Lore GELDOF - Ghent University€¦ · weefselbestanddelen (anabolisme). Deze anabole eigenschappen...

Detectie van methandiënon in urine

door middel van GC- triple

quadrupool MS

Lore GELDOF

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo

Vakgroep: Klinische biologie,

microbiologie en immunologie

Academiejaar 2010-2011

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk

ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder

met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het

aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

(handtekening student) (handtekening promotor)

(Naam student) (Naam promotor)

Woord vooraf

Via deze weg wil ik nog een aantal personen bedanken die het mogelijk maakten om deze

masterproef tot stand te brengen. Het realiseren van een masterproef vraagt immers heel wat

motivatie en doorzetting. Ik wil deze personen dan ook alvast bedanken voor hun steun.

Vooreerst wil ik mijn promotor Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo bedanken voor de kans die hij

mij gegeven heeft om mijn masterproef in het DoCoLab uit te voeren. Ik wil hem eveneens

bedanken voor het veelvuldig nalezen en corrigeren van mijn tekst en het opstellen van goede

deadlines.

Ik wil bovendien ook mijn begeleider Nik bedanken om mij op een enthousiaste manier met

raad en daad bij te staan. En eveneens voor de vele tijd die hij voor mij vrijgemaakt heeft.

Daarnaast heeft hij me veel bijgeleerd over de werking van de toestellen. Ik wil hem hierbij

ook bedanken voor al de hulp bij mijn praktisch werk.

Mijn ouders wil ik eveneens bedanken voor de mogelijkheid die ze me gaven om deze

opleiding te volgen. Ik wil hen en daarnaast ook mijn familie en vrienden bedanken voor de

steun en motivatie die ze me gegeven hebben.

Mijn medestudenten wil ik bedanken voor de praktische tips die ze me gaven bij het

neerschrijven van deze masterproef. Ik wil dan ook nog in het bijzonder de studenten in het

labo Annelies, Diedelinde en Danica bedanken voor de toffe momenten in het labo.

Ten slotte wil ik nog de medewerkers van het DoCoLab bedanken: Koen, Kris, Wim, Pieter

H., Pieter V.R., Leen, Lance, Simone, Jan, Fiona, Michaël, Dominique, Trui, Ann en Steven.

Ik wil hen bedanken voor de vele praktische hulp, de goede sfeer in het labo en om me de

nodige kennis omtrent het wielrennen bij te brengen.

Inhoudstafel

Samenvatting ............................................................................................................................ 1

1. Inleiding ................................................................................................................................. 2

1.1 Doping .............................................................................................................................. 2

1.2 Anabole androgene steroïden ........................................................................................... 3

1.3 Metabolisme van anabole androgene steroïden ................................................................ 4

1.3.1 Fase I metabolisme .................................................................................................... 5

1.3.2 Fase II metabolisme ................................................................................................... 6

1.4 Detectie van anabole androgene steroïden ....................................................................... 7

1.4.1 Chromatografie .......................................................................................................... 7

1.4.2 Injecteren van staal..................................................................................................... 8

1.4.3 Gaschromatografische scheiding ............................................................................... 8

1.4.4 Interface ..................................................................................................................... 9

1.4.5 Massaspectrometrie .................................................................................................... 9

1.5 Methodevalidatie ............................................................................................................ 12

1.6 Probleemstelling ............................................................................................................. 13

1.7 Methandiënon ................................................................................................................. 13

2. Materialen en methoden .................................................................................................... 16

2.1 Producten en reagentia .................................................................................................... 16

2.2 Instrumentatie ................................................................................................................. 16

2.3 Excretiestudie ................................................................................................................. 17

2.4 Staalvoorbereiding .......................................................................................................... 18


3. Resultaten ............................................................................................................................ 20

3.1 Analyse van referentiestandaarden ................................................................................. 20

3.1.1 Full scan spectra van referentiestandaarden van methandiënon en metabolieten .... 20

3.1.2 Production scan van de geselecteerde precursorionen ............................................. 21

3.1.3 Opstellen van MRM methode .................................................................................. 21

3.1.4 Opstellen van SIM methode ..................................................................................... 22

3.2 Analyse van excretie-urines ............................................................................................ 23

3.2.1 Full scan spectra van excretie-urines ....................................................................... 23

3.2.2 Opstellen MRM methode voor eventuele metabolieten van methandiënon en

controleparameters ............................................................................................................ 25

3.2.3 Controle van de opgestelde MRM methode aan de hand van positieve en negatieve

urines ................................................................................................................................. 28

3.2.4 Toepassen van de opgestelde MRM methode op de excretie-urines van 0-12 u ..... 30

3.2.5 Opstellen SIM methode voor metabolieten van methandiënon en

controleparameters ............................................................................................................ 35

3.2.6 Toepassen van de opgestelde SIM methode op excretie-urines van 0-12 u ............ 35

3.2.7 Toepassen van de opgestelde MRM methode op excretie-urines vanaf 30 u .......... 36

3.2.8 Toepassen van de opgestelde SIM methode op excretie-urines vanaf 30 u............. 40

3.2.9 Vergelijking van detectietijden tussen de SIM en MRM methode .......................... 41


3.3.1 Herhaalbaarheid en bias ........................................................................................... 44

4. Bespreking ........................................................................................................................... 46

4.1 MRM methode toegepast op excretie-urines tot 12 u ..................................................... 46

4.2 MRM methode toegepast op de excretie-urines vanaf 30 u ........................................... 47

4.3 Vergelijken van de MRM en SIM methode ................................................................... 48


5. Algemeen besluit ................................................................................................................. 49

6. Referenties ........................................................................................................................... 50

Afkortingenlijst

AAS Anabole Androgene Steroïden

amu atomic mass unit

CID Collision Induced Dissociation

DHT 5α-dihydrotestosteron

DHEA dehydroepiandrosteron

DoCoLab DopingControleLaboratorium UGent

EI Elektron Ionisatie

EIC Extracted Ion Chromatogram

GC Gas Chromatografie

HDL High Density Lipoprotein

IS Interne Standaard

LC Vloeistof Chromatografie

LDL Low Density Lipoprotein

LLE Vloeistof-Vloeistof Extractie

LOD Limit Of Detection

LOQ Limit Of Quantification

M+

Moleculair Ion

MPS MultiPurpose Sampler

MRM Multiple Reaction Monitoring

MRPL Minimum Required Performance Limit

MS Massaspectrometrie

MSTFA N-Methyl-N-TrimethylsilylTrifluoroAcetamide

m/z Massa/ladingsverhouding

PTV Programmed Temperature Vaporisation

Q Quadrupool

QC Kwaliteitscontrole

RRT Relatieve RetentieTijd

RSD Residuele StandaardDeviatie

RT RetentieTijd

SD StandaardDeviatie

SIM Selected Ion Monitoring

SRM Single Reaction Monitoring

TMS TriMethylSilyl

u uur

WADA Wereld AntiDoping Agentschap

(rekenkundig) gemiddelde

Samenvatting

Anabole androgene steroïden worden vaak misbruikt door sporters om hun prestaties te

verbeteren. Om de fairplay te bevorderen is het gebruik van deze anabole steroïden verboden

en werden ze op de dopinglijst van het Wereld Anti-Doping Agentschap geplaatst. Detectie

van deze steroïden in urine van atleten gebeurt vaak aan de hand van gaschromatografie

gekoppeld aan massaspectrometrie. Recent werd er een triple quadrupool massaspectrometer

ontwikkeld voor gaschromatografie. Dit type massaspectrometer maakt het mogelijk om

‘single reaction monitoring’ (SRM) uit te voeren, wat een grotere selectiviteit met zich

meebrengt dan de nu vaak toegepaste ‘single ion monitoring’ (SIM). Hierdoor is het mogelijk

om de detectielimiet te gaan verlagen, wat er op zijn beurt voor zorgt dat het misbruik van de

anabole androgene steroïden langer opspoorbaar blijft.

In deze masterproef is het de bedoeling om een ‘single reaction monitoring’ methode te gaan

ontwikkelen voor de detectie van methandiënon in urine. Methandiënon is immers één van de

meest gedetecteerde exogene anabole steroïden en daarenboven is het metabolisme van dit

steroïd reeds goed gekend. Om deze methode te kunnen ontwikkelen werd er gebruik gemaakt

van excretie-urines, gecollecteerd na inname van methandiënon. De methode werd

ontwikkeld voor reeds goed gekende metabolieten van methandiënon, maar daarnaast werd

eveneens op zoek gegaan naar nog onbekende metabolieten. Zo werd er gezocht naar

metabolieten die een langere detectietijd toelaten. Zowel de vrije fractie (ongecojugeerde

steroïden) als de totale fractie van de steroïden werd bestudeerd. Er werd eveneens een ‘single

ion monitoring’ methode opgesteld om de detectielimieten en detectietijden van beide

methodes met elkaar te kunnen vergelijken.

Uiteindelijk werd er een methode ontwikkeld voor de detectie van methandiënon, 6β-

hydroxymethandiënon, 17-epimethandiënon, epimethendiol, de mogelijke metabolieten M1

tot en met M9 en de eventuele metabolieten V1 tot en met V16. Van de mogelijk metabolieten

bleven er na controle uiteindelijk maar 8 metabolieten over (M3, M4, M7, V3, V4, V8, V12

en V16). Voor alle steroïden bleek de SRM methode de beste detectielimiet en de langste

detectietijden toe te laten.

Gebruik van de triple quadrupool massaspectrometer brengt dus zeker voordelen met zich

mee om het misbruik van methandiënon langer opspoorbaar te maken. Verder onderzoek zal

nog nodig zijn om deze ‘nieuwe’ metabolieten verder te bestuderen en hun structuur te

ontrafelen. Op basis van de resultaten van methandiënon lijkt het gebruik van SRM voor

andere steroïden veelbelovend om de detectie van hun misbruik te verbeteren.

1. Inleiding

1.1 Doping

Atleten wensen telkens hun beste prestatie neer te zetten. Om hun prestaties te bevorderen

wordt er soms misbruik gemaakt van doping. De anabole androgene steroïden (AAS) zijn de

vaakst gebruikte dopeermiddelen [1]. In 1999 werd het Wereld Anti-Doping Agentschap

(WADA) opgericht om doping in de sport te bestrijden. Het bestrijden van doping heeft als

doel om de fairplay in stand te houden en om de gezondheid van de atleet te beschermen. Het

WADA stelt elk jaar een dopinglijst op met verboden middelen en verboden methoden. De

verboden middelen worden onderverdeeld in tien klassen:

S0. Niet goedgekeurde middelen

S1. Anabole middelen

S2. Peptide hormonen, groeifactoren en verwante stoffen

S3. Bèta-2 agonisten

S4. Hormoon-antagonisten en modulatoren

S5. Diuretica en andere maskerende middelen

S6. Stimulantia

S7. Narcotica

S8. Cannabinoïden

S9. Glucocorticosteroïden

Er wordt eveneens een onderscheid gemaakt tussen binnen en buiten competitie. Zo zijn de

klassen S6 tot S9 enkel verboden tijdens de competitie terwijl de overige zowel binnen als

buiten wedstrijdverband verboden zijn. De S0 klasse werd slechts in 2011 toegevoegd aan de

verboden lijst. De anabole androgene steroïden behoren tot de anabole middelen en zitten dus

vervat in de S1 klasse [2].

Om misbruik van verboden substanties of methoden op te kunnen sporen zijn er 35

geaccrediteerde dopingcontrolelaboratoria. Het DoCoLab of Dopingcontrolelaboratorium van

de UGent is er hier één van. Naast het uitvoeren van dopingcontroles spelen ze ook een

belangrijke rol in het onderzoek naar nieuwe methoden om doping te detecteren [3].

1.2 Anabole androgene steroïden

Anabole androgene steroïden worden ingedeeld in twee klassen: de endogene en de exogene

steroïden. Testosteron, 5α-dihydrotestosteron (DHT), dehydroepiandrosteron (DHEA),

androsteendion en androsteendiol zijn belangrijke endogene steroïden. De exogene steroïden

zijn deze AAS die van nature niet in het lichaam voorkomen. Voorbeelden van exogene

steroïden zijn nandrolon, methandiënon, stanozolol en mesterolon [4].

