Radiogenomics voor predictie van radiotoxiciteit bij...

Radiogenomics voor predictie van

radiotoxiciteit bij patiënten behandeld met

radiotherapie voor H&N tumoren.

Iris Rossaert

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. H. Thierens

Vakgroep Medische Basiswetenschappen

Academiejaar 2009-2010

“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de

beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

HANDTEKENING STUDENT HANDTEKENING PROMOTOR Iris Rossaert Prof. Dr. H Thierens

Voorwoord Hierbij wil ik graag iedereen bedanken die mij bijgestaan heeft tijdens de realisatie van deze

thesis.

In de eerste plaats wil ik mijn promotor Prof. Dr. H. Thierens en Dr. Ir. Kim De Ruyck

bedanken voor de mogelijkheid die ze mij gaven om dit onderzoek uit te voeren.

In het bijzonder wil ik mijn begeleidster Joke Werbrouck bedanken voor alle hulp en steun

die ze mij bood bij het aanleren van de verschillende technieken en methoden. Bedankt ook

voor al de hulp bij de statistische verwerking en bij het schrijven van deze thesis. Naast Joke

wil ik ook Kim De Ruyck bedanken voor het aanleren van de nodige technieken gedurende

mijn stageperiode.

Verder wil ik ook Virginie De Gelder, Laurence Beels en Sofie De Langhe bedanken omdat

ook zij telkens klaar stonden voor praktische hulp in het labo.

Graag wil ik ook het volledige dienstpersoneel speciaal bedanken voor de aangename

werkomgeving. In het bijzonder bedank ik hierbij mijn mede-thesisstudenten Ans, Marlies,

Charlot en Siska. Bedankt voor al jullie hulp en steun en al de leuke momenten waardoor de

aangename sfeer, ook in meer stressvolle periodes nooit echt verdween.

Ten slotte wil ik al mijn vrienden en familie bedanken. Een extra dankwoord gaat uit naar

mijn ouders en vriend Daan waarbij ik altijd terecht kon, niet alleen dit jaar maar gedurende

mijn hele opleiding.

Bedankt, deze thesis was niet mogelijk zonder jullie hulp en steun!

Inhoudstafel Afkortingen ................................................................................................................................ 5

Samenvatting .............................................................................................................................. 1

Inleiding ..................................................................................................................................... 2

1. Hoofd- en halskanker ..................................................................................................... 2

1.1 Types Tumoren ........................................................................................................ 2

1.2 Behandeling ............................................................................................................. 3

1.2.1 Chirurgie, chemotherapie en cetuximab ........................................................... 3

1.2.2 Radiotherapie .................................................................................................... 3

2. Weefselreacties bij H&N kankerpatiënten na radiotherapie .......................................... 4

2.1 Introductie ................................................................................................................ 4

2.2 Types weefselreacties .............................................................................................. 5

2.2.1 Mucositis .......................................................................................................... 5

2.2.2 Dermatitis ......................................................................................................... 6

2.2.3 Xerostomie........................................................................................................ 6

2.2.4 Dysfagie ............................................................................................................ 6

2.2.5 Fibrose .............................................................................................................. 7

2.3 Het herstel van RT geïnduceerde DNA DSBs ......................................................... 7

A. Homologe recombinatie ................................................................................... 8

B. Niet homologe end-joining ............................................................................... 8

2.4 TGFβ1 ...................................................................................................................... 9

2.4.1 Inleiding ............................................................................................................ 9

2.4.2 Signaalpathway ................................................................................................. 9

2.5 SNPs en de ontwikkeling van normale weefselcomplicaties ................................. 10

2.5.1 SNPs ............................................................................................................... 10

2.5.2 TGFβ1 c.-509 C>T en TGFβ1 c.-800 G>A .................................................... 11

2.5.3 TGFβ1 c.74 G>C ............................................................................................ 11

2.5.4 Ku70 c.-1310 C>G .......................................................................................... 12

2.5.5 XRCC3 c.722 C>T .......................................................................................... 12

3. Doelstelling .................................................................................................................. 12

Materialen en Methoden ........................................................................................................... 14

1. Introductie .................................................................................................................... 14

2. Studiepopulatie ............................................................................................................. 14

3. Dosimetrische gegevens ............................................................................................... 15

4. DNA purificatie ............................................................................................................ 16

5. Concentratie -en kwaliteitbepaling van het DNA ........................................................ 17

6. Polymerase chain reaction (PCR) ................................................................................ 18

6.1 Principe .................................................................................................................. 18

6.2 PCR mix ................................................................................................................. 19

6.3 Primers ................................................................................................................... 19

6.4 PCR Controle ......................................................................................................... 20

7. SNP bepaling ................................................................................................................ 21

7.1 Restriction fragment length polymorphism (RFLP) .............................................. 21

7.2 High resolution melting (HRM) ............................................................................. 22

7.2.1 Primer bepaling............................................................................................... 24

7.2.2 Optimalisatie HRM protocols ......................................................................... 24

8. Kwaliteitscontroles ....................................................................................................... 25

9. Statistische Analyse ...................................................................................................... 25

Resultaten ................................................................................................................................. 26

1. Reeds geoptimaliseerde protocols ................................................................................ 26

2. Optimalisatie HRM Protocols ...................................................................................... 26

2.1 XRCC3 c.722C>T .................................................................................................. 27

2.2 Ku70 c.-1310C>G .................................................................................................. 28

2.3 Controlestalen ........................................................................................................ 31

3. Associatiestudie naar chronische radiosensitiviteit ...................................................... 31

3.1 Analyse genotype-onafhankelijke factoren ............................................................ 32

3.1.1. Therapiegerelateerde parameters .................................................................... 32

3.1.2. Patiëntgerelateerde parameters ....................................................................... 32

3.2 Analyse naar de associatie tussen SNPs en chronische radiosensitiviteit .............. 32

A. Chronische dysfagie ....................................................................................... 33

B. Xerostomie...................................................................................................... 33

C. Fibrose ............................................................................................................ 34

4. Associatiestudie naar acute radiosensitiviteit ............................................................... 35

4.1 Analyse genotype-onafhankelijke factoren ............................................................ 35

4.1.1 Therapiegerelateerde parameters .................................................................... 35

A. Acute dysfagie ................................................................................................ 35

B. Mucositis ........................................................................................................ 37

C. Dermatitis ....................................................................................................... 37

4.1.2 Patiëntgerelateerde parameters ....................................................................... 38

4.2 Analyse van de associatie van SNPs en acute radiosensitiviteit ............................ 38

A. Acute dysfagie ................................................................................................ 39

B. Mucositis ........................................................................................................ 39

C. Dermatitis ....................................................................................................... 40

Discussie ................................................................................................................................... 41

1. Optimalisatie HRM protocols ...................................................................................... 41

1.1 XRCC3 c.722 C>T ................................................................................................. 41

1.2 Ku70 c.-1310 C>G ................................................................................................. 41

2. Associatiestudie naar chronische en acute radiosensitiviteit ........................................ 41

2.1 Chronische normale weefselcomplicaties .............................................................. 42

2.1.1 XRCC3 c.722 C>T .......................................................................................... 42

2.1.2 Ku70 c.-1310 C>G .......................................................................................... 42

2.1.3 TGFβ1 c.-509 C>T ......................................................................................... 43

2.1.4 TGFβ1 c.-800 G>A......................................................................................... 43

2.1.5 TGFβ1 c.74G>C ............................................................................................. 44

2.2 Acute normale weefselcomplicaties ...................................................................... 44

2.2.1 XRCC3 c.722C>T ........................................................................................... 45

2.2.2 Ku70 c.-1310 C>G .......................................................................................... 46

2.2.3 TGFβ1 c.-509 C>T ......................................................................................... 46

2.2.4 TGFβ1 c.-800 G>A......................................................................................... 46

2.2.5 TGFβ1 c.74G>C ............................................................................................. 47

Besluit ....................................................................................................................................... 47

Referentielijst ........................................................................................................................... 48

Bijlage A: Algemene patiëntgegevens ........................................................................................ i

1. Patiëntdata voor analyse naar chronische toxiciteit ........................................................ i

2. Patiëntdata voor analyse naar acute toxiciteit ............................................................... iii

Bijlage B: CTC-scores ............................................................................................................... v

Bijlage C: Gebruikte RFLP protocols ...................................................................................... vii

Bijlage D: Resultaten van de genotypering ............................................................................. viii

Bijlage E: Geoptimaliseerde HRM protocols ........................................................................... xii

1. XRCC3 c.722C>T......................................................................................................... xii

2. Ku70 c.-1310C>G ....................................................................................................... xiii

Bijlage F: Onderzochte dosisparameters ................................................................................. xiv

1. Chronische weefselcomplicaties ................................................................................. xiv

2. Acute weefselcomplicaties ........................................................................................... xv

Bijlage G: SNP associatie ....................................................................................................... xvi

1. Chronische weefselcomplicaties ................................................................................. xvi

2. Acute weefselcomplicaties ......................................................................................... xvii

Afkortingen

BSA Bovine Serum Albumine

cAMP Cyclic Adenosine Monophosphate

CRE cAMP Responsive Elements

CREB cAMP Responsive Element-Binding

CTC Common Toxicity Criteria

CTCAE Common Terminology Criteria for Adverse Events

DD Dosis-de-escalatie

dH2O Dnase en Rnase vrij gedestilleerd water

DMSO DiMethylSulfOxide

DNA DeoxyRiboNucleicAcid

DNA-PK(cs) DNA-afhankelijke Proteïne Kinase katalytische subunit

dNTP DeoxyNucleotideTrisPhosphate

DrW Drinks/Week

ds DNA Dubbel streng DNA

DSB Dubbel Streng Breuken

DVH Dosis Volume Histogram

ECM ExtraCellulaire Matrix

EDTA EthyleenDiamineTetraAcetaat

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor

EtBr EthydiumBromide

H&N Hoofd- en Hals (Head and Neck)

HE Heterozygoot

HK Heelkunde

HN Homozygoot Normaal

HNSCC Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

HR Homologe Recombinatie

HRM High Resolution Melting

HV Homozygoot Variant

HWE Hardy-Weinberg Equilibrium

IMRT Intenstiteit gemoduleerde Radiotherapie (Intensity Modulated Radiation Therapy)

IR Infrarood

KT Kamertemperatuur

LAP Latency Associated Peptide

MgCl2 MagnesiumdiChloride

MLC Multileaf Collimator

NCBI National Center for Biotechnology Information

NHEJ Niet Homologe End-Joining

nt Nucleotide

Oligo Calc Oligonucleotide properties Calculator

OR Odds Ratio

PBS Phosphate Buffered Saline

PC Faryngeale constrictorspieren (Pharyngeal Constrictor muscles)

PCR Polymerase Chain Reaction

PEG Percutane Endoscopische Gastrostomie

PY Pack Years

QOL Levenskwaliteit (Quality Of Life)

RBC Rode Bloed Cellen

RE Restrictie-Enzym

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RNS Reactive Nitrogen Species

ROS Reactive Oxygen Species

rpm Rounds per minut

RT Radiotherapie

SNP Single Nucleotide Polymorfisme

SPSS Statistical Package for the Social Sciences

ss DNA Enkelstrengig DNA (Single Stranded DNA)

Ta Annealings Temperatuur

Taq Thermus aquaticus

TBE Tris Boraat EDTA2NA

TE Tris EDTA

TF TranscriptieFactor

TGFβ Transforming Growth Factor Beta

Tm Smelttemperatuur (melting Temperature)

Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethaan

U Units

UES Upper Esophageal Sphincter

UV UltraViolet

UZG Universitair Ziekenhuis Gent

V Volt

1

Samenvatting

Radiotherapie (RT) is een belangrijk onderdeel van de behandeling van hoofd- en hals (H&N)

tumoren. Eén van de grote nadelen is dat ook een zeker volume gezond weefsel aanwezig is in

het bestralingsveld. De ontwikkeling van dermatitis, dysfagie en mucositis (acuut) en

xerostomie, fibrose en dysfagie (chronisch) vormt het grootste probleem bij de behandeling

van H&N tumoren met RT. In deze thesis werd onderzocht of bepaalde single nucleotide

polymorfisment (SNPs) geassocieerd zijn met de ontwikkeling van acute en chronische

weefselcomplicaties in een groep van hoofd- en hals kankerpatiënten behandeld met

intensiteit gemoduleerde radiotherapie (IMRT). Er werden SNPs onderzocht in DNA dubbel

streng breuk (DSB) herstelgenen (XRCC3 c.722C>T en Ku70 c.-1310C>G) en in het TGFβ1

gen (c.-509C>T, c.-800G>A, c.74G>C) wegens hun belangrijke rol in de weefselrespons na

de blootstelling aan ioniserende straling.

Van elk van de geïncludeerde patiënten werd DNA verkregen na isolatie uit lymfocyten of uit

vol bloed. De regio rond de te onderzoeken SNP werd via Polymerase Chain Reaction (PCR)

geamplificeerd. De uiteindelijke SNP bepaling werd uitgevoerd via Restriction Fragment

Length Polymorphism (RFLP) voor de SNPs in de TGFβ1 genen of via High Resolution

Melting (HRM) analyse voor de SNPs in de DNA DSB herstel genen. Gedurende deze thesis

werden de HRM protocols voor XRCC3 c.722C>T en Ku70 c.-1310C>G geoptimaliseerd.

Voor het onderzoek naar chronische weefselcomplicaties (fibrose, xerostomie en dysfagie)

werd een groep van 61 H&N kankerpatiënten geïncludeerd. Binnen deze groep bleek het

TGFβ1 c.-800 GA genotype significant geassocieerd te zijn met een verhoogd risico op de

ontwikkeling van ernstige fibrose.

Met betrekking tot acute weefselcomplicaties (dermatitis, mucositis en dysfagie) werd een

groep van 79 nieuw verzamelde H&N kankerpatiënten geanalyseerd. De TGFβ1 c.74G>C

SNP werd geassocieerd met een verhoogd risico bij de ontwikkeling van ernstige mucositis.

Deze bevinding was bij de aanwezigheid van 1 of 2 variante allelen significant. In

tegenstelling tot de chronische complicaties, verklaren de dosisparameters een deel van de

acute stralingstoxiciteiten. De gemiddelde dosis (Dmean) op de skin5mm, bovenste faryngeale

constrictorspier (SPC), mondholte en mucosa spelen een rol in de ontwikkeling van

dermatitis, dysfagie en mucositis respectievelijk. Concomitante chemotherapie verhoogt

significant het risico op de ontwikkeling van ernstige acute dysfagie en blijkt een risicofactor

voor de ontwikkeling van ernstige mucositis.

Inleiding

2

Inleiding

1. Hoofd- en halskanker

Hoofd- en halskanker (H&N kanker) is met een wereldwijde incidentie van 650000 gevallen

per jaar, een relatief veel voorkomende kanker (6% van alle kankers wereldwijd) [1]. De

incidentie van H&N kanker stijgt met de leeftijd en bereikt een maximum rond de leeftijd van

50 jaar [2]. Dit type kanker komt frequenter voor bij mannen dan bij vrouwen (man:vrouw

ratio van 4-5:1) [3].

1.1 Types Tumoren

H&N kanker is een verzamelnaam voor een heterogene groep tumoren die voornamelijk

ontstaan in de mondholte, farynx (nasofarynx, orofarynx, hypofarynx) en larynx (supraglottis,

glottis, subglottis) (figuur 1.1). De identificatie van de anatomische locatie is belangrijk voor

de klinische classificatie van de tumoren en bijgevolg voor de gebruikte behandelingsmethode

[4].

Figuur 1.1: Anatomie van de H&N regio. Bron: Vokes et al. [4]

De tumoren kunnen verder gekarakteriseerd worden door hun verschillende histologische

oorsprong. Het grootste deel van de tumoren (85%) zijn de epidermoid epitheliomas of

squameuze carcinomas (HNSCC). Deze ontstaan in de cellen die de muceuze oppervlaktes

aflijnen ter hoogte van het respiratoir en digestieve stelsel, namelijk de plaveiselcellen. Eerder

zeldzame histologische varianten zijn de verruceuze, basaloide, papillaire, adenoid, spoelcel -

en adenocarcinoma [5].

Inleiding

3

1.2 Behandeling

1.2.1 Chirurgie, chemotherapie en cetuximab

Chirurgie is vooral belangrijk bij de behandeling van resecteerbare tumoren ter hoogte van de

larynx, hypopharynx en oropharynx. De resectie van tumorweefsel gaat echter dikwijls

gepaard met een verlies aan gezond weefsel en/of functionaliteit van bepaalde weefsels. Na

chirurgie kunnen de patiënten o.a. praat- en slikproblemen ontwikkelen zoals het geval is bij

een volledige laryngectomie. Na chirurgie zal meestal een bijkomende adjuvante therapie

(radiotherapie, RT en/of chemotherapie) volgen om eventueel niet-waarneembare uitzaaiingen

te bestrijden en het risico op herval te vermijden [7].

Het standaard chemotherapeuticum dat gebruikt wordt bij de behandeling van H&N kanker is

het platinumderivaat cisplatinum [1]. Cisplatinum interageert met het DNA van sneldelende

(kanker)cellen. Indien de DNA schade niet hersteld wordt, zal dit aanleiding geven tot

geprogrammeerde celdood (apoptose) van deze cellen [8]. Door de systemische werking van

chemotherapie, kan deze therapie gepaard gaan met complicaties zoals haarverlies,

misselijkheid en anemie. Meestal wordt bij de behandeling van HNSCC chemotherapie in

combinatie met RT (concomitant) toegediend. De combinatie van beide cytotoxische agentia

leidt tot een meer efficiënte behandeling H&N tumoren [9].

Sinds kort werd bij de behandeling van H&N kanker ook target gerichte therapie

geïntroduceerd. Het standaard moleculair target agent dat hierbij wordt gebruikt is cetuximab.

Cetuximab is een monoclonaal antilichaam gericht tegen de epidermale groei factor receptor

(EGFR). Dit antilichaam wordt ook meestal in combinatie gebruikt met RT en zal het

cytotoxisch effect van de bestraling bevorderen wat leidt tot een verhoogde overleving en

tumorcontrole [10]. Een belangrijk nadeel van deze therapie is het optreden van dermatitis dat

in sommige gevallen zeer ernstige vormen kan aannemen. Giro et al. toonden een ernstige

huidtoxiciteit aan in 50% van de behandelde patiënten [11].

1.2.2 Radiotherapie

RT is een algemeen gebruikte techniek bij de behandeling van H&N kanker. Een standaard

RT protocol bestaat uit een gefractioneerde dosistoediening van 2Gy/fractie 5dagen/week

gedurende 7 weken [7]. RT is, in tegenstelling tot chirurgie, geen invasieve techniek. In

vergelijking met chemotherapie heeft RT het grote voordeel dat het een eerder lokale

behandeling is die geen systemische bijwerkingen teweegbrengt. Bij RT worden ioniserende

stralen (IR) gebruikt om de tumorcel zodanig te beschadigen dat ze afsterft. Met de

Inleiding

4

vooruitgang in de gebruikte technologieën wordt de stralingsbundel voornamelijk gericht op

het carcinogeen weefsel waarbij het gezond weefsel een zo laag mogelijke stralingsdosis

krijgt. Naast het tumorweefsel is ook een zeker volume van het omliggende gezonde weefsel

onvermijdelijk in de stralingsbundel aanwezig, waardoor lokaal ongewenste complicaties van

het normale weefsel kunnen optreden [12]. Deze complicaties waren de basis voor het

onderzoek naar een alternatieve techniek waarbij de dosis ter hoogte van het normale weefsel

werd geminimaliseerd: de intensiteit gemoduleerde RT (IMRT). Bij deze techniek worden

meerdere stralingsbundels gebruikt waarbij de intensiteit van de bundels met behulp van

multileaf collimatoren (MLCs) zodanig gemoduleerd wordt dat er een reductie optreedt van

de dosis ter hoogte van het gezonde weefsel, terwijl het tumorweefsel de vereiste hogere

homogene dosis krijgt [13].

2. Weefselreacties bij H&N kankerpatiënten na radiotherapie

2.1 Introductie

Zoals reeds vermeld in sectie 1.3.1 kan bij de behandeling van H&N tumoren met IMRT ook

het gezond weefsel ernstig beschadigd worden waardoor ongewenste weefselreacties kunnen

ontstaan [12,14]. Omdat tumoren behorend tot de groep van H&N kanker, gelegen zijn in een

functioneel kritische regio, kunnen weefselcomplicaties in deze omgeving een sterke daling

van de levenskwaliteit (QOL) veroorzaken. Zo kunnen na bestraling bepaalde fysiologische

functies, zoals de eet- en spraakmogelijkheid, en het uitzicht van de patiënt beïnvloed worden

[7,15].

Bij de behandelde patiënten wordt onderling een grote variabiliteit gezien in de ernst van de

bijwerkingen, gaande van bijna afwezig tot zeer ernstig. Dit wordt zelfs gezien bij patiënten

die een gelijkaardig behandelingsschema ondergingen. De patiënten krijgen voor de

verschillende weefselreacties een score, gaande van 1 tot 5, afhankelijk van de ernst van de

toxiciteit. Hierbij wordt gebruik gemaakt van de Common Terminology Criteria for Adverse

Events v3.0 (CTCAEv3.0) schaal [16].

De variabiliteit in ernst van bijwerkingen tussen de patiënten wordt deels (±30%) verklaard

door therapiegerelateerde factoren (de gebruikte dosis, het bestraalde weefselvolume, de

fractionatie,…) en patiëntspecifieke factoren (rookgedrag1, geslacht, leeftijd en

alcoholgebruik2). Uit verschillende studies betreffende zeldzame genetische syndromen zoals

1 Het rookgedrag wordt uitgedrukt in pack-years (PY): (aantal sigaretten per dag/20) x aantal jaren gerookt. 2 Het alcoholgebruik wordt uitgedrukt in drinks/week (DrW) ongeacht het soort drank (bier, wijn, sterke drank).

