1

Een aardig overzicht waar het bij DNA en RNA om draait.

Module: Molgen1

Module MOLGEN1

2

Module MOLGEN1• Historie van DNA• DNA als chemische stof• DNA replicatie.• DNA als matrijs voor prot.synthese• Transcriptie en translatie• Eukaryoten: exonsplicing• Genomics

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

3

Module MOLGEN1

DNA nader bekeken..Wat is DNA?Hoe ziet DNA eruit?Wie ontdekte DNA?Wie ontdekte dat DNA iets met erfelijkheid te maken hadKan je DNA zien?Kan je DNA zichtbaar maken?Wat doet DNA eigenlijkZijn er cellen die geen DNA hebbenWat is een DNA-test?

Module: Molgen1

4

Module MOLGEN1Wat is DNA?

Een molecuul met de dure naam: Desoxyribo Nucleine AcidHoe ziet DNA eruit?

Als een dubbele wenteltrap. Eiwitten met hun alfa-helix-structuur lijken hierop.

Wie ontdekte DNA?Meerdere onderzoekers en niet één.

Wie ontdekte dat DNA iets met erfelijkheid te maken hadEigenlijk Thomas Hunt Morgan.

Kan je DNA zien?Nee. Veel te klein. Er passen miljoenen moleculen in een eierdopje!

Kan je DNA zichtbaar maken?Ja. Met kleurstof die zich eraan bindt…

Wat doet DNA eigenlijk?Matrijs voor eiwitsynthese

Zijn er cellen die geen DNA hebben?Feitelijk alle zoogdiercellen hebben DNA.

Wat is een DNA-test?De vraag beantwoorden of bepaalde sequenties

overeenkomen (vader-moeder-kind) of (daders – bloedvlekken)

Module: Molgen1

5

Basale feitenkennis DNA (voor iedereen)• DNA zit in elke lichaams CEL.. Elke dus!• Celdeling (groei, herstel, vorming

geslachtscellen) wordt vooraf gegaan door DNA-duplicatie.

• RNA wordt gemaakt aan de hand van DNAen dient als matrijs voor de eiwitsynthese

• Veel eigenschappen zijn functionele eiwitten: (oogkleur, haarkleur, afweerfuncties, enzymen etc..)

• Het menselijk DNA bevat 30.000 genen(= stukjes DNA die coderen voor stukken eiwit) .

• Een gen is ál dat DNA dat bijdraagt tot de expressie van dat gen. (ook dus de non-coding delen!)

• Een fout in het DNA kan leiden tot een fout eiwit en dus tot een foute functie (=ziek).

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

6

Basale feitenkennis DNA (voor iedereen)• DNA ondergaat mutaties = verandering die

worden doorgegeven aan de volgende cellen na deling.

• Een mutatie in je geslachtscellen wordt doorgegeven aan je nageslacht.

• Een mutatie in je lichaamscellen wordt niet doorgegeven.

• Kanker ontstaat door schade aan het DNA en de chromosomen die niet wordt hersteld.-> Op hol geslagen celdeling.

• DNA gaan we zichtbaar maken in onze practica.• DNA kunnen we ook aan een test onderwerpen

in onze practica.

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

7

Eerst kort overzicht geschiedenis DNA• Vader geneeskunde: Hippocrates: zaad komt uit het hele lichaam.• Aristoteles stelde dat erfelijkheid in het bloed was gelegen; wij

spreken nog steeds over blauw bloed, en bloedverwanten…• Microscoop door Anthonie van Leeuwenhoek (1632-1723)• Darwin (1809-1882) sprak over erfelijkheidsdeeltjes in het hele

lichaam• Celtheorie dateert uit 1839 (Schleiden en Schwann)• Hartsoeker dacht dat in zaadcellen kleine mannetjes zaten

(homunculus)• Mendel brengt licht in de zaak en experimenteert met 7

eigenschappen van erwtenplanten : Had geluk: planten waren homozygoot en factoren op andere chromosomen..• Correns, Hugo de Vries herontdekken werk van Mendel rond 1900.• Zwitserse arts Miescher toonde aan dat hemoglobine uit bloedcellen

voor zuurstoftransport verantwoordelijk waren. In die tijd geloofde niemand in onderzoek naar celinhoud..die is immers dood..• Alfred Kossel (1853-1927) ontdekt vier basen: guanine, adenine,

cytosine en thymine.

