7/27/2019 Feng - RNA Component of Human Telomerase

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R E S E A R C H A R T I C L ET h e RNA C o m p o n e n t o fHuman T e l o m e r a s e

J u n l i F e n g , W a l t e r D . F u n k , S y - S h i W a n g , S c o t t L . W e i n r i c h ,A r i e l A . A v i l i o n , C h o y - P i k C h i u , R o b e r t R . A d a m s , E d w i n C h a n g ,R i c h a r d C . A l l s o p p , J i n g h u a Y u , S i y u a n L e , M i c h a e l D . W e s t ,C a l v i n B . H a r l e y , W i l l i a m H . A n d r e w s , C a r o l W . G r e i d e r ,B r y a n t V i l l e p o n t e a u *E u k a r y o t i c c h r o m o s o m e s ar e c a p p e d w i t h r e p e t i t i v e t e l o m e r e s e q u e n c e s t h a t p r o t e c t t h ee n d s f r o m d a m a g e a n d r e a r r a n g e m e n t s . T e l o m e r e r e p e a t s ar e s y n t h e s i z e d b y t e l o m e r a s e ,a r i b o n u c l e i c a c i d ( R N A ) - p r o t e i n c o m p l e x . H e r e , t h e c l o n i n g o f t h e RNA c o m p o n e n t o fhuman t e l o m e r a s e , t e r m e d h T R , i s d e s c r i b e d . T h e t e m p l a t e r e g i o n o f h T R e n c o m p a s s e s1 1 n u c l e o t i d e s ( 5 ' - C U A A C C C U A A C ) c o m p l e m e n t a r y t o t h e h u m a n t e i o m e r e s e q u e n c e( T T A G G G ) , . G e r m l i n e t i s s u e s a n d t u m o r c e l l l i n e s e x p r e s s e d more h T R t h a n n o r m a ls o m a t i c c e l l s a n d t i s s u e s , w h i c h h a v e n o d e t e c t a b l e t e l o m e r a s e a c t i v i t y . Human c e l l l i n e st h a t e x p r e s s e d h T R m u t a t e d i n t h e t e m p l a t e r e g i o n g e n e r a t e d t h e p r e d i c t e d m u t a n tt e l o m e r a s e a c t i v i t y . H e L a c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h an a n t i s e n s e h T R l o s t t e l o m e r i c DNA a n db e g a n t o d i e a f t e r 2 3 t o 2 6 d o u b l i n g s . T h u s , human t e l o m e r a s e i s a c r i t i c a l e n z y m e f o rt h e l o n g - t e r m p r o l i f e r a t i o n o f i m m o r t a l t u m o r c e l l s .H u m a n c h r o m o s o m e s t e r m i n a t e w i t h s e v -e r a l k i l o b a s e s o f t h e s i m p l e t e l o m e r e r e p e a t( T T A G G G ) n . T e l o m e r e s p r o t e c t t h e c h r o -m o s o m e s f r o m DNA d e g r a d a t i o n , e n d - t o -e n d f u s i o n s , r e a r r a n g e m e n t s , a n d c hr o m o -s o m e l o s s ( 1 , 2 ) . B e c a u s e DN A p o l y m e r a s e ss y n t h e s i z e DNA i n t h e 5 ' t o 3 ' d i r e c t i o na n d r e q u i r e a n RNA p r i m e r f o r i n i t i a t i o n ,t e l o m e r i c DNA m a y b e l o s t a t c h r o m o s o m ee n d s u n l e s s t h e t e r m i n i a r e s p e c i f i c a l l y e x -t e n d e d b y t e l o m e r a s e ( 3 , 4 ) . T e l o m e r a s e i s as p e c i a l i z e d r i b o n u c l e o p r o t e i n p o l y m e r a s et h a t c o n t a i n s a n i n t e g r a l R NA w i t h a s h o r tt e m p l a t e e l e m e n t t h a t d i r e c t s t h e s y n t h e s i so f t e l o m e r i c r e p e a t s a t c h r o m o s o m e e n d s( 5 , 6 ) .T h e d e r e g u l a t i o n o f t e l o m e r a s e m a y p a r -t i c i p a t e i n c e l l u l a r i m m o r t a l i t y a n d o n c o -g e n e s i s . N o r m a l h u m a n s o m a t i c c e l l s e x -p r e s s l o w o r u n d e t e c t a b l e t e l o m e r a s e a c t i v -i t y a n d p r o g r e s s i v e l y l o s e t h e i r t e l o m e r i cs e q u e n c e s w i t h r e p l i c a t i v e s e n e s c e n c e i nv i t r o o r w i t h n o r m a l , i n v i v o a g i n g ( 7 - 1 4 ) .I n c o n t r a s t , g e r m l i n e c e l l s a n d a l m o s t a l lt u m o r c e l l l i n e s a n d t i s s u e s e x p r e s s t e l o -m e r a s e a n d m a i n t a i n t e l o m e r e l e n g t ht h r o u g h a n i n d e f i n i t e n u m b e r o f c e l l d i v i -s i o n s ( 1 2 , 1 5 - 1 7 ) . T r a n s f e c t i o n o f n o r m a ls o m a t i c h u m a n c e l l s w i t h v i r a l o n c o g e n e sl e a d s t o c e l l d i v i s i o n b e y o n d t h e n o r m a ls e n e s c e n c e c h e c k p o i n t a n d t h e c o n t i n u e dJ . F e n g , W . D . F u n k , S . - S . W a n g , S . L . W e i n r i c h , C . - P .C h i u , R . R . A d a m s , E . C h a n g , R . C . A l l s o p p , J . Y u , M . D .W e s t , C . B . H a r l e y , W . H . A n d r e w s , a n d B . V i l l e p o n t e a ua r e a t G e r o n C o r p o r a t i o n , 2 0 0 C o n s t i t u t i o n D r i v e , M e n l oP a r k , CA 9 4 0 2 5 , U S A . A . A . A v i l i o n , S . L e , a n d C . W .G r e i d e r a r e a t C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l dS p r i n g H a r b o r , NY 1 1 7 2 4 , U S A .* T o whom c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e a d d r e s s e d .

l o s s o f t e l o m e r e s e q u e n c e s , d e f i n e d a s " c r i -s i s . " A t c r i s i s , t e l o m e r e s a r e c r i t i c a l l y s h o r ta n d g e n o m i c i n s t a b i l i t y i s m a r k e d ( 1 2 , 1 5 ,1 8 ) . A l t h o u g h m o s t c e l l s d i e i n c r i s i s , t h er a r e c e l l s t h a t e s c a p e t h i s f a t e a r e t y p i c a l l ya n e u p l o i d , e x p r e s s t e l o m e r a s e a c t i v i t y , a n dh a v e a s t a b l e t e l o m e r e l e n g t h . T h e r e f o r e ,t e l o m e r a s e a c t i v a t i o n c a n b e a c r i t i c a l s t e pi n c e l l i m m o r t a l i z a t i o n .S h o r t t e l o m e r e s h a v e b e e n d e t e c t e d i n ar a n g e o f t u m o r c e l l l i n e s a n d t i s s u e s , i n c l u d -i n g b r e a s t c a n c e r , W i l m s t u m o r , c o l o r e c t a lc a r c i n o m a , a n d l e u k e m i a ( 8 , 1 9 - 2 6 ) ,w h i c h s u g g e s t s t h a t t e l o m e r e s h o r t e n i n gm a y b e i n v o l v e d i n o n c o g e n e s i s . P e r h a p sb e c a u s e o f t h i s t e l o m e r e s h o r t e n i n g , o v e r 9 0p e r c e n t o f p r i m a r y h u m a n t u m o r s e x p r e s st e l o m e r a s e a c t i v i t y ( 1 7 , 2 7 ) . T h u s , t e l o -m e r a s e m a y b e a c t i v a t e d i n t h e p r e m a l i g -n a n t c e l l a s t e l o m e r e s g e t c r i t i c a l l y s h o r t ,a n d c o n t i n u e d t e l o m e r a s e a c t i v i t y m a y b er e q u i r e d f o r t h e l o n g - t e r m g r o w t h o f t h ef u l l y m a l i g n a n t c a n c e r c e l l ( 7 - 9 , 1 2 , 1 7 ) .We h a v e c l o n e d t h e R N A c o m p o n e n t o fh u m a n t e l o m e r a s e a n d s h o w h e r e t h a t e x -p r e s s i o n o f a n a n t i s e n s e t e l o m e r a s e RNAl e a d s t o t e l o m e r e s h o r t e n i n g a n d c e l l d e a t h .C y c l i c s e l e c t i o n c l o n i n g o f t e l o m e r a s eRNA c a n d i d a t e s . T h e RN A c o m p o n e n t o ft e l o m e r a s e h a s b e e n c l o n e d f r o m m a n y c i l -i a t e s ( 2 8 - 3 0 ) a n d y e a s t ( 3 1 ) . No s i m i l a r i t yi n RNA s i z e o r s e q u e n c e w a s f o u n d b e t w e e nt h e s e s p e c i e s , w h i c h i n d i c a t e s t h a t t h e p r i -m a r y s e q u e n c e o f t e l o m e r a s e RNAs i s n o tc o n s e r v e d . C o n v e n t i o n a l l o w - s t r i n g e n c yh y b r i d i z a t i o n t e c h n i q u e s , t h e r e f o r e , w e r eu n l i k e l y t o y i e l d t h e h u m a n t e l o m e r a s eRNA. I n T e t r a h y m e n a , w h i c h c o n t a i n s> 2 0 , 0 0 0 t e l o m e r e s , t e l o m e r a s e RNA i s

p r e s e n t a t " 2 0 , 0 0 0 c o p i e s p e r c e l l ( 3 2 )B e c a u s e h u m a n c e l l s h a v e o n l y 9 2 t e l om e r e s a n d t e l o m e r a s e a c t i v i t y i n h u m a n sw e a k e r t h a n i n T e t r a h y m e n a ( 3 3 ) , w e a n t i ci p a t e d t h a t t h e h u m a n t e l o m e r a s e RNAm i g h t b e a r a r e t r a n s c r i p t r e q u i r i n g s p e c i ap r o t o c o l s t o e n r i c h f o r t h i s R N A .E n r i c h m e n t f o r t e l o m e r a s e g e n e s w ai n i t i a l l y c a r r i e d o u t b y s u b t r a c t i v e h y b r i di z a t i o n o r b y p a r t i a l t e l o m e r a s e p u r i f i c a t i o( 3 4 ) . RN A w a s p r e p a r e d f r o m t e l o m e r a s ep o s i t i v e c e l l s ( 2 9 3 ) , t e l o m e r a s e - n e g a t i vc e l l s ( I M R 9 0 ) , o r p a r t i a l l y p u r i f i e d t e l om e r a s e f r a c t i o n s f ro m 2 9 3 c e l l s . C o m p l em e n t a r y DN A ( c D N A ) l i b r a r i e s w e r e g e ne r a t e d f r o m t h e s e RNAs b y r a n d o m - p r i m er e v e r s e t r a n s c r i p t i o n o f t h e RNAs a n d t ha d d i t i o n o f s y n t h e t i c l i n k e r s t o a l l o w f op o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) a m p l i f ic a t i o n . S u b t r a c t i o n o f t h e t e l o m e r a s e - n e ga t i v e l i b r a r y f r o m t h e t e l o m e r a s e - p o s i t i vl i b r a r y g e n e r a t e d t h e t e l o m e r a s e - e n r i c h es u b t r a c t e d PCR-cDNA l i b r a r y . I n a d d i t i o na p u r i f i e d PCR-cDNA l i b r a r y w a s p r e p a r ef r o m p a r t i a l l y p u r i f i e d t e l o m e r a s e e n z y mf r a c t i o n s , w h i c h r e p r e s e n t e d a s e c o n d i n d ep e n d e n t l i b r a r y e n r i c h e d f o r p o t e n t i a l t e l om e r a s e R N A s .T e l o m e r a s e RNAs t y p i c a l l y c o n t a i n 1 .r e p e a t s o f t h e t e l o m e r e c o m p l e m e n t a r y s eq u e n c e ( 2 9 , 3 0 , 3 5 ) . We d e s i g n e d a P CRc y c l i c s e l e c t i o n m e t h o d t o e n r i c h f o r c a nd i d a t e t e l o m e r a s e RNAs c o n t a i n i n g t hp r e d i c t e d h u m a n t e l o m e r i c t e m p l a t e s eq u e n c e CUAACCCUA. B o t h t h e s u b t r a c te d a n d p u r i f i e d P C R - c D N A l i b r a r i e s w e re n r i c h e d f o r t e l o m e r a s e t e m p l a t e - c o n t a i ni n g s e q u e n c e s b y h y b r i d i z a t i o n t o a b i o t i n yl a t e d 1 2 - n u c l e o t i d e c o m p l e m e n t t o t h e p r ed i c t e d t e m p l a t e ( 3 6 ) . A f t e r h y b r i d i z a t i o ncDNAs b o u n d t o t h e b i o t i n y l a t e d o l i g o n uc l e o t i d e w e r e s e p a r a t e d f r o m n o n t e m p l a tc D N A s w i t h t h e u s e o f s t r e p t a v i d i n - a g a r o sm a g n e t i c b e a d s . T o m a x i m i z e t h e c o n c e nt r a t i o n o f cDNAs c o n t a i n i n g CUAAC-CCUA i n t h e l i b r a r i e s , w e u s e d t h r e e of o u r r e p e t i t i v e c y c l e s o f p o s i t i v e s e l e c t i ow i t h t h e b i o t i n y l a t e d , t e m p l a t e - s p e c i f i c o l ig o n u c l e o t i d e . A f t e r t h e t h i r d c y c l e o f s e l e ct i o n , i n d i v i d u a l P CR b a n d s c o u l d b e r es o l v e d o n n a t i v e p o l y a c r y l a m i d e g e l s , w h i ci n d i c a t e d t h a t s o m e s e q u e n c e s h a d b e eh i g h l y s e l e c t e d . I n d i v i d u a l b a n d s w e r e e xc i s e d , s u b c l o n e d i n t o p B l u e s c r i p t , a n d s eq u e n c e d . T w e l v e cDNAs c o n t a i n i n g t hp r e d i c t e d t e l o m e r e t e m p l a t e ( C U A A CC C U A ) w e r e i d e n t i f i e d a s t e l o m e r a s e R N Ac a n d i d a t e s ( T R C s ) .P r e l i m i n a r y i d e n t i f i c a t i o n o f TRC3 at h e R N A c o m p o n e n t o f h u m a n t e l o m e r a s eT o d e t e r m i n e w h i c h o f t h e 1 2 c a n d i d a t em i g h t e n c o d e t h e h u m a n t e l o m e r a s e R N Aw e i n i t i a l l y a s s a y e d f o r t h e i n h i b i t i o n o f t eo m e r a s e a c t i v i t y u s i n g a n t i s e n s e o l i g o n u c l eo t i d e s . T e t r a h y m e n a , E u p l o t e s , a n d O x y t r i c ht e l o m e r a s e s a r e s p e c i f i c a l l y i n h i b i t e d b y o l

