Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2013...

i

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2013 – 2014

Groeipotentieel van Listeria monocytogenes in zachte en half-harde ambachtelijke kazen

Hanne Van Yperzele Promotor: Prof. dr. ir. Mieke Uyttendaele Tutor: MSc. Evy Lahou

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van

Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Levensmiddelenwetenschappen en voeding

iii

“De auteur en de promotor geven de toelating deze thesis voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de thesis te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze thesis.” “The author and the promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is in subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis.” Auteur/Author: Hanne Van Yperzele Promotor: Prof. dr. ir. Mieke Uyttendaele Begeleider/tutor: MSc. Evy Lahou

iv

Woord vooraf Aangezien ik deze thesis niet op mijn eentje vervolledigd zou kunnen hebben, zou ik graag van de gelegenheid gebruik maken om een aantal personen te bedanken. In de eerste plaats zou ik graag mijn tutor MSc. Evy Lahou willen bedanken voor het begeleiden en verbeteren van deze thesis. Ik kon steeds bij haar terecht met mijn talloze vragen en ze heeft me altijd met raad en daad bijgestaan. Verder zou ik ook Prof. dr. ir. Mieke Uyttendaele willen bedanken voor het opvolgen en mogelijk maken van deze thesis. Naast mijn tutor en mijn promotor zou ik het volledige laboratorium voor levensmiddelenmicrobiologie en –conservering willen bedanken met in het bijzonder Ann Dirckx, Markus Eriksson en Elien Verguldt vanwege hun hulp bij het uitvoeren van mijn analyses en challengetesten. Voorts zou ik graag nog mijn dank betuigen aan dr. ir. An Vermeulen vanwege haar hulp bij het theoretisch modelleren en het personeel van het accreditatielabo (Belac) omdat ik gebruik mocht maken van hun dossiers bij de verwerking van deze thesis. Tot slot zou ik graag mijn vriend, zus, ouders en vrienden willen bedanken voor hun continue steun en aanmoediging gedurende mijn hele studieperiode.

v

Inhoudsopgave Lijst van afkortingen ............................................................................................................................... vii

Samenvatting ......................................................................................................................................... viii

1. Inleiding .......................................................................................................................................... 1

2. Literatuur ........................................................................................................................................ 2

2.1 Listeria monocytogenes ........................................................................................................... 2 2.1.1 Algemene karakteristieken .............................................................................................. 2 2.1.2 Taxonomie ....................................................................................................................... 2 2.1.3 Listeriose.......................................................................................................................... 3 2.1.4 Het voorkomen van Listeria monocytogenes als zoönotische pathogeen ...................... 5 2.1.5 Wetgeving ........................................................................................................................ 6

2.2 Listeria monocytogenes en kaas .............................................................................................. 6 2.2.1 Algemene karakteristieken van kaas ............................................................................... 6 2.2.2 Prevalentie van Listeria monocytogenes op kaas ............................................................ 9 2.2.3 Productterugroepingen in België .................................................................................. 12 2.2.4 Productterugroepingen in de EU ................................................................................... 14 2.2.5 Uitbraken in Europa....................................................................................................... 15

2.3 Melkzuurbacteriën in competitie met Listeria monocytogenes ........................................... 19 2.3.1 Algemeen ....................................................................................................................... 19 2.3.2 Het effect van de aanwezigheid van melkzuurbacteriën op Listeria monocytogenes. . 19

3. Methodologie ............................................................................................................................... 21

3.1 Prevalentiescreening rauwmelkse en gepasteuriseerde, zachte en half-harde kazen ......... 21 3.1.1 Aankoop kazen .............................................................................................................. 21 3.1.2 Bepaling parameters ..................................................................................................... 21 3.1.3 Dataverwerking van de prevalentiescreening .............................................................. 28

3.2 Challengetesten ..................................................................................................................... 29 3.2.1 Aankoop kazen .............................................................................................................. 29 3.2.2 Voorafgaande kwalitatieve bepaling van Listeria monocytogenes ............................... 30 3.2.3 Opkweek van L. monocytogenes ................................................................................... 30 3.2.4 Bereiding inoculum ........................................................................................................ 31 3.2.5 Beënten, verpakken, bewaren ...................................................................................... 31 3.2.6 Analyseren van de kaas ................................................................................................. 32 3.2.7 Dataverwerking van de challengetesten ....................................................................... 33

3.3 Modelleren van het groeipotentieel van L. monocytogenes ................................................ 34 3.3.1 Modelleren aan de hand van ComBase ......................................................................... 34 3.3.2 Modelleren aan de hand van SSSP ................................................................................ 34 3.3.3 Dataverwerking van de modellen ................................................................................. 35

3.4 Challengetesten uitgevoerd door het accreditatielabo .............................................................. 35 3.4.1 Challengetesten op risicoproducten .................................................................................... 35 3.4.2 Challengetesten op kaas ...................................................................................................... 36

4. Resultaten ..................................................................................................................................... 37

4.1 Prevalentiescreening rauwmelkse en gepasteuriseerde, zachte en half-harde kazen ......... 37 4.1.1 Zuurtegraad (pH) ........................................................................................................... 38 4.1.2 Wateractiviteit (aw) ........................................................................................................ 38 4.1.3 Zoutgehalte ................................................................................................................... 38 4.1.4 Staphylococcus aureus .................................................................................................. 38 4.1.5 Escherichia coli .............................................................................................................. 39

vi

4.1.6 Melkzuurbacteriën ........................................................................................................ 39 4.1.7 Listeria monocytogenes ................................................................................................. 40

4.2 Challengetesten ..................................................................................................................... 40 4.2.1 Referentiemonsters ....................................................................................................... 40 4.2.2 Geïnoculeerde monsters ............................................................................................... 43

4.3 Modelleren van het groeipotentieel van L. monocytogenes ................................................ 45 4.4 Challengetesten uitgevoerd door het accreditatielabo .............................................................. 47

4.4.1 Challengetesten op risicoproducten .................................................................................... 47 4.4.2 Challengetesten op kaas ...................................................................................................... 48

5. Discussie ....................................................................................................................................... 49

5.1 Risicoproducten .......................................................................................................................... 49 5.2 Listeria monocytogenes en kaas ................................................................................................. 51

5.2.1 Aanwezigheid van L. monocytogenes .................................................................................. 51 5.2.2 Groei van L. monocytogenes................................................................................................ 52

5.3 De vraag van de hoevewinkels en delicatessenzaken ................................................................ 56 6. Algemene conclusies .................................................................................................................... 57

7. Ideeën voor verder onderzoek ..................................................................................................... 58

8. Referenties .................................................................................................................................... 59

9. Bijlage ........................................................................................................................................... 66

Bijlage 1. Gedetailleerde informatie over de productterugroepingen op kaas in de periode van 01/01/2008 t.e.m. 31/12/2013 in België. ......................................................................................... 66 Bijlage 2. Uitbraken in Europa in de periode van 2000 tot 2012 ...................................................... 68

L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken geassocieerd met kaas in de periode van 2000 tot 2012. ....................................................................................................................................... 68 L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken geassocieerd met andere levensmiddelen in de periode van 2000 tot 2012. .......................................................................................................... 69

Bijlage 3. Statistische outputs uit Spotfire S+ 8.2. ............................................................................ 70 3.1 Prevalentiescreening rauwmelkse en gepasteuriseerde, zachte en half-harde kazen .......... 70 3.2 Challengetesten ...................................................................................................................... 76 3.3 Modelleren van het groeipotentieel van L. monocytogenes .................................................. 86 3.4 Challengetesten uitgevoerd door het accreditatielabo .......................................................... 88

Bijlage 4. Specifiek overzicht van de kazen uit de prevalentiescreening .......................................... 90

vii

Lijst van afkortingen EU = Europese Unie EFSA = European Food Safety Authority ECDC = European Centre for Disease Prevention and Control FAVV = Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen RASFF = Rapid Alert System for Food and Feed CDC = Centers for Disease Control and Prevention FDA = US Food and Drug Administration YOPI = Young, Old, Pregnant, Immunodeficient kve = kolonievormende eenheden ALOA = Agar Listeria acc. to Ottaviani & Agosti PPS = peptone physiological solution MRS = de Man, Rogosa and Sharpe BP = Baird-Parker REC = RAPID’E.coli TSA = Trypton Soya Agar YE = Yeast Extract BHI = Brain Heart Infusion

viii

Samenvatting Listeria monocytogenes is één van de belangrijkste voedselgebonden pathogenen in

West-Europa omdat deze bacterie alomtegenwoordig is in het milieu, een mortaliteit

met zich meebrengt welke schommelt tussen 20 en 30% en kan groeien onder

koelkasttemperaturen. L. monocytogenes wordt vooral geassocieerd met

verduurzaamde producten (al dan niet hittebehandeld) met een verlengde

houdbaarheid in de koeling waaronder gerookte zalm, vleeswaren, kaas en

samengestelde levensmiddelen zoals delisalades en kant-en-klare maaltijden

(Devlieghere, et al., 2011; EFSAa, 2013). Door het bestuderen van diverse

prevalentiestudies, productterugroepingen zowel in België als in de EU en L.

monocytogenes voedselgebonden uitbraken wordt duidelijk dat kaas één van de

belangrijkste risicoproducten is welke geassocieerd worden met L. monocytogenes.

Er zijn dan ook strenge eisen rond hygiëne en koeling in kaas-producerende

bedrijven. Dit vooral met betrekking tot de garantie van voedselveiligheid met in het

bijzonder L. monocytogenes. Hoevewinkels en delicatessenzaken maken echter

gebruik van een ambachtelijk productie- en rijpingsproces dat door deze strenge

wetgeving onder grote druk te staan komt. Er wordt zich dan ook afgevraagd of deze

strenge aanpak wel nodig is. Deze thesis wil een wetenschappelijke onderbouwing

geven via analyses van verschillende soorten kaas, challengetesten, theoretische

modellen en analyse van de resultaten van het accreditatielabo (Belac, verbonden

aan het Laboratorium voor Levensmiddelenmicrobiologie en –conservering, Fac. Bio-

ir. Wetenschappen, Universiteit Gent). Op deze manier kunnen de risico’s op het

aantreffen van verhoogde aantallen L. monocytogenes beter ingeschat worden. Zo

wordt duidelijk dat zachte tot halfzachte en rauwmelkse kazen een groter risico

stellen naar aanwezigheid van L. monocytogenes. Uit de theoretische groeimodellen

en de challengetesten kan besloten worden dat het groeipotentieel van L.

monocytogenes duidelijk lager zal liggen bij hardere kazen dan bij zachtere kazen.

Bovendien kan er voor zachtere kazen geen verschil opgemerkt worden tussen

rauwmelkse en gepasteuriseerde zachtere kazen naar groei van L. monocytogenes.

Het groeipotentieel zal voornamelijk beïnvloed worden door de pH van de kaas in

kwestie waarbij een lagere pH zal zorgen voor een lager groeipotentieel. Deze pH

wordt bekomen door de productie van melkzuur a.d.h.v. MZB waardoor het

groeipotentieel indirect beïnvloed wordt door de concentratie aan MZB (TAD Zuivel,

ILVO, 2006). Verder zal ook de aw van de kaas een invloed uitoefenen op het

groeipotentieel. Dit effect zal echter kleiner zijn (Vermeulen, et al., 2007; Smittle,

2000). Hieruit kan geconcludeerd worden dat de strenge eisen voor het

ambachtelijke productie- en rijpingsproces van kazen niet versoepeld kunnen worden

voor zachte tot halfzachte kazen. Bovendien moeten risicogroepen beter

geïnformeerd worden waarbij niet alleen het gevaar van rauwmelkse zachtere kazen

maar ook van gepasteuriseerde zachtere kazen benadrukt dient te worden (Lund,

2014). Bij half-harde tot harde kazen, en dan vooral bij harde kazen, kan overwogen

worden om de strenge normen iets te verzachten (Bachmann & Spahr, 1995).

Hiervoor is echter specifiek onderzoek nodig. Voorts blijkt uit de uitgevoerde

prevalentiescreening dat ook geitenkazen vanwege hun lage pH een kleiner risico

met zich meebrengen. Hier is eveneens verder onderzoek nodig.

1

1. Inleiding Listeria monocytogenes is één van de belangrijkste voedselgebonden pathogenen in

West-Europa omdat de bacterie alomtegenwoordig is in het milieu, een mortaliteit

met zich meebrengt welke schommelt tussen 20 en 30% en kan groeien onder

koelkasttemperaturen. L. monocytogenes wordt vooral geassocieerd met

verduurzaamde producten (al dan niet hittebehandeld) met een verlengde

houdbaarheid in de koeling. Hoewel L. monocytogenes door een pasteurisatieproces

afgedood kan worden, kunnen hittebehandelde producten nog steeds een risico

vormen als deze blootgesteld worden aan kruis- of postcontaminatie (FAVV, 2014).

Voorbeelden van deze producten zijn gerookte zalm, kazen, versneden voorverpakte

vleeswaren, delisalades, kant-en-klare maaltijden enzovoort. Bovendien houdt de

consument van een clean label, waardoor het gebruik van additieven beperkt wordt,

en mijdt hij liever toegevoegd zout, dat ook zorgt voor een langere houdbaarheid.

Verder vertonen personen die tot de YOPI-groep behoren de grootste gevoeligheid

om ziek te worden. Door de toenemende vergrijzing in West-Europa wordt deze

groep echter groter en groter. Hieruit blijkt dat het gevaar dat L. monocytogenes met

zich meebrengt op het vlak van voedselveiligheid niet zomaar verwaarloosd mag

worden (Devlieghere, et al., 2011; EFSAa, 2013).

In de grote baseline studie die het EFSA publiceerde in 2013 worden als grote risicoproducten verpakte gerookte zalm, verpakte vleeswaren en zachte tot halfzachte kaas beschreven (EFSAc, 2013). Wanneer de jaarrapporten van het EFSA en het ECDC bestudeerd worden, blijkt dat er zich 12 L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken hebben voorgedaan in de periode van 2007 tot 2012 inde EU. Hiervan zijn 4 uitbraken geassocieerd met kaas (ECDCa, 2013; EFSAe, 2013). Verder zijn er 114 meldingen geweest via het RASFF in verband met L. monocytogenes geassocieerd met kaas in de periode van 2008 tot en met 2013. In dezelfde tijdspanne waren er 110 meldingen i.v.m. gerookte zalm, 86 i.v.m. vlees en vleesproducten en 13 i.v.m. kip en kippenproducten (European Commission, 2013). Hieruit blijkt duidelijk dat kaas één van de belangrijkste risicoproducten is dat geassocieerd worden met L. monocytogenes. Er zijn dan ook strenge eisen rond hygiëne en koeling in kaas-producerende bedrijven. Dit vooral met betrekking tot de garantie van voedselveiligheid met in het bijzonder L. monocytogenes. Hoevewinkels en delicatessenzaken maken echter gebruik van een ambachtelijk productie- en rijpingsproces dat door deze strenge wetgeving onder grote druk te staan komt. Er wordt zich dan ook afgevraagd of deze strenge aanpak wel nodig is. Is er kans op besmetting met L. monocytogenes in ambachtelijke kazen? Zal de aanwezige microbiota in dit gefermenteerde product de uitgroei van L. monocytogenes niet beperken en is er een verschil in groeipotentieel afhankelijk van het type kaas of de plaats van de besmetting (op de korst of op het snijvlak)? Deze thesis wil dan ook een wetenschappelijke onderbouwing geven via analyses van verschillende soorten kaas, challengetesten, theoretische modellen en analyse van de resultaten van het accreditatielabo (Belac). Op deze manier kunnen de risico’s op het aantreffen van verhoogde aantallen L. monocytogenes beter ingeschat worden. Hierdoor kan mogelijks een uitspraak gedaan worden naar de wetgeving waarbij lage aantallen L. monocytogenes al dan niet getolereerd kunnen worden.

2

2. Literatuur

2.1 Listeria monocytogenes

2.1.1 Algemene karakteristieken

Listeria monocytogenes is één van de belangrijkste voedselinfectanten in West-Europa en behoort dan ook tot de ‘Big Four’1. Het is een kleine staafvormige, gram-positieve, niet-sporenvormende zoönotische bacterie (Devlieghere, et al., 2011) met een breedte van 0.5 µm en een lengte van 1-1.5 µm (Dongyou, 2006). Ze bezit peritrofe flagellen die zorgen voor de voortbeweging en een belangrijke rol spelen bij het vormen van een biofilm (Lemon, et al., 2013). Deze flagellen worden echter alleen aangemaakt bij kamertemperatuur. Bij een temperatuur van 37°C wordt de transcriptie van het gen dat verantwoordelijk is voor de aanmaak van de flagellen onderdrukt. L. monocytogenes is katalase positief, oxidase negatief en maakt beta-hemolysine aan, een enzym dat rode bloedcellen zal afbreken (Farber & Peterkin, 1991). Het is een facultatief anaerobe bacterie, wat wil zeggen dat ze zowel zonder als met zuurstof kan overleven. Afgezien daarvan is er gekend dat de groei bevorderd wordt door toevoeging van CO2 (Devlieghere, et al., 2011). In vergelijking tot gram-negatieve zoönotische bacteriën is L. monocytogenes resistenter t.o.v. ongunstige conserveringsomstandigheden die de groei van bacteriën zullen belemmeren. L. monocytogenes kan namelijk overleven binnen een pH-bereik van 4.4 tot 9.4 en de minimale wateractiviteit (aw) voor groei bedraagt 0.92. Bij de meeste gram-negatieve zoönotische bacteriën bedraagt deze circa 0.95. Hierdoor kan L. monocytogenes ook in een zoute omgeving overleven. Een belangrijk kenmerk is het feit dat deze bacterie psychrotroof (koudetolerant) is. Hierdoor kan deze (traag) groeien bij koelkasttemperaturen. De minimumtemperatuur waarbij groei kan optreden bedraagt ongeveer 0°C. Hierbij moet echter in rekening gebracht worden dat een kleine stijging in temperatuur (tot 4-7°C) ervoor kan zorgen dat de generatietijd drastisch verkort wordt. Vandaar dat de koude keten dan ook te allen tijde beheerst dient te worden. Hoewel deze bacterie ook de meest hitteresistente vegetatieve pathogeen genoemd wordt, is deze wel gevoelig aan een pasteurisatieproces (2min bij 70°C). Dit proces wordt verondersteld een 6 log reductie te bekomen waardoor producten die vooraf besmet waren veilig geconsumeerd kunnen worden indien ze niet onderhevig zijn aan nabesmetting (FDA, 2012; Devlieghere, et al., 2011).

2.1.2 Taxonomie

2.1.2.1 Geschiedenis

L. monocytogenes werd voor het eerst aangetroffen in konijnen (Murray, 1926). Vandaar dat deze bacterie oorspronkelijk beschreven werd als een dierlijk pathogeen onder de naam Bacterium monocytogenes. Deze naam veranderde in de jaren 40 naar Listeria monocytogenes (P.J.H., 1940). Hoewel de bacterie al werd vastgesteld in zowel mensen als dieren bleef deze slechts een rariteit tot in de 2de wereldoorlog wanneer ze gezien werd als oorzaak van bloedvergiftiging bij pasgeboren baby’s

1 Dit zijn de belangrijkste voedselinfectanten in West-Europa, namelijk Salmonella spp.,

Campylobacter jejuni/coli, Listeria monocytogenes en Escherichia coli O157:H7 (Devlieghere, et al., 2011).

3

(neonatale sepsis) en hersenvliesontsteking (meningitis). In de jaren 50-60 werd de bacterie voor het eerst vastgesteld bij mensen waar het immuunsysteem onderdrukt was (bv. door chemo) en later ook bij dialyse- en HIV-patiënten. Het was echter pas in 1981 dat de bacterie werd aangeduid als oorzaak van een voedselgebonden uitbraak. Sindsdien is het een belangrijke voedselgebonden pathogeen die zich vooral manifesteert bij jonge, oude, zwangere en immuunonderdrukte personen. Deze groep wordt ook wel de YOPI-groep genoemd (Schlech & Acheson, 2000).

2.1.2.2 Classificatie

Listeria monocytogenes behoort samen met Brochothrix, een micro-organisme dat vooral bederf veroorzaakt in vlees, tot de familie van de Listeriaceae. Het Listeriageslacht bestaat uit tien soorten: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. innocua, L. welshimeri, L. grayi, L. marthii, L. rocourtiae, L. fleischmannii en L. weihenstephanensis (EFSAa, 2013; Jamali, et al., 2013). Van deze soorten wordt enkel L. monocytogenes beschouwd als humane voedselpathogeen. L. innocua wordt echter ook als pathogeen aanzien bij dieren (Volokhov, et al., 2002; Dongyou, 2006). Nochtans wordt er bij het screenen van een productieomgeving of levensmiddel soms gekozen om alle Listeria spp. te analyseren. Deze analyse kan dienen als indicator voor (toekomstige) aanwezigheid van L. monocytogenes, aangezien de aanwezigheid van Listeria spp. wordt gezien als hygiëne indicator (Devlieghere, et al., 2011; LFMFP-UGent, 2010). L. monocytogenes heeft 13 serotypes waaronder 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e en 7. Van deze types worden 1/2a, 1/2b en 4b het meest geassocieerd met voedselinfecties (FDA, 2012; Dongyou, 2006). Typering heeft niet altijd evenveel nut omdat in meer dan 80% van de gevallen de drie belangrijkste serotypes voorkomen. Hierbij wordt serotype 4b meestal geassocieerd met epidemische uitbraken van listeriose terwijl serotype 1/2a en 1/2b vooral gelinkt worden met sporadische infecties. Serotypering is gebaseerd op de O (somatische) en H (flagellaire) antigenen (Dongyou, 2006). Genotypering kan echter veel nuttiger zijn om verbanden te leggen. Zo kan bij individuele ziektegevallen de gemeenschappelijke oorzaak, plaats van besmetting of het geassocieerde levensmiddel achterhaald worden. Wanneer deze informatie verzameld wordt op internationaal vlak kunnen ook verschillende uitbraken gelinkt worden aan elkaar. Hierdoor kunnen bepaalde besmettingshaarden gevolgd worden over de grenzen heen2.

2.1.3 Listeriose

2.1.3.1 Symptomen

Een persoon die besmet wordt met L. monocytogenes kan listeriose oplopen. Hierin zijn twee soorten te onderscheiden: niet-invasieve en invasieve listeriose. Meestal zal er invasieve listeriose optreden. Dit betekent dat de bacterie zich van het darmkanaal naar de bloedstroom verspreid heeft. Niet-invasieve listeriose zal vooral optreden bij gezonde mensen (die niet tot de YOPI-groep behoren). De voornaamste symptomen hiervan zijn diarree en koorts. Deze verdwijnen in principe vanzelf waardoor een behandeling meestal niet nodig is. Invasieve listeriose daarentegen treedt vooral op bij personen die tot de YOPI-groep behoren en vatbaarder zijn voor deze bacterie.

2 Dit wordt verder behandeld onder ‘2.2.4 Uitbraken in Europa’.

4

De symptomen die zich hierbij voordoen zijn griepachtige symptomen, namelijk koorts, spierpijn, vaak voorafgegaan door diarree, misselijkheid en overgeven. Wanneer de infectie zich echter verspreidt naar het bloed- en zenuwstelsel kan het meningitis (hersenvliesontsteking) en sepsis (bloedvergiftiging) veroorzaken wat uiteindelijk kan leiden tot de dood. Bij zwangere vrouwen zullen de symptomen zich beperken tot lichte griepsymptomen. Desalniettemin kan de bacterie doordringen naar de foetus wat kan resulteren in spontane abortus (2de/3de trimester), vroeggeboorte, doodgeboorte of een levensbedreigende situatie voor de pasgeboren baby zoals neonatale bloedvergiftiging. Personen uit de risicogroep (YOPI-groep) zullen veelal een antibiotica behandeling krijgen (Devlieghere, et al., 2011; Food-info, 2013; FDA, 2012; CDC, 2011). Toch blijft listeriose een ernstige ziekte die hoge sterftecijfers met zich meebrengt. Er wordt zelfs gesproken van een mortaliteit die schommelt tussen 20 en 30%. In de Europese Unie lijkt dit cijfer echter te dalen. Hier observeerde men in 2008 namelijk een cijfer van 20,5%, in 2009 16,6%, in 2010 17% en in 2011 een cijfer van slechts 12,7% (EFSAb, 2013; EFSA, 2012; EFSA, 2011; EFSA, 2010; LFMFP-UGent, 2010).

2.1.3.2 Infectiecyclus

De incubatietijd van invasieve listeriose kan variëren van enkele dagen tot 3 weken, hoewel er naar schatting al na 12u gastro-intestinale klachten vastgesteld kunnen worden. Doordat er zo’n grote tijdspanne bestreken wordt en deze ontzettend kan variëren, is het niet altijd even gemakkelijk om de oorzaak van de infectie te achterhalen (Food-info, 2013; FDA, 2012). Nadat de bacterie opgenomen is in het gastro-intestinaal kanaal kan L. monocytogenes de gastro-intestinale cellen van het epitheel binnendringen. Wanneer de bacterie de monocyten, macrofagen of polymorfonucleare leukocyten van zijn gastheer binnendringt, is er sprake van bloedvergiftiging (septicemia) en kan de bacterie verder toenemen in aantal. De intracellulaire aanwezigheid in de fagocyterende cellen maakt het bovendien mogelijk om de hersenen binnen te dringen. De ontwikkeling van listeriose wordt hoofdzakelijk bepaald door het feit dat L. monocytogenes in staat is te overleven in het lichaam en zich kan vermenigvuldigen in fagocyterende gastcellen (FDA, 2012).

2.1.3.3 Het optreden van listeriose

Hoewel de mortaliteit bij L. monocytogenes veel hoger ligt dan bij bv. Campylobacter spp. is het aantal geregistreerde gevallen bij listeriose veel lager. Zo kent campylobacteriose jaarlijks meer dan 190 000 gevallen. Dat zijn er zo’n 100 keer meer dan voor L. monocytogenes. Toch blijft listeriose een ontzettend belangrijke ziekte. Zo wordt sinds 1998, toen de incidentie nog lager lag dan 0.15 gevallen per 100 000 inwoners, een enorme toename gezien in het aantal gevallen van listeriose in de Europese Unie, en dan vooral in Frankrijk, Duitsland en Engeland. Hoewel het aantal gevallen weer lichtelijk daalde vanaf 2009 (Tabel 1) is er grote kans dat er weer een stijging zal plaatsvinden aangezien er enkele factoren zijn die dit in de hand werken. Zo is er een stijging van de bevolkingsgroepen die de grootste gevoeligheid vertonen voor L. monocytogenes, namelijk de YOPI-groep. Deze stijging is onder meer te wijten aan de groeiende vergrijzing. Dit is ook te zien in Tabel 1 waaruit blijkt dat deze groep steeds belangrijker is geworden de afgelopen jaren. Verder is er een tendens om terug te grijpen naar kant-en-klare levensmiddelen vanwege tijdgebrek. Dit zijn echter levensmiddelen met een groot risico vanwege hun verlengde houdbaarheid in de koeling en omdat ze veelal niet meer verhit moeten worden voor consumptie. Tevens is er ook een trend tot het meer

5

bewust worden van de voeding waardoor de vraag zich opdringt naar producten met minder zout. Dit zorgt ervoor dat de producten vatbaarder zijn voor besmetting en overleving van pathogene bacteriën. Tot slot kunnen ook de moderne onderzoekmethodes en de meer frequente analyses als oorzaak aanschouwd worden voor een toename van listeriose in de EU (Devlieghere, et al., 2011; EFSAb, 2013; EFSA, 2012; EFSA, 2011; EFSA, 2010; ECDC, 2007).

Tabel 1. Gegevens van listeriose in de Europese Unie. (ECDCb, 2013; ECDC, 2012; ECDC, 2011; ECDC, 2010; ECDC, 2009; ECDC, 2008; ECDC, 2007; EFSAb, 2013; EFSA, 2012; EFSA, 2011)

Jaar 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011

Aantal gevallen 1491 1628 1635 1462 1685 1624 1516

Mortaliteit - - - 20,50% 16,60% 17,00% 12,70%

Aantal meldingen (per 100.000)

0,33 0,36 0,34 0,30 0,35 0,34 0,31

Ouderen (>65j) 55,40% 55,80% 55,00% 55,20% 58,50% 60,20% 75,00%

Kinderen (<5j) 6,90% 7,00% - 20,50% 3,88% 4,13% 6,00%

2.1.4 Het voorkomen van Listeria monocytogenes als zoönotische pathogeen

2.1.4.1 Transmissie

L. monocytogenes is een pathogeen welke alomtegenwoordig is in het milieu. Deze wordt gewoonlijk aangetroffen in bodems, water en op plantenmateriaal dat reeds deels vergaan is. Dit laatste vormt een uitstekende habitat voor hoge aantallen aan L. monocytogenes. Hierdoor kan het een bron vormen voor besmetting van dieren, waaronder boerderijdieren die ermee in aanraking komen, en onverwerkte plantaardige stoffen, zoals groenten op het veld door bemesting. Ook water dat gecontamineerd is met L. monocytogenes kan bij het besproeien van het veld besmetting veroorzaken (Fenlon, 1999). Bovendien kunnen dieren met deze bacterie rondlopen zonder dat ze ziek lijken. Hierdoor wordt de veehouder niet gesignaleerd en kunnen vlees en melkproducten besmet zijn. L. monocytogenes kan dus zowat met alle soorten voedsel geassocieerd worden, zowel voedsel van plantaardige als dierlijke oorsprong (Nightingale, et al., 2004). Wanneer dit gecontamineerde voedsel terechtkomt in een verwerkingsbedrijf kan het door contact met verschillende oppervlaktes kruisbesmetting veroorzaken. Hierdoor kunnen andere producten die in het bedrijf verwerkt worden ook gecontamineerd worden waardoor L monocytogenes zich verspreidt. L. monocytogenes kan in deze nieuwe omgeving overleven naargelang de hoeveelheid bacteriën, de aard van het oppervlak, de temperatuur en de relatieve vochtigheid. Als het micro-organisme niet tijdig verwijderd wordt door een goede reiniging en desinfectie zal het een biofilm ontwikkelen welke zeer moeilijk te verwijderen is. Gebieden die hiervoor vatbaar zijn omvatten kleppen van machines, rioolputjes maar ook oppervlakken welke aangetast zijn door de ouderdom waardoor bv. krassen gevormd zijn op het oppervlak. Deze oppervlaktes worden vaak vergeten bij de reiniging en het desinfectieproces of zijn moeilijk te bereiken. Verder zijn ook snijmachines en andere gebruiksvoorwerpen plaatsen waar gemakkelijk een biofilm gevormd kan worden. Bovendien is aangetoond dat L. monocytogenes zelfs een biofilm kan vormen op roestvrij staal (RVS) en rubber, twee materialen die vaak gebruikt worden in de voedingsindustrie

6

(Lee Wong, 1998). Hierdoor kunnen producten die een hittebehandeling ondergaan hebben onderhevig zijn aan nabesmetting door kruiscontaminatie. Kruiscontaminatie via apparatuur en het voedselverwerkingsproces is dan ook de grootste oorzaak van transmissie van L. monocytogenes (Stessl, et al., 2014; FAVV, 2014). Een voorbeeld hiervan wordt beschreven op de site van het CDC. Hier werd gekookte ham versneden door gebruik te maken van een snijmachine waarop een biofilm van L. monocytogenes aanwezig was. Hoewel de gekookte ham reeds een hittebehandeling onderging, en dus kiemvrij gemaakt werd, was deze toch onderhevig aan nabesmetting door de kruiscontaminatie via de snijmachine (CDCa, 2013).

