PROTEOMICA

PROTEOOM = alle proteïnen die tot expressie worden gebracht door

het genoom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof op een bepaald ogenblik

Tweedimensionele electroforese

(Tweedimensionele chromatografie)

Massaspectrometrie

Technieken

2-D gel electrophoresis

(1) charge

(2)

size

Proteinmixture

Protein separation according to :

HART “mastergel”

German Heart Institute Berlin (2002)

Controle Rat serum

Acute ontsteking(turpentine)

E. Gianazza (2002)

ionenbron

massa analyzer

detector

vacuüm

Massaspectrometer

Iontrap

Electrospray (ESI)

iontrap

ionenbron

iontrap + helium

1- 4 kV

electrospray

mz

Onze strategie

Scheiding van eiwitmengsel dmv 2DE gelspot optimaal slechts 1 eiwit

eiwit in gel trypsine-behandeling specifieke knipplaatsen

[het maximaal aantal eiwitstukjes (= peptiden) is voorspelbaar]

[hoe groter het eiwit, des te meer peptiden ] complex mengsel

Verdere scheiding van peptidenmengsel dmv chromatografie

trypsine

peptiden A B C D E F G

eiwit

Chromatografie

A E B F G C massa-spectrometer

peptiden-mengsel

Stroomrichting over chromatografiekolom

ruwe data

intensiteit

m/z

massaspectrum van de kolomuitstroom is weliswaar minder complex maar blijft toch nog te complex voor de massaspectrometer:

Kan wel alle ionen die op een bepaald ogenblik uit de kolom stromen “wegen”, maar kan er geen verdere “sequentieinformatie” uithalen, behalve uit de drie meest intense ionen (instrumentele beperking er gaat mogelijks veel informatie verloren)

Sequentieinformatie wordt bekomen dmv fragmentatie van het peptide C ion het bekomen massaspectrum noemt men een fragmentatiespectrum

Per full scan spectrum krijgen we maximaal 3 fragmentatiespectra (volledige cycle time: ca 1.5 sec)

Fictief massaspectrum op ogenblik dat peptide Cuit de kolom stroomt

“gewicht” van peptide C

(full scan spectrum)

Peptide sequentiebepaling met MS/MS

NH2 COOH

C-R-I-S-T-A

C-R-I-S-T-A-L

C-R-I-SC-R-I

C-R-I-S-T

C-RC

S-T-A-LI-S-T-A-L

T-A-L A-L

R-I-S-T-A-LC-R-I-S-T-A-L

L

b-ionen y-ionenm/z

763.67

104.01 660.67260.11 504.57

373.20 391.49

460.23 304.45

561.27 202.98

632.31 131.94

MS/MS

Sequentie-ionen

P. Roepstorff & J. Fohlman, Biomed. Mass Spectrom. 11, 601 (1984)

chromatogram

een parent-ion(één van de vele)

m/z = 806.8 z = 2+

(806.8 * 2)-2=1611.2 Damassa neutraal peptide

Parentm/z = 806.8

MS/MS spectrum

y3

y4

y5

y6

y7

y8

y9

y10 y11

y12

m/z 1386.4 1271.5 1157.4 971.4 856.2 769.4 670.2 569.1 482.3 381.0

m/z 

114.9115.03

114.1114.04

186.0186.08

115.2115.03

86.887.03

99.299.07

101.1101.05

86.887.03

101.3101.05

      

    

        

    

    

    

    

   

sequentie D N W D S V T S T

 

Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr

RHFWQQDEPP QSPWDRVKDL ATVYVDVLKD SGRDYVSQFE GSALGKQLNL

KLLDNWDSVT STFSKLREQL GPVTQEFWDN LEKETEGLRQ EMSKDLEEVK

AKVQPYLDDF QKKWQEEMEL YRQKVEPLRA ELQEGARQKL HELQEKLSPL

GEEMRDRARA HVDALRTHLA PYSDELRQRL AARLEALKEN GGARLAEYHA

KATEHLSTLS EKAKPALEDL RQGLLPVLES FKVSFLSALE EYTKKLNTQ

Apolipoproteïne A1

b) Dataverwerking

1 ruwe datafile per analyse (per gel spot)

a) Data-acquisitie (software: Xcalibur versie 3.1)

Raw datafile-format (bestaande uit full scan spectra en fragmentaitiespectra)

dta-file format (alleen fragmentatiespectra)

Mascot Sequest

Rapport 1 Rapport 2

(. dat file) (.out file)

search

Van ruwe data tot identificatie van eiwit

Welke ruwe datafile moet er verwerkt worden ?

Ruwe datafile (verzameling van full scan spectra en fragmentatiespectra)

omvormen naar een set bestaande uit enkel fragmentatiefiles = dta-format

( 1 fragmentatiespectrum = 1 dta.file)

search-engine Mascot “publiek”: zonder licentie enkel te bevragenmet maximaal 300 dta.files

Na kopieren van merge programma (afkomstig van Mascot-website) in de juiste folder (hier peptide2975 met 299 dta files)wordt 1 grote tekst-file aangemaakt

Text-file aanbieden in Mascot

invoeren van text-file

Welke databank ?

Hoe specifiek kan/moet de search zijn?

... en na een 1-2 minuten...

Opnieuw dta-fles aanmaken :omdat a) minimizer had enkel de 300 meest intense fragmentatiespectra weerhouden en b) voor slechts een beperkt gebied van het chromatogram

nu verder werken met alle dta-files van het volledige chromatogram

Alles wat hier ingevuld wordt, wordt weggeschreven in een parameter-file in de folderwaar ook de dta-files zich bevinden (vhpeptide2975)

b) Dataverwerking

1 ruwe datafile per analyse (per gel spot)

a) Data-acquisitie (software: Xcalibur versie 3.1)

Raw datafile-format (bestaande uit full scan spectra en fragmentatiespectra)

dta-file format (alleen fragmentatiespectra)

Mascot Sequest

Rapport 1 Rapport 2

(. dat file) (.out file)

search

(Sequest)

AutomatiserenMogelijk ?

In welke mate ?Op welke manier ?

Transparantie ?

Vraagstelling:

.dat file en .out file: twee rapporten-> 1 rapport

DTAselect software bruikbaar om één rapport te maken (HTML file en een text file als output)

? Kunnen we DTAselect rapport makkelijker manipuleerbaar maken (bv. verwijderen van items en de counter aanpassen,... )

? Kunnen we DTAselect rapport publicatie-vriendelijk maken

? Automatiseren van download van databanken en extractie van subdatabanken met automatische logboekregistratie (download datum, versie, aantal items per databank)

? Kan Sequest-search vlotter verlopen (geïndexeerde databanken?)

[Validatie van identificaties (dmv Lutefisk de novo sequentie-software): belangrijk voor identificaties gebaseerd op slechts één peptide]

[Info vervat in full scan spectra]

Nauw hierbij aansluitend:

Andere vraagstellingen: