UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE...
24
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2008 - 2009 Immunologische aspecten van en diagnostische technieken voor zomereczeem bij het paard. Door Sofie MARYNISSEN Promotor: Prof. Dr. Cox Literatuurstudie in het kader van de Masterproef
Transcript of UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE...
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2008 - 2009
Immunologische aspecten van en diagnostische
technieken voor zomereczeem bij het paard.
Door
Sofie MARYNISSEN
Promotor: Prof. Dr. Cox Literatuurstudie in het kader
van de Masterproef
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2008 - 2009
Immunologische aspecten van en diagnostische
technieken voor zomereczeem bij het paard.
Door
Sofie MARYNISSEN
Promotor: Prof. Dr. Cox Literatuurstudie in het kader
van de Masterproef
Woord vooraf
In deze rubriek had ik graag een aantal mensen bedankt die me gesteund hebben bij het schrijven van
deze literatuurstudie.
Vooreerst wil ik Prof. Dr. Cox bedanken als mijn promoter. Hij heeft het op zich genomen om me te
begeleiden in een onderwerp die weinig aanleunt bij zijn eigen onderzoeksonderwerpen, waarvoor
dank. Verder wil ik hem bedanken voor de goede adviezen die hij me gegeven heeft in het afgelopen
jaar.
Daarnaast wil ik ook Prof. Dr. Goddeeris, Prof. Dr. Buys (KUL) en Ir. Peeters (KUL) bedanken
aangezien zij mij de mogelijkheid geven om volgend jaar verder te werken aan hetzelfde onderwerp.
In het bijzonder Ir. Peeters voor het bijkomend nalezen van mijn literatuurstudie en de goede raad.
Ten slotte, maar niet in het minst, wil ik ook mijn ouders, zussen en vriend bedanken voor al de
gegeven steun, niet enkel voor het schrijven van deze literatuurstudie maar in gans mijn studie.
Bedankt!
Auteursrecht
De auteur en de promoter geven de toelating deze literatuurstudie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen hiervan te kopïeren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron
uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende
de gegevens vermeld in deze literatuurstudie berust bij de promotor(en). De auteur en promoter(en)
zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie
geciteerde en beschreven zijn.
Inhoudsopgave
Samenvatting ......................................................................................................................................1
1. Inleiding ................................................................................................................................1
2. Literatuurstudie .....................................................................................................................2
2.1 Zomereczeem = een allergische reactie op bepaalde componenten in het speeksel van
Culicoïdes muggen? ....................................................................................................................2
2.1.1 Culicoïdes muggen .......................................................................................................2
2.1.2. Belang van de speekselallergenen ..............................................................................3
2.2 Immunologische aspecten van zomereczeem ....................................................................4
2.2.1 Type I overgevoeligheidsreactie ..............................................................................4
2.2.2 Type IV overgevoeligheidsreactie ............................................................................7
2.3 Diagnose van zomereczeem ..............................................................................................8
2.3.1 Klinische diagnose ..................................................................................................8
Besluit ...............................................................................................................................9
2.3.2 Immunologische diagnose .......................................................................................9
2.3.2.1 Intradermale huidtest ..........................................................................................9
Besluit ............................................................................................................................. 11
2.3.2.2 Histamine vrijstellings test ................................................................................. 12
Besluit ............................................................................................................................. 12
2.3.2.3 ELISA en RAST ................................................................................................ 13
Besluit ............................................................................................................................. 17
2.4 Discussie ......................................................................................................................... 17
3. Literatuurlijst ....................................................................................................................... 19
1
Samenvatting Zomereczeem bij het paard is een veel voorkomende allergische dermatitis. Desondanks zijn er nog
veel tegenstrijdigheden in de wetenschappelijke kennis erover. Deze tegenstrijdigheden bemoeilijken
het bekomen van een éénduidige diagnosetechniek en behandeling. In de onderstaande
literatuurstudie worden de verscheidende voorhanden diagnostische technieken besproken. Een
onderscheid moet gemaakt tussen diagnose op basis van klinische symptomen en één ondersteund
door diagnostische technieken. Binnen de laatste worden, in onderstaande literatuurstudie, de 4
meest beloftevolle besproken namelijk de intradermale test, de histamine vrijstellingstest, IgE-ELISA
en RAST. De twee eerst vernoemde zijn gebaseerd op de cellulaire immuunrespons, terwijl de overige
twee serologische technieken zijn die allergeenspecifiek IgE trachten op te sporen. Elk van de
technieken wordt geconfronteerd met problemen die voornamelijk het gevolg zijn van een gebrekkige
kennis die zich voordoet op alle vlakken van de aandoening. Er is getracht deze hiaten aan te halen
via het bespreken van verschillende studies die zich bezig houden met deze problematiek.
1. Inleiding
Zomereczeem of Culicoïdes hypersensitiviteit (CHS), ook genoemd “sweet itch”, “summer itch”,
recurrente urticaria, “summer sores” (Frankrijk) “Queensland itch” (Australië) en “Kasen” (Japan), is
een wijdverspreide allergische dermatitis beschreven bij het paard. Een allergische reactie wordt
omschreven als een inflammatoire aandoening waarbij een aberrante Th2-immuunrespons aan de
basis ligt. Zomereczeem is één van de meest frequent voorkomende allergische aandoeningen bij het
paard, met een prevalentie variërend tussen drie procent en tweeënzeventig procent (Van Grevenhof
et al., 2007).
Ondanks het feit dat deze aandoening wereldwijd voorkomt en zware laesies alsook discomfort
veroorzaakt, is er weinig geweten over de pathogenese. Algemeen wordt er uitgegaan van een type I
overgevoeligheidsreactie, al zijn er ook indicaties van een type IV overgevoeligheidsreactie als
oorzaak van zomereczeem (Slauson en Cooper, 2002). Er zijn nog veel hiaten in de
wetenschappelijke kennis van de allergische immuunrespons bij het paard. Ondermeer de rol van het
immunoglobuline G (IgG) is nog onduidelijk, alsook de invloed van omgevingsfactoren op het ontstaan
van de allergie. Omtrent het oorzakelijke agens is er meer eenduidigheid. De overgevoeligheidsreactie
wordt, naar grote waarschijnlijkheid, uitgelokt door speekselallergenen van Culicoïdes muggen. Deze
muggen zijn ubiquitair met de uitzondering dat ze niet voorkomen in IJsland (McGavin en Zachary,
2007; Wilson et al., 2007). De exacte allergenen zijn echter nog niet geïdentificeerd en andere
parasieten, zoals Simulium muggen, kunnen niet volledig uitgesloten worden als oorzakelijk agens.
Daarenboven betreft het hier een multifactorïele aandoening waarbij factoren zoals klimaat,
huisvesting en genetische achtergrond mee een cruciale rol spelen (Van Grevenhof, 2007).
De gebrekkige kennis in de pathogenese resulteert in een moeizaam verlopende diagnose. Voor de
diagnose wordt er momenteel voornamelijk uitgegaan van een klinisch onderzoek. De aandoening
gaat immers gepaard met een pruritus, een intense jeuk van de huid, die leidt tot secundaire
2
schuurletsels. De letsels komen voornamelijk voor ter hoogte van de manen en de staartbasis en
kunnen eventueel uitbreiden naar hoofd en schoftregio. Uitgaan van een klinische inspectie van het
aangetaste paard voor de diagnose is echter verre van perfect! Zomereczeem is een
seizoensgebonden allergie, waardoor aangetaste dieren in de winter klinisch gezond kunnen zijn,
indien de letsels niet te uitgebreid waren. Daarenboven moet er steeds een differentiaal diagnose
gemaakt worden met andere parasitaire of allergische aandoeningen. Enkel en alleen een correcte
diagnose kan leiden tot de meest optimale behandeling (Fadok en Greiner, 1990)!
Omwille van de bovenstaande redenen is er interesse voor onderzoek naar andere diagnostische
technieken. Ondermeer een directe intradermale test, histamine vrijstellingstest, alsook serologische
technieken zoals een Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) zijn ontwikkeld, elk met hun
pluspunten en minpunten. Het doel van deze literatuurstudie is een overzicht te geven van de
verschillende bestaande technieken, hun principes uit te leggen en aan te duiden waarom er
voordelen of nadelen aan verbonden zijn.
2. Literatuurstudie
2.1 Zomereczeem = een allergische reactie op bepaalde componenten in het
speeksel van Culicoïdes muggen?
Zomereczeem wordt gekenmerkt door een IgE-gemedieerde overgevoeligheidsreactie op allergenen
hoogstwaarschijnlijk aanwezig in het speeksel van Culicoïdes-species (Ceratopogonidae).
Overgevoeligheidsreacties worden over het algemeen ingedeeld in 4 types volgens een classificatie
initieel beschreven door Coombs en Gell. Indien uitgegaan wordt van deze indeling kan er gesteld
worden dat zomereczeem behoort tot de type I overgevoeligheidsreacties, al kan een type IV
overgevoeligheidsreactie niet uitgesloten worden. Het classificatieschema van Coombs en Gell moet
bovendien kritisch geïnterpreteerd worden. In een weefsel kunnen immers verschillende types
overgevoeligheidsreacties zich tegelijkertijd afspelen en bijdragen aan de pathogenese van de
aandoening. De 2 aangehaalde overgevoeligheidsreacties worden nader besproken in paragraaf 2.2.
(Slauson en Cooper, 2002).