2.1.4.2 Risicoproducten

L. monocytogenes wordt geassocieerd met verduurzaamde producten (al dan niet hittebehandeld) met een verlengde houdbaarheid in de koeling (bv. zachte kazen, gerookte zalm, versneden voorverpakte vleeswaren, delisalades enzovoort) en in mindere mate met verse levensmiddelen (bv. groenten en vlees) met een korte houdbaarheid (max. 5 dagen). Producten die hittebehandeld zijn in de verpakking en niet onderhevig zijn aan nabesmetting stellen normaliter geen probleem aangezien de kiem niet aanwezig zou mogen zijn na een pasteurisatieproces van 2min bij 70°C (Devlieghere, et al., 2011).

2.1.5 Wetgeving

De infectieuze dosis van L. monocytogenes is niet exact gekend omdat deze varieert afhankelijk van zijn stam en de vatbaarheid van het slachtoffer. Er zijn gevallen bekend waarbij minder dan 1000 cellen voldoende zijn om ziekte te veroorzaken. Vandaar dat men in gekende risicoproducten streeft naar afwezigheid van L. monocytogenes per 25g levensmiddel, hoewel bij occasionele gevallen de limiet van 2 log kve/g nog als veilig aanvaard wordt. Dit echter met de onderbouwing dat L. monocytogenes gedurende de houdbaarheid niet zal uitgroeien tot een hoeveelheid die dit criterium overschrijdt. Indien L. monocytogenes wel kan uitgroeien, dient de beginbesmetting laag te zijn namelijk afwezigheid in x gram, afhankelijk van het resultaat van de test, zodat de richtwaarde van 2 log kve/g op het einde van de houdbaarheid nog gegarandeerd kan worden. Dit kan aangetoond worden door het groeipotentieel te bepalen via challengetesten (LFMFP-UGent, 2010; Devlieghere, et al., 2011; Food-info, 2013; FDA, 2012).

2.2 Listeria monocytogenes en kaas

2.2.1 Algemene karakteristieken van kaas

2.2.1.1 Productieproces

Kaas is een voedingsmiddel dat ontstaat wanneer zuursel en stremsel worden toegevoegd aan melk. Zuursel wordt toegevoegd om een bepaalde smaak te bekomen en de houdbaarheid te verlengen3. Stremsel zal ervoor zorgen dat de melk zal overgaan in twee fases namelijk een vaste fase (wrongel) en een vloeibare fase (wei). Wrongel bestaat uit brokjes ter grootte van een erwt die in de wei drijven. Dit mengsel ontstaat doordat de vaste stoffen (melkeiwit en melkvet) zullen samenklonteren. Na het stremmen wordt de wei afgevoerd door het mengsel te

3 Dit wordt verder behandeld onder ‘2.3 Melkzuurbacteriën in competitie met Listeria monocytogenes’.

7

draineren. Hierbij zal de wei wegvloeien door een geperforeerde bodem. De wrongel die overblijft wordt in grote blokken verdeeld om te persen. Hierbij wordt de wrongel samengedrukt en zal het overtollige vocht afgevoerd worden. Vervolgens wordt de samengeperste wrongel al dan niet ondergedompeld in een pekelbad welke zorgt voor een betere stevigheid en een langere houdbaarheid van de kaas. Verder bevordert de pekel korstvorming en geeft het smaak aan de kaas. Hierna kan de kaas gerijpt worden, de rijpingstijd is echter afhankelijk van kaas tot kaas (VLAM, 2013).

2.2.1.2 Kaassoorten

Kaas kan ingedeeld worden op verschillende manieren, zoals op basis van de hittebehandeling van de melk, de hardheid van de kaas, de korst, het vetgehalte, de rijpingstijd en de smaak. In functie van deze thesis worden slechts drie indelingen besproken, namelijk de indeling volgens de hittebehandeling van de melk, de hardheid van de kaas en de korst. Een eerste methode is op basis van hittebehandeling van de melk. Hierbij worden 3 soorten onderscheiden, kaas gemaakt van rauwe, gethermiseerde en gepasteuriseerde melk. Wanneer de melk geen hittebehandeling ondergaat, wordt er van rauwmelkse kaas gesproken. Omdat hierbij geen micro-organismen worden afgedood, kan dit type kaas een groot risico vormen wat betreft microbiologische veiligheid (FAVV, 2011; Europese commissie, 2003). Als melk een milde hittebehandeling ondergaat waarbij bederfveroorzakende bacteriën geëlimineerd worden, wordt er van een gethermiseerde kaas gesproken. Hierbij wordt een temperatuur van 65-68°C bereikt die voor 5 à 15 minuten aangehouden wordt (European Commission, 2003). Deze hittebehandeling volstaat echter niet om met zekerheid alle pathogene bacteriën te verwijderen. Vandaar dat dit type kaas veelal over dezelfde kam geschoren wordt als rauwmelkse kaas wat betreft de alertheid tot aanwezigheid van pathogenen. Soms worden ze zelfs samen besproken in dezelfde categorie. Wanneer ieder partikel van het levensmiddel verhit wordt tot een bepaalde temperatuur, en deze temperatuur continu aangehouden wordt gedurende een specifieke tijdspanne (Tabel 2), wordt er van een gepasteuriseerde kaas gesproken. Meestal wordt gebruik gemaakt van een temperatuur van 72°C voor 15 seconden. Door de korte hittebehandeling bij hoge temperatuur worden de schadelijke bacteriën voldoende afgedood en blijft het grootste deel van de vitaminen behouden (FDA, 2013).

Tabel 2. Specifieke temperatuur en bijhorende tijd om een pasteurisatieproces uit te voeren.

Temperatuur (°C) Tijd (s)

63 (145°F)4 1800 (30min)

70 (158°F)4

72 (161°F)4 120 15

89 (191°F) 1

96 (204°F) 0,05

100 (212°F) 0,01

4 De tijdspanne welke geldt bij een temperatuur van 63 tot 72°C is enkel van toepassing als het

vetgehalte van het melkproduct 10% of meer bedraagt. Als het melkproduct zoetstoffen bevat of als het geconcentreerd is, dan moet de specifieke temperatuur met 3°C (5°F) verhoogd worden.

8

Een andere manier om kazen in te delen is op basis van hun hardheid. Zo kan er een onderscheid gemaakt worden tussen zachte, halfzachte, half-harde en harde kazen. De hardheid wordt bepaald op basis van het vochtgehalte. Het vochtgehalte kan op twee manieren weergegeven worden, namelijk een gewichtsgewogen vochtgehalte of het vochtgehalte op vetvrije basis. Dit wordt verduidelijkt in Tabel 3. Bij het EFSA wordt vooral gesproken over het vochtgehalte op vetvrije basis, waar bij het FDA vooral het gewichtsgewogen vochtgehalte gebruikt wordt. Beide manieren zijn echter juist en komen ongeveer overeen (FDA, 2013; EFSAc, 2013).

Tabel 3. Kaastype op basis van vochtgehalte.

Vochtgehalte Kaas type

Gewichtsgewogen5 Op vetvrije basis

50-85% >67%

Zachte kazen

* Vers of ongerijpt o.a. cottage cheese, kwark

* Gerijpt o.a. camembert, brie, neufchatel

* Gepekeld o.a. feta, domiati

39-50% 54-69%

Halfzacht

* Gerijpt met interne schimmelgroei (blauw geaderde kaas) o.a. stilton, roquefort, gorgonzola, danish blue

* Gerijpt door bacteriën met roodbacteriën op het oppervlak of externe schimmelgroei o.a. gourmelin, rosso di langa

* Gerijpt door bacteriën met gewassen korst o.a. bel paesa, gouda, edam, brick

<39% 49-56%

Half-hard

* Zonder ogen, gerijpt door bacteriën o.a. echte loo, orval, lucifer

* Met ogen, gerijpt door bacteriën o.a. emmental, gruyere

<34% <51% Hard

o.a. asiago old, parmezaanse kaas, romano, pecorino

Uit verder onderzoek zal echter blijken dat de definities niet zomaar toe te passen zijn en dat er eerder wat fingerspitzengefühl bij komt kijken. Zo kan zachte kaas vlot uitgesmeerd worden omdat het nog veel wei bevat. Harde kaas daarentegen heeft al veel vocht verloren tijdens het lange rijpingsproces waardoor deze veel brokkeliger is. Het verschil tussen halfzachte en half-harde kaas is minder gemakkelijk te definiëren en gebeurt eerder door met een vinger op de kaas te duwen. Bij een halfzachte kaas zal de afdruk van de vinger in de kaas blijven staan, terwijl een half-harde kaas zijn oorspronkelijke vorm terug zal aannemen. Dit is echter ook afhankelijk van de rijpheid van de kaas waardoor deze manier van classificeren niet zo accuraat is. (EFSAc, 2013; VLAM, 2013). Een laatste manier om kaas in te delen is o.b.v. de korst. Hier kunnen vier grote categorieën onderscheiden worden, namelijk de schimmelkorst, de roodbacterie korst, de natuurlijke korst en kaas zonder korst. Kazen met een schimmelkorst worden gevormd door ze voor het rijpen met eetbare schimmelculturen te beënten. Een kaas met een roodbacterie korst wordt gevormd door deze te beënten met een cultuur van roodbacteriën. Wanneer deze kazen geregeld gewassen worden in een bad met een zoutoplossing wordt een gewassen roodbacterie korst bekomen. Een

5 Hierbij is meer dan 50% van de vaste stof afkomstig van melkvet.

9

kaas met een natuurlijke korst wordt gerijpt in kamers waar de temperatuur en de vochtigheid gecontroleerd worden waardoor de buitenkant na verloop van tijd zal uitdrogen. Een laatste belangrijke categorie zijn de kazen zonder korst. Deze worden meestal voorzien van een paraffine, plastiek of wassen laagje waardoor uitdroging voorkomen wordt. Dit zijn echter niet de enige bestaande korstsoorten. Zo zijn er kazen op de markt welke een korst hebben die bestaat uit broodkruim doortrokken met calvados (VLAM, 2013; Fox, et al., 2004; Van Steenbergen, 2002).

2.2.2 Prevalentie van Listeria monocytogenes op kaas

Zoals hiervoor reeds vermeld is kaas een risicoproduct wat betreft de aanwezigheid van L. monocytogenes. Dit wordt aangetoond aan de hand van diverse prevalentiestudies waarbij producten geanalyseerd worden op de aanwezigheid van L. monocytogenes. Zo blijkt uit de meest recente grootschalige prevalentiestudie in de EU dat L. monocytogenes aanwezig was op 0.47% van de kazen welke getest werden (EFSAc, 2013). Dit getal is echter iets lager vergeleken met sommige vorige grootschalige studies (Tabel 4) (Busani, et al., 2005; Manfreda, et al., 2005; Prencipe, et al., 2004; EFSAc, 2013; EFSA, 2005; EFSA, 2006). Wat opgemerkt kan worden is dat de hittebehandeling van de kazen in al deze studies onderling verschillen. Zo is in de EFSA baseline studie 64.80% van de kazen gemaakt van gepasteuriseerde melk, 1.00% van gethermiseerde melk, 13.80% van rauwe melk en van 20.40% van de kazen kon de hittebehandeling niet achterhaald worden. In de andere studies uit Tabel 4 kon de hittebehandeling niet te achterhaald worden. Hierdoor kunnen deze studies niet zomaar onderling met elkaar vergeleken worden.

Om een duidelijker beeld te scheppen, is het beter om afzonderlijk de prevalentie van L. monocytogenes te bekijken in kazen met een verschillende hittebehandeling. Een lijst van deze studies is te terug te vinden in Tabel 5 en Tabel 6. Waar in Tabel 5 prevalentiestudies op rauwmelkse kazen beschouwd worden en in Tabel 6 prevalentiestudies op gepasteuriseerde kazen.

Dat kaas een enorm variabel product is naar aanwezigheid van L. monocytogenes blijkt duidelijk uit Tabel 5. Deze tabel bekijkt 9 studies die zich afspelen in verschillende periodes en verschillende landen. Hier is te zien dat er een enorme variabiliteit is in de gerapporteerde resultaten. De prevalentie schommelt namelijk tussen de 0.00 en 46.03% (Arslan & Özdemir, 2008; Colak, et al., 2007; Al-Tahiri, et al., 2008; Torres-Vitela, et al., 2012; Derra, et al., 2013; Arrese & Arroyo-Izaga, 2012; Brooks, et al., 2012; Cabedo, et al., 2008; Pintado, et al., 2005), wat een ontzettend grote spreiding is. Verder kan ook gezien worden dat het niet steeds over hetzelfde type kaas gaat. Wanneer de studies die minder dan 100 monsters evalueren of waarvan het aantal monsters niet bekend is achterwege gelaten worden, heeft de prevalentie een kleiner bereik. In dat geval kan een prevalentie beschouwd worden die schommelt tussen 2.00 en 12.00%. Wanneer hiervan het gewogen gemiddelde berekend wordt, bedraagt dit 4.99%. Hieruit blijkt dat zowel het gewogen gemiddelde als de spreiding van de prevalentie van de verschillende studies op rauwmelkse kazen hoger ligt dan de prevalentie die uit het EFSA rapport (EFSAc, 2013) naar voor kwam.

10

Tabel 4. Prevalentiestudies waarbij meer dan 1000 monsters beschouwd worden.

Jaar 2001 2003 2005 2005 2006 2006 2013

Land Italië Italië Italië EU EU Italië EU

Type winkels kleinhandel,

voedingsindustrie voedingsindustrie - - - -

Supermarkt of kleinhandel

Wat kaas Gorgonzola kaas kaas gepasteuriseerde

kaas kaas kaas

zachte of halfzachte kaas

Aantal monsters 13858 1489 2132 8062 10262 3861 3452

Melk-behandeling

Gepasteuriseerd - - 15,20% 100% - - 64,80%

Gethermiseerd - - - - - - 1,00%

Rauw - - - - - - 13,80%

Niet gekend 100% 100% 84,80% - 100% 100% 20,40%

Bewaar-temperatuur

Gemiddelde - - 0-4°C - - - 4,1°C

St. Afw. - - - - - - 1,8°C

Prevalentie 1,07% 2,08% 2,20% 0,52% 0,70% 1,40% 0,47%

11

Tabel 5. Prevalentiestudies waarbij enkel rauwmelkse kazen beschouwd worden6.

Jaar 1995 2004 2004 2008 2008 2012 2012 2012 2013

Land Portugal Turkije Turkije Jordanië Spanje USA Mexico Spanje Ethiopië

Regio Beira Baixa

- Istanbul Karak district Catalonië - Jalisco State Baskenland Addis Ababa

Type winkel lokale klein-

handel

lokale kleinhandel

diverse winkels

lokale kleinhandel

kleinhandel en voedings-

industrie

gespecialiseerde kleinhandel,

boerenmarken, on-line

4 groothandels kleinhandel -

Wat zachte

schapen-kaas

halfzachte thuis-

gemaakte witte kaas

half-harde Tulum kaas

Baladi, zachte verse schapenkaas

verse zoute kaas

rauwmelkse kaas

Panela harde verse kaas

Abodebera verse kaas

half-harde Idiezabal

kaas

cottage cheese

Aantal monsters

63 142 250 450 - 41 100 100 51 -

Bewaartemp. <5 - 14°C - 6-10°C - - 1,7°C - 3-4°C -

Prevalentie 46,03% 9,15% 4,80% 2,00% 1,30% 0,00% 6,00% 12,00% 0,00% 1,70%

Tabel 6. Prevalentiestudies waarbij enkel gepasteuriseerde kazen beschouwd worden.

Jaar 2004 2005 2010

Land Portugal EU Italië

Type winkels kleinhandel, producenten - supermarkten

Wat gepasteuriseerde kaas gepasteuriseerde kaas cream cheese en mozarella

Aantal monsters 371 8062 294

Bewaartemperatuur - - -

Prevalentie 1,62% 0,52% 1,85%

6 De prevalentiestudies welke minder dan 100 monsters beschouwen of waarvan het aantal monsters niet bekend is, worden weergegeven in een grijze kleur.

12

Bij het analyseren van Tabel 6 worden meer eenduidige resultaten tussen de verschillende studies teruggevonden. Bij deze drie studies die enkel gepasteuriseerde kazen beschouwen, schommelt de prevalentie tussen de 0.52 en 1.85% (EFSA, 2005; Di Pinto, et al., 2010; Mena, et al., 2004). Het gewogen gemiddelde bedraagt in dit geval 0.61%. Dit getal komt in de buurt van de prevalentie die werd teruggevonden in het EFSA rapport. De resultaten uit Tabel 5 en Tabel 6 bevestigen de gangbare gedachte dat rauwmelkse kaas een groter risico met zich meebrengt dan gepasteuriseerde kaas welke een hittebehandeling ondergaan heeft.

Voor de volledigheid dienen ook twee studies vermeld worden die resultaten geven die enigszins afwijken van de hierboven weergegeven resultaten. Het betreft een studie die in 2012 uitgevoerd werd op 350 witte gepekelde kazen waarvan 67.14% gepasteuriseerd en 32.86% rauwmelks waren (Osaili, et al., 2012). Hier werd een prevalentie teruggevonden van 10.64% voor de gepasteuriseerde kazen en 12.17% voor de rauwmelkse kazen. De prevalentie voor de gepasteuriseerde kazen in deze studie ligt beduidend hoger dan de prevalentie uit de studies in Tabel 6. Kanttekening hierbij is dat deze laatste studie kazen bekijkt die lokaal verkocht werden. De andere studie die vermeld dient te worden, handelt over 329 roodbacterie kazen die afkomstig zijn van verschillende plaatsen in Europa waarvan 49.54% gepasteuriseerde en 50.46% rauwmelkse kazen (Rudolf & Scherer, 2001). Uit deze studie blijkt dat de prevalentie voor de geteste gepasteuriseerde kazen 7.98% en die voor de rauwmelkse kazen 4.82% bedraagt. De resultaten van deze twee studies wijken lichtelijk af van de resultaten die hierboven (Tabel 6) bekomen worden als naar de prevalentie op de gepasteuriseerde kazen gekeken wordt. Een verklaring voor deze afwijkende resultaten werd niet in de artikels teruggevonden. In het laatste artikel wordt wel gesteld dat kruiscontaminatie in de zuivelboerderij een belangrijke factor tot besmetting is.

2.2.3 Productterugroepingen in België

Prevalentiestudies bepalen de kans dat er een besmet levensmiddel teruggevonden zal worden. Logischerwijs dient een levensmiddel waarbij een gezondheidsrisico vastgesteld wordt zo snel mogelijk van de markt gehaald te worden. Het is dan ook verplicht deze vaststelling te melden. In België zal het FAVV op de hoogte gesteld worden. Dit federaal agentschap heeft een databank waarin het product en het gevaar dat er op dat moment mee gepaard gaat opgenomen kan worden. Deze databanken zijn vrij te consulteren voor iedereen. Door het oplijsten van de verschillende risico’s kan dan ook getracht worden om een beeld te scheppen rond het gevaar van L. monocytogenes in België en meer bepaald in kaas. De productterugroepingen in België voor de periode 01/01/2008 t.e.m. 31/12/2013 zijn terug te vinden in Tabel 7.

13

Tabel 7. Overzicht van de productterugroepingen in België (01/01/2008 - 31/12/2013)

2008 2009 2010 2011 2012 2013 Totaal

Aantal % Aantal % Aantal % Aantal % Aantal % Aantal % Aantal %

Aantal recalls 59 47 25 57 64 55 307

Pathogene bacteriën 12 20,34% 2 4,26% 9 36,00% 15 26,32% 35 54,69% 19 34,55% 92 29,97%

Andere microbiologische oorzaken (o.a. schimmel, toxine, virus)

2 3,39% 0 0,00% 0 0,00% 1 1,75% 0 0,00% 3 5,45% 6 1,95%

Chemische en fysische oorzaken

45 76,27% 45 95,74% 16 64,00% 41 71,93% 29 45,31% 33 60,00% 209 68,08%

Listeria monocytogenes 3 5,08% 1 2,13% 2 8,00% 10 17,54% 17 26,56% 8 14,55% 41 13,36%

Kaas 3 100,00% 1 100,00% 0 0,00% 4 40,00% 8 47,06% 4 50,00% 20 48,78%

Gerookte zalm 0 0,00% 0 0,00% 1 50,00% 0 0,00% 0 0,00% 1 12,50% 2 4,88%

Vlees en vleeswaren 0 0,00% 0 0,00% 1 50,00% 6 60,00% 5 29,41% 3 37,50% 15 36,59%

Groenten 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 2 11,76% 0 0,00% 2 4,88%

Salades 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 1 5,88% 0 0,00% 1 2,44%

Andere 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 1 5,88% 0 0,00% 1 2,44%

Salmonella 8 13,56% 1 2,13% 6 24,00% 4 7,02% 14 21,88% 8 14,55% 41 13,36%

14

Uit Tabel 7 valt af te leiden dat niet alleen de microbiologische gevaren van belang zijn bij een productterugroeping. Zo spelen zowel chemische als fysische gevaren een grote rol bij producten die van de markt gehaald worden. Onder chemische gevaren verstaat men o.a. migratie of verontreiniging door bv. minerale olie of zware metalen. Fysische gevaren zijn vooral te wijten aan stukjes glas of stukjes metaal die in het product vervat zitten. Wanneer meer specifiek gekeken wordt naar de pathogenen valt op te merken dat in deze periode evenveel recalls te wijten zijn aan L. monocytogenes als aan Salmonella. Samen vertegenwoordigen ze een kleine 27% van de recalls in die periode. Als de recalls die te wijten zijn aan L. monocytogenes verder geanalyseerd worden, kan opgemerkt worden dat 48.78% te wijten is aan kaas, 36.59% aan vlees en vleeswaren, 4.88% aan gerookte zalm en 4.88% aan groenten. Kaas vormt dus het grootste aandeel aan recalls in België in die periode. Hieruit kan de bezorgdheid om kaas nogmaals bevestigd worden. In tegenstelling tot de prevalentiestudies, waar niet altijd details over de verschillende te testen kazen teruggevonden kunnen worden, kan hier een duidelijk onderscheid gemaakt worden tussen de verschillende soorten. Hieruit blijkt dat van de 20 recalls op kaas in die periode 11 (55%) te wijten zijn aan rauwmelkse kazen, 7 (35%) aan gepasteuriseerde kazen en van de overige 2 (10%) kazen is de hittebehandeling niet bekend. Verder zijn 55% van de kazen zacht tot halfzacht, 20% half-hard tot hard, 10% vers, 5% zijn deels zacht tot halfzacht en half-hard tot hard en van 10% is de hardheid niet gekend. Gedetailleerde info is terug te vinden in Bijlage 1.

2.2.4 Productterugroepingen in de EU

Ook in de EU is meldingsplicht van kracht. Het netwerk dat deze meldingen samenbrengt en oplijst is het RASFF. Dit Europees netwerk werd opgericht in 1979 en zorgt ervoor dat problemen met producten waaraan een gezondheidsrisico verbonden is snel tussen de lidstaten gecommuniceerd kunnen worden. Hierdoor kan dat product snel van de markt gehaald worden in de hoop dat enig gevaar voor de gezondheid vermeden kan worden. Door de databank van het FAVV en het RASFF naast elkaar te leggen, kan er getracht worden een vergelijking te maken tussen België en de EU. Dit is echter niet zo gemakkelijk omdat beide databanken onderling enigszins verschillen. Zo gaat het bij het FAVV over productterugroepingen en bij het RASFF over ‘alerts’ of alarmeringen. Wanneer er bij het RASFF een melding gebeurt, kan vervolgens een product teruggeroepen worden. Een overzicht van het aantal meldingen in de periode van 1 januari 2008 tot 31 december 2013 is te vinden in Tabel 8. Wanneer deze twee databanken bestudeerd worden, is te zien dat het percentage meldingen van pathogene bacteriën in België ietwat hoger ligt dan in de rest van de EU (29.97 t.o.v. 17.39%). Verder komt Salmonella op Europees vlak veel vaker voor dan Listeria monocytogenes. Dit is logisch aangezien uit het EFSA rapport van 2011 blijkt dat het aantal ziektegevallen in de EU door Salmonella zo’n 65 keer hoger ligt dan door Listeria monocytogenes (EFSAb, 2013). Wat wel in beide databanken terug te vinden is, is dat het aantal ziektegevallen door met L. monocytogenes besmette kaas iets hoger ligt dan het aantal ziektegevallen door het aantal met L. monocytogenes besmet vlees. Voorts wordt duidelijk dat kaas hoger scoort dan gerookte zalm in België. Dit is echter niet het geval in de rest van de EU. Uit dit alles blijkt duidelijk dat kaas een groot risicoproduct is. Wanneer verder gekeken wordt naar gerookte zalm, is te zien dat in België slechts 2 ziektegevallen voorkwamen in 6

15

jaar. Wanneer dit vergeleken wordt met het aantal meldingen bij RASFF is te zien dat het aantal hier veel hoger ligt, namelijk 110. Het land dat het meest aantal alerts heeft, is Italië met 70 gevallen in die periode (European Commission, 2013; FAVV - AFSCA, 2013). Wanneer deze resultaten samen beschouwd worden met de resultaten van de EFSA baseline studie zijn er toch enkele zaken die in het oog springen. Zo ligt het percentage van alerts in de EU voor L. monocytogenes op gerookte zalm op 30.93% en dat voor kaas op 23.92%. Wanneer dit vergeleken wordt met de prevalentie van zalm 10.3% en kaas 0.47% voor L. monocytogenes kan opgemerkt worden dat het verschil in de prevalentie veel groter is dan het verschil in alarmeringen.

2.2.5 Uitbraken in Europa

2.2.5.1 European Union Summary Report

In navolging van de prevalentie en het aantal alarmeringen in de EU kan ook gekeken worden naar de uitbraken die met kaas geassocieerd zijn. Er wordt van een uitbraak gesproken vanaf het moment dat twee of meer mensen ziek worden van een bepaald levensmiddel (CDCb, 2013). De uitbraken in Europa worden jaarlijks opgelijst in The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks. Deze rapporten worden gemaakt door samenwerking van EFSA en ECDC. EFSA, de Europese autoriteit voor voedselveiligheid, is een agentschap van de Europese Unie dat opgericht werd in 2002. Het werk van EFSA valt uiteen in 2 delen: risicobeoordeling en risicocommunicatie. Het ECDC, het Europees Centrum voor ziektepreventie en –bestrijding, is tevens een agentschap van de Europese Unie en werd opgericht in 2005. Het ECDC zal informatie en analyses van zoönotische gevallen in mensen verschaffen. De rapporten zijn beschikbaar vanaf het jaar 2007. Doordat deze slechts gemaakt kunnen worden na dataverzameling van het afgelopen jaar duurt het meestal een jaar voordat het summary report van het voorgaande jaar beschikbaar is. Zo werd het rapport over 2011 slechts uitgebracht op 9 april 2013. Uit analyse van deze rapporten kan afgeleid worden dat er in de periode van 2007 tot 2011 12 uitbraken plaatsvonden welke te wijten waren aan L. monocytogenes (Tabel 9). Van deze 12 zijn er 4 uitbraken geassocieerd met kaas. Hierbij was er 1 uitbraak te wijten aan zachte kaas waarvan de hittebehandeling niet gekend was, 1 aan huisgemaakte gepasteuriseerde kaas en de overige 2 aan Quargel, een Tsjechische traditionele rauwmelkse zachte kaas. Hieruit volgt dat 33.33% van de uitbraken in Europa waarvan L. monocytogenes aan de oorzaak lag te wijten was aan kaas. Van 3 van de 12 uitbraken kon het product dat de besmetting veroorzaakte niet achterhaald worden. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de variabele incubatieperiode die gepaard gaat met listeriose (enkele tot 30 dagen) (Food-info, 2013; FDA, 2012). Hierdoor wordt het steeds moeilijker om de oorzaak te achterhalen aangezien mensen vergeten wat ze in de periode voordien gegeten hebben, of omdat het product dat besmet was reeds weggegooid of opgegeten is. Het is dus ook mogelijke dat de verkeerde oorzaak aangewezen wordt. Verder zijn er nog 2 uitbraken te wijten aan varkensvlees. Gerookte zalm komt in deze periode echter niet aan bod tenzij het één van de producten was dat niet geïdentificeerd kon worden (ECDC, 2007; ECDC, 2008; ECDC, 2009; ECDC, 2010; ECDC, 2011; ECDC, 2012; ECDCb, 2013; EFSA, 2005; EFSA, 2010; EFSA, 2011).

16

Tabel 8. Het aantal meldingen aan het FAVV en het RASFF in de periode van 01/01/2008 tot 31/12/2013 (European Commission, 2013; FAVV - AFSCA, 2013)

FAVV RASFF

# %7 # %

Totaal 307 100,00% 19756 100,00%

Pathogene bacteriën 92 29,97% 3435 17,39%

Salmonella 41 13,36% 2309 11,69%

Listeria monocytogenes 41 13,36% 485 2,45%

L. monocytogenes op kaas 20 48,78% 116 23,92%

L. monocytogenes op vlees 15 36,59% 99 20,41%

L. monocytogenes op gerookte zalm8

2 4,88% 110 30,93%

Tabel 9. Overzicht van de uitbraken die in de EFSA summary reports besproken worden.

2007 2008 2009 2010 2011

Land Noorwegen Oostenrijk Oostenrijk Tsjechië Duitsland Denemarken Verenigd Koninkrijk

Duitsland België Finland Verenigd koninkrijk

Zwitserland

Uitbraken 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1

Levensmiddel Zachte

kaas -

Quargel

Varkens-

vlees - -

Huis-gemaakte

kaas

Bakkerij-producten

Gemengde voeding

Varkens-vlees

Gevallen 21 14 25 9 6 8 14 12 11 - - 9

Hospitalisaties 21 7 25 9 6 8 14 8 11 - - -

Doden 5 0 5 4 2 2 3 1 4 - - -

7 Percentages worden berekend o.b.v. het totaal. Uitzonderingen hierbij zijn ‘L. monocytogenes op kaas, vlees en gerookte zalm’, deze percentages worden

berekend o.b.v. het aantal meldingen van Listeria monocytogenes. 8 Wanneer er bij RASFF gekeken wordt naar het aantal meldingen voor gerookte vis i.p.v. gerookte zalm dan stijgt het aantal van 110 naar 150, wat neerkomt

op een percentage van 31,12%.

17

2.2.5.2 Eurosurveillance

Het jaarlijkse European Union Summary Report dat hierboven nagegaan wordt, is echter slechts een samenvatting waardoor het maar een beperkte hoeveelheid informatie bevat. Om meer gegevens te verkrijgen wordt dan ook een beroep gedaan op Eurosurveillance. Dit is een peer-reviewed openbaar medisch tijdschrift dat sinds 1995 bestaat. Het spitst zich vooral toe op epidemiologie en andere onderwerpen die van belang zijn voor de EU. Sinds 2007 wordt het wekelijks uitgegeven door ECDC (ECDCc, 2013). Na raadpleging van deze databank en enkele artikels kunnen 20 L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken teruggevonden worden in Europa in de periode van 2000 tot 2012. Op zich lijken dat er niet zoveel op een periode van 12 jaar, maar wel als het aantal uitbraken geassocieerd met besmette kaas bestudeerd wordt. Zo zijn 13 van 20 uitbraken (65%) te wijten aan L. monocytogenes op kaas. Dat is meer dan het percentage van 33% dat afgeleid wordt in de periode van 2007 tot 2011 uit de jaarrapporten van het EFSA en het ECDC.

Figuur 1. Karakterisering van de 13 uitbraken in de periode 2000 tot 2012.

De karakterisering van deze 13 uitbraken met als oorzaak besmette kaas is te zien in Figuur 1. Wanneer gekeken wordt welke soort kaas het meest geassocieerd wordt met een uitbraak komt zachte kaas naar voor. Dit komt overeen met wat in de literatuur beschreven staat. Verder wordt in de literatuur meestal gesproken over rauwmelkse kazen als risicoproduct. Dezelfde conclusie kan echter niet zomaar afgeleid worden uit bovenstaande figuur. Er zijn namelijk teveel kazen waarvan de hittebehandeling niet achterhaald kon worden. Hierdoor is het niet mogelijk om een vergelijking te maken met de literatuur. Bij de beschrijving van het serotype doet zich hetzelfde probleem voor. In de literatuur wordt serotype 1/2a meestal geassocieerd met individuele gevallen en serotype 4b met uitbraken. Ook hier kan niet dezelfde conclusie getrokken worden uit bovenstaande figuur, aangezien er teveel gevallen zijn waar het serotype niet beschreven werd (Koch, et al., 2010; Johnsen, et al., 2010; EFSA, 2006; Vit, et al., 2007; EFSA, 2007; Fretz, et al., 2010; Yde, et al., 2012; Bille, et al., 2006; de Castro, et al., 2012; Fretz, et al., 2010).

76,92%

15,38%

7,69%

Textuur

Zacht - halfzacht

Half-hard - hard

Niet gekend

25,00%

41,67%

33,33%

Hittebehandeling

Rauwmelks

Gepasteuriseerd

Niet gekend

38,46%

7,69%

7,69%

46,15%

Serotype

1/2a

1/2b

4b

Niet gekend

18

Wanneer de resterende 7 uitbraken in deze periode geanalyseerd werden, welke niet geassocieerd waren met kaas, kon gezien worden dat er hiervan 4 met vlees gerelateerd waren, 1 met voorverpakte sandwiches, 1 met ijstaart en van 1 uitbraak was de oorzaak niet bekend (Smith, et al., 2011; Kvistholm Jensen, et al., 2010; de Valk, et al., 2001; Hächler, et al., 2013; Dawson, et al., 2006). Hieruit kan afgeleid worden dat kaas een ontzettend groot risicoproduct is in de EU dat vaker betrokken is bij uitbraken met L. monocytogenes dan enig ander product. Een kleine kanttekening die hierbij gemaakt moet worden, is dat hoewel er geen enkele uitbraak met gerookte zalm gerapporteerd werd, dit niet wil zeggen dat er geen individuele ziektegevallen waren in die periode. Gerookte zalm kan dus wel degelijk behoren tot de risicoproducten, ook al komt dit niet naar voor uit deze data. Uitgebreide informatie is te vinden in Bijlage 2.

2.2.5.3 Uitbraken opsporen

Een belangrijke manier om snel uitbraken op te sporen en de oorzaak ervan te achterhalen is genotypering. Wanneer Listeria monocytogenes uit een ziek individu, voedingsmatrix of van een oppervlakte geïsoleerd wordt, kan men via pulsed field gel electrophoresis (PFGE) het DNA patroon van de bacterie analyseren. Dit DNA patroon kan in een databank opgenomen worden. Wanneer datzelfde DNA patroon bij een ander ziek individu, voedingsmatrix of oppervlakte vastgesteld wordt, betekent dit dat de besmetting afkomstig is van dezelfde bron. Zo kunnen individuele gevallen met elkaar verbonden worden en kan gemakkelijk een gemeenschappelijke oorsprong van besmetting achterhaald worden. Een voorbeeld hiervan zijn 2 individuen die ziek worden door L. monocytogenes met dezelfde DNA fingerprint. De bacteriën zullen afkomstig zijn van dezelfde bron (bijvoorbeeld hetzelfde besmette product). Indien beide personen voordat ze ziek werden dezelfde soort kaas gegeten hadden, is er veel kans dat dit het besmette product was. Dit dient natuurlijk eerst geverifieerd te worden door het product in kwestie te onderzoeken. Wanneer dit product niet meer beschikbaar is doordat de periode tussen het consumeren van het besmette product en het ziek worden te groot was, kan er onderzoek gedaan worden op de plaats van oorsprong van het product. In dit geval zal dat waarschijnlijk de zuivelfabriek zijn waar het product gemaakt werd. Dit systeem is in de V.S. reeds ontzettend goed ontwikkeld. Daar wordt gebruik gemaakt van PulseNet, een netwerk waarop alle DNA fingerprints verzameld worden. In navolging van Amerika werd in Europa eenzelfde soort netwerk opgericht, namelijk PulseNet Europe. Dit netwerk werd in september 2004 opgericht door Met-Vet-Net, een virtueel Europees zoönose netwerk dat tot 2009 gesponsord werd door verschillende Europese landen. De sponsoring van PulseNet Europe stopte echter in november 2006. Hierdoor werd het administratief werk op een laag pitje gezet tot de overname van het ECDC in 2008 (PulseNet Europe, 2013). Het ECDC dat in mei 2005 opgericht werd, stelde in januari 2008 The European Surveillance System (TESSy) voor. Dit is een zeer flexibel metadatagedreven systeem voor de verzameling, validatie, opkuis, analyse en verspreiding van data. Alle lidstaten (28) en de EER (Europese Economische Ruimte) rapporteren hun data zoals aangegeven staat in Decision No 2119/98/EC. Dit netwerk staat echter nog niet volledig op punt. Zo wordt aangegeven in het ECDC Annual Work Programme 2013 dat de TESSy molecular surveillance component nog verder geïmplementeerd dient te worden en dat de integratie van microbiologische en epidemiologische surveillance zal voortgezet worden de komende jaren (ECDCd, 2013).

19

Hieruit blijkt duidelijk dat de databank van Europa omtrent uitbraken nog niet volledig op punt staat. Dat wordt ook duidelijk bij een poging tot het oplijsten van alle uitbraken in Europa en in de EU. Dit is enkel mogelijk door de combinatie van verschillende bronnen waaronder Eurosurveillance en andere databanken zoals PubMed. Het CDC, de Amerikaanse tegenhanger van ECDC, daarentegen heeft een overzichtelijke databank waaruit zeer gemakkelijk selectieve informatie bekomen kan worden over uitbraken in de Verenigde Staten. Dit is waarschijnlijk het systeem waar na verloop van tijd naartoe gegaan zal worden (CDCb, 2013).

2.3 Melkzuurbacteriën in competitie met Listeria monocytogenes

In de literatuur worden veelal melkzuurbacteriën aangehaald als natuurlijke competitie voor L. monocytogenes. Hieronder wordt hun functie en interactie met L. monocytogenes verder uitgediept.

2.3.1 Algemeen

Melkzuurbacteriën (MZB) zijn een essentieel onderdeel bij de kaasbereiding en worden toegevoegd onder de noemer zuursel. Ze zijn op te delen in twee belangrijke groepen namelijk de zuurvormers of homofermentatieve MZB en de aromavormers of heterofermentatieve MZB. De eerste soort zet hoofdzakelijk lactose om tot melkzuur. Enkele voorbeelden hierbij zijn Lactococcus lactis subsp. lactis en subsp. cremoris. De tweede soort produceert naast melkzuur nog tal van andere stoffen die zullen bijdragen tot de smaak, zoals bv. azijnzuur, maar ook andere functies hebben zoals het produceren van CO2, waardoor gaten in de kaas gevormd worden. De aromavormers zijn meestal Leuconostoc species (TAD Zuivel, ILVO, 2006). De voornaamste functies van MZB in kaas zijn verzuring, competitie met schadelijke bacteriën, wei uitdrijving, kaasrijping en aromavorming. Zoals eerder vermeld zullen MZB melkzuur produceren uit lactose met een pH daling tot gevolg. Deze verzuring biedt bescherming tegen pathogene en technologisch ongewenste bacteriën. Bovendien zal er bij grote aantallen van MZB competitie optreden met pathogene bacteriën voor nutriënten. Hierdoor wordt de groei van deze laatste geremd. Dit wordt ook wel beschreven als het ‘Jameson effect’. Verder zullen MZB door de verzuring ervoor zorgen dat de wrongel samentrekt waardoor de wei uitgedreven wordt. Ze zullen ook een rol spelen in de eiwitafbraak wat bijdraagt tot de geur en de smaak tijdens de kaasrijping (TAD Zuivel, ILVO, 2006; Izquierdo, et al., 2009).

2.3.2 Het effect van de aanwezigheid van melkzuurbacteriën op Listeria monocytogenes.

Het gebruik van melkzuurbacteriën als natuurlijke bestrijdingsmethode tegen L. monocytogenes biedt grote voordelen. Zeker in gebieden waar niet altijd in hygiënische omstandigheden gewerkt wordt, zoals in bepaalde gebieden in Afrika en India, biedt deze methode goede vooruitzichten (Singh & Prakash, 2009; Olasupo, et al., 1999). Hoewel er al veel onderzoek uitgevoerd werd, blijven er nog steeds enkele onzekerheden naar de interactie tussen MZB en L. monocytogenes. Bovendien bestaat de microbiologische flora van kaas niet enkel uit MZB maar ook uit andere bacteriën en schimmels. Dit zorgt ervoor dat de resultaten van de onderzoeken met betrekking tot MZB en L. monocytogenes steeds zullen beschikken over een bepaalde variatie, welke voor onzekerheden zorgt naar interpretatie toe. Het is dan ook niet zo gemakkelijk om eenduidige conclusies te trekken. Meerdere onderzoeken

20

tonen wel aan dat de werking van MZB als inhibitiemethode voor L. monocytogenes berust op drie belangrijke factoren.

2.3.2.1 Het Jameson effect

Met het Jameson effect wordt bedoeld dat bij competitie naar dezelfde nutriënten bacterie x bacterie y zal onderdrukken waardoor bacterie x zal uitgroeien. Hierdoor kan bacterie y niet uitgroeien. Dit effect werd voor het eerst beschreven door Jameson in 1962 waarbij hoge aantallen aan Salmonella de groei van E. coli onderdrukten. Dit effect zal echter pas waargenomen worden als bacterie x in de groeifase zit en wanneer beide organismes strijden voor dezelfde nutriënten (Izquierdo, et al., 2009; Mellefont, et al., 2008).

2.3.2.2 pH daling

Zoals eerder vermeld zorgen MZB voor een daling in pH, omdat ze lactose omzetten tot melkzuur. De daling in zuurtegraad zorgt ervoor dat L. monocytogenes ontzettend veel energie moet verbruiken om zijn interne pH constant te houden. Vandaar dat een lage pH de groei zal remmen. Verder zal het ongedissocieerde melkzuur ervoor zorgen dat de elektrochemische proton gradiënt verstoord wordt, wat kan leiden tot bacteriostase en uiteindelijk celdood. Wanneer de pH echter verhoogd wordt zal de inhiberende activiteit van de MZB afnemen waardoor L. monocytogenes alsnog kan uitgroeien. Dit werd o.a. aangetoond in gerookte zalm waar bij verhoging van de pH de inhiberende werking verloren ging. In dit geval ging het om Lactobacillus spp. (Tomé, et al., 2006).

2.3.2.3 Bacteriocine

Een laatste belangrijke manier om de groei van L. monocytogenes te inhiberen is de productie van bacteriocines. Dit zijn proteïneachtige toxines die geproduceerd worden door bacteriën om groei van andere bacteriën die aanspraak maken op dezelfde nutriënten te inhiberen. Niet alle melkzuurbacteriën zullen bacteriocines produceren. De bekendste vorm van deze toxines is nisine. Het wordt gevormd bij de fermentatie van melk door Lactococcus lactis en kan gebruikt worden als natuurlijk conserveermiddel in voeding onder E-nummer E234 (Olasupo, et al., 1999). Er zijn zelfs gevallen beschreven waar bij 4°C L. lactis niet kon groeien maar wel in staat was om nisine te produceren en zo L. monocytogenes inhibeerde (Zhao, et al., 2004). Andere bacteriocines zijn pediocine dat geproduceerd wordt door Lactococcus lactis, lacticin en enterocine die geproduceerd worden door Enterococcus faecilis (Rodriguez, et al., 2001).

21

3. Methodologie Hoevewinkels en delicatessenzaken vragen zich af of de strenge eisen rond hygiëne en koeling voor het ambachtelijke productie- en rijpingsproces van kaas wel nodig zijn. Om hierop een antwoord te kunnen bieden zal er eerst onderzoek uitgevoerd moeten worden naar de interactie tussen de intrinsieke (pH, aw ...) en extrinsieke (bewaartemperatuur, bewaartijd ...) parameters van kaas en L. monocytogenes. Dit onderzoek valt uiteen in vier grote delen. In een eerste plaats is er de prevalentiescreening naar kazen met verschillende soorten hittebehandeling en hardheid. Vervolgens worden er een reeks challengetesten uitgevoerd welke in deel drie theoretisch gemodelleerd zullen worden. Zo kunnen de risico’s op het aantreffen van verhoogde aantallen L. monocytogenes beter ingeschat worden. Het laatste deel bestaat uit een analyse van de resultaten van challengetesten welke uitgevoerd werden door het accreditatielabo (Belac, verbonden aan het Laboratorium voor Levensmiddelenmicrobiologie en –conservering, Fac. Bio-ir. Wetenschappen, Universiteit Gent). Op deze manier kan de noodzaak ingeschat worden tot strengere richtlijnen of de tolerantie van lage aantallen L. monocytogenes.

3.1 Prevalentiescreening rauwmelkse en gepasteuriseerde,

zachte en half-harde kazen

Als eerste stap wordt een prevalentiescreening uitgevoerd op 60 verschillende soorten kaas. Deze screening heeft als doel de algemene karakteristieken van de verschillende soorten kaas in kaart te brengen. De parameters die hierbij geanalyseerd worden zijn pH, aw, zoutgehalte, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, melkzuurbacteriën en Listeria monocytogenes.

3.1.1 Aankoop kazen

Om een grote variatie aan kazen te bekomen gebeuren de aankopen in 7 gespecialiseerde kaaswinkels en 5 marktkramen. Aangezien getracht wordt om de blootstelling aan L. monocytogenes in ambachtelijke kazen te achterhalen voor de consument worden de kazen gekocht onder het mom van een gewone klant. Er worden in totaal 60 kazen gekocht waarvan 30 zachte tot halfzachte kazen en 30 half-harde tot harde kazen. Hiervan zijn er 29 kazen gemaakt van rauwe melk, 6 van gethermiseerde melk, 23 van gepasteuriseerde melk en van 2 kazen is de hittebehandeling van de melk niet gekend. De kazen worden bewaard bij 4°C tot het moment van analyse welke gebeurt op de dag van de aankoop en in enkele gevallen maximaal 2 dagen later.

3.1.2 Bepaling parameters

De parameters die bij elke aangekochte kaas bepaald worden, zijn: de zuurtegraad (pH), de wateractiviteit (aw), het zoutgehalte, de concentratie aan Staphylococcus aureus, Escherichia coli, melkzuurbacteriën en Listeria monocytogenes. Aangezien een kwantitatieve bepaling van L. monocytogenes niet steeds mogelijk is vanwege de lage aantallen waarmee deze aanwezig is, kan er ook gebruik gemaakt worden van een kwalitatieve methode om de aanwezigheid van L. monocytogenes in levensmiddelen te analyseren.

22

3.1.2.1 Zuurtegraad (pH)

De zuurtegraad van de kazen wordt bepaald m.b.v. een pH-meter (Mettler Toledo SevenEasy) (Figuur 2). Alvorens deze gebruikt kan worden, dient de kaas gemixt te worden. Omdat dit in de praktijk moeilijk uit te voeren is, wordt er voor een alternatieve manier gekozen. Wanneer het over een kaas gaat die gemakkelijk te kneden is (zacht tot halfzacht) zal de kaas in een stomacherzak gekneed worden tot een homogeen mengsel. Wanneer het gaat over een half-harde tot harde kaas worden er 2 metingen uitgevoerd. Eén aan de rand van de kaas bij de korst en de andere meer in het midden van de kaas. Hiervan wordt het gemiddelde berekend.

Figuur 2. Mettler Toledo SevenEasy pH meter.

3.1.2.2 Wateractiviteit (aw)

De wateractiviteit van de kazen wordt bepaald door gebruik te maken van een aw-cryometer Typ AWK-20 (NAGY messysteme GmbH, Gaufelden, Germany) (Figuur 3). Deze aw-meter maakt gebruik van cryoscopie of vriespuntverlaging, een methode die gebruikt wordt om een aw te bepalen die hoger ligt dan 0.85 (Shafiur Rahman, 2008). Aangezien kaas een aw heeft die hoger ligt dan 0.93 is dit een wenselijke methode om te gebruiken.

Figuur 3. aw-kryometer Typ AWK-20.

3.1.2.3 Zoutgehalte

Om het zoutgehalte (NaCl-gehalte) te bepalen wordt gebruik gemaakt van de methode van Mohr. Hiervoor wordt een kaasmonster met een gewicht tussen 1 en 2 gram afgewogen in een erlenmeyer. Hieraan wordt 100ml kokend water toegevoegd waardoor het zout (NaCl) dat in de kaas aanwezig is gemakkelijk zal oplossen. Vervolgens wordt de hoeveelheid chloride-ionen bepaald door een neerslagtitratie

23

met zilvernitraat uit te voeren. Als indicator zal een 5% K2CrO4 oplossing gebruikt worden. Hiervan wordt 2ml toegevoegd. Deze indicator zal de oplossing van kaas en kokend water een felgele kleur geven welke verandert naar roodbruin wanneer het equivalentiepunt bereikt wordt. De roodbruine kleur wordt veroorzaakt doordat er Ag2CrO4-ionen gevormd worden. Hierna kan Vergelijking 1 toegepast worden om het gewichtspercentage van NaCl in de kaas te bepalen.

Vergelijking 1. Berekening van het gewichtspercentage van NaCl in kaas.

( )

Hierbij is V1 het getitreerde volume van het monster en V0 het getitreerde volume van de referentie.

3.1.2.4 Kwantitatieve bepaling van de microbiologische parameters

Aanleggen van een verdunningsreeks Om de concentratie aan S. aureus, E. coli, melkzuurbacteriën en L. monocytogenes in kaas te bepalen, wordt ISO 6887-1:1999 toegepast als monstervoorbereiding (ISOa, 1999). Hiervoor wordt 25 gram kaas afgewogen in een stomacher zak, waaraan 225 gram PPS of pepton fysiologische zoutoplossing toegevoegd wordt. PPS wordt gemaakt door 8.5 gram zout en 1 gram pepton af te wegen, hieraan 1l gedestilleerd water toe te voegen en deze oplossing te autoclaveren (voor 15 minuten bij 121°C). Vervolgens wordt de zak gestomacherd. Aangezien er aan 25 gram kaas 9 keer het gewicht aan PPS toegevoegd wordt, zal een verdunning van 1 op 10 bekomen worden. Dit wordt de primaire verdunning genoemd (-1). Wanneer de primaire verdunning nogmaals met één tiende verdund wordt, door 1ml van de primaire verdunning aan 9ml PPS toe te voegen, wordt van een secundaire verdunning (-2) gesproken. Op deze manier wordt een verdunningsreeks aangelegd waarbij telkens 1ml overgebracht wordt in een nieuwe steriele proefbuis welke 9ml PPS bevat. Telling van Staphylococcus aureus Het analyseren van de monsters op S. aureus gebeurt door gebruik te maken van de gevalideerde ISO 6888-1:1999 methode (ISOb, 1999). Bij deze methode wordt eerst het selectieve Baird-Parker agar (Oxoid) aangemaakt door aan 62 gram BP agarpoeder 1l gedestilleerd water toe te voegen en dit mengsel op te koken. Hierna wordt het mengsel geautoclaveerd voor 15 minuten aan 121°C. Nadat de agar in een warmwaterbad tot +/- 48°C afgekoeld is, kan op steriele wijze 50ml Egg Yolk Tellurite Emulsion (Oxoid) toegevoegd worden. Indien de agar nog te heet is, kan het eigeel stollen door de hitte waardoor er brokken gevormd worden, vandaar dat gewacht wordt tot de agar afgekoeld is. Vervolgens wordt de agar verdeeld over lege steriele petrischalen voor de aanmaak van strijkplaten. Hierop kan S. aureus geïsoleerd worden door 0.1ml van de gepaste verdunning uit te strijken. Incubatie vindt plaats voor 2 dagen bij 37°C waarna het aantal kolonievormende eenheden bepaald kan worden. Staphylococcus aureus is te zien als grijs-zwarte kolonies met een bleke halo op een lichtgele agarbodem (Figuur 4). De componenten die BP agar selectief maken zijn glycine, lithium en telluriet. Hierbij zullen lithium en telluriet de groei van alternatieve microbiële flora inhiberen. Pyruvaat en glycine bevorderen de groei van

24

Staphylococcus aureus, beschermen de beschadigde cellen en helpen met hun herstel. De grijs-zwarte kolonies ontstaan door het reduceren van telluriet en de halo wordt gevormd via een proteolytische reactie waarbij het eigeel afgebroken wordt en een heldere zone verschijnt. Wanneer er verder geïncubeerd wordt kunnen er rond sommige kolonies opake zones gevormd worden (Figuur 4). Dit is te wijten aan de actie van een lipase. Niet alle stammen van S. aureus zullen beide reacties vertonen.

Figuur 4. Typische kolonies van Staphylococcus aureus.

Verder zullen ook sommige stammen van Staphylococcus saprophyticus klare en opake zones produceren. Vandaar dat typische kolonies eerst bevestigd moeten worden voordat een conclusie kan getrokken worden. In deze thesis wordt gebruik gemaakt van een testkit voor Staphylococcus aureus, namelijk Staphytect Plus (Diagnostic Reagents, Oxoid) (Figuur 5). Deze test werkt op basis van agglutinatie. Wanneer een kolonie gemengd wordt met de test vloeistof zal er in het geval van S. aureus agglutinatie plaatsvinden. Om verdachte monsters te bevestigen dienen drie geïsoleerde kolonies getest te worden op agglutinatie en dient één controle uitgevoerd te worden om autoagglutinatie uit te sluiten.

Figuur 5. Staphytect Plus, Diagnostic Reagents, Oxoid.

25

Telling van Escherichia coli Voor de analyse van de monsters op E. coli wordt er gebruik gemaakt van de gevalideerde ISO 16649-2:2001 methode (ISO, 2001). Hiervoor dient eerst het selectieve Rapid’E. coli 2 (REC) agar (Bio-Rad) aangemaakt te worden. Daartoe wordt er 37g REC agarpoeder toegevoegd aan 1l gedestilleerd water. Vervolgens wordt het mengsel voorzichtig opgekookt totdat alle agar opgelost is waarna het 15 minuten geautoclaveerd wordt aan 121°C. Na afkoeling in een warmwaterbad tot +/- 48°C kan deze agar gebruikt worden om gietplaten te maken. Hiervoor wordt op een steriele manier 1ml van de gepaste verdunning aangebracht in een lege petriplaat waarna +/- 15ml agar toegevoegd wordt. Na stolling wordt de petriplaat voor 24u bij 37°C geïncubeerd. Hierna kan het aantal kolonievormende eenheden bepaald worden. Het principe van dit selectieve medium berust op de gelijktijdige detectie van twee enzymatische activiteiten: β-D-Glucuronidase (GLUC) en β-D-Galactosidase (GAL). Om deze activiteiten op te kunnen sporen zijn er twee chromogene substraten in het medium aanwezig. Het ene substraat zal specifiek met GAL reageren en zo blauwe kolonies vormen. Het andere zal specifiek met GLUC reageren waardoor er roze kolonies gevormd worden als dit enzym aanwezig is in die kolonies. Aangezien coliformen positief zijn voor GAL en negatief voor GLUC zullen zij blauwgroene kolonies vormen. E. coli bevat het enzym GLUC maar niet het enzym GAL, hierdoor zullen zij roos-paarse kolonies vormen zoals te zien in Figuur 6.

Figuur 6. Rapid’ E. coli 2 agar waarop coliformen (blauwgroene kolonies) en E.coli bacteriën (paarse kolonies) te zien zijn.

Telling van melkzuurbacteriën Om een kwantitatieve bepaling van het aantal melkzuurbacteriën uit te voeren, wordt gebruik gemaakt van de gevalideerde ISO 15214:1998 methode (ISOa, 1998). Hiervoor dient het levensmiddel uitgeplaat te worden op M.R.S. agar (de Man, Rogosa en Sharpe agar)(Oxoid). Hiertoe wordt 62 gram M.R.S. agarpoeder opgelost in 1l gedestilleerd water. Hierna wordt het mengsel opgekookt en vervolgens voor 15 minuten geautoclaveerd bij 121°C. Dit medium wordt net als bij de bepaling van E. coli gebruikt voor gietplaten. Er zal dus eveneens 1ml van de gepaste verdunning op steriele wijze aangebracht worden in een petriplaat waarna de M.R.S. agar toegevoegd zal worden in de petriplaat. In tegenstelling tot de analyse bij E. coli gaat het hier om micro-aërofiele organismen. Er dient dus nog een deklaag aangebracht

26

te worden nadat de eerste laag gestold is. Nadat de deklaag voldoende gestold is kunnen de petriplaten gedurende 3 dagen bij 22 of 30°C geplaatst worden9. MRS agar werd ontwikkeld om de groei van melkzuurbacteriën te stimuleren waaronder volgende genera: Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus en Leuconostoc. Deze genera zijn alle vier in staat om melkzuur te produceren, verder zijn ze gram-positief, katalase en oxidase negatief en zijn ze kieskeurig in hun nutritionele elementen. De groei wordt aanzienlijk verhoogd door de micro-aërofiele omgeving. Telling van Listeria monocytogenes Voor de kwantitatieve bepaling van Listeria monocytogenes wordt de gevalideerde ISO 11290-2/ A1-2004 methode toegepast (ISOb, 1998). Hierbij wordt gebruik gemaakt van het selectieve Agar Listeria acc. to Ottaviani & Agosti (ALOA) agar (Biolife). Hiertoe wordt 35.3 gram ALOA agarpoeder gemengd met 0.5l gedestilleerd water. Dit geheel wordt geautoclaveerd voor 15 minuten aan 121°C waarna het medium afgekoeld wordt in een warmwaterbad tot +/- 48°C. Hierna wordt op steriele wijze de inhoud van twee vials toegevoegd aan het medium. De eerste vial, ALOA Enrichment Supplement (Biolife), dient voorverwarmd te worden tot 48-50°C alvorens deze toegevoegd mag worden. De tweede vial betreft een compositum van een ALOA Selective Supplement reconstituted (Biolife) en 5ml van een mengeling van ethanol met gedestilleerd water (1:1) (Figuur 7).

Figuur 7. ALOA agarpoeder met links ALOA Enrichment Supplement en ALOA Selective Supplement reconstituted.

Vervolgens wordt de agar verdeeld over petrischalen voor de aanmaak van strijkplaten. Hierop kan L. monocytogenes geïsoleerd worden door de gepaste verdunning uit te strijken. Aangezien L. monocytogenes doorgaans in zeer lage aantallen (<2log kve) aanwezig zal zijn, wordt hier het principe van verlaagde detectie toegepast. In het geval van een verlaagde detectie wordt 1ml van de primaire verdunning verspreid over 3 ALOA platen. Deze petriplaten worden

9 Beide temperaturen geven in deze thesis gelijkwaardige resultaten zoals aangetoond wordt na

vergelijkende testen die in de resultatensectie beschreven zullen worden.

27

geïncubeerd gedurende 48u bij 37°C. Hierna kunnen de gevormde kolonies geteld worden zodat het aantal kve/gram bepaald kan worden. De selectiviteit van het medium wordt bekomen door aanwezigheid van LiCl en een antimicrobieel compositum dat ceftazidime, polymyxin B, nalidixic acid en cycloheximide bevat. De differentiële activiteit van het medium wordt verworven door de aanwezigheid van het chromogene component X-glycoside. Hierdoor kan het beta-glucosidase enzyme opgespoord worden dat eigen is aan alle Listeria species. De specifieke differentiële activiteit wordt verworven door het substraat (L-alfa-fosphatidylinositol) van het phospholipase C enzyme dat aanwezig is in L. monocytogenes en in sommige stammen van L. ivanovii. Door de combinatie van beide substraten is het mogelijk om kolonies van Listeria spp., welke een blauwgroene kleur hebben, te differentiëren van kolonies van Listeria monocytogenes, welke een blauwgroene kleur hebben waarrond zich een opake halo bevindt (Figuur 8).

Figuur 8. ALOA agar waarop kolonies van Listeria spp. en Listeria monocytogenes te zien zijn.

Bepaling van de microbiële concentratie in de geteste kaas Het aantal kolonievormende eenheden per gram wordt bepaald door gebruik te maken van Vergelijking 2. Hierbij worden eerst het aantal kolonies geteld die na incubatie op de giet- of strijkplaat aanwezig zijn. Wanneer een monster geanalyseerd wordt, zullen altijd meerdere verdunningen uitgeplaat worden. Bij het tellen komt het er dan op aan de meest representatieve petriplaat uit te kiezen die geteld kan worden. In het geval van een gietplaat wordt er gekozen voor een petriplaat die 30 tot 300 kolonies bevat. Bij een strijkplaat wordt gekozen voor een petriplaat die 15 tot 150 kolonies bevat. Het inoculumlevel zal in het geval van een gietplaat 1ml bedragen en in het geval van een strijkplaat 0.1ml. Het resultaat x dat door deze vergelijking bekomen wordt, zal het aantal kolonievormende eenheden per gram levensmiddel voorstellen.

Vergelijking 2. Berekening van het aantal kve die per gram kaas aanwezig zijn. Hierbij is A het aantal kolonies op de petriplaat, V de verdunning en I het inoculumlevel dat op de petriplaat aangebracht werd.

28

3.1.2.5 Kwalitatieve bepaling van Listeria monocytogenes

Aangezien een kwantitatieve bepaling niet steeds mogelijk is vanwege de lage aantallen waarmee L. monocytogenes aanwezig is, kan er gebruik gemaakt worden van een kwalitatieve methode om de aanwezigheid van L. monocytogenes in levensmiddelen te analyseren. Om die reden wordt protocol nr. BIO-12/11-03/04, gevalideerd door AFNOR voor alle levensmiddelen en omgevingmonsters toegepast. Hierbij wordt er 25 gram kaas afgewogen en wordt er 225ml Half-Fraser bouillon (BioMérieux) toegevoegd. Deze bouillon wordt gebruikt voor een selectieve vooraanrijking, zodat de bacteriën terug aangesterkt kunnen worden (resuscitatie). Dit mengsel wordt vervolgens gestomacherd en gedurende 24-26u geïncubeerd bij 30°C. Nadien wordt er van de aanrijking 0.1ml overgebracht naar 10ml Fraser bouillon (BioMérieux), wat zorgt voor de selectieve aanrijking van L. monocytogenes, waarbij vermeerdering van L. monocytogenes plaatsvindt. Dit wordt gedurende 24-26u geïncubeerd bij 37°C waarna er 500 μl overgebracht wordt in een Vidasstrip (BioMérieux). Het Vidastoestel (BioMérieux) geeft de resultaten weer binnen de 80 minuten. Vidas werkt volgens de ELFA-methode (enzyme linked fluorescent assay). Hierbij bevinden de antilichame zich in een soort pipetpunt. Het monster en de opeenvolgende reagentia/wasvloeistof bevinden zich in cupjes op de Vidasstrip. Bij aanwezigheid van de pathogeen zal er een ‘sandwich’ of antilichaam-antigeen-antilichaam combinatie gevormd worden. Dit leidt tot fluorescentie door omzetting van het substraat met behulp van het enzym aanwezig op het tweede antilichaam. Wanneer het fluorescentiesignaal boven een bepaalde drempelwaarde komt, is het waarneembaar en kan het gemeten worden. Als het toestel een negatief resultaat geeft dan kan er geen aanwezigheid van L. monocytogenes gedetecteerd worden in het monster en wordt de test beëindigd. Indien er een positief resultaat weergegeven wordt, dient dit resultaat bevestigd te worden. Deze bevestiging wordt uitgevoerd op een chromogeen media. Hier wordt er gekozen voor ALOA strijkplaten (Biolife). Zoals hierboven reeds vermeld is ALOA een selectief medium voor L. monocytogenes en wordt het gebruikt om de typische groei van dit pathogeen te testen. Er wordt een 4x4 enting vanuit de Fraser bouillon uitgevoerd op deze ALOA strijkplaten. Deze worden vervolgens gedurende 24u bij 37°C geïncubeerd en indien er blauwgroene kolonies verschijnen met een opake halo (Figuur 8), dan is bevestigd dat L. monocytogenes wel degelijk aanwezig is in het levensmiddel.

3.1.3 Dataverwerking van de prevalentiescreening

Alle bekomen resultaten worden ingegeven in Excel 2010. Hierna kunnen ze geïmporteerd worden in Spotfire S+ 8.2. Dit programma wordt gebruikt om de nodige statistische testen uit te voeren. Bij statistische testen geldt er steeds een nulhypothese en een alternatieve hypothese. Om te beslissen of de nulhypothese al dan niet verworpen moet worden, wordt gebruik gemaakt van de p-waarde. Wanneer deze groter of gelijk is aan 0.05 kan verondersteld worden dat de nulhypothese niet verworpen moet worden. Op het 5% significatieniveau is namelijk onvoldoende bewijs gevonden tegen de nulhypothese. Wanneer de p-waarde kleiner is dan 0.05 wordt de nulhypothese wel verworpen. In dat geval is er op het 5% significatieniveau onvoldoende bewijs gevonden om de nulhypothese te weerhouden.

29

Wanneer gemiddeldes vergeleken worden, zal eerst worden nagegaan hoeveel observaties met elkaar vergeleken dienen te worden. Als de twee te vergelijken datasets elk meer dan 30 observaties bevatten, wordt eerst de normale verdeling van de data nagegaan door gebruik te maken van de Kolmogorov-Smirnov Test. Verder is het ook aan te raden gebruik te maken van een box-plot en een QQ-plot om de normaliteit van de data na te gaan. Indien er geen normaliteit verondersteld kan worden, moet er voor het vergelijken van de gemiddeldes een niet-parametrische test gebruikt worden. In dit geval zal een Wilcoxon rank-sum Test uitgevoerd worden. Als er aangetoond kan worden dat beide datasets wel normaal verdeeld zijn, dient de homoscedasticiteit nagegaan te worden door gebruik te maken van een Modified-Levene Test. Hierna kan gebruik gemaakt worden van een Pooled-Variance Two-Sample t-Test, in het geval van homoscedasticiteit, of van een Welch Modified Two-Sample t-Test, wanneer er geen homoscedasticiteit teruggevonden kan worden (Thas, 2012). Om correlatie tussen twee parameters te bepalen, moeten in eerste instantie de verschillende correlatiecoëfficiënten berekend worden. Deze correlatiecoëfficiënten stellen het lineair verband voor tussen de twee parameters. In de praktijk wordt verondersteld dat deze twee parameters onafhankelijk zijn van elkaar. Als dit niet het geval is, kan er een correlatiecoëfficiënt van meer dan 0.9 onderscheiden worden en is er sprake van een multicollineariteitsprobleem. Om na te gaan of er een significante correlatie verondersteld mag worden, kan gebruik gemaakt worden van de Correlatie Test. Deze test is niet standaard aanwezig in Spotfire S+ 8.2 maar kan door het inlezen van een specifieke script in het programma opgenomen worden. Op deze manier kan gezien worden of er een significante correlatie is tussen de verschillende parameters (Thas, 2012). De outputs van alle uitgevoerde statistische testen zijn terug te vinden in Bijlage 3.

3.2 Challengetesten

Als tweede stap in het onderzoek worden challengetesten uitgevoerd met L. monocytogenes op 5 verschillende soorten kaas. Challengetesten worden gebruikt om te bepalen of L. monocytogenes zal uitgroeien op een kaas die ermee besmet is. Dit gebeurt door de kaas te inoculeren met een cocktail van verschillende L. monocytogenes stammen. Hierna kan aan de hand van een kwantitatieve methode het groeipotentieel bepaald worden. Vervolgens kan beslist worden of de kaas, welke initieel besmet is met lage aantallen L. monocytogenes, op het einde van de houdbaarheid nog steeds veilig geconsumeerd kan worden. Het protocol is gebaseerd op het Technical guidance document on shelf-life studies for Listeria monocytogenes in RTE foods (EU CRL Listeria, november 2008). Op basis van deze testen kan getracht worden om het verband te bepalen tussen de groei van L. monocytogenes en bepaalde parameters van de kaas en de omgeving (intrinsieke en extrinsieke parameters). Hierdoor kan aangetoond worden welke soorten kaas een risico zullen stellen naar de groei van L. monocytogenes.

3.2.1 Aankoop kazen

De aankoop van de kazen voor de challengetesten vindt plaats in éénzelfde gespecialiseerde kaaswinkel te Gent waarna ze bewaard worden bij 4°C tot het moment van analyse. Hierbij zullen de kazen op de dag van de aankoop geanalyseerd worden op aanwezigheid van L. monocytogenes. Net als bij de

30

prevalentiescreening worden de kazen gekocht onder het mom van een gewone klant. De challengetesten worden uitgevoerd op 5 verschillende soorten kaas waarvan de kenmerken in Tabel 10 terug te vinden zijn. Hierbij wordt elke kaassoort 4 keer getest waardoor er in totaal 20 kazen aangekocht zullen moeten worden.

Tabel 10. Gegevens van de 5 kazen waarop de challengetesten uitgevoerd werden.

Naam Hardheid Korst Hittebehandeling

Brie de meaux Zacht Witte schimmelkorst Geen (rauwmelks)

Gourmelin Halfzacht Roodbacterie korst Gepasteuriseerd

Rosso di Langa Halfzacht Roodbacterie korst Gepasteuriseerd

Pas de rouge Half-hard Roodbacterie korst Geen (rauwmelks)

Tomme de montagne Half-hard Natuurlijke korst Geen (rauwmelks)

3.2.2 Voorafgaande kwalitatieve bepaling van Listeria monocytogenes

Na aankoop wordt de kaas onderworpen aan een kwalitatieve bepaling van L. monocytogenes. Hierdoor kan bepaald worden of er reeds een natuurlijke besmetting van L. monocytogenes aanwezig is. Wanneer de kaas positief test voor de aanwezigheid van L. monocytogenes wordt deze niet beënt en zal de natuurlijke besmetting opgevolgd worden. Indien de kaas negatief test wordt deze beënt met een cocktail van verschillende L. monocytogenes stammen. De voorafgaande kwalitatieve bepaling gebeurt aan de hand van protocol nr. BIO 12/27-02/10 gevalideerd door AFNOR volgens ISO 16140. Hierbij wordt er 25 gram kaas afgewogen waarbij 225ml LMX bouillon (BioMérieux) en 0.5ml LMX supplement (BioMérieux) toegevoegd wordt. Dit mengsel wordt vervolgens gestomacherd en gedurende 26-30u geïncubeerd bij 37°C. Nadien wordt er 250µl overgebracht in een Vidasstrip (BioMérieux) waarna deze strip voor 5min verhit wordt in een verhittingselement aan 131°C. Hierna dient de strip 10min af te koelen. Vervolgens worden de strips overgebracht in het Vidastoestel dat de resultaten binnen de 80 minuten weergeeft. Tot slot dienen positieve resultaten bevestigd te worden a.d.h.v. de methode die in sectie 3.1.2.5 reeds aangehaald werd.

3.2.3 Opkweek van L. monocytogenes

3.2.3.1 Stockcultuur

De stockcultuur wordt aangemaakt door 1 à 2 parels van elke referentiestock (LMG 23194, LFMFP 392 en LFMFP 491) op steriele wijze in een proefbuis met 10ml Brain-Heart-Infusion (BHI) bouillon over te brengen. BHI wordt gemaakt door 37 gram BHI poeder te mengen met 1l gedestilleerd water waarna de proefbuizen, waarin telkens 10ml BHI bouillon overgebracht werd, voor 15min aan 121°C geautoclaveerd worden. Nadat de bouillon 24u bij 37°C geïncubeerd werd, worden 3 TSAYE slants beënt. TSAYE agar wordt gemaakt door 40 gram TSA agarpoeder en 6 gram gistextract (0.6%) toe te voegen aan 1l gedestilleerd water waarna dit mengsel opgekookt wordt tot alle agarpoeder opgelost is. Voor de slants wordt 6 à 7ml TSAYE agar overgebracht in proefbuizen. De overige hoeveelheid kan overgebracht worden in schott-flessen. Dit alles wordt geautoclaveerd voor 15min bij 121°C. Na autoclaveren worden de slants in een hoek van 45° geplaatst. Dit zorgt ervoor dat de slants, na het stollen van de agar, een veel groter oppervlak hebben dat beënt kan worden. Vervolgens wordt de agar uit de schott-fles verdeeld over

31

petrischalen voor de aanmaak van strijkplaten. Naast de beënting van de slants wordt er een 4x4 enting uitgevoerd op TSAYE strijkplaten, om de zuiverheid van de cultuur na te gaan, en ALOA, om te controleren op typische kolonies. Hierna wordt dit alles voor 24u bij 37°C geïncubeerd.

3.2.3.2 Werkcultuur

Door middel van een oognaald wordt cultuur uit de slant overgeënt in een proefbuis met 10ml BHI. Verder wordt er ook een 4x4 enting uitgevoerd op TSAYE strijkplaten. De proefbuizen worden samen met de petriplaten voor 18 à 24u geïncubeerd bij 37°C. Nadat de zuiverheid gecontroleerd is, wordt er 0.1ml uit de bekomen cultuur overgeënt in 10ml BHI. Deze proefbuizen worden voor 4 dagen geïncubeerd bij 7°C zodat L. monocytogenes een koudeschok krijgt. Uit eerder onderzoek is namelijk gebleken dat hierdoor de lagfase of aanpassingsfase verkort wordt waardoor L. monocytogenes zich na enting meteen in de exponentiële groeifase bevindt.

3.2.4 Bereiding inoculum

Na de koudestress worden de drie stammen gemengd door 1ml van elke werkcultuur over te brengen in een steriele proefbuis. Een verdunningsreeks van deze mix wordt uitgeplaat op TSAYE om het exacte inoculumlevel te bepalen. Aan de hand van het theoretisch inoculumniveau (4.0 * 108 kve/ml) kan het gewenste inoculum berekend worden zodat er een beënting van 50 kve/gram aangebracht kan worden. De hoeveelheid vloeistof die hierbij aangebracht wordt, dient voldoende groot te zijn zodat een homogene spreiding mogelijk is. Verder mag de hoeveelheid ook niet te groot zijn aangezien het de eigenschappen van de kaas (pH, aw ...) zou kunnen beïnvloeden. Bovendien kan een grote hoeveelheid vloeistof nooit opgenomen worden door de kaas waardoor het als een film op het oppervlak blijft liggen. Vandaar dat de hoeveelheid vloeistof van het inoculum niet meer dan 1% van de te beënten eenheid mag bedragen.

3.2.5 Beënten, verpakken, bewaren

Zoals bij de aankoop reeds vermeld werd, zullen 5 verschillende soorten kaas elk 4 keer getest worden (in totaal 20 kazen) waarbij het inoculum telkens tweemaal op het snijvlak aangebracht wordt en tweemaal op de korst. Hierdoor kan geëvalueerd worden of de plaats waar L. monocytogenes aanwezig is op de kaas (snijvlak of korst) een invloed heeft op diens groeipotentieel. De aangekochte kaas wordt in stukken verdeeld zoals weergegeven in Figuur 9. Hierbij zijn enerzijds 3 referentiemonsters van 100gram te onderscheiden en anderzijds 9 monsters van 25gram die beënt worden met L. monocytogenes. Deze laatste zullen op dag 0 (de dag van de beënting) beënt worden met +/- 50 kve/gram om een natuurlijke besmetting te simuleren. Om deze hoeveelheid inoculum te bekomen zal steeds 250µl van een 10-5 verdunning gebruikt worden wanneer uitgegaan wordt van het theoretische inoculumlevel. Voorts wordt op de referentiemonsters (100gram) éénzelfde hoeveelheid (1ml) fysiologisch water aangebracht (PPS).

32

Figuur 9. De manier waarop een kaas in stukken verdeeld wordt.

Na het beënten worden de stukken kaas afzonderlijk verpakt in vershoudfolie (Delhaize). Hierna wordt een derde van de kazen 14dagen bewaard bij 7°C en een derde bij 14°C zoals weergegeven in Figuur 9. Het andere deel (Referentie 1 en monster 1.1,1.2 en 1.3) zullen na beënting direct geanalyseerd worden.

3.2.6 Analyseren van de kaas

Het analyseren van de referentiemonsters gebeurt zowel op dag 0 (de dag dat de kaas beënt wordt) als op dag 14. Op deze dagen wordt steeds de concentratie aan S. aureus, E. coli, L. monocytogenes en melkzuurbacteriën bepaald alsook de pH, de aw en het zoutgehalte. Deze analyses worden uitgevoerd zoals beschreven staat in alinea ‘3.1.2 Bepaling van de parameters’. De concentratie van Listeria monocytogenes op de geïnoculeerde monsters wordt bepaald door uitplatingen op ALOA zoals beschreven wordt in alinea ‘3.1.2 Bepaling van de parameters’. De concentratie wordt bepaald net na het beënten en na 2 weken opslag bij 7°C of 14°C. Een overzicht van deze procedure is terug te vinden in Tabel 11. Voorts worden de eerste 8 kazen ook geanalyseerd 1 week na beënting. Op deze manier kan uitgemaakt worden of er reeds na 1 week sprake is van groei van L. monocytogenes en of er een verschil is in groei tussen week 1 en week 2. Uit de testen bleek dat er na 1 week een significante groei was en deze toenam naarmate de 2de week vorderde. Aangezien er in deze thesis enkel belang gehecht wordt aan het groeipotentieel van L. monocytogenes na 2 weken worden de analyses na week 1 voor de overige 12 kazen achterwege gelaten.

Verdeling van de kaas

Referentie 1, dag 0

Referentie 2, dag 14, 7°C

Referentie 3, dag 14, 14°C

Monster 1.1, dag 0

Monster 1.2, dag 0

Monster 1.3, dag 0

Monster 2.1, dag 14, 7°C






Dag 14, 7°C

Dag 0

Dag 14, 14°C

Ref. 1, dag 0

Ref. 2, dag 14, 7°C

Ref. 3, dag 14, 14°C

33

Tabel 11. Overzicht van de uitgevoerde analyses.

Referentiemonsters Geïnoculeerde monsters

Dag 0

*Concentratie S. aureus bepalen

*Concentratie L. monocytogenes bepalen

*Concentratie E. coli bepalen *Concentratie L.monocytogenes

*Concentratie MZB bepalen (bij 22 en 30°C)

*Kwalitatieve analyse (VIDAS)

*pH

*aw

*Zoutgehalte

Dag 7 - *Concentratie L. monocytogenes bepalen10

Dag 14

*Concentratie S. aureus bepalen

*Concentratie L. monocytogenes bepalen

*Concentratie E. coli bepalen *Concentratie L.monocytogenes

*Concentratie MZB bepalen (bij 22 en 30°C)

*Kwalitatieve analyse (VIDAS)

*pH

*aw

*Zoutgehalte

3.2.7 Dataverwerking van de challengetesten

Alle bekomen resultaten worden ingegeven in Excel 2010. Hierna kunnen ze geïmporteerd worden in Spotfire S+ 8.2. Dit programma wordt gebruikt om de nodige statistische testen uit te voeren. Bij statistische testen geldt er steeds een nulhypothese en een alternatieve hypothese. Om te beslissen of de nulhypothese al dan niet verworpen moet worden, wordt gebruik gemaakt van de p-waarde. Wanneer deze groter of gelijk is aan 0.05 kan verondersteld worden dat de nulhypothese niet verworpen moet worden. Op het 5% significatieniveau is namelijk onvoldoende bewijs gevonden tegen de nulhypothese. Wanneer de p-waarde kleiner is dan 0.05 wordt de nulhypothese wel verworpen. In dat geval is er op het 5% significatieniveau onvoldoende bewijs gevonden om de nulhypothese te weerhouden. Aangezien het aantal observaties hier steeds kleiner zal zijn dan 30, wordt er gebruik gemaakt van niet-parametrische testen (FFS, 2013). Het vergelijken van twee datasets gebeurt aan de hand van een Wilcoxon rank-sum Test. Dit is het niet-parametrische equivalent van een Two sample t-Test. Wanneer normaliteit nagegaan wordt, kan in principe een parametrische test toegepast worden. Dit is echter niet aangewezen aangezien de voorwaarden voor de parametrische t-toetsen niet betrouwbaar nagegaan kunnen worden bij een laag aantal observaties (Thas, 2012). Wanneer het gaat om gepaarde observaties kan als niet-parametrisch alternatief voor een gepaarde t-Test gebruik gemaakt worden van een Wilcoxon signed rank

10

Enkel voor de eerste 8 kazen die getest werden waarbij elke kaassoort (zowel Brie de meaux, Gourmelin, Rosso di Langa, Pas de rouge als Tomme de montagne) vertegenwoordigd werd.

34

toets. Om correlatie tussen twee parameters te bepalen, moeten in eerste instantie de verschillende correlatiecoëfficiënten berekend worden. Deze correlatiecoëfficiënten stellen het lineair verband voor tussen twee parameters. In de praktijk wordt verondersteld dat deze twee parameters onafhankelijk zijn van elkaar. Als dit niet het geval is, kan er een correlatiecoëfficiënt van meer dan 0.9 onderscheiden worden en is er sprake van een multicollineariteitsprobleem. Om na te gaan of er een significante correlatie verondersteld mag worden, kan gebruik gemaakt worden van de Correlatie Test. Deze test is niet standaard aanwezig in Spotfire S+ 8.2 maar kan door het inlezen van een specifieke script in het programma opgenomen worden. Op deze manier kan gezien worden of er een significante correlatie is tussen de verschillende parameters. De outputs van alle uitgevoerde statistische testen zijn eveneens terug te vinden in Bijlage 3.

3.3 Modelleren van het groeipotentieel van L. monocytogenes

Na het uitvoeren van de challengetesten worden alle uitgevoerde challengetesten ook theoretisch gemodelleerd aan de hand van twee verschillende programma’s. Hiervoor wordt enerzijds gebruik gemaakt van ComBase (ComBase, 2014; Baranyi & Tamplin, 2004), een programma dat online beschikbaar is, en het programma SSSP (Mejlholma, et al., 2010) dat voor gebruik eerst gedownload moet worden.

3.3.1 Modelleren aan de hand van ComBase

In ComBase wordt gebruik gemaakt van verschillende groeimodellen. Vandaar dat eerst de geschikte bacterie geselecteerd dient te worden waarna de waardes voor de verschillende parameters ingevuld kunnen worden. De parameters die gebruikt worden zijn initiële besmetting (in log kve/gram), fysiologische status, temperatuur (°C), pH en aw. In plaats van de aw kan ook gebruik gemaakt worden van het zoutgehalte maar aangezien het zoutgehalte minder accuraat bepaald kan worden, wordt gekozen om aw als parameter te gebruiken. Hierna kan de observatietijd aangepast worden waardoor het aantal log kve/gram kan afgelezen worden in de tabel. De fysiologische status die vermeld wordt is een dimensieloze waarde tussen 0 en 1 welke weergeeft in welke mate de bacterie aangepast is aan zijn omgeving. Bij de challengetesten wordt een inoculum van L. monocytogenes gebruikt dat als laatste stap 4 dagen bij 7°C bewaard wordt. Onderzoek heeft aangetoond dat er door deze laatste stap bij het opkweken vanuit gegaan kan worden dat de bacterie aangepast is aan zijn omgeving. Hierdoor moet er geen lagfase verondersteld worden en kan bij fysiologische status een waarde van 1 gebruikt worden. Het programma houdt echter geen rekening met het aantal MZB wat voor mogelijke afwijkingen zou kunnen zorgen vanwege de hoge aantallen waarmee zij op kaas aanwezig zijn (ComBase, 2014).

3.3.2 Modelleren aan de hand van SSSP

Bij SSSP wordt het groeimodel voor L. monocytogenes in gekoelde zeevruchten gebruikt. Dit model is echter gevalideerd voor andere levensmiddelen waaronder niet-gefermenteerde melkproducten hoewel kaas nog niet gevalideerd werd. De parameters die in dit model gebruikt worden, zijn het initiële celniveau (in kve/gram), temperatuur (°C), NaCl% in de waterfase, pH en de bewaarperiode. De overige

35

parameters worden bij de challengetesten niet in kaart gebracht dus zullen deze ook hier niet in rekening gebracht worden waardoor een waarde van 0 toegekend dient te worden. Het NaCl-percentage in de waterfase kan het programma zelf berekenen aan de hand van het droge stof-gehalte en het zout-percentage. Het probleem hierbij is dat bij het uitvoeren van de challengetesten het droge stof-gehalte niet bepaald werd. Daarom wordt gebruik gemaakt van een gemiddeld percentage van 57% dat in de literatuur wordt teruggevonden (Rouveen, 2014). Verder wordt ook hier verondersteld dat de bacterie reeds aangepast is aan zijn omgeving door de koudeschok waardoor er geen lag-periode in rekening gebracht dient te worden. Verder houdt ook dit programma geen rekening met het aantal MZB wat voor mogelijke afwijkingen zou kunnen zorgen.

3.3.3 Dataverwerking van de modellen

De dataverwerking gebeurt op dezelfde manier als beschreven wordt in alinea ‘3.2.7 Dataverwerking van de challengetesten’.

3.4 Challengetesten uitgevoerd door het accreditatielabo

Als laatste stap worden de resultaten van de challengetesten beschouwd die uitgevoerd werden door het accreditatielabo (Belac) verbonden aan het Laboratorium voor Levensmiddelenmicrobiologie en –conservering, Fac. Bio-ir. Wetenschappen, Universiteit Gent. De testen van het accreditatielabo werden uitgevoerd op vraag van bedrijven om het groeipotentieel te bepalen van L. monocytogenes in welbepaalde levensmiddelen. Zo kan bij een groeipotentieel die kleiner is dan 2 log kve/gram een bepaalde hoeveelheid L. monocytogenes getolereerd worden op het initiële product wanneer bewezen kan worden d.m.v. deze challengetesten dat de uitgroei tot 2 log kve/gram begrensd is.

3.4.1 Challengetesten op risicoproducten

In deze thesis zullen de resultaten van zes verschillende categorieën geëvalueerd worden: kaas, ei en eiproducten, vleeswaren, vis, plantaardige producten en samengestelde levensmiddelen. De categorieën vlees, vleesbereidingen en visproducten worden achterwege gelaten omdat ze een verkeerd beeld geven van het gemiddelde groeipotentieel. De categorieën chocolade en confiserie worden weggelaten omdat deze niet relevant zijn voor dit onderzoek. De resultaten worden opgelijst in Excel 2010. Het groeipotentieel wordt steeds op drie verschillende manieren bepaald: EU mediaan, grootste verschil en UGent methode (een aanpak uitgewerkt door het accreditatielabo van UGent). Hierbij wordt de EU mediaan algemeen gebruikt en aanbevolen door het EU Community Reference Lab in Maisons’ d’Alfort, Franrijk en geeft deze het verschil weer tussen de mediaan van de concentratie op het einde van de challengetest en de mediaan van de initiële beënting. Het grootste verschil zal het verschil weergeven tussen de hoogste concentratie op het einde van de challengetest en de laagste initiële beënting. De laatste manier is de UGent methode. Hier wordt het verschil gemaakt tussen de concentratie op het einde van de challengetest en de initiële beënting voor elke herhaling. Van de drie waarden die bekomen worden, wordt het grootste getal gekozen. Bij de analyse van de resultaten zal enkel aandacht besteed worden aan de EU mediaan en het grootste verschil. Hierdoor kan de Europese manier om het groeipotentieel weer te geven getoetst worden aan het worst case scenario.

36

Om de resultaten beter te kunnen interpreteren, zal in eerste instantie het gemiddelde groeipotentieel (gemiddelde EU mediaan en gemiddelde grootste verschil) berekend worden samen met de standaard afwijking. Voorts kan er ook een densiteitstabel opgesteld worden zodat gezien kan worden hoe de data verdeeld is. Als laatste manier zal er ook gewerkt worden met een score systeem. Hierbij wordt per product telkens een score toegekend afhankelijk van de mate waarin de herhalingen (3) van uitgevoerde challengetest overeen komen. Wanneer de waardes voor het groeipotentieel van de drie herhalingen telkens tot eenzelfde scorecategorie behoren, krijgt het product een score van 1. Wanneer de drie metingen van het groeipotentieel tot 2 scorecategorieën behoren, krijgt het product een score van 2 en als de drie metingen tot drie verschillende scorecategorieën behoren een score van 3. De scorecategorieën die gebruikt worden zijn diegene die weergegeven worden in Tabel 12. Deze methode toont aan of er binnen één productcategorie (bv. vleeswaren) veel variabiliteit binnen de producten (bv. door formulering en/of samenstelling) terug te vinden is. Dan kunnen bij het uitvoeren van meerdere challengetesten op hetzelfde product (bv. Brie de meaux) verschillende uitkomsten bekomen worden hoewel dezelfde bewaaromstandigheden gebruikt werden. Dit is het geval wanneer er veel producten van éénzelfde voedselcategorie een hoge score hebben.

Tabel 12. Het geobserveerde verschil met bijhorende tolerantiewaarde op dag 0.

Score-categorie

Geobserveerde verschil log10 (x kve/g)

Tolerantiewaarde op dag 0 (afwezigheid in y gram)

A Van -1,00 tem -0,021 Afwezigheid in 0,01g of <100/g

B Van 0,00 tem 0,49 Afwezigheid in 0,01g of <100/g

C Van 0,50 tem 0,99 Afwezigheid in 0,1g

D Van 1,00 tem 1,99 Afwezigheid in 1g

E Van 2,00 tem 2,99 Afwezigheid in 10g

F > 2,99 Afwezigheid in 25g

3.4.2 Challengetesten op kaas

De challengetesten die uitgevoerd werden op kaas zullen in meer detail bestudeerd worden. Zo worden de verschillende kenmerken en omstandigheden van de challengetesten opgelijst in Excel 2010. Op deze manier kunnen deze challengetesten vergeleken worden met de zelf uitgevoerde challengetesten. De dataverwerking gebeurt dan ook op dezelfde manier. Deze wordt weergegeven in alinea ‘3.2.7 Dataverwerking van de challengetesten’.

37

4. Resultaten Om een antwoord te bieden op de vraag van hoevewinkels en delicatessenzaken of de strenge eisen rond hygiëne en koeling voor de ambachtelijke productie- en rijpingsproces van kazen wel nodig zijn, wordt onderzoek uitgevoerd naar de interactie tussen de intrinsieke (pH, aw ...) en extrinsieke (bewaartemperatuur, bewaartijd ...) parameters van kaas en L. monocytogenes. Dit onderzoek valt uiteen in vier grote delen: het uitvoeren van een prevalentiescreening en challengetesten, theoretisch modelleren en het analyseren van de challengetesten die uitgevoerd werden door het accreditatielabo. De resultaten van dit onderzoek zullen hieronder besproken worden.

4.1 Prevalentiescreening rauwmelkse en gepasteuriseerde,

zachte en half-harde kazen

Zoals in de methodologie reeds beschreven werd, werd er een prevalentiescreening uitgevoerd op 60 verschillende soorten kaas. Deze screening heeft als doel de algemene karakteristieken van de verschillende soorten kaas in kaart te brengen. De parameters die hierbij geanalyseerd worden zijn pH, aw, zoutgehalte, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, melkzuurbacteriën en Listeria monocytogenes. Een klein overzicht van de verschillende soorten kaas die getest worden, is weergegeven in Tabel 13. Hieruit valt af te leiden dat er evenveel zacht tot halfzachte (zachtere) als half-hard tot harde (hardere) kazen getest worden. Voorts zijn er 29 kazen gemaakt van rauwe melk, 6 van gethermiseerde melk, 23 van gepasteuriseerde melk en van 2 monsters is de hittebehandeling van de melk niet gekend. Waarschijnlijk betreft het hier gepasteuriseerde kazen. Een meer gedetailleerd overzicht van de kazen is terug te vinden in Bijlage 4.

Tabel 13. Overzicht van de verschillende geteste kazen in de prevalentiescreening.

ZACHT – HALFZACHT HALF-HARD – HARD

Rauw Gepasteuriseerd Rauw Gethermiseerd Gepasteuriseerd ?

16 14 13 6 9 2

30 30

Een kleine kanttekening bij deze prevalentiescreening is dat er geen rekening gehouden werd met de houdbaarheidsdatum bij de aankoop van de kazen. Hierdoor worden sommige kazen getest aan het begin van de houdbaarheid en andere kazen naar het einde van de houdbaarheid. Dit zal echter meestal het geval zijn als een consument een stuk kaas koopt in een kaaswinkel. Vandaar dat de consument meestal gebruik maakt van zijn zintuigen om het einde van de houdbaarheid te achterhalen. Zo kan het uitzicht van de kaas bekeken worden (zichtbare schimmelgroei, uitdroging ...) en kan er geroken (een zure geur, de geur van ammoniak ...) of geproefd worden (afwijkende of vreemde smaak). Aangezien de te analyseren kazen maximaal 2 dagen bewaard werden, voor het uitvoeren van de analyses, wordt ervan uitgegaan dat de houdbaarheid nog niet verstreken is. De kazen vertonen geen afwijkende geur, zichtbare schimmelgroei of sporen van uitdroging. Bovendien wordt kaas meestal gekocht met het vooruitzicht dit meerdere dagen te consumeren. Er kan dus van uitgegaan worden dat de kazen nog steeds

38

dienen te voldoen aan de wetgeving rond voedselveiligheid op het moment van de analyse.

4.1.1 Zuurtegraad (pH)

De kazen uit de prevalentiescreening hebben een zuurtegraad die schommelt tussen 4.16 en 7.47. Hierbij springen vooral de geitenkazen in het oog vanwege hun lage pH. Dit zijn zachte verse kazen waarvan de pH in deze prevalentiescreening varieert van 4.16 tot 4.28. Belangrijk hierbij is dat in de literatuur teruggevonden wordt dat L. monocytogenes een pH bereik heeft van 4.4 tot 9.4 (Devlieghere, et al., 2011). Hierdoor kan verondersteld worden dat L. monocytogenes op deze geitenkaasjes niet zal kunnen uitgroeien. Verder kan er geen significant verschil opgemerkt worden tussen de pH voor zachtere en de pH voor hardere kazen. Bovendien is er ook geen significant verschil terug te vinden tussen rauwmelkse en gepasteuriseerde kazen.

4.1.2 Wateractiviteit (aw)

Na het bepalen van de aw blijkt dat deze schommelt tussen 0.9353 en 0.9929. In eerste instantie wordt getracht om te bepalen of er een significant verschil is tussen de aw van de zachtere kazen en de hardere kazen. Na uitvoeren van statistische testen blijkt dat er wel degelijk een significant verschil is tussen zachtere en hardere kazen wanneer de aw geëvalueerd wordt. Hierna kunnen in een tweede en derde stap de gemiddelde aw en de standaard afwijking bepaald worden. De gemiddelde aw van zachtere en hardere kazen bedraagt respectievelijk 0.9645 en 0.9504. De standaard afwijking van de twee verschillende categorieën bedraagt respectievelijk 0.0155 en 0.0076.

4.1.3 Zoutgehalte

Het zoutgehalte is normaal verdeeld tussen 0.609 en 3.683. Iets wat wel in het oog springt zijn de geitenkazen. Deze hebben een vrij laag zoutgehalte, namelijk 1.45611, 1.426, 0.950 en 0.609. Toch kan er geen significante afwijking van het gemiddelde vastgesteld worden. Voorts blijkt uit de statistische testen dat er geen significant verschil is tussen zachtere en hardere kazen o.b.v. het zoutgehalte.

4.1.4 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus is aanwezig op 4 van de 60 kazen met meer dan 2 log kve/gram (Figuur 10). Hierbij zijn 3 van de 4 gevallen zachte rauwmelkse kazen en 1 een halfzachte gepasteuriseerde kaas. Bij deze laatste ging het om een uitgroei van 6 log kve/gram12 wat betekent dat de tolerantiewaarde13 overschreden werd (LFMFP-UGent, 2010). Verder kan gekeken worden of er parameters zijn die gecorreleerd kunnen worden aan de kwantitatieve bepaling van S. aureus. Uit de Correlatie Test blijkt dat enkel de pH significant gecorreleerd kan worden aan de kwantitatieve bepaling van S. aureus. Hierbij moet echter vermeld worden dat de determinatiecoëfficiënt slechts 26% bedraagt. Deze factor drukt uit met hoeveel procent de pH aan de kwantitatieve bepaling van S. aureus gecorreleerd is.

11

Het gaat hier over een half-harde rauwmelkse geitenkaas. De andere drie geitenkazen zijn verse kazen gemaakt van rauw melk. 12

Wanneer er meer dan dan 105 kve/gram aanwezig zijn, dient het levensmiddel getest te worden

voor toxines. Aangezien er geen monster meer beschikbaar was, is dit echter niet gebeurd. 13

Tolerantiewaarde is de bovengrens van de richtwaarde (in kve/gram) die vooropgesteld wordt voor een bepaald micro-organisme onmiddellijk na productie (LFMFP-UGent, 2010).

39

Figuur 10. Contaminatieniveaus van de verschillende kazen voor S. aureus, E. coli, MZB en L. monocytogenes.

4.1.5 Escherichia coli

Na analyse blijkt dat E. coli aanwezig is, ≥ 1 log kve/gram, op 16 van de 60 kazen (26.7%) (Figuur 10). Deze 16 kazen zijn allemaal rauwmelkse kazen. Het is dan ook logisch dat er een significant verschil teruggevonden kan worden tussen de gepasteuriseerde en de rauwmelkse kazen. Verder wordt er ook gekeken of er een significant verschil teruggevonden kan worden tussen de zachtere en hardere kazen. Deze zijn echter niet significant verschillend. Bij de 16 rauwmelkse kazen waarop E. coli gedetecteerd wordt, blijven 4 kazen onder de doelwaarde14 van 2 log kve/gram. De tolerantiewaarde van 3 log kve/gram wordt bij 6 kazen overschreden (LFMFP-UGent, 2010). De twee grootste uitschieters zijn Bernister fleuri, met een waarde van meer dan 4 log kve/gram en een brie van het hinkelspel met meer dan 5 log kve/gram. Beide kazen worden gemaakt van biologische rauwe melk. Verder hebben ze beide een witte schimmelkorst. De andere 4 kazen die de tolerantielimiet overschreden, hebben een aanwezigheid van E. coli die varieert tussen 3 en 4 log kve/gram. Verder wordt, net als bij S. aureus, gekeken of er correlatie gevonden kan worden tussen de kwantitatieve bepaling van E. coli en de pH, aw of het zoutgehalte. Uit de Correlatie Test blijkt echter dat er geen significante correlatie vastgesteld kan worden.

4.1.6 Melkzuurbacteriën

Uit de statistische testen blijkt duidelijk dat de melkzuurbacteriën normaal verdeeld zijn. Ze variëren tussen 5 en 9 log kve/gram met een gemiddelde van 7.64 log kve/gram en een standaard afwijking van 1.00 log kve/gram (Figuur 10). De kwantitatieve bepaling van de MZB wordt niet beïnvloed door de hardheid,

14

Doelwaarde geeft de richtwaarde (in kve/gram) weer die na productie onder goede werkpraktijken en hygiënische omstandigheden behaald moet kunnen worden (LFMFP-UGent, 2010).

56

1 1 0 1 0

10

20

30

40

50

60

S. aureus

<2 log 2 - 3 log 3 - 4 log 5 - 6 log 6 - 7 log

44

4 6 4 2

0

10

20

30

40

50

60

E. coli

<1 log 1 - 2 log 2 - 3 log 3 - 4 log 4 - 5 log

4 10

24 18

4

0

10

20

30

40

50

60

MZB

5 - 6 log 6 - 7 log 7 - 8 log

8 - 9 log 9 - 10 log

59

0 0 0 0 1 0

10

20

30

40

50

60

L. monocytogenes

<2 log 2 - 3 log 3 - 4 log

4 - 5 log 5 - 6 log 6 - 7 log

40

hittebehandeling, aw of het zoutgehalte maar wel door de pH zoals bij S. aureus het geval was. De determinatiecoëfficiënt tussen deze twee parameters bedraagt 31%.

4.1.7 Listeria monocytogenes

Uit de analyses bleek dat er slechts op één monster L.monocytogenes aanwezig was met meer dan 1 log kve/gram (Figuur 10). De kaas in kwestie is Keiems bloempje, een zachte kaas met een witte schimmelkorst gemaakt van rauwe, biologische melk. Hierop werd ongeveer 5 log kve/gram teruggevonden. De exacte hoeveelheid werd nagegaan door het uitvoeren van een nieuwe uitplating. Hierbij werd een resultaat bekomen van 6.2 log kve/gram. Een waarde die sterk boven de tolerantiewaarde van 2 log kve/gram ligt.

4.2 Challengetesten

Als tweede stap in het onderzoek worden challengetesten uitgevoerd met L. monocytogenes op 5 verschillende soorten kaas. Challengetesten worden gebruikt om te bepalen of L. monocytogenes zal uitgroeien op een kaas die ermee besmet is.

4.2.1 Referentiemonsters

De referentiemonsters worden zowel op dag 0, op dag 14 bij 7°C als op dag 14 bij 14°C getest. Hierbij worden dezelfde parameters geanalyseerd als bij de prevalentiescreening, namelijk pH, aw, zoutgehalte en concentratie aan Staphylococcus aureus, Escherichia coli, melkzuurbacteriën en Listeria monocytogenes.

4.2.1.1 Zuurtegraad (pH)

In Tabel 14 is de gemiddelde pH weergegeven samen met de standaardafwijking op dag 0 (pH B1), dag 14 bij 7°C (pH B2 – 7°C) en dag 14 bij 14°C (pH B2 – 14°C).

Tabel 14. De gemiddelde pH van de verschillende monsters en de standaard afwijking. Hierbij stelt B1 de referentiemonsters voor op dag 0 en B2 de referentiemonsters op dag 14.

pH B1 pH B2 - 7°C pH B2 - 14°C

Naam Gem. St. Afw Gem. St. Afw Gem. St. Afw

Gourmelin 6,61 0,21 6,97 0,15 7,09 -15

Brie de meaux 6,90 0,16 7,30 0,07 7,39 -13

Rosso di Langa 6,34 0,49 6,71 0,37 7,13 0,01

Pas de rouge 5,37 0,09 5,65 0,42 6,10 0,33

Tomme 5,46 0,34 6,09 0,51 6,44 0,33

De pH wordt gemeten bij drie verschillende omstandigheden, namelijk op dag 0, op dag 14 bij 7°C en dag 14 bij 14°C. Uit statistische testen blijkt echter dat er geen significant verschil is tussen de drie metingen. Er is wel een significant verschil tussen de verschillende soorten kaas, behalve wanneer de kaas voor 14 dagen bij 14°C bewaard werd. Tot slot blijkt dat de pH significant verschillend is tussen zachtere en hardere kazen.

15

Hier kan geen standaard afwijking berekend worden aangezien er slechts één resultaat beschikbaar is.

41

4.2.1.2 Wateractiviteit (aw)

Net als bij de pH wordt in Tabel 15 het gemiddelde en de standaardafwijking van de aw van de verschillende soorten kaas weergegeven. In de prevalentiescreening wordt een significant verschil tussen zachtere en hardere kazen aangetoond op het vlak van aw. Uit statistische testen blijkt dat dit ook hier bij de challengetesten het geval is. Er is namelijk een significant verschil tussen de zachtere kazen (Gourmelin, Brie de meaux en Rosso di Lango) en hardere kazen (Pas de rouge en Tomme de montagne) wat betreft de aw. Verder is er een significant verschil tussen dag 0 en dag 14 bij 14°C en tussen dag 14 bij 7°C en dag 14 bij 14°C. Voorst is er meestal een significant verschil tussen de kaassoorten onderling, behalve wanneer ze bewaard worden voor 14 dagen bij 14°C.

Tabel 15. De gemiddelde aw van de verschillende monsters en de standaard afwijking. Hierbij stelt B1 de referentiemonsters voor op dag 0 en B2 de referentiemonsters op dag 14.

aw B1 aw B2 - 7°C aw B2 -14°C


Gourmelin 0,9626 0,0028 0,9603 0,0024 0,9575 -

Brie de meaux 0,9593 0,0033 0,9592 0,0030 0,9529 -

Rosso di Langa 0,9678 0,0002 0,9697 0,0030 0,9515 0,0218

Pas de rouge 0,9544 0,0046 0,9518 0,0055 0,9519 0,0028

Tomme 0,9494 0,0077 0,9460 0,0096 0,9429 0,0096

4.2.1.3 Zoutgehalte

Het gemiddelde en de standaardafwijking van het zoutgehalte worden weergegeven in Tabel 16. Bij het zoutgehalte worden wederom dezelfde statistische testen uitgevoerd als bij de pH en de aw metingen. Hieruit blijkt dat er geen significant verschil is tussen zachtere en hardere kazen. Tevens wordt er geen verschil gevonden tussen de verschillende bewaarcondities (B1 t.o.v. B2 bij 7°C t.o.v. B2 bij 14°C). Er is echter wel een verschil tussen de kaassoorten onderling, behalve wanneer ze bewaard werden voor 14 dagen bij 14°C.

Tabel 16. Het gemiddelde zoutgehalte van de verschillende monsters en de standaard afwijking. Hierbij stelt B1 de referentiemonsters voor op dag 0 en B2 de referentiemonsters op dag 14.

zout% B1 zout% B2 - 7°C zout% B2 -14°C


Gourmelin 2,61% 0,29% 2,69% 0,17% 2,89% -

Brie de meaux 2,27% 0,20% 2,46% 0,18% 2,67% -

Rosso di Langa 1,92% 0,06% 2,04% 0,29% 2,21% 0,08%

Pas de rouge 2,69% 0,29% 2,75% 0,28% 2,73% 0,27%

Tomme 1,91% 0,31% 2,00% 0,33% 2,30% 0,44%

4.2.1.4 Staphylococcus aureus

Na analyse van de verschillende monsters op aanwezigheid van S. aureus met meer dan 2 log kve/gram, blijkt dat op geen enkel monster S. aureus teruggevonden kan worden.

42

4.2.1.5 Escherichia coli

Bij de prevalentiescreening kon er geen significant verschil teruggevonden worden tussen zachtere en hardere kazen voor de concentratie van E. coli. Er kon echter wel een verschil teruggevonden worden tussen rauwmelkse en gepasteuriseerde kazen. Zo bleek dat er bij geen enkele van de 23 gepasteuriseerde kazen aanwezigheid (≥ 1 log kve/gram) van E. coli vastgesteld kon worden. Wanneer dezelfde scenario’s nagegaan werden bij de referentiemonsters van de challengetesten bleek dat er hier wel een significant verschil kon vastgesteld worden tussen zachtere en hardere kazen (op dag 0 en op dag 14 bij 7°C). Bij de referentiemonsters op dag 14 bij 14°C werd er geen significant verschil tussen zachtere en hardere kazen vastgesteld. Hierbij is er echter vrij weinig data beschikbaar zoals in onderstaande tabel te zien is. Vandaar dat deze resultaten sceptisch bekeken moeten worden. Verder wordt opnieuw een significant verschil tussen rauwmelkse en gepasteuriseerde kazen vastgesteld. Hierbij is er meer kans op aanwezigheid (≥ 1 log kve/gram) van E. coli op rauwmelkse dan op gepasteuriseerde kazen. Het verschil, op vlak van aanwezigheid van E. coli, tussen de rauwmelkse en de gepasteuriseerde kazen is dan ook duidelijk weergegeven in Tabel 17. Verder wordt gekeken of er correlatie is tussen het aantal kve/gram E. coli en de pH, aw, het zoutgehalte of het aantal MZB. Aangezien er geen significante verschillen zijn tussen B1, B2 bij 7°C en B2 bij 14°C, wordt de Correlatie Test enkel uitgevoerd op B1. Hieruit blijkt dat er nergens een significante correlatie kan verondersteld worden.

Tabel 17. De range van het aantal kve E. coli per gram kaas.

Naam Hittebehandeling E. coli B1 (log) E. coli B2 - 7°C (log) E. coli B2 - 14°C (log)

Gourmelin Gepasteuriseerd <1,00 <1,00 <1,00

Brie de meaux Geen (rauwmelks) <1,00 - 3,86 <1,00 - 3,96 2,46 - 3,63

Rosso di Langa Gepasteuriseerd <1,00 - 1,00 <1,00 - 2,30 <1,00

Pas de rouge Geen (rauwmelks) 1,60 - 2,71 1,30 - 2,56 2,30 - 3,54

Tomme Geen (rauwmelks) 1,30 - 3,13 <1,00 - 2,76 1,00 - 3,12

4.2.1.6 Melkzuurbacteriën

Er heerst heel wat discussie over de temperatuur waarbij mesofiele MZB geïncubeerd moeten worden. Hierbij wordt soms de voorkeur gegeven aan 22°C en soms aan 30°C. Vandaar dat in deze thesis beide condities nagegaan worden door telkens een incubatie in tweevoud uit te voeren. Hieruit blijkt dat er in deze thesis geen significant verschil is tussen incubatie bij 22 en 30°C. Wanneer er gekeken wordt of er een significant verschil is tussen dag 0 en dag 14 blijkt dat er geen significant verschil is voor het aantal MZB. Verder kan er gekeken worden of er een significant verschil is tussen het bewaren van de monsters bij 7°C of bij 14°C. Hieruit blijkt dat er geen significant verschil is als de monsters bij 22°C geïncubeerd werden maar dat er wel een klein maar significant (p=0,042) verschil is als de kazen geïncubeerd werden bij 30°C. Dit laatste resultaat lijkt in tegenspraak met wat eerder aangetoond wordt, namelijk dat er geen significant verschil is tussen incubatie bij 22 en 30°C. Er moet echter in rekening gebracht worden dat het hier slechts over een beperkt aantal monsters gaat waardoor licht afwijkende resultaten mogelijk zijn.

4.2.1.7 Listeria monocytogenes

Er kon bij geen enkele kaas aanwezigheid van L. monocytogenes gedetecteerd worden na uitvoering van de kwalitatieve testmethode (VIDAS).

43

4.2.2 Geïnoculeerde monsters

De challengetesten worden uitgevoerd door kaas enerzijds 2 weken te bewaren bij 7°C en anderzijds 2 weken te bewaren bij 14°C. Alle testen gebeuren in drievoud. Hierdoor worden er steeds drie waardes geobserveerd voor elke conditie. Aan de hand van deze drie waardes kan het groeipotentieel bepaald worden. Het groeipotentieel kan op verschillende manier berekend worden. Enerzijds is er de methode die algemeen in de EU gebruikt wordt (EU mediaan) en anderzijds is er het worst case groeipotentieel (het grootste verschil). De EU mediaan wordt bekomen door de mediaan van de concentratie op het einde van de challengetest (na twee weken) te verminderen met de mediaan van de concentratie die direct na enting gemeten wordt. Zo kan er gezien worden in welke mate de beënte bacteriën zullen uitgroeien. Wanneer er echter een uitschieter zit tussen de waardes wordt hiermee geen rekening gehouden. In de praktijk kan het nochtans gebeuren dat de pathogenen tot deze hoeveelheid zullen uitgroeien. Wanneer dit het geval is, wordt van een worst case gesproken. Een logisch gevolg is dat deze uitschietende waardes niet zomaar verwaarloosd mogen worden. Om het worst case scenario te benaderen wordt het groeipotentieel op een andere manier berekend. Hierbij wordt de hoogste concentratie op het einde van de challengetest (2 weken) verminderd met de kleinste concentratie die vastgesteld werd na beënten. Het groeipotentieel dat op deze manier berekend wordt krijgt de naam ‘het grootste verschil’. De gemiddelde waardes voor de EU mediaan en het grootste verschil voor de verschillende kazen is terug te vinden in Tabel 18. Hierbij wordt 1 dataset, welke 1 EU mediaan of grootste verschil oplevert, bekomen door 9 challengetesten uit te voeren namelijk 3 batches in drievoud. Bij het vergelijken van de EU mediaan en het grootste verschil blijkt dat deze twee dan ook significant verschillend zijn.

Tabel 18. De gemiddelde EU mediaan en het grootste verschil per kaas bij een bewaartemperatuur van 7°C en een bewaartemperatuur van 14°C.

Naam Hardheid EU mediaan 7°C Gr. verschil 7°C EU mediaan 14°C Gr. verschil 14°C

Gem. St. Afw. Gem. St. Afw. Gem. St. Afw. Gem. St. Afw.

Gourmelin Zacht 3,60 0,30 3,87 0,38 5,04 0,22 5,32 0,17

Brie de meaux Halfzacht 3,34 0,69 3,86 0,53 5,19 0,37 5,37 0,30

Rosso di Langa Halfzacht 3,36 0,41 3,71 0,49 4,06 0,27 4,46 0,11

Pas de rouge Half-hard 0,35 0,17 1,03 0,35 2,13 1,25 2,98 0,12

Tomme de montagne

Half-hard 0,64 1,01 1,05 1,08 0,67 1,27 2,28 1,21

Via de waarde voor het groeipotentieel kan de tolerantiewaarde op dag 0 bepaald worden door gebruik te maken van Tabel 12. Dit betekent dat op dag 0 L. monocytogenes afwezig moet zijn in y gram. Deze voorwaarde zorgt ervoor dat tegen het einde van de houdbaarheid de tolerantiewaarde van 2 log kve/gram, die aangegeven wordt in Verordening (EG) Nr. 2073/2005, niet overschreden wordt. Als deze tolerantiewaarde wel overschreden wordt, zal er zich mogelijks een probleem kunnen stellen met betrekking tot de voedselveiligheid. Wanneer naar de tolerantiewaarde op dag 0 van de geteste kazen gekeken wordt, is te zien dat voor Gourmelin, Brie de meaux en Rosso di Langa een afwezigheid in 25 gram geldt. Bij Tomme de montagne moet er een afwezigheid in 0.1 gram zijn en bij Pas de rouge is het afhankelijk van de temperatuur waarbij de kaas bewaard wordt.

44

Uit Tabel 12 en Tabel 18 blijkt duidelijk dat er een significant verschil in groeipotentieel is tussen de kazen onderling (behalve bij het grootste verschil bij een bewaartemperatuur van 14°C). De reden hiervoor kan op verschillende vlakken gezocht worden, namelijk de plaats van beënting, de hardheid van de kaas, de soort korst, de hittebehandeling maar ook andere factoren zoals de pH, de aw, het zoutgehalte of het aantal MZB. Bovendien kan er ook vastgesteld worden dat er een significant verschil is tussen het groeipotentieel welke na 1 week vastgesteld werd en het groeipotentieel welke na 2 weken vastgesteld werd. Het verschil in groeipotentieel tussen week 1 en week 2 zal variëren tussen 0.14 en 2.07 kve/gram. Sectie van kaas (snijvlak of korst) waarop de beënting uitgevoerd wordt Elke kaassoort wordt vier keer beënt. Hierbij worden de vier kazen welke tot dezelfde kaassoort behoren tweemaal beënt op het snijvlak en tweemaal op de korst. Via statistische testen kan aangetoond worden dat er een significant verschil is in groeipotentieel tussen een beënting op het snijvlak en op de korst wanneer de kazen bewaard worden bij 7°C, maar dat er geen significant verschil is als de kazen bewaard worden bij 14°C. Bij een bewaartemperatuur van 7°C is het groeipotentieel van een korstbeënting significant kleiner dan wanneer er op het snijvlak beënt wordt. Het gemiddelde verschil is echter vrij klein (0.69 voor EU mediaan en 0.65 voor grootste verschil) en de standaard afwijking vrij groot (0.71 voor EU mediaan en 0.84 voor grootste verschil). Aldus zullen hier nog meer testen uitgevoerd moeten worden zodat een grotere dataset bekomen wordt. Hardheid Bij een vergelijking tussen zachtere en hardere kazen kan een duidelijk verschil in groeipotentieel aanschouwd worden. Zo zullen hardere kazen duidelijk een kleinere groeipotentieel vertonen dan zachtere. Dit wordt weergegeven in Tabel 18. Soort korst Aangezien er een groot verschil in groeipotentieel is tussen zachtere en hardere kazen wordt er, bij het vergelijken van de soorten korst, voor gekozen enkel de zachtere kazen te beschouwen. Zo kan bepaald worden of er een significant verschil is tussen een korst van roodbacteriën en een witte schimmelkorst. Uit de statistische testen blijkt dat er geen significant verschil is tussen een roodbacteriekorst en een witte schimmelkorst. Deze testen vergelijken echter enkel het groeipotentieel tussen een korst van roodbacteriën en een witte schimmelkorst. Er zijn echter nog andere korstsoorten die in bij deze challengetesten niet in acht genomen zijn. Hittebehandeling Bij de hardere kazen worden enkel kazen geanalyseerd die gemaakt worden van rauwe melk. Vandaar dat bij het beschouwen van het verschil in groeipotentieel tussen rauwmelkse en gepasteuriseerde kazen enkel de zachtere kazen in acht genomen worden. Bij de zachtere kazen is te zien dat er geen significant verschil in groeipotentieel is tussen rauwmelkse en gepasteuriseerde kazen bij een bewaartemperatuur van 7°C. Er is echter wel een significant verschil wanneer de kazen bewaard werden bij 14°C. Bij deze temperatuur zal er een grotere uitgroei zijn bij de rauwmelkse kazen. De hittebehandeling zal dus een invloed hebben op de uitgroei wanneer de kazen bij een verschillende bewaartemperatuur gehouden worden.

45

pH, aw, zoutgehalte en het aantal MZB Als laatste stap wordt er ook gezocht naar een verband tussen groeipotentieel en pH, aw, zoutgehalte en aantal MZB. Aangezien dit allemaal continue variabelen zijn, in tegenstelling tot de hittebehandeling wat een factorvariabele is, zal er gebruik gemaakt worden van correlatie testen. Deze testen geven enerzijds de correlatie tussen de verschillende parameters weer en anderzijds de p-waarde van de verschillende correlaties. Uit deze p-waarde kan afgeleid worden of het om een significante correlatie gaat. Hierdoor kan o.a. getracht worden het grote verschil in groeipotentieel tussen zachtere en hardere kazen te verklaren. Wanneer gebruik gemaakt wordt van de Correlatie Test kan zowel bij 7°C als 14°C een significante correlatie vastgesteld worden tussen de pH op dag 0 en het groeipotentieel van L. monocytogenes. Deze positieve relaties worden weergegeven in Figuur 11. Dit betekent dat het groeipotentieel (EU mediaan en grootste verschil) van L. monocytogenes deels door de pH van de kaas verklaard kan worden en dat bij een hogere pH het groeipotentieel hoger zal liggen. Verder kan er ook een positieve correlatie vastgesteld worden tussen de aw en het groeipotentieel (EU mediaan en grootste verschil) bij 7°C. Hierbij is de correlatiecoëfficiënt echter kleiner dan diegene die bij de pH vastgesteld wordt.

Figuur 11. Correlatie tussen de pH op dag 0 en de EU mediaan en het grootste verschil zowel bij een bewaartemperatuur van 7°C als 14°C.


Na het uitvoeren van de challengetesten worden deze ook theoretisch gemodelleerd aan de hand van twee verschillende programma’s. Hiervoor werd enerzijds gebruik gemaakt van ComBase (ComBase, 2014; Baranyi & Tamplin, 2004) en anderzijds van het programma SSSP (Mejlholma, et al., 2010). In eerste instantie worden de resultaten van de verschillende modelleerprogramma’s onderling vergeleken. Hieruit blijkt dat er geen significant verschil is in groeipotentieel

5.1 5.7 6.3 6.9pH.B1

1

4

eum

ed.7

5.1 5.7 6.3 6.9pH.B1

1

3

grv

er.

7

5.1 5.7 6.3 6.9pH.B1

2

6

eum

ed.1

4

5.1 5.7 6.3 6.9pH.B1

3

6

grv

er.

14

46

tussen ComBase en SSSP. Wanneer de modelleerprogramma’s elk afzonderlijk vergeleken worden met de resultaten van de experimenteel uitgevoerde challengetesten, is te zien dat bij bewaring van de kazen voor 2 weken bij zowel 7°C als 14°C er een significant verschil is. ComBase en SSSP geven hierbij nagenoeg altijd een overschatting van de experimenteel uitgevoerde challengetesten. Bij SSSP is de overschatting het duidelijkst te zien bij bewaring voor 2 weken bij 14°C. Bij bewaring voor 2 weken bij 7°C is er bij SSSP soms echter een onderschatting op te merken. Dit alles wordt duidelijk weergegeven in Figuur 12 en Figuur 13 waar per monster zowel het gemiddelde groeipotentieel van de experimenteel uitgevoerde challengetesten als het gemiddelde groeipotentieel berekend via ComBase en SSSP weergegeven worden in een spreidingsdiagram. De oorzaak van deze afwijkingen zou mogelijks gezocht kunnen worden bij de hoge aantallen MZB die op kaas aanwezig zijn waarmee in beide programma’s geen rekening gehouden wordt.

Figuur 12. Gemiddelde groeipotentieel na 14 dagen bij 7°C.


De eerste 8 kazen werden niet alleen na 2 weken maar ook na 1 week kwantitatief getest op L. monocytogenes. Na het theoretisch modelleren van deze 8 kazen blijkt dat er bij een bewaring voor 1 week bij 7°C geen significant verschil is tussen de experimenteel bepaalde waardes en de gemodelleerde waardes (Figuur 14). Dit moet echter wederom in perspectief gezien worden aangezien het hier slechts over een zeer beperkte dataset gaat. Hier worden 8 experimentele waardes vergeleken met twee keer 8 gemodelleerde waardes (8 waardes via ComBase en 8 waardes via SSSP).

012345678

0 5 10 15 20

Gem

idd

eld

e gr

oei

po

ten

tie

el

Monster

Gemiddelde groeipotentieel na 14 dagen bij 7°C

Exp. 7°C

Combase 7°C

SSSP 7°C

012345678

0 5 10 15 20

Gem

idd

eld

e gr

oei

po

ten

tiee

l

Monster


Exp. 14°C

Combase 14°C

SSSP 14°C

47



Als laatste stap worden de resultaten van de challengetesten die uitgevoerd werden door het accreditatielabo (Belac) beschouwd. Hier zullen enerzijds de resultaten van de risicoproducten die geassocieerd worden met aanwezigheid van L.monocytogenes geanalyseerd worden en anderzijds zullen de challengetesten m.b.t. kaas in detail bestudeerd worden.

4.4.1 Challengetesten op risicoproducten

Er wordt besloten om de resultaten van de categorie ei en eiproducten achterwege te laten omdat deze categorie niet tot de grootste risicoproducten behoort die geassocieerd worden met L. monocytogenes. Voorts wordt beslist om de categorie plantaardige producten achterwege te laten omdat er zich slechts 6 producten in deze categorie bevinden waardoor deze data minder relevant zijn dan de andere data. Het gemiddelde groeipotentieel (EU mediaan en grootste verschil) en de standaard afwijking van de overige categorieën wordt weergegeven in Tabel 19. Hierbij wordt 1 dataset, welke 1 EU mediaan of grootste verschil oplevert, bekomen door 9 challengetesten uit te voeren namelijk 3 batches in drievoud.

Tabel 19. Het gemiddelde groeipotentieel (EU mediaan en grootste verschil) en standaard afwijking van de resultaten voor de challengetesten voor de grootste risicoproducten in kve/gram.

Kaas Vlees Vis Samengest. LM

n = 21 n = 46 n = 32 n = 120

Gem. St. Afw. Gem. St. Afw. Gem. St. Afw. Gem. St. Afw.

EU mediaan

1,47 1,96 1,12 2,11 2,41 1,79 -0,08 1,13

Grootste verschil

2,15 1,97 1,44 2,13 2,81 1,85 0,26 1,21

Uit deze resultaten kan afgeleid worden dat het grootste verschil steeds hoger zal liggen dan de EU mediaan. Verder kan er geobserveerd worden dat de standaard afwijking steeds zeer hoog zal liggen t.o.v. de waarde die teruggevonden wordt voor het gemiddelde. Dit toont aan dat binnen 1 categorie heel wat variabiliteit qua producten (formulering en/of productsamenstelling) en groeipotentieel terug te vinden is wat aangeeft dat er steeds geval per geval moet gekeken worden. De resultaten voor een categorie kunnen aldus niet zomaar veralgemeend worden. Voorts kan uit

012345678

0 2 4 6 8

Gem

idd

eld

e gr

oe

ipo

ten

tie

el

Monster


Exp. 7°C

Combase 7°C

SSSP 7°C

48

de tabel een opmerkelijk resultaat voor samengestelde levensmiddelen afgeleid worden. Zo ligt het gemiddeld groeipotentieel voor samengestelde levensmiddelen onder 2 log kve/gram zowel voor de EU mediaan als voor het grootste verschil. Zelfs wanneer de standaard afwijking in rekening gebracht wordt zullen de producten nog steeds niet uitgroeien boven 2 log kve/gram. De samengestelde producten die hier beschouwd worden zijn vooral delisalades, rauwkostsalades en enkele kant-en-klare maaltijden. Verder kan ook het score systeem toegepast worden waarvan de resultaten terug te vinden zijn in Tabel 20. Bij dit score systeem wordt gekeken in hoeveel verschillende scorecategorieën de resultaten voor de drievoudige testen zich bevinden. De scorecategorieën die gebruikt worden, zijn terug te vinden in Tabel 12. Wanneer de drievoudige testen allemaal binnen eenzelfde scorecategorie vallen wordt een score van 1 toegekend, bij 2 verschillende scorecategorieën een score van 2 enzovoort. Wanneer de resultaten binnen dezelfde scorecategorie vallen (score 1), zit er weinig variabiliteit op de resultaten van de challengetesten. Bij een hogere score wordt er meer variabiliteit in de resultaten teruggevonden. Uit Tabel 20 kan afgeleid worden dat de data bij alle risicoproducten ontzettend verspreid ligt. Voorts kan gezien worden dat kaas het hoogste aantal monsters heeft waarbij de resultaten van de challengetesten (in drievoud) elk tot een andere scorecategorie behoren en dat vis het hoogste aantal monsters heeft waarbij een score van 2 bekomen wordt. Hieruit blijkt dat niet alleen veel variabiliteit binnen 1 productcategorie terug te vinden is maar ook binnen éénzelfde product.

Tabel 20. De resultaten van het score systeem voor kaas, vlees, vis en samengestelde levensmiddelen.

Kaas Vlees Vis Samengest. LM

n = 21 n = 46 n = 32 n = 120

Aantal Procent Aantal Procent Aantal Procent Aantal Procent

Score 1 13 61,90% 26 56,52% 16 50,00% 70 58,33%

Score 2 6 28,57% 17 36,96% 14 43,75% 44 36,67%

Score 3 2 9,52% 3 6,52% 2 6,25% 6 5,00%

Totaal 21 100,00% 46 100,00% 32 100,00% 120 100,00%

4.4.2 Challengetesten op kaas

De challengetesten waarbij kaas beënt werd, worden in meer detail bestudeerd dan de andere risicoproducten. Hieruit blijkt dat er, net als bij de zelf uitgevoerde challengetesten, een significant verschil is tussen de EU mediaan en het grootste verschil. Er kan voor het groeipotentieel echter geen significant verschil afgeleid worden tussen zachtere en hardere kazen of tussen rauwmelkse en gepasteuriseerde kazen. Wanneer de EU mediaan geanalyseerd wordt, kan er wel een significant verschil opgemerkt worden tussen een beënting op de korst en op het snijvlak van de kaas. Als het grootste verschil bekeken wordt, kan dit significante verschil echter niet teruggevonden worden. De reden waarom deze bevindingen afwijken van de zelf uitgevoerde challengetesten kan enerzijds te wijten zijn aan het beperkt aantal monsters (21), bovendien waren de omstandigheden waarin deze kazen bewaard werden tijdens de challengetesten onderling ontzettend verschillend zowel naar bewaartijd als temperatuur. Hierdoor is het meestal niet mogelijk om de verschillende kazen met elkaar te vergelijken waardoor de nulhypothese in de meeste testen niet verworpen wordt.

49

5. Discussie In deze discussie wordt getracht om enkele belangrijke vragen te beantwoorden met betrekking tot kaas en de aanwezigheid en groei van L. monocytogenes. Zo wordt aangetoond in welke mate kaas een risicoproduct is op vlak van aanwezigheid en groei van L. monocytogenes in vergelijking tot andere risicoproducten zoals gerookte vis, vleeswaren en samengestelde levensmiddelen zoals delisalades en kant-en-klare maaltijden. Verder wordt uitgediept welke soorten kaas het grootste risico met zich meebrengen op vlak van aanwezigheid en groei van L. monocytogenes. Op deze manier wordt er gezocht naar een antwoord op de vraag van de hoevewinkels en de delicatessenzaken of er wel zo’n strenge eisen nodig zijn rond hygiëne en koeling voor het ambachtelijk productie- en rijpingsproces van kazen.

5.1 Risicoproducten

L. monocytogenes wordt vooral geassocieerd met verduurzaamde producten (al dan niet hittebehandeld) met een verlengde houdbaarheid in de koeling. Aangezien deze producten niet meer verwarmd worden, is het belangrijk dat L. monocytogenes niet meer aanwezig is in 25 gram of dat de bacterie binnen de houdbaarheid niet boven 2 log kve/gram kan uitgroeien. Om dit laatste na te gaan, wordt er gebruik gemaakt van challengetesten (Devlieghere, et al., 2011; EFSAa, 2013). Bij het beschouwen van de resultaten van de challengetesten van het accreditatielabo (Belac) kon echter slechts een laag groeipotentieel teruggevonden worden voor samengestelde levensmiddelen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat veel van deze samengestelde levensmiddelen een lagere pH hebben of additieven bevatten die de groei van bacteriën en schimmels zullen remmen. De additieven waarvan meestal gebruik gemaakt wordt, zijn organische zuren zoals melkzuur of azijnzuur (Devlieghere, et al., 2011; Smittle, 2000). Hierdoor is het risico naar groei van L. monocytogenes, dat deze categorie met zich meebrengt, veel kleiner dan andere categorieën zoals gerookte vis of kaas. Bij deze producten worden additieven in mindere mate toegevoegd hoewel andere processen en componenten, waaronder het rookproces en de rookcomponenten bij gerookte vis, antimicrobieel kunnen werken (Arvanitoyannis & Kotsanopoulos, 2012). Nochtans neemt het laag groeipotentieel van samengestelde levensmiddelen niet weg dat er in de toekomst problemen zouden kunnen optreden aangezien de consument houdt van een clean label waardoor het gebruik van additieven beperkt wordt. Bovendien vermijdt de consument liever toegevoegd zout in zijn producten dat normaliter toegevoegd wordt om een langere houdbaarheid van het levensmiddel te bekomen. Desondanks zijn de grootste risicoproducten voor uitgroei van L. monocytogenes op dit moment gerookte vis, kaas en vleeswaren wat duidelijk blijkt uit de resultaten van het accreditatielabo. Hier wordt namelijk steeds een groeipotentieel teruggevonden welke groter is dan 2 log kve/gram levensmiddel waardoor er gestreefd moet worden naar afwezigheid van L. monocytogenes in deze producten. Deze risicoproducten, namelijk vis, vleeswaren en kaas, worden ook door het EFSA als belangrijke risicoproducten beschouwd (EFSAa, 2013). Dit blijkt o.a. uit de EFSA baseline studie die uitgevoerd werd in 2013 (EFSAc, 2013). Uit deze studie kwam naar voor dat bij 1 op de 10 gerookte visproducten aanwezigheid van L. monocytogenes terug te vinden is. Aangezien uit de resultaten van het accreditatielabo afgeleid kan worden dat aanwezigheid van L. monocytogenes zo

50

goed als altijd zal leiden tot een overschrijding van de maximale tolerantiewaarde, kan afgeleid worden dat 1 op 10 gerookte visproducten niet meer geconsumeerd mag worden. Dit is een schrikwekkend hoog getal. Er zou dan ook verwacht kunnen worden dat er een groot aantal productterugroepingen en L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken geassocieerd zijn met gerookte vis. Dit is echter niet in overeenstemming met de data die hiervoor teruggevonden wordt. Zo kunnen er in België amper productterugroepingen i.v.m. gerookte vis aangetroffen worden in tegenstelling tot andere risicoproducten zoals kaas en vleeswaren (FAVV - AFSCA, 2013). Nochtans worden op Europees vlak wel hoge percentages productterugroepingen opgemerkt voor gerookte vis (European Commission, 2013). Een mogelijke oorzaak hiervan is dat in België gerookte vis in mindere mate geconsumeerd wordt t.o.v. kaas en vleeswaren. Wanneer de rapporten van het EFSA en het ECDC en het medisch tijdschrift Eurosurveillance echter geanalyseerd worden, blijkt dat er in de periode van 2000 tot 2011 geen L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken teruggevonden kunnen worden welke te wijten zijn aan gerookte vis (ECDCa, 2013; EFSAe, 2013; ECDCc, 2013). Bij het bestuderen van uitbraken worden de individuele ziektegevallen echter buiten beschouwing gelaten hoewel deze veel talrijker aanwezig zijn. Als voorbeeld kan het jaar 2009 bekeken worden. In dat jaar waren er 1685 gerapporteerde gevallen voor listeriose. Hiervan zijn slechts 48 gevallen of 2.85% van de gevallen geassocieerd met uitbraken (ECDC, 2011). Waarschijnlijk zal gerookte vis dus eerder terug te vinden zijn als oorzaak van individuele ziektegevallen. Bovendien is de oorzaak van een uitbraak niet steeds eenvoudig te bepalen vanwege de variabele incubatieperiode die gepaard gaat met listeriose (enkele tot 30 dagen) (Food-info, 2013; FDA, 2012). Het is dus mogelijk dat er uitbraken gemist worden of dat de verkeerde oorzaak aangewezen wordt. Voorts is er de possibiliteit dat de L. monocytogenes stammen welke circuleren bij gerookte vis minder virulent zijn. Kaas komt als risicoproduct duidelijker naar voor uit de bestaande literatuur. Zo kan in de baseline studie van het EFSA een prevalentie van 0.47% aangetroffen worden (EFSAc, 2013). Hieruit volgt dan ongeveer 1 op 200 kazen niet meer geconsumeerd mag worden. Dit lijkt veel minder t.o.v. het aandeel van gerookte vis (1 op 10). Zo is er volgens de baseline studie 20 keer meer kans om gerookte vis terug te vinden, welke aanwezigheid van L. monocytogenes vertoond, dan kaas. Wanneer echter de productterugroepingen van zowel België als de EU in beschouwing genomen worden, kan afgeleid worden dat respectievelijk 48.78% en 23.92% van de productterugroepingen in de periode van 01/01/2008 tot 31/12/2013 te wijten waren aan kaas waarbij aanwezigheid van L. monocytogenes vastgesteld werd (FAVV - AFSCA, 2013; European Commission, 2013). Hierdoor blijkt uit de data van het RASFF dat er minder dan 2 keer meer kans is om aanwezigheid van van L. monocytogenes terug te vinden in kaas dan in gerookte vis wat toch een groot verschil is met wat uit de baseline studie geconcludeerd kon worden. Bovendien blijkt uit de jaarrapporten van het EFSA en het ECDC dat 33% van de L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken in de periode van 2007 tot 2011 geassocieerd zijn met kaas (ECDCa, 2013; EFSAe, 2013). De jaarlijkse rapporten zijn echter niet volledig. Zo kan er via Eurosurveillance in dezelfde periode nog een uitbraak geassocieerd met kaas teruggevonden worden. Hierdoor stijgt het percentage zelfs tot 38%. Voorts moet ook rekening gehouden worden dat de oorzaak van een deel van de uitbraken niet gekend is waardoor het percentage nog hoger zou kunnen komen te liggen. Wanneer de periode bovendien uitgebreid wordt door te kijken vanaf het jaar 2000

51

kunnen er nog 7 bijkomende uitbraken aangetroffen worden welke geassocieerd zijn met kaas (ECDCc, 2013). Uit dit alles kan geconcludeerd worden dat kaas zeker niet te onderschatten is als risicoproduct. Zo blijkt uit de resultaten van het accreditatielabo dat dit product meestal gepaard gaat met een hoog en zeer variabel groeipotentieel. Bovendien is het een product dat niet onbelangrijk is op vlak van productterugroepingen te wijten aan aanwezigheid van L. monocytogenes en wordt het vaak geassocieerd met L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken. Het is dan ook belangrijk om te bestuderen welke soorten kaas het meeste risico met zich meebrengen, welke factoren dit in de hand werken en hoe dit risico vermeden kan worden.

5.2 Listeria monocytogenes en kaas

Bij het opstarten van deze thesis werd al snel duidelijk dat kaas geen eenvoudig product is. Het is een ontzettend complex levensmiddel dat in verschillende categorieën uiteenvalt. Zo kan er een onderscheid gemaakt worden op basis van hittebehandeling, hardheid, korst, smaak enzovoort. Bovendien reageert kaas zeer variabel afhankelijk van zijn omgevingsfactoren. Het is dus niet zomaar te bepalen welke soort kaas het meeste risico met zich meebrengt op vlak van aanwezigheid en groei van L. monocytogenes. Daarnaast moet ook in rekening gebracht worden dat aanwezigheid en groei van L. monocytogenes twee verschillende zaken zijn. Zo zal de aanwezigheid van 1 kve/gram L. monocytogenes niet noodzakelijk betekenen dat deze zal uitgroeien tot een infectueuze dosis. Vandaar dat aanwezigheid en groei in eerste instantie afzonderlijk beschouwd zullen worden.

5.2.1 Aanwezigheid van L. monocytogenes

Wanneer enkele Europese prevalentiestudies bestudeerd worden die meer dan 1000 kaasmonsters analyseren op aanwezigheid van L. monocytogenes wordt een prevalentie geobserveerd die schommelt tussen 0.52 en 2.20% (Busani, et al., 2005; Manfreda, et al., 2005; Prencipe, et al., 2004; EFSAc, 2013; EFSA, 2005; EFSA, 2006). Welke soorten kaas geanalyseerd worden, is in de meerderheid van de studies niet beschreven. Aangezien het hier echter steeds over een groot aantal monsters gaat, kan besloten worden dat deze studies een mooie weergave schetsen van de werkelijkheid in de EU. Bovendien wordt voor de zelf uitgevoerde prevalentiescreening een prevalentie van 1.67% gedetecteerd. Een getal dat mooi past in deze spreiding. Om echter het verschil in prevalentie tussen de diverse kaassoorten te achterhalen, is het beter om te kijken naar prevalentiestudies waarbij duidelijk beschreven staat welke kaassoorten geanalyseerd werden. Wanneer in eerste instantie naar het verschil gezocht wordt tussen zachtere en hardere kazen blijkt dit niet zo eenvoudig. De hardheid van de kazen wordt dan ook amper gedocumenteerd. Een parameter die wel goed gedocumenteerd is, is de hittebehandeling van de verschillende kazen. Zo kan voor rauwmelkse kazen een prevalentie teruggevonden worden welke schommelt tussen 2.00 en 12.00% met een gewogen gemiddelde van 4.99% (Arslan & Özdemir, 2008; Colak, et al., 2007; Al-Tahiri, et al., 2008; Torres-Vitela, et al., 2012). Voor gepasteuriseerde kazen kan een prevalentie teruggevonden worden welke schommelt tussen 0.52 en 1.85% met een gewogen gemiddelde van 0.61% (EFSA, 2005; Di Pinto, et al., 2010; Mena, et al., 2004). Hieruit kan duidelijk afgeleid worden dat rauwmelkse kazen een groter risico met zich zullen meebrengen dan

52

gepasteuriseerde kazen op aanwezigheid van L. monocytogenes. Zelfs wanneer de twee afwijkende studies welke in de literatuur aangehaald werden in rekening gebracht worden, blijft dezelfde conclusie gelden (Osaili, et al., 2012; Rudolf & Scherer, 2001). In dat geval bedraagt het gewogen gemiddelde van de prevalentie namelijk 5.59% voor rauwmelkse kazen en 1.00% voor gepasteuriseerde kazen. Zodoende is er bij rauwmelkse kazen meer kans op aanwezigheid van L. monocytogenes. Dit wordt ook aangegeven in een recent advies van het FAVV voor de korte keten waaruit bleek dat deze pathogeen meer frequent geïsoleerd kon worden uit kazen op basis van rauwe melk dan uit kazen op basis van gepasteuriseerde melk (FAVV, 2014). Dit scenario is dan ook terug te vinden bij de productterugroepingen in België waar de overgrote meerderheid van de teruggeroepen kazen gemaakt zijn van rauwe melk (FAVV - AFSCA, 2013). Via de databank van het RASFF is dit moeilijker te verifiëren aangezien bij meer dan 70% van de terugroepingen op kaas niet gespecificeerd wordt welke hittebehandeling deze ondergingen (European Commission, 2013). Wanneer echter naar de L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken gekeken worden in de periode van 2000 tot 2012 welke geassocieerd zijn met kaas wordt een eigenaardig resultaat teruggevonden. Zo is 23.08% van de uitbraken geassocieerd met rauwmelkse kaas en 38.46% met gepasteuriseerde kaas. Dit kan echter verklaard worden doordat bij uitbraken individuele ziektegevallen niet in rekening gebracht worden. Bovendien is van 38.46% van de kazen de hittebehandeling niet gekend (ECDCa, 2013; ECDCc, 2013; EFSAe, 2013). Er zal dan ook besloten worden dat er een grotere kans op aanwezigheid van L. monocytogenes is bij rauwmelkse kazen dan bij gepasteuriseerde kazen. Dit is logisch vanwege de hittebehandeling die gepasteuriseerde kazen ondergaan waardoor bederforganismen en pathogenen afgedood worden (European Commission, 2013; FDA, 2013). Hoewel bij de prevalentiestudies amper informatie over de hardheid van kazen, waarop L. monocytogenes aanwezig is, afgeleid kan worden, is dit wel mogelijk wanneer de productterugroepingen in België bekeken worden. Na het bestuderen van de databank van het FAVV kan besloten worden dat de meerderheid (55%) van de productterugroepingen op kaas te wijten zijn aan zachtere (zachte tot halfzachte) kazen. Wanneer bovendien de verse kazen in rekening gebracht worden, stijgt dit percentage naar 65% (FAVV - AFSCA, 2013). Deze conclusie wordt bevestigd door het analyseren van de L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken geassocieerd met kaas. Zo is 76.92% van deze uitbraken te wijten aan zachtere kazen en slechts 15.38% aan hardere (half-hard tot harde) kazen (ECDCa, 2013; ECDCc, 2013; EFSAe, 2013). Bovendien stelt een recent advies van het FAVV dat harde kazen over het algemeen als hygiënische veilig beschouwd kunnen worden (FAVV, 2014). Het is dan ook duidelijk dat er een groter risico op aanwezigheid van L. monocytogenes zal gelden bij zachtere rauwmelkse kazen. Dit kwam eveneens naar voor uit de zelfuitgevoerde prevalentiestudie waar de enige kaas die aanwezigheid van L. monocytogenes vertoonde een zachte rauwmelkse kaas was.

5.2.2 Groei van L. monocytogenes

Nu er duidelijkheid is over welke kazen een hoger risico stellen naar aanwezigheid van L. monocytogenes, is een volgende stap om te kijken naar de groei van L. monocytogenes. De groei kan bestudeerd worden door challengetesten uit te voeren. Hierdoor kan getracht worden om het verband te bepalen tussen de groei van L.

53

monocytogenes en bepaalde intrinsieke (pH, aw, hittebehandeling, hardheid, MZB) en extrinsieke (bewaartemperatuur en bewaartijd) parameters. Zoals eerder werd aangegeven, kan het groeipotentieel op verschillende manieren berekend worden. De EU mediaan houdt echter geen rekening met uitschieters waardoor een onderschatting van het effectieve groeipotentieel mogelijk is. Dit komt omdat een uitschieter meestal een waarde is die werkelijk waargenomen werd. Het is dan ook logisch dat deze hoge waarde nogmaals zou kunnen vastgesteld worden in de toekomst. Het grootste verschil houdt wel rekening met deze uitschieters waardoor deze methode voor berekening van het groeipotentieel meestal aangeduid wordt als worst case groeipotentieel. Het is dan ook vanzelfsprekend dat de EU mediaan en het grootste verschil significant verschillen van elkaar. Uit de statistische testen blijkt echter dat de conclusies die getrokken worden uit de resultaten niet zullen verschillen naar gelang de manier waarop het groeipotentieel berekend werd. Vandaar dat in het verdere verloop van de discussie gesproken zal worden over het groeipotentieel i.p.v. een onderscheid te maken tussen de EU mediaan en het grootste verschil. Na analyse van de resultaten blijkt dat de bewaartemperatuur en tijdspanne waarin de kazen bewaard werden de belangrijkste omgevingsparameters zijn. Zo zal een hogere bewaartemperatuur zorgen voor een grotere uitgroei van L. monocytogenes. Dit kan logisch verklaard worden aangezien een kleine temperatuurstijging ervoor kan zorgen dat de generatietijd van de bacterie drastisch verkort wordt (Devlieghere, et al., 2011). Wanneer de bewaartemperatuur niet constant gehouden wordt, zal dit dan ook zorgen voor een groter groeipotentieel. Dit maakt duidelijk waarom het zo belangrijk is om de koude keten te beheersen. Verder kan vastgesteld worden dat ook de bewaartijd een grote invloed uitoefent op het groeipotentieel van L. monocytogenes. Hierbij moet echter rekening gehouden worden met de groeifases van L. monocytogenes namelijk de lagfase, de exponentiële groeifase, de stationaire fase en de afdodingsfase. In de afdodingsfase zal het celaantal afnemen door gebrek aan elementaire voedingsstoffen of door een te hoge concentratie aan groeiremmende stoffen. Aangezien de challengetesten steeds beëindigd werden voordat de afdodingsfase bereikt werd, is het logisch dat het gemiddeld groeipotentieel steeds toenam gedurende de bewaarperiode (Devlieghere, et al., 2011). Naast de omgevingsfactoren mogen ook de intrinsieke parameters van de kaas zelf niet verwaarloosd worden. Ook deze zullen een invloed uitoefenen op het groeipotentieel van L. monocytogenes. Zo kan er gekeken worden naar de invloed van de pH, de aw, de hittebehandeling, de hardheid, de korst en de nevenflora, waaronder MZB. Uit de resultaten blijkt dat er een significant verschil is tussen het groeipotentieel bij zachtere kazen en het groeipotentieel bij hardere kazen waarbij er een kleinere uitgroei terug te vinden is bij de hardere kazen. Zo zal er bij het uitvoeren van sommige challengetesten zelfs afsterving plaatsvinden. Dit blijkt ook uit eerdere onderzoeken waar bij half-harde kazen nagenoeg uitsluitend een risico op overleving van L. monocytogenes zonder bijkomende groei kon vastgesteld worden (Bachmann & Spahr, 1995). De verklaring hiervoor kan gezocht worden bij andere intrinsieke parameters waaronder de aw en de pH. Zo zal bij een stijging van de pH een stijgend

54

groeipotentieel vastgesteld kunnen worden. Bovendien blijkt dat het groeipotentieel bij een bewaartemperatuur van 7°C ook afhankelijk is van de aw. Deze correlatie is echter minder sterk. Zo zal een daling van het groeipotentieel meer beïnvloed worden door een lichte daling in pH dan een daling in aw (Vermeulen, et al., 2007; Smittle, 2000). Uit de resultaten van de prevalentiescreening blijkt echter dat er geen significant verschil teruggevonden kon worden tussen de pH van zachtere kazen en de pH van hardere kazen. Hieruit kan afgeleid worden dat de pH eerder afhankelijk is van het soort kaas en niet van de hardheid. Er kan dan ook geconcludeerd worden dat het groeipotentieel afhankelijk is van de pH van de kaas en van de hardheid doordat hardere kazen een lagere aw hebben (FAVV, 2012). In een recent advies van het FAVV komt naar voor dat rauwmelkse kazen een groter risico vormen voor overleving en groei van L. monocytogenes (FAVV, 2014). Uit de zelf uitgevoerde challengetesten blijkt echter dat er geen verschil kan vastgesteld worden tussen het groeipotentieel bij rauwmelkse kazen en het groeipotentieel bij gepasteuriseerde kazen. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat in het rapport van het FAVV geredeneerd wordt dat vanwege een hogere kans op aanwezigheid in rauwmelkse kazen er ook een hogere kans op overleving en groei kan vastgesteld worden. Uit recent onderzoek komt echter naar voor dat zowel rauwmelkse als gepasteuriseerde zachtere kazen afgeraden worden bij risicogroepen (YOPI) (Lund, 2014). Deze mening kan bevestigd worden door de zelf uitgevoerde challengetesten waarbij L. monocytogenes bij zowel rauwmelkse als gepasteuriseerde zachtere kazen zal uitgroeien tot een concentratie groter dan 2 log kve/gram. Hieruit volgt dat de hittebehandeling bij zachtere kazen geen directe rol zal spelen bij het groeipotentieel van L. monocytogenes waardoor zowel rauwmelkse als gepasteuriseerde kazen een risico stellen bij risicogroepen. Bij het beschouwen van de theoretische groeimodellen wordt er steeds een overschatting van het groeipotentieel teruggevonden. Een plausibele verklaring hiervoor is dat kaas een gefermenteerd product is dat een eigen microflora heeft welke niet in rekening gebracht wordt in de theoretische modellen. Tot deze microflora behoren ook de MZB welke in groten getale op kaas aanwezig zijn. Hierdoor komt het vreemd over dat het aantal MZB niet gecorreleerd is met het groeipotentieel. Dit zou eventueel verklaard kunnen worden doordat de MZB van elke kaas vanaf een bepaalde concentratie hetzelfde effect zullen hebben op het groeipotentieel van L. monocytogenes. Bovendien bevinden de MZB zich reeds in de stationaire groeifase waardoor er geen correlatie tussen het aantal MZB en het groeipotentieel teruggevonden kan worden. Vandaar dat het effect van MZB onderschat zou kunnen worden. Uit de literatuur blijkt namelijk dat MZB gebruikt kunnen worden als natuurlijke bestrijdingsmethode tegen L. monocytogenes. Zo kunnen MZB op drie verschillende manieren inwerken op de groei van L. monocytogenes. Een eerste manier is het Jameson effect. Hiermee wordt bedoeld dat bij competitie naar dezelfde nutriënten bacterie x (MZB) bacterie y (L. monocytogenes) zal onderdrukken waardoor enkel bacterie x zal uitgroeien. Dit effect kan echter enkel waargenomen indien bacterie x zich in de exponentiële groeifase bevindt (Izquierdo, et al., 2009; Mellefont, et al., 2008). Aangezien de MZB die op de kaas aanwezig zijn zich reeds in de stationaire fase bevinden zal dit effect niet geobserveerd kunnen worden. Desalniettemin kan dit effect wel kunnen plaatsvinden tijdens de productie en de initiële rijping van de kaas. Op dat moment vindt namelijk de fermentatie plaats waarbij de MZB zullen aangroeien. In deze periode zal L.

55

monocytogenes, als het aanwezig is, waarschijnlijk wel geremd worden door de MZB gezien ze zich beide in de exponentiële groeifase bevinden. Een tweede manier waarop MZB op L. monocytogenes kunnen inwerken, is door de zuurtegraad van de kaas te verlagen door lactose naar melkzuur om te zetten (TAD Zuivel, ILVO, 2006). Hiervan is het effect wel waar te nemen aangezien er een duidelijke correlatie is tussen de pH en het groeipotentieel van L. monocytogenes. Hierdoor zou afgeleid kunnen worden dat de MZB wel degelijk een effect uitoefenen op het groeipotentieel van L. monocytogenes ook al wordt dat niet duidelijk wanneer de correlaties bestudeerd worden bij de zelf uitgevoerde challengetesten. Wanneer de prevalentiescreening echter bekeken wordt, is er een correlatie tussen de pH en het aantal MZB terug te vinden waaruit af te leiden valt dat de MZB wel degelijk in zullen spelen op de pH waardoor het groeipotentieel van L. monocytogenes beïnvloed wordt. De laatste manier om in te spelen op L. monocytogenes is de productie van bacteriocines. Hierbij moet echter rekening gehouden worden dat de aanwezigheid van bacteriocines bij de analyses niet nagegaan werd. Bovendien hebben deze stoffen een grotere anti-microbiële werking bij een lage pH (lager dan 5) (Zacharof & Lovitt, 2012). Bij de geanalyseerde kazen werd echter nooit een pH met een waarde lager dan 5 geobserveerd. Uit dit alles kan geconcludeerd worden dat de MZB waarschijnlijk een indirecte werking zullen uitoefenen op de groei van L. monocytogenes, namelijk door de pH te verlagen. Voorts blijkt dat er bij hogere temperaturen geen verschil onderscheiden kan worden tussen een beënting op de korst of een beënting op het snijvlak. Bij lagere temperaturen kan er echter wel een significant verschil vastgesteld worden. Dit kan verklaard worden wanneer de groeifases van L. monocytogenes en de generatietijd in rekening gebracht worden. Zo zal de generatietijd bij hogere temperaturen veel korter zijn waardoor de stationaire fase sneller bereikt wordt. Hierdoor kan na 2 weken reeds de stationaire fase bereikt worden waardoor er geen significant verschil is tussen een beënting op de korst en een beënting op het snijvlak. Bij lagere temperaturen is de generatietijd echter langer waardoor L. monocytogenes zich na 2 weken nog steeds in de exponentiële groeifase bevind. Er wordt dan ook duidelijk dat wanneer de korst beënt wordt de bacteriën een langere groeifase zullen moeten doorlopen. Dit wordt geverifieerd aan de hand van de theoretische groeimodellen (ComBase, 2014). Aangezien het gemiddelde verschil tussen een beënting op de korst en een beënting op het snijvlak echter klein is, kan besloten worden dat onafhankelijk van de plaats waar het aanwezig is, L. monocytogenes wel degelijk een risico zal stellen (Devlieghere, et al., 2011). Uit dit alles blijkt dat er soms tegenstrijdige informatie teruggevonden wordt in de literatuur en zelf uitgevoerde testen. De reden hiervoor moet niet enkel gezocht worden bij het beperkt aantal testen welke uitgevoerd werden maar ook bij de variabiliteit van de resultaten welke bij kaas terug te vinden is. Zo wordt duidelijk na analyse van de challengetesten van het accreditatielabo dat er niet alleen ontzettende variatie is tussen de verschillende kazen, wat blijkt uit de grote standaardafwijking binnen de categorie kaas, maar ook binnen de kazen zelf, wat blijkt uit het scoresysteem. Het scoresysteem toont dan ook aan dat wanneer dezelfde kaassoort in dezelfde omstandigheden bewaard wordt, de uitkomst van de verschillende challengetesten mogelijks ontzettend kan verschillen. De reden hiervoor is dat kaas een gefermenteerd product is. Het is dan ook moeilijk om resultaten steeds te veralgemenen op vlak van groei van L. monocytogenes.