S C I E N C E V O L . 2 6 9 * 1 SEPTEMBER 1 9 9 5

.-e.a.l.r.lll-ee8Pi.m.l..rIrBBi]3.11 2 3 6

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F i g . 1 . T R C 3 RNA c o r r e l a t e s w i t h b i o c h e m i c a l p u r i -f i c a t i o n o f t e l o m e r a s e a c t i v i t y . S 1 0 0 e x t r a c t s f r o m2 9 3 c e l l s w e r e f r a c t i o n a t e d o v e r D E A E - S e p h a r o s ea n d t h e n S e p h a c r y l S 3 0 0 H R r e s i n s . F r a c t i o n s c o n -t a i n i n g a c t i v e t e l o m e r a s e w e r e p o o l e d ( D S i n p u t ) a n dt h e n l o a d e d o n t o a p r e f o r m e d g l y c e r o l g r a d i e n t ( 1 5t o 4 2 p e r c e n t ) . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n , g r a d i e n t f r a c -t i o n s w e r e c o l l e c t e d ( f r a c t i o n 1 = b o t t o m ) a n d a s -s a y e d f o r t e l o m e r a s e a c t i v i t y b y t h e P C R m e t h o d( 1 7 ) . RNA w a s e x t r a c t e d f r o m e a c h f r a c t i o n , a n dcDNA w a s m a d e w i t h r a n d o m h e x a m e r s a s p r i m e r s .T h e r e s u l t i n g cDNA w a s i n c l u d e d i n P C R r e a c t i o n sw i t h t h e u s e o f s e q u e n c e - s p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e sd e r i v e d f r o m t h e TRC c a n d i d a t e s o r f r o m R N a s e P( 5 5 ) a s i n d i c a t e d . T h e r e a c t i o n p r o d u c t s w e r e r e -s o l v e d b y p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s .g o n u c l e o t i d e s t h a t a r e c o m p l e m e n t a r y t o t h et e l o m e r a s e t e m p l a t e a n d a d j a c e n t s e q u e n c e s( 2 8 - 3 0 ) . T h e r e f o r e , w e d e s i g n e d o l i g o n u c l e -o t i d e s t h a t w o u l d h y b r i d i z e t o t h e t e m p l a t ea n d a d j a c e n t r e g i o n s f o r e a c h o f t h e c a n d i -d a t e c l o n e s . E x t r a c t s w i t h t e l o m e r a s e a c t i v -i t y w e r e t h e n t e s t e d f o r t h e i r a b i l i t y t o e l o n -g a t e e a c h o f t h e a n t i s e n s e o l i g o n u c l e o t i d e sa n d t h e n o n t e l o m e r i c t e l o m e r a s e p r i m e r T S[ o l i g o n u c l e o t i d e AATCCGTCGAGCAG-A G T T , w h i c h i s k n o w n t o s e r v e a s a n e f f e c -t i v e t e l o m e r a s e p r i m e r ( 1 7 ) ] . T h e o l i g o n u -c l e o t i d e s c o m p l e m e n t a r y t o o n e o f t h e c a n -d i d a t e s , T R C 3 , i n h i b i t e d t e l o m e r a s e a c t i v i -t y , w h e r e a s o l i g o n u c l e o t i d e s d e s i g n e d f o r t h eo t h e r 1 1 c a n d i d a t e s d i d n o t .I n c i l i a t e s , t h e p a t t e r n o f i n h i b i t i o n b ya n t i s e n s e o l i g o n u c l e o t i d e s t h a t w e r e b a s e do n t h e t e l o m e r a s e RN A c o m p o n e n t i sd e p e n d e n t o n t h e i r t a r g e t i n g t o s p e c i f i cs e q u e n c e s a r o u n d t h e t e l o m e r i c t e m p l a t ee l e m e n t ( 2 8 - 3 0 ) . T h e r e f o r e , w e d e s i g n e d as e r i e s o f o l i g o n u c l e o t i d e s c o m p l e m e n t a r y t ov a r i o u s s e q u e n c e s n e a r o r d i s t a l t o t h e p u -t a t i v e t e m p l a t e o f T R C 3 . T h e s e o l i g o n u c l e -o t i d e s w e r e a g a i n t e s t e d f o r t h e i r a b i l i t y t oi n h i b i t t e l o m e r a s e a c t i v i t y ( 3 7 ) . T h e d a t ai n d i c a t e d t h a t a n t i s e n s e i n h i b i t i o n o f h u -m a n t e l o m e r a s e r e q u i r e s o l i g o n u c l e o t i d ec o m p l e m e n t a r i t y t o s e q u e n c e s i n a n da r o u n d t h e TRC3 t e m p l a t e a n d t h a t a n t i -s e n s e o l i g o n u c l e o t i d e s d i s t a l f r o m t h e t e m -F i g . 2 . S e q u e n c e o f h T Ra n d t h e d o w n s t r e a m r e -g i o n . B o t h s t r a n d s w e r es e q u e n c e d f r o m t h eg e n o m i c c l o n e b y t h eS a n g e r d i d e o x y m e t h o d( 5 6 ) . T h e t e l o m e r a s et e m p l a t e i s u n d e r l i n e d ,a n d t h e p o s i t i o n o f t h e1 7 - b a s e i n s e r t ( A T C G -G A T C C A G A C G A G C ) i nMuC* i s s h o w n a t n u c l e -o t i d e 1 7 6 b y a n a s t e r i s k .

DS 1 3 5 7 9 1 1 1 3 1 5 1 7 1 9 2 1

p l a t e w e r e n o t i n h i b i t o r y , w h i c ht o t h e p a t t e r n o b s e r v e d i n t h e c i l iAn a d d i t i o n a l t e s t o f t h e T R 4w a s c o p u r i f i c a t i o n w i t h t e l o m e r a s eT e l o m e r a s e a c t i v i t y w a s p a r t i a l l ya n d f r a c t i o n s w e r e t e s t e d f o r tRNAs b y r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e ( R( F i g . 1 ) . T e l o m e r a s e a c t i v i t y p e a k et i o n s 7 t o 9 o f t h e g l y c e r o l g r a d i e nc a n d i d a t e s t e s t e d , o n l y TRC3 h a dt h a t c o r r e l a t e d w i t h t e l o m e r a s e a cb o n u c l e a s e ( R N a s e ) P a n d t h r e e o tc a n d i d a t e s d i d n o t c o p u r i f y w i t ha s e . S i m i l a r c o p u r i f i c a t i o n o f TRt e l o m e r a s e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d i re n t p u r i f i c a t i o n s c h e m e ( 3 8 ) . T Ic o p u r i f i c a t i o n a n d t h e a n t i s e n s e i ie x p e r i m e n t s s u g g e s t e d t h a t TRC3t h e h u m a n t e l o m e r a s e RNA c o m iS o u t h e r n ( D N A ) b l o t a n a l y s is i t u h y b r i d i z a t i o n d e m o n s t r a t e d t hi s a s i n g l e - c o p y g e n e l o c a l i z e d t o 1q u a r t e r o f t h e l o n g a r m o f c h r o r r( 3 9 ) . TRC3 cDNA w a s u s e d t oh u m a n g e n o m i c DN A l i b r a r y ( l a mI I ; S t r a t a g e n e ) . A s i n g l e p o s i t i v e c ia 1 5 - k b i n s e r t w a s i s o l a t e d a n dc o n t a i n a n e x a c t c o p y o f t h e TRCf r a g m e n t u s e d t o p r o b e t h e l i b rr e s t r i c t i o n p a t t e r n d e d u c e d f r o m t lS o u t h e r n b l o t w a s c o n s i s t e n t w i t ]s t r i c t i o n p a t t e r n o b s e r v e d i n t h (

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 60G G G T T G C G G A GGGTGGGCCT GGGAGGGGGTGGCCATIT TTGTCTAAC C C T A A C I G A G7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0AAGGGCGTAG G C G C C G T G C T T ' T G C - I C C C G C G C G C ' I G T T T F H C T C G C T ' G A C T F T C A G C G

1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 * 1 8 0GGCGGAAAAG CCTCGGCCTG C C G C C 7 T C C A C C G T T C A T T C T A G A G C A A A C A A A A A T G T C1 9 0 20 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0AGCTGCTGGC CCGTICGCCT CCCGGGGACC TGCGGCGGGT CGCCTGCCCA G C C C C C G A A C2 5 0 2 6 0 2 7 0 2 8 0 2 9 0 3 0 0CCCGCCTGGA GCCGCGGTCG GCCCGGGGCT TCTCCGGAGG C A C C C A C T G C C A C C G C G A A G3 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 0 3 6 0A G T ' G G G C T C TGTCAGCCGC GGGTCT1 C G GGGCGAGGG C G A G G T T C A C C G T . T C A G G C3 7 0 3 8 0 3 9 0 4 0 0 4 1 0 4 2 0CGCAGGAAGA GGAACGGAGC GAGTCCCGCC GCGGCGCGAT T C C C T I G A G C T G T G G G A c G T G43 0 44 0 45 0 460 470 4 8 0CACCCAGGAC TCGGCTCACA C A T G C A G T P C GCTTTCCTGT T G G T G G G G G G AACGCCGATC

