1. Introductie

1.1. Epilepsie

Epilepsie is één van de meest voorkomende neurologische aandoeningen. De ziekte treft ongeveer 1% van de totale wereldbevolking, goed voor ongeveer 5 miljoen mensen. De term “epilepsie” behelst een aantal verschillende syndromen, die alle gemeen hebben dat het belangrijkste symptoom bestaat uit het optreden van terugkerende, niet-uitgelokte convulsies.

Convulsies zijn plotse, korte aanvallen van veranderd bewustzijn, gepaard gaande met stoornissen in motorische, sensorische, psychische of autonome functies. Deze vreemde gedragingen zijn te wijten aan een abnormaal, excessief en gelijktijdig afvuren van signalen door neuronen in de hersenen.Men spreekt over epilepsie wanneer de persoon in kwestie reeds twee onuitgelokte convulsies heeft gehad. [1],[2]

1.1.1 Pathofysiologie

Epilepsiesyndromen vallen uiteen in twee grote categorieën. Gegeneraliseerde epilepsie begint gelijktijdig in beide hersenhemisferen. Veel vormen van gegeneraliseerde epilepsie vertonen een sterk genetische component. In de meeste gevallen is de neurologische functie normaal. Bij partiële epilepsie daarentegen ontstaan convulsies in gelokaliseerde “haarden” (foci), hoewel ze zich over de volledige hersenen kunnen uitspreiden. Meestal is partiële epilepsie het gevolg van één of meerdere trauma’s van het centrale zenuwstelsel, maar in veel gevallen is de aard/natuur van het trauma ongekend.

1.1.1.1 Mechanismen van gegeneraliseerde epilepsie

Het best begrepen voorbeeld van de pathofysiologische mechanismen van gegeneraliseerde convulsies is de thalamocorticale interactie die waarschijnlijk aan de basis ligt van absences. Dit is een netwerk, dat sterk afhankelijk is van inhibitorische neuronen, neuronale communicatie (bvb. synaptische transmissie) en intrinsieke neuronale eigenschappen (bvb. de mogelijkheid van een neuron tot het snel, herhaaldelijk afvuren van signalen). Een verandering in dit circuit tussen de thalamus en de hersenschors zou aan de basis liggen van de pathologie. Het normale thalamocorticale circuit heeft oscillerende ritmes, met als gevolg perioden van relatief toegenomen excitatie en perioden van relatief toegenomen inhibitie. Dit circuit bevat de pyramidale neuronen van de neocortex, de thalamische interneuronen (ook ‘thalamic relay cells’ genoemd) en de neuronen in de nucleus reticularis van de thalamus (NRT). De thalamische interneuronen projecteren naar de neocorticale neuronen. Beide projecteren dan verder naar de reticulaire neuronen om het circuit te vervolledigen. (Figuur 1)De thalamische interneuronen kunnen schommelingen vertonen in rustpotentiaal, waardoor de kans op een gelijktijdige activatie van de neocorticale pyramidale neuronen tijdens depolarisatie toeneemt en de kans op neocorticale activatie tijdens hyperpolarisatie sterk afneemt. De spil in deze schommelingen is het T-type calcium kanaal. Inhibitorische inputs van de NRT controleren de

activiteit van de thalamische interneuronen. NRT neuronen zijn inhibitorisch en bevatten γ-aminoboterzuur (GABA) als belangrijkste neurotransmitter. Ze regelen de de activatie van T-calcium kanalen in thalamische interneuronen omdat deze kanalen gedeïnactiveerd moeten worden vooraleer ze kunnen openen. T-calcium kanalen hebben 3 functionele toestanden: open, gesloten en geïnactiveerd. Calcium komt de cel binnen als de T-calcium kanalen open staan. Onmiddellijk na sluiten kan het kanaal niet opnieuw openen totdat het een staat van inactivatie bereikt. De thalamische interneuronen hebben GABAB-receptoren op hun cellichaam en ontvangen tonische activatie door GABA-vrijzetting uit de NRT. Het resultaat is een hyperpolarisatie die de T-calcium kanalen uit hun geïnactiveerde staat haalt en zo de gelijktijdige opening van een groot aantal T-calcium kanalen toestaat.

Figuur 1: Het thalamocorticale circuit.

Hoewel de meeste epilepsiesyndromen ingewikkelde overervingpatronen vertonen zijn er toch enkele die een mendeliaanse overerving volgen en geassocieerd zijn met een enkele genmutatie. Bijna alle van deze mutaties werden gevonden in genen die coderen voor kanaalproteïnen. Dit is dus een ander mechanisme van gegeneraliseerde epileptogenesis. In deze typische syndromen leiden de mutaties in genen, coderend voor kanaalproteïnen, tot hyperexciteerbaarheid van corticale neuronen via veranderingen in kanaalfunctie. Gelijkaardige ionkanaal mutaties werden gevonden in verschillende aandoeningen, die nu samen “channelopathies” genoemd worden.

