DE ONTWIKKELING VAN EEN DROOG ......DANKWOORD Vooreerst wens ik Prof. dr. apr. J.P. Remon te...

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Geneesmiddelenleer

Laboratorium voor Farmaceutische Technologie

Academiejaar 2008-2009

DE ONTWIKKELING VAN EEN DROOG POEDERAEROSOL VOOR

MASSAVACCINATIE VAN PLUIMVEE TEGEN NEWCASTLE DISEASE

Mieke MORLION

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor

Prof. dr. apr. J.P. Remon

Commissarissen

Prof. dr. apr. C. Vervaet

Dr. ir. B. De Geest

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik

valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de

verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze

masterproef.”

2 juni 2009

Promotor

Prof. dr. J.P. Remon

Auteur

Mieke Morlion

DANKWOORD

Vooreerst wens ik Prof. dr. apr. J.P. Remon te bedanken voor

het ter beschikking stellen van het labo en de apparatuur

en voor de algemene leiding van deze thesis.

In het bijzonder wens ik apr. K. Huyge te bedanken voor

de enthousiaste dagelijkse begeleiding en de vlotte samenwerking.

Door de interessante uiteenzettingen ben ik heel geboeid geraakt door

dit onderzoek en zal ik dan ook in de toekomst met veel plezier

verdere ontwikkelingen volgen.

Hierbij ook dank aan de assistenten en het personeel van het laboratorium

voor de aangename sfeer en de helpende handen.

Tenslotte wil ik graag mijn ouders bedanken die mij de mogelijkheid hebben gegeven

om farmacie te studeren. Ook dank ik mijn vriend Pieter die altijd voor mij

klaar heeft gestaan tijdens mijn studies, voor zijn aanmoedigingen en zijn geduld.

INHOUDSOPGAVE

1. INLEIDING .................................................................................................................. 1

1.1. NEWCASTLE DISEASE ................................................................................................... 2

1.1.1. Etiologie en Pathogenese ..................................................................................... 2

1.1.2. Klinische symptomen ........................................................................................... 3

1.1.3. Preventie en controlemaatregelen ...................................................................... 4

1.2. VACCINATIE BIJ PLUIMVEE .......................................................................................... 4

1.2.1. Newcastle disease vaccins.................................................................................... 4

1.2.1.1. Geïnactiveerde vaccins ................................................................................. 4

1.2.1.2. Levend-geattenueerde vaccins ..................................................................... 5

1.2.2. Vaccinatiemethoden ............................................................................................ 6

1.2.2.1. Individuele vaccinatie ................................................................................... 6

1.2.2.2. Massavaccinatie ............................................................................................ 7

1.3. DROGE POEDERS VOOR INHALATIE ALS GENEESMIDDELVEHIKEL .............................. 9

2. OBJECTIEVEN ........................................................................................................... 10

3. MATERIALEN ............................................................................................................ 11

3.1. MANNITOL ................................................................................................................. 11

3.2. TREHALOSE ................................................................................................................ 12

3.3. MYO-INOSITOL ........................................................................................................... 12

3.4. POLYVINYLPYRROLIDONE .......................................................................................... 13

3.5. BOVINE SERUM ALBUMINE ....................................................................................... 14

4. METHODEN .............................................................................................................. 15

4.2. STABILITEITSONDERZOEK VAN NEWCASTLE DISEASE VACCIN IN GESPROEIDROOGDE

POEDERS ............................................................................................................................... 15

4.1.1. Productie van droge poeders via sproeidrogen ................................................. 15

4.1.1.1. Principe ....................................................................................................... 15

4.1.1.2. Methode ...................................................................................................... 16

4.1.2. Karakterisatie van de gesproeidroogde poeders ............................................... 17

4.1.2.1. Virustitratie ................................................................................................. 17

4.1.2.2. Bepaling van hygroscopiciteit via Dynamic Vapour Sorption (DVS) ........... 19

4.1.2.3. Vochtgehaltebepaling via Karl Fischer titratie ............................................ 20

4.1.2.4. Meting van de partikelgrootte via Laserdiffractie ...................................... 21

4.1.2.5. Partikeldensiteit bepaling via heliumpycnometrie ..................................... 23

4.1.2.6. Scanning elektronenmicroscoop (SEM) ...................................................... 25

4.2. INVLOED VAN SPROEIDROOGPARAMETERS OP DE PARTIKELGROOTTE EN

VOCHTGEHALTE VAN POEDERS: EEN EXPERIMENTEEL DESIGN .......................................... 26

4.2.1. Inleidende begrippen ......................................................................................... 26

4.2.2. Design opzet ....................................................................................................... 28

4.2.3. Evaluatie van de poederstalen ........................................................................... 29

4.2.4. Analyse van het experimenteel design .............................................................. 30

4.2.4.1. Evaluatie van de ruwe data ......................................................................... 30

4.2.4.2. Lineaire regressie analyse ........................................................................... 30

4.2.4.3. Gebruik van het model ............................................................................... 33

5. RESULTATEN EN DISCUSSIE ...................................................................................... 34


POEDERS ............................................................................................................................... 34

5.1.1. Karakterisatie van de gesproeidroogde poeders ............................................... 34

5.1.1.1. Virustitraties ................................................................................................ 34

5.1.1.2. Bepaling van de hygroscopiciteit via Dynamic Vapour Sorption (DVS) ...... 35

5.1.1.3. Vochtgehaltebepaling via Karl Fischer titratie ............................................ 36

5.1.1.4. Meting van partikelgrootte via laserdiffractie ............................................ 37

5.1.1.5. Partikeldensiteit via heliumpycnometer ..................................................... 39

5.1.1.6. SEM ............................................................................................................. 40

5.2. INVLOED VAN SPROEIDROOGPARAMETERS OP DE PARTIKELGROOTTE EN HET

VOCHTGEHALTE VAN POEDERS: EEN EXPERIMENTEEL DESIGN .......................................... 41

5.2.1. Evaluatie van de poederstalen ........................................................................... 41

5.2.2 Analyse van het experimenteel design .............................................................. 42

5.2.2.1. Evaluatie van de ruwe data ......................................................................... 42

5.2.2.2. Lineaire regressie analyse ........................................................................... 42

5.2.2.3. Gebruik van het model ............................................................................... 45

6. CONCLUSIE .............................................................................................................. 47

7. LITERATUURLIJST ..................................................................................................... 49

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

BSA Bovine Serum Albumin

DVS Dynamic Vapour Sorption

EID50 Egg infectious dose 50% endpoint

G-6-P Glucose-6-Fosfaat

H Hemagglutinine

HA-test Hemagglutinatie-test

ICPI Intracerebrale pathogeniciteitsindex

IgA Immunoglobuline A

Ino Myo-inositol

Man Mannitol

N Neuraminidase

NCD Newcastle Disease

PBS Phosphate Buffered Saline

PVP Polyvinylpyrrolidone

RBC Rode bloedcellen

RH Relatieve vochtigheid

SEM Scanning elektronenmicroscoop

Treh Trehalose

1

1. INLEIDING

Door de snelle groei van de pluimvee-industrie de voorbije jaren, is het belang van

vaccinatie bij pluimvee sterk toegenomen. Grote aantallen dieren zitten vaak dicht op elkaar

gehuisd waardoor de uitbraak van ziektes reëel is, wat een groot verlies kan betekenen voor

de landbouwer. Vele Europese landen voorzien daarom ook in een wettelijk verplicht

vaccinatieschema voor pluimvee (https://bedrijfsnet.pve.agro.nl). Ook in België dient de

pluimveehouder zich aan een strikt schema te houden waar vooral de nadruk gelegd wordt

op Newcastle Disease.

Er bestaat binnen het dierenrijk een vaccinatieschema per klasse. Dit wordt verder

onderverdeeld in orden, families, geslachten en soorten. Binnen het schema van het

pluimvee krijgt elke ondersoort een vaccinatieschema zoals weergegeven in Tabel 1.1.

TABEL 1.1.: KLASSIEK VACCINATIESCHEMA VOOR KIPPEN

(http://www.bcfi-vet.be)

Leeftijd Toediningswijze Reproductie-dieren

Legkippen Mestkippen Label mestkippen

1 dag Intramusculair Spray

Marek’s disease Newcastle disease Bronchitis


Newcastle disease Bronchitis


2 à 4 weken

Drinkwater of spray

Newcastle disease Gumboro




7 à 12 weken

Drinkwater of spray

Newcastle disease Bronchitis

Newcastle disease

14 à 18 weken

Drinkwater of spray Intramusculair

Encefalomyelitis Newcastle disease Newcastle disease

Encefalomyelitis Newcastle disease Newcastle disease

2

1.1. NEWCASTLE DISEASE

1.1.1. Etiologie en Pathogenese

Newcastle Disease (NCD) of de pseudovogelpest is een uiterst besmettelijke

respiratoire aandoening bij vogels, veroorzaakt door het aviair Paramyxovirus type 1. Dit is

een (-)ssRNA-virus van de familie van de Paramyxoviridae. De ziekte werd voor het eerst

gerapporteerd in 1926 in Java, Indonesië en in 1927 in Newcastle upon Tyne in Groot-

Brittannië (Alexander et al., 2004). Daar zorgde het virus voor hoge mortaliteit onder het

pluimvee en was het de aanleiding voor 180 uitbraken in 11 verschillende landen (Brown,

1965).

Het Newcastle Disease virus bestaat uit een enkelvoudige RNA-streng ingesloten in een

omhulsel van proteïnen, het capsomeer. Het capsomeer bevat twee types proteïnen die

cruciaal zijn voor de aanhechting van het virus op de gastheercel, namelijk het

hemagglutinine (H) en het neuraminidase (N) (Seal et al, 1999). Deze proteïnen zijn in staat

mutatie te ondergaan waardoor de affiniteit van het virus voor bepaalde gastheercellen kan

wijzigen.

FIGUUR 1.1. : NEWCASTLE DISEASEVIRUS

(http://www.isracast.com)

Het virus kan door de vogels opgenomen worden via inademing, het drinken van water

of het eten van voer gecontamineerd met mest of speeksel van geïnfecteerde vogels.

Virusoverdracht van besmette wilde vogels op gedomesticeerde vogels kan plaatsvinden

door direct contact of via de lucht door inhalatie van besmette stofdeeltjes of waterdruppels

(http://www.gddeventer.com).

3

De ernst van de ziekte is afhankelijk van de vogelsoort, de individuele gevoeligheid van

het dier en de virulentie van het NCD virus. Dit laatste kan worden weergegeven via de

intracerebrale pathogeniteitsindex (ICPI). Naargelang de virulentie van het virus worden vier

verschillende stammen onderscheiden. In dalende virulentie zijn dat de velogene,

mesogene, lentogene en avirulente stammen (Gallili et al.,1998).

1.1.2. Klinische symptomen

De meest virulente stammen van het NCD-virus, dus met de hoogste ICPI, zijn de

velogene stammen. Deze worden verder onderverdeeld in viscerotropische en

neurotropische stammen, die respectievelijk hemorragische intestinale letsels en acute

respiratoire en nerveuze problemen veroorzaken. Hemorragische intestinale lestels uiten

zich in maag-darm klachten waaronder diarree. Bij de respiratoire aandoening zijn hoesten

en naar lucht happen vaak voorkomende problemen terwijl bij een nerveuze aandoening

verlamming en het vertonen van een draaihals kunnen voorkomen (zie Figuur 1.2).

Besmetting met deze velogene stammen kan leiden tot acute sterfte binnen de

pluimveepopulatie (Gallili et al., 1998).

FIGUUR 1.2. : KIP MET DRAAIHALS

(http://www.daff.gov.au)

Mesogene stammen zijn minder virulent en veroorzaken voornamelijk respiratoire

aandoeningen en occasioneel nerveuze symptomen met lage mortaliteit bij volwassen

kippen. Bij jonge kippen kan besmetting met deze stammen wel leiden tot een hoge uitval.

De minst virulente stam is de lentogene stam (lage ICPI). Deze veroorzaakt milde

respiratoire infecties, verminderde leg en vervormde eierschalen bij geïnfecteerde dieren. Bij

besmetting met avirulente stammen worden de kippen niet of nauwelijks ziek.

De lentogene en avirulente stammen worden voornamelijk aangewend voor de

productie van NCD vaccins.

4

1.1.3. Preventie en controlemaatregelen

Een uitbraak van NCD kan verhoed worden door geïnfecteerde dieren uit te roeien en

door preventief te werk te gaan. Hierbij moet vooral belang gehecht worden aan de hygiëne

en bioveiligheid in de pluimveeboerderijen. Zo is het zinvol om broederijen af te zonderen

van pluimveeboerderijen en elke vogelsoort op een verschillende plaats te kweken. Ook

voldoende toevoer van vers water is van groot belang (Alexander et al., 2004). In de

preventie tegen NCD is niet enkel het optimaliseren van de levensomstandigheden

noodzakelijk, maar ook het vaccineren van de kippen.

1.2. VACCINATIE BIJ PLUIMVEE

Voor een succesvolle vaccinatie van kippen moeten de vaccins op een efficiënte

manier worden toegediend. Afhankelijk van de leeftijd van de kip en of het om leg-, mest- of

reproductiedieren gaat, bestaan er verschillende vaccinatiemethoden en zijn er

verschillende types vaccins beschikbaar.

1.2.1. Newcastle disease vaccins

Na het toedienen van een vaccin tegen een bepaald microörganisme wordt bij het dier

een immuunrespons opgewekt zonder dat de ziekte zich uit. Op die manier wordt de ziekte

niet uitgelokt bij een volgend contact met de natuurlijke variant van het pathogeen.

Er bestaan verschillende soorten NCD vaccins, waaronder de geïnactiveerde en de

levend-geattenueerde de voornaamste zijn.

1.2.1.1. Geïnactiveerde vaccins

Geïnactiveerde vaccins, waaronder het Clone 30 (http://www.bcfi-vet.be), worden

bereid door het NCD virus te laten groeien in eieren en vervolgens te behandelen met een

inactiverende stof zoals formaline of betapropiolacton. Om het virus immunogener te maken

wordt een adjuvant zoals minerale olie of aluminiumzout toegevoegd aan het geïnactiveerd

virus (Alexander et al., 2004). Deze hulpstoffen kunnen soms lokale of systemische toxische

reacties veroorzaken. Verdere nadelen van geïnactiveerde vaccins zijn dat er hogere

dosissen moeten aangewend worden en de vaccinatiefrequentie moet worden opgedreven.

Dit laatste is het gevolg van het feit dat het virus niet meer in staat is om zich te

5

vermenigvuldigen in de gevaccineerde vogel of zich te verspreiden naar andere vogels. Deze

vaccins worden daarom voornamelijk in individuele vaccinatiemethoden gebruikt, zoals

parenterale toediening (http://www.oie.int).

1.2.1.2. Levend-geattenueerde vaccins

Een levend-geattenueerd virus wordt bekomen door het natuurlijke pathogeen te

isoleren en op te kweken in bebroede eieren. De cellen van deze bebroede eieren bevatten

licht gewijzigde proteïnenreceptoren, waardoor het virus minder efficiënt zal adheren aan

deze gastheercellen en de cellen dus moeilijker kan infecteren. Wanneer er toch een infectie

optreedt, betekent dit dat het virus een mutatie heeft ondergaan ter hoogte van de

proteïnenmantel waardoor de adhesie aan de cellen met gewijzigde proteïnenreceptoren

mogelijk werd. Na isolatie en opzuivering kan dit geattenueerde virus als vaccin worden

toegediend. Door de gewijzigde proteïnenmantel kan het virusvaccin de cellen van kippen

onvoldoende efficiënt gaan infecteren waardoor het zijn pathogeniciteit verliest, maar niet

zijn immunogeniciteit (www.nvi-vaccin.nl).

Levend-geattenueerde NCD vaccins, zoals La Sota (http://www.bcfi-vet.be), hebben

een hogere virulentie in vergelijking met geïnactiveerde. Hierdoor is het mogelijk dat het

gevaccineerde dier ziek wordt en dat er klinische symptomen optreden, voornamelijk ter

hoogte van de respiratoire tractus.

Het voordeel van een levend virus is dat het zich na vaccinatie nog kan

vermenigvuldigen in de gastheer. Het gevolg hiervan is dat de vaccinatie met levend-

geattenueerde vaccins minder frequent moeten gebeuren en hierbij lagere dosissen kunnen

aangewend worden dan met geïnactiveerde vaccins. Het virus kan zich immers van het ene

dier naar het andere verspreiden. Bovendien zijn levend-geattenueerde vaccins aangewezen

om een langdurig immunologisch geheugen tot stand te brengen (Alexander et al., 2004).

1.2.2. Vaccinatiemethoden

1.2.2.1. Individuele vaccinatie

De meest effectieve manier om pluimvee te vaccineren is via oogdruppelapplicatie. Elk

dier wordt hierbij individueel gemanipuleerd en krijgt een volle dosis vaccin.

FIGUUR 1.3. : OOGDRUPPELVACCINATIE

(http://www.fao.org)

Intramusculaire injectie is de meest aangewende methode voor de toediening van

geïnactiveerde vaccins en sommige levend

meestal ter hoogte van de borst, poot of nek. De plaats van injectie is van groot belang om

granulomavorming, verlamming, zwelling of leverpunctie te voorkomen

Meer en meer wordt er nu ook gezocht naar vaccins die in

worden. Hierbij worden de bevruchte eieren na 18 dagen incubatie in de broedstoof

geïnoculeerd met vaccin. Het virus wordt geïnjecteerd in de amnionvloeistof van het ei

waardoor het embryo in contact komt met het vaccin. Door replicatie van het virusvaccin in

het bebroede ei worden hogere concentraties aan virus bekomen. Dit leidt tot vorming van

beschermende antilichamen in het behandelde embryo

Individuele vaccinatie is duur en tijdrovend aangezien het in de pluimvee

meestal om grote aantallen kippen gaat en er getraind personeel nodig is voor het toedienen

van het vaccin. Daarom wordt er binnen de pluimvee

geopteerd.

6

natie



OOGDRUPPELVACCINATIE

(http://www.fao.org)


geïnactiveerde vaccins en sommige levend-geattenueerde vaccins. De injectie gebeurt


ranulomavorming, verlamming, zwelling of leverpunctie te voorkomen (Cargill, 1999).

Meer en meer wordt er nu ook gezocht naar vaccins die in-ovo kunnen toegediend


rd met vaccin. Het virus wordt geïnjecteerd in de amnionvloeistof van het ei



beschermende antilichamen in het behandelde embryo (Sharma et al., 1985).

Individuele vaccinatie is duur en tijdrovend aangezien het in de pluimvee


et vaccin. Daarom wordt er binnen de pluimvee-industrie vaak voor massavaccinatie




geattenueerde vaccins. De injectie gebeurt


(Cargill, 1999).

ovo kunnen toegediend


rd met vaccin. Het virus wordt geïnjecteerd in de amnionvloeistof van het ei



(Sharma et al., 1985).

Individuele vaccinatie is duur en tijdrovend aangezien het in de pluimvee-industrie


industrie vaak voor massavaccinatie

7

1.2.2.2. Massavaccinatie

Drinkwatervaccinatie is een veelgebruikte methode voor het toedienen van levend-

geattenueerde vaccins. Bij drinkwatervaccinatie wordt het vaccin ter hoogte van de gastro-

intestinale mucosa opgenomen wat leidt tot mucosale immuniteit. De mucosale immuniteit

wordt verworven nadat het virusvaccin in de mucosa is binnengedrongen. Als reactie op de

invasie zal de mucosa antilichamen, meer bepaald immunoglobuline A (IgA), produceren die

bij een volgend contact het pathogeen onmiddellijk zullen neutraliseren. Het voordeel van

deze mucosale immuniteit uit zich voornamelijk bij ziektes waar het pathogeen het

organisme via de mucosa binnendringt. Bovendien wordt het virusvaccin vanuit de mucosa

opgenomen in het bloed waardoor ook een systemische immuunrespons wordt bekomen.

Wanneer de ziekte verworven wordt via ingestie van het pathogeen zoals bij infectieuze

bursale ziekte (Gumboro ziekte) is drinkwatervaccinatie een geschikte vaccinatiemethode

(Goya et al., 2008). Het nadeel van drinkwatervaccinatie bestaat erin dat het gevriesdroogde

vaccin gereconstitueerd moet worden in water waarna het omwille van zijn beperkte

stabiliteit in water binnen de 2 uur toegediend moet zijn. Daarenboven kunnen variabele

waterkwaliteit en restanten van desinfectantia in de drinkbakken de inactivatie van het

gereconstitueerde virusvaccin versterken en zo de tijdspanne tussen reconstitutie en

toediening aanzienlijk verkorten (Cargill, 1999).

