert%20BL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Thomas%20GH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pannu%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22De%20Backer%20JF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oswald%20GL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Symoens%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Manouvrier%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Roberts%20AE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Faravelli%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Greco%20MA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pyeritz%20RE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Milewicz%20DM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Coucke%20PJ%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Braverman%20AC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Byers%20PH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22De%20Paepe%20AM%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stheneur%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Collod-B%C3%A9roud%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Faivre%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gouya%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sultan%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Le%20Parc%20JM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Moura%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Attias%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Muti%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sznajder%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Claustres%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Junien%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Baumann%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cormier-Daire%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rio%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lyonnet%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Plauchu%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lacombe%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chevallier%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jondeau%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Boileau%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Goudie%20DR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22D%27Alessandro%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Merriman%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lee%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Szever%C3%A9nyi%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Avery%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22O%27Connor%20BD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nelson%20SF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Coats%20SE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Coats%20SE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stewart%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Christie%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pichert%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Friedel%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hayes%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Burrows%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Whittaker%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gerdes%20AM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Broesby-Olsen%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ferguson-Smith%20MA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Verma%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lunny%20DP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Reversade%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lane%20EB%22%5BAuthor%5D

[15] Derynck R, Zhang YE (2003). Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-β family

signalling. Nature 425(6958):577-84.

[16] Aalberts JJ, van den Berg MP, Bergman JE, du Marchie Sarvaas GJ, Post JG, van Unen H, Pals G, Boonstra

PW, van Tintelen JP (2008). The many faces of aggressive aortic pathology: Loeys-Dietz syndrome. Neth Heart

J.16(9):299-304.

[17] Larsson J, Goumans MJ, Sjöstrand LJ, van Rooijen MA, Ward D, Levéen P, Xu X, ten Dijke P, Mummery

CL, Karlsson S (2001). Abnormal angiogenesis but intact hematopoietic potential in TGF-beta type I receptor-

deficient mice. EMBO J. 20(7):1663-73.

[18] Oshima M, Oshima H, Taketo MM (1996). TGF-beta receptor type II deficiency results in defects of yolk

sac hematopoiesis and vasculogenesis. Dev Biol. 179(1):297-302.

[19] Dickson MC, Martin JS, Cousins FM, Kulkarni AB, Karlsson S, Akhurst RJ (1995). Defective

haematopoiesis and vasculogenesis in transforming growth factor-beta 1 knock out mice. Development.

121(6):1845-54.

[20] Choudhary B, Ito Y, Makita T, Sasaki T, Chai Y, Sucov HM (2006). Cardiovascular malformations with

normal smooth muscle differentiation in neural crest-specific type II TGFbeta receptor (Tgfbr2) mutant mice.

Dev Biol. 289(2):420-9.

[21] Ito Y, Yeo JY, Chytil A, Han J, Bringas P Jr, Nakajima A, Shuler CF, Moses HL, Chai Y (2003).

Conditional inactivation of Tgfbr2 in cranial neural crest causes cleft palate and calvaria defects. Development.

130(21):5269-80.

[22] Centrum Medische Genetica Gent. http://medgen.ugent.be/CMGG

[23] Key M (2009). Dako guidebook, 5th edition.

[24] Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M, Forootan A, Jonák J, Lind K, Sindelka R, Sjöback R, Sjögreen B,

Strömbom L, Ståhlberg A, Zoric N (2006). The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27(2-

3):95-125.

[25] Qiagen (2010). RNeasy® Mini Handbook.

[26] Cordes SP (2005). N-ethyl-N-nitrosourea mutagenesis: boarding the mouse mutant express. Microbiol Mol

Biol Rev. 69(3):426-39.

[27] http://www.brc.riken.jp/lab/gsc/mouse/AboutUs/overview.htm

[28] Maleszewski JJ, Miller DV, Lu J, Dietz HC, Halushka MK (2009). Histopathologic findings in ascending

aortas from individuals with Loeys-Dietz syndrome (LDS). Am J Surg Pathol. 33(2):194-201.

[29] Montfort M, Chabás A, Vilageliu L, Grinberg D (2006). Analysis of nonsense-mediated mRNA decay in

mutant alleles identified in Spanish Gaucher disease patients. Blood Cells Mol Dis. 36(1):46-52.

[30] http://www.rtprimerdb.org/

[31] http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

[32] http://www.ensembl.org/index.html

[33] http://mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt

[34] http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

[35] http://www.promocell.com/products/human-primary-cells/endothelial-cells-large-vessels/

[36] Gomez D, Al Haj Zen A, Borges LF, Philippe M, Gutierrez PS, Jondeau G, Michel JB, Vranckx R (2009).

Syndromic and non-syndromic aneurysms of the human ascending aorta share activation of the Smad2 pathway.

46

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Derynck%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zhang%20YE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Aalberts%20JJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20den%20Berg%20MP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bergman%20JE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22du%20Marchie%20Sarvaas%20GJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Post%20JG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Unen%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pals%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Boonstra%20PW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Boonstra%20PW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Tintelen%20JP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Larsson%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Goumans%20MJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sj%C3%B6strand%20LJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Rooijen%20MA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ward%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lev%C3%A9en%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Xu%20X%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22ten%20Dijke%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mummery%20CL%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Karlsson%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oshima%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oshima%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Taketo%20MM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dickson%20MC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Martin%20JS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cousins%20FM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kulkarni%20AB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Karlsson%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Akhurst%20RJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Choudhary%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ito%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Makita%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sasaki%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chai%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sucov%20HM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ito%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yeo%20JY%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chytil%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Han%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bringas%20P%20Jr%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nakajima%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shuler%20CF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Moses%20HL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chai%20Y%22%5BAuthor%5D

http://medgen.ugent.be/CMGG

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kubista%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Andrade%20JM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bengtsson%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Forootan%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jon%C3%A1k%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lind%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sindelka%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sj%C3%B6back%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sj%C3%B6green%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Str%C3%B6mbom%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22St%C3%A5hlberg%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zoric%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cordes%20SP%22%5BAuthor%5D

http://www.brc.riken.jp/lab/gsc/mouse/AboutUs/overview.htm

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Maleszewski%20JJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Miller%20DV%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lu%20J%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Halushka%20MK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Montfort%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chab%C3%A1s%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vilageliu%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Grinberg%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.rtprimerdb.org/

http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

http://www.ensembl.org/index.html

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://www.promocell.com/products/human-primary-cells/endothelial-cells-large-vessels/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gomez%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Al%20Haj%20Zen%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Borges%20LF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Philippe%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gutierrez%20PS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jondeau%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Michel%20JB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vranckx%20R%22%5BAuthor%5D

47

J Pathol. 218(1):131-42.

[37] Wang X, LeMaire SA, Chen L, Shen YH, Gan Y, Bartsch H, Carter SA, Utama B, Ou H, Coselli JS, Wang

XL (2006). Increased collagen deposition and elevated expression of connective tissue growth factor in human

thoracic aortic dissection. Circulation. 114(1 Suppl):I200-5.

[38] Goumans MJ, Zwijsen A, van Rooijen MA, Huylebroeck D, Roelen BA, Mummery CL (1999).

Transforming growth factor-beta signalling in extraembryonic mesoderm is required for yolk sac vasculogenesis

in mice. Development. 126(16):3473-83.

[39] Carvalho RL, Itoh F, Goumans MJ, Lebrin F, Kato M, Takahashi S, Ema M, Itoh S, van Rooijen M,

Bertolino P, Ten Dijke P, Mummery CL (2007). Compensatory signalling induced in the yolk sac vasculature by

deletion of TGFbeta receptors in mice. J Cell Sci. 120(Pt 24):4269-77.

[40] Contet C, Dierich A, Kieffer BL (2007). Knock-in mice reveal nonsense-mediated mRNA decay in the

brain. Genesis. 45(1):38-43.