56

5.3 De vraag van de hoevewinkels en delicatessenzaken

Zoals eerder vermeld, worden de strenge eisen van het ambachtelijke productie- en rijpingsproces van artisanaal bereide rauwmelkse of gepasteuriseerde zachte en half-harde kazen in vraag gesteld door de korte keten, vooral omwille van onvoldoende draagkracht, middelen en kennis (FAVV, 2014). Bovendien veronderstellen ze dat, doordat kaas een gefermenteerd product is, de aanwezige microbiota de groei van L. monocytogenes zullen remmen, wanneer deze aanwezig is, waardoor deze de tolerantiewaarde van 2 log kve/gram niet zal overschrijden. Uit de sectie hierboven kan echter geconcludeerd worden dat dit niet het geval is. Zo zullen alle zachtere kazen de tolerantiewaarde overschrijden. Hieruit volgt dat zowel rauwmelkse als gepasteuriseerde zachtere kazen een risico stellen naar groei van L. monocytogenes. Bovendien blijkt uit de analyse van diverse prevalentiestudies dat er een kans van ongeveer 1 op 100 is om een gepasteuriseerde kaas terug te vinden waarop L. monocytogenes aanwezig is en een kans van 5 op 100 voor rauwmelkse kazen waardoor zowel rauwmelkse als gepasteuriseerde kazen een risico met zich zullen meebrengen. Zo blijkt uit recent onderzoek dat risicogroepen zowel rauwmelkse als gepasteuriseerde zachtere kazen beter mijden (Lund, 2014). Voorts blijkt uit de jaarrapporten van het ECDC (ECDCa, 2013) en uit de details over de L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken dat het vooral de YOPI-groep, en meer bepaald de ouderen, zijn welke een risico zullen lopen op listeriose. Aangezien deze groep alleen maar groter wordt vanwege de toenemende vergrijzing is het nodig dat deze risicogroepen beter geïnformeerd worden waarbij niet alleen het gevaar van rauwmelkse zachtere kazen maar ook van gepasteuriseerde zachtere kazen benadrukt dient te worden. Zo wordt het zwangere vrouwen afgeraden om rauwmelkse zachte kazen te consumeren hoewel gepasteuriseerde zachte kazen niet vermeld worden. Enkel op het vlak van hardere kazen en meer bepaald harde kazen zou een uitzondering gemaakt kunnen worden op de strenge eisen. Gezien bij half-harde kazen nagenoeg uitsluitend een risico op overleving van L. monocytogenes vastgesteld wordt en dat harde kazen over het algemeen als hygiënisch veilig beschouwd kunnen worden (FAVV, 2014; Bachmann & Spahr, 1995). Voorts zouden ook geitenkazen opgenomen kunnen worden vanwege hun lage pH welke de groei van L. monocytogenes niet toelaat. Dit vereist beide echter meer onderzoek.

57

6. Algemene conclusies Uit deze thesis komt naar voor dat kaas duidelijk een risicoproduct is zowel naar aanwezigheid als groei van L. monocytogenes. Dit blijkt uit data van het accreditatielabo (Belac, verbonden aan het Laboratorium voor Levensmiddelenmicrobiologie en –conservering, Fac. Bio-ir. Wetenschappen, Universiteit Gent), diverse prevalentiestudies, een oplijsting van de productterugroepingen zowel in België als in de EU en uit talloze L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken welke geassocieerd worden met kaas. Kaas is echter een complex levensmiddel dat door diverse intrinsieke (pH, aw, hittebehandeling, hardheid ...) en extrinsieke (bewaartemperatuur en bewaartijd) parameters beïnvloed wordt. Bovendien moet in rekening gebracht worden dat aanwezigheid en groei van L. monocytogenes twee verschillende zaken zijn. Zo wordt duidelijk dat zachte tot halfzachte kazen een groter risico stellen naar aanwezigheid van L. monocytogenes. Dit komt vooral naar voor door analyse van de productterugroepingen in België en de L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken welke geassocieerd zijn met kaas. Voorts wordt er een verhoogd risico op aanwezigheid van L. monocytogenes vastgesteld bij rauwmelkse kazen. Dit blijkt voornamelijk uit de verschillende prevalentiestudies welke geraadpleegd werden. Bovendien kan deze trend ook teruggevonden worden bij de productterugroepingen. Uit de theoretische groeimodellen en de challengetesten kan besloten worden dat het groeipotentieel van L. monocytogenes duidelijk lager zal liggen bij hardere kazen dan bij zachtere kazen. Voor zachtere kazen kan er echter geen verschil onderscheiden worden tussen rauwmelkse en gepasteuriseerde zachtere kazen naar groei van L. monocytogenes. Hieruit kan besloten worden dat beide soorten zachtere kazen een risico met zich zullen meebrengen voor personen met een verlaagde immuniteit (Lund, 2014). Het groeipotentieel zal voornamelijk beïnvloed zal worden door de pH van de kaas in kwestie waarbij een lagere pH zal zorgen voor een lager groeipotentieel. Deze pH wordt veroorzaakt door de concentratie aan MZB. Waardoor het groeipotentieel indirect beïnvloed wordt door de concentratie aan MZB. Verder zal ook de aw van de kaas een gelijkaardige invloed uitoefenen op het groeipotentieel. Dit effect zal echter kleiner zijn (Vermeulen, et al., 2007; Smittle, 2000). Hieruit kan geconcludeerd worden dat de strenge eisen voor het ambachtelijke productie- en rijpingsproces van kazen niet verzacht kunnen worden voor zachte tot halfzachte kazen. Bovendien moeten risicogroepen beter geïnformeerd worden waarbij niet alleen het gevaar van rauwmelkse zachtere kazen maar ook van gepasteuriseerde zachtere kazen benadrukt dient te worden. Bij hardere kazen, en dan vooral bij harde kazen, kan overwogen worden om de strenge normen iets te verzachten. Hiervoor is echter specifiek onderzoek nodig. Bovendien bleek uit de uitgevoerde prevalentiescreening dat ook geitenkazen vanwege hun lage pH een kleiner risico met zich meebrengen naar groei van L. monocytogenes. Hier is echter eveneens verder onderzoek nodig.

58

7. Ideeën voor verder onderzoek In de toekomst kan eventueel het verschil in risico voor aanwezigheid en groei van L. monocytogenes tussen gerookte vis en kaas uitgebreider bestudeerd worden. Om het risico op kaas zelf beter te kunnen inschatten zou verder onderzoek kunnen uitgevoerd worden op de aanwezigheid van bateriocines op kaas maar ook op de aanwezigheid en groei van L. monocytogenes op geitenkaas. Bovendien moet het verschil tussen rauwmelkse en gepasteuriseerde half-harde tot harde kazen uitgebreider geanalyseerd worden aan de hand van challengetesten om hierover een betere onderbouwing te kunnen geven naar richtlijnen toe.

59

8. Referenties

Al-Tahiri, R., Omar, S. & Rewashdeh, A., 2008. A study of the occurrence of Listeria species in raw sheep milk. International Journal of Dairy Technology, 61(4), pp. 347-351.

Arrese, E. & Arroyo-Izaga, M., 2012. Prevalence of Listeria monocytogenes in Idiazabal cheese. Nutrición Hospitalaria, 27(6).

Arslan, S. & Özdemir, F., 2008. Prevalence and antimicrobial resistance of Listeria spp. in homemade white cheese. Food Control, 19(4), pp. 360-363.

Arvanitoyannis, I. S. & Kotsanopoulos, K. V., 2012. Smoking of Fish and Seafood: History, Methods and Effects on Physical, Nutritional and Microbiological Properties. Food and Bioprocess Technology, Volume 5, pp. 831 - 853.

Bachmann, H. P. & Spahr, U., 1995. The Fate of Potentially Pathogenic Bacteria in Swiss Hard and Semihard Cheeses Made from Raw Milk. Journal of Dairy Science, 78(3), pp. 476-483.

Baranyi, J. & Tamplin, M. L., 2004. ComBase: A Common Database on Microbial Responses to Food Environments. Journal of Food Protection, 67(9), p. 1967–1971.

Bille, J. et al., 2006. OUTBREAK OF HUMAN LISTERIOSIS ASSOCIATED WITH TOMME CHEESE IN NORTHWEST SWITZERLAND, 2005. Eurosurveillance, 11(6).

Brooks, J. C. et al., 2012. Survey of raw milk cheeses for microbiological quality and prevalence of foodborne pathogens. Food Microbiology, 31(2), pp. 154-158.

Busani, L. et al., 2005. Prevalence of Salmonella enterica and Listeria monocytogenes Contamination in Foods of Animal Origin in Italy. Journal of Food Protection, Volume 8, pp. 1556-1775.

Cabedo, L., Picart i Barrot, L. & Teixidó i Canelles, A., 2008. Prevalence of Listeria monocytogenes and Salmonella in Ready-to-Eat Food in Catalonia, Spain. Journal of Food Protection, Volume 4, pp. 675-873.

CDC, 2011. Investigation Update: Multistate Outbreak of Listeriosis Linked to Whole Cantaloupes from Jensen Farms, Colorado. [Online] Available at: http://www.cdc.gov/listeria/outbreaks/cantaloupes-jensen-farms/092711/index.html [Geopend 30 december 2013].

CDCa, 2013. Sources of listeriosis. [Online] Available at: http://www.cdc.gov/listeria/sources.html [Geopend 31 december 2013].

CDCb, 2013. Foodborne Outbreaks. [Online] Available at: http://www.cdc.gov/foodsafety/outbreaks/multistate-outbreaks/outbreaks-list.html [Geopend 27 december 2013].

Colak, H., Hampikyan, H., Bingol, E. B. & Ulusoy, B., 2007. Prevalence of L. monocytogenes and Salmonella spp. in Tulum cheese. Food Control, 18(5), pp. 576-579.

ComBase, 2014. ComBase. [Online] Available at: http://modelling.combase.cc/membership/ComBaseLogin.aspx?ReturnUrl=%2fComBase_Predictor.aspx [Geopend 30 april 2014].

60

Dawson, S. J. et al., 2006. LISTERIA OUTBREAK ASSOCIATED WITH SANDWICH CONSUMPTION FROM A HOSPITAL RETAIL SHOP, UNITED KINGDOM. Eurosurveillance, 11(6).

de Castro, V. et al., 2012. LISTERIOSIS OUTBREAK CAUSED BY LATIN-STYLE FRESH CHEESE, BIZKAIA, SPAIN, AUGUST 2012. Eurosurveillance, 17(42).

de Valk, H. et al., 2001. Two Consecutive Nationwide Outbreaks of Listeriosis in France, October 1999–February 2000. American Journal of Epidemiology, 154(10), pp. 944-950.

Derra, F. A. et al., 2013. Occurrence of Listeria spp. in Retail Meat and Dairy Products in the Area of Addis Ababa, Ethiopia. Foodborne Pathogens and Disease, 10(6).

Devlieghere, F. et al., 2011. Levensmiddelenmicrobiologie en conservering. Brugge: Die Keure.

Di Pinto, A. et al., 2010. Occurrence of Listeria monocytogenes. New Microbiologica, Volume 33, pp. 249-252.

Dongyou, L., 2006. Identification, subtyping and virulence determination of Listeria monocytogenes, an important foodborn pathogen. Journal of Medical Microbiology, pp. 645-659.

ECDC, 2007. Annual epidemiological report on communicable diseases in Europe 2005. Report on the status of communicable diseases in the Eu and EEA/EFtA countries.

ECDC, 2008. Annual epidemiological report on communicable diseases 2006. Annual epidemiological report.

ECDC, 2009. Annual epidemiological report on communicable diseases 2007. Annual epidemiological report.

ECDC, 2010. Annual epidemiological report on communicable diseases in Europe 2008. Annual epidemiological report.

ECDC, 2011. Annual epidemiological report reporting on 2009 surveillance data and 2010 epidemic intelligence data. Annual Epidemiological Report.

ECDC, 2012. Annual epidemiological report reporting on 2010 surveillance data and 2011 epidemic intelligence data. Annual Epidemiological Report.

ECDCa, 2013. Annual Epidemiological Reports. [Online] Available at: http://www.ecdc.europa.eu/en/publications/surveillance_reports/annual_epidemiological_report/Pages/epi_index.aspx[Geopend 28 december 2013].

ECDCb, 2013. Annual epidemiological report reporting on 2011 surveillance data and 2012 epidemic intelligence data. Annual Epidemical Report.

ECDCc, 2013. Eurosurveillance. [Online] Available at: http://www.eurosurveillance.org/Public/AboutUs/AboutUs.aspx [Geopend 2 januari 2014].

ECDCd, 2013. The European Surveillance System (TESSy). [Online] Available at: http://ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/TESSy/Pages/TESSy.aspx [Geopend 27 december 2013].

EFSA, 2005. EFSA report 2005, sl: sn

61

EFSA, 2006. Trends and sources of zoonoses and zoonotic agents in humans, foodstuffs, animals and feedingstuffs, Germany: EFSA.

EFSA, 2007. Trends and sources of zoonoses and zoonotic agents in humans, foodstuffs, animals and feedingstuffs, Noorwegen: EFSA.

EFSA, 2010. Trends and Sources of Zoonoses and Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in the European Union in 2008. THE COMMUNITY SUMMARY REPORT.

EFSA, 2011. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses,. SCIENTIFIC REPORT OF EFSA AND ECDC.

EFSA, 2012. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents. SCIENTIFIC REPORT OF EFSA AND ECDC.

EFSAa, 2013. Listeria. [Online] Available at: http://www.efsa.europa.eu/en/topics/topic/listeria.htm?wtrl=01 [Geopend 19 september 2013].

EFSAb, 2013. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2011. SCIENTIFIC REPORT OF EFSA AND ECDC.

EFSAc, 2013. Analysis of the baseline survey on the prevalence of Listeria monocytogenes in certain ready-to-eat foods in the EU, 2010-2011 Part A: Listeria monocytogenes prevalence estimates, Parma, Italy: EFSA.

EFSAe, 2013. European Union Summary Reports. [Online] Available at: http://www.efsa.europa.eu/en/zoonosesscdocs/zoonosescomsumrep.htm [Geopend 28 December 2013].

European Commission, 2003. Opinion of the Scientific Committee on Veterinary Measures Relating to Public Health on Staphylococcal enterotoxins in milk products, particulaty cheeses. 26-27 maart.

European Commission, 2013. Rapid Alert System for Food and Feed. [Online] Available at: http://ec.europa.eu/food/food/rapidalert/index_en.htm [Geopend 27 december 2013].

Europese commissie, 2003. Aanbeveling van de Commissie van 19 december 2003 betreffende een gecoördineerd programma voor 2004 inzake de officiële controle op levensmiddelen, sl: Europese commissie.

Farber, J. M. & Peterkin, P. I., 1991. Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen.. Microbiological Reviews, 55(3), pp. 476-511.

FAVV - AFSCA, 2013. FAVV Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen. [Online] Available at: http://www.favv.be/ [Geopend 27 december 2013].

FAVV, 2011. Nieuws van het Europees Referentie Laboratorium voor Melk en Melkproducten (EU-RL MMP), Parijs: FAVV.

FAVV, 2012. Autocontrolegids voor de productie en verkoop van zuivelproducten op het landbouwbedrijf. 23 Juli.

FAVV, 2014. ADVIES 05-2014. Betreft: Voedselveiligheid van de korte keten (dossier Sci Com 2013/01: eigen initiatief)., sl: FAVV.

FDA, 2012. Bad bug book, Foodborne pathogenic microorganisms and natural toxins. sl:sn

62

FDA, 2013. CFR - Code of Federal Regulations Title 21. [Online] Available at: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?CFRPart=133 [Geopend 19 9 2013].

Fenlon, D. R., 1999. Listeria monocytogenes in het Natural Environment. In: E. T. Ryer & E. H. Marth, red. Listeria, Listeriosis and Food Safety. New York: Marcel Dekker, pp. 21-31.

FFS, 2013. Basis statistical principles and beyond. Leuven, Belgium: Flames Summer School.

Food-info, 2013. Listeria monocytogenes. [Online] Available at: http://www.food-info.net/nl/bact/limon.htm [Geopend 19 september 2013].

Fox, P. F., McSweeny, P. L. H., Cogan, T. M. & Guinee, T. P., 2004. Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. 1 red. sl:Academic Pres.

Fretz, R. et al., 2010. UPDATE: MULTINATIONAL LISTERIOSIS OUTBREAK DUE TO ‘QUARGEL’, A SOUR MILK CURD CHEESE, CAUSED BY TWO DIFFERENT L. MONOCYTOGENES SEROTYPE 1/2A STRAINS, 2009-2010. Eurosurveillance, 15(16).

Fretz, R. et al., 2010. LISTERIOSIS OUTBREAK CAUSED BY ACID CURD CHEESE ‘QUARGEL’, AUSTRIA AND GERMANY 2009. Eurosurveillance, 15(5).

Hächler, H. et al., 2013. OUTBREAK OF LISTEROSIS DUE TO IMPORTED COOKED HAM, SWITZERLAND 2011. Eurosurveillance, 18(18).

ISO, 2001. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli -- Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronideMicrobiology of fo, sl: International Standards Organisation.

ISOa, 1998. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the enumeration of mesophilic lactic acid bacteria -- Colony-count technique at 30 degrees C, sl: International Standards Organisation.

ISOa, 1999. ISO 6887-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination -- Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilu, sl: International Standards Organisation.

ISOb, 1998. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes -- Part 2: Enumeration method, sl: International Standards Organisation.

ISOb, 1999. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) -- Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium, sl: International Standards Organisation.

Izquierdo, E. et al., 2009. Smearing of soft cheese with Enterococcus faecium WHE 81, a multi-bacteriocin producer, against Listeria monocytogenes.. Food Microbiology, 26(1), pp. 16-20.

Jamali, H., Paydar, M., Looi, C. Y. & Wong, W. F., 2013. Prevalence of Listeria species and Listeria monocytogenes serotypes in ready mayonnaise salads and salad vegetables in Iran. Academic Journals, 7(19), pp. 1903-1906.

63

Johnsen, B. O. et al., 2010. A large outbreak of Listeria monocytogenes infection with short incubation period in a tertiary care hospital. Journal of Infection, 61(6), pp. 465-470.

Koch, J. et al., 2010. Large Listeriosis Outbreak Linked to Cheese Made from Pasteurized Milk, Germany, 2006–2007. Foodborne Pathogens and Disease, 7(12).

Kvistholm Jensen, A. et al., 2010. SUBSTANTIAL INCREASE IN LISTERIOSIS, DENMARK 2009. Eurosurveillance, 15(12).

Lee Wong, A. C., 1998. Biofilms in Food Processing Environments. Journal of Dairy Science, 81(10), pp. 2765-2770.

Lemon, K. P., Higgins, D. E. & Kolter, R., 2013. Flagellar Motility Is Critical for Listeria monocytogenes Biofilm Formation. Journal of Bacteriology, 195(19), pp. 4418-4424.

LFMFP-UGent, 2010. Microbiologische richtwaarden en wettelijke microbiologische criteria. Gent: UGent.

Lund, B. M., 2014. Microbiological Food Safety and a Low-Microbial Diet to Protect Vulnerable People. Foodborne Pathogens and Disease, 0(0).

Manfreda, G. et al., 2005. Occurrence and ribotypes of Listeria monocytogenes in Gorgonzola cheeses. International Journal of Food Microbiology, 102(3), pp. 287-293.

Mejlholma, O. et al., 2010. Predicting growth rates and growth boundary of Listeria monocytogenes — An international validation study with focus on processed and ready-to-eat meat and seafood. International Journal of Food Microbiology, Volume 141, p. 137–150.

Mellefont, L. A., McMeekin, T. A. & Ross, T., 2008. Effect of relative inoculum concentration on Listeria monocytogenes growth in co-culture. International Journal of Food Microbiology, 121(2), pp. 157-168.

Mena, C. et al., 2004. Incidence of Listeria monocytogenes in different food products commercialized in Portugal. Food Microbiology, 21(2), pp. 213-216.

Murray, E. W. R. S. M., 1926. A disease of rabbits characterized by a large mononuclear leucocytosis, caused by a hitherto undescribed bacillus Bacterium monocytogenes. The Journal of Pathology and Bacteriology, Volume 29, p. 407– 439.

Nightingale, K. K. et al., 2004. Ecology and Transmission of Listeria monocytogenes Infecting Ruminants and in the Farm Environment. Applied and Environmental Microbiology, 70(8), pp. 4458-4467.

Olasupo, N. A. et al., 1999. Occurrence of nisin Z production in Lactococcus lactis BFE 1500 isolated from wara, a traditional Nigerian cheese product. International Journal of Food Microbiology, 53(2-3), pp. 141-152.

Osaili, T. M. et al., 2012. Occurrence and Antimicrobial Susceptibility of Listeria monocytogenes Isolated from Brined White Cheese in Jordan. Journal of Food Science, 77(9), pp. M528-M532.

P.J.H., H., 1940. Listeria: change of name for a genus of bacteria. Nature, 145(3668), p. 264.

Pintado, C. M. B. S., Oliveira, A., Pampulha, M. E. & Ferreira, M. A. S. S., 2005. Prevalence and characterization of Listeria monocytogenes isolated from soft cheese. Food Microbiology, 22(1), pp. 79-85.

64

Prencipe, V. et al., 2004. Assessment of hygienic quality of some type of cheese sampled from retail outlets. Veterinaria Italiana, 46(2), pp. 233-242.

PulseNet Europe, 2013. PulseNet Europe. [Online] Available at: http://www.pulsenetinternational.org/networks/europe [Geopend 2 januari 2014].

Rodriguez, E. et al., 2001. Control of Listeria monocytogenes by bacteriocins and monitoring of bacteriocin-producing lactic acid bacteria by colony hybridization in semi-hard raw milk cheese. Journal of Dairy Research, 68(1), pp. 131-137.

Rouveen, 2014. Vragen over kaas. [Online] Available at: https://www.rouveen-kaasspecialiteiten.nl/index.php?page=vragen-over-kaas [Geopend 30 april 2014].

Rudolf, M. & Scherer, S., 2001. High incidence of Listeria monocytogenes in European red smear cheese. International Journal of Food Microbiology, 63(1-2), pp. 91-98.

Schlech, W. F. & Acheson, D., 2000. Foodborne Listeriosis. Clinical Infectious Diseases, 31(3), pp. 770-775.

Shafiur Rahman, M., red., 2008. Water Activity by Freezing Point Methods. In: Food Properties Handbook, Second Edition. sl:CRC Press, p. 14.

Singh, P. & Prakash, A., 2009. Screening of Lactic Acid Bacteria for Antimicrobial Properties. Journal of Food Safety, Volume 11, pp. 81-87.

Smith, B. et al., 2011. Outbreak of listeriosis caused by infected beef meat from a meals-on-wheels delivery in Denmark 2009. Clinical Microbiology and Infection, 17(1), pp. 50-52.

Smittle, R. B., 2000. Microbiological safety of mayonnaise, salad dressings, and sauces produced in the United States: A review. Journal of Food Protection, 63(8), pp. 1144-1153.

Stessl, B. et al., 2014. Collaborative Survey on the Colonization of Different Types of Cheese-Processing Facilities with Listeria monocytogenes. Foodborne Pathogens and Disease, 11(1).

TAD Zuivel, ILVO, 2006. Zuursel in de hoevezuivelproductie. [Online] Available at: http://www.ilvo.vlaanderen.be/Portals/46/Documents/Zuursel.pdf [Geopend 30 december 2013].

Thas, O., 2012. Statistische dataverwerking. Gent, Belgium: sn

Tomé, E., Teixeira, P. & Gibbs, P. A., 2006. Anti-listerial inhibitory lactic acid bacteria isolated from commercial cold smoked salmon. Food Microbiology, 23(4), pp. 399-405.

Torres-Vitela, M. R. et al., 2012. Incidence of Salmonella, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157: H7, and Staphylococcal Enterotoxin in Two Types of Mexican Fresh Cheeses. Journal of Food Protection, 75(1), pp. 79-84.

Van Steenbergen, A., 2002. Camembert au Calvados. Knack Weekend, 6 Februari.

Vermeulen, A. et al., 2007. Influence of pH, water activity and acetic acid concentration on Listeria monocytogenes at 7 °C: Data collection for the development of a growth/no growth model. International Journal of Food Microbiology, 114(3), pp. 332-341.

65

Vit, M. et al., 2007. Outbreak of listeriosis in the Czech Republic, late 2006 – preliminary report. Eurosurveillance, 12(6).

VLAM, 2013. Kazen van bij ons. [Online] Available at: http://www.kazenvanbijons.be/ [Geopend 27 december 2013].

Volokhov, D., Rasooly, A., Chumakov, K. & Chizhikov, V., 2002. Identification of Listeria Species by Microarray-Based Assay. Journal of Clinical Microbiology, pp. 4720-4728.

Yde, M. et al., 2012. USEFULNESS OF THE EUROPEAN EPIDEMIC INTELLIGENCE INFORMATION SYSTEM IN THE MANAGEMENT OF AN OUTBREAK OF LISTERIOSIS, BELGIUM, 2011. Eurosurveillance, 17(38).

Zacharof, M. P. & Lovitt, R. W., 2012. Bacteriocins Produced by Lactic Acid Bacteria a Review Article. APCBEE Procedia, Volume 2, pp. 50-56.

Zhao, T., Doyle, M. P. & Zhao, P., 2004. Control of Listeria monocytogenes in a Biofilm by Competitive-Exclusion Microorganisms. Applied and Environmental Microbiology, 70(7), pp. 3996-4003.

66

9. Bijlage

Bijlage 1. Gedetailleerde informatie over de productterugroepingen op kaas in de periode van 01/01/2008 t.e.m. 31/12/2013 in België.

Jaar Datum Product Hardheid Hittebehandeling

2008 9/02/2008 Chaumes Zacht Gepasteuriseerd

16/06/2008 Brie de Meaux Halfzacht Rauw

4/09/2008 Livarot Zacht Rauw

2009 29/08/2009 Epoisses Zacht 11,3% rauw

2010 - - - -

2011 19/03/2011 Nazareth classic Hard Gepasteuriseerd

10/05/2011 Belgolight Halfhard Gepasteuriseerd

Bocholter broodkaas Halfhard Gepasteuriseerd

Brugge goud Hard Gepasteuriseerd

Nazareth light Hard Gepasteuriseerd

Nazareth classic Hard Gepasteuriseerd

Affligem Halfhard Gepasteuriseerd

Corsendonk Halfhard Gepasteuriseerd

Grimbergen Halfhard Gepasteuriseerd

Kievit light kaas Halfhard Gepasteuriseerd

St Maarten Classic Hard Gepasteuriseerd

Belgolight jong Halfhard Gepasteuriseerd

10/05/2011 Grimbergen Halfhard Gepasteuriseerd

Affligem Halfhard Gepasteuriseerd

Brugge goud Hard Gepasteuriseerd

Nazareth classic Hard Gepasteuriseerd

Nazareth light Hard Gepasteuriseerd

Kievit light Halfhard Gepasteuriseerd

11/05/2011 Nazareth Hard Gepasteuriseerd

Brugge Hard Gepasteuriseerd

Belgische/Franse kaasschotel Halfhard -

hard Gepasteuriseerd

2012 1/06/2012 Louché de chèvre Vers Rauw

4/10/2012 Ricotta Torretta - -

19/10/2012 Ricotta Torretta - -

Ricotta Marzotica - -

31/10/2012 Keiems bloempje met kruiden Zacht Rauw

7/11/2012 Keiems bloempje met kruiden Zacht Rauw

Keiems bloempje natuur Zacht Rauw

9/11/2012 Keiems bloempje Zacht Rauw

Keiemse witten Zacht Rauw

Keiemnaer 20+ Halfhard Rauw

Keiemnaer Halfhard Rauw

Keiemtaler Halfhard Rauw

7/12/2012 Chevret Chimacien Vers Rauw

67

28/12/2012 Gerbizon Halfzacht Gepasteuriseerd

Brique lait de vache Zacht Gepasteuriseerd

Brique lait de brebis Zacht Gepasteuriseerd

Brique lait de chèvre Zacht Gepasteuriseerd

2013 3/01/2013 Brique du forez schapenmelk Zacht Gepasteuriseerd

Brique du forez koemelk Zacht Gepasteuriseerd

Brique du forez geitenmelk Zacht Gepasteuriseerd

11/12/2013 Schapenkaas van rauwe melk Zacht Rauw



68

Bijlage 2. Uitbraken in Europa in de periode van 2000 tot 2012

L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken geassocieerd met kaas in de periode van 2000 tot 2012.

Jaar 2001 2005 2006 2006 2006 2006 2006 2007

Land Zweden Zwitserland Tsjechië Zwitserland Duitsland Duitsland Duitsland Noorwegen

Product Kaas Tomme Zachte kaas Zachte kaas Zachte kaas Harde kaas Harde kaas Camembert

Producent - - - - - - - Lokaal

Hardheid - Zacht Zacht Zacht Zacht Hard Zacht Zacht

Hittebehandeling - Rauw - - - - Gepasteuriseerd Gepasteuriseerd

Serotype - 1/2a 1/2b - - - overwegend 4b -

Aantal zieken 50 10 78 - - 6 189 21

Aantal doden - 3 13 - - 1 26 5

Bevolkingsgroep (YOPI)

- 2Preg., 8Imm.