2.1.1 Culicoïdes muggen
Culicoïdes muggen, ook genoemd no-see-ums of knuds, veroorzaken pijnvolle beten te wijten aan
hun kauwende monddelen, waarbij de vrouwelijke muggen bloed opzuigen van de gastheer
(Robinson, 2002). Indicaties van de rol van Culicoïdes muggen in zomereczeem worden onder meer
teruggevonden in het feit dat de aandoening nog niet beschreven is geweest in IJsland waar de
Culicoïdes species niet voorkomen. Daarnaast wordt er frequent bij het uitvoeren van een
intradermale injectie met Culicoïdes extracten, bij paarden met een huidallergie, een onmiddellijke
huidreactie opgemerkt (McGavin en Zachary, 2007; Wilson et al., 2007).
Studies, uitgevoerd in verschillende landen, geven per land een ander species op als oorzaak van
3
zomereczeem. In Engeland werd er aangetoond dat C. pulicaris aan de basis ligt van zomereczeem,
aangezien populatiepieken van de muggensoort en allergie-opstoten bij paarden tezelfdertijd
opkwamen (Mellor en McCaig, 1974). In Ierland werd er aangetoond dat naast C. pulicaris ook C.
punctatus en C. nubeculosus aan de basis liggen, omdat de laatste twee zich strikt voeden ter hoogte
van de probleemregio‟s in tegenstelling tot C. pulicaris die zich ook op andere lichaamsregio‟s voedt
(Townley et al., 1984). Het valt op te merken dat de species een regiogebonden voorkomen hebben,
wat de diagnose op basis van commerciële insectextracten bemoeilijkt.
De Culicoïdes muggen gedijen in een aquatische tot semi-aquatische biotoop en zijn actief vanaf de
vroege lente (april - mei) tot de nazomer (oktober). In deze periode komen de klinische kenmerken
van zomereczeem ten volle tot uiting gevolgd door een periode van remissie in de winter (Wilson et
al., 2006). De hoogste activiteit vertonen ze op zwoele en vochtige dagen; voor, gedurende en kort na
zonsondergang. Ze voeden zich doorgaans aan de dorsale, doch ook aan de ventrale zijde van de
gastheer. Daarbij bijten ze voornamelijk ter hoogte van de manen en staartbasis en eventueel ook ter
hoogte van de huid van de buik van het paard (Kahn, 2005). Deze letsels zijn niet levensbedreigend
maar geven aanleiding tot extreem discomfort waardoor de paarden vaak niet berijdbaar zijn (Fadok
en Greiner, 1990, Wagner et al., 2006).
2.1.2. Belang van de speekselallergenen
Allergenen, aanwezig in het speeksel van Culicoïdes muggen, krijgen de belangrijkste rol toegedicht,
al mag de input van andere lichaamsallergenen niet onderschat worden (McGavin en Zachary, 2007;
Wilson et al., 2007). De exacte allergenen zijn tot nu toe nog niet geïdentificeerd geweest. Aan de
meeste van de speekselproteïnen heeft men zelfs nog geen functie kunnen toewijzen.
Er zijn slechts enkele studies waarin getracht wordt de allergenen te identificeren. In een recente
studie van 2006 (Hellberg et al.,2006) werd het moleculair gewicht van speekselproteïnen, afkomstig
van C. nubeculosus, die in staat waren te binden aan bepaalde antistoffen nl. immunoglobuline E
(IgE) afkomstig van paarden met CHS, bepaald. Uit deze studie blijkt dat Culicoïdes muggen in hun
speeksel ten minste 10 allergenen hebben die CHS kunnen uitlokken, waarvan de 48, 47, 22, 15 en
13 kDa proteïnen waarschijnlijk de belangrijkste zijn. Het vermoeden dat deze proteïnen een rol
spelen in de pathogenese van CHS wordt beargumenteerd door het feit dat ze de capaciteit hebben
om op IgE te binden (Hellberg et al., 2006). Een andere studie (Wilson et al., 2007) probeert de
verschillende speekselproteïnen te identificeren op basis van 2D-elektroforese en massa
spectrofotometrie. Hierbij kon onder meer het maltase, proteïnen van de D7-familie en kleinere
proteïnen die een rol spelen bij de bloedmaaltijd geïdentificeerd worden. Vervolgens werd ook
nagegaan of er een interactie bestond tussen de aangetoonde eiwitten en IgE aanwezig in serum van
aangetaste dieren. Uit deze studie kon geen significante interactie aangetoond worden tussen de
bekeken speekselproteïnen en een IgE-bindingscapaciteit (Wilson et al., 2007). Verder onderzoek is
vereist om meer inzicht te verkrijgen in pathogenese van zomereczeem. Deze bijkomende kennis kan
bijdragen aan een verbeterde diagnose, behandeling of preventie (Hellberg et al., 2006, Wilson et al.,
2007, Wagner et al., 2008).
4
De aandoening wordt door praktiserende dierenartsen aangetroffen bij nagenoeg alle paardenrassen
en leeftijdsgroepen en bij beide geslachten, al bestaat er een opvallende (genetische?) predispositie
voor IJslanders. Meer dan 50 procent van de IJslanders geëxporteerd naar het Europese continent
ontwikkelen zomereczeem (Marti et al., (2003) vermeld in Wilson et al. (2006)). Des te opvallender is
dat zomereczeem nog niet beschreven is in IJsland zelf, dit ten gevolge van de afwezigheid van
Culicoïdes-species in het geografische gebied, alsook door minder lange blootstelling aan andere
bijtende insecten zoals Simulium. Waarom IJslanders gepredisponeerd zijn voor de ontwikkeling van
CHS na export naar Europa blijft een vraagteken. Naar alle waarschijnlijkheid gaat het om meer dan
alleen een genetische predispositie, ook maternale effecten zouden een rol spelen. Zo wordt er
verondersteld dat IgG‟s, die via het colostrum vanuit het moederdier worden overgedragen naar het
veulen, interfereren met de antigenen en zo de productie van IgG induceren in plaats van IgE in het
veulen (Larsen et al., 1988).
2.2 Immunologische aspecten van zomereczeem
2.2.1 Type I overgevoeligheidsreactie
Een type I overgevoeligheidsreactie veronderstelt een IgE-gemedieerde reactie op „onschadelijke‟
omgevingsallergenen. Immunoglobuline E heeft een belangrijke beschermende functie tegen o.a.
parasieten. Het kan dus echter ook aanleiding geven tot een pathologische reactie. Het is dit type van
overgevoeligheidsreactie die, meest waarschijnlijk, aan de basis ligt van zomereczeem.
Immunoglobuline E komt in een beperkte fractie voor in het serum, het overgrote deel zit stevig
gebonden op Fc-receptoren van mastcellen in de weefsels. Mastcellen, de zogenaamde “sentinel”
cellen, bezitten receptoren die hen toelaten te reageren op binnenkomende stimuli. De meerderheid
van de mastcellen in het lichaam bevinden zich in de huid, het ademhalingsstelsel en het
spijsverteringsstelsel. Opmerkelijk is dat bepaalde subtypes van IgG ook kunnen binden op mastcel
receptoren, doch gebeurt dit met een opvallende lagere affiniteit.
Atopische dieren reageren, in het algemeen, op onschadelijke omgevingsallergenen met een
buitensporige Th2-respons. De, door het allergeen, geactiveerde CD4+Th2-cellen produceren
cytokines (o.a. Interleukines 4, 5, 9 en 13) die op hun beurt allergeenspecifieke B-lymfocyten
activeren. Deze cytokinerespons wordt tegengewerkt vanuit cytokines vrijgesteld door Th1-cellen,
namelijk interferon-γ en Interleukine 12. De geactiveerde B-lymfocyten produceren allergeenspecifieke
IgE‟s die vanuit de bloedbaan in de weefsels terechtkomen (zie fig. 1). De B-lymfocyten blijven IgE‟s
produceren over verschillende jaren, zelfs in afwezigheid van het omgevingsallergeen.
Het Fc-fragment van IgE vertoont een zeer hoge affiniteit voor de FcεR1-receptoren aanwezig op
mastcellen en basofielen. De IgE‟s kunnen binden op de receptor zonder dat zij voorafgaand
gebonden zijn geweest door het allergeen. Dit is in tegenstelling met alle andere immunoglobulines
die eerst een conformatieverandering moeten ondergaan door binding aan het allergeen vooraleer ze
kunnen binden op de receptor. De binding van het Fc-fragment van IgE op de FcεR1-receptor is,
omwille van de hoge affiniteit, nagenoeg irreversibel. Hierdoor zijn mastcellen quasi altijd bedekt met
5
IgE. Het FAB-fragment van de gebonden IgE‟s wijst weg van de mastcellen en kan intrageren met een
allergeen. Dit proces wordt sensibilisatie genoemd.
Fig. 1: Schematische voorstelling van de onderlinge interacties van cytokines tijdens het verloop van een Th2-
respons (uit Tizard en Richard, 2008).
De gesensibiliseerde mastcellen veroorzaken in afwezigheid van het allergeen geen reacties
waardoor symptomen van allergie gedurende jaren afwezig kunnen blijven. Wanneer er een nieuwe
blootstelling is aan hetzelfde (!) allergeen kan er een kruisgebondenheid tussen twee
mastcelgebonden IgE moleculen ontstaan. Dit veroorzaakt een “crosslinking” van de twee
respectievelijke FcεR1 receptoren wat leidt tot een degranulatiesignaal in de mastcellen. Bij deze
degranulatie komen tal van opgeslagen vaso-actieve amines, cytokines en enzymes vrij. De vaso-
actieve amines, zoals histamine en serotonine, veroorzaken een vasodilatatie in het weefsel. De
vrijgestelde cytokines (o.a. Interleukine 4, 5, 13 en tumor necrosis factor-α) hebben enerzijds een pro-
inflammatoir effect, anderzijds bevorderen ze de Th2-respons. Er ontstaat een “allergie-loop” (zie fig.