[41] Broesby-Olsen S, Bygum A, Gerdes AM, Brandrup F (2008). Multiple self-healing squamous epithelioma

of Ferguson-Smith: observations in a Danish family covering four generations. Acta Derm Venereol. 88(1):52-6.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wang%20X%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22LeMaire%20SA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chen%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shen%20YH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gan%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bartsch%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carter%20SA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Utama%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ou%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Coselli%20JS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wang%20XL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wang%20XL%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zwijsen%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Rooijen%20MA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Huylebroeck%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Roelen%20BA%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carvalho%20RL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Itoh%20F%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lebrin%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kato%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Takahashi%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ema%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Itoh%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Rooijen%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bertolino%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ten%20Dijke%20P%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Contet%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dierich%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kieffer%20BL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Broesby-Olsen%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bygum%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gerdes%20AM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brandrup%20F%22%5BAuthor%5D

Addendum: bijlagen

Protocols Muizenstaarten: DNA extractie

Materialen - staartpuntjes van muizen - TRIS-HCl (10mM)

o 0.0606g TRIS (Ultra Pure (pH7.5), 121.14g/mol; MPTM) in 50ml gedistilleerd water

o pH moeten tussen 8.0-8.5 liggen - strip (0.2ml; Thermo Scientific) - epjes (1.6ml; Thermo Scientific) - pipetten (pipetman, Gilson®) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.) - vortex (VWRTM International) - PCR-toestel (Applied BiosystemsTM) Methode

1. staartpuntjes van muizen overbrengen in nieuwe epjes 2. 50µl TRIS-HCl toevoegen 3. 15 seconden vortexen 4. 10 minuten incuberen bij 95°C 5. 15 seconden vortexen 6. supernatans (lysaat) afnemen en overbrengen in strip 7. staartpuntjes opnieuw invriezen

Embryo: DNA extractie Materialen

- HEBS buffer o 0.2ml 1M HEPES (Gibco®, Invitrogen) o 400mg NaCl (AnalaR Normapur) o 20mg KCl (74.55g/mol; Emsure® Merck) o 0.005g Na2HPO4 (137.99g/mol; Merck) o aanlengen tot 50ml met gedistileerd water

- lysis buffer o 2.5ml 20%SDS (Bio-Rad) o 0.372g EDTA (99+%; Sigma®) o 0.121g Tris Ultra Pure (pH7.5) (121.14g/mol; MPTM) o aanvullen tot 50ml met gedistilleerd water

- digestie oplossing o 2.5ml lysis buffer o 62.5µl proteïnase K (Qiagen®)

48

- mixture A o 2500µl phenol (>99%; Ambion®) o 2400µl chloroform (1.478kg/l; ucb) o 100µl isoamyl-OH (0.81kg/l; ucb)

- 3M NaOAc (pH5.2) o 12.3g 3M NaOAc in 50ml gedistilleerd water o op pH brengen (pH = 5.2)

- 100% ethanol (Fisher Scientific) - 70% ethanol - gedistilleerd water - epjes (1.6ml; Thermo Scientific) - pipetten (pipetman, Gilson®) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.) - centrifuge (centrifuge 5424; eppendorf) - vortex (L46; Labinco) - Thermomixer (eppendorf)

Methode

1. verwijder het fysiologisch water uit elk epje met behulp van een pipet 2. voeg bij elk epje 250µl HEBS 3. voeg 250µl van de digestie oplossing toe en incubeer de epjes overnacht bij 55°C (+

zachtjes roeren 300pm) (vanaf nu in de flowkast werken)

4. voeg 500µl mixture A toe per epje 5. vortexen en dan centrifugeren gedurende 15 minuten op 13.2 rpm 6. epjes voorzichtig uit centrifuge halen (moet in 2 fasen blijven) 7. breng 400µl (voorzichtig pipetteren) van het heldere supernatans (waterige fase bevat

DNA), zonder de interfase te verstoren, over in nieuwe epjes (indien de interfase verstoord is, 500µl van mix A toevoegen en re-extract)

8. voeg 40µl 3M NaOAc (pH5.2) 9. voeg 880µl 100% ethanol toe 10. vortexen en centrifugeren gedurende 10 minuten (DNA pellet wordt gevormd) 11. Giet het supernatans af 12. voeg 1ml 70% ethanol 13. centrifugeren gedurende 5 minuten (opnieuw DNA pellet vormen) 14. supernatans weggieten en de rest van de ethanol verwijderen met behulp van een pipet 15. laat de stalen aan de lucht drogen (gedurende 10 minuten) 16. 50µl gedistilleerd water toevoegen om pellet op te lossen 17. epjes incuberen bij 37°C gedurende 1 uur (+ zachtjes schudden) 18. stalen bewaren in koude kamer

PCR: genotypering Materialen

- DNA stalen - gedistilleerd water - dNTPs (1mM) - buffer

o Buffer A (Kapa Robust HS)

49

o 10xPCR Rxn Buffer – MgCl2; InvitrogenTM) - MgCl2 (50mM; InvitrogenTM) - forward primer (TGFBR1_exon 7) (werkoplossing 10µM) (IDT®)

o sequentie : 5’-GAC GGA AAA GTG TAT GAA ACA GC-3’ - reverse primer (TGFBR1_exon 7) (werkoplossing 10µM) (IDT®)

o sequentie: 5’-TCA TGA CAA ACT ATT GAG GAA AGG-3’ - polymerase

o Platinum® Taq DNA Polymerase (5U/µl; InvitrogenTM) o Kapa Taq HotStart (Kapa Biosystems)

- strip (0.2ml; Thermo Scientific) - epje voor mastermix (1.6ml; Thermo Scientific) - pipetten (pipetman, Gilson®) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.) - vortex (VWRTM International) - centrifuge (Galaxy Mini, VWRTM) - PCR-toestel (Applied BiosystemsTM)

Methode Genotypering muizen (op basis van stukjes staart)

1. maken van mastermix aan PCR-kant 25µl reactie, per staal: - 14.2µl gedistilleerd water - 3.1µl dNTPs - 5µl buffer A (Kapa) - 1.25µl primer exon 7F (10µM) - 1.25µl primer exon 7F (10µM) - 0.2µl Robust Kapa G Hotstart polymerase

2. 23µl masermix toevoegen in elk welletje (aan PCR-kant) 3. 2µl DNA (lysaat) toevoegen aan DNA-kant 4. PCR programma:

- TD 66°-54°C - bij de tweede run, 28 cycli in plaats van 24 cycli

- 4’ 94°C - 20” 94°C - 15” 66°C 12 cycli; T1-1°C - 1’ 72°C - 40” 94°C - 40” 54°C 28 cycli - 30” 72°C

- 10’ 72°C - 1’ 4°C

Genotypering embryo’s 1. maken van mastermix aan PCR-kant

25µl reactie, per staal:

50

- 14.15µl gedistilleerd water - 3.1µl dNTPs - 2.5µl invitrogen buffer - 0.75µl MgCl2 (Invitrogen)

- 1.7µl primer exon 7F (10µM) - 1.7µl primer exon 7R (10µM) - 0.1µl Taq platinum

2. 24µl mastermix toevoegen in elk welletje (aan PCR-kant) 3. 1µl DNA toevoegen aan DNA-kant 4. PCR programma:

- TD 66°-54°C - bij de tweede run, 28 cycli in plaats van 24 cycli

LabChip Materialen

- PCR-product (3µl) - dH2O (17µl) - 96 wellplaat - multi-channel pipet ( Matrix; Thermo Scientific) - tips (Thermo Scientific) - LabChipGX (Caliper Life Sciences)

Methode 1. In de koude kamer 110.015 rechts, dichtst bij de deur, staat de plaat die je moet aanvullen met je eigen stalen (bij ‘platen nog te lopen’) 2. Pipetteer 17µl HPLC-water en 3µl staal in de gereserveerde plaatsen 3. Dek af met plastiekfolie (EASYseal Greiner bio-one) en zet terug in de koude kamer 4. De resultaten zijn 3,5u na het starten van de run te vinden op:

V:\Data\Labchip\Data.