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

8

Kort overzicht geschiedenis DNA• Thomas Hunt Morgan exp met fruitvliegin 1907 en creert mutanten

en bevestigde de uitkomsten/wetten van Mendel• Morgan identificeert genen op chromosomen en krijgt het inzicht dat

de erfelijkheid dáár gezocht moest worden• Oswald Avery (1877-1955) onderzoekt bij bacterien en voert

beroemde proef uit waaruit blijkt dat de transformerende in bacterien zit en van gewone bacterien ziekteverwekkende kan maken.• Andere onderzoekers komen bij schimmels erachter dat bepaalde

soorten op bepaalde media (agar) niet konden groeien. Andere mutanten wel.• Amerikanen ontdekken bacteriofagen (virussen die bacterien

infecteren)• Hershey en Chase (1927-2003) doen wereldberoemde proef die

duidelijk maakt dat fagen uit een eiwitmantel bestonden gevuld met DNA. Middels radioactief Zwavel (eiwitbouwsteen) en fosfor (DNA-bouwsteen) konden zij aantonen dat DNA van de virus in de bacterie werd gespoten. (zie verderop)• Alexander Todd doet poging om de structuur van DNA te schetsen:

basen, phosfaat, suikers…• Linus Pauling doet voorstel dat eiwitten nog wel eens een a-helix

kunnen zijn (spiraal)

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

9

Kort overzicht geschiedenis DNA• Pauling had hierin gelijk, maar voor DNA was het toch iets anders• Rosalind Frank ontdekt de dubbele helix van DNA middels

rontgendiffractie• Watson en Crick ontdekken in 1952 de structuur van DNA en

besluiten hun vondst met de suggestie dat dit model een replicatiemogelijkheid in zich draagt.

Watson & Crick schrijven in hun artikel dit:

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

10

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

11

DNAstructuurModule MOLGEN1

Module: Molgen1

Eigenlijk is de rechter tekening niet juist: de spiralen zitten niet recht tegenover elkaar; zij zijn 90 graden verschoven.Plaatje hieronder is beter.

12

DNAstructuur:Module MOLGEN1

Module: Molgen1

13

DNAstructuur: DNAModule MOLGEN1

Module: Molgen1

14

DNAstructuur: opbouw DNAModule MOLGEN1

Module: Molgen1

15

DNAstructuur: verschil DNA/RNAModule MOLGEN1

Module: Molgen1

16

DNAstructuurDe figuur hiernaast toontde complementariteit van de beide strengen in DNA.Tegenover A zit T, Tegenover C zit GAls je één streng kent, ken je ook de andere.ATATTAGA heeft als tegenliggerTATAATCT

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

17

DNAstructuur en chromosoomModule MOLGEN1

Module: Molgen1

18

DNAstructuur en chromosoomModule MOLGEN1 DETAILS voor FIJNPROEVERS

Module: Molgen1

19Module: Molgen1

Module MOLGEN1 DETAILS voor FIJNPROEVERS

20Module: Molgen1

Module MOLGEN1 DETAILS voor FIJNPROEVERS

21Module: Molgen1

Module MOLGEN1 DETAILS voor FIJNPROEVERS

22Module: Molgen1

Module MOLGEN1 DETAILS voor FIJNPROEVERSTwee methylerings-vormen: Histonmethylering en DNA-methylering.

23

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

Verder met de DNA-replicatie.

24

DNA replicatie

DOEL: de dubbele helix dupliceren zodat de dochtercellen na de celdeling elk hun eigen kopie hebben.Hieronder zie je het replicatieproces. Behoorlijk ingewikkeld. Uitkomst is dat er twee identieke DNA structuren bestaan die elk in een dochtercel terecht komen. Er zijn (waren) drie modellen:

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

25

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

26

DNA replicatieDOEL: de dubbele helix dupliceren zodat de dochtercellen na de celdeling elk hun eigen kopie hebben.Hieronder zie je het replicatieproces. Behoorlijk ingewikkeld. Uitkomst is dat er twee identieke DNA structuren bestaan die elk in een dochtercel terecht komen. Essentieel is dat de ouderstrengen dus voor 50% in de dochtercel terecht komen. Semiconservatieve replicatie dus.

