วทยานพนธ ระบาดวทยาการตดเชอ Burkholderia pseudomallei

ในสวนสตวสงขลา

EPIDEMIOLOGY OF BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI

IN SONGKHLA ZOO

นางสาวอรรถพร จนพนธ

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

พ.ศ. 2556

ใบรบรองวทยานพนธ

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

ปรญญา

สาขา ภาควชา

เรอง ระบาดวทยาการตดเชอ Burkholderia pseudomallei ในสวนสตวสงขลา

Epidemiology of Burkholderia pseudomallei in Songkhla zoo

นามผวจย นางสาวอรรถพร จนพนธ

ไดพจารณาเหนชอบโดย

อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก

( )

หวหนาภาควชา

( ผชวยศาสตราจารยสวชา เกษมสวรรณ, M.Phil. )

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยเกษตรศาสตรรบรองแลว

( ) คณบดบณฑตวทยาลย

วนท

เดอน

พ.ศ.

วทยาศาสตรมหาบณฑต (ระบาดวทยาทางสตวแพทย)

ระบาดวทยาทางสตวแพทย สตวแพทยสาธารณสขศาสตร

รองศาสตราจารยธระ รกความสข, Ph. D.

รองศาสตราจารยกญจนา ธระกล, D.Agr.

วทยานพนธ

เรอง

ระบาดวทยาการตดเชอ Burkholderia pseudomallei ในสวนสตวสงขลา

Epidemiology of Burkholderia pseudomallei in Songkhla Zoo

โดย

นางสาวอรรถพร จนพนธ

เสนอ

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

เพอความสมบรณแหงปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต (ระบาดวทยาทางสตวแพทย)

พ.ศ. 2556

อรรถพร จนพนธ 2556: ระบาดวทยาการตดเชอ Burkholderia pseudomallei ในสวนสตว

สงขลา ปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต (ระบาดวทยาทางสตวแพทย) สาขาระบาดวทยา

ทางสตวแพทย ภาควชาสตวแพทยสาธารณสขศาสตร อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก:

รองศาตราจารยธระ รกความสข, Ph.D. 71 หนา

การศกษาระบาดวทยาของการตดเชอ Burkholderia pseudomallei ในสวนสตวสงขลา เพอ

ตองการประเมนความชกทางซรมทงในสตวและผปฏบตงานสมผสกบสตวเชน สตวแพทย และคน

เลยงสตว สารวจเชอในดนเพอประเมนการปนเปอนของเชอและวเคราะหลาดบนวคลโอไทดของ

เชอทพบในดนและสตวเพอตรวจสอบความเชอมโยงทางพนธกรรม เกบตวอยางซรมจากสตว

จานวน 65 ตวอยาง ตรวจดวยวธ indirect hemagglutination (IHA) เกบตวอยางในผปฏบตงาน

สมผสกบสตวจานวน 93 คน ตรวจดวยวธ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) สวนการ

ประเมนการปนเปอนของเชอ B. pseudomallei ในดน เกบตวอยางดนในบรเวณสวนสตวจานวน 9

จด และนามาเพาะแยกเชอดวยอาหารเลยงเชอ Ashdown’s agar และ threonine-basal-salt solution

broth plus colistin แลวนาเชอทเพาะแยกไดจากดนมาเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทด กบเชอทเพาะ

แยกไดจากสตวปวยตายในสวนสตว ดวยวธ multilocus sequence typing (MLST) ผลการศกษา

พบวาความชกทางซรมในสตวคดเปนรอยละ 1.53 (1/65) สวนผทปฏบตงานสมผสกบสตวพบ

ความชกคดเปนรอยละ 1.07 (1/93) การเพาะแยกเชอจากดนพบเชอ B. pseudomallei จานวน 1 จด

จากคอกทมประวตการปวยตายของมาลาย เมอนามาเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดกบเชอทพบใน

มาลาย และอรงอตง พบวาลาดบนวคลโอไทดของเชอทพบในดนและสตวมความแตกตางกน จาก

การศกษานสรปไดวาเชอ B. pseudomallei พบไดในสงแวดลอมในสวนสตวสงขลาและมสตว

บางสวนมการตดเชอนโดยเชอทพบมลกษณะทางพนธกรรมเหมอนเชอทมรายงานการพบใน

ประเทศไทย

ลายมอชอนสต ลายมอชออาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก

Autthaporn Jeenpun 2013: Epidemiology of Burkholderia pseudomallei in Songkhla

Zoo. Master of Science (Veterinary Epidemiology), Major Field: Veterinary

Epidemiology, Department of Veterinary Public Health. Thesis Advisor: Associate

Professor Theera Rukkwamsuk, Ph.D. 71 pages.

This study aimed to determine the prevalence of Burkholderia pseudomallei infection in

zoo animals, zoo keepers and veterinarians. The study also attempted to evaluate the

contamination of B. pseudomallei in the soil so as to compare the isolates of B. pseudomallei

from zoo animals and from the soil in the Songkhla zoo. We collected 65 serum samples from

zoo animals and 93 serum samples from zoo keepers and veterinarians. We found that 1.53%

(1/65) of zoo animals had melioidosis seropositivity with the use of indirect hemagglutination

(IHA) test and 1.07% (1/93) of humans had melioidosis seropositivity with the use of enzyme-

linked immunosorbent assay (ELISA). Soil samples were collected from nine areas in the zoo

and were cultured using Ashdown’s agar and selective enrichment broth (threonine-basal-salt

solution broth plus colistin). B. pseudomallei was identified from only one soil sample collected

from the area where the melioidosis case were previously found in zebra. The 2 isolates of B.

pseudomallei from zebra and orangutan and 1 isolate from soil were characterized and compared

by multilocus sequence typing (MLST). Molecular results indicated that the sequences of B.

pseudomallei from soil sample and both zoo animals were different. It could be concluded that

B. pseudomallei was contaminated in the environment of the zoo and some animals were found to

be infected. The isolates observed in the zoo in this study had similar genetic characteristic to the

isolates reported in Thailand.

/ /

Student’s signature Thesis Advisor’s signature

กตตกรรมประกาศ

ผวจยขอขอบคณรองศาสตราจารย นายสตวแพทย ดร.ธระ รกความสข อาจารยทปรกษา

วทยานพนธหลก ผชวยศาสตราจารย สตวแพทยหญงสวชา เกษมสวรรณ ทใหการสนบสนนและ

คาปรกษาในการคนควา วจยและการเขยนวทยานพนธ อาจารยสตวแพทยหญง ดร.ชลาลย เรองหรญ

ทใหคาปรกษาดานเทคนคทางอณชววทยา

ขอบคณนายสตวแพทย ดร. ภาวน ผดงทศ นายสตวแพทยอญญรตน ทพยธาราทชวยอาน

ปรบปรงแกไขตนฉบบวทยานพนธ

ขอบคณรองศาสตราจารยรสนา วงครตนชวน คณสวรรณา นนทภาและบคลากรทศนย

เมลออยโดสส คณะแพทยศาสตรมหาวทยาลยขอนแกน ทใหความอนเคราะหอบรมการเพาะแยก

เชอ B. pseudomallei จากดน นายสตวแพทยชวน ไชยสงคราม บคลากรของสวนสตวเขาสวนกวาง

ทแนะนาวธการเกบตวอยางจากดน นายสตวแพทยภวดล สวรรณะ สตวแพทยหญงกานดา พลศรลา

และบคลากรของสวนสตวสงขลาทชวยเกบตวอยางซรมสตวและตวอยางดนในสวนสตว สานก

ระบาดวทยา กรมควบคมโรค กระทรวงสาธารณสข ทใหการสนบสนนการเกบและตรวจตวอยาง

เลอดในคน เจาหนาทหองปฏบตการแบคทเรยวทยาและเชอรา และหองปฏบตการอมมนและซรม

วทยา ศนยวจยและพฒนาการสตวแพทย ภาคใต ทใหความอนเคราะหเพาะแยกเชอจากดนและ

ตรวจวนจฉยโรคเมลออยโดสสทางซรมวทยา

ขอบคณสตวแพทยหญงกมลทพย เพงหรญ เพอนรวมชนเรยนทคอยชวยเหลอ สนบสนน

ในการทาวทยานพนธ

สดทายนขอบคณคาแนะนาจากคณาจารยภาควชาสตวแพทยสาธารณสขศาสตร คณะสตว

แพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสนทกทาน ทสนบสนนใหการทา

วทยานพนธสาเรจไปไดดวยด

อรรถพร จนพนธ

พฤษภาคม 2556

(1)

1

สารบญ

หนา

สารบญ (1)

สารบญตาราง (2)

สารบญภาพ (3)

คาอธบายศพทและคายอ (4)

คานา 1

วตถประสงค 3

การตรวจเอกสาร 4

อปกรณและวธการ 21

อปกรณ 21

วธการ 23

ผลและวจารณ 33

ผล 33

วจารณ 43

สรปและขอเสนอแนะ 47

สรป 47

ขอเสนอแนะ 48

เอกสารและสงอางอง 49

ภาคผนวก 61

ภาคผนวก ก ภาพโคโลนของเชอ B. pseudomalleiและสตวปวยตายดวยโรค

เมลออยสส

62

ภาคผนวก ข อาหารเลยงเชอทใชแยกเชอ B. pseudomallei จากดน 66

ภาคผนวก ค ตารางแสดงขอมล ST ของเชอ B. pseudomallei จากฐานขอมล

อนเตอรเนต www.mlst.net 69

ประวตการศกษาและการทางาน 71

(2)

สารบญตาราง

ตารางท หนา

1 ปจจยดานสงแวดลอมทมผลตอการมชวตของเชอ B. pseudomallei 7

2 การระบาดของโรคเมลออยโดสสทเกดภายในสวนสตว 18

3 ตวอยางเชอทนามาวเคราะหดวยวธ MLST 29

4 house-keeping gene ทใชในการทา MLST ของเชอ B. pseudomallei 30

5 ผลการตรวจทางซรมวทยาของการตดเชอ B. pseudomallei ดวยวธ indirect

hemagglutinationในสตวของสวนสตวสงขลาจานวน 65 ตว ในป 2555 33

6 จานวนตาแหนงทมความแตกตางของลาดบนวคลโอไทดเมอเปรยบเทยบกนใน

แตละคของตวอยาง 38

7 ผลการคานวณระยะหางเพอประเมนความแตกตางของววฒนาการระหวางลาดบ

นวคลโอไทดในแตละคของตวอยาง 38

8 ผลการวเคราะห sequence type ของเชอ B. pseudomallei ทเพาะแยกไดจากสวน

สตวดวยวธ multilocus sequence typing 39

ตารางผนวกท

ค1 ขอมล ST จากฐานขอมลทางอนเตอรเนต www.mlst.net 70

(3)

สารบญภาพ

ภาพท หนา

1 ลาดบเหตการณของการระบาดของโรคเมลออยโดสสในสวนสตวสงขลา 23

2 ตาแหนงทเกบตวอยางดนจากสวนสตวสงขลา 27

3 การจดเรยงลาดบเบสของ house keeping gene ทง 7 ยน ของเชอ B.

pseudomallei ทเพาะแยกไดจาก มาลาย (Bpseu_z1) อรงอตง (Bpseu_OR) ดน

จากคอกมาลายคอกเกา (Bpseu_DD) 35

4 Phylogenetic tree แสดง ST ของ เชอ B. pseudomallei ทเพาะแยกไดจากสวน

สตวสงขลา เปรยบเทยบกบ ST แบบเดยวกนทมอยในฐานขอมล

40

5 Phylogenetic tree แสดงความแตกตางของ ST ของ เชอ

B. pseudomallei ทเพาะแยกไดจากสวนสตวสงขลา เปรยบเทยบกบ ST รปแบบ

อนทเพาะแยกไดจากประเทศไทยและออสเตรเลย

41

ภาพผนวกท

ก1 โคโลนของเชอ B. pseudomallei ในอาหารเลยงเชอ blood agar 63

ก2 ลกษณะการขดหลมในการเกบตวอยางดน 63

ก3 โคโลนของเชอ B. pseudomallei ใน Ashdown’s agar 64

ก4 อรงอตงทปวยตายดวยโรคเมลออยโดสส 64

ก5 ไตอรงอตงทปวยตาย มขนาดใหญกวาปกต และมหนองแทรก 65

ก6 มามอรงอตงทปวยตาย มหนองแทรกกระจายอยทวไป 65

(4)

คาอธบายศพทและคายอ

MLST = multilocus sequence typing

IHA = indirect haemagglutination

ST = sequence type

ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay

PCR = polymerase chain reaction

TBSS broth = threonine-basal-salt solution broth

B. pseudomallei = Burkholderia pseudomallei

IgG = immunoglobulin G

IgM = immunoglobulin M

bp = base pairs

UPGMA = unweigthed-pair-group method with arithmetric methods

OD = optical density

1

ระบาดวทยาการตดเชอ Burkholderia pseudomallei ในสวนสตวสงขลา

Epidemiology of Burkholderia pseudomallei in Songkhla Zoo

คานา

เชอ Burkholderia pseudomallei เปนแบคทเรยสาเหตของโรคเมลออยโดสส (melioidosis)

พบมากในเอเชยตะวนออกเฉยงใตและทางตอนเหนอของประเทศออสเตรเลย เชอกอโรคไดทงใน

คนและสตว พบเชอไดทวไปในดน น า โคลน เชอทนทานตอสภาพแวดลอมสง โรคนจดเปนโรค

ประจาถนทสาคญของประเทศไทย มรายงานการพบเชอไดทกภาค จากการเฝาระวงโรคเมลออยโดสส

ในป พ.ศ.2554 ของสานกระบาดวทยา กระทรวงสาธารณสข พบวามผปวยใน 57 จงหวด จานวน

3,920 ราย อตราปวย 6.13 ตอประชากรแสนคน และมผเสยชวต 10 ราย อตราปวยตายรอยละ 0.26

และมแนวโนมสงขนอยางตอเนองในรอบ 10 ปทผานมา (สานกระบาดวทยา กรมควบคมโรค,

2554) การศกษาแบบยอนหลงของโรคเมลออยโดสสในสตวในประเทศไทยระหวางป พ.ศ. 2549-2553

จากรายงานของสถาบนสขภาพสตวแหงชาตพบวามสตวปวยตาย 61 ตว ซงสวนใหญเปนแพะ 31 ตว

รองลงมาไดแก สกร 8 ตว โค 4 ตว และมา 1 ตว และมสตวในสวนสตวเชน จระเข มาลาย ลง และ

อฐ ปวยตายดวยโรคนเชนกน (Limmathurotsakul et al., 2012)

ในป พ.ศ 2550 มการระบาดของโรคเมลออยโดสสในสวนสตวสงขลา โดยอฐทนาเขามา

จากประเทศออสเตรเลยไดปวยตาย ตอมาพบวาลงอรงอตง มาลาย ชะน ปวยตายดวยโรคเดยวกนจง

มความเปนไปไดทพนทในบรเวณสวนสตวยงคงมเชอ B. pseudomallei อย มโอกาสทสตวอน

ผปฏบตงานในสวนสตว และผทไปทองเทยว จะสมผสกบเชอได ดงนนจงไดทาการศกษาระบาด

วทยาของเชอนในสวนสตวสงขลา เพอหาแนวทางปองกนการระบาดและการควบคมโรคเมลออย

โดสสทเหมาะสม เนองจากโรคนเปนโรคทยงไมมวคซนในการปองกนโรคและการรกษายงใหผล

ไมแนนอน การหลกเลยงการสมผสเชอถอเปนวธการปองกนทดทสด

วตถประสงคของการศกษาครงน เพอประเมนความชกของโรคเมลออยโดสสในสตวและ

บคลากรทปฏบตงานสมผสกบสตว ในสวนสตวสงขลา โดยการตรวจทางซรมวทยาดวยวธ indirect

haemagglutination test (IHA) ในสตว และ enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) ในคน

รวมทงเกบตวอยางจากดนในบรเวณสวนสตวมาเพาะแยกเชอและวเคราะหความเชอมโยงของสาย

2

พนธของเชอทเพาะแยกไดจากสตวปวยและสงแวดลอมโดยการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดดวยวธ

Multilocus sequence typing (MLST)

3

วตถประสงค

วตถประสงครวม

ศกษาระบาดวทยาของเชอ B. pseudomallei ในสตวและผปฏบตงานสมผสสตวใน

สวนสตวสงขลา และสารวจเชอในดนในบรเวณสวนสตว

วตถประสงคหลก

1. เพอศกษาความชกทางซรมของการตดเชอ B. pseudomallei ในสตวและผปฏบตงาน

สมผสสตวในสวนสตวสงขลา

2. เพอเพาะแยกเชอจากดนและวเคราะหลาดบนวคลโอไทดของเชอทเพาะแยกไดภายใน

สวนสตว

4

การตรวจเอกสาร

ประวตและความสาคญ

โรคเมลออยโดสสเปนโรคตดเชอจากสงแวดลอมทสาคญในพนทเอเชยตะวนออกเฉยงใต

และทางตอนเหนอของประเทศออสเตรเลย เกดจากเชอ B. pseudomallei ซงเปนเชอทพบไดทวไป

ในดนและน าในภมภาคน โรคนมรายงานครงแรกเมอป ค.ศ.1912 ทประเทศพมา โดย Whitmore

และ Krishnaswami (Whitmore, 1913) แพทยดานพยาธวทยาชาวองกฤษและผชวยแพทย

ศลยแพทยชาวพมา ททางานในโรงพยาบาล ในเมองยางกง ตรวจพบศพผปวยชาวพมามพยาธสภาพ

ของการตดเชอมฝหนองตามรางกายและอวยวะภายใน คลายกบการเกดโรค glander ในมา ชวงแรก

จงเรยกการตดเชอนวา glander-like disease แตพบวาเชอแตกตางจาก B. mallei ทกอโรค glander

เพราะเชอนสามารถเคลอนทได (motile) และเจรญเตบโตในอาหารเลยงเชอไดเรวกวา

ในป ค.ศ.1913 Fletcher พบการระบาดของโรคนในสตวทดลอง หนตะเภาและกระตาย ใน

เมองกวลาลมเปอร ประเทศมาเลเซย หลงจากนนในป ค.ศ.1917 Stanton พบการตดเชอในคนท

กวลาลมเปอรเปนครงแรก ตอมาในป ค.ศ.1921 Stanton และ Fletcher ไดเสนอใหเรยกโรคนวา

เมลออยโดสส (melioidosis) แปลวา โรคทเหมอนโรครายแรงทพบในสตวพวกมา ลา หมายถง โรคทม

อาการคลายโรค glander และใชชอนมาถงปจจบน (Stanton and Fletcher, 1921)