Embryologie Materialen

- scalpel - karton - isomoplaat - pincet - schaartje - petrischaal - stereomicroscoop - epje (1.6ml; Thermo Scientific) - Bouin oplossing (#070M4343; Sigma® ;Life Science) - vloeibare stikstof

51

Methode

1. euthanasie zwangere muis door cervicale dislocatie 2. muis vastspelden in ruglig, via poten, op karton (geplaatst op isomoplaat) 3. incisie langs de ventraallijn 4. verwijderen baarmoeder 5. elke hoorn van de baarmoeder controleren op embryo’s 6. van elk embryo een stukje weefsel (pootje) verwijderen voor genotypering 7. embryo op zijn geheel verwijderen en overbrengen in:

a. Bouin; voor het bekomen van paraffine coupes b. vloeibare stikstof; voor genexpressie analyse

Vascular corrosion casting Materialen

- CO2 (Air Liquide; Vet Tech Solutions, LTD) - karton - isomoplaat - kopspelden - Batson’s #17 Corrosion kit (monomere base oplossing, catalyst, promotor, rood en

blauw pigment) referentie 07349-1, Omnilabo International) o 5ml monomere base oplossing o 0.75ml katalysator o kleine hoeveelheid rood pigment o 2 druppels (~40µl) promotor

- gedistileerd water - katheter (26G; Terum® Surflo®-W) - spuit - 25% KOH oplossing

o 50g KOH (>85%, pastilles; Sigma-Aldrich®) o 200 ml water

- scalpel - pincetten - wattenstaafjes

Methode

1. euthanaseren van de muis door CO2-inhalatie (1L/min gedurende 1-2 minuten) 2. de muis, in ruglig, via de poten vastspelden op een karton (geplaatst op een

isomoplaat) 3. een incisie maken langs de ventraallijn 4. vrijprepareren van de aorta abdominalis 5. maken van Batson polymeer (uitgezonderd promotor), gebruik maken van het rode

pigment 6. plaatsen van de katheter in de aorta abdominalis (kan vastgemaakt worden met behulp

van kopspelden) 7. toevoegen van de promotor aan het Batson polymeer 8. injecteren van 2 à 3 spuiten (2 à 3ml) via de katheter 9. er is voldoende Batson geïnjecteerd wanneer het neusje van de muis roze begint te

kleuren

52

10. de muis in een bad met lauw water leggen, gedurende minimum 30’ (om ze te laten opstijven)

11. de muis overbrengen in een 25% KOH oplossing 12. overnacht laten maceren 13. volgende dag muis gedurende enkele uren spoelen met water 14. cast aan lucht laten drogen

Aortaprelevatie Materialen

- CO2 (Air Liquide; Vet Tech Solutions, LTD) - karton - isomoplaat - kopspelden - scalpel - pincet - draad - schaartje - petrischaal - steriele PBS (1x, Gibco®, Invitrogen) - katheter (26G; Terum® Surflo®-W) - spuiten

Methode

1. euthanasie van de muis door CO2-inhalatie (1L/min gedurende 1-2 minuten), 2. in ruglig via de poten vastspelden op een karton (geplaatst op een isomoplaat) 3. incisie langs de ventraallijn tot aan de kin 4. verwijderen van de huid en spierlaag 5. verwijderen van de ribben 6. vetweefsel rond aortaboog verwijderen 7. prepareer de 3 vertakkingen van de aortaboog (a. brachiocephalica, a. carotis

communis en a. subclavia) vrij 8. afbinden van vena cava superior met twee knopen 9. vena cava superior tussen twee knopen doorknippen 10. verwijderen van de aorta (beginnende aan de ascenderende aorta net boven het hart tot

aan het diafragma) 11. gedissecteerde aorta in petrischaal met steriele PBS brengen (om uitdroging te

voorkomen) 12. aorta met steriele PBS spoelen met behulp van spuit en katheter 13. overtolig vetweefsel verwijderen

a. paraffine coupes: enkel vetweefsel verwijderen b. gladde spiercelculturen: vetweefsel + adventitia

53

Bekomen van paraffine coupes (microtoom) Materialen

- 4% paraformaldehyde o 4g paraformaldehyde (Sigma-Aldrich®) per 100ml 0.1M PBS ((1x, Gibco®,

Invitrogen) o mengsel verhitten tot 60-65°C (al roerend) o 1N NaOH (pastillen; VWR International) toevoegen tot oplossing klaar is o oplossing laten afkoelen en filteren

- Bouin oplossing (#070M4343; Sigma® ;Life Science) - microtoom en cassettes - paraffine - microscopische slides (Menzel-Gläzer; Superfrost® plus; Thermo Scientific) - 100% ethanol (Fisher Scientific) - xyleen (AnalR Normapur, VWR International)

Methode 1. inbedden weefsel in paraffine

1. fixatie a. 4% paraformaldehyde gedurende 16-20 uren (gepreleveerde aorta’s) b. Bouin gedurende 2 uur (embryo’s)

2. bewaren in 70% ethanol 3. dehydratatie weefsel (totale duur +/-12 uur)

a. stijgende alcoholbaden (30%, 50%, 70%, 90%, 100% ethanol) b. xyleen c. paraffine

4. weefsels inbedden in paraffine en cassettes laten afkoelen tot paraffine blokjes verhard zijn

2. koel de paraffine blokjes vooraf om het snijden te vereenvoudigen (diepvries) 3. bekomen van paraffine coupes

1. opstarten microtoom - filter plaatsen indien deze er niet opzit - bakje van de filter vullen met gedistilleerd water tot de filter onder zit - voorste bakje vullen met gedistilleerd water - verwarmen op 38.5°C (groene knop) - microtoom aanzetten (knopje achteraan links) 2. aanschakelen waterslangetje - via draaiwiel snelheid bepalen van de waterstroom (meestal op 3 zetten) - indien er geen water door slangetje komt, naar beneden houden om lucht eruit te krijgen - bij waterstroom slangetje opnieuw aansluiten - water verdelen over bandje 3. er zijn 2 verschillende standen op de microtoom:

(om te wisselen van stand bovenste zwarte knop induwen) 1. TRIM (20µm)

- bij snijden nieuwe blok (paraffine zonder weefsel wegsnijden) - bij snijden reeds gebruikte blokjes (effen maken van oppervlakte) - ! blokjes mogen niet aan het water komen !

2. FEED (5µm) - om coupes te snijden 4. eerst moet het baantje uitgetrokken worden, zodat de coupes in het warm waterbad

terechtkomen 5. om de coupes te maken, moet je draaien aan het wiel

54

- best naar achteren draaien of met de wijzers meedraaien 6. wanneer de coupes in het warm waterbad terechtkomen, deze oppakken met een

microscopische slide 7. de slides benoemen (staal en nummer) en deze laten drogen

CTGF IHC Protocol (EDTA) Materialen

- xyleen (AnalR Normapur, VWR International) - 100% ethanol (Fisher Scientific) - 95% ethanol - gedistileerd water - EDTA

o 0.37g EDTA (99+%; Sigma®) o in 1L gedistilleerd water o op pH brengen (pH=8)

- 30% waterstofperoxide (H2O2) (VWR International ProLabo) - TBST (wasbuffer)

o 100ml 10x TBS o aanvullen met gedistilleerd water tot 1L o 500µl TWEEN (Sigma®)

- 5% BSA in TBST o 0.05g BSA (minimum 98%; Sigma®) o 1ml TBST

- CTGF (50µg; abcam) - secundair antilichaam (gebiotinyleerd anti-rabbit) (Vectastain® Rabbit IgG; Vector

Laboratories, Inc.) - ABC reagent (Vector Laboratories, Inc.) - DAB peroxidase (Vector Laboratories, Inc.) - Mayers hematoxylin counterstain (1/5 verdunning; Dako) - entellan (MERCK) - dekglaasjes (Menzel-Gläzer) - pipetten (pipetman, Gilson) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.) - kookplaat (SI Analytics)

Methode 1. deparaffineren/hydrateren van secties: 3 x 5 minuten xyleen 2 x 10 minuten 100% ethanol 2 x 10 minuten 95% ethanol (237ml 100% ethanol, aanvullen tot 250ml met gedistilleerd water) 3 x 5 minuten gedistilleerd water 2. antigen unmasking: slides gedurende 20 minuten in EDTA brengen (au bain marie verwarmd) slides uit kokend bad halen en laten afkoelen in EDTA gedurende 30 minuten 3. was secties in gedistilleerd water (3 x 5 minuten)

55

4. incubeer secties in 3% H2O2 (25ml 30% H2O2, aanvullen tot 250ml met gedistilleerd water) gedurende 10 minuten 5. was secties in gedistilleerd water (2 x 5 minuten) 6. was secties in wasbuffer (=TBST) gedurende 5 minuten 7. secties afdrogen (opletten om het weefsel niet te beschadigen) en met de hydrofobe stift een kring maken rond de weefselstukjes 8. secties incuberen gedurende 1 uur met 5% BSA in TBST op kamertemperatuur (= blocking solution) 9. verwijder “blocking solution” en voeg direct CTGF verdund in 5% BSA in TBST toe op de secties (50µl op elk weefsel) 1/100 (1 µlCTGF + 99µl BSA) 1/200 (0.5µl CTGF + 99.5µl BSA) 1/250 (0.4µl CTGF + 99.6µl BSA) 1/500 (0.2µl CTGF + 99.8µl BSA) 1/1000 (0.1µl CTGF + 99.9µl BSA) negatieve controle (100µl BSA) telkens voor 2 weefsels berekend 10. incubeer gedurende 2 uur op kamertemperatuur 11. verwijder antilichaam oplossing en was secties in wasbuffer (3 x 5 minuten) 12. voeg secundair antilichaam oplossing toe (Vectastain Rabbit IgG kit) gedurende 30 minuten voor 500µl

- 490µl TBST - 7.5µl BSA - 2.5µl biotinylated antibody

13. verwijder secundair antilichaam oplossing en was in wasbuffer (3 x 5 minuten) 14. voeg ABC reagent toe gedurende 45 minuten (moet 30 minuten op voorhand gemaakt worden !!!) aanmaken ABC reagent

- 1 druppel reagens A - 1 druppel reagens B - 2.5ml TBST

15. verwijder ABC reagent en was secties in wasbuffer (3 x 5 minuten) 16. voeg DAB peroxidase toe gedurende 2-10 minuten aanmaken DAB peroxidase

- 1 druppel buffer - 2 druppels DAB reagens - 1 druppel H2O2solution - 2.5ml gedistilleerd water

17. breng de secties in gedistilleerd water gedurende 5 minuten 18. incubeer de secties gedurende 2 seconden in Mayers hematoxylin counterstain 19. breng de secties in kraantjeswater gedurende 10 minuten (tussentijds het water verversen, wel opletten dat de secties niet uitdrogen) 20. dehydratatie van secties 2 x 5 minuten in 95% ethanol 2 x 5 minuten in 100% ethanol 2 x 5 minuten in xyleen 21. entellan mounting 1 druppeltje entellan op elk stukje weefsel brengen (opletten om niet met de pipet aan het weefsel te komen) is heel visceus (maken dat er geen luchtbellen in pipet zijn) 22. cover slipping step dekglaasje op de secties brengen (opletten dat er geen luchtbellen ontstaan op de weefsels)

56

Fosfo-Smad2 IHC Protocol (EDTA) Materialen

- xyleen (AnalR Normapur, VWR International) - 100% ethanol (Fisher Scientific) - gedistileerd water - EDTA

o 0.37g EDTA (99+%; Sigma®) o in 1L gedistilleerd water o op pH brengen (pH=8)

- 30% waterstofperoxide (H2O2) (VWR International ProLabo) - TBST (wasbuffer)

o 100ml 10x TBS o aanvullen met gedistilleerd water tot 1L o 500µl TWEEN (Sigma®)

- 5% BSA in TBST o 0.05g BSA (minimum 98%; Sigma®) o 1ml TBST

- fosfo-Smad2 (Ab; Cell Signaling Technology) - secundair antilichaam (gebiotinyleerd anti-rabbit) (Vectastain® Rabbit IgG; Vector

Laboratories, Inc.) - ABC reagent (Vector Laboratories, Inc.) - AEC peroxidase (Vector Laboratories, Inc.) - Mayers hematoxylin counterstain (1/5 verdunning; Dako) - VectaMountTM AQ mounting (Vector Laboratories, Inc.) - dekglaasjes (Menzel-Gläzer) - pipetten (pipetman, Gilson) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.) - kookplaat (SI Analytics)

Methode 1. deparaffineren/rehydrateren van secties: 3 x 5 minuten xyleen 2 x 10 minuten 100% ethanol 2 x 10 minuten 95% ethanol (237ml 100% ethanol, aanvullen tot 250ml met gedistilleerd water) 3 x 5 minuten gedistilleerd water 2. antigen unmasking: slides gedurende 20 minuten in EDTA brengen (au bain marie opwarmen) slides uit kokend bad halen en laten afkoelen in EDTA gedurende 30 minuten 3. was secties in gedistilleerd water (3 x 5 minuten) 4. incubeer secties in 3% H2O2 (25ml 30% H2O2, aanvullen tot 250ml met gedistilleerd water) gedurende 10 minuten 5. was secties in gedistilleerd water (2 x 5 minuten) 6. was secties in wasbuffer (=TBST) gedurende 5 minuten 7. secties afdrogen (opletten om het weefsel niet te beschadigen) en met de hydrofobe stift een kring maken rond de weefselstukjes

57

8. secties incuberen gedurende 1 uur met 5% BSA in TBST op kamertemperatuur (= blocking solution) 9. verwijder “blocking solution” en voeg direct fosfo-Smad2 verdund in blocking solution toe op de secties (50µl op elk weefsel) 1/100 (1µl Phospho-Smad2 + 99µl BSA) 1/200 (0.5µl Phospho-Smad2 + 99.5 µl BSA) 1/250 (0.4µl Phospho-Smad2 + 99.6µl BSA) 1/500 (0.2µl Phospho-Smad2 + 99.8µl BSA) 1/1000 (0.1µl Phospho-Smad2 + 99.9µl BSA) negatieve controle (100µl BSA) telkens voor 2 weefsels berekend 10. overnacht incuberen bij 4°C (koude en vochtige kamer) 11. verwijder antilichaam oplossing en was secties in wasbuffer (3 x 5 minuten) 12. voeg secundair antilichaam oplossing toe (Vectastain Rabbit IgG kit) gedurende 30 minuten voor 500µl

- 490µl TBST - 7.5µl BSA - 2.5µl biotinylated antibody

13. verwijder secundair antilichaam oplossing en was in wasbuffer (3 x 5 minuten) 14. voeg ABC reagent toe gedurende 45 minuten (moet 30 minuten op voorhand gemaakt worden!) aanmaken ABC reagent

- 1 druppel reagens A - 1 druppel reagens B - 2.5ml TBST

15. verwijder ABC reagent en was secties in wasbuffer (3 x 5 minuten) 16. voeg AEC peroxidase toe gedurende 30 minuten aanmaken AEC peroxidase

- 2 druppels buffer stockoplossing - 3 druppels AEC stokoplossing - 2 druppels hydrogen peroxide oplossing - 5ml gedistilleerd water

17. breng de secties in gedistilleerd water gedurende 5 minuten 18. incubeer de secties gedurende 2 seconden in Mayers hematoxylin counterstain 19. breng de secties in kraantjeswater gedurende 10 minuten 21. breng VectaMount AQ mounting oplossing op de weefsels en dek af met een dekglaasje H & E kleuring Materialen

- 1% acid alcohol solution o 1ml hydrochloric acid (minimum 37%; VWR International ProLabo) o 100ml 70% ethanol

(30ml dH2O en 70ml 100% ethanol (Fisher Scientific)) - 0.2% ammoniumhydroxide

o 2ml ammonium hydroxide (Sigma-Aldrich®) o 1000ml gedistilleerd water

- Eosine Y solution (Sigma-Aldrich®) o Voeg 400µl glacial acetic acid (Sigma-Aldrich®) toe aan 100ml eosine Y

oplossing

58

o filteren voor elk gebruik - Hematoxylin solution (Harris) (Sigma-Aldrich®)

o filteren voor gebruik (80ml) - filterpapier (Whatman®; Schleïcker & Schuell) - pipettor (Drummond) en plastiek pipetten (Fisherbrand®) - glazen bakjes voor de slides (kleine en grote) - xyleen (AnalR Normapur, VWR International) - 100% ethanol (Fisher Scientific) - 95% ethanol - 70% ethanol - gedistilleerd water (dH2O) - entellan (MERCK) - dekglaasjes (Menzel-Gläzer) - pipetten (pipetman, Gilson) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.)

Methode

1. slides gedurende 10-60 minuten in oven (60°C) 2. slides deparaffineren: 2 x 5 minuten in xyleen 3. rehydratatie van slides: 2 x 5 minuten in 100% ethanol 4. 2 minuten in 95% ethanol 5. 2 minuten in 70% ethanol 6. kort wassen in dH2O (+/- 2 minuten) 7. kleuren in Harris hematoxylin gedurende 8 minuten 8. slides gedurende 5 minuten wassen onder lopend kraantjeswater 9. differentiële kleuring in 1% acid alcohol voor 30 seconden 10. slides gedurende 1 minuut wassen onder lopend kraantjeswater 11. slides gedurende 30 seconden tot 1 minuut in 0.2% ammoniumhydroxide 12. slides gedurende 5 minuten wassen onder lopend kraantjeswater 13. slides afspoelen in 95% ethanol (10 dips) 14. tegenkleuren met eosin Y solution gedurende 30 seconden 15. dehydrateren in 95% ethanol gedurende 2 x 5 minuten 16. 2 x 5 minuten in 100% ethanol 17. 2 x 5 minuten in xyleen 18. entellan mounting en cover slipping step