Spray- en aerosolvaccinatie zijn methoden waarbij het vaccin onder de vorm van een

nevel respiratoir aan de dieren wordt toegediend. Hierbij wordt het gevriesdroogde vaccin,

net zoals bij drinkwatervaccinatie, gereconstitueerd in water waarna het door een

vernevelingstoestel over de kippen verstoven wordt. De gegenereerde nevel bestaat uit

vloeistofdruppels die door de kippen worden geïnhaleerd. Aangezien het vaccin geïnhaleerd

moet worden door de kip is de druppelgroottedistributie van de nevel cruciaal voor een

efficiënte vaccinatie. Ook de leeftijd van de kip bepaalt mee hoe groot de vaccindruppels

moeten zijn om een goede vaccinatie te bekomen. Voor deze toepassing zijn reeds

verschillende vernevelingstoestellen commercieel beschikbaar. Het type vernevelaar bepaalt

de druppelgroottedistributie van de nevel waarvan de gewenste distributie op zijn beurt

afhangt van de leeftijd van de kip.

8

Bij ééndagskuikens gebeurt de primaire vaccinatie voornamelijk via sprayvaccinatie. De

sprayvernevelaar genereert nevels met een druppelgroottedistributie rond 60-500 µm. De

kleinste druppels kunnen geïnhaleerd worden door de kuikens, terwijl de grotere druppels

op de kuikens neervallen en vervolgens oraal of via het oog opgenomen kunnen worden. Het

is belangrijk dat de vaccindruppels niet te klein zijn (i.e. < 20 µm). Door de bekademhaling

van deze kuikens zouden ze in de diepe luchtwegen kunnen doordringen en zo hevige

postvaccinale entreacties kunnen opwekken.

De secundaire vaccinatie van 2 weken en 4 weken oude kippen gebeurt meestal via

aerosolvaccinatie. De vernevelaars die hiervoor gebruikt worden genereren aerosols met

kleinere druppelgroottedistributies rond 35-250 µm. Bij secundaire vaccinatie zijn de diepe

luchtwegen van de kip het target om een optimale immuunrespons te verkrijgen. Vandaar

dat de gewenste druppelgroottedistributies van de aerosolen kleiner zijn dan bij primaire

vaccinatie. De ideale partikelgroottes voor secundaire vaccinatie van kippen werden

vastgelegd door Corbanie et al, 2006 in een depositiestudie. Twee weken oude kippen

worden het best met 5 µm entpartikels gevaccineerd, terwijl vier weken oude kippen ideaal

met 10 µm entpartikels gevaccineerd worden.

Het vernevelen van het vaccin als vloeistof brengt verschillende moeilijkheden met

zich mee. Het virusvaccin wordt tijdens het vernevelen geïnactiveerd. Bij de vorming van de

aerosol zijn shearkrachten werkzaam op het virusvaccin dat daardoor beschadigd geraakt.

Vervolgens wordt het virusvaccin ook geïnactiveerd in de tijdspanne tussen verneveling en

inhalatie. Dit is te wijten aan het ongecontroleerd indrogen van de vloeistofdruppels tijdens

de verneveling. Bovendien kan moeilijk ingeschat worden tot welke grootte de

vloeistofdruppels zullen indrogen. Hierdoor kan de exacte druppelgroottedistributie en dus

de depositie van de druppels in de luchtwegen van de kippen moeilijk vastgelegd worden.

Tenslotte genereren de gebruikte vernevelingstoestellen aerosolen met zeer brede

druppelgroottedistributies waarvan de fractie aan grotere druppels niet beschikbaar is voor

inhalatie.

Al deze factoren dragen bij tot een verminderde efficiëntie van de spray- en

aerosolvaccinatiemethode.

9

1.3. DROGE POEDERS VOOR INHALATIE ALS GENEESMIDDELVEHIKEL

Om een oplossing te bieden voor de problemen die de klassieke spray- en

aerosolvaccinatie met zich meebrengen, wordt geopteerd voor de ontwikkeling van een

droog poederaerosol. Het gebruik van droge poedervaccins leidt ertoe dat reconstitutie van

het vaccin in water onnodig wordt en dat ongecontroleerde indroging van vaccindruppels

vermeden wordt.

Het ontwikkelen van droge poederaerosolen voor vaccinatie wordt ook reeds

onderzocht binnen de humane geneeskunde (Amorij et al., 2008; LiCalsi et al., 2001).

Droge poederaerosolen worden vaak geproduceerd via vriesdrogen met vervolgens

een vermalingsstap tot gewenste deeltjesgrootte. De nadelen van batchproductie en een

weinig reproduceerbare vermalingsstap hebben ertoe geleid een ander productieproces

voor droge poedervaccins te kiezen, namelijk sproeidrogen.

Sproeidrogen is een goedkope techniek waarbij een vloeistof in een éénstapsproces

verwerkt kan worden tot een poeder. Met dit continue proces kunnen poeders verkregen

worden met relatief kleine partikelgroottedistributies. Omdat het proces bij hoge

temperaturen gebeurt, worden stabilisatoren toegevoegd aan de sproeidroogoplossing om

zo thermolabiele stoffen, zoals virusvaccins te beschermen tijdens het proces en tijdens de

bewaring.

10

2. OBJECTIEVEN

Newcastle disease is een besmettelijke ziekte bij vogels die veroorzaakt wordt door het

aviair Paramyxovirus type 1. Vooral kippen zijn gevoelig voor het virus en kunnen bij

besmetting talrijk sterven, wat een groot verlies voor de landbouwer betekent. Vaccinatie

speelt een belangrijke rol in de preventie van de uitbraak van deze ziekte. Een veel gebruikte

massavaccinatietechniek voor pluimvee is spray- en aerosolvaccinatie. Om de problemen

van de klassieke spray- en aerosolvaccinatie, zoals reconstitutie van het vaccin en

ongecontroleerde indroging van de vaccindruppels te omzeilen wordt geopteerd voor droge

poederaerosolen voor de massavaccinatie van pluimvee. Droge poederaerosolen kunnen

geproduceerd worden via sproeidrogen.

In een eerste luik van het onderzoek worden verschillende poedercombinaties aan

stabilisatoren onderzocht op hun vaccinstabiliserend vermogen tijdens het

sproeidroogproces alsook na 1 maand bewaring bij 6°C en 20°C. Verder worden ook de

poederkarakteristieken zoals vochtgehalte, deeltjesgrootte, hygroscopiciteit,

partikeldensiteit en morfologie onderzocht met respectievelijk Karl Fischer titraties,

laserdiffractie, dynamic vapour sorption, heliumpycnometrie en scanning

elektronenmicroscopie. Zo kan de bruikbaarheid van deze formulaties als droge

poederaerosolen ingeschat worden.

Om tot een beter begrip te komen in de effecten van de sproeidroogprocesparameters

op de resulterende poederkarakteristieken zoals partikelgrootte en vochtgehalte wordt een

full factorial experimenteel design opgesteld. De onderzochte procesparameters zijn het

vaste stofgehalte van de sproeidroogoplossing (feed), de feedsnelheid, de airflow en de

inlaattemperatuur.

3. MATERIALEN

3.1. MANNITOL

Mannitol is een wit, geurloos kristallijn poeder dat polymorfisme

suikeralcohol met structuurformule C

gedroogd sap van de manna

Commercieel wordt mannitol

monosacchariden zoals glucose en mannose. Door zijn lage hygroscopiciteit en laag

vochtgehalte wordt mannitol vaak toegevoegd aan formulaties met vochtigheidsgevoelige

actieve componenten. Mannitol is stabiel in droge vorm en in een waterige oplossing. Het

wordt gebruikt als stabilisator in droge poeder inhalatoren om proteïnes te beschermen.

Mannitol komt ook na sproeidrogen kristallijn voor. Tijdens het sproeidroogproces kan

dit nadelig zijn voor het vaccin aangezien het virus in een kristalrooster wordt getrokken,

waarbij het kan worden beschadigd. Aangezien een kristalrooster een stabiele moleculaire

configuratie is, kan dit echter wel in het voordeel werken van het vaccin tijdens de bewar

Een amorfe stof kan tijdens bewaring evolueren naar een kristallijne structuur wat de

integriteit van het vaccin kan verstoren. Tijdens het droogproces zouden amorfe stoffen

thermolabiele producten zoals vaccins en proteïnen wel goed kunnen beschermen

al., 2002). Om de voordelen van zowel kristallijne als amorfe stoffen te bekomen, wordt

mannitol vermengd met stoffen die amorf zijn na sproeidrogen.

FIGUUR 3.1.: MOLECULAIRE STRUCTUUR VAN MANNITOL

(http://upload.wikimedia.org

11

Mannitol is een wit, geurloos kristallijn poeder dat polymorfisme vertoont. Het is een

suikeralcohol met structuurformule C6H8(OH)6, dat bekomen wordt door extractie van het

gedroogd sap van de manna-es en andere natuurlijke bronnen zoals zeewieren.

geproduceerd door katalytische of elektrolytische reductie van



nitol is stabiel in droge vorm en in een waterige oplossing. Het



n voor het vaccin aangezien het virus in een kristalrooster wordt getrokken,


configuratie is, kan dit echter wel in het voordeel werken van het vaccin tijdens de bewar



thermolabiele producten zoals vaccins en proteïnen wel goed kunnen beschermen

Om de voordelen van zowel kristallijne als amorfe stoffen te bekomen, wordt

mannitol vermengd met stoffen die amorf zijn na sproeidrogen.

MOLECULAIRE STRUCTUUR VAN MANNITOL

http://upload.wikimedia.org)

vertoont. Het is een

dat bekomen wordt door extractie van het

es en andere natuurlijke bronnen zoals zeewieren.

geproduceerd door katalytische of elektrolytische reductie van



nitol is stabiel in droge vorm en in een waterige oplossing. Het



n voor het vaccin aangezien het virus in een kristalrooster wordt getrokken,


configuratie is, kan dit echter wel in het voordeel werken van het vaccin tijdens de bewaring.



thermolabiele producten zoals vaccins en proteïnen wel goed kunnen beschermen (Rowe et

Om de voordelen van zowel kristallijne als amorfe stoffen te bekomen, wordt

3.2. TREHALOSE

Trehalose is commercieel beschikbaar als trehalose dihydraat

poeder van geurloze, witte kristallen. Het natuurlijk voorkomend isomeer bestaat uit twee

glucose moleculen, α,α-1,1 gebonden. De voornaamste natuurlijke bronnen van trehalose

zijn de plant Trehala manna en de fungi. Oorspronkelijk we

maar door de lage opbrengst werd een productieschema ontwikkeld waarbij trehalose uit

zetmeel wordt verkregen via een enzymatisch proces.