1.1.1.2 Mechanismen van partiële epilepsie

Over de onderliggende mechanismen van partiële epilepsie is veel minder geweten dan over gegeneraliseerde epilepsie.Het postsynaptisch membraan ondergaat functionele, en misschien structurele veranderingen. Hierbij veranderen de eigenschappen van receptor proteïnen – conductantie kanalen, met als gevolg het vergemakkelijken van de ontwikkeling van een “paroxysmal depolarizing shift” (PDS) (Figuur 2) en een gestegen exciteerbaarheid. Epileptische neuronen lijken een toegenomen Ca2+ conductantie te vertonen. Dit kan te wijten zijn aan het gebruik van latente Ca2+ kanalen, een gestegen effectiviteit

van de aanwezige kanalen, of een chronische stijging van het aantal Ca2+ kanalen. De PDS wordt gekarakteriseerd door een verlengde calcium-afhankelijke depolarisatie die resulteert in meerdere natrium-gemedieerde actiepotentialen en gevolgd wordt door een prominente na-hyperpolarisatie. Deze hyperpolarisatie wordt voornamelijk gemedieerd door calcium-afhankelijke K+ kanalen.

Wanneer vele neuronen gelijktijdig PDS’s afvuren vertoont een “extracellular field recording” een interictale “spike”.

Vele factoren zijn betrokken in de overgang van een interictale spike naar een epileptische convulsie. Wanneer één van de mechanismen die aan de basis liggen van een acute convulsie een permanente verandering wordt zal de patiënt terugkerende convulsies ontwikkelen. [2],[3],[4]

Figuur 2: De paroxismale depolarisatie shift

1.1.2 Klassificatie

Epileptische aanvallen worden in de eerste plaats onderverdeeld in gegeneraliseerde aanvallen en partiële aanvallen, ook wel locale of focale aanvallen genoemd. Verder worden de niet te classificeren aanvallen nog apart ingedeeld.

1.1.2.1 Gegeneraliseerde aanvallen

Bij een gegeneraliseerde aanval zijn beide hersenhelften gelijktijdig betrokken. De motorische verschijnselen treden aan beide lichaamshelften op.

De gegeneraliseerde aanvallen worden verder onderverdeeld in tonisch-clonische, absence, myoclonische en atonische aanvallen, waarvan de eerste twee de meest voorkomende zijn.[5 cursus prof. Ulens invoegen]

Tonisch-clonische aanvallen, ook wel “grand mal” genoemd, gaan gepaard met plots bewustzijnsverlies. Ze behoren tot de meest voorkomende epileptische aanvallen. Ze beginnen ofwel onmiddellijk gegeneraliseerd, ofwel komen ze voort uit partiële aanvallen. In een eerste fase verkrampen de spieren van de patiënt. Dit is de tonische contractie die zich kan uiten in een verlies van lichaamshouding, een schreeuw, een beet in tong of wangen en incontinentie. De volgende fase is de clonische fase, die enkele seconden tot minuten kan duren en gekenmerkt wordt door een serie ritmische contracties van de spieren van de ledematen. Na deze fase is de patiënt meestal nog enkele minuten bewusteloos, en na terugkeer van het bewustzijn nog enige tijd gedesoriënteerd.

Absence aanvallen worden ook wel “petit mal” genoemd. De patiënt verliest gedurende korte tijd het bewustzijn, en reageert niet op de omgeving. In vele gevallen is wat dromerig staren de enige uiting van een aanval en heeft de patiënt de aanval niet opgemerkt. Absences komen vooral voor tijdens de kinderjaren en worden makkelijk verward met dromerigheid en onoplettendheid. Deze aanvallen kunnen honderden keren per dag voorkomen. Bij een lage frequentie kan het weken tot maanden duren voor ze herkend worden als epileptische aanvallen. [6]

Myoclonische aanvallen worden gekenmerkt door korte, onwillekeurige samentrekkingen van de spieren. Dit resulteert in een plotse hevige schok van de patiënt. Ook mensen zonder epilepsie kunnen een myoclonische aanval ondergaan, bijvoorbeeld in de vorm van een plotse schok, net voor het inslapen.

Atonische aanvallen gaan gepaard met een snel verlies van de lichaamshouding, als gevolg van een plots gebrek aan spierspanning. De patiënt zal neervallen en zichzelf mogelijk verwonden. De aanval duurt niet langer dan 15 seconden.[7]

1.1.2.2 Partiële aanvallen

Bij een partiële aanval beginnen de convulsies op een gelokaliseerde manier, in veel gevallen als gevolg van een plaatselijke pathologische verandering, bijvoorbeeld een tumor, of zelden als gevolg van een genetisch defect. Deze convulsies kunnen dan verder uitbreiden naar andere hersengebieden. De lokalisatie, en de snelheid en omvang van de verspreiding zullen de klinische manifestatie van de convulsies bepalen. Naargelang de plaats waar de aanval begint zal de persoon een verschillende ervaring beleven: bewegingen, gevoelservaringen, vlekken of flitsen zien enz. Partiële aanvallen kunnen dus zeer verschillend zijn [4]

Partiële aanvallen worden verder onderverdeeld in eenvoudige partiële aanvallen, complexe partiële aanvallen en partiële aanvallen met secundaire generalisatie.[5]

In het geval van een eenvoudige partiële aanval blijft de stoornis in de hersenen tot een klein deel beperkt en blijft de patiënt bijgevolg bij bewustzijn.

Indien de aanval verder uitbreidt of meteen in een groter deel van de hersenen ontstaat wordt het bewustzijn in min of meerdere mate gestoord. Dit is een complexe partiële aanval. De aanval duurt

meestal slechts enkele minuten en na terugkeer van het bewustzijn kan de persoon meestal gewoon verdergaan met zijn activiteiten.