Verhoeff - Van Gieson kleuring Materialen

- 5% alcoholic hematoxylin - 5g hematoxylin - 100ml 100% ethanol (Fisher Scientific) (mengen op roerder (Heidolph) + lichtjes opwarmen) - filteren voor gebruik

59

- 10% aequous ferric chloride - 10g ferric chloride (Sigma-Aldrich®) - 100ml dH20

- Weigert’s iodine solution (lichtgevoelig) - 2g potassium iodide (M=166.00g/mol; Riedel-de Haën®) - 1g iodine (M=253.81g/mol; Riedel-de Haën®) - 100ml dH20

a. 4ml dH20 gebruiken om potassium iodide op te lossen b. iodine toevoegen c. verder aanlengen tot 100ml met dH2O en roeren

- 5 % aequous sodium thiosulfate - 5g sodium thiosulfate (Fluka) - 100ml dH20

- Von Gieson’s counterstain - 0.05g aequous acid fushin (Sigma®) in 5ml gedistilleerd water (1% oplossing) - 100ml saturated aequous picric acid (Fluka® Analytical)

Maak deze oplossing 1 dag op voorhand! - Verhoeff’s working solution

- 44.4ml 5% alcoholic hematoxylin - 17.8ml 10% ferric chloride - 17.8ml Weigert’s iodine solution

- 2% aequous ferric chloride - 13.3ml 10% ferric chloride - 66.7ml dH20

- filterpapier (Whatman®; Schleïcker & Schuell) - pipettor (Drummond) en plastiek pipetten (Fisherbrand®) - glazen bakjes voor de slides (kleine en grote) - xyleen (AnalR Normapur, VWR International) - 100% ethanol (Fisher Scientific) - 95% ethanol - 70% ethanol - gedistilleerd water - entellan (MERCK) - dekglaasjes (Menzel-Gläzer) - pipetten (pipetman, Gilson) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.)

Methode

1. slides gedurende 10-60 minuten in oven (60°C) 2. slides deparaffineren: 2 x 10 minuten in xyleen 3. rehydratatie van slides: 2 x 5 minuten in 100% ethanol 4. 2 minuten in 95% ethanol 5. 2 minuten in 70% ethanol 6. kort wassen in dH2O (+/- 2 minuten) 7. kleuren in Verhoeff’s solution gedurende 60 minuten 8. slides spoelen onder lopend kraantjeswater (2-3 keer verversen) 9. differentiële kleuring in 2% ferric chloride gedurende 2 minuten 10. differentiatie stoppen met kraantjeswater (aantal keer verversen) 11. slides onder microscoop bekijken

60

elastische vezels = zwart achtergrond = grijs

12. slides wassen in kraantjeswater 13. slides gedurende 1 minuut in 5% sodium thiosulfaat 14. slides gedurende 5 minuten wassen onder lopend kraantjeswater 15. tegenkleuren met Von Gieson’s solution gedurende 3 minuten 16. slides dehydrateren in 95% ethanol 17. 2 x 5 minuten in 100% ethanol 18. 2 x 3 minuten in xyleen 19. entellan mounting en cover slipping step

Gladde spiercelculturen 1. Opstarten gladde spiercelculturen Materialen

- scalpel - falcon (BD FalconTM) - enzymatische oplossing (collagenase) - pipettor (Drummond) en pipetten (Fisherbrand®) - SmBM medium (SmBM®; Clonetics®, Lonza) - polystyreen falcon (15ml; BD FalconTM) - centrifuge (Rotina 380R; Hettich Zentrifugen) - pasteurpipetten (Hishermann®, Laborgerate) - 9-wellplaat

Methode ! Er moet steriel gewerkt wordt (in een flowkast) !

1. gepreleveerde aorta, ontdaan van vetweefsel en adventitia, wordt gebruikt om gladde spiercelculturen op te starten

2. aorta media in kleine stukjes versnijden 3. overbrengen in een falcon 4. toevoegen van enzymatische oplossing (collagenase) 5. 4 tot 6 uur incuberen bij 37°C 6. zachtjes tegen falcon tikken om cellen te resuspenderen 7. enkele milliliters SmBM medium toevoegen 8. alles overbrengen in een 15ml polystyreen falcon 9. 5 minuten centrifugeren 10. medium opzuigen 11. cellen resuspenderen in 5ml vers SmBM medium 12. 5 minuten centrifugeren 13. medium opzuigen 14. cellen resuspenderen in 700µl SmBM medium 15. celsuspensie overbrengen in 9-wellplaat 16. plaat in incubator (37°C) plaatsen 17. 5 dagen ongestoord laten groeien

2. Verversen van gladde spiercelculturen Materialen

- SmBM medium (SmBM®; Clonetics®, Lonza)

61

- pipetten (Fisherbrand®) - pipettor (Drummond) - pasteurpipetten (Hishermann®, Laborgerate) - denaturol (ethanol met 3% ether; TMC) - falcons (T75 en T25; Falcon®)

Methode ! steeds werken in flowkast ! ! steeds handschoenen aandoen !

1. medium op kamertemperatuur laten komen aanmaken medium

- eerst alle benodigdheden laten ontdooien - FBS (fetal bovine serum; 25ml) + groeifactoren

o rhFGF-B (rhuman fibroblast growth factor-B; 1.0ml) o insulin (recombinant human; 0.5ml) o GA-1000 (gentamicin sulfate amphotericin-B; 0.5ml)

- rhEGF (epidermal growth factor, human recombinant in a buffered BSA saline; 0.5ml) - alles overbrengen in een nieuwe mediumfles 2. flow 10 minuten op voorhand aanzetten 3. Oud medium opzuigen met vacuümpomp en pasteurpipet 4. in elke falcon nieuw medium overbrengen - T25 5ml medium - T75 10ml medium 5. falcon volledig toedraaien en dan een kwart terugdraaien, zodat de dop een beetje los

zit - CO2 uitwisseling moet mogelijk zijn 6. falcons terug in de incubators plaatsen

3. Splitsen van gladde spiercelculturen Materialen

- SmBM medium (SmBM®; Clonetics®, Lonza) - Trypsine-EDTA (0.05%; Gibco® InvitrogenTM) - pipetten (Fisherbrand®) - pipettor (Drummond) - pasteurpipetten (Hishermann®, Laborgerate) - denaturol (ethanol met 3% ether; TMC) - celschraper (costar®; Corning Incorporated) - falcons (T75 en T25; Falcon®)

Methode

1. medium opzuigen met pasteurpipet 2. trypsine-EDTA toevoegen - T25 1.5ml trypsine (per falcon) - T75 2.5ml trypsine (per falcon) 3. dop vollledig dichtdraaien 4. 10 minuten in incubator plaatsen 5. cellen losschrapen 6. vers medium toevoegen - T25 naar T 75 15ml medium - T75 naar T75 20ml medium 7. op en neer pipetteren en wanden afspoelen zodat alle cellen meezijn 8. met dezelfde pipet 10ml medium overbrengen in de nieuwe falcon 9. falcon dichtdraaien en kwartslag terugdraaien

62

10. terug in incubator plaatsen RNA isolatie Materialen

- TGFβ-1 (2µg/ml; R&D systems) - CHX (5mg/100µl 100% ethanol, Sigma) - steriele tips (Mµltigard; SorensonTM, BioScience, Inc.) - incubator - P60 petrischaaltjes (Falcon®) - SmBM medium (SmBM®; Clonetics®, Lonza) - falcons (15ml; BD FalconTM) - ijs - pasteurpipetten - centrifuge (Rotina 380R; Hettich Zentrifugen) - pipetten (Fisherbrand®) - pipettor (Drummond) - spuit (1ml; BD Plastik) en naald (18G; BD MicrolanceTM 3) - Rneasy® Mini kit (Qiagen)

o RNeasy Mini Spin Columns o Collectie tubes (1.6ml en 2.0ml) o Buffer RTL o Buffer RW1 o Buffer RPE o RNase vrij water

- Beta-mercapto (Fluka) - pipetten (eppendorf Research) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.) - centrifuge (centrifuge 5415D; eppendorf)

Methode 1. als cellen confluent zijn in 2 T75s:

a. cellen splitsen b. overbrengen naar 4 P60s (petrischalen)