2). Naast de degranulatie leidt de “crosslinking” ook tot een inductie van de synthese van bepaalde
pro-inflammatoire stoffen o.a. leukotriënen, prostaglandines en cytokines. Dit alles leidt tot een
karakteristieke allergische reactie die ook gezien wordt bij zomereczeem.
Binnen deze overgevoeligheidsreactie zijn er twee fasen te onderkennen. Een eerste acute fase geeft
een inflammatoire respons binnen de 20 minuten na blootstelling aan het allergeen. Deze respons
wordt gekenmerkt door verhoogde vasculaire permeabiliteit, contractie van de gladde spiervezels en
influx van ontstekingscellen. De tweede late fase komt pas verschillende uren later tot uiting. Deze
fase is, naar alle waarschijnlijkheid, het gevolg van pro-inflammatoire stoffen vrijgesteld uit
eosinofielen en neutrofielen alsook van de opgelopen weefselschade. De eosinofielen en neutrofielen
worden door chemotactische factoren, vrijgesteld door de mastcellen, aangetrokken (Langner et al.,
2008; McGavin en Zachary, 2007; Slauson en Cooper, 2002; Tizard en Richard, 2008; Wagner et al.,
2006; Wagner et al., 2008).
6
Fig. 2: Schematische voorstelling van de “allergie loop” (uit Tizard en Richard, 2008).
Tot voor kort werd de directe invloed van IgE in de pathogenese van zomereczeem wel verondersteld,
maar het werd pas recentelijk officieel aangetoond. Bevestiging van de directe invloed kwam er via
een eerste experiment waarin getracht werd de allergische reactie te transfereren naar gezonde
dieren via overdracht van gezuiverd IgE en IgG. De zuivering van het serum verloopt in twee stappen.
Eerst wordt er gebruik gemaakt van een „proteïne G affiniteitskolom‟, zodoende IgG uit het serum te
verwijderen. Vervolgens wordt het serum over een „anti-paard IgE affiniteitskolom‟ gebracht om de
IgE-fractie te bekomen. Met de gezuiverde fracties wordt een Prausnitz-Küstner experiment of een
indirecte intradermale test uitgevoerd. Dit houdt in dat bij klinisch gezonde dieren de gezuiverde IgE
en IgG fracties, bekomen van aangetaste paarden, intradermaal worden ingeënt. De daarop volgende
dag wordt er op dezelfde injectieplaats een challenge met Culicoïdesextracten uitgevoerd. Uit dit
experiment kon geconcludeerd worden dat de allergische respons overdraagbaar is naar gezonde
paarden indien gebruik wordt gemaakt van IgE-fracties afkomstig van aangetaste paarden. Dit in
tegenstelling tot de gezuiverde IgG-fracties waarmee geen significante allergische respons uitgelokt
kon worden bij de gezonde paarden (Wagner, 2006). IgG wordt verder opgedeeld in 5 isotypes
namelijk het IgGa, IgGb, IgGc, IgG(T) en IgG(B) of het „equin aggregating Ig‟. De constante domeinen
van deze verschillende isotypes worden bepaald door de expressie van tot nu toe 7 beschreven „Ig H
chain constant‟ genen. Recentelijk is er aangetoond via DNA-analyses dat o.a. het constante domein
van IgGa bepaald wordt door het IgG1-gen, dat van IgGb door IgG4 en IgG7 en dat die van IgG(T)
bepaald wordt door IgG3 en IgG5 (Wagner et al., 2004). In de gezuiverde fracties van IgG bevinden
zich enkel het IgGa, IgGb en IgGc. IgG(T) is er niet in aanwezig omwille van zijn lage affiniteit voor de
“protein G affiniteitskolom” (Wagner et al., 2004; Wagner et al., 2006).
In een tweede experiment werd aangetoond dat een intradermale injectie van anti-IgG(T) een
7
onmiddellijke reactie van de huid kan uitlokken. Deze bevinding veronderstelt een reeds voorafgaande
sensibilisatie van de mastcellen door IgG(T), anders gezegd zijnde vertoont vrij IgG(T) een
bindingsaffiniteit voor de high-affinifty FcεR1receptoren. Er werd tijdens het besproken onderzoek niet
verder nagegaan of het effectief IgG(T) was dat gebonden zat op de mastcellen. Men kan, met enige
voorzichtigheid, uit deze resultaten enkel besluiten dat IgG(T) een potentiële rol heeft, in tegenstelling
tot IgGa, IgGb en IgGc, in de degranulatie van de mastcellen en dus in het ontstaan van de
allergische reactie. Op deze manier werd voor het eerst aangetoond dat IgE een cruciale rol speelt in
de pathogenese van zomereczeem en dat IgG(T) een potentiële rol zou kunnen hebben (Wagner et
al., 2006; Hellberg et al., 2006).
2.2.2 Type IV overgevoeligheidsreactie
Dit type is een laattijdige lokale overgevoeligheidsreactie die T-cel gemedieerd is. De mediatoren van
deze reactie zijn dus geen antistoffen maar wel T-lymfocyten meer bepaald de CD4+ T helper cellen
en de CD8+ cytotoxische T-lymfocyten. Dit indiceert dat als zomereczeem een type IV
overgevoeligheidsreactie veronderstelt, het overdraagbaar moet zijn naar andere dieren door transfer
van T-lymfocyten. Dergelijke transfer wordt echter geconfronteerd met een restrictie van de „major
histocompatibility‟ antigenen, met andere woorden je krijgt steeds een afweerreactie van de acceptor
op donorantigenen.
De overgevoeligheid start met een voorafgaande sensibilisatie van het individu, sterk gelijkend op die
van een type I overgevoeligheid. Antigeen presenterende cellen (APC) presenteren het antigeen,
hetzij in associatie met de Major HistoCompatibility (MHC) antigenen klasse I hetzij met de MHC
klasse II, aan de naïeve T-lymfocyten. De T-lymfocyten die het lichaamsvreemde antigeen herkennen
worden geactiveerd om een immuunrespons op gang te brengen, men bekomt respectievelijk CD8+
en CD4+ T-lymfocyten. Deze gesensibiliseerde T-cellen kunnen als „herrineringscellen‟ gedurende
maanden blijven rondcirculeren. Bij een nieuwe blootstelling aan hetzelfde (!) allergeen ontstaat er
door interactie met de APC een stimulatie van de desbetreffende T-lymfocyten en release van
cytokinen, ondermeer IL-1, TNF-α, IFN-γ en tal van chemokines. Deze werken in op mastcellen en/of
basofielen leidend tot de karakteristieke ontstekingsreactie (Slauson en Cooper, 2002; McGavin en
Zachary, 2007; Tizard and Richard, 2008).
Het verloop van deze karakterstieke reactie kan men het best beschrijven via de tuberculine reactie,
initieel beschreven door Koch. Hierbij worden gezuiverde tuberculine preparaten intradermaal
geinjecteerd. Na 2 uur kan men, via histologie, ter hoogte van de injectieplaats een accumulatie zien
van neutrofielen rond de capillairen. Dit histologisch beeld verandert om op 12 uur postinjectie
voornamelijk een accumulatie te zien van CD4+ en CD8+ T-cellen, monocyten en basofielen. De
endotheliale cellen zwellen waardoor de vasculaire permeabiliteit stijgt en er lekkage optreedt. Dit
zowel van plasma alsook van fibrinogeen, die in het weefsel wordt omgezet tot fibrine. De
karakteristieke weefselzwelling, veroorzaakt door oedeem en fibrinevorming, bereikt haar hoogtepunt
tussen de 24 en 72 uur postinjectie (Slauson en Cooper, 2002; McGavin en Zachary, 2007).
Indicaties voor een type IV overgevoeligheid zijn ondermeer het feit dat men bij het uitvoeren van een
intradermale test, bij CHS-positieve dieren, ook een laattijdige reactie (24 uur) waarneemt (Larsen et
8
al., 1988; Ferroglio et al., 2006; Morgan et al., 2007). Daarnaast zijn de sterk gelokaliseerde letsels op
manen en staartbasis eerder indicatief voor een type IV overgevoeligheidsreactie. Bij een type I
overgevoeligheidsreactie verwacht je immers een over gans het lichaam zichtbare reactie (o.a.
roodheid bij de mens) wat dus niet het geval is voor zomereczeem (Tizard and Richard, 2008).
2.3 Diagnose van zomereczeem
2.3.1 Klinische diagnose
De diagnose op basis van klinische symptomen is in de praktijk de meest voor de hand liggende en
dus ook meest uitgevoerde techniek. Voor het stellen van een klinische diagnose van zomereczeem
baseert men zich op de voorgeschiedenis van het paard en de klinische symptomen. Beide zijn van
belang bij het uitdunnen van de relatief lange differentiaal diagnostische lijst die kan worden
opgesteld.
Zo is een wederkerende seizoensgebonden pruritus met ernstige schuurletstels sterk indicatief voor
zomereczeem. Ook kennis over de huisvesting is van belang. Paarden die dag en nacht op een weide
staan hebben relatief gezien een grotere kans op contact met muggen dan permanent opgestalde
paarden. De aanwezigheid van vijvers en bossen is predisponerend voor de aanwezigheid van talrijke
muggen (Morrow et al., 1987; Fadok en Greiner, 1990; Rüsbüldt, 2007).
