GENERATIE VAN TUMOR SPECIFIEKE T-CELLEN

FACULTEIT GENEESKUNDE EN

GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Academiejaar 2008 - 2009

GENERATIE VAN TUMOR SPECIFIEKE T-CELLEN

Willem STAELS

Promotor: Prof. Dr. Bart Vandekerckhove

Scriptie voorgedragen in de 2de Proef in het kader van de opleiding tot

ARTS

“De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander

gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met

betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van

resultaten uit deze scriptie.”

Datum

(handtekening student (en)) (handtekening promotor)

(Naam student) (Naam promotor)

Ik wil graag een woord van dank richten aan:

Prof. Dr. Vandekerckhove, voor de geboden mogelijkheid, voor het enthousiasme en de

vriendelijkheid.

Stefanie Van Coppernole, voor de begeleiding, de uitleg, de tips, de vele verbeteringen van

mijn voorlopige versies, voor het geven van moed en opbouwende kritiek.

Imke Velghe, Frank Timmermans, Tessa Kerre en alle andere vriendelijke mensen op het

labo.

Mijn ouders, aan wie ik meer te danken heb dan aan wie ook.

Liesbeth Micholt, die een deel van mezelf geworden is.

Niké Vanderpoorten, steun en toeverlaat, vriendin voor het leven.

De jongens van Meerbeke en Jan-Willem vanzelfsprekend ook.

Mijn vrienden en familie.

Dankjewel!

Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen i

Inhoudstafel

ABSTRACT........................................................................................................................................................... 1

INLEIDING........................................................................................................................................................... 2

1. T-CEL ONTWIKKELING BIJ DE MENS ........................................................................................................... 2

1.1. De specificiteit van een T-cel wordt bepaald door zijn TCR........................................................... 2

1.2. T-cel ontwikkeling bij de mens ........................................................................................................ 3

2. T-CEL ONTWIKKELING: IN VITRO EN IN VIVO STUDIEMODELLEN................................................................ 5

2.1. Het SCID-hu Thy/Liv injectie muismodel........................................................................................ 6

2.2. SCID-hu Thy/Liv hanging drop model ............................................................................................ 6

2.3. Het OP9-DL1 cultuursysteem ......................................................................................................... 7

3. HET IMMUUNSTELSEL, TUMOREN EN IMMUNOTHERAPIE ........................................................................... 7

3.1. Het immuunstelsel en tumoren ........................................................................................................ 7

3.2. Immunotherapie .............................................................................................................................. 9

4. PROJECTBESCHRIJVING EN KADER ........................................................................................................... 11

4.1. Kader............................................................................................................................................. 11

4.2. Doelstelling ................................................................................................................................... 11

4.3. Bijdrage van de verschillende betrokkenen................................................................................... 12

METHODOLOGIE ............................................................................................................................................ 14

1. GENEREREN VAN MELANA SPECIFIEKE T-CELLEN .................................................................................. 14

1.1. Constructie van retrovirale vectoren ............................................................................................ 14

1.2. Transductie van HSC .................................................................................................................... 16

2. SCID-HU THY/LIV INJECTIE MODEL ........................................................................................................ 16

2.1. Maken van het studiemodel ........................................................................................................... 16

2.2. Verzamelen van geproduceerde cellen.......................................................................................... 16

3. SCID-HU THY/LIV HANGING DROP MODEL.............................................................................................. 17

4. FLOWCYTOMETRISCHE ANALYSE ............................................................................................................ 17

4.1. Monoklonale antilichamen en tetrameren..................................................................................... 17

4.2. Buffers, labeling en flowcytometers .............................................................................................. 18

5. NEGATIEVE ISOLATIE MET BEHULP VAN MAGNETISCHE BEADS............................................................... 18

6. BUFFY COATS EN MONONUCLEAIRE CELLEN............................................................................................ 19

7. CMV KLOON ........................................................................................................................................... 19

8. CELAANTALLEN BEPALEN VIA EEN BÜRKER TELKAMER.......................................................................... 20

RESULTATEN ................................................................................................................................................... 21

1. GENEREREN VAN MELANA SPECIFIEKE T-CELLEN .................................................................................. 21

1.1. Constructie van retrovirale vectoren ............................................................................................ 22

2. VOORBEREIDING ANALYSE GEGENEREERDE T-CELLEN ........................................................................... 23