De basisstructuur van de steroïden is het perhydrocyclopentaanfenanthreen ringsysteem. Dit

systeem bestaat uit vier ringen: de A-, B-, C- en D-ring. De zijketens op dit ringsysteem

kunnen zich ofwel onder het vlak of boven het vlak bevinden. Deze posities van de zijketens

worden dan respectievelijk de α- en de β-positie genoemd [5]. Het typevoorbeeld van de AAS

is het endogene steroïd testosteron. Testosteron heeft het typische androstaanskelet met een

methylgroep op het tiende en dertiende koolstofatoom (Figuur 1) [6].

Zoals de naam het doet vermoeden hebben de AAS zowel anabole als androgene

eigenschappen. De steroïden stimuleren de stofwisseling en de opbouw van

weefselbestanddelen (anabolisme). Deze anabole eigenschappen zorgen voor een toename

van de spiermassa. Het viriliserende of vermannelijkende effect is toe te schrijven aan de

androgene functies van het hormoon. Het is dus vooral omwille van deze anabole

eigenschappen dat steroïden vaak misbruikt worden door sporters. Door synthetische

analogen aan te maken werd geprobeerd om de anabole effecten van testosteron te verbeteren

en te scheiden van zijn ongewenste androgene effecten. De anabole-androgene dissociatie is

meestal het resultaat van modificaties ter hoogte van de A-ring van testosteron of DHT.

Oraal ingenomen anabole steroïden worden sterk afgebroken door het ‘first-pass’

metabolisme in de lever. Om oraal actieve AAS te bekomen werden er modificaties

uitgevoerd om dit metabolisme te kunnen omzeilen. Deze steroïden worden gekenmerkt door

O

O H

2

3 4

18

19

7

8 9

11 12

15 14

16

17

10

6

13

1

5 A B

C D

Figuur 1. Structuurformule van het belangrijkste endogene steroïd testosteron

met nummering en benaming van het koolstofskelet.

een 17 α-alkyl substituent die het hepatische metabolisme van de 17β-hydroxyl groep sterisch

hinderen. Methandiënon en stanozolol zijn voorbeelden van oraal actieve steroïden met een

17α-methyl groep [4]. Daarnaast kunnen de steroïden eveneens parenteraal toegediend

worden via intramusculaire injectie of via een transdermale patch. Bij een intramusculaire

injectie wordt er een veresterde vorm van de steroïden toegediend. Door hydrolyse worden de

steroïden geleidelijk op de plaats van injectie vrijgesteld. Via een transdermale patch worden

de steroïden eveneens geleidelijk afgegeven en gaan ze via de huid naar de bloedbaan [6].

Gebruik van de anabole androgene steroïden heeft echter heel wat nevenwerkingen. Zo kan

het toedienen van hoge dosissen of het langdurig gebruik van oraal actieve AAS aanleiding

geven tot leverdysfuncties. Een aantal algemene nevenwerkingen zijn acne, toegenomen

agressiviteit en veranderingen in libido. Daarnaast is er een verhoogd risico op hart- en

vaataandoeningen door een stijging van het LDL-cholesterol en daling van het HDL-

cholesterol. Bij vrouwen kan bovendien de menstruele cyclus verstoord worden en kunnen er

mannelijke kenmerken tot expressie komen. Mannen kunnen impotentie, vergroting van de

prostaat of prostaatkanker en gynaecomastie verkrijgen [4].

Het steroïd dat in deze masterproef verder zal bestudeerd worden is methandiënon (Figuur 2).

Figuur 2. Structuurformule van het exogene steroïd methandiënon.

1.3 Metabolisme van anabole androgene steroïden

Zowel exogene als endogene steroïden worden meestal sterk gemetaboliseerd, met excretie

van slechts kleine hoeveelheden van het oorspronkelijke steroïd in de urine. In het geval van

de exogene steroïden is het bovendien zo dat de toegediende steroïden zelf meestal maar voor

een korte periode na toediening opspoorbaar zijn. Om deze redenen gebeurt de detectie van de

steroïden zelf slechts in beperkte mate. Detectie van AAS aan de hand van hun metabolieten

laat langere detectie van het misbruik toe. Hiervoor is het dus belangrijk dat het metabolisme

gekend is en dat de structuur van de metabolieten achterhaald wordt. Om het metabolisme te

bepalen kunnen er excretiestudies uitgevoerd worden bij de mens waarbij een AAS wordt

toegediend en de urine op regelmatige tijdstippen wordt gecollecteerd.

OH

O

CH3

Het is echter wel zo dat niet alle AAS aanleiding geven tot unieke metabolieten, soms zijn er

gemeenschappelijke metabolisatie pathways [4;5].

Het metabolisme van de anabole steroïden kan onderverdeeld worden in twee fasen: het fase I

en het fase II metabolisme. In de fase I reacties wordt voornamelijk de basisstructuur van de

steroïden veranderd. De AAS ondergaan enzymatisch gekatalyseerde reacties met als doel ze

meer polair te maken, te inactiveren en hun eliminatie te vergemakkelijken. Fase I

metabolisme vindt voornamelijk plaats in de lever. Fase II metabolisme zorgt voor conjugatie

van de steroïden met endogene molecules zoals sulfaat of glucuronzuur. Deze

conjugatiereactie maakt ze zo meer polair waardoor hun renale excretie bevorderd wordt [5].

1.3.1 Fase I metabolisme

De enzymatische reacties die in deze eerste fase plaatsvinden zijn oxidaties, reducties en

hydroxylaties. In Tabel 1 wordt per ring de fase I reacties vermeld. Naast de reacties in de

tabel kan ook hydroxylatie optreden ter hoogte van het 18e (en 19

e) koolstofatoom.

5α- en 5β-reductie ter hoogte van de A-ring is de snelheidsbepalende stap in de 3-keto-4-een

steroïden zoals testosteron. De enzymen die deze reacties katalyseren, 5α-reductase en 5β-

reductase, zijn voornamelijk in de lever gelokaliseerd. De verhouding van de 5α- en 5β-

isomeren is afhankelijk van de structuur van het steroïd. Zo zullen 3-keto-androsta-1,4-dien

structuren, zoals methandiënon, niet gemetaboliseerd worden tot 5α-isomeren.

De reductie van de koolstof-4,5 dubbele binding is irreversibel en wordt gevolgd door 3α- en

3β-hydroxy-reductie. Deze reductie treedt snel op bij het 5α-isomeer en wordt gekatalyseerd

door het 3α-hydroxysteroïd dehydrogenase of 3β-hydroxysteroïd dehydrogenase. 3-keto

reductie van een 5β-steroïd, zoals in het geval van methandiënon heeft enkel aanleiding tot de

3α-hydroxy structuur.

Ter hoogte van de D-ring is de 17-oxidatie een belangrijke metabolisatieweg voor AAS met

een secundaire 17β-hydroxy groep, zoals testosteron. Deze 17-keto metabolieten worden

gevormd met behulp van het 17β-hydroxysteroïd dehydrogenase. Ditzelfde enzyme kan

eveneens de 17-keto groep terug in de 17β-hydroxy groep omzetten. Bij de oraal actieve

steroïden met een 17α-alkyl groep wordt de 17-oxidatie van de 17β-hydroxyl groep

verhinderd [5].

Tabel 1. Fase I metabolisme ter hoogte van de vier ringen van de anabole steroïden [5].

A-ring B-ring C-ring D-ring

5α- en 5β-reductie 6β-hydroxylatie 12-hydroxylatie 17-oxidatie van 17β-

hydroxy groep

3α- en 3β-hydroxy-

reductie 6,7-dehydrogenatie

17β-hydroxylatie van

17-keto steroïden

1,2-hydrogenatie 17α-hydroxylatie van

17-keto steroïden

1,2-dehydrogenatie 16α- en 16β-

hydroxylatie

verder metabolisme

van A-ring

gemodificeerde AAS

16-oxidatie

17-epimerisatie

verder D-ring

metabolisme

1.3.2 Fase II metabolisme

De conjugatiereacties in deze tweede fase worden eveneens enzymatisch gecontroleerd. Het

fase I metabolisme wordt niet noodzakelijk opgevolgd door fase II. Er kan dus een

onderscheid gemaakt worden tussen geconjugeerde en ongeconjugeerde metabolieten. De

belangrijkste fase II reacties worden in Tabel 2 weergegeven [5].

Tabel 2. Fase II metabolisme ter hoogte van de A- en D-ring van de anabole steroïden [5].

A-ring D-ring

sulfatatie van 3β-hydroxy groep glucuronidatie van secundaire 17β-hydroxy groep

glucuronidatie van 3α-hydroxygroep glucuronidatie van tertiaire 17β-hydroxy groep in 17β-

hydroxy-17α-methyl steroïden

sulfatatie van secundaire 17β-hydroxy groep

sulfatatie van 17β-hydroxy groep in 17β-hydroxy-17α-

methyl steroïden en 17-epimerisatie

1.4 Detectie van anabole androgene steroïden

De matrix die wordt gekozen voor de detectie van anabole steroïden bij atleten is urine.

Afname van urine is immers minder invasief ten opzichte van bloedafname. Bovendien

komen de AAS en hun metabolieten in een hogere concentratie voor in urine dan in bloed [4].

Het misbruik van AAS wordt gecontroleerd door de detectie van de AAS zelf, indien deze in

de urine geëxcreteerd worden, en van hun metabolieten [5]. Voor de detectie van de endogene

AAS is er een kwantitatieve bepaling nodig, aangezien ze van nature al in het lichaam

voorkomen. Dit in tegenstelling tot de exogene steroïden waar een kwalitatieve analyse al

voldoende is. De aanwezigheid van exogene steroïden levert immers direct een bewijs van

misbruik op. De detectie van de AAS gebeurt vaak aan de hand van gaschromatografie

gevolgd door massaspectrometrie (GC-MS) [3;4]. Daarnaast is er eveneens detectie mogelijk

met behulp van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS). LC-MS wint aan

aandeel aangezien het geen derivatisatie vereist en dus snellere staalvoorbereiding toelaat

[7;8]. LC-MS kan complementaire informatie geven, voornamelijk in het geval van thermisch

labiele AAS, zoals trenbolon. GC-MS wordt dan weer bij voorkeur toegepast bij

componenten die moeilijker te ioniseren zijn met de zachtere ionisatietechnieken gebruikt bij

LC-MS, bijvoorbeeld in het geval van androstaandiol [8].

1.4.1 Chromatografie

Chromatografie wordt vaak gebruikt voor de scheiding van oplossingen in zijn verschillende

componenten. De oplossing wordt via de mobiele fase over de stationaire fase geleid. De

componenten gaan zich verdelen over de twee fasen. De scheiding berust op een verschil in

interactie met de stationaire fase, waardoor de componenten vertraagd worden (retentie). Zo

elueren de componenten bij een verschillende retentietijd (RT). Bij gaschromatografie is deze

mobiele fase een gas, het draaggas. De stationaire fase is vloeibaar of vast en is gecoat als dun

laagje aan de binnenzijde van een capillaire kolom van fused silica (SiO2) [6;9]. De

belangrijkste onderdelen van de gaschromatograaf zijn weergegeven in Figuur 3.

Om de chromatografische eigenschappen van de steroïden te verbeteren worden de AAS

gederivatiseerd met trimethylsilyl (TMS). Door deze derivatisatie worden de stoffen

vluchtiger en thermisch stabieler [4;10].

1.4.2 Injecteren van staal

De monstercapaciteit van capillaire kolommen is zeer klein. Overbelading kan dus snel

optreden. Daarom kan er gebruik gemaakt worden van verschillende injectors: split, splitless

of ‘Programmed Temperature Vaporisation’ (PTV).

In het geval van de split/splitless injector wordt het staal in een liner in een warme

verdampingskamer gebracht zodat het staal verdampt. In de splitless modus wordt de ganse

hoeveelheid naar de kolom geleid. Bij een split injectie gaat slechts een klein deel van het

staal naar de kolom. De hoeveelheid die opgespoten wordt, wordt bepaald door de

splitverhouding.

In een PTV injector wordt de temperatuur van de liner via een temperatuurprogramma

gereguleerd waardoor er grotere volumes staal opgespoten kunnen worden. De verdamping

van het staal gebeurt immers meer geleidelijk. Het solvent heeft het laagste kookpunt en zal

dus het eerst naar de kolom geleid worden of kan via een splitopening de liner verlaten

(‘solvent vent’) [6;9].