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

27

DNA-duplicatieBij dit proces zijn tal van enzymen betrokken die DNA opensplijten (helicase), afschermen(ssDNAbp), voorzien van een primer(primase), aaneenrijgen (polymerase), ontwarren (topo-isomerase), gaatje dichten (ligase)..etc…

Module: PCR analyse en Gelelectroforese

Module MOLGEN1

28Module: Molgen1

Module MOLGEN1

29

Het replicatieproces van DNA• Het replicatieproces moet zo foutloos mogelijk geschieden. DNA

polymerasemaakt heel weinig fouten, met name door proofreading; het enzym corrigeert fout geplaatste nucleotide zelf. Blijft een foutmarge van 1: 10E8 over, wat heel weinig is.

• Resultaat van fouten -> veelal niks omdat 98% van ons DNA non-coding is!!!

• Soms treed er zo een mutatie op… Meestal zijn die NIET gunstig en wordendeze door selectie vanzelf verwijderd.

• Tijdens de S1 fase van de mitose wordt het DNA zo verdubbeld.• Wat niet wordt verdubbeld: DNA in mitochrondrien en in

chloroplasten.Deze organellen worden “ongeveer” verdeeld over de dochtercellen.

• Dit principe geldt voor meer materiaal in de cel; sterker: bij de celdifferentiatie is dit juist erg belangrijk; zo ontstaan cellen met veel stof A, en andere dochtercellen met weinig stof A.

• Mitose is een cyclus. Sommige cellen delen zich bijna 200x, anderen 30x.

• Meiose is geen cyclus: een eenmalig vormen van gameten.Module: Molgen1

Module MOLGEN1

30

Onthoudt dus:• Een cel kan zich door deling vermenigvuldigen. Hiervoor is het nodig

dat he DNA zich (eerst) verdubbelt en daarna verdeelt over beide dochtercellen.

• Die dochtercellen zullen op hun beurt weer delen ….

• Bij de vorming van geslachtscellen, gebeurt iets eenmaligs: een slimme splitsing van DNA-materiaal: er ontstaat cellen met slechts de helft van de normale hoeveelheid.

• Als deling niet aan de orde is, worden genen (die niks anders zijn dan stukjes DNA) overgeschreven in RNA dat op zijn beurt weer wordt vertaald in eiwitten. Dit gebeurt dus in ELKE lichaamscel.

• Maar…. In levercellen worden andere genen geactiveerd dan in bloedcellen…

Module: Molgen1

Module MOLGEN1

31

Het transcriptieproces van DNA

Module: Molgen1

Module MOLGEN1

32

Het transcriptieproces van DNA: Centrale Dogma.Niet altijd worden eiwitten gemaakt…

Module: Molgen1

Module MOLGEN1

Dus: One Gene… One RNA?

33

Het transcriptieproces van DNA• Bij transcriptie wordt een vertaalslag gemaakt van

DNA naar RNA.DOEL? Omdat stukken DNA een coderende functie hebben voor eiwit~, en eiwitten vele functies in het lichaam verzorgen.

• Het transcriptieproces heeft tot doel om een stuk gen af te lezen en te vertalen in een werkzaam eiwit. Feitelijk is dit het bestaansrecht van DNA.

• Het kent drie fasen:• Initiatie• Elongatie• Terminatie

• Initiatie is het starten van de transcriptie: waar moet RNA-polymerase beginnen?

• Elongatie: Eenmaal het beginpunt gevonden, wordt DNA getranscribeert in een RNA-streng

• Terminatie: impliceert dat de verse RNA-streng modificaties ondergaat die het beschermen tegen de afbraakenzymen die altijd in het cytosol aanwezig zijn. (5`G-cap structuur en Poly-A-tail)

• Pas verderop wordt het RNA afgelezen en vertaald (translatieproces) in eiwit. (hierover later meer)

Module: Molgen1

Module MOLGEN1

34

Het transcriptieproces van DNA• Bij de transcriptie wordt de ene streng gebruikt voor

herkenning (sense) en de andere streng van DNA gebruikt als matrijs.

Module: Molgen1

Module MOLGEN1

35

DNA-gebiedenDNA kent een aantal gebieden:• Coderende stukken

Deze coderen voor o.a. eiwitten.• Niet coderende stukken:

• Besturingsdelen die de genen “aansturen”• Noncodings region: vroeger Junk-DNA genoemd.

Men vermoedt dat dit DNA een regulerende werking heeft.

• Transcriptie is het proces waarbij DNA wordt overgeschreven in RNA.