De aanval kan met uiteenlopende verschijnselen gepaard gaan, afhankelijk van de lokalisatie van de aanval in de hersenen:

In de achterhoofdskwab (occipitaal) zijn het visuele verschijnselen zoals lichtflitsen, illusies en hallucinaties. In de wandbeenkwab (pariëtaal) kunnen er abnormale gevoelswaarnemingen ontstaan zoals tintelingen.In de slaapkwab (temporaal) kunnen er auditieve verschijnselen optreden of vegetatieve, zoals een benauwd gevoel in de maag.In de voorhoofdskwab (frontaal) zijn er motorische verschijnselen. Soms zijn ze goed gelokaliseerd zoals trekkingen in arm of been, andere keren treden hevige ongecoördineerde bewegingen op. (Figuur 3)

Bij sommige aanvallen kan er zelfs verlies zijn van de controle op blaas en/of darmen.[8]

Figuur 3: Hersengebieden en de manifestaties die optreden bij beïnvloeding [8]

1.1.2.3 Status epilepticus

De aanvallen kunnen van zeer verschillende duur zijn. Sommige aanvallen duren enkele seconden, anderen duren enkele minuten. Indien de aanval langer duurt dan 20 minuten of als de patiënt tussen twee aanvallen niet tot bewustzijn komt spreken we van status epilepticus.

1.1.3 Behandeling

Epilepsie was één van de eerste neurologische ziekten die behandeld kon worden met efficiënte geneesmiddelen. In 1857 al ontdekte Charles Lockock de effectiviteit van bromiden bij de behandeling van hysterisch-epileptische convulsies bij een groep vrouwelijke patienten. De bromiden werden op dat moment beschouwd als libido-onderdrukkende stoffen, maar al snel werd duidelijk dat ze activiteit vertoonden tegen epileptische convulsies. Later, in 1912, gebruikte Hauptman voor het eerst fenobarbital om agitatie en agressie bij chronisch mentaal zieke patienten te onderdrukken. Ook hier duurde het niet lang voor de link naar een anti-epileptische activiteit gelegd werd, en van dan af werd fenobarbital het eerste keuze geneesmiddel voor de behandeling van epilepsie. Putnam en Merrit toonden experimenteel aan dat ook de groep van de hydantoïnen, waartoe bijvoorbeeld fenytoïne behoort, nuttig kunnen zijn in het controleren van convulsies. Lennox gebruikte in 1945 trimethadione om absences te behandelen, wat gevolgd werd door het gebruik van ethosuximide, door Zimmerman in 1951. Later, in de jaren 60, verschenen carbamazepine en natrium valproaat als eerstelijns geneesmiddelen, en samen met de groep van de benzodiazepines, fenytoïne en ethosuximide zijn ze de standaardbehandeling voor epilepsie gebleven. Fenobarbital en trimethadione worden minder en minder gebruikt omwille van hun toxische nevenwerkingen.[7]Sinds de jaren 90 zijn nieuwere anti-epileptische geneesmiddelen ontwikkeld met een goede effectiviteit, minder toxische effecten, betere verdraagbaarheid en zonder de nood aan monitoring van de bloedconcentratie. Enkele van deze nieuwe geneesmiddelen zijn oxcarbazepine, vigabatrine, lamotrigine, gabapentine, topiramaat, felbamaat en zonisamide.

1.1.3.1 Werkingsmechanismen van anti-epileptica

Anti-epileptische geneesmiddelen (AED’s) voorkomen convulsies door inwerking op verschillende moleculaire doelwitten om selectief de exciteerbaarheid van neuronen te beïnvloeden. Ze doen dit op een manier die convulsiegerelateerde activiteit blokkeert zonder de niet-epileptische activiteit te verstoren. AED’s beschermen dus tegen convulsies, maar laten tegelijkertijd een normaal functioneren van het zenuwstelsel toe.

De AED’s kunnen geclassificeerd worden op basis van hun werkingsmechanismen, hoewel de meesten verschillende werkingsmechanismen hebben en deze van anderen ongekend zijn.

De eerste groep bestaat uit anti-epileptica die het continue, herhaaldelijke afvuren in individuele neuronen blokkeren. Dit effect wordt voornamelijk verkregen door het blokkeren van spanningsafhankelijke natrium of calcium kanalen. Neuronale activiteit hangt af van deze kanalen die van belang zijn voor het uitlokken van de actiepotentiaal. Deze geneesmiddelen zijn effectief tegen gegeneraliseerde tonisch-clonische en partiele aanvallen. Tot deze groep behoren fenytoïne, carbamazepine, valproaat, fenobarbital, lamotrigine, oxcarbazepine, topiramaat, zonisamide en gabapentine.

De tweede groep bestaat uit ethosuximide en dimethadione, de actieve metaboliet van trimethadione. Deze moleculen blokkeren T-type calcium kanalen en zijn in het bijzonder effectief tegen absences.