De klinische symptomen van zomereczeem hangen nauw samen met de mate waarin de ziekte
gevorderd is, alsook met de ergheid van de pruritus. Initiële letsels zijn nodules en papules gesitueerd
op manen en staartbasis, gepaard gaande met een intense jeuk waardoor het paard de getroffen
regio‟s bijt en begint te schuren. Dit leidt tot automutilatie en secundaire letsels zoals korstvorming,
ulceratie, alopecie, verdikking van de huid en bacteriële bij-infecties. Herhaalde blootstelling
veroorzaakt tevens een extensie van de letsels over de dorsale zijde van het lichaam, alsook naar de
laterale zijden van de nek en de schouder (Morrow, A. et al., 1987; McGavin en Zachary, 2007). In de
acute fase uit het zich microscopisch in een perivasculaire dermatitis met infiltratie van talrijke
eosinofielen, lymfocyten en histiocyten. Oudere letsels vertonen hyperplasie, hyperkeratose en
dermale fibrose, vaak leidend tot folliculitis en furunculosis (McGavin en Zachary, 2007, Fadok en
Greiner, 1990).
De dierenarts moet steeds een differentiaal diagnose in het achterhoofd houden. Er kan onder meer
een ventraal (navel en flanken) gelokaliseerde pruritus voorkomen (zomerschurft) ten gevolge van een
overgevoeligheidsreactie op Onchocerca cervicalis (overgedragen door Culicoïdes muggen). De
diagnose hiervan gebeurt meestal via het aantonen van larven („microfilariën‟) in een huidbiopt. De
aandoening is behandelbaar met Ivermectine of Moxidectine waarbij een tijdelijke verergering van de
dermatitis optreedt door het massaal afsterven van de microfilarïen. Daarnaast is Oxyuris equi een
parasiet die verantwoordelijk is voor een anale pruritus resulterend in een rattenstaart. Onderscheid
met zomereczeem kan gemaakt worden door het terugvinden van een kleverige eimassa ter hoogte
van de anus. De behandeling ervan bestaat uit toediening van een Benzimidazole en reiniging van de
omgeving. Er werd ook een overgevoeligheidsreactie op Simulium species beschreven. Deze kan zich
9
veruiterlijken in alopecie, pruritus en korstvorming ter hoogte van o.a. de oren, het gezicht en de
ventrale middenlijn. Bovendien kunnen beten van Stomoxys calcitrans een papuleuze pruritus
veroorzaken, voornamelijk ter hoogte van borstkast, schouders en benen. Ten slotte werd er ook een
atopische dermatitis bij paarden beschreven. Deze niet-seizoensgebonden pruritus is een
overgevoeligheidsreactie op omgevingsallergenen andere dan die van bijtende insecten (Fadok en
Greiner, 1990, Frey et al., 2008, Rüsbüldt, 2007).
Fig. 3: typische schuurletsels ten gevolge van zomereczeem: Rechts een detailafbeelding van de staartwortel,
de zogenaamde rattenstaart. Links een afbeelding van een paard met afgeschuurde manen (uit Rüsbüldt, 2007).
Een belangrijk nadeel van deze diagnosetechniek zijn de vals negatieve uitslagen in de winter. Dit ten
gevolge van de periode van remissie, waardoor paarden die niet te erg aangetast zijn geweest in de
zomerperiode er in de winter perfect klinisch gezond kunnen uitzien (Ferroglio et al., 2005). Voordelen
zijn ondermeer de eenvoudigheid en de lage invasiviteit waarmee ze gesteld kan worden alsook de
lage kostprijs ervan (Wagner et al., 2006).
Besluit
Een diagnose op basis van de kliniek is gebaseerd op de vrij stereotiepe pruritus en de bijhorende
schuurletsels die voorkomen bij een paard met zomereczeem. Indien rekening wordt gehouden met
de seizoensgebondenheid van de letsels kan het een waardevol diagnostisch hulpmiddel zijn dat
hedendaags vaak wordt toegepast. Echter moet er rekening gehouden worden met de beperkingen
ervan en het is aangewezen bijkomende onderzoeken uit te voeren ter differentiaal diagnose van
andere parasitaire en allergische aandoeningen.
2.3.2 Immunologische diagnose
2.3.2.1 Intradermale huidtest
De gebruikte directe intradermale testen (IDT) zijn gebaseerd op het uitlokken van een lokale IgE-
gemedieerde mastceldegranulatie met behulp van allergeenextracten. De allergeenextracten kunnen
10
zowel gehele lichaamsextracten omvatten alsook specifieke speekselextracten. Ze veroorzaken bij
een positieve uitslag dezelfde karakteristieke reactie als diegene die naar voor komt tijdens een
overgevoeligheidsreactie type I, namelijk een zwelling of „wheal‟ ter hoogte van de injectieplaats die
men zo objectief mogelijk tracht te interpreteren. Het is een in vivo test, waarmee bedoeld wordt dat
het op het paard zelf wordt uitgevoerd. Dit in tegenstelling tot de verderop besproken technieken
(Langner et al., 2008).
Voor het uitvoeren van een betrouwbare intradermale test moeten er een aantal voorwaarden voldaan
zijn. De huid moet vooreerst vrij zijn van haren, om zo een toename van de dikte van de huid optimaal
te kunnen waarnemen. Hiervoor wordt er een zone (30x15cm) op de laterale zijde van de nek
geschoren. Deze zone bevindt zich theoretisch halfweg tussen de mandibula en de schouder, één
handbreedte onder de manen. Het scheren gebeurt het beste met behulp van een tondeuse,
zodoende verwondingen van de huid zoveel mogelijk te vermijden. Vervolgens wordt de huid ontsmet
met 70% alcohol om contaminatie uit te sluiten (Fadok en Greiner, 1990; Jose-Cunilleras, 2001; Lorch
et al., 2001).
Er zijn steeds een negatieve (fysiologische zoutoplossing 0,9% of fosfaat gebufferde saline) en een
positieve (Histamine) controle vereist naast de dermaal geïnjecteerde allergeenextracten. Moeilijk
handelbare paarden worden best gesedeerd, gebruik makend van een intraveneuze injectie met
Xylazine. De dikte van de huid wordt gemeten vooraleer de allergenen-extracten worden geïnjecteerd,
hiervoor kan men de huid tussen duim en wijsvinger nemen, echter wordt er standaard gebruik
gemaakt van een „calliper„ (soort passer). Vervolgens injecteert men de extracten en de controles
dermaal. Er wordt gebruik gemaakt van een permanente marker (inkt) om de injectieplaatsen aan te
duiden. Men bekijkt de evolutie van de dikte van de huid ter hoogte van de injectieplaatsen in de tijd,
meestal door op 20–30 minuten, 4 uur en 24 uur metingen te doen (Fadok en Greiner, 1990; Jose-
Cunilleras, 2001; Lorch et al., 2001). Hierbij wordt een opdeling gemaakt op basis van grootte van de
onderhuidse zwelling: gaande van 0 tot 4+. Een 0 wordt gegeven wanneer de reactie overeenkomt
met de negatieve controle, een 4+ wordt gegeven wanneer de zwelling equivalent is aan de zwelling
van de positieve controle. Alle reacties gelijk aan of groter dan een 2+ worden als positief aanschouwd
(Langner et al., 2008; Wagner et al., 2006; Morgan et al., 2007).
Algemeen wordt er gesteld dat in een periode van minimum 4 weken voorafgaand aan de test er geen
gebruik mag zijn van orale, topicaal toegediende of injecteerbare NSAIDS, glucocorticosteroïden,
antihistamintica en bronchodilatoren (zoals sympathomimetica) (Tahon, 2008). Een Franse humane
studie heeft echter aangetoond dat een kortdurende behandeling met topicaal toegediende
corticosteroïden de reactie op intradermaal toegediend histamine niet beïnvloedt. Corticosteroïden
bleken niet in staat te zijn om de mastcel degranulatie tegen te gaan. Dit indiceert dat een
intradermale test wel uitgevoerd kan worden in aanwezigheid van een topicale behandeling met
corticosteroïden (Nancey, 2004).
Resultaten van een directe intradermale test moeten voorzichtig geïnterpreteerd worden. Een eerste
aandachtspunt is het gebruik van verschillende typen extracten. In bepaalde studies (Fadok en
Greiner, 199; Morgan et al., 2007) wordt er gebruikt gemaakt van de zogenaamde „whole body
11
extracts‟, echter deze extracten bevatten ook veel proteïnen die wel irriterend zijn voor de huid maar
daarom nog geen allergenen zijn. Dergelijke proteïnen kunnen vals positieve uitslagen veroorzaken.
Proteïnen aanwezig in het speeksel van de muggen zijn waarschijnlijk de belangrijkste allergenen.
Hieruit volgt dat extracten op basis van de speekselklieren het meest interessant zijn. Er is echter (te)
weinig geweten over de allergenen die concreet de hypersensitiviteit veroorzaken en bovendien is de
bereiding van speekselklierextracten een arbeidsintensief proces (Fadok en Greiner, 1990; Lorch et
al., 2001). Recente studies hebben wel vooruitgang geboekt in de identificatie van de
speekselproteïnen. Zo is er aangetoond dat er ten minste 10 allergenen aanwezig zijn in het speeksel
en kon men de functionaliteit van bepaalde proteïnen aanduiden. Bijkomend onderzoek naar deze
allergenen is vereist om de techniek van intradermale testen op punt te kunnen stellen (Hellberg et al.,
2006; Wilson et al., 2007).
Een complicerende factor is de onduidelijkheid over het belang van gebruik van geografisch lokale
Culicoïdes species ter bereiding van de allergeenextracten. Er zijn aanwijzingen dat de meeste van de
CHS positieve paarden reageren op verscheidende Culicoïdes species als ook op andere insecten.
Daarnaast zijn er ook bevindingen waarbij dieren slechts reactief zijn op 1 species en dat er zelfs
paarden zijn mét symptomen van CHS maar waarbij men geen positieve reactie kan uitlokken met de
gebruikte allergenen (Wilson et al., 2007). Daarnaast is er voor de intradermale huidtest een zekere
technische expertise vereist en is de interpretatie ervan bij het paard veel moeilijker in vergelijking met
de hond. Hierdoor wordt de intradermale test bij het paard meestal enkel uitgevoerd door
geaccrediteerde dermatologen (Wagner et al., 2006; Frey et al., 2008).