Figuur 3. Opstelling van de gaschromatograaf [6].

1.4.3 Gaschromatografische scheiding

De TMS-derivaten van AAS scheiden goed op een fused-silica capillaire kolom met cross-

linked methylsilicone (zie Figuur 4) als de stationaire fase. De mobiele fase is helium (He),

waterstof (H2) of stikstof (N2). De oven is meestal ingesteld op een bepaald

temperatuurprogramma om een optimale scheiding te verkrijgen en de analysetijd zo kort

mogelijk te houden. De gasflow van het draaggas bepaalt eveneens de mate van scheiding en

de analysetijd. Aangezien de gebruikte kolom van de GC zeer apolair is, is het belangrijk dat

de glucuronide-groepen, die polair zijn, van de geconjugeerde steroïden vooraf verwijderd

worden.

De detector die hier gebruikt zal worden is de triple quadrupool massaspectrometer [4].

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Gas_chromatograph.png

Figuur 4. Structuur van de stationaire fase, dimethylpolysiloxaan [11].

1.4.4 Interface

Er is een interface nodig tussen de gaschromatograaf en de massaspectrometer indien de

gasflow hoger is dan de massaspectrometer kan verwerken. Op deze manier kan het

drukverschil overbrugd worden [10].

Bij het gebruik van fused silica capillaire kolommen is een directe koppeling mogelijk. Deze

koppeling gebeurd door middel van een transferline die verwarmd wordt. Aangezien de

oplosmiddelpiek leidt tot een grote druktoename in de ionenbron is het noodzakelijk om de

ionenbron uit te schakelen tijdens de elutie van het oplosmiddel (‘solvent delay’). Op deze

manier wordt het filament van de ionenbron beschermd [10].

1.4.5 Massaspectrometrie

Massaspectrometrie is gebaseerd op het scheiden van ionen volgens hun

massa/ladingsverhouding (m/z) [10]. De belangrijkste componenten van de

massaspectrometer worden weergegeven in Figuur 5.

Figuur 5. Hoofdcomponenten van een massaspectrometer [6].

Een eerste belangrijk onderdeel van de massaspectrometer (Figuur 5) is de ionenbron. In deze

ionenbron worden componenten vanuit de gasfase geïoniseerd en verkrijgen ze dus een

lading. De massaspectrometer werkt onder vacuüm om er voor te zorgen dat geïoniseerde

moleculen niet met resterende gasmoleculen kunnen botsen. Dit zorgt er bovendien voor dat

het filament niet doorbrandt [6]. Voor het ioniseren van anabole steroïden wordt er vaak

gebruik gemaakt van elektron ionisatie (EI) [8]. Bij EI worden de moleculen gebombardeerd

met elektronen. Op deze manier wordt er een elektron bij de molecule verwijderd en worden

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Ms_block_schematic.gif

er positief geladen ionen bekomen. Naast de ionisatie treedt er eveneens fragmentatie op.

Deze fragmentatie zorgt ervoor dat er bijkomend extra structuurinformatie over de te

analyseren verbinding bekomen wordt [10].

Naast de ionenbron is er een massa-analysator die zorgt voor de scheiding van de ionen door

middel van een elektromagnetisch veld. De quadrupool analysator (Figuur 6) bestaat uit vier

evenwijdige geplaatste staafvormige elektroden. Elk paar tegenoverliggende staven wordt

gevoed door een gelijkspanningscomponent, VDC, en een radiofrequente

wisselspanningscomponent, VRF. Door deze VDC en VRF ontstaat er een elektrostatisch veld

binnen de quadrupool massafilter. Door dit elektrisch veld ondergaan de ionen oscillerende

bewegingen. Enkel de componenten, zoals in Figuur 6, met een stabiele oscillerende

beweging bereiken de detector [6;10].

Figuur 6. Een single quadrupool massaspectrometer [12].

De triple quadrupool massaspectrometer bestaat uit 3 quadrupolen die naast elkaar geplaatst

zijn (Figuur 7). De eerste analysator (Q1) wordt gebruikt voor de selectie van precursorionen

met een bepaalde m/z. Q2 doet dienst als ‘collisie cell’, waarbij de geselecteerde ionen

worden gefragmenteerd door botsing met het collisiegas. Deze fragmentatie noemt men

‘collision induced dissociation’ (CID). Het collisiegas kan argon (Ar), stikstofgas (N2) of

helium zijn. De derde quadrupool (Q3) is terug een massa-analysator die enkel de

geselecteerde fragmentionen of productionen doorlaat voor detectie. Deze selectie van

precursor- en production wordt ‘single reaction monitoring’ (SRM) genoemd [6].

Figuur 7. Een triple quadrupool massaspectrometer [13].

Voor de analyse van de anabole androgene steroïden met behulp van massaspectrometrie

(Figuur 8) kan er gekozen worden voor het opnemen van volledige spectra (‘full scan mode’)

of voor ‘selected ion monitoring’ (SIM). Bij SIM wordt de eerste analysator ingesteld op één

of enkele ionen die een hoge specificiteit hebben voor de te analyseren verbinding terwijl bij

de volledige spectra alle ionen tussen een bepaald massabereik afgescand worden. [10]. Bij

het uitvoeren van tandem massaspectrometrie, bijvoorbeeld met een triple quadrupool

massaspectrometer, kan er eveneens gebruik gemaakt worden van ‘single reaction

monitoring’. Bij SRM wordt een bepaalde transitie (precursorion en production) gedetecteerd

die specifiek is voor de te identificeren component. Door de mogelijkheid om SRM analysen

te kunnen uitvoeren, kan een grotere selectiviteit en specificiteit bekomen worden met de

triple quadrupool massaspectrometer. Er kan eveneens een ‘multiple reaction monitoring’

(MRM) methode toegepast worden. In dit geval worden er meerdere transities per component

gedetecteerd. Een bijkomende mogelijkheid met de triple quadrupool MS is de ‘production

scan’. Bij de ‘production scan’ wordt een geselecteerd precursorion gedissocieerd en worden

alle bekomen productionen gescand. Door het toepassen van deze ‘production scan’ kunnen er

gemakkelijker transities voor een bepaalde component opgesteld worden [6].

Figuur 8. De verschillende analysemethoden die met de triple quadrupool MS toegepast kunnen worden.

Ten slotte worden de ionen gedetecteerd aan de hand van elektron multipliers. De werking

ervan is gebaseerd op het principe van secundaire elektronen-emissie. De ionen komen op een

metaaloppervlak terecht waardoor er elektronen vrijkomen. Deze elektronen vallen op hun

beurt op een tweede oppervlak en maken terug elektronen vrij. Dit wordt verschillende keren

herhaald om zo het signaal te kunnen versterken [10].

1.5 Methodevalidatie

Het is belangrijk om na het ontwikkelen van een methode deze te gaan valideren. Op deze

manier kan er gecontroleerd worden of de methode wel geschikt is voor zijn doel en of deze

voldoende betrouwbaar is [14].

Om een kwalitatieve methode te gaan valideren is het belangrijk om de selectiviteit,

specificiteit en de aantoonbaarheidsgrens of de ‘Limit of Detection’ (LOD) te gaan bepalen.

De selectiviteit is de mate waarin een methode het onderscheid kan maken tussen de analyt en

de achtergrond of interferenties. De eigenschap van een methode om enkel en alleen de analyt

te meten is de specificiteit. Om de selectiviteit en specificiteit te kunnen testen, worden er

minimum 10 blanco stalen en minimum 10 blanco stalen aangerijkt met mogelijke

interfererende stoffen geanalyseerd [14].

De LOD is de laagste concentratie die met een zekere statistische zekerheid kan worden

gemeten. Om de LOD te gaan bepalen worden er stalen gespiked met verschillende

concentraties van het steroïd. De LOD is dan de laagste concentratie waarbij de signaal tot

ruis verhouding (S/N) minimum gelijk is aan drie. Het is belangrijk dat deze LOD lager is dan

de ‘Minimum Required Performance Limit’ (MRPL). De MRPL is de concentratie die

laboratoria routinematig moeten kunnen detecteren [14]. WADA legt de MRPL vast op 10

ng/ml voor de anabole steroïden. Voor enkele metabolieten van de steroïden methandiënon,

stanozolol en 17α-methyltestosteron is deze limiet zelfs 2 ng/ml. Voor methandiënon moet

een MRPL gehaald worden van 2 ng/ml voor de metaboliet epimethendiol [15].

Bij de validatie van kwantitieve methodes moet eveneens de bepaalbaarheidsgrens of ‘Limit

of Quantification’ (LOQ) bepaald worden. De LOQ is de laagste concentratie aan een analyt

die bepaald kan worden met een aanvaardbaar niveau van precisie (herhaalbaarheid) en

juistheid (bias).

1.6 Probleemstelling

Een nadeel van het gebruik van SIM is dat het aanleiding kan geven tot misidentificatie als

dezelfde ionen ook bij een andere verbinding voorkomen. Om deze reden er gekozen worden

voor tandem MS (MS/MS). Door de hogere selectiviteit en specificiteit van de SRM methode

kunnen immers de interferenties en achtergrond gereduceerd worden. Er is immers een

kleinere kans dat de interfererende component aanleiding zal geven tot hetzelfde production

[10]. Dit heeft eveneens tot gevolg dat lagere concentraties kunnen gedetecteerd worden en

dus een lagere detectielimiet verkregen wordt.

Recent werd er een triple quadrupool massaspectrometer ontwikkeld die gekoppeld kan

worden aan een gaschromatograaf. Dit type massaspectrometer werd reeds gebruikt in

combinatie met vloeistofchromatografie. Er zijn nog geen studies gebeurd met de GC

gekoppeld aan een triple quadrupool massaspectrometer omtrent de detectie van anabole

steroïden. Het is bij deze masterproef dan ook de bedoeling om een SRM methode met behulp

van de triple quadrupool massaspectrometer gekoppeld aan een gaschromotograaf te gaan

ontwikkelen. De methode zal ontwikkeld worden voor het steroïd methandiënon aan de hand

van excretie-urines. Het is hierbij de bedoeling om naast de reeds gekende metabolieten in de

literatuur ook op zoek te gaan naar eventueel nieuwe metabolieten. Zowel de vrije fractie

(ongecojugeerde steroïden) als de totale fractie van de steroïden zal bestudeerd worden.

Daarnaast zal er eveneens een SIM methode opgesteld worden, zodat de detectietijden van de

metabolieten tussen de SIM en SRM methode vergeleken kunnen worden.

1.7 Methandiënon

Methandiënon (17α-methyl-17β-hydroxyandrosta-1,4-dien-3-on) of misschien beter gekend

onder zijn merknaam Dianabol is een exogeen anabool androgeen steroïd dat al sinds 1959 op

de markt is [16]. De structuurformule van methandiënon wordt weergegeven in Figuur 2 ( zie

pagina 4). Methandiënon heeft een moleculair gewicht van 300,44 Dalton. Na derivatisatie

met TMS wordt een moleculair ion bekomen met een m/z van 444 (300 + (2 x 72)).

Methandiënon is een exogeen steroïd met orale activiteit. Deze orale activiteit wordt bekomen

door de 17α-methyl substitutie. Dit heeft echter tot gevolg dat het bij orale inname schadelijk

is voor de lever.

In deze masterproef werd er voor methandiënon gekozen aangezien het één van de frequentst

gedetecteerde exogene anabole steroïden is. Zo werd dit steroïd in 2009 in 3,3% van de

positieve stalen voor anabole steroïden gedetecteerd [1]. Het metabolisme van methandiënon

werd bovendien al veelvuldig bestudeerd [7]. Op deze manier kon er een lijst met

metabolieten van methandiënon die reeds in de literatuur beschreven zijn, opgesteld worden

(zie Tabel 3).