De derde groep anti-epileptica oefent zijn werking uit via de modulatie van γ-aminoboterzuur (GABA) transmissie. Ze potentieren de inhibitorische werking van GABA, en verlagen zo de convulsiedrempel. GABA-ergische inhibitie is een belangrijke factor in de onderdrukking van convulsies bij epileptische patienten. GABA-receptoren omvatten twee verschillende types: ionotrope en metabotrope receptoren. De ionotrope receptoren zijn geassocieerd met een Cl- - kanaal, en worden

onderverdeeld in de GABAA en de GABAC receptoren. De metabotrope receptoren zijn gelinkt aan een cascade van second messengers in de neuronen en worden GABAB receptoren genoemd.De GABAA receptor beschikt over bindingsplaatsen voor GABA zelf, maar ook voor benzodiazepines, barbituraten, ethanol en picrotoxine, dat een chloride kanaal blokker is. Bij binding van GABA aan de GABAA receptor treedt een opening van het Cl- - kanaal op, met als gevolg een instroom van chloride ionen in het neuron. Deze instroom van anionen verhoogt de negatieve potentiaal in de cel. Er wordt dus een hyperpolarisatie geïnduceerd. Dit maakt het moeilijker voor de cel om een actiepotentiaal te genereren. Benzodiazepines verhogen de frequentie van kanaalopening, terwijl de barbituraten het aantal geopende kanalen verhogen. Beide verhogen ook de affiniteit van GABAA receptoren voor de neurotransmitter.Binding van GABA aan GABAB receptoren resulteert in de activatie van fosfolipase A2 en de daaropvolgende synthese van arachidonzuur. Arachidonzuur is via regulatorische G i proteïnen in staat de activiteit van adenylaat cyclase, en zo de cAMP concentratie, te moduleren. Via GABAB receptoren kan GABA dus de vrijzetting van andere neurotransmitters, belangrijk voor de neuronale activiteit, beïnvloeden.GABAC receptoren worden vooral in de retina gevonden, en hun fysiologische betekenis staat nog ter discussie.Tot deze groep behoren de benzodiazepines, gabapentine, fenobarbital, tiagabine, topiramaat, vigabatrine en valproaat.

Een laatste groep van anti-epileptische drugs werkt via een reductie van signalen gemedieerd door excitatorische aminozuren. Deze aminozuren, bijvoorbeeld glutamaat of asparaat, zijn zonder twijfel betrokken bij het ontstaan van convulsies. Glutamaat en afgeleide stoffen induceren immers convulsies wanneer ze systemisch of intracerebraal worden aangebracht. Samen met het feit dat sommige gevallen van epilepsie gepaard gaan met sterke verhoging aan excitatorische aminozuren in het plasma, wijst dit erop dat deze aminozuren waarschijnlijk een rol spelen in het voorkomen van epilepsie bij mensen. Deze veronderstelling wordt ondersteund door de effectiviteit die excitatorische aminozuur antagonisten, en vooral deze die inwerken op ionotrope glutamaat receptoren, vertonen. Als gevolg van de binding van glutamaat zullen de receptoren de stroom van zowel natrium als calcium ionen in de cel vergemakkelijken, terwijl kalium uit de cel stroomt, resulterend in excitatie. Verschillende receptoren mediëren ter hoogte van het postsynaptisch membraan het effect van glutamaatvrijzetting: N-methyl-D-aspartaat (NMDA), α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole (AMPA), kainaat en metabotrope receptoren. Deze receptoren zijn volgens verschillende mechanismen gekoppeld aan depolariserende kanalen.Momenteel zijn er slechts enkele anti-epileptica die via dit mechanisme inwerken: felbamaat, fenobarbital en topiramaat.[10],[11]

AED’s voorkomen dan wel convulsies, toch zijn ze niet anti-epileptogeen. Ze zijn niet in staat epilepsie te voorkomen, of een invloed uit te oefenen op de onderliggende oorzaken die de convulsies induceren. Uiteindelijk zullen AED’s enkel een eerste stap zijn naar de ontwikkeling van geneesmiddelen die zullen inwerken op de oorzaak van de epilepsie, eerder dan op de symptomen ervan.

1.1.4 Nood aan nieuwe anti-epileptica

Ondanks deze snelle vooruitgang kan ongeveer 1/3de van alle epilepsiepatiënten niet voldoende geholpen worden door medicatie, terwijl de convulsies een impact hebben op het gewone dagelijkse leven en het sociale welzijn, en de onafhankelijk van de patiënt en de kwaliteit van leven beïnvloeden.[12]

Vele van de ingeburgerde en meer moderne AED’s hebben te kampen met ernstige toxiciteitsproblemen. Neurotoxische neveneffecten zoals misselijkheid, diplopie, duizeligheid, hoofdpijn, vermoeidheid en ataxie zijn enkele van de vaak voorkomende problemen die gemeld worden door patienten, behandeld met AED’s. Sommige AED’s veroorzaken ook psychiatrische stoornissen, vooral depressie en psychose.[13] Merkwaardige reacties, zoals huiduitslag, of in ernstigere gevallen bloedaandoeningen of levertoxiciteit worden beschreven in de literatuur. Felbamaat werd zo door meldingen in verband met aplastische anemie en leverfalen gedegradeerd tot laatste keuze geneesmiddel in geval van weerbarstige epilepsie. Sommige van de meest zorgwekkende aspecten van behandeling met antiepileptica zijn chronische neveneffecten die bijvoorbeeld kunnen veranderen hoe een persoon eruitziet of zich voelt, beenderen of pezen kunnen aantasten, en sexuele functie of vruchtbaarheid kunnen verminderen. (tabel 1)

De oudere AED’s zijn berucht voor de mogelijkheid tot farmacologische interacties, zowel onder elkaar als met andere geneesmiddelen. Vele interfereren met de aanmaak van metabolische