2.1. Optimalisatie van tetrameerkleuring door bepalen van ideale buffer voor kleuring .................... 23

Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen ii

2.2. Testen van de tetrameerkleuring op T-cel klonen ......................................................................... 26

3. ANALYSE VAN GEGENEREERDE T-CELLEN .............................................................................................. 26

3.1. SCID-hu Thy/Liv injectie model .................................................................................................... 26

3.2. SCID-hu hanging drop model ....................................................................................................... 35

DISCUSSIE ......................................................................................................................................................... 38

1. RESULTATEN VAN HET ONDERZOEK ........................................................................................................ 38

2. RISICO’S VAN GETRANSDUCEERDE T-CELLEN ......................................................................................... 40

3. VOORUITZICHTEN EN IMMUNOTHERAPIE IN BREDER PERSPECTIEF........................................................... 41

REFERENTIELIJST.......................................................................................................................................... 44

Staels Willem Generatie tumorspecifieke T-cellen 1

Abstract

Immunotherapie kent in huidig toegepaste vormen slechts matig klinisch succes. Een

verklaring ligt mogelijks in de negatieve selectie van autologe hoog-affiene tumorspecifieke

T-cellen in de thymus. Om de correctheid van deze hypothese te toetsen en om oplossingen

voor de hiermee gepaard gaande therapeutische moeilijkheden te vinden, werden voor deze

thesis studiemodellen gecreëerd om tumorspecifieke T-cellen te genereren. Om de T-cel

specificiteit te richten werden hematopoiëtische stamcellen (HSC) getransduceerd met de

genen coderend voor de TCRα en TCRβ keten van een antigeenspecifieke T-cel receptor

(TCR) via retrovirale vectoren. Cytomegalovirus (CMV), HA2 en MelanA specifieke TCR

werden gebruikt in de experimenten. Om getransduceerde HSC te laten uitrijpen tot T-cellen

werden ze ingebracht in SCID-hu Thy/Liv injectie modellen en SCID-hu Thy/Liv hanging

drop modellen met verschillende HLA achtergronden om positieve en negatieve selectie te

bestuderen. De transductiestatus van de verkregen T-cellen werd geanalyseerd via

flowcytometrie. Vervolgens werd de specificiteit van de T-cellen uit de experimenten met

efficiënte transductie flowcytometrisch geanalyseerd met behulp van tetrameerkleuringen. Uit

onze resultaten bleken onverwachte hindernissen in de productie van antigeenspecifieke T-

cellen. T-cellen getransduceerd met de TCRβ keten van een antigeenspecifieke TCR bleken in

onze modellen deze TCRβ keten maar in de helft van de gevallen te gebruiken voor de

assemblage van hun TCR. Cellen die zowel met de TCRα als de TCRβ keten van een

antigeenspecifieke TCR getransduceerd waren, bleken niet steeds deze antigeenspecificiteit te

bezitten. In 4 van de 34 muizen uit het SCID-hu Thy/Liv model was transductie erg geslaagd.

Op deze muizen werden tetrameerkleuringen gedaan om de specificiteit van de genereerde T-

cellen na te gaan. Dit leverde gemiddeld 14,68% tetrameer positieve, dus antigeenspecifieke,

T-cellen op binnen de TCRαβ getransduceerde cellen. Deze successen wijzen op het

potentieel van de techniek, maar de overstap naar het therapeutisch gebruik van de

gegenereerde tumorspecifieke T-cellen is nog niet voor de nabije toekomst gezien de vrij

inefficiënte productie.


Inleiding

1. T-cel ontwikkeling bij de mens

Het menselijk lichaam wordt voortdurend blootgesteld aan micro-organismen. Ons lichaam

beschikt over een aantal verdedigingsmechanismen om infecties door die micro-organismen

te voorkomen en tegen te gaan. Het eerste verdedigingsmechanisme is de barrière gevormd

door de mechanische, chemische en microbiële eigenschappen van huid en slijmvliezen. Het

tweede verdedigingsmechanisme wordt gevormd door het immuunsysteem. Binnen het

immuunsysteem kan een onderscheid gemaakt worden tussen een aangeboren (aspecifieke) en

een verworven (specifieke) component. De aangeboren immuniteit vormt de frontlinie tegen

pathogenen die erin geslaagd zijn door huid of slijmvliezen heen te dringen. Zij heeft de

eigenschap snel te kunnen ageren, maar herkent enkel frequent voorkomende pathogenen en

dit op een aspecifieke manier. De verworven immuniteit daarentegen wordt gekenmerkt door

een trage, maar specifieke immuunrespons. Bovendien wordt er een geheugen gevormd,

waardoor bij een tweede contact met eenzelfde pathogeen de immuunrespons sneller optreedt.