Voor de detectie van de inname van methandiënon wordt er vaak gebruikt gemaakt van het

diagnostisch metaboliet 6β-hydroxymethandiënon [4]. 6β-hydroxymethandiënon is één van de

vroegst te detecteren metabolieten van methandiënon in urine na inname van dit steroïd. De

volgende steroïden worden ongeconjugeerd in de urine uitgescheiden: 17-epimethandiënon,

6β-hydroxymethandiënon, 6β-hydroxy-17epi-methandiënon en 17α,17β-dimethyl-18-

norandrosta-1,4,13-trien-3-on [16]. De metabolieten epimethendiol (17β-methyl-5β-androsta-

1-en-3α,17α-diol) en 18-normetenol (17α,17β-dimethyl-18-nor-5β-androsta-1,13-dien-3α-ol)

laten detectie van methandiënon op lange termijn toe. Beide metabolieten worden als

glucuronideconjugaten in de urine uitgescheiden. 17α-methyl-5β-androsta-3α,17β-diol is een

gemeenschappelijke metaboliet van de steroïden methandiënon, methandriol en

methyltestosteron [5].

Tabel 3. Lijst met metabolieten van methandiënon en de massa’s van de moleculaire ionen als TMS-enol-

TMS-ether derivaat.

Naam steroïd M

+

(Dalton) Referentie

Methandiënon (merknaam: Dianabol, Danabol)

= methandrostenolon

= 17α-methyl-17βhydroxyandrosta-1,4-dien-3-on

444 [7;17;18;19]

1 17-epimethandiënon

= 17β-methyl-17α-hydroxyandrosta-1,4-dien-3-on 444 [7;18]

2 6β-hydroxymethandiënon

= 17α-methyl-6β,17β-dihydroxyandrosta-1,4-dien-3-on 532 [7;18]

3 6β-hydroxy-17-epimethandiënon

= 17β-methyl-6β,17α-dihydroxyandrosta-1,4-dien-3-on 532 [7]

4 17α-methyl-17βhydroxyandrosta-1,4,6-trien-3-on 442 [7]

5 17α-hydroxymethyl-17β-methyl-18-norandrosta-1,4,13-

trien-3-on 442 [7]

6 17α-methyl-17β-hydroxy-5β-androsta-1-en-3-on 446 [7;18]

7 17β-hydroxymethyl-17α-methyl-18-norandrosta-1,4,13trien-

3-on 442 [7;17;18]

8 17α,17β-dimethyl-18-nor-5β-androsta-1,13-dien-3-on 356 [7]

9 17α,17β-dimethyl-18-norandrosta-1,4,13-trien-3-on 354 [7;18]

10 17α-methyl-5β-androsta-1-en-3α,17β-diol 448 [7]

11 Epimethendiol

= 17β-methyl-5β-androsta-1-en-3α,17α-diol 448 [7;18]

12 18-normetenol

= 17α,17β-dimethyl-18-nor-5β-androsta-1,13-dien-3α-ol 358 [7;18]

13 17α-methyl-5β-androsta-3α,17β-diol 450 [7;18]

14 17α-methyl-6β,16α,17β-trihydroxyandrosta-1,4-dien-3-on 620 [7]

15 17β-methyl-6β,16β,17α-trihydroxy-androsta-1,4-dien-3-on 620 [7]

16 17α-methyl-6β,16β,17β-trihydroxy-androsta-1,4,dien-3-on 620 [7]

17 17α-methyl-6β,12β,17β-trihdydroxy-androsta-1,4-dien-3-on 620 [7]

18 18-nor-epimethendiol

=17β-methyl-18-nor-5β-androsta-1-en-3α,17α-diol 433 [17]

19 6-en-epimethandiënon

= 17β-methyl-17α-hydroxyandrosta-1,4,6-trien-3-on 442 [7]

2. Materialen en methoden

2.1 Producten en reagentia

Referentiestandaarden voor methandiënon (17α-methyl-17β-hydroxyandrosta-1,4-dien-3on)

en de volgende metabolieten ervan: 6β-hydroxymethandiënon, 17-epimethandiënon en 17β-

methyl-5β-androsta-1-en-3α,17α-diol (epimethendiol) werden aangekocht bij het ‘National

Measurement Institute’ (Pymble, Australië). Als interne standaard (IS) wordt 17α-

methyltestosteron gebruikt dat bekomen werd via Organon (Oss, Nederland).

Het enzyme β-glucuronidase van Escherichia coli is afkomstig van Roche Diagnostics

(Mannheim, Duitsland). N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA) is afkomstig

van Karl Bucher (Waldstetten, Duitsland) en ethaanthiol komt van Acros (Geel, België).

Dinatriumwaterstoffosfaat dihydraat (Na2HPO4.2H2O) p.a., natriumdiwaterstoffosfaat

dihydraat (NaH2PO4.H2O) p.a., kaliumcarbonaat (K2CO3) p.a., natriumsulfaat (Na2SO4) p.a.

en natriumchloride (NaCl) p.a. en ammoniumiodide (NH4I) werden aangekocht bij Merck

(Darmstadt, Duitsland). Diethylether, methanol en natriumcarbonaat ( NaHCO3) p.a. komen

van Fisher Scientific (Loughborough, UK). Pentaan p.a. en acetonitrille (ACN) werden

aangekocht bij Biosolve (Valkenswaard, Nederland). Iso-octaan p.a. en ethaanthiol komen

van Acros (Geel, België).

De leverancier van de gassen gebruikt voor de GC-MS analyse, helium en stikstofgas, is Air

Liquide (Bornem, België).

2.2 Instrumentatie

De gebruikte gaschromatograaf is een Agilent 7890 GC (Agilent Technologies, Palo Alto,

USA) met een 12,5 m J&W Ultra 1 capillaire kolom van Agilent. De capillaire kolom heeft

een interne diameter van 200 µm en een film thickness van 0,11 µm. De stationaire fase van

de kolom bestaat uit ‘cross-linked’ dimethylsilicone of dimethylpolysiloxaan. Helium wordt

gebruikt als mobiele fase met een flow van 0,77 ml/min en een druk van 5,56 psi. De

massaspectrometer is een Agilent 7000A triple quadrupool MS. Het collisiegas in de

collisiecel is N2 (1,5 ml/min) en als quench gas wordt er helium (2,25 ml/min) gebruikt. De

GC gekoppeld aan de triple quadrupool MS is eveneens uitgerust met een MPS2 autosampler

en een PTV-injector van Gerstel (Mülheim en der Ruhr, Duitsland).

5 µl staal werd geïnjecteerd in de ‘solvent vent’ modus van de PTV-injector. Het volgende

temperatuurprogramma werd voor de PTV gebruikt: 35°C gedurende 0,20 min en dan met

12°C/min opwarmen tot 310°C. De ‘vent flow’ was 125 ml/min met een ‘vent’ druk van 9 psi

gedurende 0,2 min. Om injectie van dit grotere volume staal toe te laten, werd er gebruikt

gemaakt van een ‘baffled’ liner.

Het oventemperatuurprogramma was als volgt ingesteld: de initiële temperatuur was 60°C

gedurende 0,20 min (‘cold on column’). Via deze ‘cold on column’ techniek kan er een betere

scheiding van de componenten verkregen worden en worden er mooiere pieken bekomen,

aangezien de componenten terug gaan condenseren aan het begin van de kolom. Dit zorgt

eveneens voor dat de retentietijden van de componenten niet te veel verschuiven [20].

De temperatuur nam dan toe met 70°C/min tot 183°C vervolgens werd er opgewarmd met

5,1°C/min tot 220°C. Uiteindelijk werd er opgewarmd om tot de finale temperatuur van

310°C te komen met een snelheid van 50°C/min, deze temperatuur werd 1,8 min

aangehouden.

De transferline heeft een temperatuur van 310°C. De ‘solvent delay’ bedraagt 1,20 min. De

temperatuur van de ionenbron is ingesteld op 250 °C.

De totale run neemt telkens 12,81 min in beslag.

Bij het opnemen van full scan massaspectra (MS1 scan) wordt er gescand van de m/z waarden

40 tot 700 met een scantijd van 350 ms en met als grootte van de stappen 0,1 amu. Als MS

resolutie wordt er telkens voor ‘wide’ gekozen. Bij de opname van een production scan was

de collisie-energie telkens vastgelegd op 15 eV met een scantijd van 350 ms. De MS1 werd

ingesteld op het precursorion en de MS2 scande van een m/z van 40 tot een m/z van het

precursorion + 5.

2.3 Excretiestudie

De urinestalen die voor deze masterproef nodig zijn, werden afgenomen bij een excretiestudie

(UZ Gent, project B67020084191). De proefpersonen in deze studie waren gezonde mannen

met een leeftijd tussen de 21 en 60 jaar. Methandiënon werd aan één proefpersoon

toegediend, hiervoor moest er één capsule met dit steroïd ingenomen worden. De capsule

bevatte een dosis van 5 mg methandiënon. De urinestalen werden afgenomen op 0-2-4-6-9-

12-24-30-36-48-72-96 u en dan verder om de 24 u tot 14 dagen (336 u) na de orale toediening

van de anabole steroïden. Na afname werden de urinestalen in de diepvries (maximum -15°C)

bewaard ter afwachting van de analyse van de stalen.

2.4 Staalvoorbereiding

Er wordt 1 ml van de urinestalen overgebracht in een proefbuis. In het geval van de ‘full scan’

analyses werd er gebruik gemaakt van 5 ml urine. Bij elke reeks urinestalen zal er telkens ook

een systeem blanco (water), een blanco (negatief urinestaal) en een positieve controle

(steroïdvrije urine aangerijkt met referentiestandaarden van de bestudeerde steroïden)

geanalyseerd worden ter controle. Aan de stalen wordt er 50 µl 17α-methyltestosteron (IS)

toegevoegd. Vervolgens wordt er 1 ml fosfaatbuffer toegevoegd met een pH van 7,0.

Enzymatische hydrolyse van de glucuronide-groepen wordt uitgevoerd met 50 µl β-

glucuronidase (E. coli) gedurende 1,5 uur bij 56±5°C. Op deze manier kan de totale fractie

geanalyseerd worden. De totale fractie bevat dus zowel geconjugeerde als ongeconjugeerde

steroïden. Na de stalen te laten afkoelen tot kamertemperatuur wordt er 300 mg NaCl en 2 ml

vloeibare buffer NaHCO3/K2CO3 (2/1) met pH 9,5 toegevoegd. Vloeistof-vloeistof extractie

(LLE) wordt met 5 ml diethylether uitgevoerd door de buizen 20 minuten te laten rollen en

vervolgens te centrifugeren gedurende 5 minuten bij 2000-2800 toeren. Vervolgens wordt de

organische fractie afgenomen en in een kleine sovirelbuis overgebracht. Deze organische

fractie wordt gedroogd door toevoegen van 100 mg Na2SO4 en vervolgens drooggedampt

onder een stikstofstroom bij kamertemperatuur. Als de batch niet direct geanalyseerd kon

worden, werden de stalen na deze stap in de koelkast geplaatst. Voor de analyse werden de

residuen dan nog 10 min extra gedroogd bij 80±5°C. Er wordt 20 µl acetonitrille aan de

gedroogde residuen toegevoegd. Ten slotte worden de AAS gederivatiseerd met 50 µl N-

methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA) en in een tweede stap met 50 µl van een

trimethylsilyl (TMS) -derivatiseringsoplossing. De TMS-derivatiseringsoplossing bevat

MSTFA, ammoniumiodide (NH4I) en ethaanthiol (500:4:2). De derivatistering gebeurt in

twee stappen waarbij de stalen telkens 30 minuten in de oven bij 80±5°C geplaatst worden

[21]. Om te verhinderen dat MSTFA in het toestel terechtkomt, wordt er na de derivatisatie

nog een tegenextractie, die in het DoCoLab opgesteld is, uitgevoerd. Op deze manier moet de

liner minder snel vervangen worden. Dit zorgt er bovendien voor dat de derivatisatie langer

stabiel is. Voor deze tegenextractie wordt er 125 µl gedestilleerd water en 500 µl

pentaan/isoctaan (4/1) toegevoegd. De stalen worden goed gevortexd en de bovenste

organische fase wordt in een vial overgebracht. Via de MPS2 autosampler wordt er

vervolgens 5 µl uit de vials op de gaschromatograaf opgespoten.

Om de vrije fractie (ongeconjugeerde steroïden) te kunnen analyseren wordt na het toevoegen

van de IS meteen overgegaan naar de LLE, zonder de enzymatische hydrolyse uit te voeren.

Vervolgens worden de zelfde stappen voor de staalvoorbereiding gevolgd zoals hierboven

beschreven.