Inleiding

5

Ataxia Telangiectasia en het Nijmengen Breakage Syndroom werd reeds gesuggereerd dat de

genetische achtergrond ook aan de basis kan liggen van de inter-individuele verschillen in

stralingsgevoeligheid. Deze syndromen worden enerzijds gekenmerkt door mutaties in genen

betrokken in de detectie van DNA schade en herstel en anderzijds door een extreem

verhoogde stralingsgevoeligheid van de patiënten [17,18]. Voor de grootste met groep RT-

behandelde patiënten (±70%) wordt dus aangenomen dat ook de genetische achtergrond een

belangrijke rol speelt voor de variabiliteit in ernst van de optredende weefselreacties [14]. Het

onderwerp van deze thesis kadert in deze problematiek.

Wegens het optreden van ernstige bijwerkingen bij een niet te verwaarlozen aantal patiënten,

wordt bij het bepalen van de tumordosis rekening gehouden met de tolerantiedosis van de

normale weefsels aanwezig in het bestralingsveld. Hierbij wordt een maximale vernietiging

van de tumorcellen met een aanvaardbaar risico op complicaties nagestreefd [12,19].

De weefselcomplicaties kunnen onderverdeeld worden in 3 groepen. Enerzijds heeft men de

acute weefselcomplicaties, deze treden typisch op tijdens of enkele weken na RT en zijn

voornamelijk het resultaat van depletie van parenchymale cellen (hypoplasie) en beschadiging

van stamcellen waardoor de normale turn-over van het weefsel verstoord is [20]. Indien de

complicaties zich maanden (≥6maanden) tot jaren na de therapie ontwikkelen spreekt men

over late (chronische) weefselcomplicaties [21]. Als derde groep onderscheidt men ook nog

de consequentiële late effecten. Dit zijn ‘late’ weefselreacties die ontstaan uit voormalige,

persisterende acute complicaties [22]. Voor deze scriptie werden enkel de acute en late

toxiciteiten beschouwd.

2.2 Types weefselreacties

2.2.1 Mucositis

Mucositis is een inflammatiereactie van de slijmvliezen die ontstaat tijdens of na bestraling

door een beschadiging en verlies van de mucosale membranen en het onderliggende zachte

weefsel [23]. Bijna alle H&N kankerpatiënten die behandeld worden met RT (98%)

ontwikkelen mucositis. Hierbij ontwikkelt 28% van deze patiënten een zeer ernstige vorm

(CTC 3-4) [24]. Het klinisch beeld wordt gekenmerkt door het optreden van erytheem,

ulceraties en pijn. Deze kunnen enerzijds leiden tot eet-, slik- en praatmoeilijkheden wat de

QOL van de patiënten ondermijnt. Anderzijds is mucositis de meest significante

dosislimiterende weefselcomplicatie. De symptomen zijn dikwijls zo ernstig dat de

Inleiding

6

stralingsdosis moet gereduceerd worden of de therapie (tijdelijk) moet worden stopgezet.

Hierdoor heeft mucositis ook een indirect effect op de tumor respons [25].

2.2.2 Dermatitis

Dermatitis is een inflammatie van de huid. Bij bestraling kunnen de radiosensitieve

progenitorcellen in de basale laag van de epidermis beschadigd worden en afsterven. Hierdoor

worden de gedesquameerde cellen ter hoogte van het epitheel niet meer vervangen, waardoor

de epidermis geleidelijk aan ‘verdwijnt’ en de dermis bloot komt te liggen. Typische

kenmerken van dermatitis zijn huiderytheem, hyperpigmentatie, haarverlies, droge en

vochtige desquamatie [23].

2.2.3 Xerostomie

Xerostomie of verminderde en meer visceuze speekselproductie ontstaat door bestraling van

de speekselklieren. De speekselproductie kan hierbij dalen tot meer dan 50% na 1 week, en

tot 90% tijdens de 2e week van de behandeling [23]. Het is een frequent voorkomende

toxiciteit die voornamelijk als chronisch beschreven wordt. Belangrijke gevolgen van

xerostomie zijn een verminderde orale hygiëne, periodieke microbiële infecties,

moeilijkheden bij het slikken en kauwen met wijziging van het dieet als gevolg, cariës en een

verminderde smaak wegens aantasting van de tong [26]. Alhoewel het gebruik van IMRT al

geresulteerd heeft in een betere sparing van de parotisklieren blijft xerostomie nog steeds een

belangrijke complicatie [23].

2.2.4 Dysfagie

De meest kritische weefselreactie na RT bij H&N kankerpatiënten is dysfagie

(slikmoeilijkheden) waarbij het normale eetpatroon van de patiënt in het gedrang kan komen.

Dysfagie kan zowel acuut als laat optreden. Kritische structuren bij het ontstaan van dysfagie

zijn de circulaire faryngeale constrictorspieren (PCs). Deze zijn belangrijk in de de faryngeale

fase van het slikproces (propulsie van voedsel). Dysfunctie van de PCs na RT voor H&N

kankerpatiënten werd reeds beschreven als de belangrijkste oorzaak voor het optreden van

dysfagie [27]. Degeneratie en verlies van elasticiteit van de PCs kan leiden tot nutritionele

deficiëntie met gewichtsverlies en langdurige sondevoeding (percutane endoscopische

gastrostomie, PEG). Bij het ontstaan van aspiratiepneumonie3 kan dysfagie zelfs

3 Aspiratie van bepaalde stoffen zoals voedsel waardoor het longweefsel ontsteekt.

Inleiding

7

levensbedreigend zijn [28]. Bij de meeste patiënten keert de normale slikfunctie ongeveer 3

maanden na de therapie terug. Een bepaalde groep patiënten ontwikkelen de slikproblemen

pas jaren na de behandeling. De voortdurende cascade van cytokines, hypoxie en chronische

oxidatieve stress resulteert in fibrotisch weefsel en stramheid. Samen met oedeem, atrofie en

neuronale schade kan dit leiden tot functieverlies en chronische dysfagie als gevolg [29].

2.2.5 Fibrose

Fibrose is een belangrijke late weefselcomplicatie na concomitante RT en wordt beschouwd

als een nooit genezende wonde. Tijdens een normale wondheling worden fibroblasten

transiënt geactiveerd tot myofibroblasten, wat leidt tot proliferatie en collageenafzetting. Na

wondheling zullen deze myofibroblasten in apoptose gaan. Tijdens een fibrotische reactie is

deze feedback controle afwezig wat resulteert in chronisch geactiveerde myofibroblasten,

overmatige collageenafzetting en extracellulaire matrix (ECM) productie. Hierdoor wordt het

normale weefsel atrofisch en vervangen door littekenweefsel. Een mogelijke oorzaak van

deze chronische cellulaire activatie is een stralingsgeïnduceerde verandering in de expressie

van bepaalde cytokines, chemokines en groeifactoren door macrofagen, endotheelcellen en

fibroblasten [30].

2.3 Het herstel van RT geïnduceerde DNA DSBs

IR zoals gebruikt bij RT, kunnen verschillende types van DNA schade veroorzaken

waaronder enkelstrengbreuken, dubbel streng breuken (DSB) en beschadiging van basen.

Hiervan zijn de DSBs voornamelijk verantwoordelijk voor het optreden van de

radiobiologische effecten. Niet herstelde DSBs zijn namelijk kritisch voor het optreden van

stralingsgeïnduceerde celdood. Een haperende of volledig deficiënte respons op de inductie

van dit type breuken kan de stralingsgevoeligheid van de cellen en als gevolg de gevoeligheid

voor ernstige normale weefselcomplicaties bepalen [31].

De twee belangrijkste pathways voor het herstel van DSBs zijn de homologe recombinatie

(HR) en de niet-homologe end Joining (NHEJ). Terwijl in mammalia de NHEJ voornamelijk

tussenkomt bij het DNA herstel in de G1 en M fase van de celcyclus, is de HR de

belangrijkste pathway voor DSB herstel tijdens de S en G2 fase. Een schematisch overzicht

van de HR en NHEJ is weergegeven in figuur 1.2 [32].

Inleiding

8

Figuur 1.2: Schematische voorstelling van de HR (A) en de NHEJ (B) Bron: aangepast uit Weterings et al. [32]

A. Homologe recombinatie

Door de sterke sequentiehomologie die gebruikt wordt tijdens de HR is dit herstelmechanisme

zeer accuraat. Tijdens de HR worden de DNA uiteinden van de DSB geresecteerd in de 5’

→3’ richting met behulp van het MRN complex bestaande uit Mre11, RAD50 en NBS1. De

enkelstrengige 3’ uiteinden die hierbij ontstaan zullen na binding met RAD51 een

nucleoproteine filament vormen dat zal interageren met de homologe niet-beschadigde DNA

molecule. Dit bindingsproces wordt beïnvloed door andere eiwitten waaronder het replicatie

proteïne A (RPA), RAD52 en RAD54. Verschillende RAD51 paralogen zoals RAD51B, C,

D, XRCC2 en XRCC3 interageren, al dan niet op een directe manier, met RAD51. Na

lokalisatie van de homologe regio zal een uitwisseling plaatsvinden waarbij het beschadigde

DNA de niet-beschadigde homologe DNA duplex invadeert met vorming van een

‘displacement loop’ (D-loop). Het 3’ uiteinde van de beschadigde molecule zal verder worden

verlengd d.m.v. een DNA polymerase, die informatie kopieert van de niet-beschadigde

partner. Finaal worden de DNA uiteinden geligeerd door de inwerking van het DNA ligase I

(figuur 1.2) [32,33].

B. Niet homologe end-joining

In tegenstelling tot de HR is voor het herstel van DSBs d.m.v. NHEJ geen homologie vereist.

Deze methode is hierdoor gevoeliger aan fouten en dus minder accuraat. Een centrale

molecule binnen de NHEJ is het Ku-complex. Dit is een heterodimeer complex bestaande uit

Inleiding

9

twee subunits: Ku70 (XRCC6) en Ku80 (XRCC5). Dit heterodimeer kan d.m.v. zijn open

ringstructuur binden aan de beide DNA-uiteinden die ontstaan bij de DSB inductie. De

binding van het heterodimeer beschermt enerzijds de uiteinden tegen verdere degradatie en

zorgt er anderzijds voor dat andere componenten van de NHEJ de DSB kunnen bereiken.

Door binding van het Ku-complex wordt het DNA-afhankelijke proteïne kinase katalytische

subunit (DNA-PKcs) aangetrokken en vormt dit samen met het heterodimeer het DNA-

afhankelijk proteïne kinase (DNA-PK; XRCC7). Dit kinase is eveneens een sleutelmolecule

in de NHEJ en zal enkel functioneel zijn in associatie met het DNA gebonden Ku-eiwit. Naast

het samenbrengen van de DNA uiteinden zal dit kinase ook instaan voor de fosforylatie van

bepaalde targetmoleculen waaronder XRCC4. XRCC4 vormt een complex met Ligase IV dat

verantwoordelijk is voor de ligatie van de DNA uiteinden. Vooraleer deze ligatie kan

gebeuren, worden de DNA uiteinden bewerkt tot ligeerbare uiteinden. In dit proces zijn

verschillende nucleasen en polymerasen betrokken [32,33].

2.4 TGFβ1

2.4.1 Inleiding

Zoals eerder vermeld is fibrose één van de voornaamste late weefselcomplicaties na RT. Het

ontstaan van fibrotisch weefsel ter hoogte van de H&N regio kan aanleiding geven tot de

ontwikkeling van late slikproblemen. Een sleutelmolecule bij het ontstaan van fibrose is

transforming growth factor β (TGFβ). TGFβ is een multifunctionele cytokine dat betrokken is

bij drie belangrijke biologische functies. Naast zijn functie bij de aanmaak van ECM en

collageen, speelt de molecule ook een rol in de regulatie van celgroei-inhibitie en oefent hij

een immuunsuppressieve activiteit uit [30]. Van de 3 gekende isovormen (TGFβ1-3) is

TGFβ1 de dominant voorkomende in humaan plasma (>95%) [34].

2.4.2 Signaalpathway

TGFβ wordt gesecreteerd als een inactief, latent complex. Pas na klieving van het ‘latency

associated peptide’ (LAP) kan TGFβ binden aan zijn functionele receptor (TGFβR1-

TGFβR2). IR is één van de weinige exogene factoren die een activatie van TGFβ kan

induceren (figuur 1.3). IR kan enerzijds zorgen voor een directe activering van TGFβ door

dissociatie van het LAP. Anderzijds leidt blootstelling aan IR tot beschadiging van

endotheliale cellen wat op zich leidt tot een vrijstelling van pro-fibrotische cytokines

waaronder TGFβ. Ook reactieve zuurstof species (ROS) en reactieve stikstof radicalen (RNS),

Inleiding

10

die ontstaan na bestraling, resulteren in een activatie van TGFβ. Na binding van TGFβ aan

zijn functionele receptor wordt o.a. de Smad-signaalcascade geactiveerd. Dit resulteert in

gentranscriptie waardoor de proliferatie en activatie van fibroblasten wordt geïnduceerd. Dit

resulteert uiteindelijk in een verhoogde aanmaak van ECM en collageenafzetting. Deze

fibrotische reactie blijft mogelijk tot stand door de ontstane weefselhypoxie na

stralinggeïnduceerde vasculaire schade [35].

Figuur 1.3: Sleutelcomponenten tijdens stralingsgeïnduceerde fibrose Bron: Bentzen et al. [35]

2.5 SNPs en de ontwikkeling van normale weefselcomplicaties

2.5.1 SNPs

Single nucleotide polymorfismen of SNPs maken 90% uit van de natuurlijk voorkomende

sequentievariatie. SNPs zijn laag penetrante genetische veranderingen waarbij een base

vervangen wordt door een andere base en de variant een minor allel frequentie heeft groter

dan 1%. De meeste SNPs zijn ‘silent’ en zullen geen effect hebben op de genfunctie en

Inleiding

11

expressie. Een klein deel van de SNPs echter zijn gelegen in (exon) en rondom (o.a.

promotor) gensequenties en kunnen zo de expressie en functie van deze beïnvloeden [36,37].

SNPs in kritische regio’s van genen betrokken in het herstel van DSBs en in TGFβ1 kunnen

dus de werking van de resulterende proteïnen en cytokine beïnvloeden. Hierdoor kunnen

SNPs aan de basis liggen van het optreden van variaties in de ernst van normale

weefselcomplicaties na RT. Er zijn heel wat proteïnen betrokken bij DSB herstel en in de

TGFβ pathway. Er werden 2 SNPs in DSB herstelgenen (Ku70 c.-1310 en XRCC3 c.722) en 3

SNPs in het TGFβ1 gen geselecteerd.

2.5.2 TGFβ1 c.-509 C>T en TGFβ1 c.-800 G>A

TGFβ1 c.-509C>T (of c.-1347 C>T) en TGFβ1 c.-800G>A (of c.-1638 G>A) zijn SNPs

gelegen in de promotor regio van het TGFβ1 gen. SNPs in de promotor regio van een gen

kunnen de expressie van dit gen veranderen en hierdoor de concentratie van het circulerend

eiwit beïnvloeden. Dit werd aangetoond voor het TGFβ1 c.-509 HV genotype (TT) in de

studie van Grainger et al. waarin dit genotype significant geassocieerd werd met een

verhoging van de circulerende TGFβ1 concentratie [38]. Reeds meerdere studies met

betrekking tot verschillende tumoren beschreven de TGFβ1 c.-509 SNP als een risicofactor

bij de ontwikkeling van late weefselcomplicaties na behandeling met RT [20,39-41]. Ondanks

deze resultaten bestaat er geen consensus over de invloed van de SNP op de functie van het

resulterende proteïne [42-44].

De TGFβ1 c.-800G>A SNP is gelegen in een consensus gebied van de CREB4 (cAMP

responsive element-binding) familie van transcriptiefactoren (TF) waardoor deze SNP

mogelijks een invloed heeft op de transcriptionele functionaliteit van deze TF [38]. In de

literatuur verschenen slechts een beperkt aantal artikels die de associatie van deze SNP en de

ontwikkeling van weefselcomplicaties na RT onderzochten [39,41].

2.5.3 TGFβ1 c.74 G>C

De TGFβ1 c.74 G>C SNP is een SNP gelegen in exon 1 van het TGFβ1 gen. Dit exon bevindt

zich in de signaal peptide van het TGFβ1 eiwit waardoor deze SNP het transport van het eiwit

doorheen het endoplasmatisch reticulum zou kunnen beïnvloeden [39]. Uit de in vitro studie

van Awad et al. bleek dat homozygositeit voor het normale allel van deze SNP gepaard gaat

met een hogere productie van TGFβ1 [45]. Onderzoek van deze SNP en de ontwikkeling van 4 CREB is een transcriptiefactor die bindt aan specifieke DNA sequenties, meerbepaald de cAMP responsive elements (CRE) .

Inleiding

12

weefselcomplicaties na RT bij H&N kankerpatiënten werd tot nog toe niet onderzocht. Ook

bij andere kankertypes werd geen associatie gevonden [39-41].

2.5.4 Ku70 c.-1310 C>G

Zoals blijkt uit sectie 2.3.B is Ku70 een centrale molecule binnen de NHEJ. Samen met het

Ku80 eiwit vormt hij een heterodimeer complex dat vroeg in NHEJ-signaalcascade bindt aan

de DNA uiteinden die ontstaan na de inductie van een DSB. De Ku70 c.-1310 C>G SNP is

een SNP gelegen in de promotorregio van het Ku70 gen. Reeds verschillende studies toonden

aan dat de afwezigheid of verminderde aanwezigheid van het Ku70 eiwit in cellijnen de

stralingsgevoeligheid van deze cellen verhoogt [46,47]. Een SNP in de promotorregio van dit

gen zou de concentratie van Ku70 en aldus de stralingsgevoeligheid kunnen beïnvloeden. In

de literatuur werd nog maar weinig onderzoek verricht met betrekking tot deze SNPs en

radiosensitiviteit [48 19].

2.5.5 XRCC3 c.722 C>T

XRCC3 is één van de 5 RAD51 paralogen dat interageert met RAD51 bij zijn functie in de

HR (sectie 2.3.A) [33]. De XRCC3 c.722 C>T SNP is gelegen in codon 241 van het gen. Het

is een SNP die een aminozuurwijziging (Thr-Met) in het XRCC3 eiwit teweegbrengt. Deze

SNP bevindt zich in de nabijheid van het Phe249 residu. Dit residu is een essentieel

aminozuur ter hoogte van de RAD51-bindingsplaats. De aanwezigheid van de SNP zou de

interactie tussen XRCC3 en RAD51kunnen beïnvloeden [49].

De associatie van de XRCC3 c.722 SNP en de ontwikkeling van acute weefselcomplicaties

werd net als de voornoemde Ku70 SNP binnen de eigen onderzoeksgroep onderzocht in een

populatie H&N kankerpatiënten [19]. Met betrekking tot andere types tumoren werd ook in

andere studies onderzoek gedaan naar de associatie van deze SNP en de ontwikkeling van

acute en late weefselcomplicaties na RT. Met betrekking tot de resultaten van deze

onderzoeken werd echter geen consensus gevonden [40,43, 50-52].

3. Doelstelling

De ernstige acute en late weefselcomplicaties die optreden bij een bepaalde subgroep RT-

behandelde H&N kankerpatiënten behandeld met RT vormen een groot probleem. Deze

weefseltoxiciteiten kunnen resulteren in een verhoogde morbiditeit en mortaliteit en een

verminderde QOL [23]. Bij het optreden van weefselcomplicaties bij de behandelde H&N

Inleiding

13

kankerpatiënten ziet men een variabiliteit in de ernst van deze reacties. Voor de grootste groep

patiënten (±70%) wordt hierbij aangenomen dat de genetische achtergrond een belangrijke rol

speelt [14].

In deze scriptie zal de associatie onderzocht worden tussen de hierboven aangehaalde SNPs in

DSB herstelgenen en TGFβ1 en de ontwikkeling van ernstige acute en late normale

weefselcomplicaties in een groep van RT behandelde H&N kankerpatiënten. Het doel is om

genetische variaties te identificeren die de ontwikkeling van ernstige acute en late

weefselcomplicaties kunnen voorspellen voor de start van de therapie. Hierdoor zouden de

meest radiosensitieve patiënten kunnen geïdentificeerd worden met een in de toekomst

mogelijke individualisering van het behandelingsschema.

In een eerste luik van deze thesis wordt de associatie onderzocht tussen SNPs in DNA

herstelgenen en TGFβ1 en het optreden van chronische weefselcomplicaties (chronische

dysfagie, fibrose en xerostomie). De SNPs die hierbij zullen worden onderzocht zijn XRCC3

c.722C>T, Ku70 c.-1310C>G, TGFβ1c.-509C>T, TGFβ1 c.-800G>A en TGFβ1 c.74G>C.

In een tweede luik wordt in een nieuw verzamelde groep H&N kankerpatiënten de relatie

onderzocht tussen de eerder vermelde SNPs en het optreden van acute weefselcomplicaties

(dysfagie, mucositis en dermatitis). Deze groep omvat naast patiënten die een standaard

IMRT behandeling kregen (standaardgroep) ook patiënten uit de dosis de-escalatie (DD)

studie, die op de vakgroep “RT en experimenteel kankeronderzoek” loopt [53]. In deze thesis

zullen gegevens van patiënten uit de DD studie ook afzonderlijk vergeleken worden met de

data van patiënten die een standaard IMRT therapie ondergingen.