> Old - - - 11 Preg., 178 Old -

Jaar 2009 2009 2010 2011 2012

Land Oostenrijk Duitsland Oostenrijk Duitsland Tsjechië Noorwegen België Spanje

Product Quargel Quargel Camembert Pavé du Nord Latin-Style verse kaas

Producent Prolactal Prolactal - - American style aanbod

Hardheid Zacht Zacht Zacht Hard Zacht

Hittebehandeling Rauw Rauw Gepasteuriseerd Gepasteuriseerd Gepasteuriseerd

Serotype 1/2a 1/2a - 1/2a 1/2a

Aantal zieken 12 2 13 6 1 17 12 2

Aantal doden 3 2 2 1 0 2 4 0

Bevolkingsgroep (YOPI)

Old Old > Old - - - Old 1 Young,1 Preg.

69

L. monocytogenes voedselgebonden uitbraken geassocieerd met andere levensmiddelen in de periode van 2000 tot 2012.

Jaar 2000 2000 2001 2002 2003 2009 2011

Land Frankrijk Spanje België Frankrijk Verenigd koninkrijk Denemarken Zwitserland

Product Varkenstong in

gelei - Ijstaart

Smeerbare rauwe worst

Voorverpakte sandwiches

Rundsvlees Gekookte ham

Producent - - - - Kleinhandel Kleinhandel

Serotype 4b - - - - - 1/2a

Aantal zieken 32 15 3 11 5 8 9

Aantal doden 2 - - - 0 2 -

Bevolkingsgroep 9 Preg., 23 Volwassen

- - - Preg. Mediaan 78jaar -

70

Bijlage 3. Statistische outputs uit Spotfire S+ 8.2.

3.1 Prevalentiescreening rauwmelkse en gepasteuriseerde, zachte en half-harde kazen


Zachtere kazen t.o.v. hardere kazen One sample Kolmogorov-Smirnov Test of Composite Normality

data: pH in prevalentiescreening.1

ks = 0.1274, p-value = 0.5

alternative hypothesis:

True cdf is not the normal distn. with estimated parameters

sample estimates:

mean of x standard deviation of x

5.909667 1.037458

One sample Kolmogorov-Smirnov Test of Composite Normality

data: pH in prevalentiescreening.2

ks = 0.1732, p-value = 0.0221



sample estimates:


5.629333 0.381288

Wilcoxon rank-sum test

data: x: pH with hardheid = 1 , and y: pH with hardheid = 2

rank-sum normal statistic with correction Z = 1.5007, p-value = 0.1334

alternative hypothesis: mu is not equal to 0

Rauwmelkse kazen t.o.v. gepasteuriseerde kazen One sample Kolmogorov-Smirnov Test of Composite Normality

data: pH in prevalentiescreeningzonder.3

ks = 0.1076, p-value = 0.5



sample estimates:


5.742069 0.8888903


data: pH in prevalentiescreeningzonder.4

ks = 0.243, p-value = 0.0011



sample estimates:


5.816522 0.7904248


data: x: pH with R.3.P.4.T.5.N.6 = 3 , and y: pH with R.3.P.4.T.5.N.6 = 4

rank-sum normal statistic with correction Z = -0.304, p-value = 0.7611


71



data: aw in prevalentiescreening.1

ks = 0.071, p-value = 0.5



sample estimates:


0.9644933 0.01549189


data: aw in prevalentiescreening.2

ks = 0.0847, p-value = 0.5



sample estimates:


0.9504467 0.007645586

Pooled-Variance Two-Sample t-Test (wel gelijke variantie verondersteld)

data: x: aw with hardheid = 1 , and y: aw with hardheid = 2

t = 4.4534, df = 58, p-value = 0

alternative hypothesis: difference in means is not equal to 0

95 percent confidence interval:

0.007733016 0.020360317

sample estimates:

mean of x mean of y

0.9644933 0.9504467

Welch Modified Two-Sample t-Test (geen gelijke variantie verondersteld)

data: x: aw with hardheid = 1 , and y: aw with hardheid = 2

t = 4.4534, df = 42.3355937202576, p-value = 0.0001



0.007682896 0.020410437

sample estimates:

mean of x mean of y

0.9644933 0.9504467

Gemiddelde en standaard afwijking *** Summary Statistics for data in: prevalentiescreening ***

hardheid:1

aw

Mean: 0.96449333

Std Dev.: 0.01549189

-----------------------------------------------------------

hardheid:2

aw

Mean: 0.950446667

Std Dev.: 0.007645586

3.1.3 Zoutgehalte

Normale verdeling van de data


data: zoutgehalte in prevalentiescreening

ks = 0.0654, p-value = 0.5

72



sample estimates:


2.157017 0.6578346

Gemiddelde en standaard afwijking *** Summary Statistics for data in: prevalentiescreening ***

zoutgehalte

Mean: 2.1570167

Total N: 60.0000000

NA's : 0.0000000

Std Dev.: 0.6578346

Afwijking van het gemiddelde voor geitenkaas Exact Wilcoxon signed-rank test

data: V1 in geitenkazen

signed-rank statistic V = 0, n = 4, p-value = 0.125

alternative hypothesis: mu is not equal to 2.0985


data: zoutgehalte in prevalentiescreening.2

ks = 0.1521, p-value = 0.0746



sample estimates:


2.215533 0.5026003


data: zoutgehalte in prevalentiescreening.1

ks = 0.091, p-value = 0.5



sample estimates:


2.0985 0.7878601

Pooled-Variance Two-Sample t-Test

data: x: zoutgehalte with hardheid = 1 , and y: zoutgehalte with hardheid = 2

t = -0.6859, df = 58, p-value = 0.4955



-0.4585654 0.2244987

sample estimates:

mean of x mean of y

2.0985 2.215533

3.1.4 Staphylococcus aureus

Correlatie tussen S. aureus, pH, aw en zoutgehalte *** Correlations ***

aw zoutgehalte pH S.aureus

aw 1.0000000000 -0.649918166 -0.3948977 -0.0006134949

zoutgehalte -0.6499181660 1.000000000 0.3309552 -0.0081653844

pH -0.3948977320 0.330955221 1.0000000 0.2614212503

S.aureus -0.0006134949 -0.008165384 0.2614213 1.0000000000

73

*** p-values of tests for rho=0 ***

aw zoutgehalte pH S.aureus

aw NA 1.920514e-008 0.001793300 0.99628814

zoutgehalte NA NA 0.009798112 0.95062710

pH NA NA NA 0.04363317

S.aureus NA NA NA NA



data: E.coli in prevalentiescreening.1

ks = 0.447, p-value = 0



sample estimates:


1.491667 1.04919


data: E.coli in prevalentiescreening.2

ks = 0.435, p-value = 0



sample estimates:


1.42 0.7937124


data: x: E.coli with hardheid = 1 , and y: E.coli with hardheid = 2




data: E.coli in prevalentiescreeningzonder.3

ks = 0.3328, p-value = 0



sample estimates:


1.748966 1.128341


data: x: E.coli with R.3.P.4.T.5.N.6 = 3 , and y: E.coli with R.3.P.4.T.5.N.6 = 4



Correlatie tussen E. coli, pH, aw en zoutgehalte *** Correlations ***

aw zoutgehalte pH E.coli

aw 1.00000000 -0.6499182 -0.39489773 0.02466711

zoutgehalte -0.64991817 1.0000000 0.33095522 -0.11938736

pH -0.39489773 0.3309552 1.00000000 0.08662495

E.coli 0.02466711 -0.1193874 0.08662495 1.00000000


74

aw zoutgehalte pH E.coli

aw NA 1.920514e-008 0.001793300 0.8515982


pH NA NA NA 0.5104625

E.coli NA NA NA NA


Normale verdeling van de data One sample Kolmogorov-Smirnov Test of Composite Normality

data: MZB in prevalentiescreening

ks = 0.097, p-value = 0.5



sample estimates:


7.6415 0.9966381


data: MZB in prevalentiescreening.1

ks = 0.122, p-value = 0.5



sample estimates:


7.744 1.115606


data: MZB in prevalentiescreening.2

ks = 0.1662, p-value = 0.0338



sample estimates:


7.539 0.8686269


data: x: MZB with hardheid = 1 , and y: MZB with hardheid = 2

5

6

7

8

9

MZ

B

75




data: MZB in prevalentiescreeningzonder.3

ks = 0.1347, p-value = 0.5



sample estimates:


7.708966 1.031162


data: MZB in prevalentiescreeningzonder.4

ks = 0.1288, p-value = 0.5



sample estimates:


7.649565 1.007204

Pooled-Variance Two-Sample t-Test

data: x: MZB with R.3.P.4.T.5.N.6 = 3 , and y: MZB with R.3.P.4.T.5.N.6 = 4

t = 0.2084, df = 50, p-value = 0.8357



-0.5130227 0.6318233

sample estimates: mean of x mean of y

7.708966 7.649565

Correlatie tussen MZB, pH, aw en zoutgehalte *** Correlations ***

aw zoutgehalte pH MZB

aw 1.00000000 -0.6499182 -0.3948977 -0.07604013

zoutgehalte -0.64991817 1.0000000 0.3309552 0.11206854

pH -0.39489773 0.3309552 1.0000000 0.31070365

MZB -0.07604013 0.1120685 0.3107037 1.00000000


aw zoutgehalte pH MZB

aw NA 1.920514e-008 0.001793300 0.56363476


pH NA NA NA 0.01568327

MZB NA NA NA NA

76

3.2 Challengetesten


Gemiddelde en standaard afwijking *** Summary Statistics for data in: challengeblanco ***

kaas:11

pH.B1 pH.B2.7 pH.B2.14

Mean: 6.6100000 6.9700000 7.09

Total N: 4.0000000 4.0000000 4.00

NA's : 0.0000000 1.0000000 3.00

Std Dev.: 0.2070427 0.1473092 NA

-----------------------------------------------------------

kaas:22


Mean: 6.9000000 7.30000000 7.39

Total N: 4.0000000 4.00000000 4.00

NA's : 0.0000000 1.00000000 3.00

Std Dev.: 0.1574802 0.06557439 NA

-----------------------------------------------------------

kaas:33


Mean: 6.345000 6.7150000 7.13000000

Total N: 4.000000 4.0000000 4.00000000

NA's : 0.000000 0.0000000 2.00000000

Std Dev.: 0.487066 0.3700901 0.01414214

-----------------------------------------------------------

kaas:44


Mean: 5.36750000 5.6500000 6.1050000

Total N: 4.00000000 4.0000000 4.0000000

NA's : 0.00000000 1.0000000 2.0000000

Std Dev.: 0.09215024 0.4121893 0.3323402

-----------------------------------------------------------

kaas:55


Mean: 5.4600000 6.0933333 6.4400000

Total N: 4.0000000 4.0000000 4.0000000

NA's : 0.0000000 1.0000000 2.0000000

3.7 4.2 4.7 5.2 5.7 6.2 6.7 7.2 7.7

pH

5

6

7

8

9

MZ

B

77

Std Dev.: 0.3403919 0.5122825 0.3252691

B1 t.o.v. B2 14dagen bij 7°C t.o.v. B2 14dagen bij 14°C Wilcoxon rank-sum test

data: x: pH.B1 in challengeblanco , and y: pH.B2.7 in challengeblanco




data: x: pH.B1 in challengeblanco , and y: pH.B2.14 in challengeblanco




data: x: pH.B2.7 in challengeblanco , and y: pH.B2.14 in challengeblanco



Verschil tussen de kazen onderling Kruskal-Wallis rank sum test

data: pH.B1 and kaas from data set challengeblanco

Kruskal-Wallis chi-square = 14.6399, df = 4, p-value = 0.0055

alternative hypothesis: two.sided

Kruskal-Wallis rank sum test

data: pH.B2.7 and kaas from data set challengeblanco




data: pH.B2.14 and kaas from data set challengeblanco



Zachtere kazen t.o.v. hardere kazen Wilcoxon rank-sum test

data: x: pH.B1 with hardheid = 1 , and y: pH.B1 with hardheid = 2




data: x: pH.B2.7 with hardheid = 1 , and y: pH.B2.7 with hardheid = 2



Exact Wilcoxon rank-sum test

data: x: pH.B2.14 with hardheid = 1 , and y: pH.B2.14 with hardheid = 2

rank-sum statistic W = 26, n = 4, m = 4, p-value = 0.0286


78


Zachtere kazen t.o.v. hardere kazen Exact Wilcoxon rank-sum test

data: x: aw.B1 with hardheid = 1 , and y: aw.B1 with hardheid = 2




data: x: aw.B2.7 with hardheid = 1 , and y: aw.B2.7 with hardheid = 2




data: x: aw.B2.14 with hardheid = 1 , and y: aw.B2.14 with hardheid = 2



B1 t.o.v. B2 14dagen bij 7°C t.o.v. B2 14dagen bij 14°C Exact Wilcoxon rank-sum test

data: x: aw.B1 in challengeblanco , and y: aw.B2.7 in challengeblanco

rank-sum statistic W = 342, n = 19, m = 16, p-value = 1



data: x: aw.B1 in challengeblanco , and y: aw.B2.14 in challengeblanco




data: x: aw.B2.7 in challengeblanco , and y: aw.B2.14 in challengeblanco




data: aw.B1 and kaas from data set challengeblanco




data: aw.B2.7 and kaas from data set challengeblanco




data: aw.B2.14 and kaas from data set challengeblanco



79

3.2.3 Zoutgehalte


data: x: zout.B1 with hardheid = 1 , and y: zout.B1 with hardheid = 2




data: x: zout.B2.7 with hardheid = 1 , and y: zout.B2.7 with hardheid = 2




data: x: zout.B2.14 with hardheid = 1 , and y: zout.B2.14 with hardheid = 2




data: x: zout.B1 in challengeblanco , and y: zout.B2.7 in challengeblanco




data: x: zout.B1 in challengeblanco , and y: zout.B2.14 in challengeblanco




data: x: zout.B2.7 in challengeblanco , and y: zout.B2.14 in challengeblanco




data: zout.B1 and kaas from data set challengeblanco




data: zout.B2.7 and kaas from data set challengeblanco




data: zout.B2.14 and kaas from data set challengeblanco



80



data: x: ecoli.B1 with hardheid = 1 , and y: ecoli.B1 with hardheid = 2




data: x: ecoli.B2.7 with hardheid = 1 , and y: ecoli.B2.7 with hardheid = 2




data: x: ecoli.B2.14 with hardheid = 1 , and y: ecoli.B2.14 with hardheid = 2



Rauwmelkse kazen t.o.v. gepasteuriseerde kazen Wilcoxon rank-sum test

data: x: ecoli.B1 with R.3.P.4.T.5.N.6 = 3 , and y: ecoli.B1 with R.3.P.4.T.5.N.6

= 4




data: x: ecoli.B2.7 with R.3.P.4.T.5.N.6 = 3 , and y: ecoli.B2.7 with

R.3.P.4.T.5.N.6 = 4




data: x: ecoli.B2.14 with R.3.P.4.T.5.N.6 = 3 , and y: ecoli.B2.14 with

R.3.P.4.T.5.N.6 = 4




data: x: ecoli.B1 in challengeblanco , and y: ecoli.B2.7 in challengeblanco

rank-sum normal statistic with correction Z = 0.3759, p-value = 0.707 alternative hypothesis: mu is not equal to 0


data: x: ecoli.B1 in challengeblanco , and y: ecoli.B2.14 in challengeblanco

rank-sum normal statistic with correction Z = -0.7191, p-value = 0.4721 alternative hypothesis: mu is not equal to 0


data: x: ecoli.B2.7 in challengeblanco , and y: ecoli.B2.14 in challengeblanco

81


Correlatie tussen E. coli, pH, aw, zoutgehalte en MZB *** Correlations ***

pH.B1 aw.B1 zout.B1 ecoli.B1 MZB.22.B1

pH.B1 1.000000000 0.55078156 -0.002025174 -0.3184746 0.09772093

aw.B1 0.550781564 1.00000000 -0.064570865 -0.2785209 -0.19953228

zout.B1 -0.002025174 -0.06457086 1.000000000 -0.2065632 -0.80638222

ecoli.B1 -0.318474615 -0.27852092 -0.206563249 1.0000000 0.24102473

MZB.22.B1 0.097720935 -0.19953228 -0.806382220 0.2410247 1.00000000

MZB.30.B1 -0.199858265 -0.32311603 -0.111954466 0.2891901 0.37586247

MZB.30.B1

pH.B1 -0.1998583

aw.B1 -0.3231160

zout.B1 -0.1119545

ecoli.B1 0.2891901

MZB.22.B1 0.3758625

MZB.30.B1 1.0000000


pH.B1 aw.B1 zout.B1 ecoli.B1 MZB.22.B1 MZB.30.B1

pH.B1 NA 0.01659718 0.9932391 0.1711549 0.7154393935 0.4750276

aw.B1 NA NA 0.7936888 0.2523151 0.4735751796 0.2532624

zout.B1 NA NA NA 0.3822401 0.0003970242 0.6295727

ecoli.B1 NA NA NA NA 0.3294202965 0.2747482 MZB.22.B1 NA NA NA NA NA 0.2661758

MZB.30.B1 NA NA NA NA NA NA


Incubeertemperatuur van 22°C t.o.v. 30°C Wilcoxon signed-rank test

data: x: MZB.22.B1 in challengeblancoMZB , and y: MZB.30.B1 in challengeblancoMZB

signed-rank normal statistic with correction Z = -0.8243, p-value = 0.4098 alternative hypothesis: mu is not equal to 0

Wilcoxon signed-rank test

data: x: MZB.22.B2.7 in challengeblancoMZB , and y: MZB.30.B2.7 in

challengeblancoMZB

signed-rank normal statistic with correction Z = 0.5105, p-value = 0.6097 alternative hypothesis: mu is not equal to 0



challengeblancoMZB


Bewaartemperatuur 7°C t.o.v. 14°C Exact Wilcoxon signed-rank test


challengeblancoMZB

signed-rank statistic V = 25, n = 11, p-value = 0.5195 alternative hypothesis: mu is not equal to 0

82

Exact Wilcoxon signed-rank test


challengeblancoMZB


Dag 0 t.o.v. dag 14 Wilcoxon signed-rank test

data: x: MZB.22.B1 in challengeblancoMZB , and y: MZB.22.B2.7 in

challengeblancoMZB

signed-rank normal statistic with correction Z = 0.1035, p-value = 0.9176 alternative hypothesis: mu is not equal to 0



challengeblancoMZB




challengeblancoMZB




challengeblancoMZB


3.2.6 Geïnoculeerde monsters

EU mediaan t.o.v. grootste verschil Exact Wilcoxon signed-rank test

data: x: eumed.7 in challengeblanco , and y: grver.7 in challengeblanco

signed-rank statistic V = 0, n = 20, p-value = 0



data: x: eumed.14 in challengeblanco , and y: grver.14 in challengeblanco




data: eumed.7 and kaas from data set challengeblanco




data: eumed.14 and kaas from data set challengeblanco

83




data: grver.7 and kaas from data set challengeblanco




data: grver.14 and kaas from data set challengeblanco



Beënting op de korst t.o.v. beënting op het snijvlak Exact Wilcoxon signed-rank test

data: x: eumed.7A in challengekorst , and y: eumed.7 in challengekorst




data: x: eumed.14A in challengekorst , and y: eumed.14 in challengekorst




data: x: grver.7A in challengekorst , and y: grver.7 in challengekorst




data: x: grver.14A in challengekorst , and y: grver.14 in challengekorst




data: x: eumed.7 with hardheid = 1 , and y: eumed.7 with hardheid = 2




data: x: eumed.14 with hardheid = 1 , and y: eumed.14 with hardheid = 2




data: x: grver.7 with hardheid = 1 , and y: grver.7 with hardheid = 2



84


data: x: grver.14 with hardheid = 1 , and y: grver.14 with hardheid = 2



Roodbacteriekorst t.o.v. witte schimmelkorst Wilcoxon rank-sum test

data: x: eumed.7 with korst.RB6.WS.7 = 6 , and y: eumed.7 with korst.RB6.WS.7 = 7




data: x: eumed.14 with korst.RB6.WS.7 = 6 , and y: eumed.14 with korst.RB6.WS.7 =

7




data: x: grver.7 with korst.RB6.WS.7 = 6 , and y: grver.7 with korst.RB6.WS.7 = 7




data: x: grver.14 with korst.RB6.WS.7 = 6 , and y: grver.14 with korst.RB6.WS.7 =

7




data: x: eumed.7 in challengeblanco.1 , and y: R.3.P.4.T.5.N.6 in

challengeblanco.1




data: x: eumed.14 in challengeblanco.1 , and y: R.3.P.4.T.5.N.6 in

challengeblanco.1




data: x: grver.7 in challengeblanco.1 , and y: R.3.P.4.T.5.N.6 in

challengeblanco.1




data: x: grver.14 in challengeblanco.1 , and y: R.3.P.4.T.5.N.6 in

challengeblanco.1

85


Correlatie tussen EU mediaan bij 7°C, pH, aw, zoutgehalte en MZB *** Correlations ***

eumed.7

pH.B1 0.808605632

aw.B1 0.637505521

zout.B1 0.006058961

MZB.22.B1 -0.020749710

MZB.30.B1 -0.324872368

eumed.7 1.000000000


pH.B1 aw.B1 zout.B1 MZB.22.B1 MZB.30.B1 eumed.7

pH.B1 NA 0.01659718 0.9932391 0.7154393935 0.4750276 0.00001596297

aw.B1 NA NA 0.7936888 0.4735751796 0.2532624 0.00365170255

zout.B1 NA NA NA 0.0003970242 0.6295727 0.97977431724

MZB.22.B1 NA NA NA NA 0.2661758 0.94227229672

MZB.30.B1 NA NA NA NA NA 0.24549607659

eumed.7 NA NA NA NA NA NA

Correlatie tussen grootste verschil bij 7°C, pH, aw, zoutgehalte en MZB *** Correlations ***

grver.7

pH.B1 0.823499904

aw.B1 0.625999953

zout.B1 -0.009561909

MZB.22.B1 -0.026739277

MZB.30.B1 -0.331532596

grver.7 1.000000000


pH.B1 aw.B1 zout.B1 MZB.22.B1 MZB.30.B1 grver.7

pH.B1 NA 0.01659718 0.9932391 0.7154393935 0.4750276 8.159441e-006

aw.B1 NA NA 0.7936888 0.4735751796 0.2532624 4.685626e-003

zout.B1 NA NA NA 0.0003970242 0.6295727 9.680856e-001

MZB.22.B1 NA NA NA NA 0.2661758 9.246996e-001

MZB.30.B1 NA NA NA NA NA 2.285711e-001

grver.7 NA NA NA NA NA NA

Correlatie tussen EU mediaan bij 14°C, pH, aw, zoutgehalte en MZB *** Correlations ***

eumed.14

pH.B1 0.8952089

aw.B1 0.5795552

zout.B1 0.3127470

MZB.22.B1 -0.2542836

MZB.30.B1 -0.4469685

eumed.14 1.0000000


pH.B1 aw.B1 zout.B1 MZB.22.B1 MZB.30.B1 eumed.14

pH.B1 NA 0.01659718 0.9932391 0.7154393935 0.4750276 0.0002884473

aw.B1 NA NA 0.7936888 0.4735751796 0.2532624 0.0689523139

zout.B1 NA NA NA 0.0003970242 0.6295727 0.2502326782

MZB.22.B1 NA NA NA NA 0.2661758 0.4133013596

MZB.30.B1 NA NA NA NA NA 0.2097358895

eumed.14 NA NA NA NA NA NA

86

Correlatie tussen grootste verschil bij 14°C, pH, aw, zoutgehalte en MZB *** Correlations ***

grver.14

pH.B1 0.9342145

aw.B1 0.4860340

zout.B1 0.2422298

MZB.22.B1 -0.2257419

MZB.30.B1 -0.4764978

grver.14 1.0000000


pH.B1 aw.B1 zout.B1 MZB.22.B1 MZB.30.B1 grver.14

pH.B1 NA 0.01659718 0.9932391 0.7154393935 0.4750276 0.00006075014

aw.B1 NA NA 0.7936888 0.4735751796 0.2532624 0.13799518864

zout.B1 NA NA NA 0.0003970242 0.6295727 0.38002066230

MZB.22.B1 NA NA NA NA 0.2661758 0.46937278749

MZB.30.B1 NA NA NA NA NA 0.17852489949

grver.14 NA NA NA NA NA NA


Normale verdeling One sample Kolmogorov-Smirnov Test of Composite Normality

data: com.W1.T7 in modelleren

ks = 0.3043, p-value = 0 alternative hypothesis:


sample estimates:


4.154 0.8678613





sample estimates:


8.449 0.171584



ks = 0.2753, p-value = 0.0003 alternative hypothesis:


sample estimates:


6.219 1.608232


data: exp.W1.T7 in modelleren



sample estimates:


3.975 0.8847114

87





sample estimates:


5.17 1.814908





sample estimates:


4.41 1.593913


data: sssp.W1.T7 in modelleren



sample estimates:


4.065 0.3391553





sample estimates:


8.465 0.05871429





sample estimates:


6.095 0.667655

ComBase t.o.v. SSSP Wilcoxon rank-sum test

data: x: com.W2.T7 in modelleren , and y: sssp.W2.T7 in modelleren



88






Experimenteel t.o.v. ComBase Wilcoxon rank-sum test

data: x: exp.W2.T7 in modelleren , and y: com.W2.T7 in modelleren




rank-sum statistic W = 52, n = 8, m = 8, p-value = 0.1049 alternative hypothesis: mu is not equal to 0



rank-sum normal statistic with correction Z = -4.1389, p-value = 0 alternative hypothesis: mu is not equal to 0

Expermimenteel t.o.v. SSSP Wilcoxon rank-sum test

data: x: exp.W2.T7 in modelleren , and y: sssp.W2.T7 in modelleren







rank-sum normal statistic with correction Z = -4.1886, p-value = 0 alternative hypothesis: mu is not equal to 0


Beënting op de korst t.o.v. beënting op het snijvlak Wilcoxon rank-sum test

data: x: EU.mediaan with K8.S9 = 8 , and y: EU.mediaan with K8.S9 = 9



data: x: Grootste.verschil with K8.S9 = 8 , and y: Grootste.verschil with K8.S9 =

9


89


data: x: EU.mediaan with Z3.H4 = 3 , and y: EU.mediaan with Z3.H4 = 4



data: x: Grootste.verschil with Z3.H4 = 3 , and y: Grootste.verschil with Z3.H4 =

4



data: x: EU.mediaan with R1.P2 = 1 , and y: EU.mediaan with R1.P2 = 2



data: x: Grootste.verschil with R1.P2 = 1 , and y: Grootste.verschil with R1.P2 =

2


EU mediaan t.o.v. grootste verschil Wilcoxon rank-sum test

data: x: EU.mediaan in accreditatie , and y: Grootste.verschil in accreditatie



data: x: EU.mediaan in accreditatie , and y: Grootste.verschil in accreditatie

signed-rank normal statistic with correction Z = -3.7022, p-value = 0.0002


Correlatie tussen EU mediaan, grootste verschil, pH en aw

90

Bijlage 4. Specifiek overzicht van de kazen uit de prevalentiescreening

Nr. Naam Hardheid Hittebehandeling

1 Malmédy Zacht Geen (rauwmelks)

2 Herve Remoudou l'Exquis Zacht Gepasteuriseerd

3 Chabis Zacht (vers) Geen (rauwmelks)

4 Keiems bloempje Zacht Geen (rauwmelks, biologisch)

5 L'Ovifat Zacht Geen (rauwmelks)

6 Li p'tit rossê Zacht Geen (rauwmelks, biologisch)

7 Palet vieux moulin Zacht Geen (rauwmelks)

8 Geitenkaas met bieslook Zacht (vers) Geen (rauwmelks)

9 Belgische brie Zacht Geen (rauwmelks)

10 Brie (Hinkelspel) Zacht Geen (rauwmelks, biologisch)

11 Geitenkaas met tomatenkorst Zacht (vers) Geen (rauwmelks, biologisch)

12 Keiemse witten Zacht Geen (rauwmelks, biologisch)

13 Bernister fleuri Zacht Geen (rauwmelks, biologisch)

14 Bouquet des moines Zacht Gepasteuriseerd

15 Epoisses de Bourgogne Half-hard Gepasteuriseerd (11,3% rauw)

16 L'Edel de cleron Zacht Gepasteuriseerd

17 Groene peperkaas Halfzacht Gepasteuriseerd

18 Vacherin mont d'or Zacht Gethermiseerd

19 Prefere de nos montagnes Zacht Gepasteuriseerd

20 Delice de Bourgogne Zacht Gepasteuriseerd

21 Delice de pommard Zacht Gepasteuriseerd

22 Taleggio Halfzacht Gepasteuriseerd

23 Brillat savarin Zacht Gepasteuriseerd

24 Chablis de Berthaut Halfzacht Gepasteuriseerd

25 Hinkelspel met peper en knoflook Half-hard Geen (rauwmelks)

26 Wildblumenkäse Half-hard Geen (rauwmelks)

27 Antwerps pikantje Halfzacht Gepasteuriseerd

28 Rubens Half-hard Gepasteuriseerd

29 Tomme de Savoie Half-hard Geen (rauwmelks)

30 St Bernardus Half-hard Gepasteuriseerd

31 Echte loo Half-hard Gepasteuriseerd

32 Pere Josephe Light Half-hard Gepasteuriseerd

33 Trappe echourgnac abdij Half-hard Gepasteuriseerd

34 Saint paulin abdij Half-hard Gepasteuriseerd

35 Cobergher hoeve Half-hard Gethermiseerd

36 Pikantje hoeve Half-hard Gethermiseerd

37 Poperingse Hommelkaas Half-hard Gepasteuriseerd

38 Morbier Half-hard Geen (rauwmelks)

39 Orval Half-hard Gepasteuriseerd

40 Affligem Half-hard Gepasteuriseerd

41 Lucifer Half-hard Gethermiseerd

42 Cabour Half-hard Gethermiseerd

43 Kempense geitenkaas d'haese Half-hard Geen (rauwmelks)

91

44 Moerengoud Half-hard Gethermiseerd

45 Vieux Lille Halfzacht Geen (rauwmelks)

46 Sablé de Wissant Halfzacht Geen (rauwmelks)

47 Pyrénées vache Hard Geen (rauwmelks)

48 Rollot fermier Halfzacht Geen (rauwmelks)

49 Le Nuits d'Or Zacht Gepasteuriseerd

50 Timanoix Halfzacht Gepasteuriseerd

51 Camembert calvados Zacht Geen (rauwmelks)

52 Comté fruité Hard Geen (rauwmelks)

53 Le tonneau Hard Geen (rauwmelks)

54 Bierkaas Gruut Half-hard -

55 Biekaas Delirium tremens Half-hard -

56 Magere keiemnaar Half-hard Geen (rauwmelks)

57 Pas de rouge Half-hard Geen (rauwmelks)

58 Dulses Half-hard Geen (rauwmelks)

59 Herbie brandnetel Hard Geen (rauwmelks)

60 Jonge bellie Hard Geen (rauwmelks)

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2013...

Documents

Transcript of Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2013...