ในระยะแรกเชอกอโรคเมลออยโดสสมชอเรยกแตกตางกนไปเชน Bacillus pseudomallei,

Bacillus whitmori, Pfeiferella pseudomallei, Loefflerella pseudomallei, Malleomyces

pseudomallei, Flavobacterium pseudomallei, Actinobacillus pseudomallei ตอมาเชอถกจดใหอย

ใน Genus Pseudomonas จากผลการทดสอบทางชวเคมและการมแฟลคเจลลาไดชอวา Pseudomonas

pseudomallei จนกระทงป ค.ศ.1992 จงเปลยนใหอยใน Genus Burkholderia โดยพจารณาจากความ

แตกตางของ 16s ribosomal RNA, DNA-DNA homology, phenotypic characteristic และองคประกอบ

ทเปนไขมนและกรดไขมนของเซลล เชอกอโรคนจงเปลยนชอเปน Burkholderia pseudomallei

(Yabuuchi et al., 1992)

5

รปรางลกษณะของเชอ

เชอ B. pseudomallei เปนแบคทเรยรปแทง แกรมลบ เคลอนไหวไดโดยอาศยแฟลคเจลลาท

ปลายทงสองขาง ตองพงออกซเจนในการอยรอด อาศยอยภายในเซลลของสงมชวต เชอไมสราง

สปอร แตสามารถสราง hydrated glycocalyx polysaccharide capsule ซงหากถกทาลายจะทาใหเชอ

ลดความรนแรงลง (Reckseidler et al., 2001) เชอ B. pseudomallei เจรญไดดในอาหารเลยงเชอ

ทวไป เชน blood agar, MacConkey agar แตคอนขางเจรญเตบโตชา ทเวลา 18 ชวโมง โคโลนจะใส

และมขนาดเลกมาก (pin point) จะเหนโคโลนชดเจนเมอเพาะเชอไปแลว 48 ชวโมงขนไป

ใน blood agar โคโลนจะมลกษณะสขาวนวลหรอสขาวครม (ภาพผนวก ก 1) รอบโคโลนเหนเปน

ขอบใสจากการยอยสลายเมดเลอดแดง ชนดไมสมบรณ (alpha-hemolytic zone) หลงจากนนโคโลน

จะมลกษณะหยาบและใหญขนแลวเรมเหยวยน (wrinkle) หากเกบไวนานจะเหนเปนเสนนนแผเปน

รศมจากกลางโคโลน สวนลกษณะโคโลนบน MacConkey agar หลง 24 ชงโมง โคโลนจะเปนจด

ใส กลม ขอบเรยบ มคณสมบตเปน weak lactose ferment หลง 48 ชวโมง โคโลนจะกลม ขอบเรยบ

ไมนน มนวาว เรมแหงและอาจจะเหยวยน ในป ค .ศ.1998 มการจด species ในกลมเ ชอ

Burkholderia spp.เปน Burkholderia thailandensis ซงเปนเชอทมล กษณะใกลเคยงก บ

B. pseudomallei มาก แตตางกนทความสามารถในการใชน าตาล L-arabinose เพราะเชอ B. pseudomallei

ไมสามารถใชน าตาล L- arabinose ได (Ara-)ในขณะท B. thailandensis สามารถใชน าตาล arabinose

(Ara+)ได B. thailandensis เปนเชอทอยในสงแวดลอมเชนเดยวกนกบ B. pseudomallei แตม

ความสามารถในการกอโรคตา (low virulence) (Brett et al., 1998)

อาหารเลยงเชอทมความจาเพาะ (selective media) สาหรบเชอ B. pseudomallei คอ

Ashdown’s agar สามารถยบย งการเจรญเตบโตของเชอแบคทเรยตวอนทจะขนบดบงเพราะเชอตวน

โตชา ลกษณะโคโลน ทเวลา 48 ชวโมง มลกษณะแบน สชมพอมมวงออกมนวาว ในวนท 3 และ 4

จะเหนโคโลนเหยวยนชดเจน เชอนมลกษณะพเศษทจาเพาะ คอมกลนคลายดนหลงฝนตกใหม

(earthy odour) เมอนาเชอมายอมสแกรมจะมลกษณะคลายเขมซอนปลายเพราะเชอจะตดสบรเวณ

หวทาย (bipolar)

6

การกอโรคและลกษณะทางแอนตเจน

การศกษาพบวา เชอ B. pseudomallei สามารถทนตอการถกทาลายดวยกลไกทางระบบ

ภมคมกนของรางกาย เชน ระบบ complement การทาลายโดย lysosome และสารจาพวก cationic

peptides เชอสามารถอยรอดและแบงตวภายในเซลลไดหลายชนดรวมทงเซลลเมดเลอดขาว

ภายหลงถกจบกน (Egan and Gordon, 1996) เชอจะหลบหนจาก endocytic vacuoles เข าส

cytoplasm ของเซลลและเหนยวนาใหเกดกระบวนการ actin polymerization ทาใหเยอหมเซลลถก

ดนออกไปโดยทเชอตามไปดวยจงสามารถกระจายไปยงเซลลทอยตดกน (Kespichayawattana

et al., 2000)

B. pseudomallei มสวนประกอบของแอนตเจนคอนขางซบซอน ซงอาจแบงไดเปน 4 ชนด

ชนดแรกเปนแอนตเจนทปกคลมอยทผวชนนอกคอ Envelope antigen (K antigen) ซงเกยวของกบ

ในการกอโรค ชนดทสองคอ somatic antigen (O antigen) เปนสวนทอยทผนงเซลลเปนสวนททา

ใหเกดปฏกรยาขามพวก (cross reaction) ระหวางเชอ B. pseudomallei กบเชอในตระกล

Enterobacteriaceae บางสายพนธ ชนดทสามเปน flagella antigen และชนดทสเปนแอนตเจนท

ละลายน าได มคณสมบตจาเพาะเปน specific antigen (สภาภรณ, 2547) ปจจยรนแรงของการกอโรค

(virulence factors) ประกอบไปดวยสวนทเปน surface antigen ไดแก exopolysaccharide, flagella,

outer membrane protein, lipopolysaccharide และสวน extracellular products ประกอบไปดวย

เอนไซมตางๆเชน lethal exotoxin, protease, demonecrotoxin, hemolysin นอกจากนเชอ

B. pseudomallei สามารถสราง biofilm ทปองกนไมใหสารตานจลชพซมเขาสเซลล ทาใหเชอ

สามารถทนตอสารตานจลชพได (Sawasdidoln et al., 2010)

ความคงทนของเชอในสงแวดลอม

B. pseudomallei เปนเชอทมความคงทนตอสภาวะแวดลอมไดด เชอสามารถอยใน

สงแวดลอมทรอนหรอแหงไดเปนเวลานานหลายป (Wuthiekanun et al., 1995a) และในสภาวะท

ไมมสารอาหารพบวาเ ชอ B. pseudomallei สามารถอาศยอยในน ากลนไดนานกวา 3 ป

(Wuthiekanun et al., 1995b) การสารวจดนเพอหาเชอ B. pseudomallei ในไทยมรายงานการพบเชอ

ไดทกภาคของประเทศไทยแตพบไดสงในพนทภาคตะวนออกเฉยงเหนอ (Vuddhakul et al., 1999;

Finkelstein et al., 2000) ความชนของดนเปนปจจยทมผลตอการเจรญเตบโตและการมชวตของเชอ

7

จากการทดลองในหองปฏบตการพบวา ในดนทมความชน 10 % เชอมชวตอยไดนาน 70 วน ดนทม

ความชน 20 % เชอมชวตอยไดนาน 1 ป แตหากเชออยในดนทมความชนมากกวา 40%

เชอสามารถมชวตอยไดนานถง 726 วน (Tong et al., 1996) ลกษณะดนทมความแตกตางกนเชน ดนรวน

ปนทรายทมการระบายน าไดด และแสงแดดสองถง เมอนามาเพาะแยกเชอพบวาปรมาณเชอนอย

หรอเพาะแยกเชอไมได ตางจากดนโคลนทมน าทวมขงเมอเพาะแยกเชอจะมโอกาสพบเชอได

มากกวา (Inglis et al., 2004) นอกจากนยงพบวาตวอยางดนทเกบมาในชวงฤดแลงแลวเพาะแยกเชอ

ไดมกเปนดนจากพนทเกษตรกรรมทมการรดน าใหพชทเพาะปลก (Kaestli et al., 2009) การสารวจ

ดนทภาคอสานของประเทศไทยพบวาในฤดรอน เพาะแยกเชอ B. pseudomallei ไดสวนใหญจาก

ดนทระดบความลก 90 เซนตเมตร แตในฤดฝนจะเพาะแยกเชอไดทงจากผวดนและระดบความลกท

20, 30, 50 และ 60 เซนตเมตร อาจเพราะฤดฝนมปรมาณน าในดนสงขนจงทาใหเชอสามารถขนมา

อยบนผวดนไดมากขน (Wuthiekanun et al., 1995a) การศกษาในประเทศออสเตรเลยพบวาปจจย

หลายอยางในดนมผลตอการมชวตของเชอ เชน ในพนททปลอยทงไวไมไดใชสอย ปรมาณเชอท

เพาะแยกไดจะมความสมพนธกบบรเวณทมหญา รากพช และความชนของดนสง แตในพนททม

การใชสอย ปรมาณเชอจะมความสมพนธก บ คา pH ของดน การเลยงสตว ในพนท เ ชอ

B. pseudomallei สามารถอาศยอยในสงมชวตอนเชน ในซสตของ Acanthamoeba และ Hartmannella

spp. ได ทาใหเชอมความทนทานตอคลอรนมากขน (Wadowsky et al., 1991; Marolda et al., 1999)

ตารางท 1 ปจจยดานสงแวดลอมทมผลตอการมชวตของเชอ B. pseudomallei

Environmental factor Condition Duration of expt Outcome

Triple-distilled water 10 CFU/ ml6 3 yr Rise to 108 CFU/ml after 1

mo then fall to 104

CFU/ml after 2 yr

Water content 0% 30 days No later survival

5% 40 days No later survival

10% 70 days No later survival

20% 439 days No later survival

40% >726 days Survival for expt duration

80% >726 days Survival for expt duration

8

ตารางท 1 (ตอ)

Environmental factor Condition Duration of expt Outcome

pH 2 1 days No later survival

3 7 days No later survival

4 231 No later survival

5-8 726 Survival for expt duration

9 26 No later survival

10 1 No later survival

3.5-7.0 24 7 log10 reduction in

CFU/ml at pHs of <4.5

Chlorine 1 mg/liter 30 min 4 log10 reduction in

CFU/ml

0.5-4.0 mg/liter 0-60 min 1-6 log10 reduction in

CFU/ml(at pHs of 9 and 6,

respectively)

4 mg/liter(pH 6-

9)

Up to 30 min 7 log10 reduction in

CFU/ml after 30 min

Chloramine 1 mg/liter 24 h 2.5 log10 reduction in

CFU/ml

1 mg/liter 48 h 3 log10 reduction in

CFU/ml

UV light 4.65 W/m 7.75 min Shorter survival time than

control bacteria

44 J/m Not applicable 1 log10 reduction in

CFU/ml

120/m 4 log10 reduction in

CFU/ml

ทมา: Timothy et al. (2006)

9

การตดตอของโรคเมลออยโดสส

การตดตอของโรคเมลออยโดสส แบงไดเปน 3 วธ คอ

1. การตดตอผานทางผวหนง

การตดตอโดยวธนนาจะเปนวธหลกของการเกดโรคเมลออยโดสสเชอ B. pseudomallei

จะแทรกผานเขาสบาดแผลหลงการสมผสดนและน าทมเชอปนเปอนอย การศกษาในประเทศ

ออสเตรเลยพบวาคนททางานสมผสกบดนมโอกาสตดเชอเมลออยโดสสมากกวาคนทางานในบาน

ถง 10 เทา (Merianos et al. , 1993) เ ชนเดยวกบการศกษาปจจยเ สยงของโรคนในภาค

ตะวนออกเฉยงเหนอในประเทศไทยทพบวาผปวยสวนใหญเปนชาวนาทตองทางานสมผสดนและ

น าเปนเวลานาน (Suputtamongkol et al., 1994)

2. การตดตอทางการกน

การระบาดของโรคนในออสเตรเลยเมอป ค.ศ. 1997 พบวามการปนเปอนของเชอ

B. pseudomallei ในน าดมโดยมลกษณะการระบาดของโรคเปนแบบ cluster case จากการสบสวน

โรคพบเชอในทอน าประปา (Currie et al., 2001) การตดตอของโรคในสตวดวยการกนพบรายงาน

การระบาดของโรคเมลออยโดสสในฟารมสกรในออสเตรเลยทเลยงในคอกเปนพนดนพบวาสกรม

อาการบวมบรเวณขากรรไกร ผลการผาซากพบมกอนหนองทตอมน าลายพาโรทด และตอม

ทอนซล และสามารถเพาะแยกเชอไดจากตาแหนงดงกลาว (Millan et al., 2007)

3. การตดตอทางการหายใจ

การตดตอของโรคเมลออยโดสสทางการหายใจมโอกาสเกดขนได จากศกษาพบวา

ทหารชาวอเมรกนทไปรบทประเทศเวยดนามแลวเกดเปนโรคนสวนใหญเปนทหารททางานกบ

เฮลคอปเตอรอาจไดรบเชอผานทางการหายใจ ในชวงทเฮลคอปเตอรบนขนลงแลวเกดการฟง

กระจายของดนทมเชอปนเปอนอย (Biegeleison et al., 1964) นอกจากนพบวาปรมาณน าฝนทมาก

ในชวง 14 วนกอนทผปวยจะเขาทาการรกษา มความสมพนธกบการตดเชอทปอด ภาวะตดเชอใน

10

กระแสเลอด การเกด septic shock และการเสยชวตของผปวย ซงอาจเกดจากชวงฤดมรสม ลมทพด

แรงทาใหการตดตอของโรคเปลยนเปนตดเชอโดยการหายใจมากขน (Currie and Jacups, 2003)

การตดตอของโรคเมลออยโดสสนอกจาก 3 วธดงกลาวขางตนพบวาในคนมรายงานการตด

เชอผานทางเพศสมพนธ ได (Achana et al., 1985) สวนในสตวพบวาเชอ B. pseudomallei ผานทาง

รกไดในแพะโดยสามารถเพาะแยกเชอไดจากลกแพะทแทงและมดลกของแมแพะทปวยตาย (Choy

et al., 2000)

การตดตอของโรคเมลออยโดสสระหวางสตวและคนมรายงานนอยมาก แตมความเปนไป

ไดทคนจะตดเชอเขาสบาดแผลจากการสมผสสงคดหลงของสตวทเปนโรคเชน ในประเทศ

ออสเตรเลยมรายงานการตดเชอเมลออยโดสสจากบาดแผลทนวของเกษตรกรทรดนมแพะทม

อาการเตานมอกเสบ (Choy et al., 2000)

อาการของโรคเมลออยโดสส

ระยะฟกตวของเชอโรคเมลออยโดสสทงในคนและสตวยงไมแนชดอาจจะสนเปนวนหรอ

ยาวนานเปนป (The Center for Food Security and Public Health, Iowa State University, 2007)

อาการในคน

โรคเมลออยโดสสมอาการทางคลนกทคลายคลงกบโรคอนๆมากมายจงถกเรยกวา ยอดนก

เลยนแบบ นอกจากนอาการทางคลนกมความผนแปรตงแตมอาการรนแรงเฉยบพลนหรอมอาการ

แบบเรอรง อาการปวยในคนสามารถแบงชนดการตดเชอของโรคเมลออยโดสสออกไดเปน 6 กลม

โดยการแบงของสมาคมโรคตดเชอแหงประเทศไทย (เพลนจนทร, 2547) ดงน

กลมท 1 เมลออยโดสสชนดตดเชอในกระแสเลอดแบบแพรกระจาย (disseminate

septicemia melioidosis)

ผปวยมการตดเชอในกระแสเลอดรวมกบการตดเชอในอวยวะอนๆรวมดวยหลายแหง เชน

มฝกระจายตามตวผปวย ฝในอวยวะภายใน ทงตบ มาม หรอไต ลกษณะภาพถายรงสทรวงอกเปน

11

แบบปนหลายตาแหนง (multiple nodular infiltration) ซงเปนลกษณะ blood-borne pneumonia

หรอ metastatic pneumonia ผปวยมกจะมอาการรนแรงมากภายใน 24-48 ชวโมงหลงการรกษา เกดภาวะ

septic shock และเสยชวตภายใน 48 ชวโมง

กลมท 2 เมลออยโดสสชนดตดเชอในกระแสเลอดแบบไมแพรกระจาย (non-disseminate

septicemia melioidosis)

ผปวยมอาการตดเชอในกระแสเลอด แตอาจจะตรวจไมพบตาแหนงของการตดเชอทอน

หรอพบเพยง 1-2 ตาแหนงเทานน ผปวยจะมอาการไมรนแรง ผปวยบางรายอาจมภาวะชอค แตพบ

ไดนอย (รอยละ 4.9) และอตราตายตา แตหากอาการรนแรงขนจะกลายเปนการตดเชอในกระแส

เลอดแบบแพรกระจายตามมา

กลมท 3 เมลออยโดสสชนดตดเชอเฉพาะท (localized melioidosis)

ผปวยเหลานไมพบการตดเชอในกระแสเลอด และมตาแหนงของการตดเชอ ตามอวยวะ

ตางๆ 1-2 แหงโดยทวไป ผปวยมกมอาการไขเรอรง อาการทางคลนกขนอยกบตาแหนงของการตด

เชอ โดยสวนใหญอาการทางคลนกเปลยนแปลงแบบคอยเปนคอยไป มกจะไมพบภาวะชอคและ

อตราตายตา แตหากผปวยไมไดรบการรกษาดวยยาปฏชวนะทเหมาะสม อาจทาใหเกดการตดเชอใน

กระแสเลอดไดเชนกน

กลมท 4 เมลออยโดสสชนดตดเชอในกระแสเลอดแบบชวคราว (transient bacteremia

melioidosis)

ผปวยกลมนอาจจะแสดงอาการปวยหรอไมแสดงอาการปวยใหเหนกได แตมการตรวจพบ

เชอในกระแสเลอดชวคราวและไมพบตาแหนงการตดเชอทใดในรางกาย แตตองรบใหการรกษา

เพราะมโอกาสตดเชอรนแรงตามมาภายหลงได

12

กลมท 5 เมลออยโดสสชนดมโอกาสทจะเปนโรค (probable melioidosis)