I s e l e c t e d l a m b d a c l o n e , w h i c h c o n f i r m e dt h a t t h i s l a m b d a c l o n e c o n t a i n e d TRC3g e n o m i c DNA ( 3 9 ) .e l o m e r a s e M u t a t i o n o f t h e T R C 3 t e m p l a t e . A l t e r -a c t i v i t y a t i o n o f t h e t e m p l a t e r e g i o n o f T e t r a h y m e n aa n d y e a s t t e l o m e r a s e R N A g e n e s l e a d s t oc o r r e s p o n d i n g c h a n g e s i n t h e t e l o m e r e r e -p e a t s y n t h e s i z e d ( 6 , 3 1 , 3 5 ) . To d e t e r m i n e i fT R C 3 a l t e r a t i o n o f t h e TRC3 t e m p l a t e r e g i o nR N a s e w o u l d p r o d u c e a s i m i l a r r e s u l t , a g e n o m i cDNA f r a g m e n t t h a t e x p r e s s e s t h e e n t i r eT R C 4 TRC3 g e n e s e q u e n c e w a s s u b c l o n e d f r o mI T R C 1 l a m b d a a n d m u t a g e n i z e d . T h e 2 . 6 - k b H i n dI l l - S a c I f r a g m e n t c o n t a i n i n g T R C 3 w a sT R C l l f i r s t i n s e r t e d i n t o a m o d i f i e d v e r s i o n o fp B l u e s c r i p t , g e n e r a t i n g t h e g e n o m i c TRC3i s s i m i l a r p l a s m i d p G R N 3 3 . T h e f u l l TRC3 s e q u e n c ea t e s . w a s t h e n o b t a i n e d f r o m t h i s g e n o m i c s u b -C c l o n e s c l o n e ( F i g . 2 ) . T h e 5 ' a n d 3 ' e n d s o f t h ea c t i v i t y . RNA t r a n s c r i p t w e r e m a p p e d w i t h 5 ' p r i m -p u r i f i e d , e r e x t e n s i o n PCR a n d R T - P C R ( 4 0 ) . T h eh e TRC s i z e o f t h e RNA t r a n s c r i p t w a s " 4 5 0 b a s e s ,. T ) - P C R w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h i t s m i g r a t i o n o nd i n f r a c - N o r t h e r n ( R N A ) b l o t s . T h e t r a n s c r i b e d r e -i t . O f t h e g i o n f o r TRC3 w a s c e n t r a l t o t h e hTR g e n eI a s i g n a l f r a g m e n t i n p G R N 3 3 a n d c o n t a i n s 1 . 4 k b o ft i v i t y ; r i - u p s t r e a m s e q u e n c e .h e r TRC T h e p r e d i c t e d t e m p l a t e s e q u e n c e o ft e l o m e r - TRC3 w a s a l t e r e d f r o m CU A A CCCU A t o. C 3 w i t h CCAACCCCA ( M u C ) o r CA A A CCCA Ai a d i f f e r - ( M u A ) b y i n v i t r o m u t a g e n e s i s ( 4 1 ) o f t h em u s , b o t h g e n o m i c p l a s m i d p G R N 3 3 . I f i n c o r p o r a t e dn h i b i t i o n i n t o f u n c t i o n a l t e l o m e r a s e , t h e s e m u t a n te n c o d e s RNAs s h o u l d d i r e c t t h e s y n t h e s i s o f T T -) o n e n t . GGGG ( M u C ) o r TTTGGG ( M u A ) r a t h e rs a n d i n t h a n t h a t o f t h e w i l d - t y p e r e p e a t T T A -a t TRC3 GGG. T he s e m u t a n t t e l o m e r a s e a c t i v i t i e st h e d i s t a l c o u l d b e d i s t i n g u i s h e d f r o m t h a t o f t h e w i l d -l o s o m e 3 t y p e b e c a u s e t h e y n o l o n g e r r e q u i r e d e o x y -p r o b e a a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ( d A T P ) f o r a c t i v i t yL b d a ZAP a n d o n l y t h e w i l d - t y p e a c t i v i t y i s s e n s i t i v e t ol o n e w i t h t e r m i n a t i o n b y d i d e o x y A T P ( d d A T P ) . Af o u n d t o d o u b l e m u t a n t ( M u C * ) w a s a l s o p r e p a r e d i n> 3 cDNA w h i c h a 1 7 - b p i n s e r t i o n w a s p r e s e n t a ta r y . T h e + 1 7 6 b p ( a s t e r i s k s i n F i g s . 2 a n d 3 A ) i nh i e TRC3 a d d i t i o n t o t h e MuC t e m p l a t e . T h i s m u t a n th t h e r e - a l l o w e d s p e c i f i c d e t e c t i o n o f t h e a l t e r e dT R C 3 - RNA w i t h a p r o b e t o t h e 1 7 - b p i n s e r t i o n .

4 9 0 5 0 0 5 1 0 5 2 0 5 3 0 5 4 0G T G C G C A T C C G T C A C C C C T C G C C G G C A G T G G G G G C T T G T G AACCCCCAAA CCTGACTGAC5 5 0 5 6 0 5 7 0 5 8 0 5 9 0 6 0 0' I G G G C C A G T G TCCTGCAAAT TGGCAGGAGA CGTGAAGGCA CCTCCAAAGT CGGCCAAAAT6 1 0 6 2 0 6 3 0 6 4 0 6 5 0 6 6 0G A A T G G G C A G TGAGCGGG T C C I G A G CCGGTCCTGC G T G G G T T C ' I C CCGTCTTCCG6 7 0 6 8 0 6 9 0 7 0 0 7 1 0 7 2 0C T I ' T F I ' I 7 T G C C T T I T A T G G TTGTA1TACA A C T T A G T T C C T G C ' C I V G C A G ATTTIGTGA7 3 0 7 4 0 7 5 0 7 6 0 7 7 0 7 8 0GGITrITCT CTCCCAAGG TAGATCTCGA CCAGTCCCTC AACGGGGTGT GGGGAGAACA79 0 8 0 0 810 820 830 840G A I T C A ' ' i TTTGAGAGAT C A I T T A A C A T TTAATGAATA ' I T T A A T r A G A AGATCTAAAT8 5 0 860 8 7 0 880 8 9 0 90 0G A A C A T I G G A A A' TG TG TT C IT TA A TG GT C A T C G G T I T T A o T G C C A G A G G T T A G A A G T T I T C9 1 0 9 2 0 9 3 0 9 4 0 9 5 0 96 0l T I ' r i ' r A A A AAqTAGACCT TGGCGATGAC CTTGAGCAGT AGGATATAAC CCCCACAAGC

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SCIENCE * V O L . 2 6 9 1 SEPTEMBER 1 9 9 5 1 2 3 7

7/27/2019 Feng - RNA Component of Human Telomerase

3/6

I n p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s , w e d e t e r -m i n e d w h e t h e r t h e 2 . 6 k b o f g e n o m i c s e -q u e n c e w a s s u f f i c i e n t f o r e x p r e s s i o n o fT R C 3 i n v i v o . C e l l s w e r e t r a n s i e n t l y t r a n s -f e c t e d w i t h t h e MuC* p l a s m i d , a n d RNAe x p r e s s e d f r o m t h e DN A w a s d e t e c t e d b yRT-PCR w i t h t h e 1 7 - b p i n s e r t s e q u e n c e a st h e p r i m e r i n t h e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n s t e p .T h e R N A w a s d e t e c t e d i n M u C * - t r a n s -f e c t e d c e l l s b u t n o t i n m o c k - t r a n s f e c t e dc e l l s ( 4 2 ) , w h i c h i n d i c a t e s t h a t t h e 2 . 6 - k bg e n o m i c c l o n e w a s s u f f i c i e n t f o r TRC3 e x -p r e s s i o n . S t a b l e t r a n s f o r m a n t s w e r e t h e nd e r i v e d b y e l e c t r o p o r a t i o n o f M u C * , M u C ,o r M u A p l a s m i d s i n t o H T 1 0 8 0 c e l l s a l o n gw i t h p C M V n e o a s a s e l e c t i o n m a r k e r . R e -s i s t a n t c l o n e s w e r e s e l e c t e d i n G 4 1 8 , a n de x p r e s s i o n o f t h e m u t a n t RNAs w a s v e r i f i e db y R T - P C R ( 4 3 ) .T o t e s t f o r m u t a n t t e l o m e r a s e a c t i v i t y ,

w e a s s a y e d t h e e x t r a c t s f r o m u n t r a n s f e c t e dc e l l s a n d f r o m t h r e e s t a b l e t r a n s f o r m a n t sw i t h i n t e g r a t e d M u C * , M u C , o r M u A v e c -t o r s ( C * , C , o r A i n F i g . 3 A ) . B e c a u s e t h em u t a n t e x t r a c t s w e r e e x p e c t e d t o c o n t a i nb o t h w i l d - t y p e a n d m u t a n t t e l o m e r a s e a c t i v -i t i e s , v a r i o u s a s s a y c o n d i t i o n s w e r e u s e d t od i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e m . U n d e r n o r m a lr e a c t i o n c o n d i t i o n s [ w i t h d e o x y t h y m i d i n et r i p h o s p h a t e ( d T T P ) , [ a t - 3 2 P ] d e o x y g u a n o -s i n e t r i p h o s p h a t e ( d G T P ) , a n d d A T P ] , a l lt h r e e e x t r a c t s f r o m t h e m u t a n t c o n s t r u c ts e r i e s s h o w e d t e l o m e r a s e a c t i v i t y t h a t w a ss e n s i t i v e t o R N a s e . A s e x p e c t e d , t h i s a c t i v -i t y w a s u n a f f e c t e d w h e n d i d e o x y c y t o s i n et r i p h o s p h a t e ( d d C T P ) w a s i n c l u d e d i n t h er e a c t i o n s a n d w a s a b o l i s h e d b y d i d e o x y T T P( d d T T P ) . I n c o n t r a s t , w h e n d d A T P w a ss u b s t i t u t e d f o r d A T P , t h e C a n d A e x t r a c t ss t i l l d i s p l a y e d R N a s e - s e n s i t i v e t e l o m e r a s eF i g . 3 . T e l o m e r a s e a c t i v i t y Af r o m c e l l s e x p r e s s i n g t e m r n - N o r m a l ddC d d T d d Ap l a t e - m u t a t e d T R C 3 . ( A ) C * C A C * C A C * C CA C * C A* C AC * AE x t r a c t s f r o m m u t a n tT R C 3 - e x p r e s s i n g s t a b l et r a n s f o r m a n t s w e r e f r a c -t i o n a t e d b y D E A E - S e p h a -r o s e a n d w e r e a s s a y e d f o rt e l o m e r a s e a c t i v i t y b yc o n v e n t i o n a l a s s a y s u n -d e r v a r i o u s r e a c t i o n c o n -d i t i o n s . E x t r a c t s f r o m c e l l se x p r e s s i n g M u C * T R C 3( l a n e s 1 , 4 , 7 , 1 0 , 1 3 , a n d1 6 , l a b e l e d C * ) , M u CT R C 3 ( l a n e s 2 , 5 , 8 , 1 1 ,1 4 , a n d 1 7 , l a b e l e d C ) , o rM u A T R C 3 ( l a n e s 3 , 6 , 9 ,1 2 , 1 5 , a n d 1 8 , l a b e l e d A )w e r e a s s a y e d u n d e r n o r -m a l r e a c t i o n c o n d i t i o n s( l a n e s 1 t o 6 ) , n o r m a l p l u s0 . 5 m M d d C T P ( l a n e s 7 t o9 ) , n o r m a l m i n u s d T T Pp l u s 0 . 5 mM d d T T P ( l a n e s1 0 t o 1 2 ) , o r n o r m a l m i n u sd A T P p l u s 0 . 5 m M d d A T P 2( l a n e s 1 3 t o 1 8 ) . A s s a y r e -a c t i o n s i n l a n e s 1 t o 9 c o n - 1 .t a i n e d 8 ~ M t o t a l d G T P ,o f w h i c h a p o r t i o n w a s 1 1 2 3 4 5 678 9 1 0 1 1 1 2 1 6 1 7 1 8p M [ a - 3 2 P ] d G T P ( 8 0 0 C i / 1 3 1 4 1 5r m m o l ) . T o f a c i l i t a t e m u t a n t t e l o m e r a s e d e t e c t i o n , a s s a y r e a c t i o n s i n l a n e s1 0 t o 1 8 c o n t a i n e d 8 iM t o t a l d G T P , o f w h i c h a p o r t i o n w a s 2NP M[ a - 3 2 P ] d G T P ( 8 0 0 C i / m m o l ) . E x t r a c t s w e r e t r e a t e d w i t h D N a s e - f r e e R N a s e( 2 5 i ~ g / m l f o r 1 0 m i n a t 3 0 0 C ) b e f o r e t e l o m e r a s e a s s a y s ( l a n e s 1 t o 3 a n d 1 6t o 1 8 ) . F l a n k i n g l a n e s c o n t a i n D N A m a r k e r s w i t h s i z e s i n n u c l e o t i d e s ( n t ) a si n d i c a t e d . ( B t o D ) T h e s e c o n d s t r a t e g y f o r a n a l y z i n g r e p r o g r a m m i n g o ft e l o m e r a s e w i t h t e m p l a t e - m u t a t e d T R C 3 w a s t o u s e P C R p r i m e r s s p e c i f i cf o r t h e r e p e a t s e q u e n c e ( - T T G G G ) n , ( - T T G G G G ) n , o r ( - T T A G G G ) , f o u n d i nM u A , M u C , o r w i l d - t y p e ( W T ) T R C 3 , r e s p e c t i v e l y . I n ( B ) , t h e p r e s e n c e o fw i l d - t y p e t e l o m e r a s e a c t i v i t y w a s d e t e c t e d i n c e l l e x t r a c t s f r o m w i l d - t y p e ,M u A , a m d M u C c e l l s i n t h e p r e s e n c e o f a l l f o u r d e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s -p h a t e s ( d N T P s ) . I n ( C ) , c e l l e x t r a c t s w e r e f i r s t i n c u b a t e d w i t h t h e T S s u b -s t r a t e i n t h e p r e s e n c e o f o n l y d T T P a n d d G T P f o r 1 0 m i n a t r o o m t e m p e r -a t u r e t o a l l o w f o r t h e a d d i t i o n o f t e l o m e r i c r e p e a t s . We t h e n d e s t r o y e dr e s i d u a l t e l o m e r a s e a c t i v i t y b y b o i l i n g t h e e x t r a c t s f o r 5 m i n . T e l o m e r a s ep r o d u c t s w i t h s p e c i f i c D N A s e q u e n c e w e r e t h e n d e t e c t e d b y PCR a m p l i f i -c a t i o n w i t h t h e a p p r o p r i a t e r e v e r s e ( R e v . ) p r i m e r s a n d w i t h a l l f o u r d N T P s