In de natuur beschermt trehalose organismen tegen droogte, bevriezing en osmotisc

druk. Door de hoge thermostabiliteit en een breed pH

de meest stabiele sacchariden. Het zorgt onder extreme omgevingscondities voor de

stabilisatie van membranen en andere macromoleculaire assemblages

Ondanks de hoge hygroscopiciteit en het hoge vochtgehalte wordt trehalose toch als

stabilisator in formulaties gebruikt. Het komt na sproeidrogen namelijk als amorfe stof voor

wat voordelig kan zijn voor de stabilisatie van het virusvaccin tijde

Bovendien heeft het zich reeds als stabilisator voor thermolabiele stoffen tijdens

droogprocessen gemanifesteerd

FIGUUR 3.2. : MOLECULAIRE STRUCTUUR VAN TREHALOSE

(http://en.wikipedia.org

3.3. MYO-INOSITOL

Myo-inositol is een cyclisch polyol met structuurformule

gesynthetiseerd uit glucose-6

12

Trehalose is commercieel beschikbaar als trehalose dihydraat wat voorkomt als een


1,1 gebonden. De voornaamste natuurlijke bronnen van trehalose

zijn de plant Trehala manna en de fungi. Oorspronkelijk werd trehalose uit gist geëxtraheerd,


zetmeel wordt verkregen via een enzymatisch proces.

In de natuur beschermt trehalose organismen tegen droogte, bevriezing en osmotisc

druk. Door de hoge thermostabiliteit en een breed pH-stabiliteitsbereik, is trehalose een van


stabilisatie van membranen en andere macromoleculaire assemblages (Higashiya



wat voordelig kan zijn voor de stabilisatie van het virusvaccin tijdens het sproeidroogproces.


droogprocessen gemanifesteerd (Rowe et al., 2002).

MOLECULAIRE STRUCTUUR VAN TREHALOSE

http://en.wikipedia.org)

inositol is een cyclisch polyol met structuurformule C6H

6-fosfaat in twee stappen. Na isomerisatie van G

wat voorkomt als een


1,1 gebonden. De voornaamste natuurlijke bronnen van trehalose

rd trehalose uit gist geëxtraheerd,


In de natuur beschermt trehalose organismen tegen droogte, bevriezing en osmotische

stabiliteitsbereik, is trehalose een van


(Higashiyama, 2002).



ns het sproeidroogproces.


H12O6. Het wordt

fosfaat in twee stappen. Na isomerisatie van G-6-P tot myo-

inositol-1-fosfaat onstaat na defosforylatie myo

hygroscopiciteit en een laag vochtgehalte.

In een studie van Burger et al.

gebruikt voor het stabiliseren van virusvaccins tijdens het droogproces en de bewaring

achteraf. Aangezien het zuivere product moeili

met mannitol aangewend.

FIGUUR 3.3. : MOLECULAIRE STRUCTUUR VAN MYO

(http://upload.wikimedia.org

3.4. POLYVINYLPYRROLIDONE

Polyvinylpyrrolidone (PVP) is een wateroplosbaar polymeer afgeleid van het

monomeer N-vinylpyrrolidone. Het is een wit tot lichtgeel poeder met een amorf en

hygroscoop karakter. Het voorkomt de rekristallisatie van amorfe suikers tijdens bewaring

(Rowe et al., 2002).

FIGUUR 3.4. : MOLECULAIRE STRUCTUUR VAN POLYVINYLPYRROLIDONE

(http://en.wikipedia.org

13

fosfaat onstaat na defosforylatie myo-inositol. Myo-inositol heeft een lage

copiciteit en een laag vochtgehalte.

In een studie van Burger et al. (2008) worden formulaties gebaseerd op myo


achteraf. Aangezien het zuivere product moeilijk te sproeidrogen is, worden combinaties

MOLECULAIRE STRUCTUUR VAN MYO-INOSITOL

http://upload.wikimedia.org)

POLYVINYLPYRROLIDONE

(PVP) is een wateroplosbaar polymeer afgeleid van het

vinylpyrrolidone. Het is een wit tot lichtgeel poeder met een amorf en


MOLECULAIRE STRUCTUUR VAN POLYVINYLPYRROLIDONE

http://en.wikipedia.org)

inositol heeft een lage

worden formulaties gebaseerd op myo-inositol


jk te sproeidrogen is, worden combinaties

(PVP) is een wateroplosbaar polymeer afgeleid van het

vinylpyrrolidone. Het is een wit tot lichtgeel poeder met een amorf en


14

3.5. BOVINE SERUM ALBUMINE

Bovine serum albumine (BSA) wordt verkregen uit runderbloed. Albumine is de meest

voorkomende eiwitmolecule in bloedplasma. Het speelt enerzijds een belangrijke rol in de

regeling van de osmotische druk in de bloedvaten en anderzijds zorgt het voor transport van

lichaamsvreemde en –eigen stoffen in het bloed. Albumine wordt vaak in farmaceutische

preparaten aangewend waaronder ook om formulaties met proteïnen en enzymen te

stabiliseren. BSA voorkomt net zoals het PVP de rekristallisatie van amorfe suikers tijdens

bewaring (Rowe et al., 2002).

15

4. METHODEN


POEDERS

4.1.1. Productie van droge poeders via sproeidrogen

4.1.1.1. Principe

Sproeidrogen is een continu proces waarbij vloeibare producten (sproeidroogfeed) in

één stap omgezet worden naar droge poeders. Deze vloeibare producten kunnen

oplossingen, supsensies of emulsies zijn die via een pomp door een sproeikop gestuwd

worden. Tijdens de verneveling van de vloeistof door de sproeikop wordt tegelijkertijd hete

lucht door het systeem gestuurd. De temperatuur van deze hete lucht kan worden ingesteld

en wordt de inlaattemperatuur genoemd. Hierdoor droogt het water van de

vloeistofdruppels op, waardoor enkel de vaste materie als poederpartikels overblijft. Door

deze verdamping van water wordt het systeem afgekoeld tot een bepaalde

uitlaattemperatuur. De gedroogde poederpartikels worden vervolgens door de luchtstroom

meegesleurd naar de cycloon. Doordat de poederpartikels met hoge snelheid tegen de

wand van de cycloon botsen, worden ze afgeremd en vallen ze neer in het collecterende

reservoir onderaan de cycloon (Seville et al., 2007).

FIGUUR 4.1. : SPROEIDROGER

(Ameri & Maa, 2006)

16

Sproeidrogen is een continu proces, wat betekent dat zolang er feed aangevoerd

wordt, de sproeidroger continu kan draaien onder dezelfde procesparameters waardoor de

karakteristieken van het product constant blijven.

4.1.1.2. Methode

Zoals weergegeven in Tabel 4.1, werden voor het stabiliteitsonderzoek verschillende

waterige oplossingen gemaakt met variërende verhoudingen aan mannitol (C*Mannidex

16700, Cerestar, Mechelen, België), trehalose (C*Ascend 16400, Cerestar, Mechelen, België),

myo-inositol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland), PVP (Plasdone®K-25, ISP, Zwitserland) en

BSA (Albumin, bovine, Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland). Elke oplossing bevatte 5% vaste

stof en werd beladen met ongeveer 1010EID50 virusvaccin LZ58 NCD per 100 ml en op ijs

geplaatst. De virusoplossing (feed) werd vervolgens gesproeidroogd met een Büchi Mini

Spray Dryer B-290 (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Zwitserland). De inlaattemperatuur werd

ingesteld op 150°C. De feed werd door de sproeikop gestuurd met een snelheid van 4

mL/min en een airflow van 414 L/h. Dit alles resulteerde in een uitlaattemperatuur van

ongeveer 77°C. Het bekomen vaccinpoeder werd bewaard in verzegelde glazen vials bij 6°C

en 20°C.

TABEL 4.1.: VERSCHILLENDE SPROEIDROOGFORMULATIES MET PERCENTAGES VAN ELK

BESTANDDEEL

Formulatie Mannitol Trehalose Myo-inositol PVP BSA

1 4,50% 0,50% - - -

2 4,00% 0,50% - 0,50% -

3 4,00% 0,50% - - 0,50%

4 4,00% 0,50% - 0,25% 0,25%

5 4,50% - 0,50% - -

6 4,00% - 0,50% 0,50% -

7 4,00% - 0,50% - 0,50%

8 4,00% - 0,50% 0,25% 0,25%

17

4.1.2. Karakterisatie van de gesproeidroogde poeders

4.1.2.1. Virustitratie

4.1.2.1.1. Principe

Om de infectiviteit van een virussuspensie na te gaan, worden bebroede eieren

geïnoculeerd met verschillende verdunningen van het virusmateriaal (Borisevich et al.,

2007). Na de inoculatie en incubatie van de eieren kunnen embryonale afwijkingen,

membraanletsels en embryonale sterfte waargenomen worden. Deze veranderingen zijn te

wijten aan de virusvermeerdering van infectieuze virussen en hangen af van de

geïnoculeerde verdunning. Zo wordt de infectieuze titer berekend aan de hand van de

hoogste geïnoculeerde verdunning waarbij 50% van de embryo’s geïnfecteerd zijn, dit is de

egg infectious doses 50% endpoint (EID50). Deze berekening gebeurt met behulp van de

Reed-Muench formule, zie Vergelijking (4.1) (Reed et al., 1938).

�� = �% �ï��

� �� %�� %�% �ï��

� �� %�� % �ï��

� �� %� (4.1)

Met de bekomen index (x) uit de formule kan de uiteindelijke titer van de

virusoplossing berekend worden als:

Titer = 10y, x

(4.2)

waarin 10y: minst verdunde oplossing waartussen het 50% endpoint ligt

x: index

Welke eieren geïnfecteerd zijn, wordt afgelezen met een hemagglutinatietest. De

allantoïsvloeistof van de geïnoculeerde en geïncubeerde eieren van de virustitratie wordt

gemengd met kippenrode bloedcellen. Het virus dat werd toegevoegd aan de bebroede

eieren bevat in het capsomeer virale eiwitten die een sterke affiniteit voor rode bloedcellen

vertonen. Dankzij dit hemagglutinine, een hemagglutinerend glycoproteïne, zal het virus zich

aan de erytrocyten vasthechten en een netwerk vormen zoals geïllustreerd in Figuur 4.2.

Naast hemagglutinine bevat het capsomeer ook het enzym neuraminidase. Deze stof zorgt

18

tijdens de hemagglutinatie voor de afbraak van de glycoproteïnereceptoren op de wand van

de rode bloedcellen waardoor de virussen na de hemagglutinatie terug loskomen.