De hoofdrolspelers binnen de verworven immuniteit zijn de B- en de T-cellen. Het feit dat

deze een uiterst specifiek antwoord kunnen geven op quasi elke vreemde entiteit is een

kenmerk dat wordt toegeschreven aan hun antigeenreceptoren, respectievelijk de

immunoglobulines en de T-cel receptoren (TCR). Naast haar rol in de afweer tegen

pathogenen speelt de verworven immuniteit ook een rol bij het herkennen en opruimen van

‘afwijkende’ cellen (viraal geïnfecteerd, allogeen, tumoraal) (Janeway et al., 2005). T-cellen

spelen in het bijzonder een belangrijke rol in het herkennen en bestrijden van tumoren. Het is

op dit aspect van de immunologie dat deze thesis zich focust.

1.1. De specificiteit van een T-cel wordt bepaald door zijn TCR

Een T-cel kan antigenen slechts herkennen wanneer deze op een celoppervlak gepresenteerd

worden in de vorm van een MHC : peptide complex. De major histocompatibility complex

(MHC) moleculen zijn glycoproteïnen gespecialiseerd in het presenteren van

lichaamsvreemde of lichaamseigen peptiden op het celoppervlak. Iedere TCR heeft een

specificiteit die bepaald wordt door de combinatie van een antigen (peptide) en een MHC

type. De enorme diversiteit aan specificiteit die gegenereerd kan worden binnen het TCR

repertoire, ontstaat door een ingenieus systeem van genherschikking. Er zijn 4 TCR loci met 4

gelijknamige polypeptide producten (α, β, γ en δ) die 2 types heterodimeren (α:β en γ:δ)


kunnen vormen. Elke TCR locus heeft V (variable), J (joining) en C (constant) segmenten en

de β en δ locus hebben ook D (diversity) segmenten. Specifieke V, D (bij β en δ) en J

segmenten worden samengevoegd tijdens het herschikkingsproces en vormen zo een volledig

V-coderend domein met een nabijgelegen C domein. Bovendien zorgt de willekeurige additie

van nucleotiden tussen de V, D en J segmenten (N region addition) voor extra diversiteit.

Voor de αβ TCR zijn zo’n 10^15 combinaties mogelijk, voor de γδ TCR zo’n 10^18 (Davis

and Bjorkman, 1988).

1.2. T-cel ontwikkeling bij de mens

T-cellen ontstaan, net zoals alle cellulaire elementen van het bloed, uit hematopoiëtische

stamcellen (HSC) (Blom and Spits, 2006). De self-renewal van HSC en de differentiatie in

erythroïde, myelomonocytaire en B-lymfoïde cellijnen wordt gedreven door stromale cellen

in het beenmerg. Deze zijn echter niet in staat om T-cel differentiatie te ondersteunen

(Spangrude et al., 1988). Vanuit het beenmerg migreren CD34+ HSC naar de thymus. In de

thymus herschikken deze hun TCR genen en worden ze CD1+ en CD4+, dit is het stadium

van de CD4+ immature single-positive (CD4ISP) cellen. In dit stadium hebben ze nog de

mogelijkheid te differentiëren tot αβ T-cellen of γδ T-cellen. De volgende stap is de

opregulatie van één van de twee CD8 ketens, namelijk CD8α, de cellen worden early double

positive (EDP). Nadien gaan ze ook CD8β opreguleren en worden ze double positive (DP).

Cellen die er in slagen eerst TCRγδ te herschikken zullen verder differentiëren tot γδ T-cellen.