a c t i v i t y , w h e r e a s t h e C * e x t r a c t d i d n oA s s a y s o f e x t r a c t s f r o m u n t r a n s f e c t e d c e lg a v e t h e s a m e r e s u l t a s C * . T h e s i m p l ei n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e r e s u l t s i s t h a t td d A T P - r e s i s t a n t a c t i v i t i e s r e p r e s e n t t e lm e r a s e r e p r o g r a m m e d w i t h M u C o r M uTRC3 R N A . I n c o n t r a s t , t h e 1 7 - b p i n s et i o n i n C * i n h i b i t s r e c o n s t i t u t i o n , w h ii n d i c a t e s t h a t t e l o m e r a s e r e c o n s t i t u t i o ns e n s i t i v e t o c e r t a i n a l t e r a t i o n s i n t h e TRCs e q u e n c e .T o c o n f i r m t h a t t h e s e q u e n c e s y n t h e s i zb y t h e m u t a n t M u A w a s ( G G G T T T ) n , wm o d i f i e d t h e e x i s t i n g PCR m e t h o d o l o g y fa m p l i f y i n g t e l o m e r a s e r e p e a t s ( F i g . 3 , B t oa d d e d o n t o a u n i q u e t e l o m e r a s e p r i m e r ( 1 7U s i n g s y n t h e t i c t e l o m e r a s e p r o d u c t s , wi d e n t i f i e d r e a c t i o n c o n d i t i o n s w h e r e ar e t u r n p r i m e r w i t h t h e s e q u e n c e d (CCAAACCCAAACCCAA) w o u l d a m p l

I MuC N W T I M u A ll A-+- -+-+--Cb p

- 6 5

-41

(ACCCAA)4MuQ CMMIQ. kUC C-+R N a s e + +Dn t

. 8 b p3 6 .! 2

b33

8 R e v . p r i m e r ( A A C C C C ) 3 ( C C C C A A ) a ( C C A A C C ) 3( A A C C C C ) 3a n d t r a c e a m o u n t s o f [ a - 3 2 P ] d C T P . I n l a n e N , no t e l o m e r a s e e x t r a c t wa d d e d . A s a c o n t r o l f o r M uA o r MuC s p e c i f i c i t y , t h e s y n t h e t i c t e l o m e r ap r o d u c t s A [ A A T C C G T C G A G C A G A G T T - T G G ( T T T G G G ) 4 T T T G ] o r C [C C G T C G A G C A G A G T T - G G G G ( T T G G G G ) 4 T T G G ] we r e p r e p a r e d . T o dt e c t t h e M uA o r M u C p r o d u c t s , we u s e d t h e reverse p r i m e r s ( A C C C A A ) 4( A A C C C C ) 3 a n d f o u n d t h e m t o b e s p e c i f i c f o r t h e M u A or M u C p r o d u c t .f u r t h e r t e s t s o f t h e s p e c i f i c i t y o f ou r P C R a m p l i f i c a t i o n c o n d i t i o n s , s y n t h eA o r C t e l o m e r a s e o l i g o n u c l e o t i d e s g e n e r a t e d t h e a p p r o p r i a t e 6 - n t l a dP C R p r o d u c t s w i t h ( A C C C A A ) 4 or a s i n g l e b a n d w i t h t h e ( C C C C A A ) 3verse p r i m e r , r e s p e c t i v e l y , w h e r e a s ( T T A G G G ) n o l i g o n u c l e o t i d e s d i dp r o d u c e a n y P CR p r o d u c t s w i t h t h e ( A C C C A A ) 4 o r ( C C C C A A ) 3 revep r i m e r s . ( E ) T o c o n f i r m t h e s e q u e n c e o f t h e M uC p r o d u c t s , we u s e d t hreverse p r i m e r s : ( C C C C A A ) 3 , ( A A C C C C ) 3 , a n d ( C C A A C C ) 3 , r e s p e c t i v ew h i c h g a v e P C R p r o d u c t s w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g m o b i l i t y s h i f t s . T h i s r e si s r e p r e s e n t a t i v e o f t h e p r e d i c t e d s e q u e n c e o f t h e M u C t e l o m e r a s e p ru c t s a n d i s f u r t h e r s u p p o r t e d b y t h e c o m i g r a t i o n o f M u C p r o d u c t s w i t hs y n t h e t i c C p r o d u c t s w i t h e a c h p e r m u t a t i o n o f t h e r e ve r se p r i m e r .

SC IENC E VOL. 2 6 9 * 1 SEPTEMBER 1 9 9 5

WT M u _R N a s e - + -B

b p6 44 64 0

R e v . p r i m e r ( C C C T A A ) 4

1T..l.lll.l.lll*msll(1.131.11 2 3 8

7/27/2019 Feng - RNA Component of Human Telomerase

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S 5 AST~if y o n l y ( T T T G G G ) n r e p e a t s a n d w o u ld n o ta m p l i f y r e p e a t s c o n t a i n i n g e i t h e r w i l d - t y p e( T T A G G G ) n o r M u C ( T T G G G G ) n ( 4 4 ) .U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , e x t r a c t s f r o m M uAb u t n o t f r o m w i l d - t y p e c e l l s g e n e r a t e d p r o d -u c t s i n t h e m o d i f i e d t e l o m e r a s e a s s a y ( F i g .3 C ) , w h i c h i n d i c a t e s t h a t t e l o m e r a s e f r o mM u A - c o n t a i n i n g c e l l s g e n e r a t e d ( F T T -G G G ) n r e p e a t s t h a t w e r e s i m i l a r t o s y n t h e t -i c a l l y m a d e ( T T T G G G ) n r e p e a t s ( " A " i nF i g . 3 C ) .T h e s e m e t h o d s w e r e a l s o u s e d t o a n a l y z et h e M u C m u t a n t ( F i g . 3 D ) , w h i c h s y n t h e -s i z e d ( T T G G G G ) n r e p e a t s b u t t y p i c a l l yg e n e r a t e s a s i n g l e b a n d d u r i n g t h e P CRa m p l i f i c a t i o n , a s d o e s s y n t h e t i c ( T T -G G G G ) , ( " C " i n F i g . 3 D ) . T h e s e q u e n c e o ft h e M u C p r o d u c t w a s f u r t h e r c o n f i r m e d b yp e r m u t a t i o n o f t h e M u C r e t u r n p r i m e r( C C C C A A ) 3 i n t h e PCR r e a c t i o n b y t w oo r f o u r n u c l e o t i d e s ( F i g . 3 E ) . T h e M u Cp r o d u c t w a s s h i f t e d i n r e g i s t e r b y t w o o rf o u r n u c l e o t i d e s , r e s p e c t i v e l y , a s w a s t h ec a s e w i t h s y n t h e t i c a l l y m a d e ( T T G G G G ) no l i g o m e r . T h i s c o n f i r m s t h e s e q u e n c e o f t h eMuC p r o d u c t s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e -s u l t s v e r i f y t h a t TRC3 e n c o d e s t h e RNAc o m p o n e n t o f t e l o m e r a s e . T h u s , T R C 3 w a sr e n a m e d hTR f o r h u m a n t e l o m e r a s e RNA.E x p r e s s i o n o f h T R . T h e T e t r a h y m e n a ,E u p l o t e s , a n d O x y t r i c h a t e l o m e r a s e RNAsa r e a p p a r e n t l y t r a n s c r i b e d b y RNA p o l y -m e r a s e I I I ( 6 , 2 8 - 3 0 ) . H o w e v e r , t h e p r e s -

e n c e o f r u n s o f T r e s i d u e s w i t h i n t h e t r a n -s c r i b e d r e g i o n o f h T R ( F i g . 3 ) a n d p r e l i m -i n a r y r e s u l t s i n d i c a t i n g s e n s i t i v i t y t oo - a m a n i t i n ( 3 8 ) s u g g e s t t h a t h T R m i g h t b ea n RNA p o l y m e r a s e I I t r a n s c r i p t . T o d e t e r -m i n e i f hTR i s p o l y a d e n y l a t e d [ p o l y ( A ) + ] ,p o l y ( A ) + t r a n s c r i p t s w e r e s e l e c t e d o n o l i -g o ( d T ) b e a d s ( 3 8 ) . T h e h T R r e m a i n e d i nt h e p o l y ( A ) - f r a c t i o n , w h e r e a s t h e m e s s a g ef o r g l y c e r a l d e h y d e p h o s p h a t e d e h y d r o g e -n a s e ( G A P D H ) w a s e n r i c h e d i n t h ep o l y ( A ) + f r a c t i o n , w h i c h i n d i c a t e s t h a thTR i s n o t p o l y a d e n y l a t e d . T h e l a c k o fp o l y a d e n y l a t i o n a n d a p p a r e n t t r a n s c r i p t i o nb y RN A p o l y m e r a s e I I s u g g e s t s t h a t hTRm a y b e r e g u l a t e d b y t h e s p e c i a l i z e d t r a n -s c r i p t i o n c o m p l e x c h a r a c t e r i s t i c o f s m a l ln u c l e a r RNA p r o m o t e r s ( 4 5 ) . O f t h e s m a l lRNAs c h a r a c t e r i z e d t o d a t e , o n l y U 3 h a sb e e n r e p o r t e d t o b e t r a n s c r i b e d b y d i f f e r e n tRNA p o l y m e r a s e s i n d i f f e r e n t s p e c i e s ( 4 6 ,4 7 ) . T h i s p u t a t i v e d i f f e r e n c e i n t r a n s c r i p -t i o n m a y r e f l e c t t h e c o m p l e x i t y o f r e g u l a -t i o n o f t e l o m e r a s e i n m a m m a l s c o m p a r e d t ot h a t i n t h e c i l i a t e s .T e l o m e r a s e R NA i s d i v e r g e n t b e t w e e ns p e c i e s . T h e l e n g t h o f t h e m a t u r e hTR t r a n -s c r i p t i s a p p r o x i m a t e l y 4 5 0 n u c l e o t i d e s ,w h i c h d i f f e r s f r o m t h a t i n b o t h t h e c i l i a t e s[ 1 5 3 t o 1 9 2 n u c l e o t i d e s ( n t ) ] a n d S a c c h a r o -m y c e s c e r e v i s i a e ( 1 . 3 k b ) . L i t t l e o r n o i d e n -t i t y w a s f o u n d b e t w e e n t h e p r i m a r y RN As e q u e n c e o f hTR a n d t h a t o f t h e c i l i a t e s o r