Indien er zuivere referentiestandaarden (opgelost in methanol) geanalyseerd worden, worden

deze meteen drooggedampt onder een stikstofstroom en worden vervolgens dezelfde stappen

gevolgd als hierboven beschreven.


Na het ontwikkelen van de kwalitatieve methode werd de methode eveneens gevalideerd. De

validatie gebeurde aan de hand van een batch met 10 positieve urinestalen en een batch van

10 negatieve urinestalen.

Als kwalitatieve controleparameters in elke batch zijn de interne standaard, 17α-

methyltestosteron, en de transitie in de MRM methode ter controle van mono-TMS vorming

belangrijk. Het toevoegen van een interne standaard maakt het mogelijk om te corrigeren voor

variaties in de staalvoorbereiding en om relatieve retentietijden (RRT) en relatieve

piekoppervlakten te berekenen. De RRT wordt bekomen door de retentietijd van de

component te delen door de retentietijd van de IS. De controle van de derivatisatie gebeurd

aan de hand van het mono-TMS gederivatiseerde androsteron. Het is belangrijk dat de mono-

TMS vorming lager is dan 10% om een efficiënte derivatisatie te verkrijgen.

Om de methode te gaan valideren wordt de residuele standaarddeviatie (RSD) en de bias

bepaald voor 6 calibratiepunten. Deze 6 calibratiepunten hebben een concentratie van 2

ng/ml, 5ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml en 50 ng/ml. Per punt worden er 3 herhalingen

uitgevoerd. Om te kunnen spreken van een goede herhaalbaarheid moet de RSD kleiner zijn

dan de 2/3RSDmax van Horwitz ((2/3)*2(1-0,5logC)

). De bias (%) wordt berekend aan de hand

van de juistheid. De bias moet kleiner zijn dan 15%, voor het laagste punt moet dit lager zijn

dan 20%. De laagste concentratie die met voldoende statistische zekerheid kan worden

bepaald wordt als de LOQ genomen [14].

[14]

[14]

3. Resultaten

3.1 Analyse van referentiestandaarden

3.1.1 Full scan spectra van referentiestandaarden van methandiënon en metabolieten

Om een MRM methode op te kunnen stellen is het belangrijk om eerst full scan spectra op te

nemen. De full scan spectra werden opgenomen van telkens 100 µl referentiestandaard van

methandiënon (1 µg/ml), 6β-hydroxymethandiënon (20 µg/ml), 17-epimethandiënon (1

µg/ml) en epimethendiol (100 µl/ml). Aan de hand van deze massapectra kunnen de beste

precursorionen geselecteerd worden. Bij de selectie van een precursorion wordt er op gelet dat

dit ion een hoge m/z waarde heeft en dat het een voldoende hoge abundantie heeft. Op deze

manier kan het na de fragmentatie nog teruggevonden worden en kunnen er voldoende

productionen gevormd worden. In Figuur 9 wordt het massaspectrum van 6β-

hydroxymethandiënon weergegeven. De geselecteerde precursorionen worden weergeven in

Tabel 4.

Figuur 9. Full scan massaspectrum van 6β-hydroxymethandiënon.

Tabel 4. Selectie precursorionen uit full scan spectra referentiestandaarden.

Steroïd Moleculair ion (M+) Precursorion RT RRT

methandiënon 444 444; 354; 339 9,73 0,99

6β-hydroxymethandiënon 532 517 10,32 1,05

17-epimethandiënon 444 444 8,96 0,91

epimethendiol 448 448; 358 6,92 0,71

3.1.2 Production scan van de geselecteerde precursorionen

Door het opnemen van production scans wordt er nagegaan worden welke productionen

voortkomen uit de bovenstaande geselecteerde precursorionen. In Figuur 10 wordt de product

ion scan van 6β-hydroxymethandiënon weergegeven. Op deze manier was het mogelijk om de

beste productionen te selecteren. Voor de productionen is het belangrijk dat ze voldoende

specifiek zijn voor de component, daarom wordt er bij voorkeur ook geen ion met een te lage

m/z waarde gekozen. Er dient eveneens voor gezorgd te worden dat het production een

voldoende hoge abundantie heeft. Een transitie van een precursorion naar een production met

een verschil van m/z 90 dient vermeden te worden, aangezien dit niet zo specifiek is. Dit

fragmention komt immers overeen met TMS-OH ((CH3)3SiOH). Het ion met m/z 73 komt

overeen met trimethylsilyl ((CH3)3Si) en is dus niet specifiek voor een bepaalde component,

aangezien het eveneens afkomstig is van de trimethylsilylderivatisatie [8;9].

Vervolgens werd, met de beste transities van precursorion en production, een MRM methode

samengesteld (zie Tabel 5).

Figuur 10. Product ion scan van 6β-hydroxymethandiënon met m/z=517 als precursor ion.

3.1.3 Opstellen van MRM methode

De transities die gekozen werden voor methandiënon, 17-epimethandiënon, 6β-

hydroxymethandiënon en epimethendiol worden weergegeven in Tabel 5.

Deze MRM methode werd vervolgens getest op de referentiestandaarden van methandiënon,

17-epimethandiënon, 6β-hydroxymethandiënon en epimethendiol. Aan de hand van de

MassHunter software werd er een kwantitatieve methode opgesteld. In deze methode worden

de transities en retentietijden van de componenten ingegeven. Aan de hand van deze methode

was het dan mogelijk om de relatieve piekoppervlakten van de componenten in het

chromatogram te bepalen. Deze relatieve piekoppervlakten geven een idee over de

hoeveelheid van de steroïden er in de urine uitgescheiden wordt.

Tabel 5. Geselecteerde transities voor MRM methode.

Steroïd Transitie Collisie-energie (eV) Dwell (ms)

methandiënon 444 339 15 10

444 297 15 10

444 206 15 10

429 299 15 10

429 283 15 10

339 297 15 10

339 283 15 10

6β-hydroxymethandiënon 517 337 15 10

517 429 15 10

517 297 15 10

517 317 15 10

517 229 15 10

517 229 30 10

17-epimethandiënon 444 206 15 10

444 339 15 10

epimethendiol 448 419 15 10

448 301 15 10

448 216 15 10

448 195 15 10

448 182 15 10

448 143 15 10

358 301 15 10

3.1.4 Opstellen van SIM methode

Naast de MRM methode werd er eveneens een SIM methode opgesteld voor de detectie van

methandiënon, 17-epimethandiënon, 6β-hydroxymethandiënon en epimethendiol. De

geselecteerde ionen kunnen teruggevonden worden in Tabel 6.

Tabel 6. Opstellen SIM methode voor de referentiestandaarden van methandiënon en enkele

metabolieten.

Steroïd Ionen Dwell (ms)

methandiënon 444; 339; 206; 143 10

6β-hydroxymethandiënon 517; 294; 279; 229 10

17-epimethandiënon 444; 339; 206 10

epimethendiol 448; 358; 216; 143 10

3.2 Analyse van excretie-urines

3.2.1 Full scan spectra van excretie-urines

Van de excretiestudie werden de volgende urinestalen in full scan geanalyseerd: blanco urine

van methandiënon en de stalen na 1 u, 2 u, 6 u, 9 u en 12 u na inname. De vrije fractie van de

steroïden van deze stalen werd eveneens geanalyseerd.

De verkregen full scan spectra werden beoordeeld met behulp van de MassHunter software

voor kwalitatieve analysen. Bij het zoeken naar de reeds in de literatuur gekende metabolieten

werd er gebruik gemaakt van de ‘extracted ion chromatogram’ (EIC) van het moleculair ion

(M+) en het moleculair ion met een afgesplitste methylgroep (M

+-15). Het afsplitsen van een

methylgroep wordt immers vaak gezien bij de detectie van steroïden [8]. Deze metabolieten

van methandiënon en hun overeenkomende moleculaire ionen na derivatisatie met MSTFA

worden weergegeven in Tabel 3 (p. 15). De EIC van de verschillende urinestalen werden over

elkaar gelegd (overlaid chromatograms). Naast deze m/z-waarden werd er eveneens gebruik

gemaakt van m/z- waarden die vaak in steroïden teruggevonden worden. Op deze manier

kunnen nieuwe metabolieten opgespoord worden. Zo is een fragmention met een m/z van 129

een goede indicator voor gederivatiseerde steroïden met een 3- of 17-hydroxyl functie. De

aanwezigheid van een 17-methylgroep in TMS gederivatiseerde 17-hydroxy steroïden heeft

aanleiding tot de fragmentionen met een m/z van 143 en een minder intens ion met m/z 130.

Gederivatiseerde 17-keto steroïden worden gekarakteriseerd door het voorkomen van een m/z

van 169 in het massaspectrum. Steroïdstructuren met een 1,4-dien-3-on die gederivatiseerd

zijn, zoals methandiënon, genereren een intens fragment ion bij een m/z van 206 [8]. 17-

methyl-16,17-bis(trimethylsiloxy)steroïden vertonen fragmentionen met een m/z van 218 en

231, met 218 als het meest intense ion. Bijkomende karakteristieke fragmentionen bij deze

steroïden zijn de ionen met een m/z van 117 en 147 [22]. Bij steroïden met een 17-

hydroxymethylgroep komt het fragmention met een m/z van 103 voor. Maar het ion met een

m/z waarde van M+-103 kan soms meer intens zijn. Daarnaast komt er ook een fragmention

voor met m/z 133. Deze karakteristieke ionen komen voornamelijk bij methandiënon voor

[23].

Voor de metabolieten van methandiënon zal er een evolutie in concentratie zijn na inname

van methandiënon. Uiteraard moeten deze metabolieten afwezig zijn in de blanco pre-

administratieurine, de urine vooraleer methandiënon werd ingenomen. In Figuur 11 wordt dit

geïllustreerd aan de hand van het EIC van m/z 339, bij een retentietijd van 5,98. Bij deze

retentietijd is er een mooie evolutie van de hoeveelheid van M5 over de uren na inname op te

merken. Het gaat hier om een mogelijke, nog onbekende metaboliet die hier M5 wordt

genoemd. M5 vertoont de grootste piek bij 9u na de inname van methandiënon. Slechts na 2u

is er excretie van M5, die te onderscheiden is van de negatieve urine en de blanco excretie

urine.

Figuur 11. EIC van m/z 339 bij een RT van 5.98 in ‘overlaid chromatogram’ modus.

Het massaspectrum van de component die bij deze retentietijd elueert wordt weergegeven in

Figuur 12. Om vertrekkende vanuit het massaspectrum transities te bekomen voor de

metabolieten werden de gepaste precursor- en productionen geselecteerd (zoals dit gebeurde

bij 3.1.2).

In de full scan spectra kan de IS opgemerkt worden bij een RT van 9,8. Bij de

gehydrolyseerde urinestalen werden op basis van de vergelijking tussen post- en pre-

administratieurines uiteindelijk 9 mogelijke metabolieten van methandiënon (M1 tot en met

M9) gevonden naast epimethendiol, 6β-hydroxymethandiënon en methandiënon zelf. In de

vrije fractie werden er 16 mogelijke metabolieten gevonden (V1 tot en met V16).

Figuur 12. Massaspectrum van metaboliet M5 bij een RT van 5,98.

3.2.2 Opstellen MRM methode voor eventuele metabolieten van methandiënon en

controleparameters

Aan de hand van de verkregen full scan massaspectra van de excretie-urines (zie 3.2.1) werd

er een MRM methode ontwikkeld (Tabel 7). Hierbij werden eveneens de beste precursor en

productionen geselecteerd om tot goede transities te komen van te detecteren componenten.

Tabel 7. MRM methode voor detectie van mogelijke metabolieten methandiënon in excretie-urines en

enkele controleparameters.