Materialen en Methoden

14

Materialen en Methoden 1. Introductie

In deze thesis werd de associatie nagegaan tussen 5 SNPs en het optreden van acute en late

normale weefselcomplicaties. Hiervoor werden bloedstalen verzameld van patiënten met een

primaire H&N tumor, behandeld met IMRT in het Universitair Ziekenhuis Gent (UZG). Uit

deze stalen werd het DNA uit lymfocyten of direct uit vol bloed geïsoleerd. Door gebruik te

maken van specifieke primerparen werd het DNA fragment dat de te onderzoeken polymorfe

plaats bevat geamplificeerd via Polymerase Chain Reaction (PCR). De uiteindelijke SNP

bepaling werd uitgevoerd d.m.v. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) of High

Resolution Melting (HRM) analyse.

2. Studiepopulatie

Voor deze scriptie werden bloedstalen verzameld van 79 H&N kankerpatiënten die behandeld

werden met IMRT op de dienst RT van het UZ Gent. Hiervan werden er 52 gedurende het

jaar van deze scriptie gecollecteerd, de overige stalen werden reeds verzameld binnen de

onderzoeksgroep. De studiepopulatie voor de analyses naar acute weefseltoxiciteiten

(dermatitis, mucositis en dysfagie) bestond uit 67 mannen (85%) en 12 vrouwen (15%). De

gemiddelde leeftijd van de patiënten op het tijdstip van de therapie bedraagt 60.9 jaar

(spreiding: 43-86 jaar). Deze groep bevat 46 patiënten uit de DD groep en 33 patiënten uit de

standaardgroep.

Voor de analyses naar late weefseltoxiciteiten (fibrose, xerostomie en dysfagie) werden 61

patiënten geïncludeerd, waarvan 51 mannen (84%) en 10 vrouwen (16%). Deze patiënten

vormen een subgroep van de populatie geïncludeerd in een reeds gepubliceerd onderzoek naar

acute radiosensitiviteit[19]. De gemiddelde leeftijd van deze populatie was 59.7 jaar

(spreiding: 40-80). De patiënten waren gemiddeld 4.1 jaar in follow-up (spreiding: 2.7-5.3)

Naast RT onderging een deel van de patiënten ook chemotherapie en/of chirurgie (heelkunde,

HK). Een overzicht van de verkregen behandelingen van de patiënten geïncludeerd in de

analyses naar acute en late toxiciteiten worden weergegeven in tabel 2.1.

Van elke patiënt die deelneemt aan de studie werd gevraagd een lijst in te vullen voor het

verkrijgen van informatie betreffende hun rook- en drinkgedrag. Deze gegevens, inclusief

leeftijd en geslacht staan beschreven in bijlage A.


15

Tabel 2.1: Overzicht behandelingen

Behandeling Acute weefseltoxiciteiten Late weefseltoxiciteiten

n (%) n (%)

Exclusief RT 25 (31.6) 21 (34.5)

Adjuvante RT na heelkundige ingreep 13 (16.5) 15 (24.5)

Heelkunde gevolgd door radiochemotherapie 4 (5.1) 16 (26.2)

Chemoradiotherapie* 37 (46.8) 9 (14.8) Afkortingen: RT = radiotherapie *2 patiënten kregen bijkomend een behandeling met cetuximab

De acute stralingsgeïnduceerde weefselcomplicaties namelijk faryngeale en oesofageale

dysfagie, mucositis en dermatitis werden wekelijks gescoord gebruik makend van de

CTCAEv3.0 schaal [16]. Voor de late weefselcomplicaties meer bepaald fibrose, xerostomie,

late faryngeale en oesofageale dysfagie gebeurde de scoring gedurende het jaar na de therapie

om de 3 maanden, gedurende het 2e jaar om de 4 maanden en gedurende het 3e, 4e en 5e jaar

om de 6 maanden. Men beschouwt de complicaties die optreden vanaf 6 maanden na de

therapie als late weefselcomplicaties. De CTC-scores voor de verschillende

weefselcomplicaties staan beschreven in bijlage B.

Vóór bloedafname werd aan de patiënten gevraagd een ‘informed consent’ te ondertekenen.

Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Comité van het UZG.

3. Dosimetrische gegevens

De stralingsdosis die de normale weefsels ontvangen is een eerste bepalende factor voor het

ontstaan van stralingstoxiciteiten. De dosis-volume histogrammen (DVHs) van de weefsels

die een kritische rol spelen in de ontwikkeling van de acute en late weefselcomplicaties

werden bestudeerd. De DVHs van deze kritische structuren werden bekomen van de dienst

RT van het UZG. Op basis van deze informatie werd de gemiddelde dosis (Dmean) op elk van

de structuren berekend.

De kritische structuren die werden onderzocht bij het ontstaan van dysfagie (acuut/laat) zijn

de PCs (UPC, MPC en IPC), de supraglottis (larynx), het bovenste deel van de slokdarm

(upper eosofagus) en de sfinkter aldaar (upper oesophageal sphincter, UES).Voor deze

structuren werd naast de Dmean ook de minimale dosis op de omtrek5 (Dmin_circumferentie) in

5 Dmin_circumferentie wordt gedefinieerd als de laagste isodose die de twee naburige craniocaudale faryngeale constrictorspieren omvat.


16

rekening gebracht. Skin5mm6 is de structuur die gelinkt wordt aan optreden van dermatitis. De

Dmean ter hoogte van de mondholte en de mucosa werd onderzocht voor een mogelijke

associatie met het ontstaan van acute mucositis. Met betrekking tot xerostomie is de Dmean op

de rechter en linker parotisklier een bepalende factor. Voor fibrose werd de Dmean ter hoogte

van de subcutis onderzocht [19,27].

4. DNA purificatie

De isolatie van het genomisch DNA gebruikt tijdens deze scriptie gebeurde direct uit humaan

bloed (EDTA buis) of uit humane lymfocyten die reeds geïsoleerd werden uit heparine buisjes

en ingevroren in vloeibare stikstof (-196°C).

Voor de DNA purificatie uit vol bloed worden als eerste de rode bloedcellen (RBC)

gelyseerd. Hiervoor wordt 3 ml vol bloed toegevoegd aan 9 ml RBC-lyse oplossing (Qiagen).

De buisjes worden gedurende 5 min op kamertemperatuur (KT) gehouden en tussentijds

enkele malen omgekeerd. Na de incubatie worden de buisjes 2 min aan 2000xg (4600 rpm)

centrifugeerd (Centrifuge 5415 R, Eppendorf) en wordt het supernatans bijna volledig

verwijderd. Om de verkregen celpellet op te lossen in de overgebleven vloeistof worden de

buisjes hevig gevortext (Genius3, IKA). Vervolgens wordt de cellyse oplossing toegevoegd (3

ml). Na deze stap kan het protocol ongeveer 2 jaar onderbroken worden. Voor de isolatie van

DNA uit lymfocyten worden de cellen na ontdooiing overgebracht in 1.5 ml epjes waarna ze

gedurende 5 min gecentrifugeerd worden aan 300xg (1800 rpm). Vervolgens wordt, na

verwijderen van het supernatans, de verkregen celpellet geresuspendeerd in phosphate

buffered saline (PBS) (Invitrogen) tot een totaalvolume van 200 µl. Wederom worden de

epjes gecentrifugeerd gedurende 10 sec aan 16000xg (13100 rpm). Het supernatans wordt

verwijderd met behoud van 40 µl vloeistof. Om de cellen in de overgebleven vloeistof op te

lossen, wordt hevig gevortext. Na deze stap wordt de cellyse oplossing (Qiagen) toegevoegd

(600 µl) en kan ook hier het protocol ongeveer 2 jaar onderbroken worden.Voor de verdere

DNA isolatie wordt voor zowel humaan bloed (●) als voor humane lymfocyten (♦) een

gelijkaardig protocol gebruikt. Na de cellyse worden de aanwezige eiwitten geprecipiteerd.

Hiervoor wordt proteïne precipitatie buffer toegevoegd aan het cellysaat (●: 1 ml; ♦: 200 µl)

waarna gedurende 20 sec aan hoge snelheid gevortext wordt. Vervolgens worden de

buisjes/epjes preferentieel 5 min op ijs of 10 min in de ijskast geplaatst om de eiwitten beter

6 Skinn5mm wordt gedefineerd als een laagje van 5 mm dat een groot deel van de epidermis en dermis omvat. Dit laagje wordt craniaal afgelijnd t.h.v. de Meatus Akousticus Externus en caudaal t.h.v. wervel C6.


17

te laten neerslaan. De buisjes/epjes worden hierna gecentrifugeerd (●: 5 min aan 2000xg: ♦: 2

min aan 16000xg) zodat de eiwitten neerslaan en een pellet vormen. Bij de verdere

opzuivering van het DNA wordt het DNA eerst geprecipiteerd. Hierbij wordt het supernatans

overgebracht in een buisje/epje met 100% isopropanol (VWR) (●: 3 ml; ♦: 600 µl). Nadien

wordt de oplossing ongeveer 50 keer omgekeerd totdat de witte DNA draden zichtbaar

worden. Vervolgens worden de buisjes/epjes gecentrifugeerd (●: 3 min aan 2000xg; ♦: 1 min

aan 16000xg) waarbij het DNA als een witte pellet zichtbaar wordt. Het supernatans wordt

afgepipetteerd en de DNA pellet wordt gewassen met 70% ethanol (Sigma) (●:3 ml; ♦:600

µl). Daarna worden de buisjes/epjes opnieuw gecentrifugeerd (●: 1 min aan 2000xg; ♦: 1 min

aan 16000xg), wordt het supernatans verwijderd en laat men de buisjes/epjes gedurende 10

min drogen aan de lucht. De laatste stap van de DNA purificatie is de DNA hydratie.

Hiervoor wordt DNA hydratie oplossing (Qiagen) toegevoegd (●: 500 µl; ♦: 150 µl) en

worden de buisjes/epjes gedurende 1 uur op 65°C (Polystat 24, Fisher Scientific) geïncubeerd.

In de laatste worden de buisjes/epjes na een overnachtperiode op KT kort gecentrifugeerd,

overgebracht in 1.5 ml buisjes en worden ze bewaard op -20°C.

5. Concentratie -en kwaliteitbepaling van het DNA

Voor verdere analyses wordt de DNA oplossing van alle stalen op een concentratie gebracht

van 25ng/µl. Voor de concentratiebepaling van het geïsoleerde DNA wordt gebruik gemaakt

van de NanoDrop ND-1000 V3.5 spectrometer. Deze is beschikbaar op de afdeling Medische

Genetica van het UZG. Aan de hand van absorbantiemetingen kan de concentratie en de

zuiverheid van het staal gemeten worden. De verhouding van de absorbantie bij 260 en 280

nm van 1.8 wordt beschouwd als een zuiver staal, een contaminatie met eiwitten zal deze

waarde doen dalen. De eventuele verdunning gebeurt door toevoeging van TE buffer (10mM).

Voor het maken van een 100mM stockoplossing wordt 6.05 g Tris en 1.86 g EDTA opgelost

in 500ml Dnase en Rnase vrij gedestilleerd water (dH2O, Sigma). De oplossing wordt

aangezuurd met 1M HCl tot een pH van 8.5 wordt bekomen. Voor het maken van de

werkoplossing wordt de stockoplossing 10 x verdund met dH2O.


18

6. Polymerase chain reaction (PCR)

6.1 Principe

PCR is een in vitro techniek die typisch gebruikt wordt voor de multiplicatie van een

welbepaalde DNA fragment (amplicon). Door gebruik te maken van een specifiek primerpaar

kan de plaats van de te onderzoeken polymorfe regio geamplificeerd worden.

Het algemene PCR proces bestaat uit 3 stappen: denaturatie, aanhechting of annealing van de

primers en primerextensie. In de eerste stap wordt het DNA gedenatureerd. Deze stap gebeurt

bij een temperatuur van 95°C waardoor het dubbelstrengig DNA (double stranded DNA,

dsDNA) enkelstrengig (single stranded DNA, ssDNA) wordt. Tijdens de tweede stap (de

annealing) wordt de temperatuur verlaagd tot de annealingstemperatuur (Ta) van de primers,

wat hen toelaat om te binden aan hun complementaire sequenties op het ssDNA. De Ta is

afhankelijk van de base samenstelling van de gekozen primers en wordt als volgt bepaald: Ta

= [(#T/A × 2) + (#G/C × 4)] − 2. De laatste stap van de PCR reactie is de extentie van de

primers. Bij deze stap wordt de temperatuur verhoogd tot 72°C waarbij het gebruikte hot start

Taq polymerase zijn functie kan uitvoeren. Dit polymerase bindt deoxyribonucleotide

trifosfaten (dNTPs) aan de gebonden primers en synthetiseert de volledige complementaire

DNA streng. Deze 3 stappen worden verschillende malen herhaald wat uiteindelijk resulteert

in een zeer groot aantal kopijen van het DNA fragment [54]. Het algemene PCR programma

dat in deze thesis wordt gebruikt is weergegeven in tabel 2.2.

Tabel 2.2: Algemeen PCR programma

95°C 5 min

95°C 30 sec

Ta 30 sec 35 cycli

72°C 30 sec

72°C 10 min

15°C 10 min

De gebruikte PCR protocols worden beschreven in tabel 2.3 deze werden reeds

geoptimaliseerd binnen de onderzoeksgroep. Er werd gewerkt met de Bio-rad c1000 Thermal

Cycler PCR toestel.


19

Tabel 2.3: Reeds geoptimaliseerde PCR protocols

Gen SNP PCR programma Ta (°C) Fragmentlengte (nt)

Ku70 c.-1310 C>G Algemeen 58 438

XRCC3 c.722 C>T Algemeen 58 650

TGFβ1 c.-800 G>A Algemeen 60 681

c.-509 C>T Algemeen 60 681

c.74 G>C Algemeen 58 365

6.2 PCR mix

De concentraties en volumes van de verschillende reagentia nodig bij het opstellen van een

PCR mix worden weergegeven in tabel 2.4. De mix wordt uiteindelijk aangevuld met een

hoeveelheid dH2O (Sigma) tot een eindvolume van 15 µl.

Tabel 2.4: Gebruikte PCR mixen

Product (concentratie)

Volume (finale concentratie)

TGFβ1 c.-800 G>A/ TGFβ1 c.-509 C>T/ XRCC3 c.722 C>T/ Ku70 c.-1310 C>G

TGFβ1 c.74 G>C

dNTP (1mM)* 3 µl (0.2mM) 3 µl (0.2mM)

Buffer (5x)† 3 µl (1x) 3 µl (1x)

MgCl2 (25mM)† 0.9 µl (1.5mM) 0.9 µl (1.5mM)

Forward primer (50µM)‡ 0.3 µl (1µM) 0.3 µl (1µM)

Reverse primer (50µM)‡ 0.3 µl (1µmM) 0.3 µl (1µmM)

Kapa Taq (0,6 U/µl)† 1.2 µl (0,072 U) 1.2 µl (0.072 U)

DMSO§ / 1.5 µl DNA (25 ng/µl) 3 µl (5 ng/µl) 3 µl (5 ng/µl)

Afkortingen: DMSO = DiMethylSulfOxide; dNTP = deoxyriboNucleotide TriTosfaten; U = units; MgCl2 = MagnesiumdiChloride

*Amersham Pharmacia Biotech Inc. †Kappa Biosystems ‡Biolegio §Invitrogen

Het PCR fragment van TGFβ1 c.74 G>C bevat een hoog percentage GC wat de PCR reactie

kan bemoeilijken. Dit probleem kan men vermijden door aan deze PCR mix 10%

dimethylsulfoxide (DMSO, Merck) toe te voegen. DMSO beïnvloedt de smelttemperatuur en

thermostabiliteit van het polymerase [55]. Bij het uitvoeren van een PCR experiment wordt

telkens ook een negatieve controle geïncludeerd om eventuele contaminaties te achterhalen.

Hierbij wordt het DNA vervangen door dH2O.

6.3 Primers

De PCR primers die gebruikt worden in deze thesis, werden reeds bepaald binnen de

onderzoeksgroep (tabel 2.5).


20

Tabel 2.5: Gebruikte PCR primers

Gen Nr. Naam Sequentie Lengte

(nt) Ta

(°C)

Ku70 c.-1310 C>G P1a Ku70/1233F 5'-CTTCAGACCACTCTCTTCTC-3' 20 58

P2a Ku70/1670R 5'-TCACCTCACAGTAGTCGTTG-3' 20 58

XRCC3 c.722 C>T 27 XRCC3/17.630F 5'-GACACCTCTACAGAGGACG-3' 19 58

28 XRCC3/18.279R 5'-TTCTCGATGGTTAGGCACAG-3' 20 58

TGFβ1 c.-800 G>A / TGFβ1 c.-509 C>T*

39 TGFb1/142F 5'-GCAGTTGGCGAGAACAGTTG-3' 20 60

40 TGFb1/722R 5'-TGGGTCACCAGAGAAAGAGG-3' 20 60

TGFβ1 c.74 G>C 41 TGFb1/1.936F 5'-TGTTCGCGCTCTCGGCAG-3' 18 58

42 TGFb1/2.300R 5'-GACCTCCTTGGCGTAGTAG-'3 19 58 *Beide SNPs liggen in hetzelfde PCR fragment

Voor de keuze van de primerparen wordt rekening gehouden met de lengte van de primers

welke ideaal 20 nucleotiden (nt) is, de Ta is best gelegen tussen 58°C en 62°C en identiek

voor het PCR primerpaar. Optimaal eindigt de forward primer met een G of C, terwijl de

reverse primer begint met een G of C dit wegens de sterkere interactie met de doelsequentie

van deze nt. Men vermijdt ook best herhalingen van 3 of meer gelijke nt om aspecifieke

binding te voorkomen.

6.4 PCR Controle

De controle van de PCR reacties gebeurt d.m.v. gelektroforese. Hierbij wordt een 1.5%

agarosegel gemaakt door opkoken, tot een heldere vloeistof van 1.5 g agarose (Invitrogen) in

100 ml TBE buffer (0.5x). Deze oplossing wordt in een daarvoor voorziene houder gegoten

waarin kammetjes geplaatst worden voor het vormen van de laantjes waarin het PCR product

kan worden geladen. Voor de aanmaak van een stockoplossing TBE buffer (10x) wordt 54 g

Tris, 27.5 g en 4.65 g EDTA opgemengd in 500 ml dH2O. Deze stockoplossing wordt 20 keer

verdund met dH2O om de werkoplossing (0.5x) te krijgen.

Na het afkoelen en opstijven van de agarose gel (na ± 20 min) kan de gel geladen worden.

Hiervoor wordt aan 1 µl ladingsbuffer7 2 µl PCR product toegevoegd. Samen met een extra 6

of 16 µl dH2O, afhankelijk van de grootte van de gebruikte laantjes, wordt het PCR product

op gel gebracht. Naast de PCR stalen wordt ook 1 µl DNA ladder (Invitrogen) in één van de

7 Voor de aanmaak van ladingsbuffer wordt 500 µl glycerol (om het DNA te verzwaren) en 250 µl broomfenolblauw (voor de visualisatie van het DNA in de gel) opgemengd met 250 µl dH2O.


21

laantjes gepipetteerd. Deze wordt zichtbaar op gel als meerdere bandjes van gekende grootte.

Aan de hand van deze ladder kan nagegaan worden of het PCR bandje op de juiste hoogte

voorkomt en dus het gewenste amplicon verkregen werd. Na het laden van de gel stelt men

het elektroforese toestel (Cosmo bio, Westburg) in op 135 Volt voor ongeveer 30 min. De

DNA ladder en de PCR bandjes worden gevisualiseerd door het gel gedurende 40 à 45 min in

een ethidiumbromide (EtBr , Gibco) bad (0.1%) te leggen en daarna op een UV plaat (UV

Transilluminator, UPV) te plaatsten.

7. SNP bepaling

In deze thesis wordt voor de bepaling van de genetische variaties in de patiëntstalen gebruik

gemaakt van 2 technieken: RFLP, een post-PCR techniek en HRM waarbij PCR en SNP

detectie gebeuren in één reactie.

7.1 Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

Bij RFLP zal na PCR van de te onderzoek sequentie het verkregen amplicon door

welbepaalde restrictie-enzymen (RE) geknipt worden. Bij de keuze van het RE wordt gewerkt

met de restriction mapper software [56]. Met deze software kan het PCR fragment virtueel

door verschillende enzymen geknipt worden. Het ideale RE knipt op de plaats van de

polymorfe site waardoor de aan- of afwezigheid van de te onderzoeken SNP een ander

knippatroon geeft en fragmentanalyse de SNP bepaling toelaat. De gevormde fragmenten

worden d.m.v. gelelektroferese op basis van hun lengte gescheiden. Voor een RFLP reactie

wordt gewerkt in een totaalvolume van 30 µl. Naast het RE wordt ook een enzym specifieke

buffer voorzien. De gebruikte hoeveelheid bedraagt steeds 10% (3 µl) van het eindvolume. De

hoeveelheid PCR product en het aantal U van het RE werden voor de geselecteerde SNPs via

optimalisatie reeds bepaald binnen de onderzoeksgroep. Afhankelijk van het gebruikte RE

wordt ook bovine serum albumine (BSA) toegevoegd aan de digest mix. Met behulp van

dH2O wordt er uiteindelijk aangevuld tot een totaalvolume van 30 µl per staal. Na het

toevoegen van de digest mix aan het DNA worden de gebruikte epjes goed gevortext en

gecentrifugeerd. Daarna worden ze gedurende een geoptimaliseerde periode geïncubeerd bij

een specifieke temperatuur in een warmwaterbad (Polystat 24, Fisher Scientific). Hierna

worden de epjes kort gecentrifugeerd en worden ze voor minimaal 30 min in de ijskast

bewaard. De in deze thesis gebruikte RFLP protocols staan beschreven in bijlage C . Deze

werden reeds binnen de onderzoeksgroep geoptimaliseerd.