Tabel 1: Enkele chronische neveneffecten van anti-epileptische geneesmiddelenAcne HypocalcemieHirsutisme OsteomalacieOvermatige groeivan het tandvlees

Osteoporose

Gewichtstoename Perifere neuropathie

Haaruitval

DepressiePsychose

Polycystische ovariaVerminderd libidoImpotentieOnvruchtbaarheid

Teratogenese

Beperkt gezichtsveldCerebellaire atrofie

Ziekte van Depuytren Capsulitis adhaesiva(Frozen shoulder)

Lupus-achtig syndroomPseudolymfoma

leverenzymen. Fenobarbital,primidone, fenytoïne, carbamazepine en, meer selectief, topiramaat, oxcarbazepine en felbamaat induceren de synthese van één of meerdere isovormen van enzymen van de cytochroom P450 superfamilie. Hierdoor wordt de klaring versneld, de halfwaardetijd verkort, de concentratie verlaagd en dus de kosten van andere vetoplosbare geneesmiddelen verhoogd. De endogene substanties, zoals hormonen en vitaminen, worden ook sneller verwerkt als gevolg van de geïnduceerde enzymen, en dit kan bijdragen tot sommige van de chronische effecten, vermeld in tabel 1.

Er is dus duidelijk nood aan nieuwe anti-epileptica die een betere effectiviteit vertonen en die niet gebukt gaan onder problemen van toxiciteit en farmacologische interacties. Er is geen behoefte aan meer “me-too” geneesmiddelen, met gelijkaardige werkingsmechanismen, maar het onderzoek moet zich richten op innoverende ontwikkelingen. [14]

1.2 De Zebravis biotest

Danio rerio, de zebravis, is een zoetwatervis die behoort tot de familie van de Cyprinidae. Deze vertebraat komt oorspronkelijk voor in de rivieren van het zuidoostelijke Himalaya-gebied, maar ze leven er ook in sloten, meren en rijstvelden. De volwassen vis kan ongeveer 3 tot 4 cm groot worden en kan tot vijf jaar oud worden. (Figuur 4) De ontwikkeling van de zebravis wordt ingedeeld in zeven stadia; zo worden zygote-, splitsings-, blastula-, gastrula, segmentatie-, en faryngula stadia onderscheiden. Tijdens het laatste stadium, na het faryngula stadium, komt het embryo vrij uit het chorion, de ‘eidooier’ van het embryo, en van dan af spreken we over een larve. Na ongeveer 90 dagen wordt de zebravis dan als volwassen beschouwd. [15],[16]

Figuur 4: Danio rerio, de zebravis

1.2.1 De zebravis als proefdiermodel

Hoewel de zebravis bekend staat als model in de studie van de ontwikkeling en het zicht wordt deze kleine vertebraat toch meer en meer gebruikt in de zoektocht naar geneesmiddelen. De zebravis biedt immers een unieke combinatie van een genetische soepelheid, een sterke overeenkomst met hogere vertebraten en handige experimentele methoden die van deze vis een ideaal model maken.[17]

Omwille van de sterke genetische, fysiologische en farmacologische gelijkenis met de mens zijn zebravissen een zeer interessant hulpmiddel in de eerste identificatie van mogelijk therapeutisch actieve stoffen. De zebravis heeft vele voordelen als model. De beperkte grootte van de embryo’s en larven is een eerste zeer groot voordeel gezien de meeste testen op vissen in deze stadia kunnen gebeuren. De embryo’s en larven zijn transparant waardoor het detecteren van functionele en morfologische veranderingen sterk vergemakkelijkt wordt. Verder is de enorme vruchtbaarheid van de vissen een enorm voordeel. Zo kan een vruchtbaar koppel tot tweehonderd nakomelingen per week voortbrengen. Een andere handigheid bestaat uit het feit dat de te testen stoffen gewoonweg aan het water kunnen worden toegevoegd wat de snelheid van testen uiteraard bevordert. Gezien de vissen tijdens de larvale stadia makkelijk kunnen leven in een volume van 50 µl zijn screeningen in 96-well platen mogelijk. Hierdoor kan de benodigde hoeveelheid van de te testen stoffen sterk beperkt worden.

Vermits de meeste screeningen gebeuren in embryo’s of larven is het belangrijk rekening te houden met de verschillen tussen deze ontwikkelende vissen en volwassen mensen. De zebravis kan dus de behoefte aan een gesofisticeerd zoogdiermodel niet wegnemen, en alle moleculen dienen na

identificatie in de zebravis gevalideerd te worden in een gepast knaagdiermodel.Afhankelijk van moleculegewicht en hydrofobiciteit kunnen sommige stoffen minder, of niet, geabsorbeerd worden door embryo’s en larven, wat kan leiden tot vals negatieven. Een laatste beperking tenslotte bestaat eruit dat er, gezien men met vertebraten werkt, rekening moet gehouden worden met de plaatselijke regulatie rond dierenrechten en bio-ethiek.[20]

1.2.2 Rol van de zebravis in de zoektocht naar anti-epileptica

Zebravissen worden sinds kort ook gebruikt als experimenteel model in de zoektocht naar nieuwe anti-epileptica. Als proconvulsieve stof wordt pentyleentetrazol (PTZ) gebruikt. Om nuttig te zijn met het oog op een latere toepassing op zoogdieren, en uiteindelijk de mens, moet de aard van de convulsies die bij de zebravis opgewekt worden overeenkomen met deze die men bij epilepsiepatiënten aantreft. Daarom is het nodig om de zebravis als epilepsiemodel zowel met betrekking tot gedragingen als elektrofysiologisch, als moleculair te verifiëren. [18]