Een cruciaal voordeel van een intradermale test is dat het, in theorie, ook gebruikt kan worden
gedurende de winter (periode van remissie). Dit in tegenstelling tot diagnose op basis van klinische
symptomen. Omtrent het praktisch toepassen van een intradermale test in de winter is nog veel
bijkomend onderzoek nodig, dit omwille van soms tegenvallende resultaten (Ferroglio, 2005). In een
studie, waarbij voor de intradermale test uitgegaan werd van precieze eiwitconcentraties, werd er
aangetoond dat de test op 24 uur een gevoeligheid en specificiteit van honderd procent heeft, zelfs in
de winter. Dit is in tegenstelling tot andere studies, waar niet uitgegaan werd van deze precieze
concentraties. Daar werden deze gunstige resultaten niet bekomen (Ferroglio, 2005).
Er zijn ook nadelen aan de intradermale test ten opzichte van een klinische diagnose. Een eerste
factor is dat de intradermale testen, welke een technische expertise vereisen, vaak enkel worden
uitgevoerd in (universitaire) klinieken. Het transporteren van de dieren naar dergelijke instelling kan
een beperkende factor zijn. Ook economische factoren kunnen in het voordeel spelen van een
klinische diagnose (Wagner et al., 2006).
Besluit
De directe intradermale test is gebaseerd op het verloop van een overgevoeligheidsreactie in het
lichaam. Indien het paard gesensibiliseerd is voor de Culicoïdes-allergenen zal er zich bij een
intradermale injectie van het allergeenextract een karakteristieke ontstekingsreactie voordoen,
12
dewelke wordt afgelezen op verschillende tijdstippen. Deze procedure kan waardevolle informatie
opleveren voor de diagnose van zomereczeem, zeker in de winter. Echter is er nog te weinig
wetenschappelijke kennis over de exacte allergenen alsook voor een correcte productie van de
extracten om deze techniek op dit moment routinematig te gebruiken.
2.3.2.2 Histamine vrijstellings test
Deze test combineert de functionele aspecten van een intradermale test met de eenvoudigheid van
serologie. De histamine vrijstellingstest of „histamine release test‟ (HRT) maakt gebruik van basofiele
granulocyten bekomen van bloedstalen afkomstig van paarden. Het is dus een in vitro uitgevoerde
test. Basofielen behoren, samen met o.a. de monocyten en B-lymfocyten, tot de perifere bloed
leucocyten (PBL). Op elk van de drie bovenvernoemde cellen kan IgE gebonden worden. De
monocyten en B-lymfocyten brengen IgE-receptoren (FcεRII) met een lage affiniteit tot expressie, de
zogenaamde “low-affinity” receptoren. Deze zijn verantwoordelijk voor de regulatie van de IgE-
gehaltes in het bloed. De basofielen bevatten daarentegen, net zoals bij de mastcellen hoge affiniteits
IgE-receptoren (FcεRI) waarop allergeenspecifieke IgE‟s kunnen binden (alsook IgG). In
overeenstemming met mastcellen, kan een crosslinking van twee gebonden IgE‟s leiden tot een
degranulatie van de basofielen. Hierbij komen onder meer histamine en leukotriënen vrij die zorgen
voor een inflammatoire respons.
Er zijn heel veel gelijkenissen tussen mastcellen en basofielen. Ze brengen namelijk beide hoge
affiniteits receptoren tot expressie, ze ondergaan beide een IgE-gerelateerde sensibilisatie en kennen
beide een IgE-gemedieerde histamine release. Hierdoor kunnen de basofielen waardevolle cellen zijn
voor de diagnose van zomereczeem. Men neemt aan dat de hoeveelheid vrijgestelde histamine door
de basofielen gelinkt is aan de allergiestatus van het paard, waardoor men een onderscheid kan
maken tussen aangetaste en gezonde paarden. Het originele protocol werd opgesteld door Dr. S.
Kaul (Hannover) in 1998. In dit protocol wordt er gebruik gemaakt van het volledige bloedvolume. Het
hedendaagse protocol gaat uit van geïsoleerde PBC bekomen door centrifugatie. Men maakt steeds
gebruik van een positieve (anti-IgE) en een negatieve (buffer met gewassen bloedcellen) controle.
Eerst stelt men de maximale histamine vrijstelling vast. Hiervoor worden de PBC gedurende 10
minuten gekookt om vervolgens het supernatans ervan te bekijken via een ELISA. Nadien bepaalt
men de histamine vrijstelling ten gevolge van de blootstelling aan het allergeenextract vast via een
RIA (“RadioImmunoAssay”) of via een colometrische, niet radio-actieve ELISA. Aangezien het aantal
basofielen per ml bloed alsook het histamine-gehalte per basofiel sterk kunnen variëren van paard tot
paard, worden de resultaten uitgedrukt als een relatieve histamine vrijstelling ten opzichte van de
maximale vrijstelling. Een histaminevrijstelling gelijk aan of groter dan 10% van de maximale
vrijstelling wordt als positief aanschouwd. Bij het uitvoeren van dergelijke test zullen zowel de gezonde
als aangetaste paarden een sterke reactie vertonen op de positieve controle, een bewijs dat het
proces van sensibilisatie zich ook afspeelt op het oppervlak van basofielen.
Besluit
De test is een waardevolle techniek om sensibilisatie voor Culicoïdes aan te tonen, hij is echter niet
13
geschikt om allergische dieren van de niet-allergische te onderscheiden. Immers bij bepaalde paarden
kan er ook een sensibilisatie aangetoond worden zonder dat ze daarbij enige kliniek vertonen of
ontwikkelen. Dit indiceert dat klinisch gezonde paarden andere mechanismen van het
immuunsysteem aanspreken om de reactie op Culicoïdes antigenen te controleren (Wagner et al.,
2008). De juiste werking van deze mechanismen is nog niet geweten, al brengen recente studies de
regulatoire of T-suppressor cellen naar voor als één van de rolhebbende factoren. Zo is er in
experimentele humane modellen aangetoond dat de natuurlijk voorkomende CD4+CD25+ T-
suppressor cellen en de induceerbare interleukine-10 secreterende T-suppressor cellen de allergische
respons tegenwerken. De natuurlijk voorkomende T-suppressor cellen controleren zowel de „inate‟ als
de verworven immuunrespons. De interleukine-10 secreterende T-suppressor cellen werden
aangetoond als de dominerende cellen in de immuunrespons op omgevingsallergenen bij gezonde,
non-allergische mensen, terwijl bij allergische individuen een hoge frequentie werd teruggevonden van
Interleukine-4 producerende T-cellen. Interleukine-10 heeft zowel anti-inflammatoire als
immunologische eigenschappen (Akdis, M. et al., 2004; Hawrylowicz en O‟Garra, 2005; Langner et al.,
2008; Wagner et al., 2008,).
2.3.2.3 ELISA en RAST
ELISA (“Enzym linked immuno-sorbent assay”) alsook RAST (“Radioallergosorbent test”) zijn 2 in vitro
serum allergietesten. Diagnose bij beiden wordt gesteld op basis van een meting van de relatieve
concentraties van allergeen-specifieke IgE‟s in een serumstaal van een paard. Dit in tegenstelling tot
de “Radio Immuno Sorbent tests” (RIST) die het totale IgE in het lichaam bepalen. Deze laatste test
wordt niet verder besproken (Lorch, G. et al., 2001). Deze beide testen krijgen veel aandacht van het
wetenschappelijk onderzoek net omdat allergeen-specifiek IgE zo‟n cruciale rol speelt in de
pathogenese van zomereczeem. Het stellen van een serologische diagnose is een veel eenvoudigere
procedure dan het uitvoeren van een intradermale test. Dit geldt voor alle hieronder besproken
technieken (Morgan et al., 2007).
1. ELISA
ELISA behoort tot de “enzym immunoassays” die kunnen opgedeeld worden in homogene en
heterogene technieken. Bij de homogene technieken verblijven alle reagentia in oplossing, terwijl bij
de heterogene één van de reagentia (hetzij het antigeen, hetzij het immunoglobuline (Ig)) gecoat
wordt op een vaste fase (zoals plastiek, een membraan,…). ELISA behoort tot de laatste. De
algemene procedure verloopt eenvoudig. Na binding van het reagentia op de vaste fase wordt het
staal toegevoegd en volgt er een incubatietijd, zodanig dat er binding kan optreden tussen het
antigeen en het antilichaam. Hierop volgt een wasstap, waarbij de ongebonden componenten
verwijderd worden. Deze wasstap voorkomt dat dergelijke ongebonden componenten interferentie
geven gedurende de visualisatiefase. Tenslotte worden de Ig-antigeen complexen gevisualiseerd door
detectie van een enzym geïnduceerd signaal. Dit houdt in dat de gebruikte antilichamen gemerkt
worden met een enzym (vaak Horseradish peroxidase) en dat door toevoegen van substraat
(waterstofperoxide en een kleurreagens) een verkleuring wordt verkregen. Deze kleurreactie kan ook
kwantitatief bepaald worden met behulp van een spectrometer.
14
Verder wordt er onderscheid gemaakt tussen een directe en een indirecte test, waar de laatste
gebruikt maakt van gemerkt anti-Ig antilichaam om het gebonden Ig te visualiseren. Voordelen van
ELISA zijn de eenvoudigheid van de procedure, de gevoeligheid en specificiteit alsook de capaciteit
om meerdere stalen simultaan te kunnen analyseren (Cliquet, P. 2004).