Cellen die eerst TCRβ kunnen herschikken ondergaan β-selectie, d.w.z. dat de cellen die een

TCRβ keten hebben die kan associëren met een pre-TCRα (pTα) keten uitgeselecteerd worden

voor verdere differentiatie tot αβ T-cellen. Ze krijgen een signaal om TCRβ, TCRγ en TCRδ

genherschikking te stoppen, gaan sterk prolifereren en na proliferatie gaan ze TCRα

herschikken. Volgens Spits (2002) begint β-selectie reeds in het CD4ISP stadium en loopt het

door tot in het DP stadium en is het als dusdanig niet absoluut geassocieerd met CD4 of CD8

expressie. Na succesvolle TCRα herschikking, associeert de TCRα keten met de TCRβ keten

en ondergaan de cellen positieve selectie. Cellen die in staat zijn te interageren met self-

peptides gepresenteerd in een MHC op thymus epitheel cellen (TEC) zullen verder

differentiëren tot CD4+ single positive cellen (CD4SP) of CD8+ single positive cellen

(CD8SP). Indien deze interactie niet lukt gaan ze verder met herschikkingen op de TCRα

locus, heeft dit niet tijdig een functionele TCR tot gevolg dan zullen de cellen sterven. Tot in

dit stadium speelt het proces zich af in de cortex van de thymus. Vanaf het CD4SP, CD8SP

stadium zullen de cellen migreren naar de medulla. Hier zullen cellen die met een hoge


affiniteit binden op self-peptide : MHC complexen negatief geselecteerd worden. Deze laatste

interactie speelt zich vermoedelijk af op antigen presenterende cellen (APC) in de thymus, al

is hier discussie over (Spits, 2002). Uiteindelijk komen de T-cellen in de periferie waar ze

geactiveerd kunnen worden na het herkennen van een peptide : MHC complex op

professionele APC. Professionele APC verzamelen antigenen in beschadigde weefsels. Deze

eiwitten worden d.m.v. proteasomen afgebroken tot korte peptiden die gepresenteerd worden

in MHC moleculen. Deze worden dan herkend door CD4SP T-helpercellen (indien

gepresenteerd op MHC klasse II) of cytotoxische CD8SP T-cellen (indien gepresenteerd op

MHC klasse I). De APC migreren naar de dichtstbijzijnde lymfeklier en presenteren daar de

peptide : MHC complexen in combinatie met de juiste alarmsignalen aan de T-cel. Pas als een

T-cel ‘zijn’ antigeen herkent in combinatie met de juiste alarmsignalen wordt ze geactiveerd

(Janeway et al., 2005). Grofweg zijn 2 types reactie mogelijk: CD8SP cytotoxische T-cellen

zullen de ‘afwijkende’ cel na herkenning doden, CD4SP T-helpercellen zullen stoffen

uitscheiden die de immuunrespons van andere onderdelen van het immuunstelsel aansturen

(Janeway et al., 2005) (figuur 1).

De meeste informatie over de hematopoiëse bij de mens is afkomstig uit in vitro studies

(Blom and Spits, 2006).


Figuur 1. T-cel ontwikkeling bij de mens. Zelfhernieuwende HSC zitten in het beenmerg. Deze stamcellen

differentiëren tot precursoren, waarvan enkelen migreren naar de thymus. Daar genereren deze naast NK cellen

en γδ T-cellen voornamelijk αβ T-cellen. De αβ T-cellen worden gegenereerd vanuit immature cellen die hun

TCRβ genen herschikken, β-selectie ondergaan, TCRα herschikken, positieve en negatieve selectie ondergaan en

uiteindelijk differentiëren tot mature thymocyten. Deze thymocyten verlaten de thymus als naïeve T-cellen en

gaan naar de periferie. HSC = hematopoiëtische stamcellen, PP = pluripotente precursor, MP = myeloïde

precursor, CLP = common lymphoid progenitor, NK = natural killer cell, B = B-cel, T/NK = T-cel/NK-cel

precursor, preT = T-cel precursor, ISP4+ = immature single positive CD4+ cell, EDP = early double positive

cell, DP = double positive CD4+CD8+ cell, SP4+ = mature single positive CD4+ cell, SP8+ = mature single

positive CD8+ cell, γδ = γδ T-cel (figuur gebaseerd op Plum, 2000).

2. T-cel ontwikkeling: in vitro en in vivo studiemodellen

Er zijn een aantal experimentele modellen beschreven voor het in vitro en in vivo genereren

van mature humane T-cellen uitgaande van hematopoiëtische precursorcellen afkomstig uit

foetale lever, navelstrengbloed, kinderthymus of beenmerg. Drie gebruikte modellen worden

besproken: het Severe Combined Immune Deficiency-human fetal Thymus / fetal Liver (SCID-

hu Thy/Liv) injectie muismodel, het SCID-hu hanging drop model en het OP9-Delta Ligand 1

(DL1) cultuursysteem.