Met betrekking tot het gedrag van zebravissen, geïncubeerd in PTZ, kunnen 3 fazen onderscheiden worden.Aanvankelijk verhoogt de zwemactiviteit van de vissen drastisch. Dit wordt gevolgd door een fase waarin de larven een snelle ‘whirlpool’-achtige zwembeweging maken. Dit houdt in dat de larven snel in cirkels zwemmen tegen de rand van de well. Dit gedrag vloeit dan verder in een derde fase die bestaat uit een serie van korte clonische convulsies, waarna de larven hun lichaamshouding voor een korte tijd verliezen. De vis zal naar een kant vallen en gedurende 1 tot 3 seconden onbeweeglijk blijven. Dit zijn allen zeer typische gedragingen, vermits geen van deze motorische stoornissen optreden bij vissen die opgevolgd worden in normale omstandigheden. De vertraging waarmee de verschillende fasen optreden, en in hoeverre de vissen alle drie de fasen zullen doormaken is duidelijk afhankelijk van de concentratie PTZ in het water. (Figuur 5) [18]

Figuur 5: Het gedrag van de larven is afhankelijk van de concentratie PTZ. A: Vertraging met betrekking tot het optreden van de verschillende convulsiefasen. De verschillende balken betreffen een verschillende concentratie PTZ; blauw = 2.5 mM, geel= 5mM, groen= 15mM. Het oneindigheidssymbool wijst erop dat geen vissen deze fase bereiken bij deze concentratie. B: De verschillende balken geven de convulsiefase aan die bereikt wordt bij de gegeven concentratie; zwart=fase I,

grijs=fase II, wit=fase III. [18]

Lagere concentraties aan PTZ lokken enkel fase I en fase II convulsies uit, maar bijna 75% van alle vissen ondergaat een fase III convulsie in aanwezigheid van de hoogste concentratie PTZ.

Elektrofysiologisch gaan convulsies, spontaan of geïnduceerd, gepaard met abnormale elektrische ontladingen. In vitro elektrofysiologische experimenten werden uitgevoerd om te verifieren of PTZ-geïnduceerde convulsies een elektrografische component vertonen. Uit deze experimenten is gebleken dat de larven, geïncubeerd in PTZ, spontane epileptiforme ontladingen ondergaan die overeenkomen met ontladingen die gezien worden in het zenuwstelsel van knaagdieren of mensen die een convulsie ondergaan.

Om de moleculaire basis van de zebravistest te verifiëren werden de vissen behandeld met stoffen die de synaptische transmissie blokkeren, nadat een stabiel patroon van epileptiforme ontladingen bereikt werd door middel van incubatie in PTZ. Indien de chemisch uitgelokte epileptiforme ontladingen in de vis inderdaad gelijk zijn aan deze in zoogdieren, verwacht men dat deze activiteit met dergelijke stoffen kan gemoduleerd worden. Na toevoeging van tetrodotoxine, een stof die de Na+ afhankelijke actiepotentiaal blokkeert, ziet men de elektrische ontladingen verdwijnen. (Figuur 6B)Ook stoffen die de excitatorische, glutamaat-gemedieerde synaptische transmissie blokkeren werden getest. Hiervoor werd gebruikt gemaakt van een ‘cocktail’ van NMDA en niet-NMDA receptor blokkers. Ook met kynurenaat, een niet-specifieke blokker van postsynaptische glutamaat receptoren werd deze transmissiemodulatie getest. Beide methoden verminderden significant de PTZ-geïnduceerde epileptiforme ontladingen. (Figuur 6A) [18]

Figuur 6: Tetrodotoxine en kynurenaat kunnen PTZ-geïnduceerde epileptiforme ontladingen verminderen. [18]

Wanneer bij knaagdieren convulsies worden geïnduceerd resulteert dit in een expressie van bepaalde genen in de hersenregio’s die gelinkt worden aan convulsie-initiatie. Om te controleren of PTZ-geïnduceerde convulsies de expressie van deze genen beïnvloeden werd het c-fos mRNA gemeten. Zo werd bewezen dat de c-fos mRNA concentratie zeer sterk was gestegen. [18]

Deze bevindingen worden nog kracht bijgezet door de resultaten van S. Berghmans en collega’s (2007). In deze studie worden 14 AED’s getest op zebravissen die voordien geïncubeerd werden met pentyleentetrazol. Met 13 van deze 14 anti-epileptica kon een vermindering van excessieve bewegingen gevonden worden. Een uitgevoerde toxiciteits- en sedatietest doet vermoeden dat deze effecten te danken zijn aan een anti-epileptisch effect, hoewel niet-specifieke effecten nooit uitgesloten kunnen worden. [19]

Er is dus aangetoond dat de PTZ-geïnduceerde convulsies bij de zebravis biotest relevant zijn met verdere betrekking tot de mens en dat deze biotest in staat is tot het identificeren van een reeks anti-epileptische geneesmiddelen. Het is duidelijk dat deze biotest een zeer belangrijke rol kan vervullen in de screening naar nieuwe onbekende anti-epileptica.