F i g . 4 . E x p r e s s i o n o f h T R i n n o r m a l _ _,_a n d i m m o r t a l i z e d c e l l s a n d n o r m a l , 0 00=ot i s s u e s . ( A ) T h e s t e a d y - s t a t e l e v e l o f _ ' ;h T R a n d GAPDH RNA w a s d e t e r - o - - -m i n e d w i t h q u a n t i t a t i v e R T - P C R , , < i s - , So m H- o( 4 3 ) . C o n t r o l s s h o w t h a t a l l P C R h T Rq u a n t i t a t i o n s w e r e i n t h e l i n e a rr a n g e u p t o 2 3 c y c l e s a n d t h a t t h e G A P D Hs i g n a l w a s a b o l i s h e d i f r e v e r s e t r a n -s c r i p t a s e w a s l e f t o u t ( r i g h t t w o . n c . -- ,,, 8l a n e s ) . R T - P C R w a s a n a l y z e d f o r R e l a t i v ehT R c o n c e n t r a t i o nf i v e n o r m a l t e l o m e r a s e - n e g a t i v e B Rc e l l l i n e s ( l a n e s 1 t o 5 ) a n d f i v e t u - _U. ' 2 0 , ) |m o r t e l o m e r a s e - p o s i t i v e c e l l s l i n e s ~ ,- ' " = > '-U( l a n e s 6 t o 1 0 ) : l a n e 1 , p r i m a r y f e t a l E c.- _. Sl u n g ; l a n e 2 , p r i m a r y f e t a l h a n d s k i n ; 0 L CC H Il a n e 3 , a d u l t p r i m a r y p r o s t a t e ; l a n e i4 , p r i m a r y s i n o v i a l f i b r o b l a s t s ; l a n e h T R5 , f o r e s k i n f i b r o b l a s t s ; l a n e 6 , m e l -a n o m a L O X ; l a n e 7 , l e u k e m i a U 2 5 x ; r R N Al a n e 8 , N C I H 2 3 l u n g c a r c i n o m a ;l a n e 9 , c o l o n t u m o r S W 6 2 0 ; l a n e1 0 , b r e a s t t u m o r M C F 7 ; l a n e 1 1 , R e l a t i v e h T R c o n c e n t r a t i o nt e s t e s ; l a n e 1 2 , b r e a s t t u m o r MCF7w i t h o u t R T ; a n d l a n e 1 3 , c o l o n t u m o r S W 6 2 0 w i t h o u t R T . PCR p r o d u c t s w e r e l a b e l e d w i t h 3 2 p , r e s o l v e db y 6 % p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r p h o r e s i s , a n d q u a n t i f i e d w i t h a P h o s p h o r l m a g e r ( M o l e c u l a r D y n a m i c s ) .R e l a t i v e s t e a d y - s t a t e t r a n s c r i p t i o n w a s n o m a l i z e d t o GAPDH a s a c o n t r o l f o r l o a d i n g a n d i s s h o w n b e l o we a c h l a n e . T e s t i s t i s s u e w a s a r b i t r a r i l y g i v e n t h e v a l u e o f 1 0 0 t o c o m p a r e t h e s e d a t a w i t h t h o s e f r o m t h eN o r t h e r n b l o t i n ( B ) . N o t e t h a t t e s t i s t i s s u e t y p i c a l l y e x p r e s s e s o n e - t h i r d o f t h e GAPDH w i t h e q u a l RNAl o a d i n g , s o t h a t t h i s t h r e e f o l d d i f f e r e n c e w a s f a c t o r e d i n t o o u r n o r m a l i z a t i o n v a l u e f o r t e s t i s t i s s u e . ( B )N o r t h e r n RNA b l o t o f h T R RNA p r e p a r e d f r o m h u m a n t i s s u e s ( 5 6 ) . T e l o m e r a s e RNA w a s d e t e c t e d i n a l lt i s s u e s , w i t h t h e h i g h e s t e x p r e s s i o n s e e n i n t e s t i s a n d o v a r y t i s s u e . A s a c o n t r o l f o r l o a d i n g , t h e b l o t wa sw a s h e d a n d r e p r o b e d f o r 1 8 S r i b o s o m a l R N A . T h e N o r t h e r n h y b r i d i z a t i o n s i g n a l s w e r e q u a n t i f i e d o n aP h o s p h o r l m a g e r , a n d t h e h T R w a s n o r m a l i z e d t o t h e 1 8 S l o a d i n g c o n t r o l . T h e r e l a t i v e s i g n a l i s i n d i c a t e db e l o w t h e b a n d s w i t h t e s t i s t i s s u e a g a i n g i v e n t h e v a l u e o f 1 0 0 .

S . c e r e v i s i a e . F i n a l l y , c o m p a r i s o n o f h T Rw i t h t h e m o u s e h o m o l o g ( 4 8 ) r e v e a lb l o c k s o f c o n s e r v e d r e g i o n s w i t h l i t t l e s i m -i l a r i t y a r o u n d t h e t e m p l a t e . I n c o n t r a s t , t h ec i l i a t e t e l o m e r a s e RNAs a r e c o n s e r v e d i nt h e t e m p l a t e r e g i o n ( 3 0 ) .T e s t e s a n d m o s t c a n c e r c e l l s h a v e t e l om e r a s e a c t i v i t y , w h e r e a s i n m o s t n o r m a ls o m a t i c h u m a n c e l l s i n a d u l t s t e l o m e r a s e in o t d e t e c t e d ( 1 7 ) . T o d e t e r m i n e i f h T RRNA i s e l e v a t e d i n t e s t i s t i s s u e a n d i m m o r -t a l c a n c e r c e l l l i n e s , w e a n a l y z e d h T R a n dGAPDH t r a n s c r i p t s f r o m f i v e m o r t a l p r im a r y c e l l s t r a i n s t h a t l a c k d e t e c t a b l e t e l o -m e r a s e a c t i v i t y a n d f r o m f i v e i m m o r t a l c a n -c e r c e l l l i n e s a n d t e s t i s t i s s u e t h a t h a v e h i g ht e l o m e r a s e a c t i v i t y . T h e s t e a d y - s t a t e c o n -c e n t r a t i o n s o f h T R t r a n s c r i p t s w e r e t w o - t os e v e n f o l d g r e a t e r i n t h e t u m o r c e l l l i n et h a n i n p r i m a r y c e l l s w h e n n o r m a l i z e d t oGAPDH m e s s e n g e r RN A ( F i g . 4 A ) . A l -t h o u g h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f hTR w e r eT a b l e 1 . E l e v e n t o 1 8 s t a b l e c l o n e s w e r e i s o l a t ef r o m e a c h t r a n s f e c t i o n s e r i e s . C l o n e s f r o m a l l i s ol a t e s d i s p l a y e d i d e n t i c a l m o r p h o l o g y a n d g r o w t hp r o f i l e s u n t i l 2 0 P D s , a t w h i c h p o i n t t h e g r o w t h om o s t o f t h e a n t i s e n s e - e x p r e s s i n g c l o n e s ( p 1 0 - 3h T R a n d p B B S - h T R ) s l o w e d . B y P D s 2 3 t o 2 6t h e s e c e l l s u n d e r w e n t c r i s i s , c h a r a c t e r i z e d b y t ha p p e a r a n c e o f e n l a r g e d a n d r o u n d e d c e l l s . H o w -e v e r , n o t a l l o f t h e c l o n e s g e n e r a t e d f r o m t hp B B S - h T R - t r a n s f e c t e d H e T e 7 c e l l s u n d e r w e nc r i s i s ; e i g h t c l o n e s e x p r e s s i n g a n t i s e n s e h T R c o nt i n u e d g r o w i n g i n a m a n n e r s i m i l a r t o t h a t o f t hc o n t r o l c u l t u r e s . C e l l s f r o m t h e c l o n e s w e r e h a rv e s t e d a t P D 2 3 , a n d t h e a v e r a g e m e a n TR Fl e n g t h s w e r e d e t e r m i n e d . T h e P v a l u e s w e r e c a lc u l a t e d b y u n p a i r e d t t e s t . A s f u r t h e r c o n t r o l s f ot h e s e e x p e r i m e n t s , a n t i s e n s e h T R o r p B B S v e c t oo n l y w e r e t r a n s f e c t e d i n t o n o r m a l h u m a n f o r e s k iB J f i b r o b l a s t c e l l s a t PD 2 2 . N o n e o f t h e f o r e s k ic l o n e s u n d e r w e n t c r i s i s e v e n a f t e r 3 8 d o u b l i n g( P D 2 2 t o PD 6 0 ) . R e p l i c a t i v e s e n e s c e n c e f o r t hB J l i n e t y p i c a l l y o c c u r s a t >PD 9 0 . T h e T R F a n a ly s i s o n t h e f o r e s k i n c l o n e s w a s d o n e a t P D 6 0 . F oe a c h s e r i e s , t h e r a t i o o f c l o n e s t h a t u n d e r w e nc r i s i s i s i n d i c a t e d i n r e l a t i o n t o t h e t o t a l . C , c o n t r o l

TR F s i z eP l a s m i d C r i s i s R a t i oM e a n S h o r tE x p e r i m e n t 1p 1 0 - 3 N o - - 0 /

p 1 0 O - 3 - h T R Y e s - - 1 8 / 1E x p e r i m e n t 2p 1 0 - 3 N o 3 . 3 0 0 . 1 4 2 . 9 6 0 / 1 1p l O - 3 - h T R Y e s 2 . 4 0 + 0 . 1 3 1 . 5 9 1 1 / 1 1E x p e r i m e n t 3p B B S N o 3 . 2 2 0 . 1 1 2 . 6 1 0 / 1p B B S - h T R a Y e s 2 . 2 3 0 . 1 9 1 . 7 1 4 /p B B S - h T R b N o 3 . 0 3 0 . 2 0 2 . 4 6 0 /C o n t r o lN o n e N o 3 . 1 5 0 . 0 9 2 . 9 6 CF o r e s k i n c o n t r o lp B B S N o 7 . 5 0 / 4p B B S - h T R N o 7 . 5 0 / 3N o n e N o 7 . 5 C