22

Voor de controle van het digest wordt aan het digestproduct 3 µl (10% van het eindvolume)

ladingsbuffer toegevoegd en wordt het product geladen op een 2% agarosegel8. Om na te gaan

of het PCR product effectief geknipt werd, wordt er eveneens in één van de laantjes niet-

geknipt PCR product geladen. Na het laden van de gel stelt men het elektroforese toestel in op

135 Volt gedurende 30 à 40 min. De digestproducten worden net zoals de PCR producten

gevisualiseerd op een UV plaat na incubatie in een EtBr bad (0.1%).

7.2 High resolution melting (HRM)

HRM is een high-throughput techniek waarbij de genotypering gebeurt op basis van het

smeltpatroon van het PCR amplicon. Tijdens deze thesis wordt gewerkt met het Applied

Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR systeem en de geassocieerde Applied Biosystems

HRM software v2.0. De analyse start met een PCR van de te onderzoeken regio in de

aanwezigheid van een fluorescente kleurstof (Meltdoctor HRM dye) dat een hoog fluorescent

signaal geeft bij de binding aan dsDNA en een laag fluorescent signaal in de niet-gebonden

toestand (als het DNA enkelstrengig is, na denaturatie) [57]. De standaard mix die gebruikt

wordt bij een HRM experiment staat vermeld in tabel 2.6. De mix wordt uiteindelijk

aangevuld met dH2O tot een totaalvolume van 20 µl per staal.

Tabel 2.6: Standaard HRM mix

Product (concentratie) Hoeveelheid (concentratie)

Buffer (10x) 2 µl (1x)

MgCl2 (25mM) 1.2 µl (1.5mM)

dNTP Mix (10mM) 0.4 µl (0.2mM)

Forward primer (5µM) 1.2 µl (0.3µM)

Reverse primer (5µM) 1.2 µl (0.3µM)

Meltdoctor HRM Dye (20x) 1 µl (1x)

AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase (5U/µl) 0.2 µl (0.05 U/µl, 1U)

DNA (25 ng/µl) 1 µl (1 ng/µl)

De smeltcurve ontstaat door het DNA traag te denaturen (uitsmelten). Tijdens deze

denaturatie wordt het dsDNA ssDNA waardoor de kleurstof van het DNA loskomt en een

vermindering in fluorescentie wordt waargenomen. Door het detecteren van de

fluorescentiegraad in functie van de temperatuur wordt een smeltpatroon gevormd (figuur 2.1)

[57]. Het standaard HRM programma wordt weergegeven in tabel 2.7.

8 2% agarosegel: 2 g agarose + 100 ml TBE (0.5x)


23

Tabel 2.7: Standaard HRM programma

Stadium Reactiestap Temperatuur

(°C) Tijd

Precyclische fase Enzym activatie 95 10 min

Cyclische fase (40 cycly) Denaturatie 95 15 sec

Annealing/Extentie 60 1 min

Smelt curve/ dissociatie Denaturatie 95 10 sec

Annealing 60 1 min

HRM 95 15 sec

Annealing 60 15 sec

De vorm van de smeltcurve van een PCR fragment wordt bepaald door zijn thermische

stabiliteit die op zich bepaald wordt door de sequentie. De aanwezigheid van een SNP in het

fragment kan hierdoor het smeltpatroon beïnvloeden. Indien de SNP homozygoot

(homozygoot variant, HV; rood in figuur 2.1) is, ziet men een verschuiving van de smeltcurve

t.o.v. het homozygoot normaal (HN) DNA (wild-type; groen in figuur 2.1). Deze

verschuiving is te wijten aan een verandering van de smelttemperatuur9 (Tm), de vorm van de

curves blijft hierbij gelijk. Wanneer voor de SNP een heterozygoot genotype aanwezig is

(HE, blauw in figuur 2.1) ziet men door het ontstaan van 2 homoduplexen en 2 minder

stabiele heteroduplexen, een veranderde vorm van de smeltcurve [58,59] (figuur 2.1). De

baseveranderingen worden onderverdeeld in verschillende klassen die verwijzen naar de

baseverandering zelf en de frequentie van de SNP in het humane genoom. De classificatie

wordt gerelateerd met de Tm shift tussen de homozygote smeltcurves. Klasse 1 (C/T en G/A)

en klasse 2 (C/A en G/T) SNPs vertonen eenvoudig te onderscheiden smeltcurves (Tm curve

shift > 0.5°C). Dit verschil in Tm wordt kleiner (0.2-0.5°C) tot zeer klein (<0.2°C) bij een

klasse 3 (C/G) en klasse 4 (A/T) SNP [57].

Figuur 2.1: Genormaliseerde smeltcurve, rood = homozygoot variant, Groen = homozygoot wild-type, blauw =heterozygoot Bron: https://products.appliedbiosystems.com [57]

9 Tm is het punt in de smeltcurve waar 50% van het dsDNA werd omgezet naar ssDNA.


24

7.2.1 Primer bepaling

Bij de ontwikkeling van primers voor HRM moet men rekening houden dat extra

polymorfismen in het PCR fragment een invloed hebben op het smeltpatroon. Tijdens deze

thesis zal HRM gebruikt worden voor de genotypering van 1 SNP per fragment en wordt de

aanwezigheid van een andere polymorfisme in het amplicon vermeden. Hiernaast mogen ook

geen SNPs in de primersequentie voorkomen omdat dit hun binding zou kunnen beïnvloeden.

De aanwezigheid van SNPs kan gecontroleerd worden via de Ensembl genoom browser [60].

Verder moet er bij de keuze van het primerpaar ook rekening gehouden worden met de

primerlengte (±20 nt elk), de fragmentlengte (optimaal 80-100 nt), de smelttemperatuur van

de primers (58°C-60°C), het % GC (30-80%) en moeten herhalingen (> 3) worden vermeden.

Deze karakteristieken kunnen samen met de zelf-complementariteit van de primers bepaald

worden via de Oligonucleotide Properties Calculator (Oligo Calc) [61]. Voor het ontwerpen

van de primers wordt de SNP eerst, via NCBI, in de referentiesequentie van het gen gezocht

[36]. De uiteindelijke primerontwikkeling kan manueel of automatisch via Primer3Plus

gebeuren [62]. Na het ontwerpen van de primers dient hun specificiteit getest te worden, dit

kan d.m.v. een in silico PCR via de UCSC genoom browser [63]. Deze software laat toe te

controleren of de primers op de correcte plaats in het genoom binden en het correcte fragment

genereren. Bij de optimalisatie van een HRM experiment worden telkens meerdere

primerparen besteld waaruit dan het optimale paar wordt bepaald. De gebruikte HRM primers

staan vermeld in tabel 2.8.

Tabel 2.8: Gebruikte HRM primers

Nr. Naam Sequentie Primerlengte

(nt) Tm

(°C) PCR

fragment (nt)

Ku70 c.-1310 C>G

145 Ku70_HRM_F2 5’-GTCGTGGCCCAAGTCTCC -3’ 18 61.7

100 147 Ku70_HRM_R 5’-CCATCATGCTGGGTGAGG -3’ 18 61.1

XRCC3 c.722 C>T

124 XRCC3_HRM_F1 5’-GGCCAGGCATCTGCAGTC-3’ 18 63

87 122 XRCC3_HRM_R1 5’-CTCACCTGGTTGATGCACAG-3’ 20 60.3

7.2.2 Optimalisatie HRM protocols

De optimalisatie van de HRM protocols van Ku70 c.-1310 C>G en XRCC3 c.722 C>T

vormen één van de doelstelling van deze thesis. Tijdens deze optimalisatie worden


25

verschillende HRM mixen en HRM programma’s geprobeerd om tot een optimale smeltcurve

te komen waarin de verschillende genotypes konden onderscheiden worden.

8. Kwaliteitscontroles

Om de juistheid van de reacties na te gaan volgt steeds een kwaliteitscontrole na genotypering

van alle stalen. Hierbij worden per SNP ongeveer 15% van de stalen opnieuw gegenotypeerd.

Indien afwijkingen worden gedetecteerd, worden alle stalen van deze reactie opnieuw

geanalyseerd.

9. Statistische Analyse

Voor de statistische analyse wordt gewerkt met de SPSS 15.0 software. Voor elke

onderzochte weefselcomplicatie (xerostomie, fibrose, dermatitis, acute dysfagie, late dysfagie

en acute mucositis) worden de patiënten op basis van de CTC-scores opgedeeld in twee

groepen. Bij de verdere analyse wordt de niet- tot matig radiosensitieve groep (CTC0-2, voor

acute complicaties en CTC0-1 voor late complicaties) vergeleken met de sterk radiosensitieve

groep (CTC3+ voor acute complicaties en CTC2+ voor late complicaties).

Om na te gaan of patiëntgerelateerde parameters (leeftijd, rookgedrag10 en alcoholgebruik) en

therapiegerelateerde parameters (dosis ter hoogte van kritische weefsels) op zich een effect

hebben op de opdeling van de patiënten in de matig tot ernstig radiosensitieve groep wordt

een Mann-Whitney U test uitgevoerd. Het eventuele effect van het geslacht, chemotherapie en

chirurgie op het optreden van ernstige weefselcomplicaties wordt nagegaan d.m.v. de chi-

kwadraat test. Voor alle SNPs wordt voor elke complicatie ook het Hardy-Weinberg

equilibrium (HWE) gecontroleerd.

Voor het vinden van een relatie tussen de genotypefrequenties en het optreden van ernstige

radiosensitiviteit wordt gebruik gemaakt van logistieke regressie analyse. Om het effect van

therapie- en patiëntgerelateerde factoren uit te sluiten wordt in de analyses gecorrigeerd voor

die parameters die significante verschillen vertonen tussen de twee groepen. Bij de analyses

wordt telkens het HN genotype gebruikt als referentie. De genotypefrequenties worden

geëvalueerd d.m.v. de odds ratio (OR) en de p-waarde. Een p kleiner of gelijk aan 0.05 wordt

als statistisch significant beschouwd.

10 Het rookgedrag wordt uitgedrukt in pack-years (PY): ( aantal sigaretten per dag/20) x aantal jaren gerookt.

Resultaten

26

Resultaten

1. Reeds geoptimaliseerde protocols

De protocols voor de bepaling van de SNPs in het TGFβ1 gen werden reeds geoptimaliseerd

binnen de onderzoeksgroep waardoor de patiëntenstalen eenvoudig bepaald konden worden.

Voor de genotypering van de drie onderzochte polymorfismen TGFβ1 c.-509 C>T, c.-

800G>A en c.74G>C SNP werd de RFLP techniek toegepast. Na inwerking van het RE kan

via de lengte van de bekomen fragmentjes een duidelijk onderscheid gemaakt worden tussen

de mogelijke genotypes. Voorbeelden van digest gels voor elk van de SNPs worden

weergegeven in figuur 3.1. De volledige resultaten van de genotypering staan beschreven in

bijlage D.

Figuur 3.1: Digest gels voor de genotypering van TGFβ1 c.-800 G>A (I), TGFβ1 c.-509C>T (II) en TGFβ1 c.74G>C (III). Per gel van links naar rechts: ladder, ongeknipt product en de 3 mogelijke genotypes.

2. Optimalisatie HRM Protocols

De genotypering van de XRCC3 c.722C>T en Ku70 c.-1310C>G polymorfismen werd binnen

de onderzoeksgroep reeds geoptimaliseerd met behulp van de RFLP techniek. Het proces van

PCR en RFLP, inclusief het lopen van de controlegels, neemt respectievelijk 8 en 9uur in

beslag. Om in de toekomst efficiënter te werken zou het handig zijn dat de genotypering op

een veel snellere manier kan gebeuren. Hiervoor biedt de recent ontwikkelde HRM

technologie een oplossing. Dit proces neemt slechts een 2-tal uur in beslag voor een reactie

waarbij PCR en uitsmelting van de amplicons gecombineerd worden. Het is bovendien een

high-througput techniek die toelaat 96 stalen in eens te genotyperen. Aangezien de

amplificatieplot en ampliconsmeltcurve in grafieken weergegeven worden, is er geen controle

van de PCR via gelelektroforese meer nodig. In deze scriptie werden de protocols voor de

XRCC3 c.722 en Ku70 c.-1310 SNPs geoptimaliseerd voor genotypering via HRM.

Resultaten

27

2.1 XRCC3 c.722C>T

Voor de optimalisatie van het HRM protocol van XRCC3 c.722C>T werd een experiment

opgesteld waarin 4 standaard HRM-mixen (tabel 2.6 Materialen en Methoden) met

verschillende primercombinaties uitgetest werden (tabel 3.1). De aanwezigheid van extra

polymorfismen in zowel de bindingssequentie van de primers als in het amplicon werden

vermeden aangezien deze de efficiëntie van de PCR reactie en het resulterende smeltpatroon

sterk kunnen beïnvloeden. Als startprogramma werd het standaard HRM programma, zoals

aangegeven door de leverancier van het toestel (Applied biosystems), gebruikt met een Ta van

60°C (tabel 2.7 Materialen en Methoden). Tijdens het optimalisatieproces werden in elk

experiment 5 gekende stalen per genotypegeïncludeerd.

Tabel 3.1: De geselecteerde primercombinaties voor XRCC3 c.722C>T

Mix

Primers XRCC3 c.722 C>T

Nr. Primer

Naam primer Primer sequentie Primerlengte

(nt) Tm (°C)

Lengte PCR fragment (nt)

Mix 1 121 Forward primer CCATTCCGCTGTGAATTTG 19 60.1

128 122 Reverse primer CTCACCTGGTTGATGCACAG 20 60.3

Mix 2 121 Forward primer CCATTCCGCTGTGAATTTG 19 60.1

101 123 Reverse primer CTCTGGAAGGCACTGCTCA 19 60.3

Mix 3 124 Forward primer GGCCAGGCATCTGCAGTC 18 63.0

60 123 Reverse primer CTCTGGAAGGCACTGCTCA 19 60.3

Mix 4 124 Forward primer GGCCAGGCATCTGCAGTC 18 63.0

87 122 Reverse primer CTCACCTGGTTGATGCACAG 20 60.3

Afgaande op de specificiteit en de vorm van de ampliconpiek gaven mix 2 en 4 bij dit

experiment de beste resultaten. Voor de verdere optimalisatie werd gekozen voor mix 4 bij

een Ta van 60°C.

Wegens de hoge kostprijs van het AmpliTaq Gold 360 DNA polymerase werd in volgende

experimenten geprobeerd om het verbruik ervan zo laag mogelijk te houden. Er werd

nagegaan of een verlaging van de hoeveelheid polymerase (5U/µl) een effect had op de

efficiëntie van de PCR reactie en het resulterende smeltpatroon. Standaard werd 1 U (0.2 µl)

per staal gebruikt. De hierbij verkregen smeltcurve werd vergeleken met de smeltpatronen die

ontstonden na toevoegen van 0.5 U (0.1 µl), 0.25 U (0.05 µl) of 0.125 U (0.025 µl) aan de

mix. Zoals voorgesteld in figuur 3.2 zijn de verschillende genotypes nog steeds goed te

onderscheiden bij gebruik van 0.5 U en 0.25 U. Bij 0.125 U liggen de smeltpatronen van de

Resultaten

28

verschillende genotypes duidelijk dichter bij elkaar waardoor geopteerd werd om bij verdere

experimenten te werken met 0.25 U (0.05 µl) polymerase per staal. Het geoptimaliseerde

HRM protocol (HRM mix samenstelling en HRM programma) van XRCC3 c.722C>T staat

beschreven in bijlage E.1.

A B C

Figuur 3.2: Genormaliseerde smeltcurven (XRCC3 c.722C>T ) bij verschillende hoeveelheden AmpliTaq Gold 360 DNA polymerase: 0.5 U (A), 0.25 U (B), 0.125 U (C) met groen = homozygoot normaal, blauw = heterozygoot, rood = homozygoot variant.

In de HRM analyses voor de genotypering van de patiëntenstalen worden extra stalen met

gekend genotype meegenomen als referentie. Na analyse in de HRM software (applied

biosystems) werd besloten dat voor de genotypering van ongekende stalen een bijkomende

analyse van 2 gekende stalen van elk genotype per experiment voldoende zijn.

Van een aantal patiënten, waarvan het genotype via HRM werd bepaald, werd de analyse

herhaald via RFLP (figuur 3.3). Deze data dienden als een extra ingebouwde controle. Er

werden geen afwijkende resultaten gevonden. Een overzicht van de genotypes per patiënt

voor de XRCC3 c.722C>T SNP staan beschreven in bijlage D.

Figuur 3.3: Ingebouwde controle van de genotypering d.m.v. RFLP (I) van de met HRM verkregen genotypes (II). A = RT 626 (CT); B = RT 627 (CT); C = RT 636 (TT); D = RT 651 (CC); E = RT 654 (CC); F = RT 673 (TT).

2.2 Ku70 c.-1310C>G

Ook voor de optimalisatie van het HRM protocol voor Ku70 c.-1310C>G werden meerdere

primerparen ontwikkeld. Drie verschillende primercombinaties werden getest gebruik

Resultaten

29

makende van de standaard mix (tabel 2.6 Materialen en Methoden) en met het standaard

HRM programma (Ta = 60°C) (tabel 2.7 Materialen en Methoden). Wegens het voorkomen

van vele herhalingen in de DNA sequentie rond de SNP werd slechts één reverse primer (128)

geselecteerd die in elke mix gebruikt werd. Er bevinden zich ook 2 extra SNPs in het

fragment dat geamplificeerd wordt met het primerpaar 127/128. Het primerpaar werd toch

geïncludeerd omdat deze extra SNPs slechts met een zeer lage frequentie voorkomen en

hierdoor geen interferentie met de smeltcurve van de Ku70 c.-1310 SNP werd verwacht.

Geen enkele van de primerparen resulteerde echter in 3 te onderscheiden smeltpatronen. Bij

het gebruik van mix 1 kon geen enkel genotype onderscheiden worden. Bij het gebruik van

mix 2 en 3 zag men wel dat de homozygote stalen (HN en HV) gescheiden werden van de HE

stalen. De identificatie van de afzonderlijke HV en HN stalen was echter niet mogelijk. De

gebruikte primerparen staan beschreven in tabel 3.2.

Tabel 3.2: De geselecteerde primercombinaties voor Ku70 c.-1310C>G

Mix

Primers Ku70 c.-1310 C>G

Nr. Primer

Primer naam Primer sequentie Primerlengte

(nt) Tm

(°C) Lengte PCR fragment (nt)

Mix 1 127 Forward primer TTCTTCCATCCTCCTGGCC 19 62.5

135 128 Reverse primer CCATCATGCTGGGTGAGG 18 61.1

Mix 2 129 Forward primer GTCGTGGCCCAAGTCTCC 18 61.7


Mix 3 130 Forward primer CATGTGTCTCCCCGTGAGT 19 59.5


Bij de verdere optimalisatie werd nagegaan of voor primerpaar 129/128 (mix2) en 130/128

(mix 3) een verhoging van de Ta (tabel 2.7 Materialen en Methoden) een effect had op het

smeltpatroon waardoor de HN en HV stalen zouden gescheiden kunnen worden. Bij de

verhoging van de Ta naar 62°C werd voor de beide primerparen geen significante verbetering

gezien in de scheiding van de smeltcurves, wel werd een scherpere en meer afgelijnde

amplificatiepiek gegenereerd. Een Ta van 64°C gaf zowel voor de amplificatiecurve als voor

de smeltcurve geen verbetering. Hierdoor werd geopteerd om te werken met een Ta van 62°C.

In een volgende experiment werd nagegaan of het gebruik van een hogere concentratie MgCl2

een effect had op het smeltpatroon waardoor de HN en HV stalen zouden gescheiden kunnen

worden. Een verhoging van de concentratie MgCl2 naar 2.0 mM (1.6 µl/staal) resulteerde

voor de beide primerparen tot een smeltcurve waarin 3 groepen te zien zijn, niet alle

homozygote stalen werden echter correct gegenotypeerd. Er was dus nog steeds geen perfecte

Resultaten

30

scheiding mogelijk van de HV en HN stalen. Ook een verdere verhoging van de concentratie

MgCl2 (2.5 mM, 3.0 mM en 3.5 mM) gaf geen verbetering.

Voor de verdere optimalisatie werd in de literatuur gezocht naar een mogelijke oplossing voor

het scheiden van de HN en HV stalen. Liew et al. beschreven de ‘spike-in’ techniek als een

mogelijke oplossing voor dit probleem [58]. Bij het uitvoeren van dit experiment werd

gewerkt met het 129/128 primerpaar bij een Ta van 62°C en een concentratie MgCl2 van 2.0

mM. Het experiment bestaat uit 2 delen. In de eerste stap wordt een standaard HRM

experiment uitgevoerd onder de eerder vermelde condities. Hierdoor worden de HE stalen,

door hun afwijkende smeltpatroon, gescheiden van de homozygote stalen (HN en HV). In een

tweede stap worden de HN stalen van de HV stalen geïsoleerd. Dit gebeurt door in een 2e

HRM mix aan elk homozygoot staal 1µl wild type (HN) DNA toe te voegen. Hierdoor

vormen de HV stalen nu ook heteroduplexen waardoor ze een afwijkend smeltpatroon

vertonen t.o.v. de HN stalen die enkel homoduplexen vormen en waarbij het oorspronkelijk

smeltpatroon bij deze laatste (uit deel 1 van het experiment) behouden blijft (figuur 3.4).

Tijdens de optimalisatie werd het experiment in 2 afzonderlijke reacties uitgevoerd. Om

sneller resultaten te bekomen kan het volledige experiment ook in 1 reactie gebeuren door

alles in duplicaat uit te voeren.

A

B

Figuur 3.4: Spike-in experiment. In een eerste stap worden de heterozygote stalen (blauw) gescheiden van de homozygoot normaal en variant stalen (oranje) (A). In een tweede stap worden de homozygoot variant stalen (rood) gescheiden van de homozygoot normaal stalen door toevoeging spike-in DNA (groen) (B).