• Translatie is het proces dat RNA vertaald in een eiwit. (in cytosol)

• Transcriptie vindt in de kern plaats (eukaryoot)Bij bacterien kunnen deze processen tegelijk plaatsvinden. Er is geen kernmembraan…

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

36

DNA-gebiedenTRANSCRIPTIE bij prokaryoten (bacterien).

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

37

DNA-gebieden TRANSCRIPTIE.• DNA: sense-streng lezen wij van 5’ naar 3’. RNApol leest template van 3’ naar

5’ • Kenmerken: RNApol zoekt de TATAAbox (promotor) als startpunt. (Iets anders

dan TATAA zal leiden tot minder binding en dus minder expressie, niet nul).• 35 posities verderop begint de transcriptie…

Ribosoom is degene die AUG leest als startcodon. RNApol niet

-35 1 5’-CGTATAACA..TAGCGATGACGTAGCGCATGCACGGG.. sense3’-GCATATTGT..ATCGCTACTGCATCGCGTACGTGCCC.. templateRNA: 5’-CGTUCGCGAUGGUGGGG..• 5’-CGTUCGCGAUGGUGGGGGUUGAGGGUAAC.....Wordt later vertaald in: 5’-CGTUCGCGAUGGUGGGGGUUGAGGGUAAC..... .M..V..G..L..E..G..A. Methionine->Valine->Glycine->Leucine etc

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

38

DNA-gebieden TRANSCRIPTIE. Na DELETIE van 1 bp.• Door een mutatie verdwijnt er een bp. GEVOLGEN?• Het was:• -35 1

5’-CGTATAACA..TAGCGATGACGTAGCGCATGCACGGG.. sense3’-GCATATTGT..ATCGCTACTGCATCGCGTACGTGCCC.. templateRNA: 5’-CGTUCGCGAUGGUGGGG..

• WORDT:• -35 1

5’-CGTATAACA..TAGCGATGACGTAGCGCATGCAGGG.. sense3’-GCATATTGT..ATCGCTACTGCATCGCGTACGTCCC.. templateRNA: 5’-CGTUCGCGAUGGUGGG..

• Was: 5’-CGTUCGCGAUG GUG GGG GUU GAG GGU AAC..... Met Val Gly Val Glu Gly Asn

• Wordt:5’-CGTUCGCGAUG GUG GGG UUG AGG GUA AC..... Met Val Gly Leu Arg Val …

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

39

DNA-gebieden TRANSCRIPTIE. • Blijkbaar een zeer gevoelig proces.• Eén mutatie (deletie, insertie, frameshift of wat dan ook) kan

leiden tot een te kort, te lang, corrupt of ander type eiwit dat meestal niet zijn werk doet, schadelijk is ed.

• Recessieve ziekten zijn soms precies het verschil in 1 nucleotide anders..

• Ook het verschil in allelen kan soms maar 1 bp zijn. Het verschil rode of gele bloemkleur bijvoorbeeld.

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

40

DNA-transcriptie.DOEL: stukje van het DNA overschrijven in de vorm van ssRNA opdat dit als matrijs kan dienen voor eiwitsynthese: (rode streng is RNA, blauw: DNA)

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

41

DNA-Trans-criptie

Module MOLGEN1

Module: Molgen1

42

EIWITSYNTHESE (vereenvoudigd)

Module: Molgen1

Module MOLGEN1

Het in de kern gemaakte mRNA (een prévorm ondergaat nog enkele nabewerkingsstappen zoals:1. Aanbrengen van een 5`cap2. Toevoegen van een poly-A-staart3. Verwijderen van stukken mRNA die niet tot eiwit

leiden: zgn introns. Exons blijven over.

43

EIWITSYNTHESE (vereenvoudigd)

Module: Molgen1

Module MOLGEN1

44

Module MOLGEN1

Translatieproces• Aangenomen dat het transcriptieproces goed verlopen is, en er

een juiste RNA-kopie gemaakt is, wordt deze gebruikt als matrijs om de juiste aminozuurvolgorde te maken.