SCIENCE V O L . 2 6 9 1 SEPTEMBER 1 9 9 5 1 2 3

7/27/2019 Feng - RNA Component of Human Telomerase

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p r e s e n t i n t h e i m m o r t a l c a n c e r c e l l s t h a te x p r e s s e d h i g h t e l o m e r a s e a c t i v i t y , s m a l lb u t r e a d i l y d e t e c t a b l e a m o u n t s o f h T RR N A w e r e a l s o p r e s e n t i n m o r t a l p r i m a r yc e l l s t h a t l a c k e d d e t e c t a b l e t e l o m e r a s e a c -t i v i t y . T e s t i s t i s s u e , w h i c h h a s h i g h t e l o -m e r a s e a c t i v i t y , h a d l a r g e a m o u n t s o f h T RR N A , a s e x p e c t e d .E x p r e s s i o n o f hTR w a s a l s o e x a m i n e d i na v a r i e t y o f n o r m a l h u m a n t i s s u e s b y N o r t h -e r n b l o t a n a l y s i s . O v a r y t i s s u e h a d l a r g ea m o u n t s o f h T R , t h o u g h n o t a s l a r g e a s t h a tf o u n d i n t e s t i s t i s s u e . H o w e v e r , a n u m b e r o fo t h e r t i s s u e s a l s o e x p r e s s e d hTR ( F i g . 4 B ) .T h e s e i n c l u d e n o r m a l k i d n e y , p r o s t a t e , a n da d u l t l i v e r t i s s u e , a l l o f w h i c h l a c k d e t e c t -a b l e a m o u n t s o f t e l o m e r a s e a c t i v i t y ( 1 7 ) .T h e s e r e s u l t s c o n f i r m t h e d a t a f r o m c e l ll i n e s ( F i g . 4 A ) a n d i n d i c a t e t h a t t e l o -m e r a s e RNA i s p r e s e n t i n a n u m b e r o fh u m a n t i s s u e s . B e c a u s e t e l o m e r a s e a c t i v i t yi s n o t d e t e c t e d i n m o s t s o m a t i c t i s s u e s , t h ep r e s e n c e o f h T R s u g g e s t s ( b a r r i n g a s s a y f a i l -u r e ) t h a t h T R i s i n a c t i v e i n t h e s e t i s s u e s .S i m i l a r t i s s u e - s p e c i f i c d i f f e r e n c e s i n t e l o -m e r a s e RNA e x p r e s s i o n c a n b e s e e n i nm o u s e t i s s u e s ( 4 8 ) . H o w e v e r , m a n y n o r m a lm o u s e t i s s u e s h a v e t e l o m e r a s e a c t i v i t y ( 4 9 ,5 0 ) . T h u s , t e l o m e r a s e a c t i v i t y p a r a l l e l s t e l o -m e r a s e R NA c o n c e n t r a t i o n s i n m i c e , b u tn o t i n h u m a n s . P e r h a p s t h e p r o t e i n c o m p o -n e n t s o f t e l o m e r a s e a r e s t r i n g e n t l y r e g u l a t -e d i n h u m a n b u t n o t m o u s e c e l l s , w h i c hF i g . 5 . A n t i s e n s e h T R l e a d s t o as h o r t e r m e a n T R F a n d c e l l c r i s i s .T h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t sw e r e d o n e i n w h i c h H e T e 7 c e l l s( H e L a c e l l s t h a t e x p r e s s l a r g ea m o u n t s o f t h e t e t r a c y c l i n e r e p r e s -s o r - V P 1 6 c h i m e r i c p r o t e i n ) w e r et r a n s f e c t e d b y e l e c t r o p o r a t i o n w i t he i t h e r p l a s m i d p 1 0 - 3 - h T R , e x p r e s s -i n g a n t i s e n s e h T R u n d e r c o n t r o l o ft h e t e t r a c y c l i n e - V P 1 6 - i n d u c e d c y -t o m e g a l o v i r u s m i n i m a l p r o m o t e r( 5 4 ) o r p B B S - h T R , e x p r e s s i n g a n t i -s e n s e h T R u n d e r t h e c o n t r o l o f t h eM PS V p r o m o t e r ( 5 4 ) . [ I n t h e s e e x -p e r i m e n t s , n o r e g u l a t i o n b y t e t r a c y -c l i n e w a s o b s e r v e d ( 5 7 ) . ] A s a c o n -t r o l , H e T e 7 c e l l s w e r e a l s o t r a n s -f e c t e d w i t h t h e p a r e n t a l v e c t o r u n d e rt h e s a m e c o n d i t i o n s . A l l p 1 0 - 3 - h T Ra n d p B B S - h T R c l o n e s w e r e s h o w nt o e x p r e s s a n t i s e n s e t r a n s c r i p t s . ( A )TR F a n a l y s i s i s s h o w n f o r e x p e r i -m e n t 2 . N u c l e a r DNA f r o m t h eH e T e 7 c l o n e s w a s p u r i f i e d , c u t w i t hH i n f a n d R s a I , a n d r u n o n a 0 . 5 %a g a r o s e g e l . T h e DN A w a s p r o b e di n t h e g e l w i t h a n [ a - 3 2 P ] - l a b e l e d( T T A G G G ) 3 o l i g o n u c l e o t i d e t o l a b e lt h e t e l o m e r i c T R F . S i z e m a r k e r s a r es h o w n o n t h e l e f t i n k i l o b a s e s . ( B )T h e m e a n TR F i s s h o w n f o r e a c ha n t i s e n s e a n d c o n t r o l c l o n e i n e x -

AM

* Io6 -5 - A4 - -3- ~

1-~ ?iB 4 -

3 . 5 -3 -

c 2 . 5 -c 2 -Z 1 . 5 -

1 00 . 5 -

c o u l d e x p l a i n w h y m o u s e c e l l s s p o n t a n e o u s -l y i m m o r t a l i z e i n c u l t u r e , w h e r e a s h u m a nc e l l s d o n o t ( 5 1 ) .E x p r e s s i o n o f a n t i s e n s e h TR t r a n -s c r i p t s i n H e L a c e l l s . T o e x a m i n e t h e f u n c -t i o n o f t e l o m e r a s e i n a n i m m o r t a l i z e d c e l l ,w e i n t r o d u c e d a n t i s e n s e hTR e x p r e s s i o nc o n s t r u c t s i n t o H e L a c e l l s ( 5 2 ) . I n p a r a l l e l ,c o n t r o l e x p r e s s i o n v e c t o r s l a c k i n g t h e a n t i -s e n s e h T R c o d i n g s e q u e n c e w e r e a l s o e l e c -t r o p o r a t e d i n t o H e L a c e l l s . C l o n e s c o n t a i n -i n g a n t i s e n s e o r c o n t r o l p l a s m i d s w e r e s e -l e c t e d i n t h r e e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s ( T a b l e1 ) . I n i t i a l l y , t h e 4 1 c u l t u r e s e x p r e s s i n g a n -t i s e n s e hTR g r e w t h e s a m e a s t h o s e o f c e l l sw i t h t h e c o n t r o l v e c t o r . H o w e v e r , a t 2 3 t o2 6 p o p u l a t i o n d o u b l i n g s ( P D s ) a f t e r t r a n s -f e c t i o n , 3 3 o u t o f 4 1 a n t i s e n s e - e x p r e s s i n gc u l t u r e s u n d e r w e n t c r i s i s ( F i g . 5 A ) . I n c o n -t r a s t , n o n e o f t h e c o n t r o l c l o n e s ( H e T e 7w i t h v e c t o r a l o n e o r t h e t e l o m e r a s e - n e g a -t i v e f o r e s k i n c e l l s w i t h h T R a n t i s e n s e e x -p r e s s i o n ) w e n t i n t o c r i s i s .C e l l c r i s i s i n t h e h T R a n t i s e n s e H e T e 7c u l t u r e s w a s c h a r a c t e r i z e d b y a m a r k e d i n -h i b i t i o n i n c e l l g r o w t h f r o m 2 0 t o 2 6 P D sa n d t h e n t h e r o u n d i n g u p a n d d e t a c h m e n to f c e l l s f r o m t h e p l a t e o v e r a p e r i o d o f 1w e e k . I n 2 8 o u t o f 3 3 c a s e s i n w h i c h t h ec e l l s u n d e r w e n t c r i s i s , r a r e ( < 1 p e r c e n t )r e v e r t a n t c o l o n i e s w e r e o b s e r v e d w h e n c u l -t u r e s w e r e m a i n t a i n e d f o r 3 w e e k s a f t e r t h ec r i s i s e v e n t . T h e r e v e r t a n t s m a y r e p r e s e n t

A n t i s e n s e C o n t r o lp l 0 - 3 - h T R p 1 0 - 3C 1 2 3 4 5 6 789 1011 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 C

A n t i s e n s e C o n t r o l-n

m RlJill I I I I I I I l I I lJl1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 234567891011p e r i m e n t 2 . T h e TR F g e l w a s s c a n n e d w i t h a P h o s p h o r l m a g e r , a n d t h e m e a n T R F q u a n t i f i e d a s d e s c r i b e dp r e v i o u s l y ( 1 1 ) . A h o r i z o n t a l l i n e m a r k s t h e a v e r a g e m e a n TR F f o r t h e a n t i s e n s e a n d c o n t r o l v e c t o r g r o u p s .

v a r i a n t s t h a t e s c a p e t h e i n h i b i t i n g e f f e c t ot h e a n t i s e n s e h T R c o n s t r u c t . I n c o n t r a s t tt h e a n t i s e n s e c l o n e s , n o n e o f t h e v e c t oc o n t r o l c e l l l i n e s h a d a n y c h a n g e i n g r o w to r m o r t a l i t y o v e r 5 0 d o u b l i n g s . I n a d d i t i o nn o r m a l y o u n g f o r e s k i n f i b r o b l a s t s w i t h l o nt e l o m e r e s a n d n o d e t e c t a b l e t e l o m e r a ss h o w e d n o e f f e c t o f t h e a n t i s e n s e c o n s t r u c tf o r a t l e a s t 3 8 d o u b l i n g s a f t e r t r a n s f e c t i o nT o d e t e r m i n e i f t e l o m e r e l e n g t h a nt e l o m e r a s e i n h i b i t i o n c o r r e l a t e d w i t h c e lc r i s i s i n t h e a n t i s e n s e - e x p r e s s i n g c l o n e s , wa s s a y e d t e l o m e r e l e n g t h ( 1 1 ) a n d t e l om e r a s e a c t i v i t y ( 1 7 ) i n s e v e r a l p r e c r i s i s c o nt r o l a n d e x p e r i m e n t a l c o l o n i e s a t 2 3 P Da f t e r t r a n s f e c t i o n . A l l c o l o n i e s c o n t a i n i nt h e c o n t r o l v e c t o r h a d m e a n TRF ( t e r m i n ar e s t r i c t i o n f r a g m e n t ) l e n g t h s ( 3 . 3 0 a n d 3 . 2k b f o r e x p e r i m e n t s 2 a n d 3 i n T a b l e 1s i m i l a r t o t h o s e i n t h e p a r e n t c e l l l i n e ( 3 . 1k b ) , w h e r e a s c l o n e s c o n t a i n i n g t h e a n t is e n s e v e c t o r c o n s t r u c t s t h a t u n d e r w e n t c r is i s h a d m e a n TRF l e n g t h s o f 2 . 4 0 a n d 2 . 2k b - t h a t i s , t h e y w e r e 2 7 t o 3 1 p e r c e ns h o r t e r t h a n t h o s e o f t h e v e c t o r c o n t r oc l o n e s . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t t e l o m e rr e p e a t s w e r e l o s t i n t h e a n t i s e n s e - c o n t a i ni n g c l o n e s a s a r e s u l t o f i n h i b i t i o n o f t e l om e r a s e a c t i v i t y .T o t e s t t h i s d i r e c t l y , w e a s s a y e d t e l om e r a s e a c t i v i t y i n 1 4 o f t h e c l o n e s i n e xp e r i m e n t 3 . T e l o m e r a s e a c t i v i t y w a s g e n e ra l l y l o w b u t d e t e c t a b l e i n m a n y o f t h e a nt i s e n s e c l o n e s ( 5 3 ) , a l t h o u g h t h e p r e s e n co f s h o r t e n e d t e l o m e r e s s u g g e s t s t h a t t ha m o u n t o f a c t i v i t y w a s n o t s u f f i c i e n t tm a i n t a i n t e l o m e r e l e n g t h , a s t h e m e a n TRFf e l l f r o m 3 . 2 2 t o 2 . 2 3 k b ( P = 0 . 0 0 0 4 ) it h e f o u r c l o n e s t h a t w e n t i n t o c r i s i s . I n t he i g h t c l o n e s t h a t c o n t a i n t h e a n t i s e n s e v e ct o r ( p B B S - h T R b ) b u t d i d n o t e n t e r c r i s i st e l o m e r e l e n g t h w a s n o t s i g n i f i c a n t lc h a n g e d ( 3 . 0 3 v e r s u s 3 . 2 2 ; P = 0 . 3 5 5 ) , a nt e l o m e r a s e a c t i v i t y w a s s i m i l a r t o t h a t oc o n t r o l s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s s u pp o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t t e l o m e r e l o s s l e a dt o c r i s i s a n d c e l l d e a t h o n c e t e l o m e r e s a rs h o r t e n e d t o a c r i t i c a l l e n g t h . T h e i n d u ct i o n o f c e l l c r i s i s i n H e L a c e l l s e x p r e s s i na n t i s e n s e hTR d e m o n s t r a t e s t h e p o t e n t i ao f t e l o m e r a s e i n h i b i t i o n a s a t h e r a p e u t ia p p r o a c h f o r t r e a t i n g h u m a n c a n c e r .

