CRISPR- Cas technologie :

mogelijkheden en grenzen

Katia Pauwels, Ph.D.

Sciensano – Dienst Bioveiligheid en Biotechnologie (SBB)

Katia.Pauwels@sciensano.be

Dienst Bioveiligheid en Biotechnologie (SBB)

Beoordeling van risico’s voor de menselijke gezondheid en het leefmilieu bij activiteiten met

genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s) en/of pathogenen

in de handel brengen

INFORMATIE

INP

ER

KIN

G

R&D, preklinische studies

Klinische proeven,

veldproeven

www.biosafety.be

Naar een ‘doelgerichte’ modificatie

Conventionele Mutagenese

(virale) vectoren voor integratie van (soortvreemde) genetisch materiaal

3200 plantevariëteitenwaaronder 214 plantensoorten

Ad random locatie Doelgerichte locatie

Site-gerichte nucleases

vb CRISPR-Cas

+ selectie, en terugkruising bij planten

Naar een ‘doelgerichte’ modificatie (2)

…The ability to introduce targeted, tailored

changes into the genomes of several species

will make it feasible to ask more precise

biological questions…..

Gene-editing nucleases will achieve their full

potential when they can be easily and quickly

designed…..

Nature Methods, Vol 9 (1) January 2012

• Meganucleases (MN)

• ZincFinger nuceases (ZFNs)

• Transcriptor Activator Like Effector Nucleases(TALENs)

Method of the year - 2011

Inhoud

• Wat is CRISPR-Cas ?

• Hoe werken gene-editing nucleases ?

• Waarom is CRISPR-Cas baanbrekend ?

• Mogelijke risico’s ?

• Welke toepassingen ?

• Mogelijkheden voor de geneeskunde ?

• Welke regelgeving is voorhanden? Hiaten ? Beperkingen ?

• Welke debatten (dienen te) worden gevoerd?

Wat is CRISPR- Cas ?

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)

and CRISPR-associated System (CAS)

Adapted from Soppe & Lebbink, Trends in Microbiology, 2017

Wat is CRISPR- Cas ? (2)

RNA chimera

PAMTarget DNA

5’ 3’3’ 5’

3’

5’

Cas9crRNA tracrRNA

Adapted from Carroll, Mol Ther 2012; 20(9)

The CRISPR minimal-cleavage elements

Cas9 is een ‘RNA-guided’ nuclease, een gene-editing nuclease

met een werkingsmechanisme dat vergelijkbaar is met deze van

Zinc-Finger nucleases, TALENs and meganucleases

Hoe werken gene-editing nucleases zoals CRISPR-Cas?

ZFNsTALENs MNs

CRISPR

NHEJ

indel

+ donor DNA

HR

+ donor DNA (with correction)

insertion or replacement correction

deletion

Hoe werken gene-editing nucleases zoals CRISPR-Cas ?

ZFNsTALENs MNs

CRISPR ZFNsTALENs MNs

CRISPR

NHEJ

Intra-chromosomal deletion ZFNs

TALENs MNsCRISPR ZFNs

TALENs MNsCRISPR

Chromosomal translocation between two different chromosomes

Waarom is CRISPR-Cas baanbrekend ?

Meganuclease

5’

3’ 5

’

3

’

FokI

FokI

5’

3’ 5’

3’

FokI

FokI

Zink Finger nucleases

TALEN

Eiwit-DNA interacties

RNA chimera

PAMTarget DNA

5’ 3’3’ 5’

3’

5’

Cas9crRNA

tracrRNA

CRISPR- Cas

Hoe gebeurt de herkenning van DNA-sequentie in het genoom ?

RNA-DNA interacties

Gemakkelijker !

Sneller !

Goedkoper !

Waarom is CRISPR-Cas baanbrekend ?

Eigenschappen van genome-editing tools

CRISPR-Cas 9 systeem is baanbrekend …

Science, 26 Sept 2014

“The CRISPR-Cas9 system is revolutionizing genomic

engineering … this technique has grown into one of the

most powerful genomic engineering tools to date”

Nature, 9 March 2016

“Such genetic microsurgery was a dream a decade ago…”

Mogelijke risico’s ?

Off-target effecten

Doelgerichtheid van site-gerichte nucleases werkt niet altijd voor 100% ….

Off-target effecten kunnen worden verminderd door

• Nuclease activiteit in tijd te verminderen

• In silico identificatie van locaties die minder off-target homologen hebben

• Onderzoek naar nucleases met betere in vivo specificiteit

Mogelijke risico’s ?

Zijn off-target effecten (on)aanvaardbaar ?

• Micro-organismen : Volledige sequenering en selectie mogelijk

• Planten : doelgerichter dan conventionele mutagenese ; selectie en terugkruising nog steeds van toepassing

• Dieren : Selectieproces is veel moeizamer + welzijn van dieren

• Menselijke somatische cellen :

• in vivo - nog veel vraagtekens rond efficiëntie, specificiteit + immunogeniciteit van CRISPR componenten

• Ex vivo – klinische proeven lopende

CRISPR-Cas 9 en andere …

• Targets RNA

• Combating RNA-viruses ?