2.1. Het SCID-hu Thy/Liv injectie muismodel

De Severe Combined Immune Deficiency-human (SCID-hu) muis is geconstrueerd als

preklinisch in vivo model voor de analyse van humane fysiologie en pathofysiologie (McCune

et al., 1988). Het SCID-hu fetal Thymus / fetal Liver (Thy/Liv) injectie model reproduceert de

differentiatie en functie van humane hematopoiëtische precursorcellen in de humane thymus.

Bij deze in vivo benadering worden kleine fragmenten van humane foetale lever en humane

foetale thymus samen geïmplanteerd onder het nierkapsel van een SCID muis. De zware

immuundeficiëntie van deze SCID muis zorgt ervoor dat een dergelijke greffe niet wordt

afgestoten. De HSC die aanwezig zijn in het foetale leverfragmentje gaan migreren naar het

foetale thymusfragmentje en na 8 weken aanleiding geven tot de uitgroei van een humaan

thymusorgaantje. Dit orgaantje vormt een gespecialiseerde micro-omgeving om humane T-cel

differentiatie te bestuderen (McCune, 1996 ; Namikawa et al., 1990). De muizen kunnen in dit

stadium bestraald worden om de aanwezige HSC uit te schakelen en zo plaats te maken voor

HSC van e.g. een ander haplotype, of in het geval van deze thesis met HSC die

getransduceerd zijn met een bepaald gen (e.g. een TCR keten), waarvan men T-cel

ontwikkeling wil bestuderen (Verhasselt et al., 1999).

2.2. SCID-hu Thy/Liv hanging drop model

Het SCID-hu Thy/Liv hanging drop model is een nieuw model ontwikkeld om

getransduceerde HSC te laten uitrijpen tot T-cellen. In essentie is het model een adaptatie van

het Fetal Thymus Organ Culture (FTOC) model. Het FTOC model is het oudste in vitro

studiemodel voor T-cel differentiatie (Kingston et al., 1985 ; Jenkinson et al., 1982). Het is

ontwikkeld vanuit de idee dat voor T-cel maturatie de driedimensionale structuur van het

thymusweefsel onontbeerlijk was (Kingston et al., 1985). In ons gemodificeerd model werden

humane foetale lever CD34+ cellen getransduceerd met de genen coderend voor een TCR.

Deze cellen werden in hanging drop gebracht met humane foetale thymus. Een hanging drop

cultuur of ‘hangende druppel cultuur’ is een cultuur waarin het te kweken materiaal

geïnoculeerd wordt in een druppel vocht die hangt aan een omgedraaide holte. De humane

foetale thymi werden geïncubeerd met de getransduceerde humane foetale lever CD34+

cellen in een hanging drop cultuur en de hieruit verkregen orgaantjes werden dan

getransplanteerd onder het nierkapsel van een SCID muis. Het voordeel van dit model t.o.v.

het SCID-hu Thy/Liv injectie model is de belangrijke tijdswinst die het oplevert.


2.3. Het OP9-DL1 cultuursysteem

In de zoektocht naar essentiële moleculaire interacties in de generatie van T-cellen werden de

Notch receptor en zijn liganden ontdekt. Er is een belangrijke rol voor Notch aangetoond in

verschillende stadia van T-cel ontwikkeling (Maillard et al., 2005). Notch receptor stimulatie

in precursorcellen met zowel B-cel als T-cel potentieel leidt tot het induceren van T-cel

differentiatie en het inhiberen van B-cel differentiatie.

De OP9 stromale cellijn is afkomstig van het beenmerg van macrophage colony stimulating

factor (M-CSF) - deficiënte osteopetrosis muizen (op/op). Na transductie van deze cellijn met

het Notch ligand Delta-like 1 (DL1), krijgt de cellijn de capaciteit volledige T-cel

differentiatie te ondersteunen en verliest ze de capaciteit B-cel differentiatie te ondersteunen

(Schmitt and Zúñiga-Pflücker, 2002 ; Schmitt and Zúñiga-Pflücker, 2006).