2. cellen opnieuw confluent laten groeien (+/- 2 dagen) 3. 1 week laten staan en enkel medium verversen 4. cellen gedurende 24 uur zonder FBS plaatsen (SmBM medium waar geen FBS is aan

toegevoegd) 5. 16 uur voor RNA-isolatie bij 2 van de 4 P60s CHX toevoegen 6. bij 2 van de 4 (één +CHX en één –CHX) P60s, 6.25µl TGFβ-1 toevoegen 7. P60s terugplaatsen in incubator gedurende 60’ 8. cellen met behulp van celschraper losmaken 9. alles op pipetteren en overbrengen in respectievelijke falcon (op ijs) 10. met 3ml SmBM medium P60 naspoelen en dit toevoegen aan de falcon 11. 10 minuten centrifugeren bij +/- 1400 rpm 4°C 12. supernatans met behulp van pasteurpipetten afzuigen 13. 600µl RTL buffer + β-mercapto toevoegen aan elke falcon

voor 2 stalen: - 15µl β-mercapto

63

- 1500µl RLT buffer 14. 7 maal op en neer pipetteren met naald en spuit 15. toevoegen van 600µl 70% ethanol en goed op en neer pipetteren 16. 700µl van dit mengsel overbrengen op de respectievelijke spinkolom 17. 15 seconden centrifugeren bij 13.2 rpm 18. weggooien flowthrough 19. opnieuw 700µl van het mengels op spinkolom brengen 20. 15 seconden centrifugeren bij 13.2 rpm 21. weggooien flowthrough 22. 700µl RW1 buffer op spinkolom brengen 23. 15 seconden centrifugeren bij 13.2 rpm 24. weggooien flowthrough 25. 500µl RPE buffer op spinkolom brengen 26. 2 minuten centrifugeren bij 13.2 rpm 27. verwijderen flowthrough 28. nogmaals 500µl RPE buffer op spinkolom brengen 29. 2 minuten centrifugeren bij 13.2 rpm 30. verwijderen flowthrough 31. spinkolom op nieuwe collectie tube zetten 32. 1 minuut centrifugeren bij 13.2 rpm 33. spinkolom op nieuw epje plaatsen (1.6ml) 34. 50µl RNase vrij water toevoegen 35. 1 minuut centrifugeren bij 13.2 rpm 36. spinkolom verwijderen en epje sluiten en op ijs zetten 37. bewaren bij -80°C

DNase behandeling Materialen

- RNA stalen - TURBO DNA-freeTM (Ambion®)

o TURBO DNase (2U/µl) o 10X TURBO DNase buffer o DNase inactivatie reagent o nuclease vrij water (0.2µm)

- pre-PCR tubes (0.2ml) (Thermo Scientific) - ijs - pipetten (eppendorf Research) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.) - MyCycler Thermal Cyclers - vortex (VWKTM International) - centrifuge (eppendorf)

Methode

1. er wordt gewerkt in een 50µl reactie a. 5µl 10X TURBO DNase buffer b. 1µl TURBO DNase c. 200ng/µl RNA (in een volume van 44µl) d. xµl nuclease vrij water (tot totaal volume van 50µl)

64

e. geheel zachtjes mengen 2. incuberen op 37°C gedurende 20’ 3. 5µl geresuspendeerd DNase inactivatie reagent toevoegen 4. epjes goed mengen door er tegen te tikken 5. gedurende 2’ op kamertemperatuur incuberen (af en toe mixen met vortex) 6. centrifugeren op 10rcf gedurende 2’ bij 4°C 7. supernatans (bevat het RNA) overbrengen naar nieuwe pre-PCR tubes, op ijs geplaatst 8. bewaren in -80°C diepvries

cDNA synthese Materialen

- DNase behandelde RNA-stalen - iScriptTM cDNA synthesis kit (Bio-Rad #170-8891)

o 5x iScriptTM reaction mix o iScriptTM reverse transcriptase o nuclease vrij water

- pre-PCR tubes (0.2ml) (Thermo Scientific) - ijs - pipetten (ependorf Research) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.) - MyCycler Thermal Cyclers

Methode

1. er wordt gewerkt in een 20µl reactie: a. 2µg DNase behandelde RNA-stalen b. 4µl iScript reaction mix toevoegen aan elke tube toevoegen c. 1µl iScript reverse transcriptase aan elke tube toevoegen d. xµl nuclease vrij water (tot totaal volume van 20µl)

2. reverse transcriptase polymerase chain reaction (MyCycler Thermal Cyclers) a. 5’ op 25°C b. 30’ op 42°C c. 5’ op 85°C

3. first strand cDNA verdunnen door 180µl nuclease vrij water aan het epje toe te voegen 4. goed vortexen 5. verdelen in 50µl volumes 6. bewaren in -20°C diepvries

qPCR Materialen

- cDNA stalen (2ng/µl) - gedistilleerd water - 5x roche mastermix (5x concentratie; Roche) - LightCycler®480 ResoLight Dye (Roche) - forward primer (werkoplossing 10µM) (IDT®)

o sequentie Ctgf : 5’-CCA CCC GAG TTA CCA ATG AC-3’

65

o sequentie Tgfbr1 : 5’-GGT TCC GAG AGG CAG AGA TT-3’ o sequentie Tgfb1 : 5’-CCA AAG ACA TCT CAC ACA GT-3’ o sequentie Mmp2 : 5’-ACC CAG ATG TGG CCA ACT AC-3’ o sequentie Fn1: 5’-CAG AGG GGA GTG GAA GTG TG-3’ o sequentie Smad6: 5’-CCC CTA TTC TCG GCT GTC TC-3’ o sequentie Smad7: 5’-GCA TTC CTC GGA AGT CAA GA-3’ o sequentie B1F1: 5’-TGG CGC ACG CCT TTA ATC-3’ o sequentie B1F2: 5’-GTG GCG CAC GCC TTT AAT-3’ o sequentie B2F: 5’-AAG ATC AGT GAA AGA CTT GT-3’ o sequentie: Hprt1: 5’-CCT AAG ATG AGC GCA AGT TGA A-3’ o sequentie Tuba1a: 5’-AAG GAG GAT GCT GCC AAT AA-3’ o sequentie Gadph: 5’-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3’

- reverse primer (werkoplossing 10µM) (IDT®) o sequentie Ctgf: 5’-GAC AGG CTT GGC GAT TTT AG-3’ o sequentie Tgfbr1: 5’-TGA TAA TCT GAC ACC AAC CAC AG-3’ o sequentie Tgfb1: 5’-GTA GAG TTC CAC ATG TTG CT-3’ o sequentie Mmp2: 5’-AAA GCA TCA TCC ACG GTT TC-3’ o sequentie Fn1: 5’-GTG ACA CAG TGG CCG TAG G-3’ o sequentie Smad6: 5’-GGC CTC GGT TTC AGT GTA AG-3’ o sequentie Smad7: 5’-AAA TCC ATT GGG TAT CTG GAG TAA-3’ o sequentie B1R: 5’-ATT TTC AAT CAT TTC TGA GG-3’ o sequentie B2R1: 5’-ACA CCA GAA GAG GGC ATC AGA-3’ o sequentie B2R2: 5’-ACA CAC CAG AAG AGG GCA TCA-3’ o sequentie Hprt1: 5’-CCA CAG GAC TAG AAC ACC TGC TAA-3’ o sequentie Tuba1a: 5’-GCT GTG GAA AAC CAA GAA GC-3’ o sequentie Gadph: 5’-TTG CTG TTG AAG TCG CAG GAG-3’

- epje voor mastermix (1.6ml; Thermo Scientific) - pipetten (pipetman, Gilson) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.) - vortex (VWRTM International) - centrifuge (Galaxy Mini, VWRTM) - repetitieve pipet (Repetman®; Gilson®) - multi-channel pipet (Finnpipette®, Thermo Scientific) - multiwell plaat 384 (Roche) - seal (Roche) - LightCycler® 480 (LC480; Roche) - centrifuge voor plaat (B4i multifunction centrifuge; KeyWrite-DTM) - softwaren qbasePLUS (Biogazelle)

Methode

1. maken van mastermix aan PCR-kant 3µl reactie, per staal: - 1µl 5x mastermix roche (onverdund) - 0.25µl forward primer (1/20 verdunning; 5µM) - 0.25µl reverse primer (1/20 verdunning; 5µM) - 0.25µl resolight - 1.25µl gedistilleerd water

66

67

2. 3µl masermix toevoegen aan welletjes (384 wellplaat) (repetitieve pipet) 3. 2µl cDNA toevoegen aan DNA-kant (multi-channel) 4. plaat bedekken met seal 5. plaat centrifugeren 6. LightCycler (LC480)

a. new experiment b. apply template (roche_5x_mix)

Roche 5x mix run template 1 pre-incubatie 1’ bij 95°C

(4.8°C/s)

2-46 amplificatie 3” bij 95°C (4.8°C/s)