ผปวยมอาการทางคลนกเขาไดกบโรคเมลออยโดสส มตาแหนงของการตดเชอชดเจน เชน

ปอดอกเสบ ฝในตบ ฝในมาม แตไมสามารถเพาะแยกเชอไดจากเลอดหรอสงสงตรวจ และมการ

ตรวจพบแอนตบอดตอการตดเชอ B. pseudomallei ทบงบอกการตดเชอทผานมา

กลมท 6 เมลออยโดสสชนดไมมอาการ (subclinical melioidosis)

ผปวยกลมน ไมแสดงอาการและไมพบการตดเชอทตาแหนงใด แตตรวจพบแอนตบอดตอ

การตดเชอ B. pseudomallei ซงแสดงวาผปวยเคยไดรบเชอมากอน การจดผปวยในกลมนม

ความสาคญดานระบาดวทยา เกยวของกบการหาความชกของการตดเชอในผทอาศยในแหลงทม

การระบาดของโรค (endemic area)

สาหรบคนกลมเสยงทจะเปนโรคเมลออยโดสสและแสดงอาการรนแรงคอ ผทมภาวะปวยดวย

โรคเบาหวาน โรคไตเรอรง โรคธาลสซเมย รวมทงผท มภาวะภมคมกนบกพรองเชน ผปวยทไดรบ

ยาในกลม steriods เปนเวลานาน (Suputtamongkol et al., 1999) ผปวยโรคเมลออยโดสสมโอกาส

กลบมาเปนโรคซาไดอก พบวาปจจยเสยงททาใหกลบมาเปนโรคซาในคนภาคตะวนออกเฉยงเหนอ

ของประเทศไทยขนกบระยะเวลาการกนยาปฏชวนะอยางตอเนองและการตดเชอแบบแพรกระจาย

(multifocal distribution) ในการตดเชอครงแรก (Limmathurotsakul et al., 2006)

อาการในสตว

สตวปวยแสดงอาการไดทงแบบเฉยบพลนและเรอรงเชนเดยวกบในคน สตวทแสดงอาการแบบ

เฉยบพลนมกมการตดเชอในกระแสเลอดและตายอยางรวดเรว อาการปวยทพบคอ ไขสง หอบ มน ามก

ไอ ปอดอกเสบ ทองเสย บางตวอาจแสดงอาการทางระบบประสาท (Thomas et al., 1988) แตสวนใหญ

สตวจะปวยแบบเรอรง โดยเปนฝแพรกระจายตามอวยวะตางๆ อณฑะอกเสบ เตานมอกเสบ ซงพบวาม

การปนเปอนเชอออกมากบนมได (Choy et al., 2000) จากรายงานการตดเชอเมลออยโดสสในสกรจาก

การปนเปอนของเชอในน าบอของฟารมสกรในประเทศออสเตรเลย พบวาสกรในแตละชวงอายปวย

ดวยอาการทรนแรงแตกตางกน อาจเกดจากสกรตดเชอโดยวธทตางกน พบวาหากสกรตดเชอโดยการ

กนจะมการบวมของตอมน าลาย parotid ซงพบไดบอยในสกรทเลยงบนพนดน (Millan et al., 2007)

13

สกรทตดเชอเขาสบาดแผลพบตมหนองบรเวณตวสกรและแพรกระจายในอวยวะภายใน สวนสกรท

แสดงอาการทางระบบหายใจอาจเกดจากการทสกรหายใจเอาเชอเขาไประหวางกนน าจากทใหน า

(nipple drinker) ทมแรงดนน ามากเกนไป (Millan et al., 2007)

การตรวจวนจฉยโรค

การตรวจวนจฉยโรคเมลออยโดซสทางหองปฏบตการทงในคนและสตว การเพาะแยกเชอ

แบคทเรยถอเปนวธมาตรฐาน (gold standard) ของการวนจฉยโรคน ซงสามารถตรวจพบเชอไดใน

เลอด หนอง เสมหะ ปสสาวะ อวยวะภายในจากการผาซาก หรอสามารถเพาะแยกเชอไดจากน านม

ของสตวทแสดงอาการเตานมอกเสบ การตรวจโรคเมลออยโดสสดวยวธเพาะแยกเชอมกทาการ

วนจฉยรวมกบการทดสอบความไวตอยาปฏชวนะโดยทวไปการเพาะแยกเชอจากสงสงตรวจทาง

คลนกจะไดผลใน 3-5 วน จงมการพฒนาวธการเพอใหเพาะแยกไดเรวขน ไดแก การเพาะแยกเชอ

โดยอาศยระบบ automated nonradiomatric blood culture และมการใชชดทดสอบสาเรจรปมาชวย

ในการพสจนเชอดวย เชน API 20E, Microbact 24E, API 20NE, Minitek disc นอกจากนการ

ตรวจหาแอนตบอดเปนวธการทใชในการตรวจคดกรองโรคทสาคญ ซงสามารถตรวจไดหลายวธ

เชน latex agglutination, indirect haemagglutination test (IHA), indirect fluorescent antibody

technique (IFA), enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) และ Gold blot

วธทใชกนอยางแพรหลายในการตรวจคดกรองโรคเมลออยโดสสคอ IHA โดยใช crude

antigen ของเชอ B. pseudomallei เคลอบไปบนผวเมดเลอดแดง เมอทาปฏกรยากบแอนตบอดใน

ซรม จะจบกลมตกตะกอนใหเหนเปนวธการทงายและไดผลรวดเรวจงนยมใชกนอยางกวางขวาง

การตรวจดวยวธ IHA มการใชคา cut off titer แตกตางกนในแตละพนท พนททมการระบาดของ

โรคพบวาหากใชคา cut of titer มากกวา 1: 160 จะมความไว (sensitivity)รอยละ 77 ความจาเพาะ

(specificity)รอยละ 92 และความแมนยา (precision) รอยละ 89 (Appassakij, 1990) แตวธ IHA มขอจากด

หลายประการเนองจากไมสามารถแยกผปวยทมการตดเชอในปจจบนจากผปวยทมการตดเชอมา

กอน และยงตรวจพบผลบวกในคนปกตทอาศยในแหลงของโรคดวย จงมการพฒนาการตรวจทาง

ซรมวทยาดวยวธ ELISA เพอทดแทนวธ IHA เพราะมคาความไวและความจาเพาะทดกวา

(Petkanjanapong, 1992; Sirisinha et al., 2000)

14

การวนจฉยโรคเมลออยโดสสดวยวธ ELISA เปนการตรวจแอนตบอดตอเชอ B. pseudomallei

มการพฒนาการตรวจดวยวธนอยางตอเนอง โดยใช antigen ของเชอ B. pseudomallei ทแตกตางกน

เชน crude antigen, culture-filtrated antigen, endotoxin, exotoxin และ kD polypeptide antigen

เคลอบทไมโครเพลทหรอเมมเบรน แลวดการเกดปฏกรยาจากแอนตบอดทจาเพาะตอ IgM หรอ

IgG ทตดฉลากดวยเอนไซม ทาใหเกดสซงมองเหนดวยตาเปลา หรอวดปรมาณดวยเครองวดคา

optical density (OD) แตจากการศกษาพบวาการตรวจหา culture filtrate antigen ดวย IgG ELISA

ชบงการเกดโรคไดดกวาการตรวจดวย IgM (Chenthamarakshan et al., 2001)

ในสตวการวนจฉยโรคเมลออยโดสสทางซรมวทยาใชวธ IHA เปนหลก คา cut off ทใช

ในปจจปนคอ 1:320 ตามมาตรฐานการตรวจของสถาบนสขภาพสตวแหงชาตและศนยวจยและ

พฒนาการสตวแพทย ทง 7 แหง แตการตรวจโรคเมลออยโดสสในซรมสตว ดวยวธ ELISA ไมพบ

ความแตกตางของคา sensitivity และ specificity เมอเทยบกบวธ IHA (Srikawkheaw and

Lawhavinit, 2007) อาจเปนเพราะวธ ELISA ยงมขอจากดเรองความจาเพาะตอแอนตบอดในแต

ชนดสตว (Mekaprateep et al., 2010)

ปจจบนนอกจากการตรวจวนจฉยโดยเทคนคทางวทยาภมค มกนแลว เทคนคทางอณ

ชววทยาถอไดวามบทบาทอยางมากในการตรวจโรคเมลออยโดสส โดยเฉพาะการตรวจหาเชอทม

ปรมาณนอยในสงสงตรวจซงอาศยหลกการเพมจานวน DNA ในหลอดทดลองโดยใชวธการ

polymerase chain reaction (PCR) เพมความรวดเรวในการตรวจหาเชอเพราะไมตองรอผลเพาะแยก

เชอและมความไวในการตรวจสงถงรอยละ 91 (Meumann et al., 2006)

การศกษาลกษณะทางพนธกรรมของเชอ

การศกษาระบาดวทยาระดบโมเลกลเพอหาความสมพนธของเชอกอโรคในคนและสตวกบ

เชอทอยในสงแวดลอม มหลายวธไดแก ribotyping, pulse-field gel electrophoresis, random

amplified polymorphic DNA (RAPD) multilocus enzyme electrophoresis (MLEE) และ

multilocus sequence typing (MLST) วธทสะดวก ใหผลทแมนยาทสดคอ MLST เพราะวธนใช

จานวนยนในการทดสอบมากกวาและสามารถเปรยบเทยบขอมลลาดบนวคลโอไทดทไดกบ

ฐานขอมลในอนเตอรเนตทรวบรวมขอมลสายพนธของเชอตางๆทวโลก (Maiden et al., 1998)

15

Multilocus sequence typing (MLST) คอวธการทใชแยกชนดของสงมชวตเชน แบคทเรย

เชอรา หรอปรสตใหเฉพาะเจาะจง โดยอาศยความแตกตางของลาดบนวคลโอไทดของสาย DNA

ซงเปนลาดบนวคลโอไทดทอยตรงกลาง (internal fragments) ของยน ทมความจาเปนตอการ

ดารงชวตอยของเชอ (house-keeping gene) โดยทวไปมกจะใช 7 ยน แตละยนมขนาดประมาณ

450-500 base pairs (bp) (Maiden et al., 1998) house-keeping gene จะมลกษณะของ allele ทม

ลาดบนวคลโอไทดแตกตางกนอยางชดเจนในแบคทเรยแตละสายพนธ โดยวธนจะพจารณา

ตาแหนงของนวคลโอไทดโดยไมคานงถงจานวนนวคลโอไทดทตางกน ซงความแตกตางของการ

จดเรยงนวคลโอไทดอาจจะมความแตกตางเพยงตาแหนงเดยวหรอหลายตาแหนง ความแตกตาง

ของรปแบบ alleles ของยนทง 7 ชนดนจะเปนตวระบ allelic profile และถกกาหนดเปน sequence

type (ST) ขนตอนของวธ MLST ประกอบไปดวย data collection, data analysis และ multilocus

sequence analysis ขนตอน data collection คอ ขนตอนทเพมจานวนและกาหนดตาแหนงนวคลโอไทด

ของชนสวนยนทตองการโดยใชวธ PCR ตอมาวเคราะหลาดบนวคลโอไทดทไดในขนตอน data

analysis โดยพจารณาความแตกตางของตาแหนงนวคลโอไทด (allele numbers) ของแตละยนและ

ระบเปน allelic profile หรอ sequence type (ST) รปแบบของตาแหนงการจดเรยงนวคลโอไทดท

ตางไปจะถกจดเปน allelic profile แบบใหม เมอทาการพสจน allelic profile แลวหากเปนแบบใหม

จรงขอมลจะถกนามาเกบไวในฐานขอมล (MLST database) ขนตอนสดทายของวธนคอ multilocus

sequence analysis จะวเคราะหความสมพนธของเชอโดยเปรยบเทยบ allelic profile ของเชอท

ตองการทดสอบกบขอมลทมอยในฐานขอมล เพอศกษาดานระบาดวทยาและววฒนาการของเชอ

เปรยบเทยบรปแบบของ allelic profile หรอ ST วาใกลเคยงหรอตางจาก clonal complexes

(กลมของเชอ)ทมอยในฐานขอมล (Urwin and Maiden, 2003) ความสมพนธของเชอจะแสดงใน

ลกษณะแผนภมโครงสรางตนไม (dendrogram) โดยใชหลกการ matrix of pairwise differences

ระหวาง allelic profile ซงแผนภมจะแสดงใหเหนวารปแบบ allelic profile หรอ ST ของเชอแตละ

ตวมความใกลเคยงหรอแตกตางกนเพยงใด ซงหากพบวาเชอม allelic profile ทใกลเคยงกนมาก

สนนษฐานไดวานาจะมาจากบรรพบรษเดยวกน

ระบาดวทยา

โรคเมลออยโดสสกอโรคไดในคนและสตวหลายชนดทงแพะ แกะ สกร สนข แพนดา ลง

นก อฐ มา สตวเลอยคลาน โลมา แมวน า แตสตวทมรายงานการเกดโรคบอยทสดคอ แพะ และสกร

(Choy et al., 2000; Limmathurotsakul et al., 2012) ปจจบนมรายงานการตรวจพบโรคเมลออยโดสส

16

ไดเกอบทวโลก อาจเกดจากการเดนทางระหวางประเทศทสะดวก ทาใหมนกทองเทยวเขามาใน

พนททเปนแหลงของโรคมากขน และการแลกเปลยนสตวปาเพอเขาไปเลยงในสวนสตว ซงพบ

รายงานการระบาดของโรคเมลออยโดสสทเกดในสวนสตวหลายแหง (ตารางท 2) หรอการลกลอบ

คาสตวปา เปนอกสาเหตหนงทสงผลทาใหโรคแพรกระจายไปไดทวโลก

ในป ค.ศ.1975 มการระบาดของโรคเมลออยโดสสในประเทศฝรงเศส ทสวนสตวปารสพบ

สตวหลายชนดปวย เกดจากการนาเขาแพนดาทตดเชอจากประเทศจนและมการระบาดของโรคเมล

ออยโดสสในสโมสรขมาหลายแหงจากการนาเขามาจากประเทศอหรานและมรายงานพบคน

เสยชวต 2 ราย (Mollaret, 1988) ในป ค.ศ. 1992 พบการระบาดของโรคเมลออยโดสสในประเทศ

องกฤษ จากการนาเขาลงจากประเทศฟลปปนส และอนโดนเซย (Dance et al.,1992) นอกจากนม

รายงานการเกดโรคเมลออยโดสสทสหรฐอเมรกาทรฐ Oklahoma จากการตดเชอทางบาดแผลจาก

อบตเหตในการทางานในฟารม (McCormick et al., 1977) แตทสดแลวมการวนจฉยแยกเชอใหม

เปน B. oklahomensis (Glass et al., 2006)

B. pseudomallei ทกอโรคเมลออยโดสส เปนเชอทพบในภมประเทศรอนแถบเสนศนยสตร

ละตจด 20 องศาเหนอไปจนถง 20 องศาใต พบวามการระบาดสงมากในแถบเอเชยตะวนออกเฉยง

ใต ไปจนถงทางภาคเหนอของออสเตรเลย ความชกของโรคเมลออยโดสสในประชากรทอาศยอย

ทางตอนเหนอของประเทศออสเตรเลยพบวาตากวาในประชากรในภาคอสานของประเทศไทย

(Kanaphun et al.,1993; Currie et al., 2004) การศกษาความชกของโรคเมลออยโดสสทรฐ

Queensland พบวาประชากรทอาศยอยในเขตเมองมความชกของโรคประมาณรอยละ 5 ตางจากคน

ทอาศยอยตามชนบทหรอชนพนเมองชาวเผาอะบอรจน ทพบความชกประมาณรอยละ 10

(Ashdown and Guard, 1984) ใน ป ค.ศ.1981-1983 มรายงานการระบาดในฟารมสกร ทตงอย

บรเวณแมน า Burnett ทาใหสกรปวยถง 159 ตว จากการปนเปอนของเชอ B. pseudomallei ในน าท

สบขนมาจากแมน าเพอใชในฟารม (Ketterer et al., 1986) ในป ค.ศ. 1992-1997 มรายงานการ

ระบาดของโรคเมลออยโดสสในแพะ แกะ สกร สนข แมว อลพากา นก โคและอฐ แตพบรายงาน

การเกดโรคสงในแพะ แกะ และสกร (Choy et al., 2000)

การระบาดของโรคเมลออยโดสสในเวยดนามพบวา หลงสนสดสงครามเวยดนาม มรายงาน

การระบาดในทหารผานศกชาวอเมรกนและฝรงเศสหลายรายในชวงป ค.ศ. 1940-1970 (Howe et al.,

1971; Dance, 1991) นอกจากนมรายงานการระบาดของโรคแบบ sporadic ในผอพยพชาวเวยดนาม

17

(Worthington and McEniry, 1990) และนกทองเทยวชาวเบลเยยมทเดนทางกลบจากเวยดนาม

(Heyse et al., 2003) ในชวงป ค.ศ. 1992-1998 ผลการเฝาระวงโรคเมลออยโดสสในผปวยทมไข

ในโรงพยาบาลทเมองโฮจมนหพบผลบวกจากการเพาะเชอจากเลอดเทากบรอยละ0.25 (9/3,653)

และจากการสารวจตวอยางดนในเมองเดยวกนพบเชอ B. pseudomallei ในนาขาว 9 แหงจากการ

สารวจนาขาว 147 แหง (Parry et al., 1999)

ในระหวางป ค.ศ. 1982-1993 ทฮองกงมรายงานการเกดการระบาดของโรคเมลออยโดสส

ในสตวเลยงลกดวยนมทเปนสตวทะเลหลายชนดเชน โลมา สงโตทะเล แมวน าในสวนน าของสวน

สตว (Hicks et al., 2000)

ประเทศจน พบการระบาดของโรคเมลออยโดสสทเกาะไหหลาและเมองชายฝงเปนการ

ระบาดในคนโดยเฉพาะในกลมชาวนา จากการสารวจทางซรมวทยาในป ค.ศ. 1995-1996 พบความ

ชกของโรคสงถงรอยละ 34 (IHA titer > 1:40) ( Yang et al., 1998)

การสารวจดนและน าในประเทศมาเลเซยเมอป ค .ศ . 1969 พบวาสามารถเจอเชอ

B. pseudomallei ไดทวไปในมาเลเซย รฐฝงตะวนตก (Strauss et al., 1969) และจากการศกษาพบวา

ในระยะเวลา 35 ป มผปวยโรคเมลออยโดสสทเขารบการรกษาทโรงพยาบาลของคณะแพทยศาสตร

มหาวทยาลยมาลายา ทงหมดรวม 141 ราย (Puthucheary, 2009)

ในป ค.ศ.1989-1996 ประเทศสงคโปรมผปวยดวยโรคเมลออยโดสส 372 ราย เสยชวต 147 ราย

อตราปวย 1.7 ตอประชากรแสนคน (Heng et al., 1998) ตอมาชวงตนป ค.ศ. 2004 มผปวย 57 ราย

และมอตราปวยตายของโรคสงรอยละ 40 ซงเกยวของกบการมฝนตกหนกและเกดน าทวมใน

ชวงเวลานน (Tong et al., 2009)

ประเทศอนโดนเซยและฟลปปนส เปนประเทศในเอเชยตะวนออกเฉยงใตทมรายงานการ

เกดโรคเมลออยโดสสตากวาประเทศอนในภมภาค แตพบผปวยโรคเมลออยโดสส 10 ราย

หลงเหตการณคลนสนามถลมเมอป ค.ศ. 2004 ทอนโดนเซย (Eugene et al., 2005) และรายงานการ

เกดโรคเมลออยโดสสในชาวนาทประเทศฟลปปนสในป ค.ศ. 2002 (Ereno et al., 2002)

18

สถานการณโรคเมลออยโดสสในไทยจากการเฝาระวงโรคเมลออยโดสสในป พ.ศ. 2554

มรายงานผปวยจาก 57 จงหวด จานวน 3,920 ราย อตราปวย 6.13 ตอประชากรแสนคน พบผปวย

โรคเมลออยโดสสสงทสดในภาคตะวนออกเฉยงเหนอ (สานกระบาดวทยา กรมควบคมโรค, 2554)

การสารวจเชอ B. pseudomallei ในสงแวดลอมของประเทศไทยพบวามเชอกระจายทวไปในดน

และน าในทกภมภาค โดยเฉพาะพนททเปนนาขาว (Vuddhakul et al., 1999) และสารวจพบเชอ

B. thailandensis ในสงแวดลอมดวย จงมความเปนไดทการมอยของเชอ Burkholderia spp. สายพนธ

อนในพนททาใหคาความชกของโรคโดยการสารวจทางซรมวทยาในพนทนสงเพราะหากสมผสกบ

เชอในสงแวดลอมมากอนทาใหเกด cross-reactivity ในการตรวจทางซรมได (Gilmore et al., 2007)

ตารางท 2 การระบาดของโรคเมลออยโดสสทเกดภายในสวนสตว

Species Identifiation Country

Przewalski horses, Sika deer,

Muntjac deer, Mouflon, Canadian mouflon,

Redneck antelope, Beisa oryx, Indian buffalo

Cu, Bio, Nec France

Panda Cu France ex China

Antelopes Cu, Ser France

Wallabies Cu, Bio, Pa, Ser Malaysia ex Australia

Dolphin n.d. Hong-Kong

Camel, Zebra, Cow, Goat Cu Malaysia

Dolphin, Tursiops gilli Cu Hong-Kong

Cetaceans Cu Hong-Kong

Penguin, Eudyptes chrysolophus Cu Singapore

Kangaroo, cassowary, palm cockatoo, crown

pigeon

Cu Singapore

Marcopodidae, Ceropithecidae, Hylobatidae,

Pongidae, Ursidae, Equidae, Cervidae, Bovidae,

Hyderochaeridae, Otaridae

Nec Malaysia

Psitattacidae, Bucerotidae, Struthionidae

Crocodylidae, Testudinidae, Trionychidae

Cu HongKong

19

ตารางท 2 (ตอ)

Species Identifiation Country

Killer whale Orcinus orca, aduncas/gilli type

bottle nosed

Dolphin Tursiops truncates,

false killer whale Pseudorca crassidens, pacific

white sided dolphin, Lagenorhynchus

obliquidenus,

Californean sealion Zalophus californianus,

gray seal Halichoerus grypus

Cu Hong Kong

หมายเหต Cu: Culture, Bio: biochemistry, Pa: pathogenicity testing in laboratory animals, Nec:

necropsy, n.d.: not described

ทมา: Sprague and Neubauer (2004) ตารางนดดแปลงมาจาก Melioidosis in Animals: A Review

on Epizootiology, Diagnosis and Clinical Presentation

การรกษา

การรกษาผปวยหรอสตวปวยดวยโรคเมลออยโดสส จะทารกษาใหหายไดยาก ในคนผปวย

ทมภาวะ septicemia จะเสยชวตอยางรวดเรว การใชยาปฏชวนะทเหมาะสมและการวนจฉยอยาง

ทนทวงทจงมความสาคญมาก การรกษาในผปวยมกแบงเปนสองระยะ ระยะแรก (acute phase) ใชเวลา

ประมาณ 2 สปดาห นยมใชยา ceftazidime, imipenem หรอ meropenem โดยใหยาทางหลอดเลอดดา

และระยะทสอง (maintenance phase) เปนยารบประทาน มกใหรวมกน 2-3 ชนด ไดแก trimetoprim-

sulfamethoxazole, chloramphenicol, amoxicillin-clavulinate เปนเวลา 20-24 สปดาห พบวาการรกษา

ดวยระยะเวลาทไมเหมาะสมเพยงพอ จะทาใหผปวยมโอกาสกลบเปนซาไดสง

การรกษาโรคเมลออยโดสสในสตวดวยยาปฏชวนะมกไมไดผลเพราะเชอดอยาปฏชวนะ

หลายชนด สตวมกแสดงอาการปวยใกลเคยงกบโรคอนถาเลอกใชยาไมเหมาะสมสตวจะปวยตาย

หากสตวปวยทไดรบการรกษาจนหายแลว ยงมโอกาสกลบมาเปนโรคนซ าไดอกเพราะเชอหลบซอน

อยในรางกายและกอโรคไดเมอสตวมสภาพออนแอ (พฒนพงษและมนส, 2547; Thomas et al., 1988)

20

การปองกนการปนเปอนของเชอ

เนองจากเชอ B. pseudomallei เปนเชอทมความทนทานตอสงแวดลอมสง การปองกน

ไมใหเชอทอยในสงคดหลงของสตวปวยหรอผปวยปนเปอนสสงแวดลอมจงมความสาคญมาก

การใชสารเคมทมฤทธฆาเชอแบคทเรย ทาความสะอาดในบรเวณทมสงคดหลงเชน หนอง เลอด

เสมหะตกคางอย เปนสงทควรปฏบตทกครง จากการศกษาสารเคมทใชเปน antiseptic และ

disinfectant ในโรงพยาบาลศรนครนทร จงหวดขอนแกน พบวาสารเคมในกลม disinfectant ทม

ประสทธภาพสงในการทาลายเชอ B. pseudomallei ไดแก 0.1-0.5 % Chlorine, 4% Formaldehyde,

3% H2O2 และ 2% Lysol® สวนสารเคมในกลม antiseptic ไดแก 70% alcohol, 2% providine, 0.1

Thimerosal® (sodium ethylmercurithiosalicylate) และ 2% Mecurochorme®(merbromin) (ฐตมา

และคณะ, 2549)

21

อปกรณและวธการ

อปกรณ

1. อปกรณและเครองมอ

1.1 หลอดเกบเลอด 1.2 flask shaker

1.3 deep well microplate

1.4 อางน าควบคมอณหภม (water bath)

1.5 เครองปนเหวยงสารละลาย (centrifuge)

1.6 เครองดด-ปลอยสารละลายอตโนมต (micropipette)

1.7 เครองผสมสารละลาย (vortex mixer)

1.8 เครองเขยา Microtiter plate (microtiter plate shaker)

1.9 เครองอานคาการดดกลนแสง (ELISA reader)

1.10 เครองดด-ปลอยสารละลายอตโนมตชนดใชกบไปเปต (pipette aid)

1.11 ตควบคมอณหภม (incubator)

1.12 ตปลอดเชอ (larminar flow hood)

1.13 เครองนงฆาเชอ (autoclave)

1.14 Thermocycler

1.15 เครอง electrophoresis

1.16 เครอง UV Transilluminator

2. สารเคมและอาหารเลยงเชอ

2.1 สารละลาย PBS

2.2 glutaraldehyde-fixed sheep red blood cell

2.3 1% bovine serum albumin

2.4 rabbit anti-mouse immunoglobulins/horse radish peroxidase

2.5 orthophenylenediamine

2.6 distill water (DW)

22

2.7 4 M H2 SO4

2.8 2.5 % polyethylene glycol

2.9 0.1 sodium dioxycholate

2.10 อาหารเลยงเชอ Ashdown’s agar

2.11 อาหารเลยงเชอ threonine-basal-salt solution broth plus colistin

2.12 oxidation test

2.13 motile

2.14 nitrate reduction

2.15 glucose

2.16 maltose

2.17 lactose

2.18 citrate

2.19 gelatinase liquetation

2.20 triple sugar iron agar (TSI)

2.21 L-arabinose

2.22 ชดทดสอบ latex agglutination

2.23 อาหารเลยงเชอ tryptone soy agar

2.24 Wizard® SV Genomic DNA Purification System

2.25 AmpliTaq Gold® 360 Master Mix

2.26 1.5% agarose gel

2.27 100 bp DNA Ladder

2.28 สยอม Gel star®

2.29 FavorPrep™ Gel/PCR Purification Kit

2.30 ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit

3. โปรแกรมทใชในขนตอนวเคราะหลาดบนวคลโอไทด

3.1 โปรแกรม BioEdit version 7.1.9

3.2 โปรแกรม Chromas Lite version 2.1

3.3 โปรแกรม Mega version 4.0

23

วธการ

พนทศกษา

สวนสตวสงขลา เปนสวนสตวแหงท 5 ภายใตการกากบดแลขององคการสวนสตว ในพระ

บรมราชปถมภ เปนสวนสตวแหงแรกของภาคใต จดตงขน เมอวนท 23 พฤษภาคม พ.ศ.2532

ในพนท 878 ไร ซงตงอยบรเวณเขารปชาง อาเภอเมอง จงหวดสงขลาและไดเปดใหบรการอยางเปน

ทางการ เมอวนท 3 ตลาคม พ.ศ.2541 ปจจบน ประชากรสตวในสวนสตวสงขลามจานวนทงหมด

1,036 ตว แบงเปนสตวเลยงลกดวยนม 56 ชนดจานวน 355 ตว สตวเลอยคลาน 37 ชนด จานวน

148 ตว สตวปก 80 ชนด จานวน 533 ตว

การเกบขอมล

สอบถามขอมลจากสตวแพทยเกยวกบการระบาดของโรคเมลออยโดสสในสวนสตว

สงขลา (ภาพท 1) การเลยงการจดการสตว แหลงทมาของสตว มาตรการปองกนและควบคมเมอเกด

โรคระบาด เปนตน

ภาพท 1 เหตการณของการระบาดของโรคเมลออยโดสสในสวนสตวสงขลา

การเกบตวอยาง

เกบตวอยางซรมสตวในเดอนพฤษภาคม 2555 และเกบตวอยางซรมคนในเดอน มกราคม 2555 เกบตวอยางซรมจากสตวดวยวธ convenience sampling เนองจากขอจากดในการบงคบ

สตวปาซงตองวางยาสลบอาจเปนอนตรายตอสตวไดจงเกบตวอยางไดทงหมด 65 ตวอยาง จากสตว

24

เลยงลกดวยนม 18 ชนด จานวน 49 ตวอยาง สตวเลอยคลาน 2 ชนด จานวน 7 ตวอยาง และสตวปก

5 ชนด จานวน 9 ตวอยาง

เกบเลอดสตวปรมาณตวละ 2-10 ml ขนอยกบน าหนกตวของสตว โดยใชหลอดเกบเลอดท

มซลกาเจล และตงทงไวใหซรมแยกออกมา นาเลอดทเกบมาปนดวย centrifugeท 2,500 รอบ/นาท

เปนเวลา 15 นาท และเกบซรมไวทอณหภม -20 ºC จนกวาจะนาไปตรวจ

การเกบตวอยางซรมจากคนเลยงสตว สตวแพทย และผปฏบตงานในสวนสตวสงขลา

จานวน 93 คน เกบเลอดคน คนละ 10 ml จากเสนเลอดดาทแขน (Cephalic vein) ใชหลอดเกบเลอด

ทมซลกาเจล และตงทงไวใหซรมแยกออกมา นาเลอดทเกบมาปนดวย centrifuge ท 2,500 รอบ/นาท

ในเวลา 15 นาท และเกบซรมไวทอณหภม -20 ºC จนกวาจะนาไปตรวจ หาแอนตบอด IgG ตอเชอ

B.pseudomallei

การตรวจวนจฉยโรคเมลออยโดสสทางซรมวทยา

การตรวจทางซรมของโรคเมลออยโดสสในสตว โดยวธ indirect haemagglutination (IHA)

เพอทดสอบหาแอนตบอดชนด IgG ตอ เชอ B. pseudomallei ตามวธการของสถาบนสขภาพสตว

แหงชาต ดงน

ขนตอนการเตรยม absorbed serum

นาซรมสตวใสใน deep well microplate หลมละ 50 µl แลวนาไป inactivate ใน water bath

(Julabo, Germany) ท 56 ºC นาน 30 นาท จากนนเตม 5% glutaraldehyde-fixed sheep red blood

cell หลมละ 450 µl เขยาใหเขากนดวยเครอง shaker (Heidolph, Germany) และบมในต incubator

(Binder, Germany)ทอณหภมหองนาน 30 นาท นาไปปนเหวยงท 2000 - 2500 รอบ/นาทเปนเวลา

10 นาทจงได absorbed serum เพอจะลดการเกดปฏกรยาจาก non-specific antigen

25

ขนตอนการทดสอบดวยวธ IHA

นา absorbed serum มาทดสอบดวยวธ IHA (Puapermpoonsiri et al.,1986)ใน U-shape

microtiter plate โดยเตมสารละลาย PBS 50 µl ลงในหลมคอลมนท 2 ถง 11 แลวดด absorbed

serum 50 µl ลงใน microplate คอลมนท 1 , 2 และ 12 ทาการเจอจางซรมจากคอลมนท 2 ถง 9 (two-

fold serial dilution) เตม 0.5% sensitized antigen 50 µl ลงในคอลมนท 1 ถง 10 เตม 0.5%

glutaraldehyde-fixed sheep red blood cell 50 µl ลงในคอลมนท 11 และ 12 เขยาใหเขากนดวย

เครอง shaker ทงไวทอณหภมหองอยางนอย 2 ชวโมง

การอานผล

ดปฏกรยาการจบกลมระหวางแอนตเจนกบแอนตบอดจากการจบกลมของเมดเลอดแดง

(hemagglutination) กบซรมทดสอบโดยพจารณาทหลมสดทายทมการจบกลมและหลมสดทาย

(หลม 12) ของแตละคอลมน ซงเปนหลมควบคมตองไมมการรบกวนจาก heterophile antibody คอ

ไมมการเกาะกลมของเมดเลอดแดง รวมทงคาไตเตอรของซรมควบคมผลบวก และซรมควบคมผล

ลบ จะตองเทาเดมทกครงททาการทดสอบ การแปลผล ถาซรมมแอนตบอดไตเตอรท ≥1:320

ตดสนเปนบวก ซรมมแอนตบอดไตเตอรท ≥ 1:160 แตนอยกวา 1:320 ตดสนเปนผลสงสย ซรมม

แอนตบอดไตเตอรตากวา 1:160 ตดสนเปนลบ

การตรวจทางซรมของโรคเมลออยโดสสในคน โดยวธ ELISA ตามวธการของศนยวจย

โรคเมลออยโดสส คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน มขนตอนดงน

เคลอบเพลทดวย crude Ag of B. pseudomallei ทเจอจางดวย coating buffer ใหมความ

เขมขน 10 µg/ml เตมใน ELISA plate หลมละ 100 µl บมท 4 ºC ทงไวขามคน

นาเพลทออกมาลางดวย washing buffer 3 ครง ครงละ 3 นาท เตม incubation buffer ทม

5% skim milk หลมละ 200 µl ตงทงไว 1-2 ชวโมง แลวลางเพลท ดวย washing buffer 3 ครงครงละ

3 นาท เจอจางซรมทตองการตรวจในอตราสวน 1:4500 ดวย 1% skim milk เตมหลมละ 100 µl บมใน

incubator (Memmert, Germany)ท 37 ºC นาน 2 ชวโมง แลวลางเพลทดวย washing buffer 3 ครง

ครงละ 3 นาท เตม conjugate 50 µl โดยเจอจาง conjugate ในอตราสวน 1:1000 ดวย 1% bovine

26

serum albumin (BSA) in incubation buffer เตม rabbit anti-mouse immunoglobulins/horse radish

peroxidase หลมละ 50 µl บมท 37 ºC 1 ชวโมง ลางเพลท ดวย washing buffer 3 ครงครงละ 3 นาท

เตมsubstrate (orthophenylenediamine 1 เมด (2mg) + DW 10 ml + 10 µl 35% H2O2) หลมละ 100 µl

นาไปบมทอณหภมหองในทมด 20 - 30 นาท เตม stop solution (4 M H2 SO4) หลมละ50 µl เพอ

หยดปฏกรยา

การอานผล

อานผลทคา OD 490 นาโนเมตร ถาคา OD มากกวาหรอเทากบ 0.5 อานเปน positive

การเกบตวอยางจากดนในบรเวณสวนสตวมาเพาะแยกเชอ

การเกบตวอยางดน

เลอกตาแหนงทเกบตวอยางดนจากพนทมประวตทเคยมสตวปวยตาย และเปนบรเวณทเปน

ดนเกาดงเดมของสวนสตว ยงไมไดปรบปรงพนทเปนคอนกรตหรอนาดนใหมมาถม เกบดนแตละ

ตาแหนงจะขดแบงเปน 3 จดยอยเปนลกษณะรปสามเหลยม ขนาดความกวางปากหลมทขด

ประมาณ 15 เซนตเมตร (ภาพผนวก ก 2) โดยขดลกลงไปเกบดนทความลกประมาณ 15 และ 30

เซนตเมตร ดนทเกบในแตละจดยอยนามารวมกนเปน 1 ตวอยาง คลกเคลาดนใหเขากน ใชชอนท

สะอาดตกดนประมาณ 500 กรม จากกนหลมใสในถงซป เกบดนโดยไมใหสมผสกบแสงแดด

แลวนาสงหองปฏบตการ

เกบตวอยางดนจากสวนสตวสงขลาทงหมด 9 ตวอยาง โดยเกบในสวนแสดงสตวจานวน

3 ตวอยาง ไดแก คอกมาลายคอกเกา เกาะชะนดานลาง คอกนกอมและนลกาย และเกบจากบรเวณ

ดานนอกสวนแสดงสตวอกจานวน 6 ตาแหนงไดแก บรเวณหนาคอกนาก หลงกรงเสอ หลงคอก

อรงอตง คอกสตวเลอยคลาน โรงพยาบาลสตวบรเวณหลงหองผาซาก และอางเกบน าดานลาง

(ภาพท 2)

27

ภาพท 2 ตาแหนงทเกบตวอยางดนจากสวนสตวสงขลา

เพาะแยกเชอจากดน ตามวธการของศนยวจยโรคเมลออยโดสส คณะแพทยศาสตร

มหาวทยาลยขอนแกน มขนตอนดงน

การเตรยมตวอยางดน

1. ชงดน 25 กรมใสในขวดรปชมพ (flask) แลวเตมสารละลาย 2.5 % polyethylene glycol

ทผสม 0.1 Sodium dioxycholate ปรมาตร 50 ml ลงไป

2. เขยาใหเขากนดวยเครอง flask shaker (Labcon, U.S.A.) ความเรว 200 รอบ/นาท

ทอณหภมหองนาน 2 ชวโมง แลวตงทงไว ทอณหภมหอง 5 นาท 3. เทสวนใสปรมาตรประมาณ 40 ml ใส tube ใหม แลวนามาปนดวยเครอง centrifuge

(Eppendorf , Netherlands) ดวยความเรว 2000-3000 รอบ/นาท นาน 15 นาทแลวเทสวนใสดานบน

ใส tube ใหม เพอนามาเพาะแยกเชอใน Ashdown’s agar และ threonine-basal-salt solution broth

plus colistin (50 mg/liter) (TBSS C-50 broth) ในขนตอนตอไป

28

การเพาะแยกเชอใน Ashdown’s agar

นาตวอยางดนทเตรยมไว มาเพาะโดยไมตองทาการเจอจาง (undiluted) ดดน าใสสวนบน

100 µl หยดลงบนเพลท Ashdown’s agar แลว spread ใหทวเพลท บมทอณหภม 37 oC นาน 2 วน

แลวนาเพลทมาอานผล โดยการดลกษณะโคโลน เชอ B. pseudomallei ท 2 วน โคโลนจะมลกษณะแบน

สชมพอมมวงออกมนวาว แตวนท 3 และ 4 จะเหนโคโลนเหยวยนชดเจน (ภาพผนวก ก 3) มลกษณะ

พเศษทจาเพาะ คอมกลนคลายดนหลงฝนตกใหม (Earthy odour) เมอนาเชอมายอมสแกรมจะม

ลกษณะคลายเขมซอนปลายเพราะเชอจะตดสบรเวณหวทาย (bipolar)

การเพาะแยกเชอใน TBSS C-50 broth

นาตวอยางดนทเตรยมไว ดดน าใสสวนบนมา 1 ml ใสในหลอด TBSS C-50 broth 9 ml

เขยาดวยความเรว 200 รอบ/นาท นามาบมใน incubator (Memmert, Germany) ทอณหภม 42 ºC

นาน 4 วน เจอจางตวอยางทความเขมขน 10-3-10-5 ขนอยกบระดบความขนของ broth ดวยสารละลาย

PBS (pH 7.2) แลวเขยาใหเขากน ดดตวอยาง 100 µl spread ลงบน Ashdown’s agar บมทอณหภม

37 º C นาน 2 วนแลวนาเพลทมาอานผล

ทงวธเพาะแยกเชอใน Ashdown’s agar โดยตรงและเพาะแยกเชอในTBSS C-50 broth หากพบ

โคโลนทสงสย ทาการทดสอบทางชวเคม ไดแก oxidation test motile nitrate reduction glucose

maltose lactose citrate gelatinase liquetation Triple sugar iron agar (TSI) L-arabinose

(Wuthiekanun et al., 1996) และทดสอบดวยวธ latex agglutination (Smith et al., 1993) เพอยนยน

ผลวาเปนเชอ B. pseudomallei

29

วเคราะหลาดบนวคลโอไทดจากเชอทเพาะแยกไดโดยใชวธ Multilocus sequence typing

1. ตวอยางทนามาใชในการวเคราะห MLST

เชอ B. pseudomallei ทนามาวเคราะหเพอหาลาดบนวคลโอไทดดวยวธ MLST ใน

การศกษานไดมาจากเชอทเพาะแยกไดจากดน ในบรเวณสวนสตวและเชอทเพาะแยกไดจากสตวใน

สวนสตวทปวยตายดวยโรคเมลออยโดสส (ตารางท 3) ไดแก มาลาย และอรงอตง (ภาพผนวก ก 4,

ก 5, ก 6)

ตารางท 3 ตวอยางเชอทนามาวเคราะหดวยวธ MLST

ตวอยาง วธการเพาะแยกเชอ ตาแหนงทเกบ วนทเพาะแยกเชอได

1. มาลาย blood agar และ

MacConkey agar

ปอด 14 ม.ย.2553

2. อรงอตง blood agar และ

MacConkey agar

ปอด 23 ธ.ค.2554

3. ดนในคอกมาลาย

คอกเกา

Ashdown’s agar

(Direct)

ทความลก 30

เซนตเมตร

26 พ.ย.2555

2. การสกด DNA เพอใชในการวเคราะหดวยวธ MLST

B. pseudomallei ทง 3 ตวอยาง ถกนามาเพาะใหม ในหองปฏบตการจลชววทยา คณะ

สตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร ในอาหารเลยงเชอ Tryptone soy agar (Oxoid Ltd.,

Basingstoke, United Kingdom) บมทอณหภม 37 ºC นาน 18-24 ชวโมง จากนนนามาสกด DNA

(DNA extraction)โดยการใช Wizard® SV Genomic DNA Purification System (Promega, USA)

ตามวธการและขนตอนตามขอบงใชของผผลต เพอเปนแมแบบของดเอนเอ (DNA template) แลวนา

DNA ทสกดไดมาเกบรกษาทอณหภม - 20 ºC โดยใสรหสใหแมแบบของดเอนเอททดสอบคอ มาลาย

คอ Bpseu_z1 ลงอรงอตง คอ Bpseu_OR ดนในคอกมาลายคอกเกาคอ Bpseu_DD

30

3. การเพมปรมาณสารพนธกรรมดวยวธ PCR

นาตวอยางทไดมาเพมปรมาณสารพนธกรรม (DNA amplification) ดวยการทา PCR

โดยใช primer ทสามารถจบกบ house-keeping gene ทง 7 ยน (Godoy et al., 2003) ดงแสดงใน

ตารางท 4

ตารางท 4 house-keeping gene ทใชในการทา MLST ของเชอ B. pseudomallei

ชอ primer ลาดบนวคลโอไทด

ace-up 5'-CGGCGCTTCTCAAAACGATA-3'

ace-dn 5'-GAATCGCCTTCACCATGTC-3'

gltB-up 5'-ACGCTCGCGATCGCGATGAA-3'

gltB-dn 5'-TTCAGCACGAGCGTCTGCTG-3'

gmhD-up 5'-GCAGTTCCTGTATGCGTC-3'

gmhD-dn 5'-GAAGCACTGGTACTTGCC-3'

lepA-up 5'-CATATTCGCAATTTCTCGATC-3'

lepA-dn 5'-CACGAGCATCACGACGCCG-3'

lipA-up 5'-GGCACCGCGACGTTCATG-3'

lipA-dn 5'-GACCATCAGGCCCGATTTCG-3'

narK-up 5'-CTACTCGTGCGCTGGGAT-3'

narK-dn 5'-GACGATGAACGGCACCCAC-3'

ndh-up 5'-AGTCGCGACGTTCTACAC-3'

ndh-dn 5'-CGAGTTGCAGACGAGATA-3'

การเพมปรมาณ DNA ในปฏกรยาขนาด 50 µl ประกอบดวย 5 µl DNA template,

AmpliTaq Gold® 360 Master Mix 25 µl, 10 µM forward primer, 10 µM reverse primer, 11 µl

nuclease-free water ใชเครอง Thermal Cycler (MJ mini personal Thermal cycler, BIO-RAD)

ขนตอนประกอบดวย initial denaturation ท 95 ºC เปนเวลา 4 นาท ขนตอนการเพมจานวนยน 30 รอบ

ประกอบดวย denaturation ท 94 ºC เปนเวลา 30 วนาท annealing ท 62 ºC เปนเวลา 30 วนาท

31

extension ท 72 ºC เปนเวลา 1.5 นาท และ post extension ท 72 ºC เปนเวลา 10 นาท อก 1 รอบ ทาให

เยนลงท 4oC ไดเปน PCR product เกบรกษาไวท -20 ºC

4. การตรวจสอบ PCR product

นา PCR product ทไดมาตรวจสอบวามขนาดถกตอง โดยใชวธ electrophoresis ผาน

กระแสไฟฟา 100 mA ใน 1.5% agarose gel นาน 30 นาท แลวเปรยบเทยบขนาดกบ DNA

มาตรฐาน 100 bp DNA Ladder (Promega, USA) ททราบขนาดแนนอน จากนนยอม DNA บนแผน

gel ดวยสยอม Gel star®( Cambrex Bio Science Rockland Inc., U.S.A.) แลวนาไปสองดดวยแสง

อลตราไวโอเลต โดยใชเครอง UV Transilluminator หลงจากนนนา PCR product มาทาใหบรสทธ

ในขนตอน purification โดยใช FavorPrep™ Gel/PCR Purification Kit เพอทจะทาขนตอน

sequencing ตอไป

5. การหาลาดบนวคลโอไทด (DNA sequencing)

ตวอยาง DNA แตละตวอยางจะถกนามาทาการ sequencing โดยการตดฉลาก ABI

PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Macrogen, U.K.)ใช primer เดยวกนกบทใชใน

ขนตอนการเพมปรมาณ DNA

6. การวเคราะหการจดเรยงลาดบนวคลโอไทด

วเคราะหลาดบนวคลโอไทดโดยใชโปรแกรม BioEdit version 7.1.9 (Carolina state

University, U.S.A.) และ Chromas Lite version 2.1 (Carolina state University, U.S.A.) โดยขอมล

ลาดบนวคลโอไทดทไดจะถกนามาเปรยบเทยบกบรปแบบของ allelic profile ทมอยในฐานขอมล

ของเชอ B. pseudomallei ในเวบไซต http://bpseudomallei.mlst.net เพอระบ sequence types (ST)

32

7. การเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดและสรางแผนภาพ phylogenetic tree

เปรยบเทยบความแตกตางระหวางลาดบนวคลโอไทดโดยคานวณคาระยะหางเปนค

(pairwise alignment) ของเชอตวอยาง สรางแผนภาพ phylogenetic tree โดยใชโปรแกรม Mega 4.0

(Arizona state University, USA) จากขอมลลาดบนวคลโอไทด (ST) ของทง 3 ตวอยางกบขอมล

ลาดบนวคลโอไทดของเชอ B. pseudomallei ทมรายงานจากประเทศไทยและออสเตรเลยใน

ฐานขอมลดวยวธ unweigthed-pair-group method with arithmetric methods (UPGMA) โดยเลอก

โมเดลของววฒนาการแบบ Kimura 2 method ทดสอบความถกตองของ phylogenetic tree ดวยวธ

bootstrapping 500 ครง เพอวเคราะหหาความใกลเคยงและความเชอมโยงของของเชอ

B. pseudomallei ทระบาดในสวนสตวสงขลา

33

ผลและวจารณ

ผล

ตวอยางเลอดสตวจากสตวในสวนสตวสงขลาจานวนทงสน 65 ตวอยาง เปนสตวเลยงลก

ดวยนม 18 ชนด จานวน 49 ตว สตวเลอยคลาน 2 ชนด จานวน 7 ตว และสตวปก 5 ชนด จานวน 9 ตว

ความชกทางซรมของการตดเชอ B. pseudomallei ในสตวของสวนสตวสงขลาเทากบ 1.53 % (1/65)

โดยพบผลบวกในสตวเลยงลกดวยนมคอ แรดขาว สวนตวอยางจากสตวเลอยคลานและสตวปก

ใหผลลบทงหมด (ตารางท 5)

ตารางท 5 ผลการตรวจหาแอนตบอดตอเชอ B. pseudomallei ดวยวธ indirect hemagglutination

ในสตวของสวนสตวสงขลาจานวน 65 ตว ในป 2555

ชนดสตว ชอวทยาศาสตร จานวนตว ผลการตรวจ

สตวเลยงลกดวยนม

กวางปา Cervus unicolor 3 negative

คางแวนถนใต Tachypithecus obscura 6 negative

ชะนแกมขาว Nomascus leucogenys 2 negative

ชะนมอขาว Hylobates lar 3 negative

ชะมดแผงหางปลอง Viverra zibetha 4 negative

ชางเอเชย Elephas maximus 3 negative

นลกาย Boselaphus Tragocamelus 2 negative

เนอทราย Axis porcinus 4 negative

เมนใหญแผงคอยาว Hystrix Brachyura 1 negative

เมนหางพวง Atherurus macrourus 2 negative

แรดขาว Ceratotherium simum simum 1 positive

ลงกง Macaca nemestrina 1 negative

ลงชมแพนซ Pan Troglodytes 2 negative

ลงแสม Macaca fascicularis 5 negative

ลงอรงอตง Pongo pygmaeus 1 negative

ละมง Cervus eldi thamin 1 negative

34

ตารางท 5 (ตอ)

ชนดสตว ชอวทยาศาสตร จานวนตว ผลการตรวจ

สมเสรจ Tapirus indicus 4 negative

หมขอ Arctictis binturong 2 negative

อนเลก Cannomys badius 1 negative

ไฮยนา Crocuta crocuta 1 negative

สตวเลอยคลาน

งหลามทอง Python molurus bivittatus 6 negative

งหลามบอล Python regius 1 negative

สตวปก

นกกาฮง Buceros biconis 1 negative

นกเงอกกรามชาง Rhyticeros undulatus 1 negative

นกเพนกวน Spheniscus humboldti 3 negative

นกยงอนเดย Pavo cristatus 1 negative

เหยยวแดง Haliastur indus 3 negative

ผลการตรวจหาแอนตบอดตอเชอ B. pseudomallei ดวยวธ ELISA ในผทปฏบตงานสมผส

กบสตวในสวนสตวสงขลาพบความชกคดเปนรอยละ 1.07 (1/93) โดยผทตรวจพบผลบวกเปน

บคลากรททางานทสวนแสดงนกเพนกวนและทางานในสวนสตวมาประมาณ 8 ป (ตงแตป พ.ศ.

2547)

การเพาะแยกเชอ B. pseudomallei ดวยอาหารเลยงเชอ Asdown’s agar และ TBSS C-50

broth จากดนในสวนสตวพบใหผลบวก 1 ตวอยาง จากจานวน 9 ตวอยางโดยพบจากตวอยางดนท

ระดบความลก 30 เซนตเมตร บรเวณคอกมาลายคอกเกาทเคยมมาลายปวยตาย

จากขอมลลาดบนวคลโอไทดของ B. pseudomallei ในการศกษาครงน จะไดขนาดนวคล

โอไทดของยน ace- gltB- gmhD- lepA- lipA- narK- ndh เทากบ 519-522-468-485-401-561-443 bp

ตามลาดบ เมอนาเอาผล sequence ของทง 7 ยนมาตอกน (concanated) แบบ joined end to end เปน

สายยาว จะไดความยาวรวมทงหมด 3,401 bp แลวทาการ alignment จะไดผลดงภาพท 3

35

10 20 30 40 50 60 70 80 90 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 CGAATTGCTTACGTAACGGGCGGCATGGGCGGCATCGGCACGAGCATCTGCCAGCGCCTGCACAAGGACGGCTTCAGGGTGGTCGCGGGC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 100 110 120 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 TGCGGCCCGAATTCGCCGCGCCGCGTGAAATGGCTCGAGGATCAGAAGGCGCTCGGCTTCGATTTCTACGCGTCCGAAGGCAACGTCGGC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 190 200 210 220 230 240 250 260 270 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GACTGGGATTCGACGAAGCAGGCGTTCGACAAGGTGAAGGCCGAAGTGGGCGAGATCGACGTGCTCGTCAATAACGCGGGCATCACGCGC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 280 290 300 310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GACGTCGTGTTCCGCAAGATGACCCGCGAGGATTGGCAGGCGGTGATCGACACGAACCTGACGAGTCTCTTCAACGTCACGAAGCAGGTG Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 370 380 390 400 410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 ATCGACGGGATGGTCGAGCGCGGCTGGGGGCGCATCATCAACATCTCGTCGGTGAACGGCCAGAAGGGGCAGTTCGGCCAGACCAACTAT Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 460 470 480 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 TCGACCGCGAAGGCGGGCATTCACGGCTTCACGATGTCGCTCGCGCAGGAAGTCGCGACGAAGGGGGTGCGCAACGAGCTGCGCGGCATT Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 550 560 570 580 590 600 610 620 630 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 CCGATCAAGGTCGGCGACACGCTGAAATCGGTGATCGGCGACGAGATCGTGCGCGACATCCCGCTGAAGGAAGGCGATTCGCTGCGCTCG Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 640 650 660 670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 AAGATCAAGCAGGTCGCATCGGGCCGCTTCGGCGTGACGGCCGAGTATCTCGCGTCGGCCGACCAGATCCAGATCAAGATGGCGCAGGGC Bpseu_OR .................G........................................................................ Bpseu_DD .................G........................................................................ 730 740 750 760 770 780 790 800 810 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GCGAAGCCGGGCGAAGGCGGCCAACTGCCGGGCCACAAGGTGTCCGAATACATCGGCAAGCTGCGCTACTCGGTGCCGGGCGTCGGCCTC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 820 830 840 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 ATCTCGCCGCCGCCGCACCATGACATCTATTCGATCGAGGATCTCGCGCAACTGATCCACGATCTGAAGAACGTCAATCCGGTCGCGAGC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 910 920 930 940 950 960 970 980 990 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 ATTTCGGTGAAGCTCGTGTCGGAGGTGGGCGTCGGCACGGTGGCGGCGGGCGTCGCGAAGGCGAAGGCCGATCACGTCGTGATCGCGGGC Bpseu_OR ..C....................................................................................... Bpseu_DD ..C....................................................................................... 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 CACGACGGCGGCACGGGCGCTTCGCCGCTGTCGTCGGTCAAGCACGCGGGTGCGCCGCTCAATGTGTACGGCTATTCGAAGTTCCTGTTC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GATCAGGTGATCCGCCGCGTGATGCCGAGCGCGAAGAGCCAGATCGCGGGCTTCCGCTATTTCAACGTGTACGGGCCGCGCGAGTCGCAC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 1180 1190 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 AAGGGGCGCATGGCGTCGGTTGCGTTCCACAACTTCAACCAGTTTCGCGCCGAGGGCAAGGTCAAGCTCTTCGGCGAGTACAACGGCTAT Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD ..........................................................................................

ภาพท 3 การจดเรยงลาดบนวคลโอไทดของ house keeping gene ทง 7 ยนของเชอ B. pseudomallei

ทเพาะแยกไดจาก มาลาย (Bpseu_z1) อรงอตง (Bpseu_OR) และดนจากคอกมาลายคอก

เกา (Bpseu_DD)

36

1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 1340 1350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GGCCCGGGCGAGCAGACGCGCGATTTCGTGTCGGTCGAGGACGTCGCGAAGGTGAACCTGCATTTCTTCGATCACCCGCAGAAGTCGGGC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 1360 1370 1380 1390 1400 1410 1420 1430 1440 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 ATCTTCAATCTCGGTACTGGCCGCGCGCAGCCGTTCAACGACATCGCGACGACGGTCGTCAACACGCTGCGCGCGCTCGAAGGCCAGCCC Bpseu_OR .................C........................................................................ Bpseu_DD .......................................................................................... 1450 1460 1470 1480 1490 1500 1510 1520 1530 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GCGCTCACGCTTGCTGAGCAGGTCGAGCAGGGGCTCGTCGAATACGTGCCGTTCCCGGACGCGCTGCGCCACATCGACCACGGCAAGTCG Bpseu_OR ..............C........................................................................... Bpseu_DD ..............C........................................................................... 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 1620 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 ACGCTCGCGGATCGCATCATCCAGCTTTGCGGTGGCCTGTCCGACCGGGAGATGGAATCGCAGGTGCTCGACTCGATGGACCTCGAGCGC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD ................................C...................................T..................... 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700 1710 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GAGCGCGGCATCACGATCAAGGCGCAGACCGCCGCGCTCACCTATCGCGCGCGCGACGGCAAGGTCTACAACCTGAATCTCATCGATACC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 CCGGGGCACGTCGATTTCTCGTACGAAGTGAGCCGCTCGCTGTCCGCGTGCGAGGGCGCGCTGCTCGTCGTCGACGCAAGCCAGGGCGTC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GAGGCGCAGACGGTCGCGAACTGCTATACGGCGATCGAGCTCGGCGTCGAGGTGGTGCCCGTCCTCAACAAGATCGATCTGCCGGCGGCG Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 AACCCGGAGAACGCGATCGCCGAGATCGAGGACGTGATCGGCATCGACGCGATGGACGCGGTGCGCTGCAGCGCGAAGACGGGCCTCGGC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 1990 2000 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GTCGAGGACGTGCTCAAGTGCACGCGCCGCTGCCCGTTCTGCGACGTCGGCCACGGCCGGCCCGATCCGCTCGACGCAGACGAGCCGAAG Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 2080 2090 2100 2110 2120 2130 2140 2150 2160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 AACCTCGCGCGCACGATCGCGGCGCTCAAGCTCAAGTACGTGGTGATCACGAGCGTCGACCGCGACGATCTGCGCGACGGCGGCGCCGGC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 2170 2180 2190 2200 2210 2220 2230 2240 2250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 CACTTCGTCGAATGCATCCGCGAAGTGCGCGAGCAGTCGCCCGCGACGCGCATCGAGATCCTGACACCGGACTTCCGTGGCCGCCTCGAC Bpseu_OR ...........G.....................................................G........................ Bpseu_DD .......................................................................................... 2260 2270 2280 2290 2300 2310 2320 2330 2340 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 CGTGCGCTCGCGATCCTGAACGCGGCGCCGCCCGACGTGATGAACCACAATCTCGAAACGGTGCCGCGCCTGTACAAGGAGGCGCGCCCC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 2350 2360 2370 2380 2390 2400 2410 2420 2430 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GGCTCGGACTATGCGCATTCGCTGAAGCTCCTGAAGGATTTCAAGGCGCTGCATCCGCCCGAAAACCCGGCCTTCTGGCAAGCCAAGGGG Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 2440 2450 2460 2470 2480 2490 2500 2510 2520 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 CGCCCCGTCGCGTGGCGCAATCTCGCGATCTCGATTCCCGCGCTGATGCTCGCGTTCGTCGTCTGGTCGCTCTGGAGCGTCGTCGTCGTC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD ..........................................................................................

ภาพท 3 (ตอ)

37

2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 2600 2610 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 AACCTCGATCGCGCGGGCTTTCACTTCAGCAAGAACCAGCTGTTCTGGCTCACCGCGCTGCCCGCGCTCTCCGGCGCGACGCTGCGCATC Bpseu_OR ....................................................................T..................... Bpseu_DD .......................................................................................... 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 2700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 TTCTATTCGTTCCTCGTGCCGATCTTCGGCGGCCGCCGCTTCACCGCGATCTCGACCGCGACGCTGCTGATTCCCGCGCTCGGAATGGGC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 TTCGCGCTGCGCGACCCCGGCACGGGCTACCCGACGCTCCTCATCCTCGCGCTGCTCTGCGGGTTCGGCGGCGCGAACTTCAGCTCGTCG Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 2800 2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 ATGGCGAACATCAGCTTCTTCTTCCCGAAGGCGAAGAAAGGACTCGCGACCGGCCTGAACGCGGGCATCGGCAACCTCGGCGTGTCGGTC Bpseu_OR .........................................G................................................ Bpseu_DD .......................................................................................... 2890 2900 2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GTGCAGTTCGTCACGCCGCTCGTGATCTCGGCGGGCCTGTTCGGCGCGCTCGCGGGCGATCCGCAGAGCGTCGTCGCGATGTACGAGCTC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 2980 2990 3000 3010 3020 3030 3040 3050 3060 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GCGCCCGTCGGCAAGCACAAGATCACGCTCTGCACGAACCTGCCGTGCCAGCTCGGCCCGCACGGCGGCGCCGAGGCGACGGCCGACTAT Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 3070 3080 3090 3100 3110 3120 3130 3140 3150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 CTGAAGCAAAAGCTCGGCATCGATTTCGGCGAAACCACGCCGGACGGCAAGTTCACGCTGAAGGAAGGCGAATGCTTCGGCGCGTGCGGC Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 3160 3170 3180 3190 3200 3210 3220 3230 3240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 GATGCGCCGGTGCTGCTGCTCAACAATCACAAAATGTGCAGCTTCATGAGCCGCGAGAAGATCGACCAGCTGCTTGAGGAGCTCTCGAAA Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................T.................................................................. 3250 3260 3270 3280 3290 3300 3310 3320 3330 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Bpseu_z1 TGACGTCCCTTCACGATCGTCACATCAAACCGCTGATCCTCGCCGGCCTGACCGGCGAGAACTGGCATCTCGAAGACTACGTCGCGCGCG Bpseu_OR .......................................................................................... Bpseu_DD .......................................................................................... 3340 3350 3360 3370 3380 3390 3400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|. Bpseu_z1 GCGGCTACAAGCAGTTGCGCCGCATCCTCGAAGAAAAGATTCCGCCCGAGCAGGTGATCGCCGACGTGAAG Bpseu_OR ....................................................................... Bpseu_DD .......................................................................

ภาพท 3 (ตอ)

ผลการจดเรยงลาดบนวคลโอไทดพบตาแหนงทไมมความแตกตางของลาดบนวคลโอไทด

(invariable sites ) เทากบ 3,390 ตาแหนง และตาแหนงทมความแตกตางของลาดบนวคลโอไทด

(variable sites) เทากบ 11 ตาแหนง (total number of mutations: 11) โดยเปนลกษณะ singleton

variable sites (two variants) ทงหมด 11 ตาแหนง ทตาแหนง 648, 903, 1368, 1455, 1563, 1599,

2172, 2226, 2589, 2832, 3174 เมอนาขอมลลาดบนวคลโอไทดท ง 3 ตวอยางมาคานวณแบบ

pairwise เพอหาจานวนของตาแหนงทแตกตางกน (Number of differences) ในแตละคตวอยางจะ

ไดผลดงคา matrix แสดงในตารางท 6

38

ตารางท 6 จานวนตาแหนงทมความแตกตางของลาดบนวคลโอไทดเมอเปรยบเทยบกนในแตละค

ของตวอยาง

Bpseu_z1 Bpseu_OR Bpseu_DD

Bpseu_z1

Bpseu_OR 8

Bpseu_DD 6 8

เมอนาขอมลลาดบนวคลโอไทดทง 3 ตวอยางมาคานวณแบบ pairwise เพอหาระยะความ

แตกตางกนในแตละคตวอยางโดยใชวธ Kimura 2-parameter จะไดผลดงคา matrix แสดงในตารางท 7

ตารางท 7 ผลการคานวณระยะหางเพอประเมนความแตกตางของววฒนาการระหวางลาดบนวคล

โอไทดในแตละคของตวอยาง

Bpseu_z1 Bpseu_OR Bpseu_DD

Bpseu_z1

Bpseu_OR 0.02

Bpseu_DD 0.02 0.02

การวเคราะหดวยวธ MLST พบวา isolates ทง 3 ตวอยางของ B. pseudomallei ในการศกษา

นมรปแบบ ST ใน 3 แบบ คอ ST 54, 290, 369 โดยมรายละเอยดดงตารางท 8

39

ตารางท 8 ผลการวเคราะห sequence type ของเชอ B. pseudomallei ทเพาะแยกไดจากสวนสตว

ดวยวธ multilocus sequence typing

ตวอยาง แหลงทมา ปทเพาะ

แยกเชอ

ST Allele profile

ace gltB gmh

D

lepA lipA narK ndh

Bpseu_z1

มาลาย 2553 290 3 4 11 3 5 4 1

Bpseu_OR

อรงอตง 2554 54 3 1 3 3 1 2 1

Bpseu_DD

ดนในคอกมา

ลายคอกเกา

2555 369 3 1 2 1 5 4 3

เมอทาการวเคราะห phylogenetic analyses จากรปแบบ ST ของตวอยางเปรยบเทยบกบ

รปแบบของ ST จากฐานขอมลทางอนเตอรเนต www.mlst.net ดวยวธ UPGMA และทาการ

bootstrapping 500 ครง ไดแผนภม phylogenetic tree ดงภาพท 4 และภาพท 5

40

ภาพท 4 Phylogenetic tree แสดง ST ของ เชอ B. pseudomallei ทเพาะแยกไดจากสวนสตวสงขลา

เปรยบเทยบกบ ST แบบเดยวกนทมอยในฐานขอมล

ST 369

ST 290

ST 54

41

ภาพท 5 Phylogenetic tree แสดงความแตกตางของ ST ของ เชอ B. pseudomallei ทเพาะแยกได

จากสวนสตวสงขลา เปรยบเทยบกบ ST รปแบบอนทเพาะแยกไดจากประเทศไทยและ

ออสเตรเลย

42

ผลการทา phylogenetic tree พบวา ST ทงสามแบบของเชอ B. pseudomallei ทเพาะแยกได

จากตวอยางของสวนสตวสงขลา พบวา ST 369 จากตวอยางดนในคอกมาลายคอกเกา (Bpseu_DD)

กบ ST 290 ทเพาะแยกไดจากมาลายทปวยตาย (Bpseu_z1) ในคอกเดยวกนมความใกลเคยงกน

มากกวา ST 54 ของเชอ B. pseudomallei ทเพาะแยกไดจากอรงอตง เมอเปรยบเทยบกบขอมล ST

ในฐานขอมลพบวา ST 290 ของมาลายและ ST 54 ของอรงอตงมรปแบบเหมอนกบ isolate ทเพาะ

แยกไดจากคนและสงแวดลอมในประเทศไทย แต ST 54 มรายงานการเพาะแยกไดจากประเทศ

มาเลเซยดวยเชนกน ในขณะท ST 369 ของเชอทเพาะแยกไดจากดนในคอกมาลายคอกเกา

(Bpseu_DD) มรายงานพบในเชอทเพาะแยกไดจากสงแวดลอมในประเทศไทย (ตารางผนวกท ค 1)

43

วจารณ

การศกษาในครงนพบความชกของโรคเมลออยโดสสในสตวของสวนสตวสงขลามคา

เทากบรอยละ 1.53 เปนคาทไมสงนกเชนเดยวกนกบการสารวจความชกของโรคเมลออยโดสสใน

แพะทเลยงในจงหวดสงขลาในป พ.ศ. 2552-2553 ซงพบความชกรอยละ 0.51 (พรทพยและอรรถ

พร, 2555) อยางไรกตามขอจากดทสาคญของการศกษาในครงนคอ จานวนตวอยางเลอดสตวยงไม

เพยงพอทจะเปนตวแทนทดของประชากรสตวในสวนสตวได เนองจากเกบตวอยางดวยวธ

convenience sampling เพราะการเกบเลอดจากสตวในสวนสตวตองอาศยการวางยาสลบซงอาจเปน

อนตรายตอสตวดงกลาวและมงบประมาณทตองใชสง จากจานวนตวอยางเลอดจากสตวในสวน

สตวในการศกษานทาใหคาความชกทวดไดอาจมความคลาดเคลอนจากความชกจรง ดงนนควรม

การตรวจตวอยางเพมเตมโดยเฉพาะในกลมสตวเลยงลกดวยนมเพอเปนการเฝาระวงการตดเชอโรค

เมลออยโดสสในสวนสตวจงหวดสงขลาตอไป

ผลการสบสวนโรคในสวนสตวสงขลายงพบสตวปวยตายดวยโรคเมลออยโดสสอยาง

ตอเนอง โดยเฉพาะลงอรงอตงทปวยตายและมผลการเพาะแยกเชอยนยน แตผลการตรวจโรคดวย

วธ IHA ใหผลลบ (ขอมลจากการสมภาษณ ) ซงสอดคลองกบการศกษาลกษณะอาการปวยในผปวย

โรคเมลออยโดสส ทประเทศออสเตรเลยพบวา ผปวยทมผลเพาะแยกเชอยนยนวาเปนโรค แตผล

การตรวจดวยวธ IHA ใหผลลบเชนกน โดยพบความเกยวของกนอยางมนยสาคญระหวางการตรวจ

โรคในระยะทมการตดเชอในกระแสเลอดแลวผลการตรวจดวย IHA ใหผลลบ (Harris et al., 2009)

ดงนนในกรณทมสตวปวยตายในสวนสตวจงหวดสงขลาโดยมอาการหรอลกษณะวการทสงสยวาม

การตดเชอโรคเมลออยโดสส ควรทาการเพาะแยกเชอ B. pseudomallei เพอยนยนการตดเชอตอไป

รวมทงควรมมาตรการดานความปลอดภยทางชวภาพทเขมงวดเพอลดความเสยงในการตดเชอจาก

สตวทปวยตายเขาสผปฏบตงาน รวมทงลดการปนเปอนของเชอในสงแวดลอม และมการวางแนว

ปฏบตทดในการเลยงสตวใหกบผปฏบตงาน และแจงเตอนผปฏบตงานใหระมดระวงการสมผสกบ

เชอ B. pseudomallei

ผลการตรวจซรมในผปฏบตงานของสวนสตวสงขลาทสมผสสตวพบความชกทางซรมของ

โรคเมลออยโดสสจากการตรวจดวยวธ ELISA มคาเทากบรอยละ 1.07 (1/93) ซงมคาตาสอดคลอง

กบรายงานผปวยโรคเมลออยโดสสประจาป พ.ศ. 2552-2554 ของสานกระบาดวทยา กรมควบคม

โรคกระทรวงสาธารณสข ทพบผปวยในจงหวดสงขลาแตมอตราปวยตาโดยมคาเทากบ < 2.3, < 4.56

44

และ < 6.12 ตอประชากรแสนคน (สานกระบาดวทยา กรมควบคมโรค, 2552 , 2553, 2554) การตรวจ

โรคเมลออยโดสสดวยวธ ELISA มความนาเชอถอมากกวา IHA เพราะมความไวและความจาเพาะ

ในการตรวจสงกวา (Sirisinha et al., 2000; Wongratanacheewin et al., 2001) แตวธนยงตรวจพบ

ผลบวกลวงไดในคนปกต (Wongratanacheewin et al., 2001) ดงนนในสวนสตวทมการระบาดของ

โรคเมลออยโดสส ควรมมาตรการในการเฝาระวงการตดเชอในผปฏบตงานเปนระยะๆ โดยเฉพาะ

ในผปฏบตงานกลมมทมความเสยงสง หรอกลมทมความไวตอการตดเชอสง

การเพาะแยกเชอจากดน ตรวจพบเชอ B. pseudomallie ในพนทคอกมาลายคอกเกาทเคย

พบมาลายปวยตายดวยโรคเมลออยโดสสมากอน ตวอยางดนทพบเชอเกบไดจากบรเวณใตรมไมทม

น าขง ซงสอดคลองกบการศกษาในประเทศไตหวน พบวาเชอ B. pseudomallie เจรญเตบโตไดดใน

อาหารเลยงเชอทเปนดนโคลนและมชวตอยไดนานหากมปรมาณน าในดนสง (Chen et al.,2003)

และการศกษาในตอนเหนอของประเทศออสเตรเลย พบวามหลายปจจยทมผลตอการเพาะแยกเชอ

จากดนเชน ลกษณะของดน พนททอยใกลลาธาร และพนททมการเลยงสตว (Kaestli et al., 2009)