FIGUUR 4.2: RESULTAAT VAN EEN HEMAGGLUTINATIETEST: DE RODE BLOEDCELLEN

BEDEKKEN DE VOLLEDIGE BODEM WANNEER ER VIRUS AANWEZIG EN DE TEST

DUS POSITIEF IS. EEN NEGATIEVE TEST, WAARBIJ DUS GEEN VIRUS AANWEZIG

IS, WORDT GEKENMERKT DOOR DE BEZINKING VAN DE RBC’S TOT EEN PUNT.

(http://www2.oakland.edu) (http://pages.usherbrooke.ca)

4.1.2.1.2. Methode

Voor de titratie op eieren werd ± 100mg van het gesproeidroogde poeder met levend-

geattenueerd virus opgelost en 10 keer verdund in commerciële PBS (Phosphate Buffered

Saline). Een aliquot van de feedoplossing werd als zodanig aangewend voor de

verdunningen.

Er werden 10-1 tot en met 10-8 virusverdunningen van de poeder- en de

feedoplossingen gemaakt. Hierna werden de verschillende verdunningen geïnoculeerd in de

bebroede eieren. Per verdunning werden vier eieren geïnoculeerd in de allantoïsvloeistof

met 100µl virusverdunning per ei in de. Na de inoculatie werden de eieren in de broedstoof

geplaatst bij 37°C en met een vochtigheidsgraad tussen 60 en 65%. Na drie dagen werden de

eieren gedurende één uur afgekoeld tot -20°C waardoor de embryo’s afstorven en de eieren

geopend konden worden. Op deze eieren werd vervolgens een hemagglutinatietest (HA-

test) uitgevoerd.

19

De HA-test werd uitgevoerd met behulp van microtiterplaten. Hiervoor werd uit elk ei

50µl allantoïsvloeistof gepipetteerd naar een welletje met 50µl PBS. Vanuit deze well

werden dan 8 opeenvolgende 1/2 verdunningen gemaakt. Zo werden 1/2, 1/4, 1/8,... tot

1/256 verdunningen gemaakt per ei. Aan elk welletje werd tot slot 50µl van een 0,5%

kippenrode bloedcellen suspensie toegevoegd en geschud. Dit werd gedurende één uur

geïncubeerd bij kamertemperatuur en vervolgens afgelezen. Wanneer er hemagglutinatie

zichtbaar was, was het virus aanwezig. Geen hemagglutinatie wees op de afwezigheid van

het virus.

Vervolgens werd de virustiter (EID50) berekend aan de hand van de formule van Reed

en Muench zoals hierboven beschreven.

4.1.2.2. Bepaling van hygroscopiciteit via Dynamic Vapour Sorption (DVS)

4.1.2.2.1. Principe

Om de watersorptie van poederformulaties te bepalen werd gebruik gemaakt van een

dynamic vapour sorption toestel (DVS) met microbalans. Het te onderzoeken staal werd

blootgesteld aan een variabele relatieve vochtigheid (RH). Deze RH werd geregeld door

elektrische massadebietcontrollers die met waterdamp verzadigd carriergas vermengen met

droog gas. Een stijging of daling van RH kan een verandering in de massa van het staal

induceren ten gevolge van opname of verlies aan water. Deze gewichtsverandering wordt

vervolgens gemeten door de microbalans die de massa van het staal vergelijkt met een

referentiemassa (http://www.thesorptionsolution.com).

4.1.2.2.2. Methode

Om de hygroscopiciteit van de gesproeidroogde poeders te bepalen, werd gewerkt

met de DVS Advantage 1 (Surface Measurement Systems, Londen, VK). Per meting werd van

het staal een massa tussen 10 en 20 mg afgewogen in de staalhouder. Dit werd eerst

gedroogd tot constant gewicht in het toestel en vervolgens blootgesteld aan een stijgende

relatieve vochtigheid van 0% tot 90% RH. De hygroscopiciteit werd bepaald bij ongeveer

25°C.

20

FIGUUR 4.3. : SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN DYNAMIC VAPOUR SORPTION

(http://www.ices.a-star.edu.sg)

4.1.2.3. Vochtgehaltebepaling via Karl Fischer titratie

4.1.2.3.1. Principe

Met behulp van Karl Fischer titraties kan het vochtgehalte in poederstalen accuraat

bepaald worden. De methode is gebaseerd op de oxidatie van zwaveldioxide door jood in de

aanwezigheid van water volgens de reactie:

I2 + SO2 + 2H2O → 2HI + H2SO4 (4.3)

Hiertoe wordt een oplossing van I2 en SO2 in watervrij methanol gebracht. De

gevormde zuren H2SO4 en HI worden geneutraliseerd met pyridine. De bepaling van het

titratie eindpunt is gebaseerd op de detectie van de overmaat I2, wanneer er geen water

meer aanwezig is in de titratiecel. De overmaat I2 wordt voltametrisch vastgesteld. Nadat

een constante stroom wordt aangelegd tussen 2 identieke indicatorelektroden, wordt het

potentiaalverschil tussen beide elektroden gemeten. Vooraleer het eindpunt van de titratie

bereikt is, is er geen vrij I2 aanwezig in de oplossing. Een reductie van I2 en een

stroomdoorgang kan dus niet optreden. Pas bij titratie van het laatste spoor H2O zal vrij I2

aanwezig zijn. Hierdoor daalt het potentiaalverschil heel sterk en is stroomdoorgang

mogelijk. De sterke daling in potentiaal of de stijging van de stroom wordt gebruikt als

indicatie van het titratie eindpunt (Wieland, 1987).

21

4.1.2.3.2. Methode

De Mettler Karl Fischer titrator DL35 (N.V. Mettler-Toledo SA, Zaventem, België) werd

gebruikt voor de Karl Fischer titraties. De titraties werden uitgevoerd met behulp van

watervrij methanol (Biosolve BV, Valkenswaard, Nederland) en het Karl Fischer reagens

Hydranal®-Composite 2 (Sigma-Aldrich, Seelze, Duitsland). Bij elke titratie werd 0,05 – 0,1

gram poeder afgewogen en in de titratiecel gebracht. Het staal werd vóór elke titratie

gedurende 5 minuten vermengd met het medium met behulp van een magnetische roerder.

Elk staal werd drie keer getitreerd.

4.1.2.4. Meting van de partikelgrootte via Laserdiffractie

4.1.2.4.1. Principe

Laserdiffractie is een instrumentele methode die veel gebruikt wordt voor het bepalen van

de deeltjesgroottedistributie van poeders, suspensies en emulsies. Deze techniek wordt ook

vaak lichtverstrooiing of Fraunhofer diffractie genoemd.

FIGUUR 4.4. : SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN DE LASERDIFFRACTOR

(http://www.malvern.com)

De laserdiffractor bestaat uit een Helium-Neonlaser, die dienst doet als bron van

coherent, intens licht met een golflengte van 632,8 nanometer. Deze monochromatische

lichtbundel gaat door verschillende optische lenzen vooraleer ze in evenwijdige stralen op

het staal invalt. Hiervoor bestaat een presentatiesysteem zodat de laserstraal doorheen een

homogeen gedistribueerd staal kan passeren. De partikels van het staal verstrooien het licht

volgens een bepaalde hoek en een bepaalde intensiteit afhankelijk van de partikelgrootte.

Deze hoek neemt logaritmisch toe wanneer de partikelgrootte afneemt. Zoals voorgesteld

22

in Figuur 4.5 is het diffractiepatroon voor sferische partikels een typische ringstructuur

waarbij de straal r0 afhankelijk is van de partikelgrootte. Verschillende diode array

detectoren worden gebruikt om het lichtpatroon te meten over een groot bereik van hoeken

(http://www.malvern.com).

De resultaten van het experiment zijn gebaseerd op het volume van de partikels. De

verkregen diameters worden berekend als diameters van de sferen met hetzelfde volume als

de gemeten (niet-sferische) partikels. Om partikels van aerosolen in menselijke en dierlijke

geneesmiddelen te karakteriseren is de volumediameter praktisch gezien de meest

aangewezen diameter. Het is namelijk waardevoller om de toegediende massa te weten dan

het aantal aerosolpartikels. De gemeten partikelgroottedistributie wordt gekarakteriseerd

door de diameters D[v, 0.1], D[v, 0.5] en D[v, 0.9]. Dit wil zeggen dat respectievelijk 10%,

50% en 90% van de gemeten volumes van de partikels vertegenwoordigd worden door

partikels die een volume hebben kleiner dan het volume van een sfeer met dezelfde

diameter.

FIGUUR 4.5.: DIFFRACTIEPATROON

(http://www.sympatec.com)

4.1.2.4.2. Methode

Tijdens het onderzoek werd gewerkt met de long bench Malvern Mastersizer 2000

(Malvern instruments, Worcestershire, Verenigd Koninkrijk), een laserdiffractor die

partikelgroottes van 0,05 tot 3500 µm kan meten.

Om de partikelgrootte van de individuele partikels in de gesproeidroogde poeders na

te gaan, werd een aliquot hiervan gesuspendeerd in een oliemedium van Miglyol 812 (Sasol,

Witten, Duitsland) met 0,2% Tween 80 (Polysorbatum 80, SA Fagron, Waregem, België). Na

goed mengen van deze suspensie via vortexen werden de stalen in een ultrasoon bad

23

geplaatst zodat alle resterende agglomeraten opengebroken werden. Voor deze natte

dispersiemethode werd de 300RF lens gebruikt. De stalen werden met behulp van een

rotordrijfkracht, ingesteld op 1500 rpm, doorheen een meetcel gestuurd. Tussen elk staal

door werd een wasstap uitgevoerd. Bepalingen werden uitgevoerd in drievoud.

Voor de droge deeltjesgroottebepaling van de poeders werd de 300mm lens gebruikt

en werd het poeder in een vacuümfles gebracht. In deze fles werd lucht geblazen met een

compressor (Omron CX3, Omron Healthcare B.V., Hoofddorp, Nederland) waardoor de

poederpartikels in een luchtstroom gesuspendeerd werden en via een kunststoftubing

gepresenteerd werden aan het meetsysteem.

A. B.

FIGUUR 4.6.: OPSTELLING VAN LASERDIFFRACTOR VOOR DE DROGE METHODE (A.),POEDER

DOOR LASERSTRAAL (B.)

4.1.2.5. Partikeldensiteit bepaling via heliumpycnometrie

4.1.2.5.1. Principe

Om de dichtheid van het gesproeidroogde poeder te bepalen werd gebruik gemaakt

van een heliumpycnometer. Een pycnometer werkt volgens het principe van Archimedes dat

zegt dat de opwaartse druk die een voorwerp in een vloeistof ondervindt gelijk is aan het

gewicht van dat voorwerp. De vloeistof is in het geval van een heliumpycnometer een gas,

namelijk helium. Dit gas kan de fijnste poriën van het poeder binnendringen en zorgt dus

voor maximale accuraatheid.