• smaller than Cas9

• different sequence requirements

• good specificity

• No need of guide RNA or specific neighbouring sequence

• Critisism…

Cpf1

C2c2

NgAgo

• Kim, D. et al. Nature Biotechnol (2016)

• Kleinstiver, B. P. et al. Nature Biotechnol. (2016)

• Abudayyeh, O. O. et al. Science 353, aaf5573 (2016).

• Gao, F. et al. Nature Biotechnol. 34, 768–773 (2016).

CasX • RNA-guided genome editors distinct of Cas9 family

• Liu, JJ. et al. Nature 568 (7752) (2019).

Genregulatie/epigenome engineering of base-editing

Ledford, 2016, Nature, vol 531

Fusie DNA-bindende delen van Cas 9 met

Histone methylase

Acetylase

Cytidine deaminase

Toepassingen – Witte biotechnologie

Witte Biotechnologie

• Industriële stammen met verbeterde eigenschappen

(dmv. multiplex insertie van exogeen DNA)

• Onderzoek en ontwikkeling van nieuwe stammen voor productie (fungi)

• Bescherming van industriële bacteriestammen tegen bacteriofaag infectie

• Programmeerbare en CRISPR-cas gemedieerde verwijdering van een populatie uit eencultuur

Toepassingen – Groene Biotechnologie

2013Rijst, tarwe, maïs

2014Tomaat, soja, citrus..

2015Katoen, aardappel …

2016Watermeloen, druif, alfalfa…

2017Cassava, groeten

2018Wortel, cacao, sla, ….

Jaganathan et al., Frontiers in Plant science (9) 985, 2018,

Toepassingen bij dieren

• Verbeterde productie of nieuwe eigenschappen (bv vee zonder hoorns)

• Introductie van resistentie tegen ziektes bij vee (bv resistentie tegen tuberculose)

• Bijdrage tot voedselveiligheid (bv allergen-vrije eieren)

• Terugbrengen van verdwenen diersoorten

• Genetische modificatie van proefdieren als model voor aandoeningen bij de mens

• Verhoogde en meer veilige productie van vaccins in SPF eieren

•

Toepassingen bij dieren

Gene drives

• Controle van vector-gedragen ziektes

• Controle van invasieve species

• Reversie van insecticide resistentie

Mendeliaans (normaal) Gene drive

Toepassingen – Rode biotechnologie (1)

• Behandeling van monogenetische erfelijke aandoeningen

• Immuno-oncologie: gene-editing van T-lymphocyten

Ex vivo - Genetische modificatie van somatische cellen

• Regeneratieve geneeskunde : ex vivo gene-edited stem cells (iPSCs)

Autologe en allogene celtherapie

bv bloedziektes zoals Sickle cell disease, β-thalassemia

Autologe en allogene CAR-T therapie

Reardon, Nature news, June 2016

Allogene CAR-T behandeling

Sommer et al., 2019 Mol Therapy 27 (6)

Allogene CAR- T behandeling Onmiddellijke behandeling

Patiënt

Gezonde donor

Sommer et al., 2019 Mol Therapy 27 (6)

Voor Diagnose Na diagnose

Week 1 Week 2 Week 3

Jour

1 :

dia

gno

se

Apheresis Productie Behandeling

Behandeling

Apheresis Productie Meerdere

dosis

Behandeling

Gene-editing en EU- Regelgeving

GGO- regelgeving in Europa

GGO : een organisme, met uitzondering van menselijke wezens, waarvan het genetische

materiaal veranderd is op een wijze welke van nature door voortplanting en/of door

natuurlijke recombinatie niet mogelijk is

!! Conventionele mutagenese , techniek van genetische modificatie maar

resulterende organismen vallen buiten toepassingsgebied

Voorafgaande gevalsspecifieke beoordeling van risico’s voor menselijke gezondheid en leefmilieu

Vereisten rond detectie en traceerbaarheid

Kunnen gene-edited organismen

(puntmutatie of indels)

vrijgesteld worden

van GGO- EU- richtlijnen ?

GGO-Toelatingsaanvraag = Tijdrovend en duur

Juli, 2018

Europese Hof van Justitie

oordeelt over GGO-status

Pharma versus GGO- Regelgeving

Te veel / weinig regelgeving ?

• ‘Hoe kan technologie evolueren / nuttig zijn voor mens en maatschappij indien toelating voor

product gemiddeld tot 20 jaar duurt ? ‘

• ‘ Kijk naar mogelijke voordelen, laat onderzoek niet afremmen door angst voor alle mogelijke

risico’s’

• ‘ Tal van producten op de markt zijn niet risico-vrij ….’

October 2017, Josiah Zayner, San Francisco: Do-It-Yourself gene therapy

Te veel / weinig regelgeving ?

November 2018, He Jiankui, China : Geboorte van gene-edited tweeling

CRISPR-gemedieerde aanpassing van het CCR5- gen met als doel HIV te voorkomen

• Genetische modificatie van kiembaancellen, erfelijke aanpassingen van het menselijk genoom

Naast ethische ook wetenschappelijke bezwaren

o HIV-kan niet volledig worden voorkomen door CCR5-gen knockout

o Neveneffecten van CCR5-gen knock-out

o Balans Risico / voordeel

Moratorium op menselijke kiembaancel gene-editing

14 maart, 2019

Bedankt !!