ในชวงป พ.ศ. 2553 ทพบมาลายปวยตายเปนชวงทสวนสตวมการปรบปรงพนทเพอสรางคอกใหม

จงมการขดหนาดน (ขอมลจากการสมภาษณ) ซงอาจเพมโอกาสททาใหสตวสมผสกบเชอไดมากขน

เชนเดยวกบการพบการระบาดของโรคเมลออยโดสสในคนแบบ cluster case ในแถบตะวนตกของ

ประเทศออสเตรเลย ในพนททมงานกอสราง โดยมการขดหนาดนเพอสรางบานดน วางสายเคเบล

และทอประปาใตดน (Inglis et al., 1999) จากขอมลในการศกษาครงนแสดงใหเหนวาพนท

บางสวนของสวนสตวสงขลามการปนเปอนเชอ B. pseudomallei ดงนนควรหลกเลยงการเลยงสตว

ในพนทเสยงดงกลาว รวมทงเฝาระวงไมใหมการกระจายของเชอในบรเวณดงกลาวสพนทอนๆ

ของสวนสตวสงขลาตอไป

จากการสมภาษณพบวาการระบาดของโรคเมลออยโดสสในสวนสตวสงขลาเรมตนในป

พ.ศ. 2550 อฐทนาเขามาจากประเทศออสเตรเลยตงแตป พ.ศ. 2540 ปวยตายเปนตวแรก ตอมาในป

พ.ศ. 2552 อรงอตง 3 ตวปวยตายดวยโรคเมลออยโดสสเชนกน อรงอตงทงสามตวตายในเดอน

พฤษภาคม 1 ตวและตายในเดอนพฤศจกายน 2 ตว โดยทงหมดแสดงอาการระบบทางเดนหายใจ

จากนนในเดอนมถนายนป พ.ศ. 2553 พบมาลายปวยตายดวยโรคเดยวกน จากประวตการรกษา

พบวา มาลายทปวยตายมแผลทขาจากการถกเตะในเดอนมถนายน พ.ศ. 2552 หนงปถดมาจงแสดง

อาการปวย มน ามก หายใจลาบากเปนเวลา 1 สปดาหจงตาย มความเปนไดทมาลายอาจไดรบเชอเขา

สบาดแผลเมอเวลาผานไปจงแสดงอาการเพราะระยะฟกตวตวของโรคนไมแนนอนและมเวลา

45

ยาวนานเปนปได แตการตายของมาลายอาจเกดจากการทมาลายไดรบเชอ B. pseudomallei เขาส

รางกายผานการตดตอทางการกนหรอการหายใจภายหลงไดเชนกน นอกจากนคอกทมาลายอาศยอย

เปนคอกทมพนทเชอมตอกบคอกทอฐปวยตายเคยอย ในป พ.ศ. 2554 พบชะนมอดาปวยตาย 1 ตว

ในเดอนพฤศจกายนและเดอนธนวาคมพบอรงอตงตายเพมอก 1 ตว จากขอมลทไดพบวาสวนสตว

สงขลามการระบาดของโรคเมลออยโดสสอยางตอเนองในชวง 5 ปทผานมาในสตวหลายชนดทงท

อาศยอยรวมในคอกเดยวกน และทอาศยในคอกทหางกน มความเปนไดทสตวปวยเหลานไดรบเชอ

B. pseudomallei มาจากสงแวดลอมภายในสวนสตวหรอไดรบจากสตวปวยทแพรเชอ แตขอจากด

ของการศกษาครงนคอ เชอ B. pseudomallei ทนามาศกษาจากสตวปวยตายมเพยง 2 isolates จากมา

ลายและอรงอตงทปวยตายตวลาสด ทาใหไมสามารถวเคราะหลาดบนวคลโอไทดของเชอ

B. pseudomallei ทงหมดททาใหเกดการระบาดในสวนสตวสงขลาได โดยเฉพาะจากอฐทนาเขามา

จากออสเตรเลยทเปนอกพนทหนงทมโรคนเปนโรคประจาถน

ผลการวเคราะหนวคลโอไทดของเชอทเพาะแยกไดจากดนกบเชอทเพาะแยกไดจากสตว

ปวยตายพบวาม ST คนละแบบกน (ST 54, ST 290, ST 369) จากการศกษาของ McCombies ในป

ค.ศ.2006 พบวาเชอ B. pseudomallei ทเพาะแยกไดจากพนทภาคใตของประเทศไทยม ST ท

คอนขางหลากหลาย ST 54 ทเพาะแยกไดจากอรงอตงเปน ST ทมรายงานในฐานขอมลวาพบจาก

คนและสงแวดลอมในประเทศไทยซงพบ ST 54 ไดบอยในพนทภาคอสาน (Vesaratchavest et al.,

2006) นอกจากนยงมรายงานการพบ ST นในประเทศมาเลเซยดวย (McCombie et al., 2006) ST 290

ทพบในมาลายจากฐานขอมลพบวามการแยกเชอไดจากทงในคนและสงแวดลอมในไทยเชนกนแต

มการรายงานในฐานขอมลนอยกวา ST 54 สวน ST 369 ทไดจากตวอยางดนในสวนสตวสงขลา

เมอเปรยบเทยบกบขอมลในฐานขอมลพบวาเปน ST เดยวกนกบเชอทเพาะแยกไดจากสงแวดลอมท

เคยสารวจในพนทภาคใต ของไทย เชนในจงหวดพทลง และสงขลา ในป ค.ศ. 1965 (McCombie

et al., 2006)

เชอทเพาะแยกไดจากมาลาย (ST 290) กบเชอทแยกไดจากดนในคอกเดยวกน (ST 369)

นนมความใกลชดกนมากกวาเชอทเพาะแยกไดจากอรงอตง (ST 54) แตการเกบตวอยางดนมาเพาะ

แยกเชอมระยะเวลาหางจากทมาลายปวยตายนานกวา 2 ป จงมโอกาสทเมอเวลาผานไปเชออาจม

การเปลยนแปลงลาดบนวคลโอไทดไปได แตจากการศกษาพบวาเชอ B. pseudomallei มคา

population recombination rate คอนขางตา (Pe´rez-Losada, 2006) ดงนนเชอ B. pseudomallei ทเพาะ

แยกไดจากดนในคอกและจากมาลายทปวยตายไมนาจะสมพนธกน

46

เมอทาการเปรยบเทยบ ST ของเชอทแยกไดจากสวนสตวสงขลากบขอมล ST ทมอยใน

ฐานขอมล พบวา ST ของเชอทเพาะแยกจากสตวปวยตายและจากดนในสวนสตวมรปแบบเดยวกน

กบ ST ของเชอ B. pseudomallei ทเพาะแยกไดในประเทศไทย และจากการศกษาเปรยบเทยบ

รปแบบ ST ของเชอ B. pseudomallei ทเพาะแยกไดจากประเทศไทยและออสเตรเลยพบวาม

รปแบบของ ST ทแตกตางกน (Vesaratchavest et al., 2006) แสดงใหเหนวาการเกดโรคในสตว

นาเขามความเปนไปไดสงวาเปนการตดเชอภายหลงจากทสตวเขามาอยในประเทศไทยหรออย

ภายในสวนสตวแลว

47

สรปและขอเสนอแนะ

สรป

1. ผลการศกษาพบวา ความชกของโรคเมลออยโดสสในสตวในสวนสตวสงขลาคดเปน

รอยละ 1.53 แสดงวาสตวในสวนสตวมโอกาสสมผสกบเชอ B. pseudomallei ไดจากสงแวดลอม

เชนเดยวกบการตรวจเจอความชกในผปฏบตงานสมผสสตวคดเปนรอยละ 1.07 ซงอาจสมผสเชอ

จากสงแวดลอมทปฏบตงานจงควรมการเพมมาตรการในการปองกนโรคใหบคลากร เชน สวมถง

มอหรอรองเทาบททกครงทปฏบตงานโดยเฉพาะคนกลมเสยงทปวยดวยโรคเบาหวาน โรคไต

โรคธาลสซเมย ควรระมดระวงในการสมผสสงคดหลงจากสตวและหลกเลยงการสมผสดนและน า

เปนเวลานาน

2. การเพาะแยกเชอ B. pseudomallei ในดนของสวนสตว เมอนามาเปรยบเทยบลาดบ

นวคลโอไทดพบวารปแบบของ ST ตางจากเชอทแยกไดจากสตวปวยตาย แตมความใกลเคยงกนกบ

สตวทเคยปวยตายในบรเวณนน

3. เชอ B. pseudomallei ทเพาะแยกไดทงจากสตวทปวยตายและจากดนของสวนสตว

สงขลาเปนเชอทมรปแบบของ ST เหมอนกบ ST ของเชอในฐานขอมลทเพาะแยกไดจากผปวยและ

สงแวดลอมในประเทศไทย

48

ขอเสนอแนะ

1. การศกษาครงนไมไดทาการสารวจเชอ B. pseudomallei ในแหลงน าของสวนสตว ซงเปน

สงแวดลอมทเชอสามารถเจรญเตบโตได จงควรมการสารวจเพมเตมในแหลงน า ทงแหลงน าตาม

ธรรมชาต และน าทนามาใชในสวนสตว เพอความครอบคลมในการสารวจและมแผนการสารวจ

เชอ B. pseudomallei ประจาปหรอสารวจตามฤดกาลและขยายพนทในการสารวจสงแวดลอมใน

สวนสตวใหกวางขน เพอหาพนททเปนจดเสยงตอการสมผสเชอและนาขอมลทไดมาประยกตเปน

แนวทางการปองกนการตดเชอและปองกนโรคไมใหเกดการระบาดตอไป

2. สวนสตวสงขลาควรวางมาตรการในการเฝาระวงการตดเชอ B. pseudomallei ทงใน

สตวและในผปฏบตงานในสวนสตวเปนระยะอยางตอเนอง รวมกบการสารวจการปนเปอนของเชอ

ในดนในพนทเสยงเพอการปองกนการกระจายของเชอในพนทอนๆ ของสวนสตว

3. การนาสตวชนดใหมเขามาในสวนสตวอาจจาเปนตองมการตรวจการตดเชอ

B. pseudomallei กอนการนาเขามาเลยง โดยเฉพาะสตวทมโอกาสเปนพาหะของการตดเชอ

แบคทเรยชนดน

4. ในกรณทมสตวปวยตายในสวนสตว ควรพจารณาการชนสตรซากและทาการเพาะแยก

เชอเพอตรวจยนยนการตดเชอ B. pseudomallei ในทกกรณ

5. ใหความรเกยวกบโรคเมลออยโดสสและการปองกนแกบคลากร เพอใหบคลากรมความ

ตระหนกถงอนตรายของโรคและระมดระวงเมอปฏบตงานสมผสกบสตว หรอสงคดหลงของสตว

มการกาจดสงคดหลงเชน หนอง เสมหะ เลอด หรอซากสตว อยางเหมาะสมโดยใชยาฆาเชอทม

ประสทธภาพสามารถทาลายเชอ B. pseudomallei ไดเพอปองกนไมใหเชอแพรกระจายสสงแวดลอม

49

เอกสารและสงอางอง

ฐตมา ไชยทา, ณฐชมล ปทมวน, เพลนพศ หานนท, อรญญา คงถาวร, วเศษ นามวาท, สรรเพชญ

องกตตระกล และฑฆมพร กยยกานนท. 2549. ผลการประเมนสารเคมในหลอดทดลองท

ตานตอเชอ Burkholderia pseudomallei ซงแยกไดจากผปวย. ศรนครนทรเวชสาร 21(4):

289-292.

พรทพย ชเมฆ และอรรถพร จนพนธ. 2555. การศกษาทางซรมวทยาของโรคบรเซลโลสสและเมลออย

โดสสในแพะทเลยงในภาคใตของประเทศไทย, น. 329-338. ใน เรองเตมการประชมทาง

วชาการของมหาวทยาลยเกษตรศาสตร ครงท 50 (สาขาสตว, สาขาสตวแพทยศาสตร,

สาขาประมง) มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

พฒนพงษ โลหะอนกลและมนส แตงออน. 2547. รายงานสตวปวย เมลออยโดซสในแพะทจงหวด

พษณโลก ขาวสขภาพสตวภาคเหนอ ศนยวจยและพฒนาการสตวแพทยภาคเหนอ

(ตอนบน) 12 (2).

แหลงทมา: http://www.dld.go.th/vrd_np/journal/2547/NRVDCApril2004.pdf, 14 ตลาคม

2555.

เพลนจนทร เชษฐโชตศกด. 2547. การจาแนกชนดของโรคเมลออยโดสส. น. 31-38. ใน

เพลนจนทร เชษฐโชตศกด. โรคเมลออยโดสส. บรษทโฮลสตกพบลสชง จากด.

กรงเทพฯ

สานกระบาดวทยา กรมควบคมโรค. 2552. สรปรายงานการเฝาระวงโรคประจาป 2552.

แหลงทมา: http://www.boe.moph.go.th/Annual/Annual%202552/Main.html, 18 มกราคม

2556.

สานกระ

http://www.boe.moph.go.th/Annual/aesr2553/Open.html

. 2553. สรปรายงานการเฝาระวงโรคประจาป 2553. แหลงทมา:

, 18 มกราคม 2556.

50

สานกระ

http://www.boe.moph.go.th/Annual/AESR2011/index.html

. 2554. สรปรายงานการเฝาระวงโรคประจาป 2554. แหลงทมา:

, 18 มกราคม 2556.

สภาภรณ พวเพมพลศร. 2547. แบคทเรยวทยาของเชอ Burkholderia pseudomallei และการเพาะ

เชอ. น. 23-30. ใน เพลนจนทร เชษฐโชตศกด. โรคเมลออยโดสส. บรษทโฮลสตกพบ

ลสชง จากด. กรงเทพฯ

Achana,V., K. Silpapojakul, W. Thininta and S. Kalnaowakul. 1985. Acute Pseudomonas

pseudomallei pneumonia and septicemia following aspiration of contaminated water: a

case report. Southeast Asian J Trop Med Public Health 16: 500-504.

Appassakij, H., K. R. Silpapojakul, R. Wansit and M. Pornpatkul. 1990. Diagnostic value of the

indirect hemagglutination test for melioidosis in an endemic area. Am J Trop Med Hyg

42: 248-253

Ashdown. L. R. and R. W. Guard. 1984. The prevalence of human melioidosis in northern

Queensland. Am J Trop Med Hyg 33: 474-478.

Biegeleison, J.Z., R. M. Mosquera and W. B. Cherry. 1964. A case of human melioidosis:

clinical, epidemiological and laboratory findings. Am J Trop Med Hyg 13: 89-99.

Brett, P. J., D. DeShazer and D. E. Woods. 1998. Burkholderia thailandensis sp. nov., a

Burkholderia pseudomallei-like species. International Journal of Systematic

Bacteriology 48: 317-320

Chen, Y. S., S. C. Chen, C. M. Kao and Y. L. Chen. 2003. Effects of soil pH, temperature and

water content on the growth of Burkholderia pseudomallei. Folia Microbiol 48: 253-

256.

51

Chenthamarakshan, V., J. Vadivelu and S. D. Puthucheary. 2001. Detection of immunoglobulins

M and G using culture filtrate antigen of Burkholderia pseudomallei. Diagnostic

Microbiology and Infectious Disease 39: 1-7.

Choy, J. L., M. Mayo, A. Janmaat and B. J. Currie. 2000. Animal melioidosis in Australia. Acta

Tropica 74: 153-158

Currie, B. J. and S. P. Jacups. 2003. Intensity of rainfall and severity of melioidosis, Australia.

Emerg Infect Dis 9: 1538-1542.

สานกระ

., M. Mayo, N. M. Anstey, P. Donohoe, A. Haase and D. J. Kemp. 2001. A cluster of

melioidosis case from an endemic region is clonal and is linked to the water supply using

molecular typing of Burkholderia pseudomallei isolate. Am. J. Trop. Med. Hyg 65:

177-179.

สานกระ

., S. P. Jacups, A. C. Cheng, D. A. Fisher, N. M. Anstey, S. E. Huffam and V. L. Krause.

2004. Melioidosis epidemiology and risk factors from a prospective whole-population

study in northern Australia. Trop Med Int Health 9: 1167-1174.

Dance, D. A. B. 1991. Melioidosis: the tip of the iceberg?. Clin. Microbiol. Rev 4:52-60.

Dance, D. A, C. King, H. Aucken, C. D. Knott, P. G. West and T. L. Pitt. 1992. An outbreak of

melioidosis in imported primates in Britain. Vet Rec 13: 525-529.

Egan, A. M. and D. L. Gordon. 1996. Burkholderia pseudomallei activates complement and is

ingested but not killed by polymorphonuclear leukocytes. Infect Immun 64: 4952-4959.

Ereno, I. L., N. Mariano, J. Reyes and C. Amando. 2002. Melioidosis: A case report. Phil J

Microbiol Infect Dis 31: 125-133

52

Eugene, A., A. M. Allworth, C. Engler, I. Bastian and A. C. Cheng. 2005. Melioidosis in

Tsunami survivors. Emerg Infect Dis 11 (10): 1638-1639.

Finkelstein, R.A., P. Atthasampunna and M. Chulasamaya. 2000. Pseudomonas (Burkholderia)

pseudomallei in Thailand, 1964-1967: Geographic distribution of organism, attempts to

identify cases of active infection, and presence of antibody in representative sera. Am. J.

Trop. Med. Hyg 62: 232-239.

Gilmore, G., J. Barnes, N. Ketheesan and R. Norton. 2007. Use of antigens derived from

Burkholderia pseudomallei, B. thailandensis and B. cepacia in the indirect

hemagglutination assay for melioidosis. Clini vaccine immunol 14 (11): 1529-1531

Glass, M. B., A. G. Steigerwalt, J. G. Jordan, P. P. Wilkins and J. E. Gee. 2006. Burkholderia

oklahomensis sp. nov., a Burkholderia pseudomallei-like species formerly known as the

Oklahoma strain of Pseudomonas pseudomallei. International Journal of Systematic

and Evolutionary Microbiology 56: 2171-2176. Godoy, D., G. Randle, A. J. Simpson, D. M. Aanensen, T. L. Pitt, R. Kinoshita and B. G. Spratt.

2003. Multilocus sequence typing and evolutionary relationships among the causative

agents of melioidosis and glanders, Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei.

J. Clin. Microbial. 41 (5): 2068-2079

Harris, P. N. A., N. Ketheesan, L. Owens and R. E. Norton. 2009. Clinical features that affect

indirect hemagglutination assay responses to Burkholderia pseudomallei. Clini vaccine

immunol 16 (6): 924-930

Heng, B. H., K. T. Goh, E. H. Yap, H. Loh, M. Yeo. 1998. Epidemiological surveillance of

melioidosis in Singapore. Ann Acad Med Singapore 27: 478-84.

53

Heyse, A. M., J. Dierick, H. Vanhouteghem, F. Ameye, D. Baert, P. Burvenich and G. Wauters.

2003. A case of imported melioidosis presenting as prostatitis. Infection 31: 60-62.

Hicks, C. L., R. Kinoshita and P. W. Ladds. 2000. Pathology of melioidosis in captive marine

mammals. Aust. Vet. J. 78: 193-195.

Howe, C., A. Sampath and M. Spotnitz. 1971. The Pseudomallei group: a review. J Infect Dis

124: 598-607.

Inglis, T. J., N. F. Foster, D. Gal, K. Powell, M. Mayo, R. Norton and B. J. Currie. 2004.