24

FIGUUR 4.7 : SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN DE HELIUMPYCNOMETER

De heliumpycnometer gebruikt helium (99,995% puur) om het volume van het staal te

bepalen door meting van het drukverschil van helium in een gekalibreerd volume. Het staal

wordt in de celkamer gebracht, waarna vervolgens de lucht uit het staal in de celkamer

wordt verwijderd door het opeenvolgend laten vollopen en leeglopen van de celkamer met

helium. Hierna kan het staalvolume gemeten worden door de celkamer met helium te vullen

tot een bepaalde druk (Viana et al., 2002). Na opening van het expansieventiel zet het gas

uit in de expansiekamer en bij evenwicht tussen de twee kamers wordt de finale druk

opgenomen (Pf). Het volume van het staal wordt berekend volgens Vergelijking (4.4).

�� ! = �� !"�! − $�%& ��'()*)+,�-

(4.4)

waarin: Vstaal: volume van het staal (cm³)

Vstaalcel: volume van de celkamer met staal (cm³)

Vexp cel: volume van de expansiekamer (cm³)

Pr: druk tijdens het vullen

Pf: finale druk

Uit dit volume (Vstaal) en de vooraf bepaalde massa van het poeder wordt de dichtheid

berekend volgens Vergelijking (4.5).

. = /�0�11'�$0�11' (4.5)

waarin: ρ: dichtheid (g/cm³)

m(staal): massa van het staal (g)

Vstaal: volume van het staal (cm³)

25

4.1.2.5.2. Methode

De dichtheid van de poeders wordt in het laboratorium bepaald met een AccuPyc 1330

(Micromeritics, Brussel, België). Voor elke bepaling werd 0,1 – 1,9 gram staal afgewogen. De

metingen werden door de pycnometer per staal 10 keer uitgevoerd.

4.1.2.6. Scanning elektronenmicroscoop (SEM)

4.1.2.6.1. Principe

Om de morfologie van de gesproeidroogde poeders te kunnen aanschouwen, werd

gebruik gemaakt van de scanning elektronenmicroscoop (SEM). Een elektronenmicroscoop

verschilt van een optische microscoop onder andere door de aanwezigheid van

elektromagneten. Deze elektromagneten worden gebruikt om een elektronenbundel af te

buigen, terwijl bij een optische microscoop de afbuiging van lichtstralen gebeurt door

lenzen. Door het gebruik van elektronen en elektromagneten is er meer controle over de

vergroting en wordt een duidelijker beeld van het te onderzoeken materiaal verkregen. De

SEM kan dieper in het staal meten dan een optische microscoop, waardoor een

driedimensionaal beeld verkregen wordt. Omwille van het 3D resultaat wordt deze

microscoop voornamelijk gebruikt voor het bestuderen van oppervlaktes van vaste

materialen (http://mse.iastate.edu).

FIGUUR 4.8.: SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN DE SCANNNING ELECTRONEN-

MICROSCOOP (http://cache-media.britannica.com.cdnetworks.net)

26

Bovenaan de kolom van de SEM bevindt zich een filament als elektronenbron.

Wanneer dit verwarmd wordt, zal het een elektronenbundel uitsturen, die vervolgens in

verticale richting door de kolom van de microscoop gestuurd wordt. Deze bundel baant zich

een weg door elektromagnetische lenzen, die de bundel focusseren en leiden naar het staal.

Eenmaal de elektronen het staal bereiken, worden elektronen afkomstig van het staal

uitgestoten. Deze secundaire elektronen worden door detectoren gecollecteerd en omgezet

naar een signaal. Dit signaal wordt tot slot verstuurd naar het computerscherm waar het 3D

beeld verschijnt.

4.1.2.6.2. Methode

De Quanta 200F (FEI Company, Eindhoven, Nederland) scanning electron microscoop

werd gebruikt om de morfologie van de deeltjes na te gaan. De poeders werden

aangebracht op zelfklevende staalhouders en gecoat met ongeveer 40nm goud. Hierdoor

werd het staal geleidbaar voor elektronen.

4.2. INVLOED VAN SPROEIDROOGPARAMETERS OP DE PARTIKELGROOTTE EN

VOCHTGEHALTE VAN POEDERS: EEN EXPERIMENTEEL DESIGN

4.2.1. Inleidende begrippen

Om informatie te verkrijgen over welke sproeidroogparameters de

poederkarakteristieken beïnvloeden, moeten experimenten uitgevoerd worden. Door alle

procesparameters constant te houden en telkens één parameter te wijzigen kan de invloed

van die parameter op het resulterende product nagegaan worden. Dit zou echter talloze

tijd- en kostrovende experimenten vereisen. Daarenboven kunnen bepaalde

procesparameters interacties met elkaar vertonen die zo niet gedecteerd kunnen worden.

Met behulp van een experimenteel design kan een maximum aan informatie vergaard

worden met een minimum aan experimenten.

In een experimenteel design worden vooraf de relevante factoren gekozen die een

invloed zouden kunnen hebben op de responsen. In dit onderzoek zijn de factoren de

27

sproeidroogprocesparameters en de responsen de partikelgrootte en het vochtgehalte van

de gesproeidroogde poeders.

Het basis experimenteel design is het two level full factorial design. Het aantal

experimenten die worden uitgevoerd, is afhankelijk van het aantal factoren die onderzocht

worden. Zo zal een two level (2x) experimenteel design met drie factoren 23 of 8

experimenten omvatten. In een two level full factorial design wordt elke factor op twee

niveaus getest, een laag en een hoog niveau, respectievelijk weergegeven als een ‘-‘ en ‘+’

symbool. Om een optimaal design te verkrijgen worden ook centerpoints toegevoegd,

weergegeven met het symbool ‘0’. Voor de centerpoint experimenten wordt voor elke factor

de middelste waarde toegepast tussen het laag en hoog niveau. Het driemaal uitvoeren van

deze centerpoints laat toe de replicaatfout te berekenen.

In onderstaande tabel en figuur wordt een 23 full factorial design weergegeven,

waarbij x1, x2 en x3 de factoren zijn.

TABEL 4.2.: SCHEMATISCH OVERZICHT VAN EEN 23 FULL FACTORIAL DESIGN

FIGUUR 4.9.: GEOMETRISCHE VOORSTELLING VAN EEN 23 FULL FACTORIAL DESIGN

X1 X2 X3

1 - - -

2 + - -

3 - + -

4 + + -

5 - - +

6 + - +

7 - + +

8 + + +

9 0 0 0

10 0 0 0

11 0 0 0 Centerpoints

28

Het randomiseren van de run order is voornamelijk van belang om te voorkomen dat

systematische veranderingen in ongecontroleerde variabelen de experimenten zouden

kunnen beïnvloeden. Moesten alle experimenten van hoge inlaattemperatuur eerst worden

uitgevoerd, dan zou de temperatuur in het lokaal ook toenemen en hoger liggen dan

wanneer de experimenten met lage inlaattemperatuur zouden worden uitgevoerd. Dit is van

belang wanneer de omgevingstemperatuur een invloed op het resulterende poeder heeft.

De invloed hiervan op de partikelgrootte en het vochtgehalte van de gesproeidroogde

poeders is vermoedelijk verwaarloosbaar. Voor de zekerheid werden de experimenten toch

gerandomiseerd.

4.2.2. Design opzet

De formulatie mannitol- myo-inositol – BSA (8:1:1) werd over de gehele experimentele

design gebruikt. Deze formulatie werd gekozen op basis van resultaten uit de

stabiliteitsstudie.

TABEL 4.3.: OPZET VAN HET EXPERIMENTEEL DESIGN

Run order Exp No

Inlaat-temperatuur

(°C) Airflow

(L/h)

Feed-snelheid (ml/min)

Solids gehalte (%)

1 18 150 414 5 8,75

2 8 170 473 7 2,5

3 11 130 473 3,5 15

4 5 130 355 7 2,5

5 12 170 473 3,5 15

6 17 150 414 5 8,75

7 16 170 473 7 15

8 1 130 355 3,5 2,5

9 19 150 414 5 8,75

10 2 170 355 3,5 2,5

11 13 130 355 7 15

12 14 170 355 7 15

13 15 130 473 7 15

14 4 170 473 3,5 2,5

15 9 130 355 3,5 15

16 6 170 355 7 2,5

17 7 130 473 7 2,5

18 3 130 473 3,5 2,5

19 10 170 355 3,5 15

29

De gekozen factoren waren de inlaattemperatuur, feedsnelheid, airflow en vaste

stofgehalte (solids) van de feedoplossing. Aangezien er vier factoren zijn, betekent dit dat

het een 24 full factorial design is, wat geometrisch voorgesteld kan worden als een

hyperkubus. Er werden dus 19 gerandomiseerde experimenten (24 + 3 centerpoints)

uitgevoerd.

Voor de inlaattemperatuur werd 130°C als laag niveau gekozen en 170°C als hoog

niveau. Het is belangrijk dat de inlaattemperatuur niet te laag gekozen wordt, zodat het

gesproeidroogde product voldoende gedroogd wordt tijdens het proces. Anderzijds mag de

inlaattemperatuur niet te hoog zijn om het virusvaccin tegen thermale degradatie te

beschermen, wanneer dit in de formulatie zou geïntroduceerd worden.

De feedsnelheid bepaalt mee wat de resulterende uitlaattemperatuur zal zijn. Is deze

hoger dan zal er meer water door het sproeidroogsysteem gestuurd worden, wat resulteert

in een grotere afkoeling van het systeem en een lagere uitlaattemperatuur. Een lage

uitlaattemperatuur is eveneens belangrijk voor de vaccinstabiliteit wanneer het virusvaccin

in de formulatie geïntroduceerd wordt. Een te lage uitlaattemperatuur zou onvoldoende

droging van het product kunnen betekenen. De mimimumfeedsnelheid werd ingesteld op

3,5 mL/min, de maximale op 7,0 mL/min.

De luchtstroom (airflow) door de sproeikop werd gevarieerd van 355 tot 473 L/h, wat

de meest gebruikte waarden zijn voor de Büchi B-290 sproeidroger.

Het solidsgehalte bedroeg minimum 2,5% en maximum 15%. De bovengrens werd

bepaald door de maximale wateroplosbaarheid van mannitol, wat 18,2% bedraagt bij

kamertemperatuur.

4.2.3. Evaluatie van de poederstalen

De responsen die gemeten werden, waren de partikelgrootte en het vochtgehalte van

de gesproeidroogde poeders.