30” bij 60°C (2.5°C/s)

10” bij 72°C (4.8°C/s) single detection

47 smeltcurve 5” bij 95°C (4.8°C/s)

1’ bij 60°C (2.5°C/s)

T verhogen met 0.11°C/S tot 97°C continuous detection

48 cooling T verlagen met stappen van 2°C/s tot 40°C (30s)

c. programma d. sample editor

i. alle welletjes selecteren die gevuld zijn ii. make replicates

e. plaat in LigthCycler steken f. experiment start run g. opslaan plaat (datum_naamexperiment)

7. Analyse (op LightCycler) a. analysis b. quantification c. calculate d. resultaten kopiëren naar excell-bestand e. programma sluiten

8. qPCR analyse met qbasePLUS software

Overzicht embryonale ontwikkeling Normale ontwikkeling (wild type en heterozygote p.Y378X muizen) E 8.5 E 9.5 E 10.5 E 11.5 E 12.5

Afwijkende ontwikkeling en sterfte (homozygote p.Y378X muizen)

E 8.5 E 9.5 E 10.5 E 11.5 E 12.5

68

Ontworpen qPCR primers Tgfbr1 primer (exon 4-5) GTTTACCACTGCTTGTTCAAAGAACAATTGCCAGGACCATTGTGTTACAAGAAAGCATTG GCAAAGGTCGGTTTGGAGAAGTTTGGCGAGGCAAATGGCGGGGAGAAGAAGTTGCTGTGA AGATATTCTCTTCTAGAGAAGAGCGTTCATGGTTCCGAGAGGCAGAGATTTATCAGACTG TAATGTTACGCCATGAAAATATCCTGGGATTTATAGCAGCAGACAACAAAG ACAATGGGACATGGACGCAGCTGTGGTTGGTGTCAGATTATCATGAGCATGGATCCCTTT TCGATTACTTGAATAGATACACTGTTACTGTGGAAGGAATGATCAAGCTTGCTCTGTCCA CAGCAAGTGGTCTTGCCCATCTTCACATGGAGATTGTTGGTACCCAAG Tgfb1 primer (exon 2) CCATCTATGAGAAAACCAAAGACATCTCACACAGTATATATATGTTCTTCAATACGTCAG ACATTCGGGAAGCAGTGCCCGAACCCCCATTGCTGTCCCGTGCAGAGCTGCGCTTGCAGA GATTAAAATCAAGTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTACCAG Ctgf primer (exon 4-5) CCTACCGACTGGAAGACACATTTGGCCCAGACCCAACTATGATGCGAGCCAACTGCCTGG TCCAGACCACAGAGTGGAGCGCCTGTTCTAAGACCTGTGGGATGGGCATCTCCACCCGAG TTACCAATGACAATACCTTCTGCAGACTGGAGAAGCAGAGCCGCCTCTGCATGGTCAGGC CCTGCGAAGCTGACCTGGAGGAAAACATTAAG AAGGGCAAAAAGTGCATCCGGACACCTAAAATCGCCAAGCCTGTCAAGTTTGAGCTTTCT GGCTGCACCAGTGTGAAGACATACAGGGCTAAGTTCTGCGGGGTGTGCACAGACGGCCGC TGCTGCACACCGCACAGAACCACCACTCTGCCAGTGGAGTTCAAATGCCCCGATGGCGAG ATCATGAAAAAGAATATGATGTTCATCAAGACCTGTGCCTGCCATTACAACTGTCCTGGG GACAATGACATCTTTGAGTCCCTGTACTACAGGAAGATGTACGGAGACATGGCGTAAAGC CAGGAAGTAAGGGACACGAACTCATTAGACTATAACTTGAACTGAGTTGCATCTCATTTT CTTCTGTAAAAACAATTACAGTAGCACATTAATTTAAATCTGTGTTTTTAACTACCGTGG GAGGAACTATCCCACCAAAGTGAGAACGTTATGTCATGGCCATACAAGTAGTCTGTCAAC CTCAGACACTGGTTTCGAGACAGTTTACACTTGACAGTTGTTCATTAGCGCACAGTGCCA GAATGCACACTGAGGTGAGTCTCCTGGAACAGTGGAGATGCCAGGAGAAAGAAAGACAGG TACTAGCTGAGGTTATTTTAAAAGCAGCAGTGTGCCTACTTTTTGGAGTGTAACCGGGGA GGGAAATTATAGCATGCTTGCAGACAGACCTGCTCTAGCGAGAGCTGAGCATGTGTCCTC CACTAGATGAGGCTGAGTCCAGCTGTTCTTTAAGAACAGCAGTTTCAGCTCTGACCATTC TGATTCCAGTGACACTTGTCAGGAGTCAGAGCCTTGTCTGTTAGACTGGACAGCTTGTGG CAAGTAAGTTTGCCTGTAACAAGCCAGATTTTTATTGATATTGTAAATATTGTGGATATA TATATATATATATATATATATATTTGTACAGTTATCTAAGTTAATTTAAAGTCATTTGTT TTTGTTTTAAGTGCTTTTGGGATTTTAAACTGATAGCCTCAAACTCCAAACACCATAGGT AGGACACGAAGCTTATCTGTGATTCAAAACAAAGGAGATACTGCAGTGGGAATTGTGACC TGAGTGACTCTCTGTCAGAACAAATGCTGTGCAGGTGATAAAGCTATGTATTGGAAGTCA GATTTCTAGTAGGAAATGTGGTCAAATCCCTGTTGGTGAACAAATGGCCTTTATTAAGAA ATGGCTGGCTCAGGGTAAGGTCCGATTCCTACCAGGAAGTGCTTGCTGCTTCTTTGATTA TGACTGGTTTGGGGTGGGGGGCAGTTTATTTGTTGAGAGTGTGACCAAAAGTTACATGTT TGCACCTTTCTAGTTGAAAATAAAGTATATATATATTTTTTATATGAAA

69

Mmp2 primer (exon 2-3) CAATACCTGAACACTTTCTATGGCTGCCCCAAGGAGAGTTGCAACCTCTTTGTGCTGAAA GATACCCTCAAGAAGATGCAGAAGTTCTTTGGGCTGCCCCAGACAGGTGACCTTGACCAG AACACCATCGAGACCATGCGGAAGCCAAGATGTGGCAACCCAGATGTGGCCAACTACAAC TTCTTCCCCCGCAAGCCCAAGTGGGACAAGAACCAGATCACATACAG GATCATTGGTTACACACCTGACCTGGACCCTGAAACCGTGGATGATGCTTTTGCTCGGGC CTTAAAAGTATGGAGCGACGTCACTCCGCTGCGCTTTTCTCGAATCCATGATGGGGAGGC TGACATCATGATCAACTTTGGACGCTGGG Fn1 primer (exon 6-7) ACAGATGCAACGATCAGGACACCCGGACATCCTATAGGATTGGAGACACGTGGAGCAAGA AGGACAACCGAGGAAACCTGCTTCAGTGTGTCTGCACAGGCAATGGCAGAGGGGAGTGGA AGTGTGAGCGACATGCTCTACAAAGTGCTTCAGCCG GATCTGGCTCCTTCACTGATGTCCGAACAGCTATTTACCAACCGCAGACTCACCCCCAGC CCGCTCCCTACGGCCACTGTGTCACCGACAGTGGTGTGGTCTACTCTGTGGGAATGCAGT GGCTGAAGTCGCAAGGAAACAAGCAAATGCTGTGCACGTGCCTGGGCAATGGCGTCAGCT GCCAGGAGACAG Smad6 primer (exon 2-3) AATCACCGCCGCCCCCCTATTCTCGGCTGTCTCCTCCTGACCAGTACAAGCCACTGG ATCTGTCCGATTCTACATTGTCTTACACTGAAACCGAGGCCACCAACTCCCTCATCACTG CTCCGGGTGAATTCTCAG Smad7 primer (UTR + exon 1-2) ATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGCTCGTCCGGCGTCTCTGGAGGAGCCGTGCGCCCGGCGGCGAGGACGAGGAGGAGGGCGTGGGGGGTGGCGGCGGAGGAGGCGAGCTGCGGGGAGAAGGGGCGACGGACGGCCGGGCTTATGGGGCTGGTGGCGGCGGTGCGGGCAGGGCTGGCTGCTGCCTGGGCAAGGCAGTCCGAGGTGCCAAAGGTCACCACCATCCCCATCCCCCAACCTCGGGTGCCGGGGCGGCCGGGGGCGCCGAGCGGATCTGAAGGCGCTCACGCACTCGGTGCTCAAGAAACTCAAGGAGCGGCAGCTGGAGCTGCTGCTTCAGGCCGTGGAGTCCCGCGGCGGTACGCGCACCGCGTGCCTCCTGCTGCCCGGCCGCCTGGACTGCAGGCTGGGCCCGGGGGCGCCCGCCAGCGCGCAGCCCGCGCAGCCGCCCTCGTCCTACTCGCTCCCCCTCCTGCTGTGCAAAGTGTTCAGGTGGCCGGATCTCAGGCATTCCTCGGAAGTCAAGAGGCTGTGTTGCTGTGAATCTTACGGGAAGATCAACCCCGAGCTGGTGTGCTGCAACCCCCATCACCTTAGTCGACTCTGTGAACTAG AGTCTCCCCCTCCTCCTTACTCCAGATACCCAATGGATTTTCTCAAACCAACTG