1.3 Zoektocht naar anti-epileptica in de plantenwereld

1.3.1 Planten als bron van nieuwe geneesmiddelen

Zolang er aan geneeskunde wordt gedaan worden chemische verbindingen, afgeleid van dieren en planten, al gebruikt om ziekten bij de mens te bestrijden. De interesse in natuurlijke producten in deze context mag er dan al op achteruit gegaan zijn de voorbije decennia, ze blijven een onuitputtelijke bron van chemische diversiteit. [20]

Cruciale doorbraken in scheidings- en structuurophelderings-technieken hebben de belangrijkste hinderpalen, die gepaard gingen met de screening van complexe mengsels, overwonnen. Samen met een beter inzicht in de sterke specificiteit die secundaire metabolieten hebben verkregen doorheen de evolutie, en de vooruitgang die geboekt is in de synthetische scheikunde, maken zij dat de mogelijkheden steeds blijven toenemen.

De zoektocht naar therapeutisch interessante verbindingen kan twee wegen volgen. De ene tracht ruwe extracten te ontleden om zo een eventueel actief bestanddeel te identificeren. De andere aanpak gebruikt de kracht van combinatoriële synthese om de unieke eigenschappen van natuurlijke producten te optimaliseren. Het samenkomen van al deze technieken zal enorme mogelijkheden bieden om de enorme chemische diversiteit aan natuurlijke molecules verder te exploiteren in de zoektocht naar nieuwe geneesmiddelen[21]

Ook vandaag blijven planten dus een belangrijke weg in de zoektocht naar nieuwe medicijnen.

1.3.2 Planten als bron van nieuwe anti-epileptica

Het is daarom interessant om in de zoektocht naar nieuwe anti-epileptische geneesmiddelen te gaan kijken naar bepaalde planten die enige anti-convulsieve activiteit worden toegedragen. In deze context lijkt het zeker de moeite te zijn om verder onderzoek uit te voeren op de plant Curcuma longa. Vanuit verschillende invalshoeken zijn er immers aanwijzingen te vinden voor een anti-convulsieve activiteit, aanwezig in deze plant.

Curcuma is een genus van ongeveer 80 soorten in de plantenfamilie van de Zingiberaceae, de gemberfamilie. Het poeder, vervaardigd uit de rhizomen van de soort Curcuma longa, ook wel Curcuma domestica genoemd, wordt gebruik voor het kruiden en kleuren van voedsel. Ook wordt deze plant al eeuwen gebruikt in de etnomedische wereld voor de behandeling van een variëteit aan inflammatoire aandoeningen en andere ziekten. De therapeutische eigenschappen van dit kruid worden voornamelijk toegeschreven aan de curcuminoïden. De belangrijkste component hiervan is curcumine met de chemische structuurformule (E,E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-1,6-heptadieen-3,5-dion. De andere twee belangrijkste curcuminoïden zijn demethoxy curcumine en bisdemethoxycurcumine. (Figuur 7) [22]

Curcumine is een oranje-geel kristallijn poeder dat practisch onoplosbaar is in water. De stof heeft bewezen een wijde farmacologische activiteit te bezitten zoals anti-inflammatoir, antikanker, antioxidatief, en antimicrobieel. De antioxidatieve activiteit van curcumine is te danken aan de aanwezigheid van twee elektrofiele, β-ongesatureerde carbonylgroepen in zijn structuur (figuur 7), dewelke kunnen reageren met nucleofielen, net zoals gluthation. Hierdoor heeft curcumine de mogelijkheid om lipidenperoxidatie te voorkomen en reactieve O- en NO-radicalen te neutraliseren. In de literatuur wordt de antioxidatieve activiteit van curcumine beschreven als minstens tien keer zo sterk als deze van vitamine E. [23],[24] ZEKER VRAAG OP VERDEDIGING!!!! UITLEG, ZIE [24] !!!!!

Figuur 7: Chemische structuur van de curcuminoïden curcumine, demethoxy curcumine en bisdemethoxycurcumine.

Recent zijn er publicaties verschenen over studies op knaagdieren die de anti-convulsieve activiteit van curcumines onder de loep hebben genomen. In verschillende studies, via verschillende methoden uitgevoerd, komt de anticonvulsieve activiteit van curcumine naar voren. Deze studies tonen onder andere aan dat curcumine zowel acuut, als chronisch toegediend een anticonvulsieve actie vertoont.[25] Er werd elektrofysiologisch, biochemisch, microscopisch en met betrekking tot gedragingen vastgesteld dat curcumine een significante anti-epileptische therapeutische waarde heeft.[23],[26]

Verdere bevindingen die wijzen op een anticonvulsieve activiteit, aanwezig in Curcuma longa, worden gevonden in de etnomedische wereld. Zo worden bladeren van de plant door Tanzaniaanse genezers gebruikt in de behandeling van convulsies. Deze genezers maken gebruik van een afkooksel van de bladeren van Curcuma dat dan oraal of via inhalatie wordt toegediend. [27]In de ayurveda, een hindoeïstische gezondheidsleer uit India, wordt gebruikt gemaakt van het poeder vervaardigd uit de rhizomen van Curcuma longa in de behandeling van vele aandoeningen waaronder huidaandoeningen, pulmonaire aandoeningen en gastrointestinale aandoeningen.[28]In deze context wordt ook het gebruik in geval van epilepsie gemeld, wat nog maar eens aanwijzing is voor de aanwezigheid van een anticonvulsieve activiteit.[29]

Referenties

[1] J. Jr. Engel, T. Pedley, editors (2007). Epilepsy: a comprehensive textbook, 2nd ed. Vols 1-3. Philadelphia: Lippencott Williams & Wilkins.