Steroïd RT (min) RRT Transitie Collisie-energie (eV) Dwell (ms)

androsteron 7,59 0,77 239 167 15 10

239 117 15 10

IS 9,8 1 446 301 15 10

446 198 15 10

mono-TMS 6,81 0,69 347 253 15 10

M1 9,54 0,97 446 143 15 10

431 143 15 10

M2 8,92 0,91 444 206 15 10

444 339 15 10

M3 8,56 0,87 505 143 15 10

358 143 15 10

448 216 15 10

M4 3,11 0,32 354 193 15 10

354 324 15 10

M5 5,98 0,61 446 267 15 10

446 133 15 10

M6 7,98 0,81 450 246 15 10

450 194 15 10

450 143 15 10

M7 9,87 1,01 550 507 15 10

550 458 15 10

M8 10,58 1,08 548 206 15 10

548 231 15 10

M9 10,74 1,09 634 529 15 10

619 265 15 10

V1 3,63 0,37 313 117 15 10

313 185 15 10

V2 5,3 0,54 420 217 15 10

289 217 15 10

217 95 15 10

V3 5,94 0,60 432 133 15 10

339 133 15 10

432 206 15 10

V4 6,5 0,66 408 354 15 10

354 206 15 10

354 229 15 10

V5 7,5 0,76 427 281 15 10

427 148 15 10

427 131 15 10

442 339 15 10

V6 7,78 0,79 422 309 15 10

422 237 15 10

422 143 15 10

V7 8,1 0,82 502 339 15 10

473 339 15 10

443,5 339 15 10

V8 8,25 0,84 427 317 15 10

427 215 15 10

427 129 15 10

V9 9,12 0,93 450 199 15 10

450 156 15 10

V10 9,28 0,94 522 168 15 10

522 256 15 10

522 417 15 10

V11 9,36 0,95 536 169 15 10

536 253 15 10

536 291 15 10

V12 9,69 0,99 445 339 15 10

445 157 15 10

339 157 15 10

V13 9,84 1,004 550 230 15 10

517 230 15 10

550 244 15 10

V14 10,48 1,07 433 354 15 10

433 253 15 10

433 343 15 10

V15 10,7 1,09 605 463 15 10

605 542 15 10

605 113 15 10

V16 10,76 1,10 605 243 15 10

605 449 15 10

605 403 15 10

A1 358 253 15 10

358 216 15 10

A2 532 337 15 10

532 281 15 10

A3 532 337 15 10

532 297 15 10

A4 442 339 15 10

442 337 15 10

442 133 15 10

442 228 15 10

442 281 15 10

Legende:

M = eventuele metabolieten in totale fractie

V = eventuele metabolieten in vrije fractie

A = bijkomende metabolieten van methandiënon uit artikels [16,23]

Mono-TMS = mono-TMS gederivatiseerde androsteron

3.2.3 Controle van de opgestelde MRM methode aan de hand van positieve en negatieve

urines

Om de geschiktheid van de mogelijke metabolieten uit het vorige experiment te controleren

werden er telkens 10 negatieve urinestalen en 10 positieve urinestalen voor methandiënon

geanalyseerd met behulp van de opgestelde MRM methode. Van deze urinestalen werd zowel

de vrije fractie als de totale fractie geanalyseerd. De metabolieten die in de positieve

urinestalen werden teruggevonden zijn weergegeven in Tabel 8 (totale fractie) en Tabel 9

(vrije fractie).

Tabel 8. Detectie van metabolieten aan de hand van de opgestelde MRM methode in de totale fractie van

10 positieve urines.

Metabolieten Positieve urines

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Methandiënon X X X X X X X X X X

6β-

hydroxymethandiënon

X X X X X X X X X X

17-epimethandiënon X X X X X X X X X X

epimethendiol X X X X X X X X X X

M1

M2

M3 X X X X X X X X

M4 X X X X X X X X X

M5 X X X X X X X X X X

M6 X X

M7

M8 X X X X X X X X

M9 X X X X X X X X X X

Van de metabolieten gevonden in de totale fractie werden de volgende metabolieten echter

teruggevonden in sommige negatieve urines: M5, M8 en M9. Bij het toepassen van de MRM

methode op de vrije fractie van 10 negatieve urines werden de volgende metabolieten

eveneens teruggevonden: V1, V5, V6, V9, V10, V13 en V14. Hieruit blijkt dat deze

componenten geen metabolieten kunnen zijn van methandiënon, aangezien ze eveneens in

blanco urines aanwezig zijn.

Tabel 9. Detectie van metabolieten aan de hand van de opgestelde MRM methode in de vrije fractie van 10

positieve urines.

Metabolieten Positieve urines

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Methandiënon X X X X X X X X X X

6β-hydroxymethandiënon X X X X X X X X X X

17-epimethandiënon X X X X X X X X X X

Epimethendiol X X X X

M1

M2

M3

M4

M5

M6

M7

M8

M9

V1 X X X X X

V2

V3 X

V4 X X X X X X X X

V5 X X X X X X X X X X

V6 X X X X X X X X X X

V7

V8

V9 X

V10 X X X X

V11

V12

V13 X X

V14 X X X X X

V15

V16

3.2.4 Toepassen van de opgestelde MRM methode op de excretie-urines van 0-12 u

De totale MRM methode met zowel de transities van de referentiestandaarden en van de

gevonden metabolieten in de excretie-urines werd vervolgens nog eens toegepast op de batch

van excretie-urines (zie 3.2.1) voor zowel de vrije fractie als de totale fractie. Op deze manier

kan de relatieve piekoppervlakte van de metabolieten uitgezet worden ten opzichte van de tijd

na inname van methandiënon. Deze grafieken kan je in de volgende figuren zien (Figuur 13

tot en met Figuur 22).

Figuur 13. Detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon, epimethendiol en 6β-hydroxymethandiënon

in de totale fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de MRM methode.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 2 4 6 8 10 12

rela

tie

ve p

ieko

pp

erv

latk

e

tijd na inname methandiënon (u)

Totale fractie 0-12u

methandiënon

17-epimethandiënon

epimethendiol

6B-hydroxymethandiënon

Figuur 14. Detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon en epimethendiol in de totale fractie van de

excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de MRM methode.

Figuur 15. Detectie van M4 en M7 in de totale fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van

de MRM methode.

0

0,05

0,1

0,15

0 2 4 6 8 10 12

rela

tie

ve p

ieko

pp

erv

latk

e



methandiënon

17-epimethandiënon

epimethendiol

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 2 4 6 8 10 12

rela

tiev

e p

ieko

pp

ervl

akte



M4

M7

Figuur 16 . Detectie van M7 in de totale fractie van de excretie-urines van 0-12u aan de hand van de MRM

methode.

Figuur 17. Detectie van V4, V12 en V16 in de totale fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand

van de MRM methode.

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0,003

0,0035

0,004

0 2 4 6 8 10 12

rela

tie

ve p

ieko

pp

erv

lakt

e



M7

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0 2 4 6 8 10 12

rela

tiev

e p

ieko

pp

ervl

akte



V4

V12

V16


in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de MRM methode.

Figuur 19. Detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon en epimethendiol in de vrije fractie van de


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 2 4 6 8 10 12

rela

tie

ve p

ieko

pp

erv

lakt

e


Vrije fractie 0-12u

methandiënon

17-epimethandiënon

epimethendiol


0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 2 4 6 8 10 12

rela

tiev

e p

ieko

pp

ervl

akte


Vrije fractie 0-12u

methandiënon

17-epimethandiënon

epimethendiol

Figuur 20. Detectie van M3 en M4 in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand van de

MRM methode.

Figuur 21. Detectie van V3, V4, V8 en V12 in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de

hand van de MRM methode.

0

0,0001

0,0002

0,0003

0,0004

0,0005

0,0006

0 2 4 6 8 10 12

rela

tie

ve p

ieko

pp

erv

lakt

e


Vrije fractie 0-12u

M4

M3

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0,003

0,0035

0,004

0 2 4 6 8 10 12

rela

tiev

e p

ieko

pp

ervl

akte


Vrije fractie 0-12u

V3

V4

V8

V12

Figuur 22. Detectie van V3, V8 en V12 in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-12 u aan de hand

van de MRM methode.

3.2.5 Opstellen SIM methode voor metabolieten van methandiënon en controleparameters

Naast de MRM methode werd er eveneens een SIM methode ontwikkeld aan de hand van de

excretie-urines (zie 3.2.1). Zo wordt het mogelijk gemaakt om de detectietijden van de

metabolieten tussen beide methodes met elkaar te vergelijken. Deze SIM methode met de

geselecteerde ionen wordt weergegeven in Tabel 10.

3.2.6 Toepassen van de opgestelde SIM methode op excretie-urines van 0-12 u

Deze SIM methode voor zowel de ionen voor de identificatie van de referentiestandaarden en

de gevonden metabolieten in de excretie-urines werd vervolgens nog eens toegepast op de

batch van excretie-urines (zie 3.2.1) voor zowel de vrije als de totale fractie.

0

0,00005

0,0001

0,00015

0,0002

0,00025

0,0003

0,00035

0,0004

0,00045

0 2 4 6 8 10 12

rela

tie

ve p

ieko

pp

erv

lakt

e


Vrije fractie 0-12u

V8

V3

V12

Tabel 10. SIM methode voor de detectie van mogelijke metabolieten van methandiënon in excretie-urines

en enkele controleparameters.

Steroïd RRT Ionen Dwell (ms)

androsteron 0,77 434; 329 10

IS 1 301; 198 10

M3 0,87 448; 358; 216 10

M7 1,01 550; 507; 458; 219 10

V3 0,60 432; 339; 133 10

V4 0,66 408; 354; 229 10

V8 0,84 427; 317; 215 10

V12 0,99 445; 339; 157 10

V16 1,10 605; 449; 403; 243 10

A1 358; 253; 185 10

A2 532; 337; 281 10

A3 532, 337; 297 10

A4 442; 339; 228; 194 10

3.2.7 Toepassen van de opgestelde MRM methode op excretie-urines vanaf 30 u

Om na te gaan hoe lang de eventuele metabolieten gevonden in de excretie-urines van 1u tot

9u teruggevonden kunnen worden, werden er eveneens later afgenomen excretie-urines

geanalyseerd met deze MRM methode. Hiervoor werd zowel de vrije fractie als de totale

fractie van de excretie-urines van 30u, 36u, 48u, 72u, 96u, 120u, 144u, 168u, 192 u, 216u,

240u, 264u, 288u, en 312u na toediening van methandiënon geanalyseerd.

Door de relatieve piekoppervlakte van de metabolieten uit te zetten ten opzicht van de tijd na

inname van methandiënon wordt de detectietijd van de metabolieten bepaald. Deze grafieken

worden weergegeven in de figurenFiguur 23 tot en met Figuur 30.

Legende:

M= eventuele metabolieten in totale fractie

V= eventuele metabolieten in vrije fractie

A= bijkomende metabolieten van methandiënon uit artikels

Figuur 23. Detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon, epimethendiol, 6β-hydroxymethandiënon in

de totale fractie van de excretie-urines van 0-312 u aan de hand van de MRM methode.

Figuur 24. Detectie van methandiënon, epimethendiol en 17-epimethandiënon in de totale fractie van de


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 50 100 150 200 250 300 350

rela

tie

ve p

ieko

pp

erv

lakt

e


Totale fractie 0-312 u

epimethendiol

17-epimethandiënon

methandiënon


0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0 50 100 150 200 250 300 350

rela

tiev

e p

ieko

pp

ervl

akte



epimethendiol

17-epimethandiënon

methandiënon

Figuur 25. Detectie van M4 en M7 in de totale fractie van de excretie-urines van 0-312 u aan de hand van

de MRM methode.

Figuur 26. Detectie van M7 in de totale fractie van de excretie-urines van 0-312 u aan de hand van de

MRM methode.

0

0,125

0,25

0,375

0,5

0 50 100 150 200 250 300 350

rela

tie

ve p

ieko

pp

erv

lakt

e



M4

M7

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0,003

0,0035

0,004

0 50 100 150 200 250 300 350

rela

tiev

e p

ieko

pp

ervl

akte



M7

Figuur 27. Detectie van V4, V12 en V16 in de totale fractie van de excretie-urines van 0-312 u aan de hand

van de MRM methode.


in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-312 u aan de hand van de MRM methode.

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0 50 100 150 200 250 300 350

rela

tie

ve p

ieko

pp

erv

lakt

e



V4

V12

V16

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 50 100 150 200 250 300 350

rela

tiev

e p

ieko

pp

ervl

akte


Vrije fractie 0-312 u

epimethendiol

methandiënon

17-epimethandiënon


Figuur 29. Detectie van methandiënon, 17-epimethandiënon en epimethendiol in de vrije fractie van de


Figuur 30. Detectie van V4, V12 en V16 in de vrije fractie van de excretie-urines van 0-312u aan de hand

van de MRM methode.