Het gebruik van spike-in DNA gaf dus de mogelijkheid om de 3 mogelijke Ku70 c.-1310C>G

genotypes van elkaar te onderscheiden. Ook hier werd voor een aantal patiënten, waarvan het

genotype via HRM werd bepaald, de analyse herhaald via RFLP. Deze data dienen als extra

ingebouwde controle (figuur 3.5). Er werden geen afwijkende resultaten gevonden. De

resultaten van de genotypering staan beschreven in bijlage D.

Resultaten

31

Figuur 3.5: Ingebouwde controle van de genotypering RFLP (I) van de met HRM verkregen genotypes (II). A = RT 679 (GG); B = RT 681 (CC); C = RT 673 (CG); D = RT 636 (GG); E = RT 667 (CG); F = RT 690 (CC). Bij de genotypering van de stalen zou het praktisch zijn mocht het protocol voor Ku70 c.-

1310C>G ook werken bij een Ta van 60°C zoals voor de XRCC3 SNP. Dan zou men beide

SNPs simultaan in één HRM analyse kunnen bepalen. Aangezien tijdens de optimalisatie

gezien werd dat voor Ku70 c.-1310C>G ook bij een Ta van 60°C de scheiding van de HE en

homozygote stalen (HN en HV) mogelijk was, werd een Ta van 60°C getest in een volgend

experiment. De analyse toonde aan dat de mogelijke genotypes van de Ku70 c.-1310C>G

SNP inderdaad konden bepaald worden bij een Ta van 60°C via de spike-in techniek. De

samenvatting van het geoptimaliseerde HRM protocol van Ku70 c.-1310C>G (bij een Ta van

60°C) staat beschreven in bijlage E.2.

2.3 Controlestalen

Voor de genotypering van de verschillende patiëntenstalen worden tijdens elk HRM

experiment 2 referentiestalen van elk van de 3 mogelijke genotypes geïncludeerd. Ook voor

de spike-in techniek is extra DNA materiaal vereist. Om te vermijden dat hiervoor DNA van

patiënten wordt gebruikt werden tevens ook controlestalen gegenotypeerd. Deze stalen zijn

afkomstig van medewerkers op het labo waarvan snel extra DNA materiaal kan verkregen

worden.

3. Associatiestudie naar chronische radiosensitiviteit

Tijdens deze analyses werd in een groep van 61 H&N kankerpatiënten de associatie nagegaan

tussen de XRCC3 c.722C>T, Ku70 c.-1310C>G, TGFβ1c.-509C>T, TGFβ1 c.-800G>A en

TGFβ1 c.74G>C SNPs en het optreden van chronische dysfagie, xerostomie en fibrose.

Vooraleer men onderzoek uitvoert naar de genetische susceptibiliteit voor de ontwikkeling

van chronische normale weefselcomplicaties is het belangrijk dat wordt nagegaan of andere

onafhankelijke patiënt- en therapiegerelateerde factoren op zich een invloed hebben op de

Resultaten

32

reactie na blootstelling aan IR. Voor de analyses werden de patiënten voor elke onderzochte

weefselcomplicatie opgedeeld in een niet- tot mild radiosensitieve groep (CTC0-1) en een

matig tot ernstig radiosensitieve groep (CTC2+). De niet- tot mild radiosensitieve groep werd

telkens als referentiegroep beschouwd.

3.1 Analyse genotype-onafhankelijke factoren

Als in deze analyses een p-waarde van kleiner dan 0.05 gevonden wordt, is het verschil tussen

de onderzochte groepen significant en wordt de onderzochte parameter als confounder

beschouwd in het onderzoek naar genetische risicofactoren voor de ontwikkeling van

chronische weefselcomplicaties.

3.1.1. Therapiegerelateerde parameters

De meeste patiënten die geïncludeerd werden in de studie, ondergingen naast de IMRT

behandeling ook chemotherapie en/of HK. De invloed van deze bijkomende behandelingen op

de ontwikkeling van matige- tot ernstige late weefselcomplicaties (CTC2+) werd onderzocht

voor elke complicatie beschouwd in deze studie. Ook de combinaties RT+chemo, RT+HK en

RT+chemo+HK werden onderzocht. Hiernaast werd ook het effect van de dosisparameters

onderzocht. Deze parameters werden berekend op basis van de verkregen DVH data voor de

kritische structuren met betrekking tot de verschillende weefselcomplicaties. De

dosisparameters onderzocht voor elk van de chronische eindpunten worden voorgesteld in

bijlage F.1. Geen enkele therapiegerelateerde parameter lijkt een invloed te hebben op de

ontwikkeling van late stralingstoxiciteiten.

3.1.2. Patiëntgerelateerde parameters

Met betrekking tot de patiënt specifieke parameters die mogelijk een rol spelen in het ontstaan

van ernstige normale weefselcomplicaties werden de niet- tot mild radiosensitieve en de matig

tot ernstig radiosensitieve groep vergeleken voor mogelijke verschillen in leeftijd, geslacht,

PY en drinks/week. Geen van deze parameters vertoonde significante verschillen tussen de

CTC0-1 en CTC2+ groep.

3.2 Analyse naar de associatie tussen SNPs en chronische radiosensitiviteit

Vooraleer deze analyse kon gebeuren, werd gecontroleerd of er voldaan werd aan het HWE.

Hierbij wordt nagegaan of de geobserveerde genotypefrequenties overeenkomen met wat

verwacht wordt volgens het HWE (p² + 2pq + q² =1).

Voor de verdere analyses werd gebruik gemaakt van logistieke regressie

HN genotype gebruikt werd

weergegeven d.m.v. de OR.

OR<1 als een verlaagd risico of

OR werd ook telkens de p-waarde berekend. Een

statistisch significant aangenomen.

A. Chronische dysfagie

Het TGFβ1 c.-509 HV (TT)

ontwikkeling van matig tot e

significantie bekomen (p= 0.622

aanwezigheid van 1 variant allel (OR

verondersteld. Hierbij werden de patiënten met een

patiënten met een HE (CT) en

referentiegroep). De data toonden nog een sterkere risicoverhoging (OR=

steeds werd geen significantie g

ontwikkeling van chronische dysfagie staat weergegeven in bijlage

De genotypefrequenties voor

verschil in genotypefrequenties tussen de CTC0

klein waardoor geen verdere associaties gevonden werden met de ontwikkeling van matige

tot ernstige chronische dysfagie.

Figuur 3.6: Risicoanalyse chronische dy

B. Xerostomie

Uit de analyses met betrekking tot xerostomie

voor de TGFβ1 c.-509 SNP geassocieerd te zijn met

voor de ontwikkeling van matig

020406080

100

Gen

otyp

e fr

eque

ntie

(%)

Resultaten

33

ens het HWE (p² + 2pq + q² =1). Alle SNPs voldeden aan dit evenwicht.

werd gebruik gemaakt van logistieke regressie. Waarbij

werd als referentie. De genotype specifieke risico’s worden

de OR. Een OR>1 wordt beschouwd als een verhoogd risico en een

OR<1 als een verlaagd risico of beschermend effect t.o.v. het referentie genotype. Naast de

waarde berekend. Een p-waarde kleiner of gelijk aan 0.05

tistisch significant aangenomen.

) genotype lijkt geassocieerd met een verhoogd risico op de

ernstige chronische dysfagie (OR= 1.70). Er werd echter geen

0.622). Omdat deze verhoogde OR niet gevonden werd bij de

aanwezigheid van 1 variant allel (OR≈1) werd een recessieve werking van de SNP

Hierbij werden de patiënten met een HV genotype (TT) vergeleken met

(CT) en HN (CC) genotype (deze laatste vormen

De data toonden nog een sterkere risicoverhoging (OR=

ie gevonden (p= 0.541). De associatie van deze SNP met de

ontwikkeling van chronische dysfagie staat weergegeven in bijlage G.1.

De genotypefrequenties voor de TGFβ1 c.-509 SNP zijn weergegeven in

verschil in genotypefrequenties tussen de CTC0-1 en CTC2+ groep voor de andere SNPs was

klein waardoor geen verdere associaties gevonden werden met de ontwikkeling van matige

tot ernstige chronische dysfagie.

chronische dysfagie: genotypefrequenties voor de TGFβ1

Uit de analyses met betrekking tot xerostomie lijkt de aanwezigheid van 2 variante allelen

geassocieerd te zijn met een licht verhoogd, niet significant

matig tot ernstige xerostomie (OR= 1.46, p=

47.2 47.2

5.6

50.0

40.0

10.0

CC CT TT

Genotype

TGFβ c.-509 C>T

CTC0-1

CTC2+

Alle SNPs voldeden aan dit evenwicht.

Waarbij telkens het

De genotype specifieke risico’s worden

beschouwd als een verhoogd risico en een

effect t.o.v. het referentie genotype. Naast de

kleiner of gelijk aan 0.05 werd als

geassocieerd met een verhoogd risico op de

Er werd echter geen

). Omdat deze verhoogde OR niet gevonden werd bij de

recessieve werking van de SNP

genotype (TT) vergeleken met

deze laatste vormen samen de

De data toonden nog een sterkere risicoverhoging (OR= 1.89), maar nog

. De associatie van deze SNP met de

weergegeven in figuur 3.6. Het

1 en CTC2+ groep voor de andere SNPs was

klein waardoor geen verdere associaties gevonden werden met de ontwikkeling van matige-

β1 c-509C>T SNP

de aanwezigheid van 2 variante allelen

, niet significant risico

= 0.727). Na analyse

Resultaten

34

van de SNP volgens het recessief model, werd deze risicoverhoging ook waargenomen, maar

nog steeds niet significant bevonden (OR= 1.48, p= 0.708). Verder kon afgeleid worden uit de

analyses dat het TGFβ1 c.-800 GA genotype geassocieerd is met een verlaagd risico op de

ontwikkeling van matig tot ernstige xerostomie (OR= 0.56, p= 0.392). Het effect van de

aanwezigheid van 2 variante allelen kon niet worden nagegaan omdat geen enkele patiënt

drager is van het TGFβ1 c.-800 AA genotype. Voor de andere SNPs werden geen duidelijke

verschillen gevonden in genotypefrequentie tussen de CTC0-1 en CTC2+ groep. De resultaten

van de analyses voor xerostomie worden weergegeven in bijlage G.1.

In figuur 3.7 staan de genotypefrequenties voor de TGFβ1 c.-509 en de TGFβ1 c.-800 SNPs

weergegeven.

Figuur 3.7: Risicoanalyse xerostomie: genotypefrequenties voor de TGFβ1 c-509C>T en TGFβ1 c.-800G>A SNPs

C. Fibrose

Uit de SNP analyses met betrekking tot het risico op fibrose (bijlage G.1) blijkt dat de

aanwezigheid van 2 variante allelen voor de TGFβ1 c.-509 SNP geassocieerd zijn met een

matig verhoogd, maar niet significant risico bij de ontwikkeling van matig tot ernstige fibrose

(OR= 1.92; p= 0.610). Het TGFβ1 c.-800 GA genotype is geassocieerd met een significant

sterk verhoogd risico bij de ontwikkeling van ernstige fibrose (OR= 10.0; p= 0.003). Het

risico bij de aanwezigheid van 2 variante allelen kon niet worden nagegaan wegens de

afwezigheid van patiënten met het HV genotype in beide groepen. In figuur 3.8 worden de

genotypefrequenties voor de TGFβ1 c.-509 SNP en de TGFβ1 c.-800 SNP weergegeven.

Figuur 3.8: Risicoanalyse fibrose: genotypefrequenties van de TGFβ1 c.-509C>T en TGFβ1 c.-800G>A SNPs

50.0 43.5

6.5

40.050.0

10.0

020406080

100

CC CT TT

Gen

otyp

efre

quen

ties

(%)

Genotype

TGFβ1 c.-509 C>T

CTC0-1

CTC2+

87.0

13.00.0

40.060.0

0.00

20406080

100

GG GA AA

Gen

otyp

efre

quen

ties

(%)

Genotype

TGFβ c. -800 G>A

48.545.4

6.1

47.8 43.5

8.7

0

20

40

60

80

100

CC CT TTGen

otyp

efre

quen

tie (%

)

Genotype

TGFβ1 c.-509 C>T

CTC0-1CTC2+

72.7

27.3

0.0

82.6

17.4

0.00

20

40

60

80

100

GG GA AAGen

otyp

efre

quen

tie (%

)

Genotype

TGFβ1 c.-800 G>A

Resultaten

35

Voor geen enkele van de andere onderzocht SNPs werd een mogelijke associatie gevonden

met de ontwikkeling van matig tot ernstige fibrose.

4. Associatiestudie naar acute radiosensitiviteit

In dit deel van de thesis werd in een nieuw verzamelde groep H&N kankerpatiënten (n= 79)

de associatie nagegaan tussen de XRCC3 c.722C>T, Ku70 c.-1310C>G, TGFβ1 c.-509C>T,

TGFβ1 c.-800G>A en TGFβ1 c.74G>C SNPs en de ontwikkeling van acute dysfagie,

mucositis en dermatitis. Naast patiënten die de huidige standaard IMRT behandeling

ondergingen (standaardgroep, n= 33) omvat deze groep ook patiënten uit de DD studie (DD

groep, n= 46). Door het verschil in dosisprotocols tussen deze twee groepen zullen de

dosisvolume distributies van deze groepen ook afzonderlijk worden bekeken. Vooraleer het

onderzoek naar genetische susceptibiliteit kon gebeuren werd, net als voor de analyses naar

chronische weefselcomplicaties, eerst het eventuele effect van de verschillende genotype-

onafhankelijke factoren bestudeerd. Voor de verschillende analyses werden de patiënten voor

elke onderzochte weefselcomplicatie opgedeeld in een niet- tot matig radiosensitieve groep

(CTC0-2) en een sterk radiosensitieve groep (CTC3+). De niet- tot matig radiosensitieve

groep werd telkens als referentiegroep beschouwd.

4.1 Analyse genotype-onafhankelijke factoren

4.1.1 Therapiegerelateerde parameters

A. Acute dysfagie

Totale patiëntengroep

Uit de analyses naar het effect van bijkomende behandelingen (chemotherapie en HK) bleek

dat patiënten in de CTC3+ groep voor acute dysfagie significant meer behandeld werden met

concomitante chemotherapie (p= 0.048). Met betrekking tot de dosisparameters op de

kritische structuren werd voor ernstige acute dysfagie (SAD) enkel de Dmean op de SPC als

“borderline” significant bevonden (p= 0.052). Voor de andere acute eindpunten werden geen

significante verschillen in de beschouwde dosisparameters of bijkomende behandelingen

waargenomen tussen de CTC0-2 en CTC3+ groep (bijlage F.2).

Resultaten

36

Standaardgroep vs. DD groep

Zoals hierboven besproken wordt, verhoogt de behandeling met concomitante chemotherapie

het risico op SAD in de totale patiëntengroep. Voor de afzonderlijke standaard en DD groep

kon het effect van chemotherapie statistisch niet worden nagegaan met de chi-kwadraat test

wegens te lage aantallen in de CTC3+ groep. Een percentuele weergave van de frequentie van

chemotherapie in de standaard en DD groep wordt voorgesteld in figuur 3.9.

Figuur 3.9: Percentuele weergave van de chemotherapiefrequentie in de standaard en dosis-de-escalatiegroep

Uit deze figuur kan afgeleid worden dat binnen de beide CTC3+ groepen percentueel meer

chemotherapie wordt gegeven in vergelijking met CTC0-2. In de DD groep krijgen in beide

subgroepen een hoog percentage van de patiënten concomitante chemotherapie. In de

standaardgroep is de verhouding van het percentage patiënten met concomitante

chemotherapie echter hoger (3:1) in vergelijking met de DD groep (4:3).

Verder werd ook nagegaan of de dosis-volume distributie op de SPC, MPC en IPC

verschillend was tussen de standaard en de DD groep. In figuur 3.10 worden de gemiddelde

DVHs weergegeven op deze structuren. Uit deze figuur blijkt dat zowel voor de CTC0-2 als

voor de CTC3+ groep de gemiddelde DVH ter hoogte van de 3 PC spieren in een lager

dosisbereik te liggen voor de DD groep in vergelijking met de standaard groep.

Figuur 3.10: Voorstelling van de gemiddelde DVHs voor de bovenste, middelste en onderste faryngeale constrictorspieren (SPC, MPC, IPC) in de standaard en dosis-de-escalatiegroep

61

82

39

18

0

20

40

60

80

100

CTC0-2 CTC3+

Fre

quen

tie %

)

Dosis de-escalatie

17

60

83

40

0

20

40

60

80

100

CTC0-2 CTC3+

Fre

quen

tie (%

)

Standaard

Chemo

Geen Chemo

Resultaten

37

B. Mucositis


Met betrekking tot de ontwikkeling van ernstige acute mucositis werden geen effecten

gevonden van bijkomende behandelingen (chemotherapie, HK of combinatie) op de

distributie van de CTC scores in de totale groep. Bij de analyse van het effect van de

dosisparameters werd de Dmean op de mondholte en de Dmean op de mucosa als significante

parameters gevonden in de ontwikkeling van acute mucositis (p= 0.01, 0.003 resp.) (bijlage

F.2).


De gemiddelde DVHs op de kritische structuren met betrekking tot mucositis (mondholte en

mucosa) voor de standaardgroep en de DD groep worden weergegeven in figuur 3.11. Zowel

de gemiddelde DVHs voor de CTC0-2 groep als de gemiddelde DVHs voor de CTC3+ groep

liggen voor de standaardgroep in een hoger dosisgebied in vergelijking met de DVHs voor de

DD groep. Alhoewel de subgroepen te klein waren om statistiek op uit te voeren, werden voor

de andere behandelingswijzen procentueel geen grote verschillen gezien tussen de standaard

en de DD groep.

Figuur 3.11: Voorstelling van de gemiddelde DVHs voor de mondholte en de mucosa in de standaard en dosis- de-escalatie groep

C. Dermatitis


Met betrekking tot de bijkomende therapieën (chemotherapie,HK of combinatie) werden voor

dermatitis geen significante verschillen gevonden tussen de CTC0-2 en CTC3+ groep. Wel

Resultaten

38

was de Dmean op de huid (skin5mm) statistisch significant hoger in de CTC3+ groep in

vergelijking met de CTC0-2 referentiegroep (p= 0.012) (bijlage F.2).


De gemiddelde DVH data op de huid (skin5mm) voor de standaard en DD groep wordt

weergegeven in figuur 3.12. Uit deze figuur blijkt dat de gemiddelde DVH van de CTC0-2 en

CTC3+ groep groep hoger ligt bij de standaardgroep in vergelijking met de DD groep.

Figuur 3.12: Voorstelling van de gemiddelde DVHs voor skin5mm in de standaard en dosis-de-escalatiegroep

4.1.2 Patiëntgerelateerde parameters

De patiëntgerelateerde parameters die werden onderzocht voor hun rol in de ontwikkeling van

acute normale weefselcomplicaties zijn leeftijd, geslacht, PY en DrW. Voor acute dysfagie en

dermatitis bleken geen van deze parameters significant te verschillen tussen de CTC0-2 en

CTC3+ groep. Met betrekking tot mucositis werd gevonden dat patiënten uit de CTC3+ groep

significant meer rookten (hoger aantal PY) dan de patiënten uit de CTC0-2 groep. Deze

parameter werd beschouwd als confounder in de analyse naar de rol van genetische

parameters in de ontwikkeling van ernstige acute mucositis (p= 0.003).

4.2 Analyse van de associatie van SNPs en acute radiosensitiviteit

De analyses van de SNPs met betrekking tot de ontwikkeling van acute klinische

radiosensitiviteit werden beperkt tot de totale patiëntengroep. Na onderverdeling van de

standaard en DD subgroep volgens de verschillende genotypes worden de aantallen in de

groepen te klein, waardoor statistische analyse op deze populaties betekenisloos is. Door de

verschillen die gevonden werden in het gemiddelde dosis-volume bereik (sectie 4.1.1.b) ter

hoogte van de kritische structuren is het wel belangrijk om in de toekomst na uitbreiding van

de patiëntenpopulaties de twee groepen afzonderlijk te analyseren.

Resultaten

39

Voor het nagaan van de associatie tussen enerzijds de aanwezigheid van SNPs in DNA DSB

herstelgenen en TGFβ1 en anderzijds het optreden van ernstige acute weefselcomplicaties na

RT, werden de data gecorrigeerd voor alle therapie en patiëntgerelateerde parameters die uit

de voorgaande analyses (sectie 4.1.1 en 4.1.2) als risicofactoren beschouwd werden voor de

ontwikkeling van graad CTC3+ acute weefseltoxiciteiten. Vooraleer deze analyse kon

gebeuren, werd gecontroleerd of er voldaan werd aan het HWE. Alle SNPs voldeden aan dit

evenwicht.

A. Acute dysfagie

De resultaten genotype analyse en het risico voor het optreden van acute dysfagie staan

weergegeven in bijlage G.2. Uit de data kan afgeleid worden dat de aanwezigheid van 1

variant allel van de XRCC3 c.722 SNP gepaard gaat met een verhoogd risico op de

ontwikkeling van SAD (OR= 1.97). Dit risico ligt nog hoger bij dragers van beide variante

allelen (OR= 2.56). Voor het TGFβ1 c.74G>C variant allel (GC) werd een meer dan 3-voudig

verhoogd risico gevonden. Voor deze resultaten werd echter geen significantie bereikt (p=

0.218, 0.105 resp.). De aanwezigheid van het Ku70 c.-1310 HV genotype (GG) lijkt

geassocieerd met een verhoogd risico voor de ontwikkeling van ernstige dysfagie (OR= 1.82).

Voor de andere SNPs werden geen noemenswaardige verschillen in genotypefrequenties

gevonden tussen de CTC0-2 en CTC3+ groep.

In figuur 3.13 staan de genotypefrequenties van XRCC3 c.722C>T, Ku70 c.-1310C>G en

TGFβ1 c.74G>C besproken.