• Elke drietal RNA-nucleotide corresponderen met één aminozuur:GGG = GlycineAUG = MethionineUGA = Stopcodon

• Het RNA wordt gevangen door een ribosoom, dat na een paar stappen start met de synthese van het eiwit. Proces vergelijkbaar met het draaiboek van een orgel. Het boek schrijft voor welke aminozuur nu moet komen etc…

• Als de RNA-streng afgelezen is, is het eiwit klaar en volgt nabewerking die ervoor moet zorgen dat het op die plaats terecht komt war het eiwit bedoeld was. (Afweer eiwit-> buiten de cel), (membraaneiwit -> alleen in het celmembraan) , (nieuw enzym -> in de cel blijven)

Module: Molgen1

45

Module MOLGEN1Tabel met RNA-codons - aminozuren

Module: Molgen1

46

Het transcriptie en translatie-proces van DNAEnkele vragen:• Voor deze cursus is het belangrijk dat iedereen snapt dat DNA de

matrijs is, waarmee RNA wordt gemaakt. Aan de hand van RNA worden eiwitten gesynthetiseerd.

• Waarom worden geen eiwitten gemaakt adhv DNA?• Hoe zou je als cel de hoeveelheid eiwit (enzym, signaalstof, etc)

kunnen regelen?• Hoe en waar zou je dit hele proces kunnen blokkeren/belemmeren?• ANTWOORDEN:

1. DNA-methylering = onmogelijk maken voor RNA-pol om érbij te kunnen2. Blokkerende stoffen die bovenop het DNA klimmen (eiwitten) die

voorkomen dat het DNA wordt afgelezen3. Het corrupt zijn van het startpunt… Hele gen is niet meer afleesbaar4. Etc..

Module: Molgen1

Module MOLGEN1

47

EXONSPLICING

• Een gen in het (menselijk) eukaryorisch genoom is vaak opgedeeld in stukken (exonen). Daartussen zitten stukken die wel worden getranscribeerd tot RNA, maar later eruit worden geknipt.

• Een gen: ……ooooooooo-----ooooooo------oooooooo---ooo---oooooo………

• Alleen de stukken met de oooo’tjes wil je hebben.• RNA-post-processing sloopt de streepjes er tussenuit zodat de

zinvolle RNA-streng overblijft.• Wat blijkt: Een gen dat bestaat uit A B C D E F G kan worden

vertaald in • RNA: A B D G of B C D G of A B D F G• Deze alternatieve vorm van ‘splicing’ leidt tot verschillende eiwitten

op basis van één gen. De mens heeft ca 20000 genen, maar kan dus toch veel meer soorten eiwit maken.

• Bacterien (prokayryoten) kunnen/doen dat niet; er is immers geen kern.

Module: Molgen1

Module MOLGEN1

48

GENOMICS

• Met de komst van de computer is het heel snel gegaan met de volgorde bepaling van o.a. het menselijk DNA. Wij hebben 3 miljard baseparen…

• Men schatte anno 2001 in , dat dit 10 jaar zou duren.• Krap twee jaar later was men klaar.• Nu hebben we de volledige sequentie van veel organismen.

In elk geval van de modelorganismen van de biologie: E.Coli, D.melanogaster, C. Elegans, Aribidopsis thaliana, etc.

• Ook van stukje DNA weten we het.• Besef dat het kennen van de hele sequentie net zoiets is als weten

welke letters er in een woordenboek staan. De betekenis is dan nog geheel onduidelijk. We weten nog LANG nietwaar alle genen zitten.

• In ons volgende blok kijken we naar het genoom van de aardappelplant: Solanum tuberosum. Hiervan kennen we ook het gehele genoom!

Module: Molgen1

Module MOLGEN1

49

GENOMICS: een voorproefje:

Een gen dat de aardappel beschermt tegen aardappelziekte:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/74040323?report=graphModule: Molgen1

Module MOLGEN1

50

GENOMICS: een voorproefje:

Grasduinen in de ncbi-databaseZomaar een gen van de erwt: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/6855710?report=graphChromosoom 3R van Drosophila:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=drosophila+melanogaster+chromosome

Resistentiegenen van de aardappel: komen in de derde week!

Overzicht over Genetica en DNA: http://nl.wikipedia.org/wiki/Genetica

Module: Molgen1

Module MOLGEN1

51

GENOMICS: een voorproefje:

Nu:• Geen practicum; Morgen wel: voorbereiden practicum

DNA-isolatie (kiwi en banaan)• Vandaag: In groepen van 2-4 maken van de vragen die

bij deze module horen• De uitwerkingen van alle vragen staan bij de verslagen

en tellen behoorlijk mee in de beoordeling.

• Ga je gang. Gebruik de site, de bronnen en dergelijke

Module: Molgen1

Module MOLGEN1