3.2.8 Toepassen van de opgestelde SIM methode op excretie-urines vanaf 30 u

De batchen van in 3.2.7 worden eveneens geanalyseerd met de opgestelde SIM methode.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 50 100 150 200 250 300 350

rela

tie

ve p

ieko

pp

erv

lakt

e

tijd na inname methandiënon


epimethendiol

methandiënon

17-epimethandiënon

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0,003

0,0035

0,004

0 50 100 150 200 250 300 350

rela

tiev

e p

ieko

pp

ervl

akte

tijd na inname methandiënon


V4

V12

V16

3.2.9 Vergelijking van detectietijden tussen de SIM en MRM methode

Na het analyseren van de totale fractie en de vrije fractie van de excretie-urines van 0-312 u

met zowel de MRM als met de SIM methode werden de detectietijden van de verschillende

componenten vergeleken. Bij het bepalen van deze detectietijden werd er eveneens rekening

gehouden met het voorkomen van de transities van de qualifiers, die naast de quantifier

gedetecteerd worden. Deze detectietijden worden in de volgende figuren (Figuur 31 tot en met

Figuur 34) weergegeven.

Deze eventuele metabolieten van methandiënon zijn wel niet steeds meteen direct na inname

detecteerbaar. Deze tijden worden in Tabel 11 weergegeven. Het verschil tussen beide

methodes kan je ook opmerken in de figurenFiguur 35 enFiguur 36.

Figuur 31. Vergelijking van de detectietijden tussen de MRM en SIM methode voor de detectie van

methandiënon, epimethendiol, 17-epimethandiënon en 6β-hydroxymethandiënon in de totale fractie.

methandiënon ; 48

methandiënon ; 36

epimethendiol ; 120

epimethendiol ; 72

17-epi ; 48

17-epi ; 36

6B-OH ; 96

6B-OH ; 48

0 20 40 60 80 100 120 140


Totale fractie MRM vs SIM

Legende:

6B-OH = 6β-hydroxymethandiënon Blauw = MRM

17-epi = 17-epimethandiënon Rood = SIM

Figuur 32.Vergelijking van de detectietijden tussen de MRM en SIM methode voor de detectie van

methandiënon, epimethendiol, 17-epimethandiënon en 6β-hydroxymethandiënon in de vrije fractie.

Figuur 33. Vergelijking van de detectietijden tussen de MRM en SIM methode voor de detectie van M4,

M7, V4, V12, en V16 in de totale fractie.

methandiënon ; 36

methandiënon ; 12

epimethendiol ; 36

epimethendiol ; 30

17-epi ; 48

17-epi ; 48

6B-OH ; 96

6B-OH ; 72

0 20 40 60 80 100 120


Vrije fractie MRM vs SIM

M4 ; 12

M4 ; 12

M7 ; 48

M7 ; 36

V4 ; 12

V4 ; 12

V12 ; 12

V12 ; 0

V16 ; 12

V16; 0

0 10 20 30 40 50 60


Totale fractie MRM vs SIM

Legende:

Blauw = MRM Rood = SIM

Legende:

6B-OH = 6β-hydroxymethandiënon Blauw = MRM

17-epi = 17-epimethandiënon Rood = SIM

Figuur 34. Vergelijking van de detectietijden tussen de MRM en SIM methode voor de detectie van M4,

V3, V8 en V12 in de vrije fractie.

Tabel 11. Tijd tot detectie voor de metabolieten met behulp van de MRM en SIM methode in zowel de

totale als vrije fractie.

Metabolieten Totale fractie Vrije fractie

MRM SIM MRM SIM

Methandiënon 2 6 6 6

Epimethendiol 1 6 6 6

17-epimethandiënon 1 2 1 6

6β-hydroxymethandiënon 1 12 1 6

M3 / / / /

M4 1 1 6 /

M7 1 2 / /

V3 / / 6 /

V4 2 / 2 6

V8 / / 6 /

V12 6 / 2 /

V16 1 / / /

M4 ; 12

M4 ; 0

V3 ; 12

V3 ; 0

V4 ; 36

V4 ; 12

V8 ; 12

V8 ; 0

V12 ; 48

V12 ; 0

0 10 20 30 40 50 60


Vrije fractie MRM vs SIM

Legende:

Blauw = MRM Rood = SIM

Figuur 35. Detectie van epimethendiol in de totale fractie van de excretie-urine van 1u aan de hand van de

MRM methode. De verschillend transities en hun bijhorende piek in het chromatogram worden

weergegeven. De quantifier is in het zwart weergeven.

Figuur 36. Detectie van epimethendiol in de totale fractie van de excretie-urine van 1u aan de hand van de

SIM methode. De verschillend transities en hun bijhorende piek in het chromatogram worden

weergegeven. De quantifier is in het zwart weergegeven.


3.3.1 Herhaalbaarheid en bias

In Tabel 12 worden de resultaten van de methodevalidatie weergegeven, waaronder de bias

(%) en de herhaalbaarheid (RSD (%)).

Tabel 12. Validatie van de MRM en SIM methode voor methandiënon, epimethendiol, 6β-

hydroxymethandiënon.

Concentratie methandiënon epimethendiol 17-epi 6β-OH

MRM SIM MRM SIM MRM SIM MRM SIM

2 ng/ml 4,44 5,29 3,68 4,99 1,08 4,31 3,68 4,31

2/3RSDmax

= 27,18

SD 0,21 0,08 0,38 0,38 0,28 0,05 0,12 0,11

RSD 4,76 1,53 10,24 7,54 25,81 1,05 3,29 2,46

bias -122,24 -164,65 -83,81 -149,82 45,85 -115,68 -84,02 -115,26

5 ng/ml 6,56 7,39 14,97 15,20 4,45 6,22 5,48 6,11

2/3RSDmax

= 23,68

SD 0,22 0,19 2,44 2,60 0,36 0,12 0,33 0,29

RSD 3,36 2,55 16,33 17,13 8,02 1,93 6,08 4,78

bias -31,20 -47,75 -199,36 -203,95 11,06 -24,37 -9,52 -22,15

10 ng/ml 8,96 9,79 8,71 6,40 10,73 9,97 9,13 9,58

2/3RSDmax

= 21,33

SD 0,69 0,19 1,23 1,18 2,27 0,58 0,42 0,62

RSD 7,73 1,92 15,08 18,45 21,17 5,97 4,59 6,45

bias 10,44 2,11 12,81 36,04 -7,37 0,28 8,61 4,23

15 ng/ml 13,73 14,59 15,25 13,50 17,09 13,97 13,88 14,46

2/3RSDmax

= 20,07

SD 0,48 0,38 1,93 1,79 0,59 1,42 0,71 0,79

RSD 3,52 2,57 12,71 13,2 3,47 10,15 5,10 5,46

bias 8,44 2,72 -1,72 9,97 -13,93 6,85 7,48 3,60

20 ng/ml 18,68 19,16 18,81 18,59 20,02 18,46 18,56 18,88

2/3RSDmax

= 19,22

SD 3,45 3,43 3,45 3,35 3,64 2,4 2,11 1,76

RSD 18,48 17,91 18,04 12,03 18,18 13,00 11,36 9,30

bias 6,60 4,18 5,94 7,03 -0,09 7,69 7,17 5,59

50 ng/ml 51,86 52,44 43,47 42,45 55,13 52,95 46,04 45,49

2/3RSDmax

= 16,74

SD 6,05 7,35 0,69 0,66 9,20 8,42 3,32 3,37

RSD 11,67 14,01 1,58 1,03 16,68 15,90 7,21 7,41

bias -3,72 -4,88 13,05 15,00 -10,27 -5,90 7,92 9,02

Legende:

17-epi= 17-epimethandiënon

6β-OH= 6β-hydroxymethandiënon

= gemiddelde

Rood = voldoet niet aan de gestelde eisen

voor de herhaalbaarheid of bias

4. Bespreking

Aan de hand van excretie-urines voor methandiënon kon er een MRM methode ontwikkeld

worden voor de detectie van methandiënon, epimethendiol, 17-epimethandiënon, 6β-

hydroxymethandiënon, de eventuele metabolieten M1 tot en met M9 en de mogelijke

metabolieten V1 tot en met V16. Na het toepassen van deze MRM methode op de excretie-

urines en op positieve en negatieve urines bleken enkel nog de metabolieten M3, M4, M7, V3,

V4, V8, V12 en V16 over te blijven als eventuele metabolieten van methandiënon. Daarnaast

was het wel steeds mogelijk om de reeds goed gekende metabolieten van methandiënon:

epimethendiol, 17-epimethandiënon en 6β-hydroxymethandiënon te detecteren. De

metabolieten A1 tot A4 werden niet teruggevonden in deze excretie-urines.

4.1 MRM methode toegepast op excretie-urines tot 12 u

In de grafiek van de totale fractie valt het op dat 6β-hydroxymethandiënon tamelijk snel wordt

uitgescheiden. Na 9u wordt al de hoogste concentratie bereikt. 6β-hydroxymethandiënon is

dan ook al langer bekend als één van de vroegst te detecteren metabolieten van methandiënon

[16]. Het valt meteen op dat 6β-hydroxymethandiënon een belangrijke metaboliet is van

methandiënon, de piek is eveneens veel hoger dan voor epimethendiol en 17-

epimethandiënon. 6β-hydroxymethandiënon kan in een zelfde mate teruggevonden worden in

de vrije fractie. 6β-hydroxymethandiënon wordt immers ongeconjugeerd uitgescheiden in de

urine [16]. Methandiënon zelf wordt wel in een grotere hoeveelheid in de totale fractie

teruggevonden, dit steroïd wordt immers wel geconjugeerd geëxcreteerd. 17-epimethandiënon

wordt net zoals 6β-hydroxymethandiënon ongecojugeerd uitgescheiden. Dit is eveneens af te

leiden uit de grafieken, 17-epimethandiënon wordt immers ook in grote mate teruggevonden

in de vrije fractie, dit in tegenstelling tot methandiënon en epimethendiol die wel

geconjugeerd worden [5;16]. In Figuur 14 is te zien dat epimethendiol geen zo’n hoge

maximale concentratie bereikt. Het houdt wel langere tijd dezelfde relatieve piekoppervlakte

aan. Epimethendiol komt dan ook overeen met een metaboliet die lange detectie van de

inname van methandiënon mogelijk maakt [5].

M3 wordt enkele gedetecteerd in de vrije fractie, maar dit slechts in vrij geringe abundantie,

waardoor het geen echt geschikte metaboliet is voor het opsporen van misbruik van

methandiënon. M4 wordt voornamelijk in de totale fractie gedetecteerd en is dus een

hoofdzakelijk geconjugeerde metaboliet van methandiënon. De maximale concentratie van

M4 wordt reeds na 9 u bereikt en de relatieve piekoppervlakte is na 12 u al sterk afgenomen.

M7 wordt enkel in de totale fractie gedetecteerd, maar met een kleinere abundantie dan M4.

De concentratie aan M7 bereikt na 1 u zijn maximum en daalt hierna ook vlug terug en houdt

dan van 6 u tot 12 u een zelfde concentratie aan.

V3 wordt enkel in de vrije fractie gedetecteerd en bereikt na 1 u al zijn maximum en wordt

slechts gedurende de eerste 12 u gedetecteerd. V3 is bijgevolg een kortetermijn-metaboliet

van methandiënon. V4 wordt hoofdzakelijk teruggevonden in de totale fractie en steekt in

beperkte hoeveelheid in de vrije fractie. In tegenstelling tot de totale fractie waar de

concentratie aan V4 na 6 uur reeds afneemt, blijft de concentratie in de vrije fractie echter wel

verder stijgen. Dit duidt op verschillen in fase II metabolisme volgens post-administratietijd.

V8 wordt uitsluitend in de vrije fractie gedetecteerd en bereikt na 12 u zijn hoogste

concentratie. V12 heeft in de totale fractie de hoogste relatieve piekoppervlakte en bereikt zijn

maximale waarde na 9u. V16 wordt alleen in de totale fractie gedetecteerd met een minimale

relatieve abundantie. Hieruit kunnen we afleiden dat de metabolieten M4, V4 en V12

voornamelijk geconjugeerde metabolieten van methandiënon zijn. M7 en V16 worden

uitsluitend geconjugeerd geëxcreteerd. Terwijl de metabolieten M3, V3 en V8 uitsluitend in

de vrije fractie gedetecteerd worden en dus als ongecojugeerde metabolieten worden

uitgescheiden.