Figuur 3.13: Risicoanalyse acute dysfagie: genotypefrequenties van de XRCC3 c.722C>T, Ku70 c.-1310C>G en TGFβ1 c.74G>C SNPs

B. Mucositis

De resultaten van de SNP analyse voor mucositis worden weergegeven in bijlage G.2. Het HE

TGFβ1 c.-800G genotype is significant frequenter aanwezig bij de niet tot matig

41.148.2

10.7

28.6

57.1

14.3

0

20

40

60

80

100

CC CT TTGen

otyp

efre

quen

ties

(%)

Genotype

XRCC3 c.722 C>T

28.6

48.2

23.228.6 38.1 33.3

0

20

40

60

80

100

CC CG GGGen

otyp

efre

quen

ties

(%)

Genotype

Ku70 c.-1310 C>G

CTC0-2 CTC3+

89.3

8.91.8

70.0

25.05.0

0

20

40

60

80

100

GG GC CC

Gen

otyp

efre

quen

ties

(%)

Genotype

TGFβ1 c.74 G>C

Resultaten

40

radiosensitieve patiënten, wat wijst op een beschermend effect van het variant allel (OR=

0.11, p= 0.046). De invloed van beide variante allelen kon niet worden nagegeaan.

De aanwezigheid van 1 variant allel voor de TGFβ1 c.-800G>A SNP vertoont een significant

negatieve associatie met de ontwikkeling van ernstige acute mucositis, wat wijst op een

beschermend effect van het variant allel. De aanwezigheid van het TGFβ1 c.74 HE genotype

geeft aanleiding tot een sterk verhoogd (maar niet significant) risico op de ontwikkeling van

ernstige acute mucositis (OR= 4.93, p= 0.104). Bij de aanwezigheid van 1 of beide variante

allelen werd een meer dan 8-voudig significant verhoogd risico gevonden (OR= 8.29, p=

0.019). Voor de andere SNPs werden geen noemenswaardige verschillen gevonden tussen de

niet- tot matig radiosensitieve en de ernstig radiosensitieve groep. In figuur 3.14 staan de

genotypefrequenties van TGFβ1 c.-800G>A en TGFβ1 c.74G>C besproken.

Figuur 3.14: Risicoanalyse mucositis: genotypefrequenties van de TGFβ1 c.-800 G>A en TGFβ1 c.74G>C SNPs.

C. Dermatitis

De resultaten met betrekking tot de SNP analyse voor dermatitis worden beschreven in bijlage

G.2. Uit deze resultaten lijken de XRCC3 c.722 en vooral de TGFβ1 c.-800 HE genotypes

geassocieerd te zijn met een verhoogd risico op de ontwikkeling van ernstige acute dermatitis

(OR = 2.14 en 3.77 resp.). Er werd echter geen significantie bereikt (p= 0.399, 0.120 resp.).

Voor de andere onderzochte SNPs werden geen noemenswaardige verschillen in

genotypefrequenties tussen de CTC0-2 en CTC3+ groep gevonden. In figuur 3.15 staan de

genotypefrequenties van XRCC3 c.722C>T en TGFβ1 c.-800G>A besproken.

Figuur 3.15: Risicoanalyse dermatitis: genotypefrequenties van de XRCC3 c.722C>T en TGFβ1 c.-800 G>A en SNPs

40.6

64.4

13.030.0

70.0

0.00

20

40

60

80

100

CC CT TTGen

otyp

efre

quen

ties

(%)

Genotype

XRCC3 c.722C>T

CTC0-2

CTC3+

84.1

14.51.4

70.0

30.0

0.00

20406080

100

GG GA AA

Gen

otyp

efre

quen

ties

(%)

Genotype

TGFβ1 c. -800 G>A

79.7

18.6

1.7

90.0

10.00.0

020406080

100

GG GA AAGen

otyp

efre

quen

ties

(%)

Genotype

TGFβ1 c. -800 G>A

CTC0-2

CTC3+

88.1

11.9 0.0

68.4

21.110.5

020406080

100

GG GC CCGen

otyp

efre

quen

ties

(%)

Genotype

TGFβ1 c.74 G>C

Discussie

41

Discussie

In deze thesis werd de associatie onderzocht tussen SNPs in DNA DSB herstelgenen (XRCC3

c.722C>T en Ku70 c.-1310C>G), TGFβ1 (c.-509C>T, c.-800G>A en c.74G>C) en de

ontwikkeling van acute (mucositis, dermatitis en dysfagie) en chronische (fibrose, xerostomie

en dysfagie) normale weefselcomplicaties. Een onderdeel van deze thesis was ook de

optimalisatie van de HRM protocols voor XRCC3 c.722C>T en Ku70 c.-1310C>G.

1. Optimalisatie HRM protocols

1.1 XRCC3 c.722 C>T

De optimalisatie van dit protocol verliep vlot. Het juiste primerpaar en reactiecondities werd

bij de eerste optimalisatiereactie gevonden, waardoor alle patiëntenstalen snel gegenotypeerd

konden worden. Een reden voor de snelle optimalisatie ligt in het feit dat de XRCC3

c.722C>T variant een klasse 1 SNP is, waarbij het verschil in smelttemperatuur tussen de HN

en HV stalen redelijk hoog ligt (>0.5°C) en dus gemakkelijk te onderscheiden is [57].

1.2 Ku70 c.-1310 C>G

De optimalisatie van het Ku70 c.-1310C>G (een klasse 3 SNP) protocol verliep minder vlot.

Dit polymorfisme behoort tot de klasse 3 SNPs, waarbij het verschil in Tm tussen de HN en

HV stalen kleiner is dan 0.2°C. Geen van de geselecteerde primerparen leek ideaal te zijn en

enkel de HE stalen konden geïdentificeerd worden. Ook na verhoging van de Ta en de MgCl2

concentratie konden de homozygote stalen niet onderscheiden worden. In de literatuur werd

de spike-in techniek voorgesteld als oplossing voor dit probleem. Toevoeging van een zelfde

hoeveelheid HN DNA maakte het uiteindelijk wel mogelijk alle stalen te genotyperen. Een

nadeel van deze techniek is echter dat het experiment dubbel moet worden uitgevoerd,

éénmaal zonder en éénmaal met gekend HN DNA waardoor deze methode meer materiaal

kost [57].

2. Associatiestudie naar chronische en acute radiosensitiviteit

De SNPs onderzocht in deze thesis zijn gelegen in de promotor of coderende regio’s van het

gen en kunnen dus een belangrijke invloed hebben op de hoeveelheid en de functionaliteit van

het geproduceerde eiwit.

Discussie

42

2.1 Chronische normale weefselcomplicaties

In het onderzoek naar chronische weefselcomplicaties speelden in deze thesis noch de

onderzochte dosisparameters en bijkomende behandelingen, noch de patiëntgerelateerde

parameters een rol in de ontwikkeling van late toxiciteiten in de gezonde weefsels.

2.1.1 XRCC3 c.722 C>T

Met betrekking tot de ontwikkeling van chronische weefselcomplicaties kon in deze thesis

geen associatie aangetoond worden met de XRCC3 c.722C>T SNP. In overeenstemming met

deze resultaten kon ook in de studie van Alsbeih et al. geen associatie aangetoond worden bij

het onderzoek naar de ontwikkeling van fibrose na RT bij patiënten met tumoren in de

nasofarynx [52]. In de studie van Andreassen et al. werd deze SNP wel geassocieerd met de

ontwikkeling van ernstige fibrose bij patiënten behandelt met RT na mastectomie [40]. Deze

associatie kon in een grotere validatie studie echter niet meer bevestigd worden[43]. Met

betrekking tot de ontwikkeling van ernstige late weefselcomplicaties na behandeling van

prostaatkankerpatiënten werd in de studie van Burri et al. een significante associatie

gevonden met deze SNP [51]. Het feit dat in deze thesis geen associatie gevonden werd kan

enerzijds te wijten zijn aan de mogelijks weefselspecifieke werking van het XRCC3 eiwit met

betrekking tot chronische toxiciteit. Anderzijds is XRCC3 een eiwit betrokken in het herstel

van DSBs, een proces dat werkzaam is in de periode tijdens en kort na de

stralingsblootstelling.

2.1.2 Ku70 c.-1310 C>G

In deze thesis kon geen associatie aangetoond worden tussen de ontwikkeling van chronische

weefselcomplicaties en de Ku70 c.-1310C>G SNP. Slechts in een enkele studie werd de rol

van deze SNP naar chronische toxiciteit onderzocht. Hierbij werd het variant allel

geassocieerd met een verhoogd risico op de ontwikkeling van chronische

weefselcomplicaties, meerbepaald bij de ontwikkeling van dysurie bij prostaat-

kankerpatiënten na RT [48]. De verschillen in protocol (indeling patiënten, type

weefselcomplicaties, gebruik van carbon ion RT) kunnen een verklaring zijn voor de

verschillende resultaten.

Discussie

43

2.1.3 TGFβ1 c.-509 C>T

In deze thesis werd het HV TGFβ1 c.-509 genotype (TT) geassocieerd met een

risicoverhoging voor de ontwikkeling van matig tot ernstige fibrose (OR= 1.92). Ook met

betrekking tot de ontwikkeling van CTC2+ graad chronische dysfagie en xerostomie werd het

TT genotype geassocieerd met een risicoverhoging (OR= 1.70; 1.46 resp.). De rol van deze

SNP in de ontwikkeling van xerostomie en chronische dysfagie bij H&N kankerpatiënten

werd echter nog niet onderzocht door andere onderzoeksgroepen, waardoor geen vergelijking

met literatuurdata mogelijk was voor deze weefselcomplicaties. Slechts een enkele studie met

betrekking tot fibrose bij H&N kankerpatiënten werd gevonden. Hier kon echter geen

associatie aangetoond worden [44].

Met betrekking tot andere kankertypes werden wel reeds verschillende studies uitgevoerd met

oog op het vinden van een associatie tussen dit polymorfisme en fibrose na de behandeling

met RT. In de studie van Quarmby et al. werd een significant positieve associatie gevonden

tussen het c.-509 TT genotype en het optreden van ernstige stralinggeïnduceerde fibrose bij

borstkankerpatiënten (OR= 3.4) [39]. In de studies van Andreassen et al. en Giotopoulos et al.

werden deze resultaten bevestigd. In deze laatste studie werd deze SNP zelfs geassocieerd met

een 14.7-voudige risicoverhoging (p< 0.001) [20,40]. Ook in het onderzoek van De Ruyck et

al. naar late klinische radiosensitiviteit bij gynaecologische kankerpatiënten werd dezelfde

trend gezien, maar kon geen significantie aangetoond worden (OR= 4.0). In overeenstemming

met deze thesis werd de recessieve werking van de SNP in deze studie ook gevonden [41].

Ondanks deze overtuigende publicaties werd deze associatie in een meer recent artikel van

Andreassen et al. (2006) niet meer gevonden [43]. Ook in de studie van Yuan et al. werd deze

SNP niet aangeduid als risicofactor bij de ontwikkeling van pneumotitis na behandeling van

longkankerpatiënten met RT [42]. Het is duidelijk dat omtrent deze SNP nog geen consensus

bestaat, hierbij is het ook belangrijk om de gevonden resultaten in een grotere groep patiënten

te valideren.

2.1.4 TGFβ1 c.-800 G>A

Uit de resultaten van de analyses voor de TGFβ1 c.-800G>A SNP met betrekking tot

chronische toxiciteiten bleek dat het c.-800 GA genotype significant geassocieerd is met een

sterk verhoogd risico met de ontwikkeling van matig tot ernstige fibrose (OR= 10.0; p=

0.003). Deze significantie is te wijten aan het zeer grote verschil in de frequentie van het

Discussie

44

variante allel tussen de CTC0-1 en CTC2+ groep (6.5% vs. 30.0%). Omdat de CTC2+ groep

slechts 10 patiënten telt, kan de hoge variante allelfrequentie te wijten zijn aan toeval. Daarom

is het belangrijk dat men deze sterke risicoverhoging nuanceert en dat er verder onderzoek

met een grotere groep patiënten gebeurt om een waardevol besluit te kunnen nemen over de

associatie van deze SNP en de ontwikkeling van ernstige fibrose.

Met betrekking tot de ontwikkeling van xerostomie vertoont het HE genotype (GA) een 2-

voudige protectieve rol. Dit gegeven werd echter niet significant bevonden. De frequenties

van het variante allel lagen voor zowel de CTC0-2 groep als de CTC3+ groep rond de

normale frequentie volgens NCBI (≈10%) [36].

De associatie van deze SNP met de ontwikkeling van chronische weefselcomplicaties bij

H&N kankerpatiënten na behandeling met RT werden tot nog toe niet onderzocht. Met

betrekking tot de ontwikkeling van late weefselcomplicaties na RT behandeling van

gynaecologische tumoren en borstkanker werd voor deze SNP in de studie van De Ruyck et

al. en Quarmby et al. geen associatie gevonden [39,41].

2.1.5 TGFβ1 c.74G>C

In deze thesis werd geen associatie gevonden tussen de TGFβ1 c.74G>C SNP en de

ontwikkeling van chronische weefselcomplicaties na RT bij H&N kankerpatiënten. De SNP

werd tevens onderzocht in de eerder vermelde studies van Quarmby et al., Andreassen et al.,

De Ruyck et al. en Yuan et al. [39-42]. Deze onderzoeken bevestigen de afwezigheid van een

associatie tussen deze SNP en de ontwikkeling van late weefselcomplicaties na RT

behandeling bij borst, gynaecologische- en long kankerpatiënten.

2.2 Acute normale weefselcomplicaties

Binnen de onderzoeksgroep werd reeds een associatie studie uitgevoerd naar de ontwikkeling

van acute radiosensitiviteit en de aanwezigheid van SNPs in DNA herstelgenen (waaronder

XRCC3 c.722C>T en Ku70 c.-1310C>G). Uit deze studie werden sterk significante

verschillen gevonden in de dosis distributie tussen de CTC0-2 en CTC3+ groep. Zowel de

Dmean als de Dmin_circumferentie op de 3 faryngeale constrictorspieren (SPC, MPC en IPC) lagen

significant hoger in de CTC3+ groep. Geen van deze dosisparameters werden echter in deze

thesis significant bevonden in de huidige populatie. Enkel de Dmean op de SPC was

‘borderline’ significant (p= 0.052).

Discussie

45

Wanneer de gemiddelde DVH data op deze structuren vergeleken werd tussen de patiënten uit

de studie van Werbrouck et al. en de patiënten uit deze thesis zag men dat het dosisbereik

voor zowel de CTC0-2 als de CTC3+ groepen lager lag bij de huidige populatie. Dit was ook

te verwachten aangezien de huidige patiëntengroep bestaat uit patiënten uit een dosis-de-

escalatie groep en patiënten behandeld met de huidige standaard (meer weefselsparende)

IMRT protocols. De gemiddelde DVHs van de CTC0-2 en CTC3+ groepen liggen ook minder

ver uiteen voor elk van deze acute weefselcomplicaties.

Uit de studie van Werbrouck et al. bleek chemotherapie geen rol te spelen bij de ontwikkeling

van SAD. Uit de resultaten van deze thesis bleek deze parameter echter wel een belangrijke

rol te spelen bij de ontwikkeling van SAD [19]. Omdat de ervaring in de kliniek aangetoond

heeft dat het geven van concomitante RT een meer efficiënte behandeling van H&N

kankerpatiënten geeft werd in de huidige behandelingsschema’s de toepassing van

concomitante chemotherapie opgedreven in vergelijking met de pilootstudie. Dit verschil

geeft een logische verklaring waarom chemotherapie nu wel een belangrijke parameter is bij

de ontwikkeling van SAD [9,19].

Met betrekking tot de ontwikkeling van ernstige acute mucositis bleek in de studie van

Werbrouck et al. enkel de Dmean ter hoogte van de mondholte significant hoger te liggen in de

CTC3+ groep. In deze thesis werd naast de Dmean ter hoogte van de mondholte ook de Dmean

op de mucosa significant verschillend gevonden tussen de CTC0-2 en CTC3+ groep (p=

0.001, 0.003 resp.) Verder bleek uit de huidige studie ook het rookgedrag een significante rol

te spelen bij de ontwikkeling van ernstige mucositis (p= 0.003).

Bij de ontwikkeling van ernstige dermatitis bleek uit deze thesis de Dmean op de huid (skin5mm)

een significante rol te spelen (p= 0.012), terwijl dat niet het geval was in de studie van

Werbrouck et al. [19].

2.2.1 XRCC3 c.722C>T

Slechts een enkele studie met betrekking tot de associatie van deze SNP en het optreden van

weefselcomplicaties bij H&N kankerpatiënten werd gepubliceerd. Dit is de pilootstudie van

Werbrouck et al. die binnen de onderzoeksgroep werd uitgevoerd. Uit deze studie bleek het

HE XRCC3 c.722 (CT) genotype significant geassocieerd te zijn met een verhoogd risico op

de ontwikkeling van SAD (OR= 4.47) [19]. Ook in de huidige studie werd deze SNP

geassocieerd met een risicoverhoging op SAD (OR= 2.56). Uit de resultaten van deze thesis

bleek dat het HE genotype ook positief geassocieerd is met de ontwikkeling van ernstige

Discussie

46

dermatitis (OR= 2.04). In de studie van Popanda et al. werd de associatie van deze SNP bij de

ontwikkeling van acute toxiciteit bevestigd bij RT-behandelde prostaatkankerpatiënten [50].

Ondanks deze resultaten werd in de literatuur aangetoond dat deze SNP geen invloed heeft op

de functie van het gen binnen de HR [64]. Een mogelijk verklaring voor de gevonden

associatie kan zijn dat het XRCC3 gen in linkage-equilibrium is met een andere (tot op

vandaag ongeïdentificeerde) SNP die verantwoordelijk is voor het ontstaan van de acute

weefseltoxiciteiten.

2.2.2 Ku70 c.-1310 C>G

In deze thesis werd een positieve associatie gevonden tussen de ontwikkeling van SAD en het

HV Ku70 c.-1310 genotype (OR= 1.82). Deze resultaten liggen in lijn met wat gevonden

werd in de studie van Werbrouck et al. waar de aanwezigheid van 1 of 2 variante allelen voor

de Ku70 c.-1310 SNP significant geassocieerd werden met een risicoverhoging bij de

ontwikkeling van SAD na RT bij H&N kankerpatiënten [19]. Geen andere studies die de

associatie tussen deze SNP en acute RT effecten onderzochten werden reeds gepubliceerd.

2.2.3 TGFβ1 c.-509 C>T

De onderzoeken met betrekking tot SNPs in TGFβ1 worden over het algemeen geplaatst in

het kader van late weefselcomplicaties. In deze thesis werd echter ook de invloed van deze

SNPs nagegaan bij de ontwikkeling van acute weefselcomplicaties. Er konden echter geen

associaties aangetoond worden. Ook in de literatuur werd deze SNP tot nog toe niet gelinkt

met de ontwikkeling van acute weefseltoxiciteiten.

2.2.4 TGFβ1 c.-800 G>A

Uit de resultaten van deze thesis bleek het TGFβ1 c.-800 HE genotype een verhoogd risico te

geven voor de ontwikkeling van ernstige acute dermatitis (OR= 3.77). Hierbij moet

opgemerkt worden dat het aantal patiënten in de CTC3+ groep zeer laag is (n= 10) en dat deze

risicoverhoging dus moet genuanceerd worden. Voor ernstige mucositis was het c.-800 GA

genotype significant geassocieerd met een sterk verlaagd risico voor deze complicatie (OR=

0.11; p= 0.046). Wegens de lage aantallen in de CTC3+ groepen, zeker in het onderzoek naar

acute dermatititis, is het noodzakelijk de studie uit te voeren bij een veel grotere groep

Discussie

47

patiënten. Deze SNP werd tot nog toe niet onderzocht naar zijn associatie met de

ontwikkeling van acute weefseltoxiciteit.

2.2.5 TGFβ1 c.74G>C

Uit deze thesis bleek het HE en HV genotype van de TGFβ1 c.74 G>C SNP geassocieerd te

zijn met een risicoverhoging voor de ontwikkeling van SAD (OR= 2.90). Verder bleek bij de

ontwikkeling van ernstige mucositis het TGFβ1 c.74 de aanwezigheid van 1 of beide variante

allelen significant geassocieerd met een sterke risicoverhoging (OR= 8.29; p= 0.019). Deze

sterke risicoverhoging moet ook hier genuanceerd worden door de relatief kleine CTC3+

groep waardoor de hoge variante allelfrequentie in deze groep aan het toeval te wijten kan

zijn.

Door het gebrek aan publicaties die de relatie van deze SNP en de ontwikkeling van acute

weefselcomplicaties onderzochten konden de resultaten van deze thesis met betrekking tot

acute toxiciteit niet worden vergeleken met de literatuur.

Besluit

Uit dit onderzoek lijkt zowel de XRCC3 c.722 SNP (bij dysfagie en dermatitis) als de Ku70

c.-1310 SNP (bij dysfagie) geassocieerd te zijn met de ontwikkeling van acute

weefselcomplicaties. Verder lijkt ook TGFβ1 (c.74, c.-800) een rol te spelen bij het optreden

van acute weefselcomplicaties na RT. Met betrekking tot de ontwikkeling van chronische

weefelcomplicaties bleek zowel de TGFβ1 c.-800 SNP (bij xerostomie en fibrose) als de

TGFβ1 c.-509 SNP ( bij xerostomie, fibrose en dysfagie) een mogelijke rol te spelen. De

associaties naar chronische toxiciteit moeten echter wel genuanceerd worden door het kleine

aantal patiënten in de CTC2+ groepen. Verder onderzoek bij een grotere patiëntenpopulaties

is nodig om de statistische power op te drijven.