2. RAST
De Radio-Allergo-Sorbent-Test is een test die toelaat om allergeenspecifiek IgE in het serum op te
sporen. Het protocol van een RAST verloopt als volgt. Eerst wordt het serumstaal behandeld met
Staphylococcus proteïne A voor het verwijderen van IgG. Vervolgens worden er helminth-antigenen
aan toegevoegd om zoveel mogelijk aspecifiek IgE te kunnen elimineren. Beide voorafgaande
stappen moeten vals-positieve uitslagen minimaliseren. In het bekomen serum worden vervolgens,
met antigeen geïmpregneerde cellulose disks ondergedompeld waardoor het antigeen-specifiek IgE
zal binden. Na een incubatie worden de disks verwijderd, gewassen en ondergedompeld in een
oplossing die radioactief-gemerkte of isotroop-gemerkte anti-IgE immunoglobuline bevat. Ten slotte
meet men de radioactiviteit. De radioactiviteit is een kwantificatie voor de hoeveelheid antigeen-
specifiek IgE aanwezig in het serum. RAST is echter verdreven geweest door de opkomst van de
Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent Assays, die de nadelen van het gebruik van radioactieve stoffen niet
hebben. Deze nadelen zijn ondermeer de nood aan speciale meettoestellen voor het meten van
radioactiviteit, het radioactieve afval en het potentiële gevaar voor de gezondheid (Cliquet, 2004).
Serum kan, in theorie, gebruikt worden als diagnostisch hulpmiddel voor zomereczeem. Alle paarden
in contact gebracht met Culicoïdes allergenen vertonen een immunoglobulinerespons (IgG) echter
enkel de CHS-positieve paarden brengen het allergeen-specifieke IgE tot expressie (Wilson et al.,
2001). Op basis hiervan kan een onderscheid gemaakt worden. Op te merken valt dat het IgE niet tot
expressie wordt gebracht bij een “challenge” van CHS-positieve dieren gedurende de remissieperiode
(Wilson et al., 2001). Serum gebaseerde testen voor de diagnose van allergische reacties bij het
paard, bestaan echter nagenoeg niet (Kalina, W. et al.., 2003). Nochtans kunnen deze nuttig zijn,
aangezien de intradermale huidtest vaak vals positieve resultaten oplevert, technische expertise
vereist en de interpretatie eerder subjectief is (Wagner et al., 2006). Tal van studies, vertrekkend van
verschillende uitgangspunten, werden en worden omwille van deze redenen uitgevoerd om tot een
volwaardige serologische techniek te komen. Het hoofddoel van deze onderzoeken is het bekomen
van reagentia die specifiek zijn voor IgE van het paard (Langner et al., 2008). In wat volgt tracht ik een
beknopt overzicht hiervan te geven.
Allereerst is er een gebrek aan beschikbare reagentia voor de detectie van de vrije IgE-fractie in
serum. Dit ten gevolge van de uiterst lage concentraties waarin IgE in het serum voorkomt. Daarom is
het van belang om een gezuiverde IgE-fractie te gebruiken vermits bij gebruik van natief serum het
IgE beneden de detectielimiet kan liggen. Tegelijkertijd is er een potentieel hoge concentratie van
allergeenspecifiek IgG aanwezig in het ongezuiverde serum, waardoor er competitie kan optreden met
IgE voor binding op de ELISA-plaat. Zuivering van het serum blijkt echter vaak ontoereikend om
voldoende IgE te bekomen voor productie van reagentia.
15
Een alternatief wordt aangeboden via de productie van peptide-gebasseerde immunogenen op basis
van de nucleotide-sequentie van IgE. Deze nucleotide-sequentie is reeds vroeger bepaald geweest
door Marti et al. (1995), Navarro et al. (1995) en Watson et al. (1997). Voor de synthese van de
immunogenen wordt gebruik gemaakt van continue epitopen van het natieve proteïne en van multiple
algoritmes die o.a. de hydrofiliteit en oppervlakte blootstelling voorspellen (Halliwel, 1985; Kalina et al.,
2003; Langner et al., 2008; Morgan et al., 2007).
Voor het uitvoeren van de ELISA wordt er vaak gebruik gemaakt van een monoklonale anti-IgE
antistof en commerciële allergeenpreparaten. Het gebruikte anti-IgE antistof vertoont geen
kruisreactiviteit met IgG. Echter de gebruikte commerciële preparaten vormen een belemmering
omdat de exacte concentratie onbekend is. Bovendien kunnen er ook andere componenten in
aanwezig zijn die interfereren met de allergeen-coating in de ELISA, waardoor er minder allergeen
beschikbaar is voor de test. Het gebruik van pure, recombinante allergenen is daarom aangewezen
(Wagner et al., 2006; Morgan et al., 2007). In een onlangs uitgevoerde studie wordt deze invalshoek
bestudeerd. Men ging hierin het gebruik na van recombinante allergenen voor het bepalen van IgE in
sera bij paarden met chronische bronchitis via ELISA. De resultaten tonen aan dat IgE, tegen de
standaard gebruikte (schimmel)extracten, in alle sera werd teruggevonden, onafhankelijk van de
status van het paard, terwijl tegen de recombinante allergenen slechts enkele keren IgE kon
aangetoond worden. Vanuit deze resultaten kunnen we dus besluiten dat de recombinante allergenen
toelaten om een ELISA uit te voeren met een hogere gevoeligheid (Eder et al., 2000). In een andere
studie slaagde men erin om monoklonale antilichamen te produceren, gericht tegen recombinante
allergenen en gedeeltelijk gezuiverd IgE serum, die natieve paarden-IgE herkenden (Watson et al.,
2006).
Voor het stellen van een correcte serologische diagnose via ELISA is het tijdstip waarop het serum
afgenomen wordt wel van groot belang, aangezien de IgE halfwaardetijd zeer kort is. Daarenboven
betreft het hier een seizoensgebonden aandoening, die extra bijdraagt aan variatie op het IgE-gehalte.
Dit is een mogelijke oorzaak van een vals negatieve uitslag in ELISA bij paarden die positief testen bij
uitvoeren van een intradermale huidtest waar IgE een veel langere halfwaardetijd kent. Daarnaast
worden er bij klinisch gezonde paarden vaak hoge allergeenspecifieke IgE-niveaus teruggevonden. Bij
de mens is aangetoond dat de aanwezigheid van allergeenspecifiek IgE niet altijd inhoudt dat er zich
een ziekte moet manifesteren. Dit kan ook zo zijn bij het paard!
Ten eerste kan het te wijten zijn aan een subklinisch verloop van de aandoening. Onder meer kan de
histamine vrijstellingstest klinisch gezonde maar wel gesensibiliseerde paarden herkennen. Dit
indiceert dat gezonde paarden andere mechanismen van het immuunsysteem aanspreken dan
allergische paarden. Ten tweede kan het te wijten zijn aan het feit dat IgE niet het enige oorzakelijke
immunoglobuline is van zomereczeem. Er is aangetoond geweest dat één subklasse van IgG namelijk
IgG(T) kan binden op mastcellen en daardoor zou kunnen bijdragen tot zomereczeem (Kalina et al.,
2003; Wagner et al., 2006; Hellberg et al., 2006; Morgan et al., 2007; Wagner et al., 2008). Men moet
ook rekening houden met individuele verschillen in sterkte van de IgE respons. Zo kan het ene paard
een sterke respons vertonen terwijl een ander, allergisch, paard een minimale immuunrespons
vertoont (Eder et al.; 2000). Bovendien is er aangetoond dat verschillende paarden op verschillende
16
allergenen reageren, wat het gebruik van commerciële allergenen in vraag stelt (Eder et al., 2000;
Wilson et al., 2001). Er is duidelijk nood aan bijkomende studies die de o.a. de effecten van omgeving
(klimaat en huisvestiging), mate van infestatie met endoparasieten, leeftijd en geslacht op IgE-
gehaltes verder onderzoeken (Eder et al., 2000; Langner et al., 2008).
Een vergelijkende studie tussen de verschillende technieken gehanteerd ter diagnose van
zomereczeem werd uitgevoerd (Langner et al., 2008). Hiervoor werden de intradermale test (IDT), de
histamine vrijstellingstest (HRT) en IgE-ELISA, elk uitgevoerd met volledige lichaamsextracten of
specifiek het speeksel van Culicoïdes, met elkaar vergeleken voor wat betreft sensitiviteit en
specificiteit. Het grootste verschil tussen de bekeken testen is dat ELISA zich baseert op het meten
van allergeenspecifieke antilichamen, terwijl IDT en HRT gebaseerd zijn op de cellulaire
immuunrespons. Voor het onderzoek werden deze testen uitgevoerd voor zowel de natieve als
exotische Culicoïdes species en werd er gebruik gemaakt van gestandaardiseerde preparaten. Het
gebruik van gestandaardiseerde preparaten is aangewezen, aangezien er anders een beperking
optreedt van de reproduceerbaarheid van de resultaten. In realiteit worden vaak niet
gestandaardiseerde tot zelfs sterk verschillende preparaten gebruikt bij de verschillende studies
waardoor het moeilijk wordt om ze onderling te vergelijken. De HRT bleek de meest accurate en
gevoeligste test (sensitiviteit = 100%) te zijn, met een specificiteit variërend van 78% voor gehele
lichaamsextracten tot 100% voor speekselextracten. Dit terwijl er bij ELISA en IDT geen significant
onderscheid kon gemaakt worden tussen aangetaste en gezonde paarden (Langner et al., 2008).
Zo werd er vastgesteld dat bij de IDT mild aangetaste dieren een vals negatieve uitslag
veroorzaakten. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat mastcellen ongelijk verdeeld zitten in de huid.