Van elk gesproeidroogd poeder werd de partikelgrootte gemeten via laserdiffractie.

Hierbij werd de primaire partikelgrootte van de poederstalen gemeten via de natte

30

dispersiemethode (zie 4.1.2.4). De weergegeven partikelgrootte is de grootte die bij de

meeste deeltjes gemeten werd i.e. de top van de distributiecurve.

Het vochtgehalte van de poeders werd bepaald via Karl Fischertitraties (zie 4.1.2.3).

4.2.4. Analyse van het experimenteel design

Het uitvoeren van de data-verwerking van het experimenteel design werd uitgevoerd

met behulp van het software programma MODDE (MKS Umetrics AB, Umeå, Zweden).

4.2.4.1. Evaluatie van de ruwe data

Voor elke respons werd een replicatieplot opgesteld. Hierbij wordt voor elk

experiment de gemeten waarde uitgezet in een grafiek. De 3 centerpoint experimenten zijn

3 identieke experimenten die voor elke factor uitgevoerd werden bij waarden tussen het

laagste en hoogste niveau. Daarom horen de responsen van deze experimenten een gelijke

waarde te hebben, die ongeveer tussen de hoogste en de laagste responswaarde ligt.

4.2.4.2. Lineaire regressie analyse

Om na te gaan of alle experimenten mogen gebruikt worden om lineaire regressie

analyse op toe te passen, werd van elke respons een N-probabiliteitsplot van de residuals

opgemaakt. Residuals zijn het verschil tussen de geobserveerde waarde en de voorspelde

waarde en werden berekend door de software via volgende formule:

ei = 4��Ŷ�678 (4.6)

waarin ei: residual

Yi: geobserveerde waarde

Ŷi: voorspelde waarde i: experimentnummer RSD: residuele standaarddeviatie

FIGUUR 4.10.: NORMALE

BETROUWBAARHEIDSINTERVALLEN

FIGUUR 4.11.: N-PROBABILITEITSPLOT

(http://www.itl.nist.gov

Residuals kunnen beschouwd worden als de fout tussen de voorspelde waarde en de

experimentele waarde. Indien de voorspelde waarden en de experimentele waarden een

normale distributiecurve volgen, zullen de residuals ook binnen de normaalverdelingscurve

vallen. In de N-probabiliteitsplot worden de residuals uitgedrukt als het aantal

standaardafwijkingen dat een bepaald residual afwijkt van nul in de normaalverdeling.

Vandaar dat de x-waarden rond nul gecentreerd worden.

31

DISTRIBUTIECURVE MET BIJHORENDE

BETROUWBAARHEIDSINTERVALLEN

PROBABILITEITSPLOT

http://www.itl.nist.gov)

kunnen beschouwd worden als de fout tussen de voorspelde waarde en de



probabiliteitsplot worden de residuals uitgedrukt als het aantal


waarden rond nul gecentreerd worden.

DISTRIBUTIECURVE MET BIJHORENDE

kunnen beschouwd worden als de fout tussen de voorspelde waarde en de



probabiliteitsplot worden de residuals uitgedrukt als het aantal


32

Indien de residuals als een rechte op mekaar volgen zoals in figuur 4.11, zijn de data

normaal verdeeld. Met behulp van deze plot kunnen afwijkende experimenten of outliers

gedetecteerd worden. Dit zijn de experimenten waarvan de residuals niet binnen 3

standaarddeviaties liggen van de normaalverdeling en er dus niet toe behoren. Residuals die

meer dan 4 standaarddeviaties afwijken worden door de software MODDE als significante

outliers beschouwd (Eriksson et al., 2008). Deze experimenten worden geëxcludeerd uit de

lineaire regressie aangezien ze de analyse kunnen verstoren.

Via lineaire regressie konden de hoofd- en interactie-effecten berekend worden. Het

24 full factorial design kon via de volgende vergelijking, i.e. model, beschreven worden.

Y = β0 + gemiddelde respons

β1x1 + β2x2 + β3x3 + β4x4 + hoofdeffecten

β12x1x2 + β13x1x3 + β14x1x4 + β23x2x3 + β24x2x4 + β34x3x4 + 2-factorinteracties

β123x1x2x3 + β124x1x2x4 + β234x2x3x4 + β134x1x3x4 + 3-factorinteracties

β1234x1x2x3x4 4-factorinteracties

(4.7)

waarin Y: respons

x1,x2,…: factoren

β0: gemiddelde respons

β1, β2,…: coëfficiënten van de hoofdeffecten

β12,… β123,… β1234: coëfficiënten van de interacties

Een hoofdeffect van een factor wordt beschreven als het gemiddelde verschil in

respons tussen het lage en hoge factorniveau.

Aangezien de software MODDE de data met behulp van gecodeerde factorniveaus (-1,

0, +1) hanteert in plaats van de werkelijke waarden (vb. voor temperatuur: 130°C, 150°C,

170°C) wordt niet meer over hoofd- en interactie-effecten gesproken, maar wel over hoofd-

en interactiecoëfficiënten. De coëfficiënten zijn een maat voor de effecten. Deze

33

coëfficiënten werden uitgezet in een plot. Niet-significante coëfficiënten van hoofd- en

interactie-effecten werden geëxcludeerd uit de modelopzet.

Om interacties tussen factoren visueel te kunnen beschouwen, werden interactie-plots

gegenereerd door de software. Hierbij worden de bijbehorende responsen op de hoge en

lage niveaus van 2 factoren uitgezet in een plot. Wanneer deze lijnen evenwijdig blijven, is er

geen interactie tussen de twee factoren voor die respons, kruisen de lijnen dan is er wel een

interactie.

Vervolgens werden de R2, Q2 en reproduceerbaarheid van het experimenteel model

berekend door de software via lineare regressie. Deze waarden werden uitgezet in een

‘summary of fit’ plot.

R2 drukt uit in hoeverre het berekende model de gegeven data kan herberekenen

volgens het model. Deze waarde ligt tussen ‘0’ en ‘1’, waarbij een waarde van ‘1’ een perfect

model weergeeft.

Q2 geeft weer hoe goed het model in staat is nieuwe experimenten te voorspellen.

Aanvaardbare waarden van Q2 zijn vanaf ‘0,5’. Vanaf ‘0,9’ worden excellente waarden

verkregen voor de Q2-waarde. Het is belangrijk in acht te nemen dat R2 de Q2 waarde met

niet meer dan 0,2-0,3 mag overschrijden.

De reproduceerbaarheid laat zien hoe groot de pure fout op de experimenten is. Is

deze waarde kleiner dan ‘0,5’ dan is er een grote pure fout en zijn de uitgevoerde

experimenten onvoldoende gecontroleerd.

4.2.4.3. Gebruik van het model

Voor elke respons werd een contour plot opgemaakt met de belangrijkste

coëfficiënten. Uit deze contour plot kunnen voorspellingen gedaan worden in verband met

bij welke omstandigheden de experimenten moeten worden uitgevoerd om een bepaalde

respons te bekomen.

34

5. RESULTATEN EN DISCUSSIE


POEDERS

5.1.1. Karakterisatie van de gesproeidroogde poeders

5.1.1.1. Virustitraties

TABEL 5.1.: VERLIES VAN VIRUSTITER NA SPROEIDROGEN EN NA 1 MAAND BEWARING BIJ

6°C EN 20°C UITGEDRUKT IN 10XEID50/5G

*

Uit de resultaten van de virustitraties kon worden afgeleid dat myo-inositol een

beschermende invloed heeft op het virus tijdens het sproeidroogproces. Het gemiddeld

verlies van infectiviteit bij de trehalosereeks na sproeidrogen was namelijk 2 log10 EID50

eenheden terwijl dit bij de myo-inositolreeks slechts 1,65 log10 EID50 eenheden bedroeg.

Zowel binnen de trehalose- als de myo-inositolreeks werd vastgesteld dat BSA een

stabiliserende invloed had op het virusvaccin bij 1 maand bewaring. Formulaties met BSA

bewaard bij 6°C en 20°C toonden weinig verschil in infectiviteitsverlies na 1 maand bewaring,

vergeleken met de formulaties zonder BSA.

Uit de resultaten van de virustitratie kan besloten worden dat myo-inositol het virus

beter stabiliseert dan trehalose. Het gemiddelde virustiterverlies is zowel na het

sproeidrogen als na bewaring het kleinst in de mannitol-myo-inositolreeks. Ook de

polymeren PVP en BSA hebben een stabiliserende invloed op het virus tijdens de bewaring.

NA SPROEIDROGEN (10x EID50/5g)

NA 1 MAAND (10x EID50/5g)

BEWARING

Formulatie 6°C 20°C

Man-Treh 2,9 1,9 2,5 Man-Treh-PVP 1,3 0,5 3,2 Man-Treh-BSA 2,3 0,3 1,2 Man-Treh-PVP-BSA 1,5 -0,3* 0,7 Man-Ino 1,0 0,3 3,8 Man-Ino-PVP 2,0 1,0 2,2 Man-Ino-BSA 1,8 0,5 0,2 Man-Ino-PVP-BSA 1,8 0,0 0,5 * negatieve verliezen werden gelijkgesteld aan ‘0’

35

De formulaties met BSA erbij vertonen het kleinste verlies van virusinfectiviteit na

sproeidrogen en bij bewaring gedurende 1 maand zowel bij 6°C als bij 20°C.

5.1.1.2. Bepaling van de hygroscopiciteit via Dynamic Vapour Sorption (DVS)

In figuur 5.1. werden de watersorptiecurven weergegeven van de gesproeidroogde

formulaties.

A.

B.

FIGUUR 5.1.: WATERSORPTIEPROFIELEN BEKOMEN DOOR DVS EXPERIMENTEN.

A.MANNITOL-TREHALOSE REEKS; B. MANNITOL-INOSITOL REEKS

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

Ve

ran

de

rin

g in

ma

ssa

(%

)

Relatieve vochtigheid (%)

man treh

man treh PVP

man treh BSA

man treh PVP BSA

0,000

2,000

4,000

6,000

8,000

10,000

12,000

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

Ve

ran

de

rin

g in

ma

ssa

(%

)

Relatieve vochtigheid (%)

man ino

man ino PVP

man ino BSA

man ino PVP BSA

Uit de bepaling van de hygroscopiciteit via de DVS kon in eerste instantie afgeleid

worden dat zowel de formulaties met inositol als met trehalose e

hygroscopiciteit hebben. Voor de mannitol

wateropname 3,17% bij blootstelling aan 90% RH (Man

was deze maximale waarde 10,47% water afkomstig van de mannitol

Uit dit experiment bleek ook dat het toevoegen van een polymeer zoals PVP en BSA,

zorgde voor een stijgende hygroscopiciteit, voornamelijk binnen de mannitol

reeks. Binnen deze reeks zorgde de toevoeging van PVP voor de grootste

(2,72% water bij 50% RH). Bij de mannitol

hygroscoop karakter van de poeders met polymeren geringer.