[2] C.E. Elger, D. Schmidt (2008). Modern management of epilepsy: A practical approach. Epilepsy and behavior , 12, 501-539.

[3] B.S. Chang, D.H. Lowenstein (2003). Mechnism of disease: Epilepsy. New England Journal of Medicine, 349, 1257-1266.

[4]J.E.Cavazos, M.spitz(2009).Seizures and epilepsy: overview and classification.

[5] C. Ulens (2008). Cursus farmacologie, 1e Master Farmaceutische Wetenschappen, hoofdstuk epilepsie

[6] Epilepsie, de ziekte en de gevolgen voor de patiënt. Afgehaald op 21 maart, 2009, van http://www.rivm.nl/vtv/object_class/kom_epilepsie.html

[7] All About Epilepsy & Seizures. Afgehaald op 21 maart, 2009, van http://www.epilepsy.com/epilepsy/types_seizures

[8] Vlaamse Liga Tegen Epilepsie. Afgehaald op 21 maart, 2009, van http://www.epilepsieliga.be/files/wat/aanvalsvormen.php

[9] J. M. Lopes Lima (2000). The new drugs and the strategies to manage epilepsy. Current Pharmaceutical Design, 6, 873-878.

[10] P. Czapinski, B. Blaszczyk, S. J. Czuczwar (2005). Mechanism of action of antiepileptic drugs. Current Topics in Medicinal Chemistry, 5, 3-14.

[11] B. S. Meldrum (1996). Update on the mechanism of action of antiepileptic drugs. Epilepsia, 37, s4-s11.

[12] J.A.Johnston, M.I.Rees, P.E.M. Smith (2009). Epilepsy genetics: clinical beginnings and social consequences. QJM - Monthly Journal of the Association of Physicians, 1460-2725.

[13] M.Mula, J.W. Sander (2007). Negative effects of antiepileptic drugs on mood in patients with epilepsy. Drug safety, 30, 555-567.

[14] M.J. Brodie (2001). Do we need any more new antiepileptic drugs? Epilepsy research, 45, 3-6.

[15] R.L. Mayden, K. L. Tang, K. W. Conway, J. Freyhof, S. Chamberlain, M. Haskins,L. Schneider, M. Sudkamp, R. M. Wood, M. Agnew, A. Bufalino, Z. Sulaiman, M. Miya,K. Saitoh, S. HE (2007). Phylogenetic Relationships of Danio Within the Order Cypriniformes: A Framework for Comparative and Evolutionary Studies of a Model Species. Journal of Experimental Zoolog, 308, 642-654.

[16]C.B. Kimmel, W.W. Ballard, S.R. Kimmel, B. Ullman, T.F. Schilling (1995). Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203, 253-310.

[17] S.C. Baraban (2007). Emerging epilepsy models: insight from mice, flies, worms and fish. Current opinion in Neurology, 20, 164-168.

[18] S.C. Baraban, M.R. Taylor, P.A. Castro, H. Baier (2005). Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience, 131, 759-768.

[19]S. Berghmans, J. Hunt, A. Roach, P. Goldsmith (2007). Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants. Epilepsy research, 75, 18-28.

[20] A.D. Crawford, C.V. Esguerra, P.A.M. de Witte (2008). Fishing for drugs from nature: zebrafish as a technology platform for natural product discovery. Planta Medica, 74, 624-632.

[21] F.E. Koehn, G.T. Carter (2005). The evolving role of natural products in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery, 4, 206-220.

[22] R.K. Maheswari, A.K. Singh, J. Gaddipati, R.C. Srimal (2006). Multiple biological activities of curcumin: a short review. Life Sciences, 78, 2081-2087.

[23] A. Jyoti, P. Sethi, D. Sharma (2009). Curcumin protects against electrobehavioral progression of seizures in the iron-induced experimental model of epileptogenesis. Epilepsy and Behavior, 14, 300-308.

[24] T. Ak, I. Gulçin (2008). Antioxidant and radical scavenging properties of curcumin. Chemico-Biological Interactions, 174, 27-37.

[25] N. Bharal, K. Sahaya, S. Jain, P.K. Mediratta, K.K. Sharma (2008). Curcumin has anticonvulsant activity on increasing current electroshock seizures in mice. Phytotherapy Research, 22, 1660-1664.

[26] C. Jithendra, T.E.G.K. Murthy, L. Upadyay (2008). Protective role of curcumin in maximal electroshock induced seizures, memory impairment and neurotransmitters in rat brain. Journal of Pre-clinical and Clinical Research, 2, 35-39.

[27] M.J. Moshi, G.A.B. Kagasbe, Z.H. Mbwambo (2005). Plants used to treat epilepsy by Tanzanian traditional healers. Journal opf Ethnopharmacology, 97, 327-336.

[28] B.B. Aggarwal, C. Sundaram, N. Malani, H. Ichikawa (2007). Curcumin: the Indian solid gold. Advances in Experimental Medicine and Biology, 595, 1-75.

[29] S.C. Schachter (2009). Botanical and herbs: A traditional approach to treating epilepsy. The Journal of the American Society for Experimental Neurotherapeutics, 6, 415-420.