Deze variatie doet zich niet enkel voor tussen diersoorten maar ook in verschillende weefsels van 1
diersoort en zelfs binnen eenzelfde weefsel o.a. de huid (Hampel, 2007; vermeld in Langner et al.,
2008; Morrow et al., 1987), waardoor het aantal mastcellen aanwezig in een bepaalde regio niet
representatief is voor de allergiestatus van het dier. Deze verklaring wordt echter tegengesproken
door een studie uitgevoerd door Morrow et al. (1987). Hierbij werd getracht een associatie te vinden
tussen letsels veroorzaakt door een positieve IDT reactie en het aantal mastcellen, bepaald door
punchbiopten genomen in verschillende regio‟s. Er werd geen associatie tussen beide factoren
gevonden (Morrow et al., 1987). Daarnaast zag men in het vergelijkende onderzoek een reactie bij
klinisch gezonde dieren op 4 uur postinjectie terwijl deze geen reactie vertoonden na 30 minuten. Een
mogelijke verklaring hiervoor is dat de geïnjecteerde preparaten substanties bevatten die irriterend
kunnen zijn waardoor ze een niet-allergeen complement gemedieerde ontstekingsreactie (IgG) met
oedeem en erythema veroorzaken.
Bij de HRT werden er twee vals positieve reacties vastgesteld bij gebruik van volledige
lichaamsextracten. Een mogelijke oorzaak hiervoor is een aspecifieke reactie. Een eerste reden
omdat dergelijke extracten tal van componenten bezitten die een non-allergeen gemedieerde basofiel-
degranulatie kunnen uitlokken. Het is immers geweten dat basofielen een rijk repertoire aan
receptoren bezitten. Dergelijke receptoren kunnen binden aan structureel gelijkende proteïnen van
17
hun antigenen. Een tweede reden is dat carbolhydraten aanwezig in dergelijke extracten zorgen voor
een crosslinking tussen de gebonden antistoffen, wat leidt tot een activatie en degranulatie van de
basofielen. Deze lage specificiteit ten gevolge van het gebruik van volledige lichaamsextracten wordt
ook beschreven bij het uitvoeren van een ELISA. Een mogelijke verklaring is een gebrek aan zuivering
of gewoonweg de afwezigheid van het belangrijkste allergeen. Gebruik van speekselextracten drijft de
specificiteit en gevoeligheid van de testen verder op. Dit is ook het geval voor de IDT. Opmerkelijk
was het voorkomen van een prozone-effect bij de HRT, dit houdt in dat bij een te hoge concentratie
allergeen de verschillende individuele antilichamen wordt bezet, waardoor er geen “cross-linkage”
meer mogelijk is tussen de multiple antistoffen, nodig om een degranulatie te bekomen. Daarom is het
van belang om bij uitvoeren van een HRT gebruik te maken van verdunningsreeksen van het
allergeen, om vals negatieve resultaten te ontlopen.
Voor wat betreft het onderscheid tussen natieve Culicoïdes extracten en exotische Culicoïdes
extracten werd er bevonden dat er bij IDT en HRT geen verschil was in intensiteit van positieve
reacties terwijl er bij ELISA meer positieve reacties waren voor de natieve extracten.
Besluit
Algemeen kan men besluiten dat HRT en IDT meer betrouwbaar zijn dan ELISA. Dit omdat ze gebruik
maken van de effector cellen van de allergische reactie en dus beter de natuurlijke reactie imiteren.
Het grootste nadeel van ELISA is dat ze een indicatie geeft van de circulerende immunoglobulines
maar niet van de weefselgebonden immunoglobulines. Daarnaast bestaan er nog geen duidelijke en
correcte cut-off levels voor deze techniek. De HRT is de minst invasieve methode en zal dus ook de
minst aspecifieke reacties veroorzaken, mogelijk nadeel is dat deze techniek enkel de onmiddellijke
allergische reactie aantoont terwijl bij zomereczeem ook een laattijdig type van reactie beschreven is.
Deze wordt wel weergegeven door de IDT. Bovendien is de HRT enkel ideaal voor het aantonen van
een sensibilisatie en moet er dus opgelet worden met de interpretatie van de resultaten. Immers ook
klinisch gezonde paarden kunnen gesensibiliseerd zijn en positief testen op de HRT maar daarom nog
geen zomereczeem ontwikkelen! Het feit dat de HRT een sensibilisatie kan aantonen is tevens een
voordeel, op deze manier kunnen immers paarden die risico lopen op het ontwikkelen van
zomereczeem geïdentificeerd worden (Langer et al., 2008; Schoefer et al., 2007; Frey et al., 2008;
Wagner et al., 2008).
2.4 Discussie
Uit deze literatuurstudie kan besloten worden dat er nog veel tegenstrijdigheden bestaan over
verschillende aspecten van zomereczeem. Voor de pathogenese gaat men algemeen uit van een type
I overgevoeligheidsreactie op speekselallergenen van Culicoïdes species. Dergelijk type van reactie is
theoretisch IgE-gemedieerd niettemin zijn er indicaties dat een IgG subklasse, namelijk het IgG(T),
een potentiële rol heeft. De wetenschappers (Wagner et al., 2006) die deze tegenstelling hebben
aangehaald zijn er echter niet in geslaagd om dit eensluidend te bewijzen. Ze hebben in hun
onderzoek niet verder uitgediept of IgG(T) effectief kon binden op mastcellen. Daarom is het
aangewezen om deze bevinding met enige voorzichtigheid te interpreteren. Het identificeren van de
18
oorzakelijke allergenen krijgt in recente studies steeds meer en meer aandacht. Dit heeft geleid tot de
kennis van verschillende proteïnen aanwezig in het speeksel van Culicoïdes. Deze kennis biedt
mogelijkheden o.a. voor het beter begrijpen van de pathogenese. Ten gevolge van de identificatie van
de exacte allergenen is er daarenboven een verfijning mogelijk van de voorhanden
diagnosetechnieken.
Dit moet de diagnose die tevens een knelpunt is in de problematiek van zomereczeem verbeteren.
Inderdaad, tal van uiteenlopende technieken zijn beschreven en ontworpen, maar geen enkele kan tot
nu toe als gouden standaard gehanteerd worden. Elk van de technieken wordt geconfronteerd met
verschillende moeilijkheden. Ten eerste is zomereczeem een seizoensgebonden aandoening
waardoor in de remissieperiode de gevoeligheid van de testen vaak te laag ligt. Dit geldt ook voor een
diagnose op basis van de klinische symptomen waar tevens een differentiaal diagnostische lijst moet
opgesteld worden. Ten tweede gaat het om een allergie die steeds een voorafgaande sensibilisatie
inhoudt. Het is daarom cruciaal dat een onderscheid kan gemaakt worden tussen een gesensibiliseerd
allergisch en een gesensibiliseerd maar (nog) niet allergisch paard. Dit is vooral een knelpunt van de
histamine vrijstellingstest, waar gesensibiliseerde dieren vlug als positief worden aanschouwd zonder
duidelijke „cut off‟ tussen allergie en geen allergie. Men zou zich kunnen afvragen of dat dit ook zo
geldt voor de intradermale test. Immers beide testen zijn gebaseerd op het uitlokken van een
degranulatie door een kruisbinding van 2 IgE‟s. Het enige verschil is dat de HRT in vitro wordt
uitgevoerd, terwijl de IDT een in vivo test is. De vraag is of dat de aanwezigheid van omliggende
weefsels en bijkomende factoren van het immuunsysteem, wel bij IDT maar niet bij HRT, kunnen
voorkomen dat gesensibiliseerde maar niet allergische dieren positief zouden testen. Bovendien is,
zoals reeds vermeld, het aantonen van een sensibilisatie op zich ook waardevol. Immers indien men
beschikt over deze informatie kan men hier rekening mee houden in het kader van de huisvesting of
aankoop van het paard.
Voor de testen die allergeen specifieke IgE opsporen is het van belang een onderscheid te maken
tussen het circulerend IgE en het IgE gebonden op de mastcellen in de weefsels. De halfwaardetijd
van vrij IgE in het bloed is immers kort waardoor een vals negatieve uitslag bekomen kan worden. Op
dit vlak zijn de direct intradermale test en de histamine vrijstellingstest te verkiezen boven de ELISA.
Ten slotte moet ook gekeken worden naar de invasiviteit van een techniek. Hier komt de diagnose op
basis van klinische symptomen veruit op één te staan gevolgd door de serologische technieken. De
intradermale test scoort hier slechter. Het is zeer moeilijk om de eigenaar van een paard overtuigd te
krijgen om een oppervlak van 30x15cm in de hals te laten scheren, enkel en alleen om tot een
diagnose te komen. Op dit vlak zijn de HRT en ELISA vele toegankelijker, aangezien een
bloedafname voldoende is. Het blijft dus nog steeds van belang om de klinische symptomen met de in
vitro en in vivo testen te combineren om zo tot een correcte diagnose te komen. Dit is arbeidsintensief
en vandaar dus niet echt te prefereren. Net daarom is het belangrijk om verder uit te diepen hoe de
pathogenese verloopt en welke allergenen oorzakelijk zijn.
Tot slot is er nog (te) weinig geweten over de genetische achtergrond van de problematiek. Men zit
nog met vele vragen over de genetische predispositie van IJslanders voor zomereczeem. Waarom het
ene individu wel zomereczeem ontwikkelt en het andere niet, blijft een vraagteken. Uitgebreidere
19
kennis van de immuunrespons, ondermeer van de rol van T-suppressor cellen, kan ook bijdragen aan
een betere diagnose. Dit is in deze literatuurstudie niet zo uitvoerig besproken maar dat zeker in
toekomstige studies verder aan bod zal komen.