70

Protocol optimalisatie qPCR primers 1. cDNA verdunningsreeks Materialen

- muis referentie cDNA (25µg; Stratagene) (uitgegaan van 10µg/µl voor cDNA synthese)

- tRNA (carrier ; 10mg/ml ; Brewer’s Yeast) - nuclease vrij water (sigma water) - strip (0.2ml; Thermo Scientific) - epje (1.6ml; Thermo Scientific) - pipetten (pipetman, Gilson) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.) - vortex (VWRTM International) - centrifuge (Galaxy Mini, VWRTM)

Methode

1. 50x en 1x carrier oplossing maken a. 50x carrier oplossing

1. 9µl tRNA 2. 36µl nuclease vrij water 3. geheel goed vortexen en afdraaien

b. 1x carrier oplossing 1. 29µl 50x carrier oplossing 2. 1421µl nuclease vrij water 3. geheel goed vortexen en afdraaien

2. epje maken met: a. 100µl cDNA (muis referentie) b. 6.25µl 50x carrier c. 206.25µl nuclease vrij water d. geheel goed vortexen en afdraaien = punt 1 (zie tabel)

3. 78µl van punt 1 en 234µl 1x carrier toevoegen aan epje punt 2 4. vorige stap 4 keer herhalen (punt 3 tot punt 6) 5. laatste epje is negatieve controle (240µl 1x carrier) 6. geheel verdelen over 6 strips (+/- 40µl per epje) 7. bewaren bij -20°C

start volume verdund met punt 1: 32ng/µl 100µl cDNA 6.25µl 50x carrier + 206.5µl nuclease vrij water punt 2: 8ng/µl 78µl punt 1 234µl 1x carrier punt 3: 2ng/µl 78µl punt 2 234µl 1x carrier punt 4: 0.5ng/µl 78µl punt 3 234µl 1x carrier punt 5: 0.125ng/µl 78µl punt 4 234µl 1x carrier punt 6: 0.0312ng/µl 78µl punt 5 234µl 1x carrier negatieve controle 240µl 1x carrier

71

2. optimalisatie qPCR primers Materialen

- cDNA verdunningsreeks - gedistilleerd water - 5x roche mastermix (5x concentratie; Roche) - LightCycler®480 ResoLight Dye (Roche) - forward primer (werkoplossing 10µM) (IDT®)

o sequentie Ctgf : 5’-CCA CCC GAG TTA CCA ATG AC-3’ o sequentie Tgfbr1 : 5’-GGT TCC GAG AGG CAG AGA TT-3’ o sequentie Tgfb1 : 5’-CCA AAG ACA TCT CAC ACA GT-3’ o sequentie Mmp2 : 5’-ACC CAG ATG TGG CCA ACT AC-3’ o sequentie Fn1: 5’-CAG AGG GGA GTG GAA GTG TG-3’ o sequentie Smad6: 5’-CCC CTA TTC TCG GCT GTC TC-3’ o sequentie Smad7: 5’-GCA TTC CTC GGA AGT CAA GA-3’ o sequentie B1F1: 5’-TGG CGC ACG CCT TTA ATC-3’ o sequentie B1F2: 5’-GTG GCG CAC GCC TTT AAT-3’ o sequentie B2F: 5’-AAG ATC AGT GAA AGA CTT GT-3’ o sequentie: Hprt1: 5’-CCT AAG ATG AGC GCA AGT TGA A-3’ o sequentie Tuba1a: 5’-AAG GAG GAT GCT GCC AAT AA-3’ o sequentie Gadph: 5’-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3’ o sequentie Ywhaz: 5’-TAA ATG GTC TGT CAC CGT CT-3’

- reverse primer (werkoplossing 10µM) (IDT®) o sequentie Ctgf: 5’-GAC AGG CTT GGC GAT TTT AG-3’ o sequentie Tgfbr1: 5’-TGA TAA TCT GAC ACC AAC CAC AG-3’ o sequentie Tgfb1: 5’-GTA GAG TTC CAC ATG TTG CT-3’ o sequentie Mmp2: 5’-AAA GCA TCA TCC ACG GTT TC-3’ o sequentie Fn1: 5’-GTG ACA CAG TGG CCG TAG G-3’ o sequentie Smad6: 5’-GGC CTC GGT TTC AGT GTA AG-3’ o sequentie Smad7: 5’-AAA TCC ATT GGG TAT CTG GAG TAA-3’ o sequentie B1R: 5’-ATT TTC AAT CAT TTC TGA GG-3’ o sequentie B2R1: 5’-ACA CCA GAA GAG GGC ATC AGA-3’ o sequentie B2R2: 5’-ACA CAC CAG AAG AGG GCA TCA-3’ o sequentie Hprt1: 5’-CCA CAG GAC TAG AAC ACC TGC TAA-3’ o sequentie Tuba1a: 5’-GCT GTG GAA AAC CAA GAA GC-3’ o sequentie Gadph: 5’-TTG CTG TTG AAG TCG CAG GAG-3’ o sequentie Ywhaz: 5’-GGA AAT ACT CGG TAG GGT GT-3’

- epje voor mastermix (1.6ml; Thermo Scientific) - pipetten (pipetman, Gilson) - tips (ART®; Molecular BioProducts) (MµltiGuard; SorensonTM, BioScience, Inc.) - vortex (VWRTM International) - centrifuge (Galaxy Mini, VWRTM) - repetitieve pipet (Repetman®; Gilson®) - multi-channel pipet (Finnpipette®, Thermo Scientific) - multiwell plaat 384 (Roche) - seal (Roche) - LightCycler® 480 (LC480; Roche) - centrifuge voor plaat (B4i multifunction centrifuge; KeyWrite-DTM)

72

73

- softwaren qbasePLUS (Biogazelle) Methode

1. maken van mastermix aan PCR-kant 3µl reactie, per staal: - 1µl 5x mastermix roche (onverdund) - 0.25µl forward primer (1/20 verdunning; 5µM) - 0.25µl reverse primer (1/20 verdunning; 5µM) - 0.25µl resolight - 1.25µl gedistilleerd water

2. 3µl masermix toevoegen aan welletjes (384 wellplaat) (repetitieve pipet) 3. 2µl verdund cDNA toevoegen aan DNA-kant (multi-channel) 4. plaat bedekken met seal 5. plaat centrifugeren 6. LightCycler (LC480)

a. new experiment b. apply template (roche_5x_mix)

Roche 5x mix run template 1 pre-incubatie 1’ bij 95°C

(4.8°C/s)

2-46 amplificatie 3” bij 95°C (4.8°C/s)

30” bij 60°C (2.5°C/s)

10” bij 72°C (4.8°C/s) single detection

47 smeltcurve 5” bij 95°C (4.8°C/s)

1’ bij 60°C (2.5°C/s)

T verhogen met 0.11°C/S tot 97°C continuous detection

48 cooling T verlagen met stappen van 2°C/s tot 40°C (30s)

c. programma d. sample editor

i. alle welletjes selecteren die gevuld zijn ii. make replicates

e. plaat in LigthCycler steken f. experiment start run g. opslaan plaat (datum_naamexperiment)

7. Analyse (op LightCycler) a. analysis b. quantification c. calculate d. resultaten kopiëren naar excell-bestand e. programma sluiten

8. qPCR analyse met qbasePLUS software

Amplificatie efficiëntie grafieken Ctgf Tgfb1 Fn1 Gadph Hprt1 Mmp2

74

75

Tgfbr1 Tuba1a Smad6 Smad7

Functionele karakterisatie van een Tgfbr1 muismodel voor...

Documents

Transcript of Functionele karakterisatie van een Tgfbr1 muismodel voor...