5.1.1.3. Vochtgehaltebepaling via Karl Fischer titratie

A.

FIGUUR 5.2.: VOCHTGEHALTE (%) VAN DE

STANDAARDDEVIATIE (N=3) BEPAALD DOOR KARL FISCHER TITRATIE. A.

MANNITOL-TREHALOSE REEKS; B. MANNITOL

Uit de resultaten van de Karl Fischer titraties weergegeven in Figuur 5.2 kon worden

afgeleid dat poeders zonder polymeren het laagste vochtgehalte binnen hun reeks bezitten.

Formulaties met polymeren vertoonden binnen beide reeksen hogere vochtgehaltes.

In het algemeen bezaten alle gesproeidroogde poeders in dit experiment een laag

vochtgehalte (max. 1,00%), wat

de bewaring en de vernevelingseigenschappen van het poeder.

0,00

0,50

1,00

1,50

Vo

chtg

eh

alt

e (

%)

36


worden dat zowel de formulaties met inositol als met trehalose e

hygroscopiciteit hebben. Voor de mannitol-inositolformulaties bedroeg de maximale

wateropname 3,17% bij blootstelling aan 90% RH (Man-Ino-PVP-BSA). Bij de trehalosereeks

was deze maximale waarde 10,47% water afkomstig van de mannitol-treha


zorgde voor een stijgende hygroscopiciteit, voornamelijk binnen de mannitol

reeks. Binnen deze reeks zorgde de toevoeging van PVP voor de grootste

(2,72% water bij 50% RH). Bij de mannitol-inositolformulaties was de stijging van het


Vochtgehaltebepaling via Karl Fischer titratie

B.

VOCHTGEHALTE (%) VAN DE GESPROEIDROOGDE POEDERS MET


TREHALOSE REEKS; B. MANNITOL-INOSITOL REEKS


r polymeren het laagste vochtgehalte binnen hun reeks bezitten.



vochtgehalte (max. 1,00%), wat gunstig kan zijn voor de stabiliteit van het virusvaccin tijdens

de bewaring en de vernevelingseigenschappen van het poeder.

Man-Treh

Man-Treh-PVP

Man-Treh-BSA

Man-Treh-PVP-BSA 0,00

0,50

1,00

1,50

Vo

chtg

eh

alt

e (

%)


worden dat zowel de formulaties met inositol als met trehalose een relatief lage

inositolformulaties bedroeg de maximale

BSA). Bij de trehalosereeks

trehalose formulatie.


zorgde voor een stijgende hygroscopiciteit, voornamelijk binnen de mannitol-trehalose

reeks. Binnen deze reeks zorgde de toevoeging van PVP voor de grootste wateropname

inositolformulaties was de stijging van het


GESPROEIDROOGDE POEDERS MET


INOSITOL REEKS


r polymeren het laagste vochtgehalte binnen hun reeks bezitten.



gunstig kan zijn voor de stabiliteit van het virusvaccin tijdens

Man-Ino

Man-Ino-PVP

Man-Ino-BSA

Man-Ino-PVP-BSA

37

5.1.1.4. Meting van partikelgrootte via laserdiffractie

In Figuur 5.3. en Tabel 5.2 werden de partikelgroottedistributies van de verschillende

formulaties weergeven.

FIGUUR 5.3.: PARTIKELGROOTTEDISTRIBUTIE VOLGENS FORMULATIE EN UITVOER-

METHODE. A. MAN-TREH DROOG; B. MAN-TREH NAT; C. MAN-INO DROOG; D.

MAN-INO NAT

Uit de partikelgroottedistributies van de natte dispersiemethode konden de

individuele partikelgroottes worden vastgesteld. Zowel binnen de trehalose- als de myo-

inositolreeks hadden alle poeders ongeveer gelijke partikelgroottedistributies met

uitzondering van de PVP-formulaties. Deze laatste formulaties resulteerden in grotere

primaire partikels.

Bij de partikelgroottedistributies gemeten via de droge dispersiemethode konden niet

alle agglomeraten opgebroken worden door het vernevelingstoestel. Dit is te zien in de

38

bimodale partikelgroottedistributies. Enkel bij de PVP-formulaties werd geen bimodale

distributie verkregen.

TABEL 5.2.: PARTIKELGROOTTEDISTRIBUTIE MET STANDAARDDEVIATIE (N=3)

GEKARAKTERISEERD DOOR DE VERSCHILLENDE DIAMETERS. A. MAN-TREH

DROOG; B. MAN-TREH NAT; C. MAN-INO DROOG; D. MAN-INO NAT

D(v, 0.1) (µm) D(v, 0.5) (µm) D(v, 0.9) (µm) Span

Man-Treh 3,19 ± 0,29 12,11 ± 1,04 96,39 ± 51,13 5,00 ± 0,01 Man-Treh-PVP 14,23 ± 1,46 44,07 ± 5,03 121,54 ± 22,70 2,42 ± 0,20 Man-Treh-BSA 3,16 ± 0,13 9,59 ± 0,36 31,86 ± 7,09 2,98 ± 0,65

Man-Treh-PVP-BSA 3,10 ± 0,36 7,83 ± 1,09 36,20 ± 11,41 4,16 ± 0,85

A.


Man-Treh 4,67 ± 0,05 17,78 ± 0,67 34,07 ± 0,98 1,65 ± 0,01 Man-Treh-PVP 5,99 ± 0,06 28,4 ± 0,67 57,72 ± 2,82 1,82 ± 0,06 Man-Treh-BSA 3,10 ± 0,02 8,07 ± 0,04 18,23 ± 0,29 1,88 ± 0,04

Man-Treh-PVP-BSA 2,76 ± 0,01 7,10 ± 0,11 14,69 ± 0,41 1,68 ± 0,03

B.


Man-Ino 2,36 ± 0,31 7,42 ± 1,59 384,42 ± 171,03 64,80 ± 26,78 Man-Ino-PVP 15,59 ± 2,47 48,36 ± 19,11 178,42 ± 46,43 3,64 ± 1,65 Man-Ino-BSA 2,43 ± 0,20 7,28 ± 0,92 188,65 ± 135,93 37,80 ± 3,43

Man-Ino-PVP-BSA 3,59 ± 0,24 9,33 ± 1,37 340,96 ± 164, 97 12,72 ± 19,56

C.


Man-Ino 3,17 ± 0,80 9,15 ± 2,22 19,90 ± 5,26 1,82 ± 0,07 Man-Ino-PVP 6,74 ± 2,76 27,81 ± 2,02 55,29 ± 0,71 1,75 ± 0,20 Man-Ino-BSA 3,11 ± 0,38 8,66 ± 1,12 19,82 ± 3,44 1,92 ± 0,19

Man-Ino-PVP-BSA 3,30 ± 0,56 10,93 ± 1,88 23,95 ± 5,18 1,84 ± 0,12

D.

Uit Tabel 5.2. werden de gemeten volumediameters en bijbehorende spans

weergegeven, waaruit bleek dat de gemiddelde volumediameters voor de myo-

inositolformulaties kleiner waren dan die van de trehalosereeks.

39

Bij de metingen met de droge dispersiemethode konden grotere spans worden

vastgesteld dan bij de metingen met de natte dispersiemethode, wat te wijten was aan de

onvolledige de-agglomeratie van de poeders door het vernevelingstoestel.

Uit de bekomen resultaten van de laserdiffractie kon besloten worden dat de

partikelgrootte afhankelijk is van de samenstelling van het poeder.

5.1.1.5. Partikeldensiteit via heliumpycnometer

TABEL 5.3 : GEMIDDELDE DICHTHEID (G/CM³) EN STANDAARDDEVIATIE (N=10) VAN

GESPROEIDROOGDE FORMULATIES

Formulatie gemiddelde dichtheid (g/cm³) SD (g/cm³)

Mannitol 1,4842 0,0058 Trehalose 1,5028 0,0012

Myo-inositol 1,5614 0,0020

Mannitol – Trehalose 1,5226 0,0042 Mannitol - Trehalose – PVP 1,8479 0,0494 Mannitol - Trehalose – BSA 1,5887 0,0082

Mannitol - Trehalose - PVP - BSA 1,5697 0,0078

Mannitol – Inositol 1,4838 0,0075 Mannitol - Inositol – PVP 1,7974 0,0670 Mannitol - Inositol – BSA 1,6067 0,0075

Mannitol - Inositol - PVP – BSA 1,5489 0,0091

Vergeleken met mannitol, trehalose en myo-inositol als zodanig werd een grotere

dichtheid bekomen met de gesproeidroogde formulaties. Bij het vergelijken van de

gemiddelde dichtheid van de verschillende gesproeidroogde formulaties werd weinig

verschil gezien tussen de trehalose- en myo-inositolreeks met respectievelijk 1,6322g/cm³ en

1,6092g/cm³. Er kon opgemerkt worden dat bij de toevoeging van een polymeer een lichte

stijging in dichtheid waar te nemen is. Voornamelijk met het PVP-polymeer was deze stijging

in densiteit duidelijk te zien.

De resulaten van de heliumpycnometer toonden aan dat sproeidrogen een lichte

stijging van de partikeldensiteit tot gevolg heeft en dat deze ook afhankelijk is van de

samenstelling van de formulatie.

5.1.1.6. SEM

De gesproeidroogde poederformulaties werden gevisualiseerd in Fi

5.5.

A.

C.

FIGUUR 5.4. : OPPERVLAKTEMORFOLOGIE VAN DE VERSCHILLENDE GESPROEIDROOGDE

FORMULATIES.

MANNTIOL-INOSITOL

A.

C.

FIGUUR 5.5.: OPPERVLAKTEMORFOLOGIE VAN DE VERSCHILLENDE GESPROEIDROOGDE

FORMULATIES.

MANNITOL-TREHALOSE

40

De gesproeidroogde poederformulaties werden gevisualiseerd in Fi

B.

DE ONTWIKKELING VAN EEN DROOG ......DANKWOORD Vooreerst wens ik Prof. dr. apr. J.P. Remon te...

Documents

Transcript of DE ONTWIKKELING VAN EEN DROOG ......DANKWOORD Vooreerst wens ik Prof. dr. apr. J.P. Remon te...