3. Literatuurlijst
1. Akdis, M., Verhagen, J., Taylor A., Karamloo F., Karagiannidis, C., Crameri, R., Thunberg, S., Deniz, G., Valenta, R.,
Fiebig, H., Kagel, C., Disch, R., Schmidt-Weber, CB., Blaser, K., Akdis, CA. (2004). Immune responses in healthy and
allergic individuals are characterized by a fine balance between allergen-specific T regulatory 1 and T helper 2 cells,
Journal of experimental medicine, vol.199, Issues 11, blz. 1567-1575.
2. Corrêa, T.G., Ferreira, J.M., Riet-Correa, G., Ruas, J.L, Schild, A.L, Riet-Correa, F., Guimarães, A., Felippe-Bauer,
M.L (2007). Seasonal allergic dermatitis in sheep in Southern Brazil caused by Culicoïdes insignis (Diptera
Ceratopogonidae), Veterinary Parasitology, vol. 145, Issues 1-2, blz. 181-185.
3. Eder, C., Crameri, R, Mayer, C., Eicher, R., Straub, R., Gerber, H., Lazary, S., Marti, E. (2000). Allergen-specific IgE
levels against crude mould and storage mite extracts and recombinant mould allergens in sera from horses affected
with chronic bronchitis, Veterinary Immunology and Immunopathology, vol. 73, blz. 241-253.
4. Fadok, V.A., Greiner, E.C. (1990). Equine insect hypersensitivity: skin test and biopsy results correlated with clinical
data, Equine Veterinary Journal, vol. 22, Issue 4, blz. 236-240.
5. Ferroglio, E., Pregel, P., Accosato, A.., Taricco, I., Bollo, E., Rossi, L., Trisciuoglio, A. (2006). Equine Culicoïdes
hypersensitivity: Evaluation of a skin test of humoral response, Journal of Veterinary Medicine Series A, vol. 53, Issue
1, blz. 30-33.
6. Frey, R., Bergvall, K., Egenvall, A. (2008). Allergen-specific IgE in Icelandic horses with insect bite hypersensitivity
and healthy controls, assessed by FcεR1-based serology, Veterinary Immunology and Immunopathology, vol. 126,
blz. 102-109.
7. Hawrylowicz, C. M., O‟Garra, A. (2005). Potential role of interleukin-10-secreting regulatory T cells in allergy and
asthma, Nature Reviews Immunology, vol. 5, blz. 271-283.
8. Hellberg, W;. Wilson, A.D., Mellor, P., Doherr, M.G., Torsteinsdottir, S., Zurbriggen, A., Jungi, T., Marti, E. (2006).
Equine insect bite hypersensitivity: Immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoïdes
nubeculosus salivary gland extract, Veterinary Immunology and Immunopathology, vol. 113, blz. 99-112.
9. Jose-Cunilleras, E., Kohn, C., Hillier, A., Saville, W.J., Lorch, G. (2001). Intradermal testing in healthy horses and
horses with chronic obstructive pulmonary disease, recurrent urticaria, or allergic dermatitis, Journal of the American
Veterinarian Medicine Association, vol. 219, issue 8, blz. 1115-1121.
10. Kahn, C. (2005). The Merck Veterinary Manual: Integumentary System. Ninth edition. Merck en co, INC, Whitehouse
Station, N.J., USA, blz. 717-718.
11. Kalina, W., Pettigrew, H. and Gershwin, J. (2003). IgE ELISA using antisera derived from epsilon chain antigenic
peptides detects allergen-specific IgE in allergic horses, Veterinary Immunology and Immunopathology, vol.92, blz.
137-147.
12. Langner, K., Darpel, K., Drolet, B., Fischer, A., Hampel, S., Heselhaus, J., Mellor, P., Mertens, P., Leibold, W. (2008),
Comparison of cellular and humoral immunoassays for the assessment of summer eczema in horses, Veterinary
Immunology and Immunopathology, vol. 122, Issues 1-2, blz. 126-137.
13. Larsen, H.J., Bakke, S.H., Mehl, R. (1988). Intradermal challenge of Icelandic Horses in Norway and Iceland with
Extracts of Culicoïdes spp., Acta Veterinaria Scandinavia, vol. 29; blz. 311-314.
14. Lorch, G., Hillier, A., Kwochka, K., Saville, W.J. (2001). Comparison of immediate intradermal test reactivity with
serum IgE quantitation by use of a radioallergosorbent test and two ELISA in horses with and without atopy, Journal
of the American Veterinarian Medicine Association, vol. 218, issue 8, blz. 1314-1322.
15. McGavin, M.D., Zachary, J.F (2007). Chapter 17: The Integument, Pathologic Basis of Veterinary Disease. Edition 4,
Mosby Elsevier, Missouri USA, blz. 1154, 1202 en 1209).
16. Mellor, P., McCaig, J. (1974). The probable cause of “sweet itch” in England, Veterinary Record, vol. 95, blz. 411-
415.
17. Morgan, E., Miller Jr, W., Wagner, B. (2007). A comparison of intradermal testing and detection of allergen-specific
20
immunoglobulin E in serum by enzyme-linked immunosorbent assay in horses affected with skin hypersensitivity,
Veterinary Immunology and Immunopathology, vol. 120, Issues 3-4, blz.160-167.
18. Morrow, A.N., Baker, K.P., Quinn, P.J. (1987). Skin lesions of Sweet itch and the distribution of dermal mast cells in
the horse, Zentralblatt für Veterinärmedzin, vol. 34, issue 5, blz. 347-355.
19. Nancey, S., Freymond, N., Catelain, A., Cousin, F., Rozieres, A., Nicolas, J.-F. (2004). Effect of local corticosteroids
on acute experimental urticaria, European Journal of Dermatology, vol. 14, Issue 5, blz. 323-326.
20. Robinson, NE. (2002). section 16: Skin Disease, Arthropod hypersensitivity, Current Therapy in Equine Medicine,
edition 5, Elsevier Health Sciences, blz. 184-187.
21. Rüsbüldt, A. (2007). Sommerekzem; vorbeugen – erkennen – behandeln, Forte Uitgevers bv, blz. 1-80.
22. Schoefer, Y., Schäfer, T., Meisinger, C., Wichmann, H-E., Heinrich J. (2008). Predictivity of allergic sensitization
(RAST) for the onset of allergic diseases in adults, Allergy, vol. 63, Issue 1, blz. 81-86.
23. Slauson, D., Cooper, B. (2002). Chapter 5 Immunopathology, Mechanisms of Disease, a Textbook of comparative
general Pathology, edition 3, Mosby Missouri, blz.262-269.
24. Swiderski, C. (2000). Hypersensitivity disorders in Horses, Veterinary Clinics of North America: Equine Practice, vol.
16, issue1, blz.131-151.
25. Tahon, L., Baseglia, S., Gerber, V., Dorherr, M., Straub, R., Robinson, N.E., Marti, E. (2009). In vitro allergy tests
compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction, Veterinary Immunology and
Immunopathology, vol. 127, issue 1-2, blz. 85-93.
26. Tizard, I. and Richard, M. (2008). Chapter 25: type I Hypersensitivity and chapter 28: type IV Hypersensitivity,
Veterinary Immunology: an Introduction. Edition 8, Elsevier, blz. 329-347 en 369-379.
27. Townley, P., Baker; K., Quinn, P. (1984). Preferential landing and engorging sites of Culicoïdes species landing on an
horse in Ireland, Equine Veterinary Journal, vol. 16; blz. 117-120.
28. Van Grevenhof, E.M., Ducro, B., Heuven, H.CM., Bijma, P. (2007) Identification of environmental factors affecting the
prevalence of insect bite hypersensitivity in Shetland ponies and Friesian horse in the Netherlands, Equine Veterinary
Journal, vol. 39, Issue 1, blz. 69-73.
29. Wagner, B., Miller, D., Lear, T., Antczak, D. (2004). The complete map of the Ig heavy chain constant gene region
reveals evidence for seven IgG isotypes and for IgG in the horse, The Journal of Immunology, vol. 173, blz. 3230-
3242.
30. Wagner, B., Miller, D., Morgan, E., Hillegas, J., Erb, H., Leibold, W., Antczak, D. (2006). IgE and IgG antibodies in
skin allergy of the horse, Veterinary Research, vol. 37, blz. 813-825.
31. Wagner, B., Bronwen AB., Hollis NE. (2008). A histamine release assay to identify sensitisation to Culicoïdes
allergens in horses with skin hypersensitivity, Veterinary Immunology and Immunopathology, vol.126 (3-4), blz.302-
308.
32. Warren, V.K., Howard, D.P., Laurel, J.G. (2003). IgE ELISA using antisera derived from epsilon chain antigenic
peptides detects allergen-specific IgE in allergic horses, Veterinary Immunology and Immunopathology, vol. 92, blz.
137-147.
33. Wilson, A.D., Harwood, L.J., Björnsdottir, S., Marti, E., Day, M.J. (2001). Detection of IgG and IgE serum antibodies to
Culicoïdes salivary gland antigens in horses with insect dermal hypersensitivity (sweet itch), Equine Veterinary
Journal, vol. 33, Issue 7, blz. 707-713.
34. Wilson, A., Harwood, L., Torsteindsdottir, S., Marti, E. (2006). Production of monoclonal antibodies specific for native
equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with
insect bite dermal hypersensitivity, Veterinary Immunology and Immunopathology, vol. 112, Issue 3-4, blz. 156-170/
35. Wilson, A.D., Heesom, K.J., Mawby, W.J., Mellor, P.S., Russell, C.L. (2008). Identification of abundant proteins ands
potential allergens in Culicoïdes nubeculosus salivary glands, Veterinary Immunology and Immunopathology, vol.122,
Issues 1-2, blz. 94-103.