Preliminary report on the northern Australian melioidosis environmental surveillance

project. Epidemiol Infect 132: 813-820

สานกระ

., S. C. Garrow, C. Adams, M. Henderson, M. Mayo and B. J. Currie. 1999. Acute

melioidosis outbreak in western Australia. Epidemiol Infect 123: 437-443.

Kaestli, M., M. Mayo, G. Harrington, L. Ward, F. Watt, J. V. Hill, A. C. Cheng and B. J. Currie.

2009. Landscape changes influence the occurrence of the melioidosis bacterium

Burkholderia pseudomallei in soil in northern Australia. PLoS Negl Trop Dis 3: e364.

Kanaphun, P., N. Thirawattanasuk, Y. Suputtamongkol, P. Naigowit, D. A. B. Dance, M. D.

Smith and N. J. White. 1993. Serology and carriage of Pseudomonas pseudomallei: a

prospective study in 1,000 hospitalized children in northeast Thailand. J. Infect. Dis

167: 230-233.

Kespichayawattana, W., S. Rattanachetkul, T. Wanun, P. Utaisincharoen and S. Sirisinha. 2000.

Burkholderia pseudomallei induces cell fusion and actin associated membrane

protrusion: a possible mechanism for cell-to-cell spreading. Infect Immun 68: 5377-84.

54

Ketterer, P. J., W. R. Shield, R. J. Authur, P. J. Blackall and A. D. Thomas. 1986. Melioidosis is

intensive piggeries in south eastern Queensland. Australian Veterinary Journal 63(5):

146-149.

Limmathurotsakul, D., S. Thammasart, N. Warrasuth, P. Thapanagulsak, A. Jatapai, V.

Pengreungrojanachai, S. Anun, W. Joraka, P. Thongkamkoon, P. Saiyen, S.

Wongratanacheewin, N. P. J. Day and S. J. Peacock. 2012. Melioidosis in animals,

Thailand, 2006-2010. Emerg Infect Dis 18: 325-327.

สานกระ

Available Source:

., W. Chaowagul, W. Chierakul, K. Stepniewska, B. Maharjan, V. Wuthiekanun, N. J.

White, N. P. J. Day and S. J. Peacock. 2006. Risk factors for recurrent melioidosis in

northeast Thailand. CID 43: 979-986.

http://cid.oxfordjournals.org/content/43/8/979.full.pdf+html,

December 24, 2012.

Maiden, M. C. J., J. A. Bygraves, E. Feil, G. Morelli, J. E. Russell, R. Urwin, Q. Zhang, J. Zhou,

K. Zurth, D. A. Caugant, I. M. Feavers, M. Achtman and B. G. Spratt. 1998. Multilocus

sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of

pathogenic microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci 95: 3140-3145.

Marolda, C., B. Hauroder, M. J. R. Michel and M. Valvano. 1999. Intracellular survival and

saprophytic growth of isolates from the Burkholderia cepacia complex in free-living

amoebae. Microbiology 145: 1509-1517. McCombie, R. L., R. A. Finkelstein and D. E. Woods. 2006. Multilocus sequence typing of

historical Burkholderia pseudomallei isolates collected in southeast Asia from 1964 to

1967 provides insight into the epidemiology of melioidosis. J. Clin. Microbiol. 44:

2951–2962

55

McCormick, J. B., R. E. Weaver, P. S. Hayes, J. M. Boyce and R. A. Feldman. 1977. Wound

infection by an indigenous Pseudomonas pseudomallei-like organism isolated from the

soil: case report and epidemiologic study. J Infect Dis 135: 103-107.

Mekaprateep, M., P. Tharavichitkul and L. Srikitjakarn. 2010. Application of a non-species

dependent ELISA for the detection of antibodies in sera of Burkholderia pseudomallei-

immunized goats. Journal of Microbiological Methods 83: 266–269

Merianos, A., M. Petal, J. M. Lane, C. Noonan, D. Sharrock and P. A. Mork. 1993. The 1990-

1991 outbreak of melioidosis in northern territory of Australia:epidemiology and

environmental studies. South Asian J Trop Med Hyg 24: 425-435.

Meumann, E. M., R.T. Novak, D. Gal, M. E. Kaestli, M. Mayo, J. P. Hanson, E. Spencer, M. B.

Glass, J. E. Gee, P. P. Wilkins and B. J. Currie. 2006. Clinical evaluation of a type III

secretion system real-time PCR assay for diagnosing melioidosis. J. Clin. Microbiol.

44: 3028-3030.

Millan, J. M., M. Mayo, D. Gal, A. Janmaat and B. J. Currie. 2007. Clinical variation in

melioidosis in pigs with clonal infection following possible environmental contamination

from bore water. The Veterinary Journal 174: 200-202.

Mollaret, H. H.. 1988. L'affaire du Jardin des plantes ou comment le mélioïdose fit son

apparition en France. Médecine et Maladies Infectieuses 18: 643-54.

Parry, C. M., V. Wuthiekanun, N. T. T. Hoa, T. S. Diep, L. T. T. Thao, P. V. Loc, B. A. Wills, J.

Wain, T. T. Hien, N. J. White and J. J. Farrar. 1999. Melioidosis in southern Vietnam:

Clinical surveillance and environmental sampling. CID 29: 1323-1326

Available Source: http://cid.oxfordjournals.org/content/29/5/1323.full.pdf+html,

December 20, 2012.

56

Pe´rez-Losada, M., E. B. Browne, A. Madsen, T. Wirth, R. P. Viscidi and K.A.Crandall. 2006.

Population genetics of microbial pathogens estimated from multilocus sequence typing

(MLST) data. Infection, Genetics and Evolution 6: 97-112

Petkanjanapong,V., P. Naigowit, E. Kondo and K. Kanai. 1992. Use of endotoxin antigens in

enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of P. pseudomallei infections

(melioidosis). Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology 10: 145-150

Puthucheary, S. D. 2009. Melioidosis in Malaysia. Med J Malaysia 64: 266-274

Puapermpoonsiri, S., P. Puapermpoonsiri, K. Bhuripanyo, C. Vilachai and A. Auncharoen.

1986. Indirect hemagglutination antibody titer to Pseudomonas pseudomallei in patients

with melioidosis. pp.193-196. In: Proceedings of National Workshop on melioidosis.

Bangkok Medical Publisher. Bangkok

Reckseidler, S. L., D. DeShazer, P. A. Sokol and D. E. Woods. 2001. Detection of bacterial

virulence genes by subtractive hybridization: identification of capsular polysaccharide of

Burkholderia pseudomallei as a major virulence determinant. Infect Immun 69: 34-44.

Sawasdidoln, C., S. Taweechaisupapong, R. W. Sermswan, U. Tattawasart, S. Tungpradabkul and

S. Wongratanacheewin. 2010. Growing Burkholderia pseudomallei in biofilm

stimulating conditions significantly induces antimicrobial resistance. PLoS ONE

/www.plosone.org 5: e9196 Available Source:

http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0009196,

December 18, 2012.

Sirisinha, S., N. Anuntagool and T. Dharakul. 2000. Recent developments in laboratory

diagnosis of melioidosis. Acta Trop 74: 23545.

57

Smith, M. D., V. Wuthiekanun, A. L. Walsh and T. L. Pitt. 1993. Latex agglutination test for

identification of Pseudomonas pseudomallei. J. Clin. Pathol. 46: 374-375.

Sprague, L. D. and H. Neubauer. 2004. Minireview Melioidosis in animals: A review on

epizootiology, diagnosis and clinical presentation. J. Vet. Med 51: 305-320.

Srikawkheaw, N. and O. Lawhavinit. 2008. The study of the detection of IgG antibody against

Burkhoderia pseudomallie by ELISA and indirect haemaglutination test (IHA). pp. 375-

382. In Proceedings of 46th Kasetsart University Annual Conference(Animals and

Veterinary Medicine). Kasetsart University, Bangkok

Stanton, A.T.and W. Fletcher. 1921. Melioidosis, a new disease of the tropics. Trans. 4th

Congress Far East Assc. Trop. Med. 2:196-198.

Strauss, J. M., M. G. Groves, M. Mariappan and D. W. Ellison. 1969. Melioidosis in Malaysia:

II Distribution of Pseudomonas pseudomallei in soil and surface water. Am J Trop Med

Hyg 18: 698-702.

Suputtamongkol, Y., A. J. Hall, D. A. Dance, W. Chaowagul, A. Rajchanuvong and M. D. Smith.

1994. The epidemiology of melioidosis in Ubon Rachatani, northeastern Thailand. Inter

J Epidemiol 23: 1082-1090.

สานกระ

http://cid.oxfordjournals.org/content/29/2/408.full.pdf+html

., W. Chaowagul, P. Chetchotisakd, N. Lertpatanasuwun, S. Intaranongpai, T.

Ruchutrakool, D. Budhsarawong, P. Mootsikapun,V. Wuthiekanun, N. Teerawatasook

and A. Lulitanond. 1999. Risk factors for melioidosis and bacteremic melioidosis. CID

29: 408-13. Available Source:

, December 6, 2012

58

The Center for Food Security and Public Health, Iowa State University. 2007. Melioidosis.

Available Source http://www.ivis.org/advances/Disease_Factsheets/melioidosis.pdf ,

October 6, 2012

Thomas A. D., J. C. Forbes-Faulkner, J. H. Norton and K. F. Trueman. 1988. Clinical and

pathological observation on goats experimentally infected with Pseudomonas

pseudomallei. Australian Veterinary Journal 65: 43-46.

Timothy, J., J. Inglis and J. L. Sagripanti. 2006. Minireview Environmental factors that affect

the survival and persistence of Burkholderia pseudomallei. Appl Environ Microbiol

72: 6865-6875

Tong, J. L., W. A. Li, J. Lyn and K. T. Goh. 2009. Melioidosis in a tropical city state, Singapore.

Emerg. Infect. Dis. 15: 1645-1647. Available Source:

http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/15/10/pdfs/09-0246.pdf, December 4, 2012.

Tong, S., S. Yang, Z. Lu and W. He. 1996. Laboratory investigation of ecological factors

influencing the environmental presence of Burkholderia pseudomallei. Microbiol

Immunol 40: 451-453.

Urwin, R. and M. C. J. Maiden. 2003. Multi-locus sequence typing: a tool for global

epidemiology. Trends Microbiol 11: 479-487.

Vesaratchavest, M., S. Tumapa, N. P. J. Day, V. Wuthiekanun, W. Chierakul, M. T. G. Holden,

N. J. White, B. J. Currie, B. G. Spratt, E. J. Feil and S. J. Peacock. 2006. Nonrandom

distribution of Burkholderia pseudomallei clones in relation to geographical location and

virulence. J. Clin. Microbiol. 44: 2553-2557.

59

Vuddhakul, V., P. Tharavichitkul, N. Na-ngam, S. Jitsurong, B. Kunthawa, P. Noimay, P.

Noimay, A. Binla and V.Thamlikitkul. 1999. Epidemiology of Burkholderia

pseudomallei in Thailand. Am. J. Trop. Med. Hyg 60: 458-461.

Wadowsky, R. M., T. M. Wilson, N. J. Kapp, A. J. West, J. M. Kuchta, S. J. States, J. N. Dowling

and R. B. Yee. 1991. Multiplication of Legionella spp. in tap water containing

Hartmannella vermiformis. Appl Environ Microbiol 57: 1950-1955.

Whitmore, A. 1913. An account of a glanders-like disease occurring Rangoon. J Hyg 13: 1-34

Wongratanacheewin, S., R. W. Sermswan, N. Anuntagool and S. Sirisinha. 2001. Retrospective

study on the diagnostic value of IgG ELISA, Dot immunoassay and indirect

hemagglutination in septicemic melioidosis. Asian Pacific Journal of Allergy and

immunology 19: 129-133.

Worthington, M. G. and D. W. McEniry. 1990. Chronic melioidosis in a Vietnamese immigrant.

Rev. Infect. Dis 12: 966.

Wuthiekanun, V., M. D. Smith, D. A. B. Dance and N. J. White. 1995a. Isolation of

Pseudomonas pseudomallei from soil in north-eastern Thailand. Transacions of the

Royal Society of Tropical Medicine and Hygine 89: 41-43

สานกระ., สานกระ

. and N. J. White. 1995b. Survival of Burkholderia pseudomallei in the

absence of nutrients. Transcation of the Royal Society of Tropical Medicine and

Hygiene 89: 491

สานกระ., สานกระ

., D. A. B. Dance, A. L. Walsh, T.L. Pitt and N. J. White. 1996. Biochemical

characteristics of clinical and environmental isolates of Burkholderia pseudomallei. J

Med Microbiol 45: 408-412.

60

Yabuuchi, E., Y. Kosako, H. Oyaizu, I. Yano, H. Hotta, Y. Hashimoto, T. Ezaki and M. Arakawa.

1992. Proposal of Burkholderia gen. nov. and transfer of seven species of the genus

Pseudomonas homology group 11 to the new genus with the type species Burkholderia

cepacia (Palleroni and Holmes 1981) comb. nov. Microbiol Immunol 36: 1251-1275.

Yang, S., S. Tong, C. Mo, Z. Jiang, Y. Ma and Z. Lu. 1998. Prevalence of human melioidosis on

Hainan Island in China. Microbiol Immunol 42: 651–654.

61

ภาคผนวก

62

ภาคผนวก ก

ภาพโคโลนของเชอ B. pseudomallei และสตวปวยตายดวยโรคเมลออยโดสส

63

63

ภาพผนวกท ก1 โคโลนของเชอ B. pseudomallei ในอาหารเลยงเชอ blood agar

ภาพผนวกท ก2 ลกษณะการขดหลมในการเกบตวอยางดน

64

ภาพผนวกท ก3 โคโลนของเชอ B. pseudomallei ใน Ashdown’s agar

ภาพผนวกท ก4 อรงอตงทปวยตายดวยโรคเมลออยโดสส

65

ภาพผนวกท ก5 ไตอรงอตงทปวยตาย มขนาดใหญกวาปกต และมหนองแทรก

ภาพผนวกท ก6 มามอรงอตงทปวยตาย มหนองแทรกกระจายอยทวไป

66

ภาคผนวก ข

อาหารเลยงเชอ ทใชแยกเชอ B. pseudomallei จากดน

67

อาหารเลยงเชอ ทใชแยกเชอ B. pseudomallei จากดน

อาหารเลยงเชอ Ashdown’s agar

สวนประกอบของอาหารเลยงเชอ Ashdown’s agar

Tryptic soy broth 10 g.

Agar powder 15 g.

Glycerol 40 ml

1% neutral red 5 ml

0.1% crytal violet * 5 ml

Distilled water 950 ml

Gentamycin (40 mg/ml)

หมายเหต * บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส 1 สปดาห กอนนาไปใช

ผสมสวนประกอบทงหมดใหเขากน แลวนาไปเขา autoclave ท 121 oC นาน 15 นาท จงแช

ใน water bath ใหอณหภมลดลงเปน 45 oC แลวคอยเตม gentamycin เขยาใหเขากนกอนนาไปเทใน

จานเพาะเชอ

อาหารเลยงเชอThreonine-basal-salt solution broth plus colistin (50 mg/liter) (TBSS C-50 broth)

สวนประกอบของ TBSS C-50 broth

KH2PO4 0.451 g

K2HPO4 1.730 g

MgSO27H2O 0.123 g

CaCl2 0.0147 g

NaCl 10 g

Nitrilotriacetic acid 0.20 g

Solution A 20 ml

นากลน pH 7.2 900 ml

68

สวนประกอบของ Solution A

85% H3PO4 2.306 ml

FeSO47H2O 0.556 g

ZnSO47H2O 0.297 g

CuSO45H2O 0.218 g

MgSO4H2O 0.125 g

CO(NO3)6H2O 0.030 g

MoO3Na22H2O 0.030 g

H3BO3 0.062 g

นากลน pH 7.2 1000 ml

สวนประกอบของ L-threonine

L-threonine 5 g

นากลน 100 ml

ปรบ pH ครงสดทายเปน 7.2 ดวย 1.0 N KOH นาไปนงฆาเชอดวย autoclave ท 121 oC

นาน 15 นาท ทงใหเยนทอณหภมหองแลวเตม L-threonine 0.05 M เตมยา colistin 50 mg/l เขยาให

เขากน แลวแบงใสหลอดปลอดเชอ หลอดละ 9 ml

69

ภาคผนวก ค

ตารางแสดงขอมล ST ของเชอ B. pseudomallei จากฐานขอมล

ทางอนเตอรเนต www.mlst.net

70

ตารางผนวกท ค 1 ขอมล ST ทมรปแบบเดยวกบเชอ B. pseudomallei ทเพาะแยกไดสวนสตว

สงขลาจากฐานขอมลทางอนเตอรเนต www.mlst.net

Strain ST ace

glt

B

gm

hD

lep

A

lip

A

nar

K ndh

ประเทศ แหลงทมา

1494e 290 3 4 11 3 5 4 1 ไทย คน

STW 415 290 3 4 11 3 5 4 1 ไทย นา

204 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย คน

KK 454 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย คน

956a 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย คน

1882 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย คน

2613 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย คน

2659 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย คน

2660 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย คน

2670 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย คน

E0021 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย สงแวดลอม

E0024 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย สงแวดลอม

E0037 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย สงแวดลอม

E0235 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย สงแวดลอม

E0399 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย สงแวดลอม

E0411 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย สงแวดลอม

E0413 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย สงแวดลอม

Phuket 3 W-1 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย นา

STW 106-1 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย นา

STW 168-3 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย นา

USAMRU

Malaysia 12 54 3 1 3 3 1 2 1

มาเลเซย -

PM 30 54 3 1 3 3 1 2 1 ไทย คน

Phattalung 49

W-1 369 3 1 2 1 5 4 3

ไทย นา

Patalung 51 W 369 3 1 2 1 5 4 3 ไทย นา

STW 114-1 369 3 1 2 1 5 4 3 ไทย นา

STW 175-1 369 3 1 2 1 5 4 3 ไทย นา

71

ประวตการศกษาและการทางาน

ชอ – นามสกล นางสาวอรรถพร จนพนธ

วน เดอน ป ทเกด 13 เมษายน 2524

สถานทเกด อาเภอเมอง จงหวดนครศรธรรมราช

ประวตการศกษา (พ.ศ.2542-2548) สตวแพทยศาสตรบณฑต

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

ตาแหนงหนาทการงานปจจบน นายสตวแพทย ชานาญการ

สถานททางานปจจบน ศนยวจยและพฒนาการสตวแพทย ภาคใต