Analyse van de dosisparameters toonde aan dat Dmean op de skin5mm, mucosa, mondholte en

SPC sterk verschillen tussen de subgroepen in de analyses naar de ontwikkeling van acute

toxiciteiten. Hoe hoger de dosis op deze structuren hoe sterker het risico op ernstige

dermatitis, mucositis en dysfagie respectievelijk. Ook het gebruik van concomitante

chemotherapie bleek significant geassocieerd met de ontwikkeling van SAD. In tegenstelling

hiermee lijken de therapiegerelateerde parameters echter geen rol te spelen in de ontwikkeling

van chronische toxiciteit in de H&N regio.

Referentielijst

48

Referentielijst

1. Argiris A, Karamouzis MV, Raben D, Ferris RL (2008). Head and neck cancer. Lancet 371(9625):1695-1709. 2. National Cancer Institute (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/head-and-neck). 3. Pinar T, Akdur R, Tuncbilek A, Altundag K, Cengiz M (2007). The relationship between occupations and head

and neck cancers. Journal of the national medical association 99(1):64,68-71. 4. Vokes EE, Weichselbaum RR, Lippman SM, Hong WK (1993). Head and neck cancer. The new England journal

of medicine 328(3):184-194. 5. Stelow EB, Mills SE (2005). Squamous cell carcinoma variants of the upper aerodigestive tract. American

journal of clinical pathology 124(Suppl 1):96-109. 6. Werbrouck J, De Ruyck K, Duprez F, Van Eijkeren M, Rietzschel E, Bekaert S, Vral A, De Neve W, Thierens H

(2008). Single-nucleotide polymorphisms in DNA double-strand break repair genes: association with head and neck cancer and interaction with tobacco use and alcohol consumption. Mutation research 656(1-2):74-81.

7. Ang KK (2008). Multidisciplinary management of locally advanced SCCHN: optimizing treatment outcomes. The Oncologist 13(8):899-910.

8. Alderden RA, Hall MD, Hambley TW (2006). The discovery and development of cisplatin. Journal of chemical education 83(5):728-734.

9. Bernier J, Domenge C, Ozsahin M, Matuszewska K, Lefebvre JL, Greiner RH, Giralt J, Maingon P, Rolland F, Bolla M, Cognetti F, Bourhis J, Kirkpatrick A, van Glabbeke M (2004). Postoperative irradiation with or without concomitant chemotherapy for locally advanced head and neck cancer. The new England journal of medicine 350(19)):1945-1954.

10. Bonner JA, Harari PM, Giralt J, Azarnia N, Shin DM, Cohen RB, Jones CU, Sur R, Raben D, Jassem J, Ove R, Kies MS, Baselga J, Youssoufian H, Amellal N, Rowinsky EK, Ang KK (2006). Radiotherapy plus cetuximab for squamous-cell carcinoma of the head and neck. The new England journal of medicine 354(6):567-578.

11. Giro C, Berger B, Bölke E, Ciernik IF, Duprez F, Locati L, Maillard S, Ozsahin M, Pfeffer R, Robertson AG, Langedijk JA, Budach W (2009). High rate of severe radiation dermatitis during radiation therapy with concurrent cetuximab in head and neck cancer: Results of a survey in EORTC institutes. Radiotherapy and Oncology 90(2):166-171.

12. Hendry JH, Jeremic B, Zubizarreta EH (2006). Normal tissue complications after radiation therapy. Pan American journal of public health 20(2-3):151-160.

13. Hong Ts, Tomé WA, Harari PM (2005). Intensity-modulated radiation therapy in the management of head and neck cancer. Current opinion in oncology 17(3):231-235.

14. Bourguignon MH, Gisone PA, Perez MR, Michelin S, Dubner D, Giorgio MD, Carosella ED (2005). Genetic and epigenetic features in radiation sensitivity. Part 2: implications for clinical practice and radiation protection. European journal of nuclear medicine and molecular imaging 32(3):351-368.

15. Nguyen NP, Sallah S, Karlsson U, Antoine JE (2002). Combined chemotherapy and radiation therapy for head and neck malignancies: quality of life issues. Cancer 94(4):1131-1141.

16. Common terminology criteria for adverse events v3.0 (CTCAE) (http://ctep.cancer.gov/protocol Development/electronic_applications/docs/ctcaev3.pdf).

17. Barnett GC, West CM, Dunning AM, Elliott RM, Coles CE, Pharoah PD, Burnet NG (2009). Normal tissue reactions to radiotherapy: towards tailoring treatment dose by genotype. Nature reviews. Cancer 9(2):134-142.

18. Filippi AR, Franco P, Ricardi U (2006). Is clinical radiosensitivity a complex genetically controlled event? Tumori 92(2):87-91.

19. Werbrouck J, De Ruyck K, Duprez F, Veldeman L, Claes K, Van Eijkeren M, Boterberg T, Willems P, Vral A, De Neve W, Thierens H (2009). Acute normal tissue reactions in head-and-neck cancer patients treated with IMRT: influence of dose and association with genetic polymorphisms in DNA DSB repair genes. International journal of radiation oncology, biology, physics 73(4):1187-1195.

20. Giotopoulos G, Symonds RP, Foweraker K, Griffin M, Peat I, Osman A, Plumb M (2007). The late radiotherapy normal tissue injury phenotypes of telangiectasia fibrosis and atrophy in breast cancer patients have distinct genotype-dependent causes. British journal of cancer 96(6):1001-1007.

21. Stone HB, Coleman CN, Anscher MS, McBride WH (2003). Effects of radiation on normal tissue consequences and mechanisms. The lancet oncology 4(9):529-536.

22. Dörr W, Hendry JH (2001). Consequential late effects in normal tissue. Radiotherapy and oncology 61(3):223-231.

23. Murphy BA, Gilbert J, Cmelak A, Ridner SH (2007). Symptom control issues and supportive care for patients with head and neck cancer. Clinical advances in hematology & oncology: H&O 5(10):807-822.

24. Palazzi M, Tomatis S, Orlandi E, Guzzo M, Sangalli C, Potepan P, Fantini S, Bergamini C, Gavazzi C, Licitra L, Scaramellini G, Cantu G, Olmi P (2008). Effects of treatment intensification on acute local toxicity during

Referentielijst

49

radiotherapy for head and neck cancer: prospective observational study validating CTCAE, version 3.0, scoring system. International journal of radiation oncology, biology, physics 70(2):330-337.

25. Scully C, Epstein J, Sonis S (2003). Oral mucositis: a challenging complication of radiotherapy, chemotherapy, and radiochemotherapy: part 1, pathogenesis and prophylaxis of mucositis. Head & Neck 25(12):1057-1070.

26. Henson BS, Inglehart MR, Eisbruch A, Ship JA (2001). Preserved salivary output and xerostomia-related quality of life in head and neck cancer patients receiving parotid-sparing radiotherapy. Oral oncology 37(1):84-93.

27. Eisbruch A, Schwartz M, Rasch C, Vineberg K, Damen E, Van As CJ, Marsh R, Pameijer FA, Balm AJ (2004). Dysphagia and aspiration after chemoradiotherapy for head-and-neck cancer: which anatomic structures are affected and can they be spared with IMRT? International journal of radiation oncology, biology, physics 60(5):1425-1439.

28. Platteaux N, Dirix P, Dejaeger E, Nuyts S (2009). Dysphagia in head and neck cancer patients treated with chemoradiotherapy. Dysphagia in druk.

29. Murphy Ba, Gilberd J (2008). Dysphagia in head and neck cancer patients treated with radiation: assessment, sequelae and rehabilitation. Seminars in radiation oncology 19(1):35-42.

30. Martin M, Lefaix J, Delanian S (2000). TGF-beta1 and radiation fibrosis: a master switch and a specific therapeutic target? International journal of radiation oncology, biology, physics 47(2):277-290.

31. Sakata K, Matsumoto Y, Tauchi H, Satoh M, Oouchi A, Nagakura H, Koito K, Hosoi Y, Suzuki N, Komatsu K, Hareyama M (2001). Expression of genes involved in repair of DNA double-strand breaks in normal and tumor tissues. International journal of radiation oncology, biology, physics 49(1):161-167.

32. Weterings Eric, Chen DJ (2008). The endless tale of non-homologous end-joining. Cell research 18(1):114-124. 33. Jackson PS (2002). Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis 23(5):687-696. 34. Novakova-Jiresova A, Van Gameren MM, Coppes RP, Kampinga HH, Groen HJ (2004). Transforming growth

factor-β plasma dynamics and post-irradiation lung injury in lung cancer patients. Radiotherapy and oncology 71(2):183-189.

35. Bentzen SM (2006). Preventing or reducing late side effects of radiation therapy: radiobiology meets molecular pathology. Nature reviews. Cancer 6(9):702-713.

36. National center for biotechnology information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 37. Savas S, Geraci J, Jurisica I, Liu G (2009). A comprehensive catalogue of functional genetic variations in the

EGFR pathway: protein-protein interaction analysis reveals novel genes and polymorphisms important for cancer research. International journal of cancer 125(6):1257-1265.

38. Grainger DJ, Heathcote K, Chiano M, Snieder H, Kemp PR, Metcalfe JC, Carter ND, Spector TD (1999). Genetic control of the circulating concentration of transforming growth factor typ β1. Human molecular genetics 8(1):93-97.

39. Quarmby S, Fakhoury H, Levine E, Barber J, Wylie J, Hajeer AH, West C, Stewart A, Magee B, Kumar S (2003). Association of transforming growth factor beta-1 single nucleotide polymorphisms with radiation-induced damage to normal tissues in breast cancer patients. International journal of radiation biology 79(2):137-143.

40. Andreassen CN, Alsner J, Overgaard M, Overgaard J (2003). Prediction of normal tissue radiosensitivity from polymorphisms in candidate genes. Radiotherapy and oncology 69(2):127-135.

41. De Ruyck K, Van Eijkeren M, Claes K, Bacher K, Vral A, De Neve W, Thierens H (2006). TGFβ1 polymorphisms and late clinical radiosensitivity in patients treated for gynecologic tumors. Radiation oncology, biology, physics 65(4):1240-1248.

42. Yuan X, Liao Z, Liu Z, Wang LE, Tucker SL, Mao L, Wang XS, Martel M, Komaki R, Cox JD, Milas L, Wei Q (2009). Single nucleotide polymorphism at rs1982073: T869C of the TGFβ1 gene is associated with the risk of radiation pneumonitis in patients with definitive radiotherapy. Journal of clinical oncology 27(20):3370-3378.

43. Andreassen CN, Alsner J, Overgaard M, Sørensen FB, Overgaard J (2006). Risk of radiation-induced subcutaneaous fibrosis in relation to single nucleotide polymorphisms in TGFB1, SOD2, XRCC1, XRCC3, APEX and ATM – a study based on DNA from formalin fixed paraffin embedded tissue samples. International journal of radiation biology 82(8):577-586.

44. Andreassen CN, Grou C, Alsner J, Overgaard J (2007). Are TGF-beta 1 polymorphisms potential predictors of fibrosis risk after radiotherapy? – a subset analysis from the DAHANCA 6 and 7 protocols. European journal of cancer supplements 5(4):119.

45. Awad MR, El-Gamel A, Hasleton P, Turner DM, Sinnott PJ, Hutchinson IV (1998). Genotypic variation in the transforming growth factor-[beta]1 gene: association with transforming growth factor-[beta]1 production, fibrotic lung disease and graft fibrosis after lung transplantation. Transplantation 66(8):1014-1020.

46. Omori S, Takiguchi Y, Suda A, Sugimoto T, Miyazawa H, Takiguchi Y, Tanabe N, Tatsumi K, Kimura H, Pardington PE, Chen F, Chen DJ, Kuriyama T (2002). Suppression of a DNA double-strand break repair gen, Ku70, increases radio-and chemosensitivity in a human lung carcinoma cell line. DNA repair 1(4):299-310.

Referentielijst

50

47. Gu Y, Jin S, Gao Y, Weaver DT, Alt FW (1997). Ku70-deficient embryonic stem cells have increased ionizing radiosensitivity , defective DNA end-binding activity, and inability to support V(D)J recombination. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America 94(15):8076-8081.

48. Suga T, Iwakawa M, Tsuji H, Ishikawa H, Oda E, Noda S, Otsuka Y, Ishikawa A, Ishikawa K, Shimazaki J, Mizoe JE, Tsujii H, Imai T (2008). Influence of multiple genetic polymorphisms on genitourinary morbidity after carbon ion radiotherapy for prostate cancer. International journal of radiation oncology, biology, physics 72(3):808-813.

49. Kurumizaka H, Enomoto R, Nakada M, Eda K, Yokoyama S, Shibata T(2003). Region and amino acid residues required for Rad51C binding in the human Xrcc3 protein. Nucleic acids research 31(14):4041-4050.

50. Popanda O, Marquardt JU, Chang-Claude J, Schmezer P (2009). Genetic variation in normal tissue toxicity induced by ionizing radiation. Mutation research 667(1-2):58-69.

51. Burri RJ, Stock RG, Cesaretti JA, Atencio DP, Peters S, Peters CA, Fan G, Stone NN, Ostrer H, Rosenstein BS (2008). Association of single nucleotide polymorphisms in SOD2, XRCC1 and XRCC3 with susceptibility for the development of adverse effects resulting from radiotherapy for prostate cancer. Radiation research 170(1):49-59.

52. Alsbeih G, Al-Harbi N, Al-Hadyan K, El-Sebaie M, Al-Rajhi N (2010). Association between normal tissue complications after radiotherapy and polymorphic variations in TGFB1 and XRCC1 genes. Radiation research 173(4):505-511.

53. Duprez F, Bonte K, De Neve W, Boterberg T, De Gersem W, Madani I (2010). Regional relapse after intensity-modulated radiotherapy for head-and-neck cancer. International journal of radiation oncology, biology, physics in druk..

54. Singleton P (2000). DNA methods in clinical microbiology. The Netherlands: Kluwer academic publishers. 55. Chakrabarti R, Schutt CE (2001). The enhancement of PCR amplification by low molecular-weight sulfones.

Gene 274(1-2):293-298. 56. RestrictionMapper version 3 (http://restrictionmapper.org). 57. A guide to high resolution melting (HRM) analysis (https://products.appliedbiosystems.com). 58. Liew M, Pryor R, Palais R, Meadows C, Erali M, Lyon E, Wittwer C (2004). Genotyping of single-nucleotide

polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clinical chemistry 50(7):1156-1164. 59. Montgomery J, Wittwer CT, Palais R, Zhou L (2007). Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-

resolution DNA melting analysis. Nature protocols 2(1):59-66. 60. Ensembl genome browser (http://www.ensembl.org/index.html) 61. Oligonucleotide properties calculator (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html). 62. Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). 63. UCSC genome bioinformatics (http://genome.ucsc.edu). 64. Araujo FD, Pierce AJ, Stark JM, Jasin M (2002). Variant XRCC3 implicated in cancer is functional in

homology-directed repair of double-strand breaks. Oncogene 21(26):4176-4180.

i

Bijlage A: Algemene patiëntgegevens

1. Patiëntdata voor analyse naar chronische toxiciteit

Code Geslacht Leeftijd Pack-years† Drinks/week Chemo Heelkunde

RT067 m 60 45 105 ja ja RT075 m 65 55 0 neen ja RT079 m 73 60 7 ja ja RT081 m 47 23 40 ja ja RT082 m 54 19 150 ja neen RT084 m 53 4 8 ja ja RT089 v 61 16 0 neen neen RT099 m 52 37 30 neen ja RT108 m 52 37 95 neen neen RT109 m 62 25 21 neen ja RT117 v 54 56 0 neen neen RT119 m 70 30 10 ja neen RT128 m 74 32 21 ja neen RT129 m 51 34 18 neen ja RT130 m 54 30 42 neen ja RT137 m 57 38 30 neen ja RT138 v 51 70 5 ja ja RT144 m 70 63 70 ja ja RT145 m 80 38 0 neen ja RT147 m 55 35 25 ja ja RT148 v 67 13 0 ja neen RT149 m 69 13 6 neen ja RT153 v 49 5 0 neen ja RT163 m 40 20 70 ja ja RT166 m 73 38 34 neen neen RT168 m 65 3 40 ja ja RT169 m 54 8 21 ja ja RT179 m 58 38 50 neen neen RT191 m 63 5 4 neen neen RT198 m 69 15 4 ja ja RT214 m 50 22 60 neen ja RT224 m 61 0 10 neen ja RT243 m 59 19 22 ja neen RT245 m 58 50 40 ja neen RT246 m 62 15 17 neen neen RT247 m 75 18 20 ja neen RT249 m 62 0 5 ja ja RT251 v 60 27 13 neen ja RT260 m 45 15 30 neen ja

ii


RT261 m 49 25 16 neen ja RT270 m 68 36 0 ja neen RT275 m 65 45 60 neen neen RT284 v 65 47 36 neen neen RT287 m 55 23 30 neen neen RT305 m 57 25 54 ja neen RT310 m 67 63 30 ja ja RT316 m 59 12 60 ja ja RT317 m 70 30 0 neen ja RT318 v 56 10 30 neen neen RT333 m 49 45 40 ja ja RT357 m 58 15 77 neen neen RT358 m 61 20 5 ja ja RT382 m 67 4 105 neen neen RT391 v 56 15 0 neen neen RT394 v 69 50 20 neen neen RT399 m 57 50 20 neen neen RT406 m 40 0 2 neen neen RT408 m 52 30 7 neen neen RT422 m 70 22 12 neen neen RT426 m 47 0 25 neen neen RT427 m 73 27 14 neen neen

† Pack-years : (aantal sigaretten per dag /20) * aantal jaren gerookt

iii

2. Patiëntdata voor analyse naar acute toxiciteit


RT521 m 54 45 0 neen neen RT522 m 60 104 25 neen neen RT528 v 52 35 35 ja neen RT529 m 48 45 21 neen neen RT530 v 52 30 14 neen neen RT531 m 48 35 70 neen ja RT539 m 60 48 75 ja neen RT540 m 48 0 47 ja neen RT541 m 61 135 2 ja neen RT543 m 48 17.5 15 ja neen RT544 m 75 4 9 ja neen RT551 m 55 38 14 neen neen RT554 m 53 0 / ja neen RT555 m 53 60 14 ja ja RT556 m 52 65 14 neen neen RT557 m 69 30 50 neen neen RT561 m 63 30 4 neen neen RT562 m 68 28.5 107 neen ja RT563 v 72 0 23 neen ja RT568 m 54 12.5 35 neen neen RT575 m 70 28.7 / neen neen RT576 m 83 30 3 neen neen RT577 m 59 40 70 neen ja RT579 m 67 10 1 ja neen RT581 m 55 97.8 / neen ja RT583 m 54 25 22 neen ja RT584 m 55 10 1 neen neen RT585 m 56 22 21 ja neen RT586 v 68 43.5 / ja neen RT587 m 52 27 35 ja neen RT590 m 47 30 / ja neen RT592 m 66 22 23 neen neen RT595 m 75 40 1 ja neen RT600 v 72 37.5 7 neen neen RT608 m 65 30 1 ja neen RT612 m 71 43.5 8 neen neen RT613 m 48 50 7 neen ja RT614 m 52 37.5 56 ja ja RT620 m 51 40 13 ja neen RT626 m 71 36 14 neen neen RT627 m 56 40 20 ja neen RT636 m 62 60 4 neen neen

iv

Code Geslacht Leeftijd Pack-years† Drinks/week Chemo Heelkunde RT651 m 61 20 105 ja neen RT654 m 52 35 20 ja neen RT657 m 78 22.5 1 neen ja RT658 m 86 8.7 2 neen neen RT664 m 43 50 60 neen ja RT666 m 60 88 100 neen ja RT667 m 51 40 6 ja neen RT668 m 70 53 5 ja ja RT672 v 55 30 21 neen ja RT673 v 73 0 2 neen neen RT674 v 54 0 / ja neen RT675 m 62 60 160 ja neen RT678 v 86 0 / neen neen RT679 m 61 27 2 ja neen RT681 v 65 38 1 ja neen RT682 v 55 30 / ja neen RT684 m 66 50 50 ja neen RT685 m 66 25 100 ja neen RT687 m 57 63 15 ja neen RT688 m 51 18 7 ja neen RT690 m 50 30 30 ja neen RT692 m 61 25 3 neen neen RT694 m 65 50 10 ja neen RT695 m 74 43 30 ja neen RT696 m 65 17.5 14 neen neen RT700 m 66 80 100 ja neen RT701 m 73 68 40 neen neen RT703 m 56 60 / ja neen RT707 m 80 24 15 neen neen RT709 m 54 33 49 ja neen RT713 m 60 50 10 neen ja RT714 v 60 30 42 neen neen RT722 m 52 / / ja neen RT723 m 59 40 30 ja neen RT727 m 59 39.5 50 ja neen RT730 m 67 50 70 neen ja RT731 m 60 41 100 ja ja