4.2 MRM methode toegepast op de excretie-urines vanaf 30 u

Uit Figuur 24 blijkt dat epimethendiol inderdaad als een langetermijn-metaboliet van

methandiënon kan beschouwd worden, aangezien deze metaboliet het langst gedetecteerd kan

worden. De detectietijd van alle andere metabolieten is veel korter. M4 kan eveneens

gedurende een relatief lange periode gedetecteerd worden, alhoewel de abundantie van M4 na

12 u al terug sterk daalde. M7 wordt eveneens gedurende een lange periode gedetecteerd. In

de excretie-urines tot en met 12 u was te zien dat na 1 u reeds de maximale concentratie aan

M7 in de urine bereikt werd. Het uitscheidingspatroon op het einde van de excretieperiode

van 30 tot 240 u na de inname van methandiënon vertoont wel een pulsatief karakter. V12 is

ook over een relatief lange periode te detecteren en vertoont eveneens een aantal terugkerende

pieken. Dezelfde resultaten worden gezien in de vrije fractie en de totale fractie.

M3 en V3 worden niet meer gedetecteerd in de excretie-urines na 30 u van de inname van

methandiënon en zullen dus als kortetermijn-metabolieten kunnen beschouwd worden. V8

kan na 30 u niet meer gedetecteerd worden en dit zowel in de vrije als in de totale fractie. De

excretie van V16 in de urine vertoont na meer dan de 12 u na inname van methandiënon een

vlugge afname.

4.3 Vergelijken van de MRM en SIM methode

Bij het vergelijken van beide methodes wordt duidelijk dat de MRM methode een langere

detectie van de metabolieten toelaat. In beide methodes blijkt epimethendiol de meest

geschikte metaboliet te zijn om misbruik van methandiënon op te sporen. IN deze studie kon

er aangetoond worden dat epimethendiol zelfs 2 dagen langer detecteerbaar is met de

opgestelde MRM methode dan met de SIM methode (120 u versus 72 u).

Bij de ‘nieuwe’ metabolieten van methandiënon blijkt M7 het langste detecteerbaar in de

totale fractie en V12 in de vrije fractie. Uit de resultaten voor deze metabolieten blijkt

eveneens dat de MRM methode de langste detectietijden toelaat. Beide metabolieten zijn

echter niet zo lang detecteerbaar als epimethendiol.

De structuren van de metabolieten V12 en M7 zijn echter nog niet volledig opgehelderd. V12

heeft een moleculair ion van 445 na derivatisatie met MSTFA. Dit komt niet overeen met één

van de reeds gekende metabolieten van methandiënon, cfr. Tabel 3. Het massaspectrum bevat

wel het ion met m/z 206 wat wijst op een gederivatiseerd steroïd met een 1,4-dien-3-on

structuur [8]. Een ion met een m/z van 143 wordt echter niet teruggevonden in het

massaspectrum.

M7 komt niet overeen met een eerder gevonden metaboliet van methandiënon, cfr. Tabel 3 en

heeft een M+ van 550, na derivatisatie. Een ion met een m/z van 143, dat karakteristiek is voor

17-gemethyleerde steroïden zoals methandiënon, wordt hier eveneens niet teruggevonden [8].

Het is wel zo dat de ionen met een m/z van 117 en 147 teruggevonden worden en dit zou

karakteristiek zijn voor 17-methyl-16,17-bis(trimethylsiloxy)steroïden [22].

Daarnaast is het ook zo dat met MRM methode een vroegere detectie van het misbruik kan

bereikt worden. In het geval van 6β-hydroxymethandiënon in de totale fractie is er een

verschil van bijna een halve dag waar te nemen. Er is immers na 1 u al een detectie mogelijk

met behulp van de MRM methode, waar dit met de SIM methode pas na 12 u is.


Met de MRM methode kan er een LOQ bereikt worden van 5 ng/ml voor 17-epimethandiënon

en 6β-hydroxymethandiënon. Voor epimethendiol en methandiënon wordt er een LOQ

gehaald van 10 ng/ml.

De SIM methode bereikt voor geen enkele van de referentiestandaarden een LOQ van 5

ng/ml. Een LOQ van 10 ng/ml wordt wel gehaald voor 17-epimethandiënon, methandiënon en

6β-hydroxymethandiënon. Voor epimethendiol wordt er slechts een LOQ van 15 ng/ml

bereikt. Door het toepassen van de MRM methode kan er dus een betere LOQ gehaald

worden voor 17-epimetandiënon, 6β-hydroxymethandiënon en epimethendiol in vergelijking

met de SIM methode. Voor methandiënon zelf, blijkt de LOQ gelijk voor de MRM en de SIM

methode. De lagere detectielimiet die kan gehaald worden, verklaart dan ook waarom aan de

hand van de MRM methode een vroegere en langere detectie mogelijk is.

5. Algemeen besluit

Een methode werd ontwikkeld voor de detectie van methandiënon, 6β-hydroxymethandiënon,

17-epimethandiënon, epimethendiol, en 8 ‘nieuwe’ metabolieten van methandiënon (M3, M4,

M7, V3, V4, V8, V12 en V16).

Voor alle steroïden bleek de MRM methode de beste detectielimiet en de langste

detetectietijden toe te laten in vergelijking met de SIM methode. De opgestelde MRM

methode werd gevalideerd en haalde een LOQ van 5 ng/ml voor 17-epimethandiënon en 6β-

hydroxymethandiënon. Voor epimethendiol en methandiënon wordt er een LOQ bereikt van

10 ng/ml.

Gebruik van de triple quadrupool massaspectrometer brengt dus zeker voordelen met zich

mee om het misbruik van methandiënon langer opspoorbaar te maken. Verder onderzoek zal

nog nodig zijn om de geschiktheid van deze eventuele metabolieten nog uitgebreider te

bestuderen en hun structuur te gaan bepalen. De metabolieten M7 en V12 dienen zeker verder

gekarakteriseerd te worden als potentiële langetermijn-metabolieten van methandiënon. Het

gebruik van de triple quadrupool massaspectrometer gekoppeld aan een gaschromatrograaf

zou eveneens gebruikt kunnen worden om de detectie van andere steroïden te verbeteren.

6. Referenties

1. World AntiDoping Agency (WADA). Laboratory statistics , http://www.wada-

ama.org/Documents/Science_Medicine/AntiDoping_Laboratories/Lab_Statistics/WADA_2009_Labora

toryStatisticsReport_Final.pdf (21/12/2010).

2. World AntiDoping Agency (WADA). The 2011 Prohibited List, http://www.wada-

ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-Prohibited-

list/To_be_effective/WADA_Prohibited_List_2011_EN.pdf (21/03/2011).

3. www.wada-ama.org

4. Kickman AT, Gower DB (2003). Anabolic steroids in sport: biochemical, clinical and analytical

perspectives. Annals of clinical biochemistry 40: 321-356.

5. Schänzer W (1996). Metabolism of anabolic androgenic steroids. Clinical chemistry 42: 1001-1020.

6. www.wikipedia.org

7. Pozo OJ, Lootens L, Van Eenoo P, Deventer K, Meuleman P, Leroux-Roels G, Parr MK, Schänzer W,

Delbeke FT (2009). Combination of liquid-chromatography tandem mass spectrometry in different scan

modes with human and chimeric mouse urine for the study of steroid metabolism. Drug testing and

analysis 1:554-567.

8. Thevis M, Schänzer W (2007). Mass spectrometry in sports drug testing: structure characterization and

analytical assays. Mass spectrometry reviews 26: 79-107.

9. Lipschitz C, Baars B, Van den Berg J, Janssen H-G, Maaskant J, Schoenmakers P, Tijsen R, Vonk N

(1996). Gaschromatografie. Den Haag: Ten Hagen en Stam

10. Lipschitz C, Baars B, Van Den Berg J, Janssen H-G, Schoenmakers P, Tijsser P, Vonk N (1997).

Gaschromatorgrafie. Den Haag: Ten Hagen en Stam.

11. http://chemwiki.ucdavis.edu/xApproaches/ChemCases/Silicones_1._Silicate_Structures/Silicones_5._O

rganic_Silicones_at_General_Electric

12. http://chemwiki.ucdavis.edu/Wikitexts/UCD_Chem_115_Lab_Manual/Lab_7%3A_Electrospray_Mass

_Spectrometry

13. http://www.chromatography-online.org/GC-Tandem/Quadrapole-Mass-Spectrometer/MS-MS/rs39.html

14. Pieters I, De Logi E, Vandenkerckhove B, Van Eenoo P, Plum J, Verhofstede C (2009). Cursus goede

laboratorium praktijk, hoofdstuk 10 : 51-69.

15. World AntiDoping Agency (WADA). Technical document TD2010MRPL, http://www.wada-

ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-IS-

Laboratories/WADA_TD2010MRPLv1.0_Minimum%20Required%20Performance%20Levels_Sept%

2001%202010_EN.pdf (21/12/2010)

16. Schänzer W, Geyer H, Horning S (1998). Long-term determination of methandienone and mestanolone.

Recent advances in doping analysis 5: 13-26.

17. Fragkaki AG, Angelis YS, Tsantili-Kakoulidou A, Koupparis M, Georgakopoulos C (2009). Schemes

of metabolic patterns of anabolic androgenic steroids for the estimation of metabolites of designer

steroids in human urine. Journal of steroid biochemistry and molecular biology 15: 44-61.

18. Lootens L, Meuleman P, Pozo OJ, Van Eenoo P, Leroux-Roels G, Delbeke FT (2009). uPA +/+

- SCID

mouse with humanized liver as a model for in vivo metabolism of exogenous steroids: methandienone

as a case study. Clinical Chemistry 55:1783-1793.

19. Schänzer W, Delahaut P, Geyer H, Machnik M, Horning S (1996). Long-term detetection and

identification of methandienone and stanozolol abuse in athletes by gas chromatography-high-resolution

mass spectrometry. Journal of chromatography B Biomedical applications 687: 93-108.

20. Agilent Technologies (2009). Agilent Triple Quadrupole GC/MS techniques and operation (Student

manual). Course number R1718A Volume 1.

21. Kiousi P, Angelis YS, Lyris E, Koupparis M, Calokerinos AC, Atta-Politou J, Georgakopoulos CG

(2009). Two-step silylation procedure for the unified analysis of 190 doping control substances in

human urine samples by GC-MS. Bio-analysis 1: 1-11.

22. McKinney AR, Ridley DD, Suann CJ (2001). Metabolism of methandrostenolone in the horse: a gas

chromatographic-mass spectrometric investigation of phase I and phase II metabolism. Journal of

chromatography B Biomedical applications 765: 71-79.

23. Parr MK, Fußhöller G, Gütschow M, Hess C, Schänzer (2010). GC-MS(/MS) investigations on long-

term metabolites of 17-methyl steroids. Recent advances in doping analysis (18): 64-73

http://www.wada-ama.org/Documents/Science_Medicine/AntiDoping_Laboratories/Lab_Statistics/WADA_2009_LaboratoryStatisticsReport_Final.pdf



http://www.wikipedia.org/

http://chemwiki.ucdavis.edu/Wikitexts/UCD_Chem_115_Lab_Manual/Lab_7%3A_Electrospray_Mass_Spectrometry

http://chemwiki.ucdavis.edu/Wikitexts/UCD_Chem_115_Lab_Manual/Lab_7%3A_Electrospray_Mass_Spectrometry

http://www.chromatography-online.org/GC-Tandem/Quadrapole-Mass-Spectrometer/MS-MS/rs39.html

http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-IS-Laboratories/WADA_TD2010MRPLv1.0_Minimum%20Required%20Performance%20Levels_Sept%2001%202010_EN.pdf




Lore GELDOF - Ghent University€¦ · weefselbestanddelen (anabolisme). Deze anabole eigenschappen...

Documents

Transcript of Lore GELDOF - Ghent University€¦ · weefselbestanddelen (anabolisme). Deze anabole eigenschappen...