REFERENCES A ND NOTES1 . H . J . M u l l e r , C o l l e c t . N e t 1 3 , 1 8 1 ( 1 9 3 8 ) .2 . B . M c C l i n t o c k , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 2 5 , 4 0( 1 9 3 9 ) .3 . J . W a t s o n , N a t u r e 2 3 9 , 1 9 7 ( 1 9 7 2 ) .4 . A . O l o v n i k o v , J . T h e o r . B i o l . 4 1 , 1 8 1 ( 1 9 7 3 ) .5 . C . W . G r e i d e r a n d E . H . B l a c k b u r n , C e l l 4 3 , 4 0( 1 9 8 5 ) .6 . G . L . Y u , J . D . B r a d l e y , L . D . A t t a r d i , E . H . B l a c k b u r nN a t u r e 3 4 4 , 1 2 6 ( 1 9 9 0 ) .7 . C . B . H a r l e y , A . B . F u t c h e r , C . W . G r e i d e r , i b i d . 3 4 54 5 8 ( 1 9 9 0 ) .8 . N . D . H a s t i e e t a l . , i b i d . 3 4 6 , 8 6 6 ( 1 9 9 0 ) .9 . C . B . H a r l e y , M u t a t . R e s . 2 5 6 , 2 7 1 ( 1 9 9 1 ) .1 0 . J . L i n d s e y , N . I . M c G i l l , L . A . L i n d s e y , D . K . G r e e n , H

SCIENCE VOL. 2 6 9 1 SE PTEMBER 1 9 9 5

[

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1 2 4 0

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S * &m

J . C o o k e , i b i d . , p . 4 5 .1 1 . R . C . A l l s o p p e t a l . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 9 ,1 0 1 1 4 ( 1 9 9 2 ) .1 2 . C . M . C o u n t e r e t a l . , EMBO J . 1 1 , 1 9 2 1 ( 1 9 9 2 ) .1 3 . H . V a z i r i e t a l . , A m . J . H u m . G e n e t . 5 2 , 6 6 1 ( 1 9 9 3 ) ; H .V a z i r i e t a l . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 9 1 , 9 8 5 7( 1 9 9 4 ) .1 4 . D . B r o c c o l i , J . Y o u n g , T . d e L a n g e , i b i d . , i n p r e s s .1 5 . C . M . C o u n t e r , F . M . B o t e l h o , P . W a n g , C . B . H a r l e y ,S . B a c c h e t t i , J . V i r o l . 6 8 , 3 4 1 0 ( 1 9 9 4 ) .1 6 . P . N i l s s o n , C . M e h l e , K . R e m e s , G . R o o s , O n c o g e n e9 , 3 0 4 3 ( 1 9 9 4 ) .1 7 . N . W . K i m e t a l . , S c i e n c e 2 6 6 , 2 0 1 1 ( 1 9 9 4 ) .1 8 . A . J . K l i n g e l h u t z , S . A . B a r b e r , P . P . S m i t h , K . D y e r ,J . K . M c D o u g a l l , M o l . C e l l . B i o l . 1 4 , 9 6 1 ( 1 9 9 4 ) .1 9 . T . D e L a n g e e t a l . , i b i d . 1 0 , 5 1 8 ( 1 9 9 0 ) .2 0 . D . J . A d a m s o n , D . J . K i n g , N . E . H a i t e s , C a n c e rG e n e t . C y t o g e n e t . 6 1 , 2 0 4 ( 1 9 9 2 ) .2 1 . J . K . S m i t h a n d G . Y e h , A m . J . O b s t e t . G y n e c o l . 1 6 7 ,1 8 8 3 ( 1 9 9 2 ) .2 2 . K . H o l z m a n n e t a l . , G e n e s C h r o m o s o m e s C a n c e r 6 ,1 7 8 ( 1 9 9 3 ) .2 3 . H . S . S c h w a r t z , G . A . D a h i r , M . G . B u t l e r , C a n c e rG e n e t . C y t o g e n e t . 7 1 , 1 3 2 ( 1 9 9 3 ) .2 4 . C . M . C o u n t e r , H . W . H i r t e , S . B a c c h e t t i , C . B . H a r -l e y , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 9 1 , 2 9 0 0 ( 1 9 9 4 ) .2 5 . K . H i y a m a l e t a l . , i n P r o c . A m . A s s o c . C a n c e r R e s .3 6 , 5 5 4 ( 1 9 9 5 ) .2 6 . C . M . C o u n t e r , J . G u p t a , C . B . H a r l e y , B . L e b e r , S .B a c c h e t t i , B l o o d 8 5 , 2 3 1 5 ( 1 9 9 5 ) .

2 7 . E . H i y a m a e t a l . , N a t u r e M e d . 1 , 2 4 9 ( 1 9 9 5 ) .2 8 . C . W . G r e i d e r a n d E . H . B l a c k b u r n , N a t u r e 3 3 7 , 3 3 1( 1 9 8 9 ) .2 9 . D . S h i p p e n - L e n t z a n d E . H . B l a c k b u r n , S c i e n c e 2 4 7 ,5 4 6 ( 1 9 9 0 ) .3 0 . J . L i n g n e r , L . L . H e n d r i c k , T . R . C e c h , G e n e s D e v . 8 ,1 9 8 4 ( 1 9 9 4 ) .3 1 . M . S . S i n g e r a n d D . E . G o t t s c h l i n g , S c i e n c e 2 6 6 , 4 0 4( 1 9 9 4 ) ; M . J . M c E a c h e r n a n d E . H . B l a c k b u r n , N a -t u r e , i n p r e s s .3 2 . A . A . A v i l i o n , L . A . H a r r i n g t o n , C . W . G r e i d e r , D e v .G e n e t . 1 3 , 8 0 ( 1 9 9 2 ) .3 3 . G . B . M o r i n , C e l l 5 9 , 5 2 1 ( 1 9 8 9 ) .3 4 . T o e n r i c h f o r p o t e n t i a l t e l o m e r a s e R N A s , we f o l -l o w e d t w o p r o c e d u r e s : s u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n t or e m o v e h i g h - a b u n d a n c e common s e q u e n c e s o rp a r t i a l t e l o m e r a s e p u r i f i c a t i o n . I n t h e s u b t r a c t i o n a p -p r o a c h , a P C R - a m p l i f i a b l e cDNA l i b r a r y f r o m t e l o -m e r a s e - p o s i t i v e c e l l s w a s h y b r i d i z e d t o a n e x c e s s o fP C R - a m p l i f i e d c D N A s p r o d u c e d f r o m t e l o m e r a s e -n e g a t i v e c e l l s . I n t h i s c a s e , t o t a l RNA f r o m t e l o -m e r a s e - p o s i t i v e 2 9 3 c e l l s o r t e l o m e r a s e - n e g a t i v eI M R 9 0 c e l l s w a s s i z e - s e l e c t e d o n a n a g a r o s e g e l ,m a d e i n t o d o u b l e - s t r a n d e d cDNA w i t h r e v e r s e t r a n -s c r i p t a s e , l i g a t e d t o o l i g o n u c l e o t i d e a r m s , a n d a m -p l i f i e d b y P C R . C o n t r o l e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a ts u b t r a c t i o n h y b r i d i z a t i o n o f t h e 2 9 3 c e l l l i b r a r y b y t h eI M R 9 0 c e l l l i b r a r y d e p l e t e d t h e t e l o m e r a s e - p o s i t i v e2 9 3 c e l l l i b r a r y o f m o s t h i g h - a b u n d a n c e commons e q u e n c e s . I n t h e s e c o n d a p p r o a c h , t e l o m e r a s ef r o m S 1 0 0 e x t r a c t s o f 2 9 3 c e l l s w a s p a r t i a l l y p u r i f i e dw i t h DEAE i o n e x c h a n g e a n d s e p h a c r y l s i z i n g c o l -u m n s , t h e n b y s e d i m e n t a t i o n t h r o u g h a g l y c e r o l g r a -d i e n t . A cDNA l i b r a r y w a s p r e p a r e d f r o m t h e t o t a lRNA o f t h e p e a k g r a d i e n t f r a c t i o n s , l i g a t e d t o o l i g o -n u c l e o t i d e a r m s , a n d a m p l i f i e d b y P C R .3 5 . C . A u t e x i e r a n d C . W . G r e i d e r , G e n e s D e v . 8 , 5 6 3( 1 9 9 4 ) ; G . - L . Y u a n d E . H . B l a c k b u r n , C e l l 6 7 , 8 2 3( 1 9 9 1 ) .3 6 . T e l o m e r a s e RN A cDNA c a n d i d a t e s w e r e s e l e c t e d b yh y b r i d i z a t i o n t o t h e b i o t i n y l a t e d 2 ' - O - m e t h y l RN Ao l i g o n u c l e o t i d e ( 5 ' - U U A G G G U U A G I I - 3 ' b i o t i n , i nw h i c h i s i n o s i n e ) t h a t c o n t a i n e d t w o f u l l c o p i e s o ft h e p r e d i c t e d t e l o m e r i c r e p e a t i n t h e human t e l o -m e r a s e t e m p l a t e . T h e c D N A s t h a t h y b r i d i z e d t o t h i sb i o t i n y l a t e d o l i g o n u c l e o t i d e w e r e c a p t u r e d w i t hs t r e p t a v i d i n - m a g n e t i c b e a d s ( P r o m e g a ) a n d r e a m -p l i f i e d b y P C R .3 7 . J . F e n g , S . L e , C . W . G r e i d e r , B . V i l l e p o n t e a u , u n -p u b l i s h e d r e s u l t s .

3 8 . A . A . A v i l i o n , t h e s i s , S t a t e U n i v e r s i t y o f New Y o r k ,S t o n y B r o o k ( 1 9 9 5 ) .3 9 . DN A w a s i s o l a t e d f r o m 2 9 3 c e l l s a n d d i g e s t e d w i t hB g l I I p l u s E c o R I , E c o R I a l o n e , E c o R I p l u s H i n d I I I ,H i n d I I I a l o n e , P s t I , o r S p e p l u s X b a I . T h e r e s t r i c t e dDN A w a s r u n o n a n a g a r o s e g e l , S o u t h e r n b l o t t e d ,a n d p r o b e d w i t h a n [ a - 3 2 P ] - l a b e l e d TRC3 cDNA f r a g -m e n t o f 1 8 6 b p . S i z e s e x p e c t e d f o r TRC3 b a s e d o nt h e l a m b d a c l o n e ( 1 . 0 , 4 . 2 , 1 . 3 , > 2 . 4 , 0 . 9 7 , a n d 1 . 6 )w e r e o b s e r v e d i n t h e g e n o m i c S o u t h e r n b l o t . T h i sl a b e l e d T R C 3 p r o b e a l s o s p e c i f i c a l l y h y b r i d i z e d t oc h r o m o s o m e 3 i n a s o m a t i c c e l l h y b r i d p a n e l . T h ec h r o m o s o m e 3 l o c a t i o n o f t h e T R C 3 w a s n a r r o w e d t ot h e d i s t a l e n d o f 3 q b y c h r o m o s o m e i n s i t u s u p p r e s -s i o n h y b r i d i z a t i o n [ I . P a r r a a n d B . W i n d l e , N a t u r e G e n -e t . 5 , 1 7 ( 1 9 9 3 ) ] w i t h t h e u s e o f a T R C 3 - s e l e c t e dg e n o m i c l a m b d a c l o n e l a b e l e d w i t h b i o t i n - 1 6 - d e -o x y u r i d i n e t r i p h o s p h a t e ( d U T P ) a s a p r o b e . C h r o m o -s o m e 3 w a s i d e n t i f i e d w i t h a c h r o m o s o m e 3 - s p e c i f i cc e n t r o m e r i c DN A ( w h i c h w a s l a b e l e d w i t h d i g o x i g e -n i n - 1 1 - d U T P ) a s a p r o b e .4 0 . RNA w a s e x t r a c t e d f r o m p u r i f i e d t e l o m e r a s e p r e p a -r a t i o n s a n d w a s t h e n u s e d i n t h e f o l l o w i n g e x p e r i -m e n t s . T h e m e t h o d o f t h e 5 ' e n d m a p p i n g w a s a sf o l l o w s . F i r s t - s t r a n d cDNA w a s m a d e w i t h a n t i s e n s eTRC3 p r i m e r s ( R 3 B : 5'-CAACGAACGGCCAGCAG-C T G A C A T T ) i n t h e p r e s e n c e o f [ a - 3 2 P ] d A T P . E x t e n -s i o n p r o d u c t s w e r e r e s o l v e d b y p o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s , i d e n t i f i e d b y a u t o r a d i o g r a p h y , e x -c i s e d , a n d e x t r a c t e d . A n o l i g o n u c l e o t i d e ( N o t A : 5 ' -p A T A G C G G C C G C T T G C C T T C A ) w a s l i g a t e d t ot h e s e f i r s t - s t r a n d p r o d u c t s w i t h T 4 RNA l i g a s e , a n dPCR w a s t h e n d o n e w i t h a n e s t e d p r i m e r R 3 c ( 5 ' -G T T T G C T C T A G A A T G A A C G G T G G A A G ) a n d a n o l i -g o n u c l e o t i d e ( N o t B : 5'-TGAATTCTTGCGGCCGC-T A T ) c o m p l e m e n t a r y t o t h e N o t A o l i g o n u c l e o t i d e .PCR p r o d u c t s w e r e r e s o l v e d o n a g a r o s e g e l s , e x -c i s e d , a n d s e q u e n c e d d i r e c t l y w i t h o l i g o n u c l e o t i d eG 1 ( 5 ' - A G A A A A A C A G C G C G C G G G G A G C A A A G C A )a s a p r i m e r . T h e m e t h o d f o r t h e 3 ' e n d m a p p i n g w a sa s f o l l o w s . A n R T - P C R s t r a t e g y w a s f i r s t u s e d i nw h i c h a s e r i e s o f a n t i s e n s e p r i m e r s c o m p l e m e n t a r y t ot h e g e n o m i c DN A s e q u e n c e p r i m e d f i r s t - s t r a n d cDNAs y n t h e s i s . T h e p r i m e r s i n t h i s s e r i e s w e r e s p a c e d a ta p p r o x i m a t e l y 1 5 0 - b p i n t e r v a l s s t a r t i n g f r o m t h e 5 'e n d o f t h e t r a n s c r i p t . PCR w a s t h e n d o n e w i t h t h ef i r s t - s t r a n d p r i m e r a n d a p r i m e r w h o s e s e q u e n c e w a si n t e r n a l t o t h e k n o w n TRC3 t r a n s c r i p t ( F 3 b : 5 ' - T C T A -A C C C T A A C T G A G A A G G G C G T A G ) . R e v e r s e t r a n -s c r i p t a s e - s e n s i t i v e PCR b a n d s o f t h e p r e d i c t e d s i z ew e r e s e e n w i t h cDNA m a d e w i t h a l l p r i m e r s d e s i g n e dt o t h e i n t e r v a l +9 6 t o + 4 4 6 b u t n o t w i t h a n y o f t h ep r i m e r s d e s i g n e d t o + 5 5 4 t o + 9 4 6 . T R C 3 r u n s a t- 4 5 0 b a se s o n N o r t h e m b l o t s , w h i c h p l a c e s t h e p u -t a t i v e 3 ' e n d o f t h e m a t u r e T R C 3 t r a n s c r i p t a t + 4 5 0 ,a l t h o u g h l o n g e r T R C 3 t r a n s c r i p t s o u t t o + 5 4 1 h a v eb e e n d e t e c t e d b y R T - P C R .4 1 . D . H . P e r e z , L . V i l a n d e r , W . H . A n d r e w s , R . H o l m e s ,J . B i o l . C h e m . 2 6 9 , 2 2 4 8 5 ( 1 9 9 4 ) .4 2 . W . F u n k a n d J . F e n g , u n p u b l i s h e d d a t a . B o t h t r a n -s i e n t a n d s t a b l e t r a n s f o r m a n t s w e r e g e n e r a t e d . R T -P CR w a s u s e d t o m e a s u r e e n d o g e n o u s a n d m u t a n tTRC3 a m o u n t s . T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e i n a c t i v e1 7 - b a s e i n s e r t RNA i n t h e a n a l y z e d c l o n e s ( M u C * )w a s > 1 0 - f o l d h i g h e r t h a n t h e e n d o g e n o u s RNA l e v e li n o t h e r c l o n e s t h a t w e r e a n a l y z e d . A s t o t h e l e v e l s o fm u t a n t t e m p l a t e h T R ( M u C o r M u A ) i n t r a n s f e c t e dc e l l s c o m p a r e d w i t h t h e e n d o g e n o u s h T R l e v e l s , wed i d n o t o b s e r v e m u c h c h a n g e i n t h e o v e r a l l a m o u n t o fh T R i n a n y o f o u r m u t a n t c e l l s ( w i t h t h e e x c e p t i o n o ft h e i n a c t i v e M u C * m u t a n t s ) . We e s t i m a t e t h a t i n o u rh i g h e s t e x p r e s s i n g c l o n e s - 1 0 p e r c e n t o f t h e w i l d -t y p e t e l o m e r a s e a c t i v i t y wa s c o n v e r t e d t o m u t a n t a c -t i v i t y . A s e x p e c t e d w i t h s u c h a l o w l e v e l o f m u t a n tt e l o m e r a s e , we d i d n o t n o t i c e a n y e f f e c t o n H T 1 0 8 0v i a b i l i t y , c o l o n y n u m b e r , o r g r o w t h r a t e .4 3 . J . I r v i n g , J . F e n g , C . W i s t r o m , M . P i k a a r t , B . V i l l e p o n -t e a u , E x p . C e l l R e s . 2 0 2 , 1 6 1 ( 1 9 9 2 ) .4 4 . F o r M u A , t h e P CR w e n t f o r 2 7 c y c l e s ( 9 4 C , 1 0 s ;6 0 C , 3 0 s ; a n d 7 2 C , 3 0 s ) . T h e P CR c o n d i t i o n s

u s e d f o r MuC w e r e t h e s a m e a s t h o s e f o r M u A ,e x c e p t t h a t t h e a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e w a s 5 0 C . A l lPCR c o n d i t i o n s w er e c h ec k e d f o r s p e c i f i c i t y w i t hs y n t h e t i c M u A, M uC , a n d w i l d - t y p e t e l o m e r a s ep r o d u c t s . W i t h t h e u s e o f t h e s p e c i f i c MuA ( A C -C C A A ) 4 o r MuC ( A A C C C C ) 3 r e t u r n p r i m e r s , n o m u -t a n t t e l o m e r a s e p r o d u c t s w e r e g e n e r a t e d f r o m e x -t r a c t s o f p a r e n t a l c e l l s o r c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h t h ew i l d - t y p e TRC3 g e n e . T h u s , t h e PCR p r o d u c t s s p e -c i f i c a l l y i n d i c a t e d t h a t t h e s e w e r e d i a g n o s t i c f o r Mu Aa n d M uC DNA s e q u e n c e s .4 5 . N . H e r n a n d e z , i n T r a n s c r i p t i o n a l R e g u l a t i o n , S . L .M c K n i g h t a n d K . R . Y a m a m o t o , E d s . ( C o l d S p r i n gH a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y ,1 9 9 2 ) , p p . 2 8 1 - 3 1 3 .4 6 . T . K i s s , C . M a r s h a l l s a y , W . F i l i p o w i c z , C e l l 6 5 , 5 1 7( 1 9 9 1 ) .4 7 . C . M a r s h a l l s a y , S . C o n n e l l y , W . F i l i p o w i c z , P l a n t M o l .B i o l . 1 9 , 9 7 3 ( 1 9 9 2 )4 8 . M . A . B l a s c o , W . F u n k , B . V i l l e p o n t e a u , C . W .G r e i d e r , S c i e n c e 2 6 9 , 1 2 6 7 ( 1 9 9 5 ) .4 9 . K . R . P r o w s e a n d C . W . G r e i d e r , P r o c . N a t l . A c a d .S c i . U . S . A . 9 2 , 4 8 1 8 ( 1 9 9 5 ) .5 0 . C . C h a d e n e a u , P . S i e g e l , C . B . H a r l e y , W . M u l l e r , S .B a c c h e t t i , O n c o g e n e 1 1 , 8 4 1 ( 1 9 9 5 ) .5 1 . R . A . M i l l e r , C a n c e r 6 8 , 2 4 9 6 ( 1 9 9 1 ) .5 2 . A 2 0 0 - b p E c o R I DN A f r a g m e n t c o n t a i n i n g n u c l e o t i -d e s 1 t o 1 8 5 o f TRC3 w a s i n s e r t e d i n t o t h e E c o R Is i t e s o f p 1 0 - 3 a n d p B B S 2 1 2 t o m a k e t h e p l a s m i d sp 1 0 - 3 - h T R a n d p B B S - h T R , r e s p e c t i v e l y . P l a s m i dp 1 0 - 3 - h T R e x p r e s s e s t h e a n t i s e n s e o f h T R u n d e rt h e c o n t r o l o f t h e t e t r a c y c l i n e - r e g u l a t e d c y t o m e g a -l o v i r u s m i n i m a l p r o m o t e r [ M . G o s s e n a n d H . B u i a r d ,P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 9 , 5 5 4 7 ( 1 9 9 2 ) ] . P l a s -m i d p B B S - h T R e x p r e s s e s t h e a n t i s e n s e o f h T R u n -d e r t h e c o n t r o l o f t h e MPSV p r o m o t e r ( 5 4 ) .5 3 . B e c a u s e o f t h e s m a l l c e l l p o p u l a t i o n s , t e l o m e r a s ea c t i v i t y w a s a s s a y e d f o r t h e s a m p l e s i n e x p e r i m e n t 3b y t h e PCR m e t h o d ( 1 7 ) , w hi c h h a s l i m i t e d u s e a s aq u a n t i t a t i v e a s s a y . H e T e 7 c e l l s t h a t e x p r e s s e d t h ea n t i s e n s e v e c t o r a n d w e n t i n t o c r i s i s h a d s o m e o n e -f i f t h o f t h e t e l o m e r a s e a c t i v i t y f o u n d i n v e c t o r c o n t r o l s .I n c o n t r a s t , t h o s e a n t i s e n s e c l o n e s t h a t d i d n o t g oi n t o c r i s i s a v e r a g e d t h r e e - f i f t h s o f t h e t e l o m e r a s e a c -t i v i t y f o u n d i n t h e c o n t r o l v e c t o r c l o n e s .5 4 . J . - H . L i n , M . W a n g , W . H . A n d r e w s , R . W y d r o , J .M o r s e r , G e n e 1 4 7 , 2 8 7 ( 1 9 9 4 ) .5 5 . T h e PCR p r i m e r s f o r F i g . 1 a r e a s f o l l o w s : T R C 3 ,

CTAACCCTATCTGAGTTGGGCGTA a n d C A A C G -G A C A G A C A G C A G C T G A C A T ; T R C 4 , ACCCTAACA-GCTAAATCAAGGACC a n d GGAGTGCAAGACCAA-G G G T T C T G G ; T R C 1 , TTGCTCATGAGGTCATGTC-CCCGGAA a n d G G A G G A A T T G C C T T A G G G T T A G ;a n d R N a s e P , GGAAGGTCTGAGACTAG a n d A T C T -CCTGCCCAGTCTC.5 6 . F . S a n g e r , S . N i c k l e n , A . R . C o u l s e n , P r o c . N a t l .A c a d . S c i . U . S . A . 7 4 , 5 4 6 3 ( 1 9 7 7 ) .5 7 . T o t a l 2 9 3 RNA w a s p r e p a r e d b y g u a n i d i n i u m t h i o -c y a n a t e a n d p h e n o l c h l o r o f o r m e x t r a c t i o n , a n d t i s -s u e RNAs w e r e o b t a i n e d f r o m C l o n e t e c h . T o t a lRNA ( 3 0 j g ) w a s l o ad ed o n t o a 1 . 5 % a g a r o s e -f o r m a l d e h y d e g e l a n d t r a n s f e r r e d o n t o H y b o n d N .T h e b l o t w a s p r o b e d w i t h a n [ a - 3 2 P ] - l a b e l e d RNAc o m p l e m e n t a r y t o t h e h u m a n t e l o m e r a s e R N A .5 8 . T h e e x p e r i m e n t s w i t h p 1 0 - 3 - h T R w e r e d o n e i n t h ea b s e n c e o f t e t r a c y c l i n e , b e c a u s e c o n t r o l e x p e r i -m e n t s w i t h l u c i f e r a s e o r a n t i s e n s e h T R u n d e r t h ec o n t r o l o f t h e t e t r a c y c l i n e - V P 1 6 - i n d u c e d c y t o -m e g a l o v i r u s m i n i m a l p r o m o t e r s h o w e d t h a t t h ep r e s e n c e o r a b s e n c e o f t e t r a c y c l i n e h a d l i t t l e e f f e c to n l u c i f e r a s e o r a n t i s e n s e h T R e x p r e s s i o n i n H e T e 7c e l l s . I n e a r l y e x p e r i m e n t s w i t h a n t i s e n s e h T R c o n -s t r u c t s i n H e T e 7 c e l l s , t h e c e l l s s t i l l u n d e r w e n t c r i -s i s a t 2 3 t o 2 6 P D s i n t h e p r e s e n c e o f t e t r a c y c l i n e .5 9 . S u p p o r t e d b y G e r o n C o r p o r a t i o n a n d b y g r a n tA G 0 9 3 8 3 ( C . W . G . a n d C . B . H . ) f r o m N I H . We t h a n kG . H u a n g a n d P . H o f o r s k i l l e d t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .2 M a y 1 9 9 5 ; a c c e p t e d 1 0 A u g u s t 1 9 9 5

SCIENCE V O L . 2 6 9 1 SEPTEMBER 1 9 9 5

.j.1 2 4 1