† Pack-years : (aantal sigaretten per dag /20) x aantal jaren gerookt

v

Bijlage B: CTC-scores

Code

Chronische weefselcomplicaties

Code

Acute weefselcomplicaties

Fibrose Xerostomie Dysfagie Mucositis Dermatitis Dysfagie

RT067 2 2 3 RT521 3 3 3 RT075 2 0 0 RT522 3 2 2 RT079 0 2 1 RT528 3 2 3 RT081 0 2 2 RT529 2 3 2 RT082 0 1 0 RT530 1 2 2 RT084 1 1 1 RT531 2 2 1 RT089 / / 3 RT539 2 2 3 RT099 1 1 2 RT540 2 2 3 RT108 1 2 1 RT541 2 2 2 RT109 1 2 0 RT543 2 3 3 RT117 1 1 0 RT544 2 2 2 RT119 0 2 3 RT551 1 2 2 RT128 2 1 3 RT554 2 2 2 RT129 1 1 1 RT555 2 2 3 RT130 2 1 0 RT556 3 1 1 RT137 1 0 1 RT557 1 1 1 RT138 0 1 2 RT561 1 1 1 RT144 1 2 1 RT562 1 0 0 RT145 0 0 4 RT563 2 2 3 RT147 2 0 0 RT568 1 1 2 RT148 0 0 1 RT575 2 2 3 RT149 1 2 / RT576 2 2 1 RT153 1 2 2 RT577 1 2 2 RT163 3 1 3 RT579 2 2 3 RT166 0 2 2 RT581 1 1 2 RT168 2 1 3 RT583 3 3 2 RT169 0 2 1 RT584 2 1 2 RT179 1 1 0 RT585 3 3 3 RT191 1 1 0 RT586 3 3 2 RT198 0 2 1 RT587 2 1 2 RT214 1 2 1 RT590 3 2 3 RT224 1 2 2 RT592 2 2 2 RT243 2 2 1 RT595 2 1 1 RT245 0 / 0 RT600 2 2 3 RT246 0 1 1 RT608 1 1 1 RT247 1 1 0 RT612 4 4 3 RT249 1 1 1 RT613 3 2 3 RT251 2 2 1 RT614 2 2 2 RT260 1 1 0 RT620 2 2 3 RT261 1 2 1 RT626 0 2 1 RT270 1 2 2 RT627 2 2 3

vi

Code

Chronische weefselcomplicaties

Code

Acute weefselcomplicaties

Fibrose Xerostomie Dysfagie Mucositis Dermatitis Dysfagie

RT275 1 1 3 RT636 2 2 2 RT284 1 2 0 RT651 1 2 2 RT287 1 2 0 RT654 1 2 1 RT305 0 2 2 RT657 1 2 2 RT310 1 1 0 RT658 2 2 2 RT316 1 1 0 RT664 1 1 1 RT317 0 1 1 RT666 3 2 2 RT318 1 1 1 RT667 1 1 2 RT333 0 0 0 RT668 3 3 3 RT357 0 1 0 RT672 2 1 1 RT358 0 1 1 RT673 1 2 2 RT382 1 1 0 RT674 2 3 2 RT391 2 0 2 RT675 1 2 2 RT394 1 2 2 RT678 2 2 2 RT399 1 1 0 RT679 2 2 3 RT406 0 0 4 RT681 3 2 3 RT408 1 1 3 RT682 3 1 2 RT422 1 2 1 RT684 2 1 1 RT426 2 2 1 RT685 2 2 2 RT427 / 2 / RT687 2 1 2

RT688 2 2 2 RT690 1 1 1 RT692 1 1 2 RT694 1 1 2 RT695 3 1 2 RT696 2 1 1 RT700 3 2 2 RT701 2 2 2 RT703 3 2 2 RT707 1 2 2 RT709 3 2 /

RT713 3 1 2 RT714 1 1 2 RT722 3 3 3 RT723 2 2 /

RT727 2 1 2 RT730 1 1 1 RT731 2 2 3

vii

Bijlage C: Gebruikte RFLP protocols

Gebruikte RFLP protocols

TGFβ1 c.-800G>A TGFβ1 c.-509C>T TGFβ1 c.74G>C Ku70 c.-1310C>G XRCC3 c.722C>T

Enzym

HpyCh4IV 0.2 µl

Bsu36I 0.3 µl

Bgl I 0.4 µl

HhaI 0.5 µl

NIAIII 0.2 µl

PCR product 10 µl 8 µl 10 µl 10 µl 10 µl

BSA

0.3 µl

1 µl 0.3 µl

Buffer

NEbuffer1 3 µl

NEbuffer3 3 µl

NEbuffer3 3 µl

NEbuffer4 3 µl

NEbuffer4 3 µl

Incubatie- temperatuur

37°C 37°C 37°C 37°C 37°C

Incubatietijd 3 uren 22 uren 3 uren 4 uren 2-3 uren

Lengte verwachte digest producten (bp)

GG: 195/486 CC: 193/488 GG: 252 CC: 390 CC: 281/298

GA: 195/486/681 CT: 193/488/681 GC: 252/312 CG: 390/291/99 CT: 105/193/281/298

AA: 681 TT: 681 CC: 312 GG: 291/99 TT: 105/193/281

Afkortingen: BSA = Bovine Serum Albumin

viii

Bijlage D: Resultaten van de genotypering

Code Ku70

c.-1310 C>G

XRCC3 c.722 C>T

TGFβ1

c.74G>C TGFβ1

c.-800G>A TGFβ1

c.-509C>T

RT067 CG * CT * GG GG CT *

RT068 CC * CT * GG GG TT *

RT071 CG * TT * GG GG CC *

RT074 CG * CT * GG GA CC *

RT075 CG * CC * GG GG CT *

RT076 CC * CC * GG GG CT *

RT079 CG * CT * GG GG CC *

RT081 CC * CT * GG GA CT *

RT082 CG * CC * GG GA CT *

RT084 CC * CC * GG GA CC *

RT085 CC * CT * GC GG CC *

RT089 CC * CT * GG GG CT *

RT099 CC * TT * GG GG TT *


RT104 CG * TT * GG GG CT *

RT108 CC * CC * GG GG CC *


RT116 CC * TT * GG GG CT *

RT117 CG * TT * GC GA CC *

RT119 CG * CT * GC GG CT *

RT128 /

CC * / GG TT *




RT138 CC * TT * GC GG CC *

RT141 GG * TT * GG GG TT *


RT144 CC * TT * GC GG CC *


RT147 CG * CT * GG GA CT *

RT148 CG * CT * GC GG CC *


RT151 CC * CT * GG GG CC *



RT158 GG * CT * GG GA CC *

RT163 CC * TT * GG GA CT *


RT168 CC * CT * GG GA CC *


RT172 CG * CT * GG GG TT *


ix

Code Ku70

c.-1310 C>G

XRCC3 c.722 C>T

TGFβ1

c.74G>C TGFβ1

c.-800G>A TGFβ1

c.-509C>T

RT189 CC * TT * GG GG TT *


RT198 / TT * / / /



RT218 CG * CC * GG GG /


RT243 CC * TT * GG GG CC *


RT246 CC * TT * GG GG CC *



RT251 CC * CC * GG GA CT *

RT256 CG * CT * GG AA CC *


RT260 CG * CC * CC GG CC *




RT275 CG * TT * GC GG CT *


RT287 CC * CT * GG GG TT *

RT301 CG * CC * GG AA CC *



RT310 CC * TT * GG GA CC *

RT316 CC * CT * GC GG CT *


RT318 CC * CT * / / /

RT322 CC * TT * GG GA CC *



RT357 CG * CC * GG GG CC *

RT358 GG * CC * GG GG CT *






RT406 GG * TT * GG GG CC *

RT408 GG * CC * GG GG CC *




x

Code Ku70

c.-1310 C>G XRCC3

c.722 C>T TGFβ1

c.74G>C TGFβ1

c.-800G>A TGFβ1

c.-509C>T

RT426 CG * CT * / / /



RT521 CG * CC * GC GG CT *

RT528 CG * CC * GC GG CC *

RT529 CG * CC * GG GG TT *

RT530 GG * TT * GG AA CC *


RT537 CG * CC * GG GA CC *

RT539 GG * CT * GC GG CC *


RT541 GG * CC * GG GA CT *

RT543 GG * CT * GG GA CC *





RT556 GG * TT * GG GA CT *


RT561 GG * CT * GG GG CC *

RT562 GG * TT * GC GG CT *


RT568 GG * CT * GG GG CC *

RT575 GG * CT * GG GG CT *

RT576 GG * CT * GG GG CT *






RT585 CG * CT * / GG CT *






RT600 GG * CC * GG GG CC *



RT613 CC * CC * GC GG CT *


RT620 GG * CC * GG GA CT *

RT626 GG CT GG GG CT

RT627 CC CT GG GG CC

RT636 GG TT GG GG CC

xi

Code Ku70

c.-1310 C>G

XRCC3 c.722 C>T

TGFβ1

c.74G>C TGFβ1

c.-800G>A TGFβ1

c.-509C>T

RT651 CG CC GG GG CT

RT654 CG CC GG GG TT

RT657 CG CT GG GG CC



RT666 GG CT GG GG CC

RT667 CG CC GC GG CT

RT668 CG CT GG GG CT

RT672 CC CT GG GG CT

RT673 CG TT GG GG CT

RT674 CC CT GG GA CC


RT678 CC TT GG GG TT

RT679 GG TT GG GG CC

RT681 CC CT CC GG CC



RT685 GG CC GG GG CC

RT687 CC CC GG GG CT

RT688 CC CC GG GA CC

RT690 CC CC GG GG CT

RT692 CG CC GG GG CC

RT694 GG CC GG GG TT


RT696 CG CT GG GA CC

RT700 CG CC CC GG CC

RT701 CC CT GC GG CC



RT709 CC CC GC GG CT


RT714 CC CC GG GG CC

RT722 GG CC GG GG CC

RT723 CG CC GG GA CC

RT727 CC CT GG GG CT

RT730 CG CT GG GA CC

RT731 CC CT GG GG CT * Werden reeds binnen de onderzoeksgroep gegenotypeerd

xii

Bijlage E: Geoptimaliseerde HRM protocols

1. XRCC3 c.722C>T

HRM Mix (20µl)

Product Hoeveelheid

(µl)

Buffer (10x) 2

MgCl2 (25mM) 1.2

dNTP Mix (10mM) 0.4

124 F primer (5µM) 1.2

122 R primer (5µM) 1.2

Meltdoctor HRM Dye (20x) 1

AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase (5U/µl) 0.05

dH2O 11.95

DNA (25 ng/µl) 1

HRM programma


(°C) Tijd


Cyclische fase (40 cycles) Denaturatie 95 15 sec


Smeltcurve/ dissociatie Denaturatie 95 10 sec

Annealing 60 1 min

HRM 95 15 sec

Annealing 60 15 sec

xiii

2. Ku70 c.-1310C>G

HRM Mix (20µl)

Standaard HRM mix Spike-in HRM mix

Product Hoeveelheid (µl) Hoeveelheid (µl)

Buffer (10x) 2 2

MgCl2 (25mM) 1.6 1.6

dNTP Mix (10mM) 0.4 0.4

F primer (5µM) 1.2 1.2

R primer (5µM) 1.2 1.2

Meltdoctor HRM Dye (20x) 1 1

AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase (5U/µl) 0.05 0.05

dH2O 11.55 10.55

DNA (25 ng/µl) 1 1

Homozygoot WT DNA (25 ng/µl) / 1

HRM programma


(°C) Tijd


Cyclische fase (40 cycles) Denaturatie 95 15 sec


Smeltcurve/ dissociatie Denaturatie 95 10 sec

Annealing 60 1 min

HRM 95 15 sec

Annealing 60 15 sec

xiv

Bijlage F: Onderzochte dosisparameters

1. Chronische weefselcomplicaties

Dosisparameters CTC0-1 Gemiddelde

CTC2+ Gemiddelde p-waarde CTC0-1 vs CTC2+

Xerostomie

Dmean rechter parotisklier 40.2 45.2 0.256 Dmean linker parotisklier 41.2 43.2 0.736

Fibrose

Dmean Subcutis 45.8 40.3 0.448 Dysfagie

Dmean SPC 61.5 62.5 0.586

Dmean MPC 68.2 69.4 0.199 Dmean IPC 66 68.2 0.096

Dmean upper_oesofagus 53.9 55.2 0.387 Dmin_circumferentie SPC 65 66.3 0.659 Dmin_circumferentie MPC 64.9 66.2 0.293 Dmin_circumferentie IPC 65.1 66.4 0.268

Afkortingen: Dmean=gemiddelde dosis; Dmin_circumferentie= minimale dosis op de circumferentie, SPC, MPC, IPC= bovenste, middelste en onderste faryngeale constrictorspier respectievelijk.

Behandelingswijzen CTC0-1 n (%)

CTC2+ n (%) p-waarde CTC0-1 vs CTC2+

Xerostomie RT + chemo 14 (14.2) 10 (40.0) 0.859

RT + HK 18 (52.9) 13 (52.0) 0.848 RT + chemo + HK 10 (29.4) 6 (24.0) 0.868

Fibrose RT + chemo 19 (39.6) 6 (54.5) Nt*

RT + HK 24 (50.0) 7 (63.6) Nt RT + chemo + HK 12 (25.0) 4 (36.4) Nt

Dysfagie RT + chemo 16 (41.0) 9 (45.0) 0.989

RT + HK 21 (53.8) 9 (45.0) 0.713 RT + chemo + HK 11 (28.2) 5 (25.0) Nt

Afkortingen: RT= radiotherapie, Chemo= chemotherapie, HK= Heelkunde, Nt= Niet toepasbaar * Te kleine aantallen in de subgroepen

xv

2. Acute weefselcomplicaties

Dosisparameters CTC0-1 Gemiddelde

CTC2+ Gemiddelde p-waarde CTC0-1 vs CTC2+

Dermatitis

Skin5mm 30.5 36.9 0.012 Mucositis

Dmean orale caviteit 50.9 57.1 0.001

Dmean mucosa 50.2 56.3 0.003 Dysfagie

Dmean SPC 60.9 62.5 0.052 Dmean MPC 62.1 62.3 0.723 Dmean IPC 56.3 57.1 0.837

Dmean oesofagus 42.6 49.8 0.529 Dmean larynx 59.0 59.6 0.941 Dmean_UES 52.3 53.5 0.873

Dmin_circumferentie SPC 48.4 53.7 0.086 Dmin_circumferentie MPC 55.6 58.3 0.426 Dmin_circumferentie IPC 49.9 51.1 0.959

Dmin_circumferentie oesofagus 39.6 40.5 0.83 Dmin_circumferentie larynx 50.3 50.8 0.751 Dmin_circumferentie_UES 48.5 50.1 0.862

Afkortingen: Dmean=gemiddelde dosis; Dmin_circumferentie= minimale dosis op de circumferentie; SPC, MPC, IPC= bovenste, middelste en onderste faryngeale constrictorspier respectievelijk; UES= upper esophaegal sphincter

Behandelingswijzen CTC0-1 n (%)

CTC2+ n (%) p-waarde CTC0-1 vs CTC2+

Dermatitis RT + chemo 35 (50.7) 6 (60.0) Nt*


Mucositis RT + chemo 29 (49.2) 12 (60.0) Nt

RT + HK 12 (20.3) 5 (25.0) 0.562 RT + chemo + HK 3 (5.08) 1 (5.0) Nt

Dysfagie RT + chemo 24 (42.9) 15 (71.4) 0.048


Afkortingen: RT= radiotherapie, Chemo= chemotherapie, HK= Heelkunde, Nt= Niet toepasbaar *Te kleine aantallen in de subgroepen

xvi

Bijlage G: SNP associatie

1. Chronische weefselcomplicaties

Associatie tussen de TGFβ1 c.-509C>T SNP en het risico op chronische dysfagie

SNP Genotype CTC0-1 n (%)

CTC2+ n (%)

CTC2+ vs. CTC0-1

OR p-waarde TGFβ1 c.-509C>T CC 17 (47.2) 10 (50.0) Referentie* CT 17 (47.2) 8 (40.0) 0.80 0.703 TT 2 (5.6) 2 (10.0) 1.70 0.622 CT+TT 19 (52.8) 10 (50.0) 0.90 0.842 TT† 34 (94.4) 18 (90.0) 1.89 0.541 Frequentie T allel 29% 30%

*Analyse volgens dominant model, HN als referentie †Analyse volgens recessief model, HN + HE als referentie

Afkortingen: OR = odds ratio

Associatie tussen de TGFβ1 c.-509C>T en TGFβ1 c.-800C>T SNPs en het risico op xerostomie


CTC2+ n (%)

CTC2+ vs. CTC0-1

OR p-waarde

TGFβ1 c.-509C>T CC 16 (48.5) 11 (47.8) Referentie*

CT 15 (45.5) 10 (43.5) 0.97 0.957

TT 2 (6.0) 2 (8.7) 1.46 0.727

CT+TT 17 (51.5) 12 (52.2) 1.03 0.961

TT† 31 (94.0) 21 (91.3) 1.48 0.708

Frequentie T allel

29% 30%

TGFβ1 c.-800G>A GG 24 (72.7) 19 (82.6) Referentie*

GA 9 (27.3) 4 (17.4) 0.56 0.392

AA 0 0 Nt Nt

GA+AA 9 (27.3) 4 (17.4) 0.56 0.392 Frequentie A allel

14% 9%


Afkortingen: OR = odds ratio; Nt = niet toepasbaar

xvii

Associatie tussen de TGFβ1 c.-509C>T en TGFβ1 c.-800G>A SNPs en het risico op fibrose


CTC2+ n (%)

CTC2+ vs. CTC0-1

OR p-waarde

TGFβ1 c.-509C>T CC 23 (50.0) 4 (40.0) Referentie*

CT 20 (43.5) 5 (50.0) 1.44 0.623

TT 3 (6.5) 1 (10.0) 1.92 0.610

CT+TT 23 (50.0) 6 (60.0) 1.50 0.568

TT† 43 (93.5) 9 (90.0) 1.59 0.701

Frequentie T allel

28% 35%

TGFβ1 c.-800G>A GG 40 (87.0) 4 (40.0) Referentie*

GA 6 (13.0) 6 (60.0) 10.0 0.003

AA 0 (0.0) 0 (0.0) Nt Nt

GA+AA 6 (13.0) 6 (60.0) 10.0 0.003 Frequentie A allel

7% 30%


Afkortingen: OR = odds ratio; Nt = niet toepasbaar

2. Acute weefselcomplicaties

Associatie tussen de XRCC3 c.722C>T, Ku70 c.-1310C>G en TGFβ1 c.74G>C SNPs en het risico op ernstige

acute dysfagie


CTC3+ n (%)

CTC3+ vs. CTC0-2

OR p waarde ORcorr p waarde

XRCC3 c.722C>T CC 23 (41.1) 6 (28.6) Referentie†

Referentie†

CT 27 (48.2) 12 (57.1) 1.70 0.354 1.97 0.262

TT 6 (10.7) 3 (14.3) 1.92 0.440 2.56 0.309

CT+TT 33 (58.9) 15 (71.4) 1.74 0.316 2.06 0.218

Frequentie T allel

35% 43%

Ku70 c.-1310C>G CC 16 (28.6) 6 (28.6) Referentie†

Referentie†

CG 27 (48.2) 8 (38.1) 0.79 0.706 0.77 0.684

GG 13 (23.2) 7 (33.3) 1.44 0.589 1.82 0.407

CG+GG 40 (71.4) 15 (71.4) 1.00 1.000 1.05 0.933

Frequentie G allel

47% 52%

TGFβ1 c.74G>C GG 50 (89.3) 14 (70.0) Referentie†

Referentie†

GC 5 (8.9) 5 (25.0) 3.57 0.379 3.24 0.105

CC 1 (1.8) 1 (5.0) 3.57 0.069 1.63 0.744

GC+CC 6 (10.7) 6 (30.0) 3.57 0.051 2.90 0.117 Frequentie C allel

6% 18%

†Analyse volgens dominant model, HN als referentie.

Afkortingen: OR = odds ratio; ORcorr = OR gecorrigeerd voor chemotherapie en Dmean SPC.

xviii

Associatie tussen de TGFβ1 c.-800G>A en TGFβ1 c.74G>C SNPs en het risico op ernstige acute mucositis


CTC3+ n (%)

CTC3+ vs. CTC0-2

OR p waarde ORcorr p waarde TGFβ1 c.-800G>A

GG 47 (79.7) 18 (90.0) Referentie†

Referentie†

GA 11 (18.6) 2 (10.0) 0.48 0.362 0.11 0.046 AA 1 (1.7) 0 (0.0) Nt Nt Nt Nt

GA+AA 12 (20.3) 2 (10.0) 0.44 0.306 0.11 0.046 Frequentie A allel

11% 5%

TGFβ1 c.74G>C GG 52 (88.1) 13 (68.4) Referentie†

Referentie†

GC 7 (11.9) 4 (21.1) 2.29 0.237 4.93 0.104

CC 0 (0.0) 2 (10.5) Nt Nt Nt Nt

GC+CC 7 (11.9) 6 (31.6) 3.43 0.053 8.29 0.019 Frequentie C allel

6% 21%

†Analyse volgens dominant model, HN als referentie

Afkortingen: OR = odds ratio; Nt = niet toepasbaar; ORcorr = OR gecorrigeerd voor rookgedrag, Dmean mucosa en Dmean mondholte

Associatie tussen de XRCC3 c.722C>T en TGFβ1 c.-800G>A SNPs en het risico op ernstige dermatitis


CTC3+ n (%)

CTC3+ vs. CTC0-2

OR p waarde ORcorr p waarde

XRCC3 c.722C>T CC 28 (40.6) 3 (30.0) Referentie†

Referentie†

CT 32 (64.4) 7 (70.0) 2.04 0.333 2.14 0.399

TT 9 (13.0) 0 (0.00) Nt Nt Nt Nt

CT+TT 41 (59.4) 7 (70.0) 1.59 0.53 1.80 0.438

Frequentie T allel

36% 35%

TGFβ1 c.-800G>A GG 58 (84.1) 7 (70.0) Referentie† Referentie†

GA 10 (14.5) 3 (30.0) 2.49 0.237 3.77 0.120

AA 1 (1.4) 0 (0.00) Nt Nt Nt Nt

GA+AA 11 (15.9) 3 (30.0) 2.26 0.28 2.58 0.225 Frequentie A allel

9% 15%

†Analyse volgens dominant model, HN als referentie

Afkortingen: OR = odds ratio; Nt = niet toepasbaar; ORcorr = OR gecorrigeerd voor Dmean skin5mm

Radiogenomics voor predictie van radiotoxiciteit bij...

Documents

Transcript of Radiogenomics voor predictie van radiotoxiciteit bij...