3. Het immuunstelsel, tumoren en immunotherapie

3.1. Het immuunstelsel en tumoren

Naast haar rol in de afweer tegen micro-organismen speelt de verworven immuniteit en vooral

het T-cel compartiment ook een rol bij het herkennen en opruimen van ‘afwijkende’ cellen

zoals tumorcellen. T-cellen kunnen hiervoor 2 types antigenen herkennen: tumor-specific

antigens (moleculen uniek voor tumorcellen) of tumor-associated antigens (moleculen die

zowel op tumorcellen als op niet-levensnoodszakelijke ‘normale’ cellen tot expressie komen

en moleculen die discrepant met het ontwikkelingsstadium van de patiënt tot expressie komen

op tumorcellen). Wanneer het immuunstelsel in contact komt met een tumor zijn 3 uitkomsten

mogelijk: eliminatie van de tumor, evenwichtssituatie met de tumor of tumor escape (de groei

van tumorvarianten die immunologische destructie weerstaan of systemische / lokale

onderdrukking van de immuniteit door de tumor) (Finn, 2008 ; Janeway et al., 2005).

De rol van het immuunstelsel in de controle over tumoren wordt duidelijk aan de hand van

volgende bevindingen :

- Enerzijds zijn gevallen van spontane tumorregressie beschreven bij

immuuncompetente patiënten. Anderzijds wordt een toegenomen incidentie van

tumoren gevonden bij immuungecompromiteerde patiënten (Blattman and Greenberg,

2004). De voornaamste tumoren die we in de immuungecompromiteerde populatie


zien, zijn non-Hodgkin lymfomen bij HIV geïnfecteerde patiënten, bij transplantatie

patiënten en bij mensen met primaire immuundeficiënties; Kaposi sarcoma bij HIV

geïnfecteerde patiënten en non-melanoma huidkanker bij transplantatie patiënten

(Mueller, 1999).

- Tumor-immuniteit kan worden aangetoond in proefdiermodellen. Muizen met

bepaalde immuunstoornissen vertonen een toegenomen vatbaarheid voor spontane en

geïnduceerde tumoren, terwijl veel van deze tumoren worden afgestoten wanneer ze

getransplanteerd worden naar immuuncompetente muizen (Shankaran et al., 2001 ;

Dunn et al., 2004).

- Een accumulatie van immuuncellen op de tumor site is geassocieerd met een betere

prognose (Zhang et al., 2003). Met weefsel microarrays is aangetoond dat een hoge

densiteit van CD8+ effector memory T-cellen in het tumorparenchym geassocieerd is

met een betere overleving (Pages et al., 2005).

- Bij meer dan 300 patiënten met hepatocellulair carcinoom is aangetoond dat de

ziektevrije en algemene overleving beter is bij tumoren met een lager aantal regulator

T-cellen (Gao et al., 2007). Regulator T-cellen zijn een subset van CD4+ T-cellen die

de ontwikkeling van een specifieke immuunrespons tegen self-antigens, in het

bijzonder self-tumor-antigens, tegenwerken via de secretie van immunosuppressieve

cytokines als IL-10 of via directe inhibitie van APC (Zou, 2006).

De rol van het immuunstelsel in de controle over tumoren werd bevestigd door de

therapeutische successen van behandelingen die het immuunstelsel betrekken in hun

werkingsmechanisme:

- In patiënten met relaps van hematologische maligniteiten na allogene

stamceltransplantatie zijn donor lymfocyt infusies standaardtherapie geworden,

resulterend in duurzame en volledige remissie bij vele patiënten (Dazzi et al., 2000 ;

Lokhorst et al., 2000).

- Stamceltransplantatie zonder dat de T-cellen verwijderd zijn uit de stamcelpopulatie

geeft soms een betere prognose, ondanks een hogere kans op Graft-versus-Host

Disease (Asai et al., 1998).

De ultieme bevestiging van de rol van het immuunstelsel in de controle over tumoren

werd gegeven door het succes van verschillende vormen van immunotherapie.


3.2. Immunotherapie

Immunotherapie bij kanker tracht gebruik te maken van de uitzonderlijke kracht en

specificiteit van het immuunstelsel voor de behandeling van maligniteiten. Er zijn reeds vele

tumor antigenen beschreven en het is dus belangrijk om een aantal criteria voorop te stellen

waaraan tumor antigenen moeten voldoen vooraleer zij als doel voor klinisch onderzoek

kunnen gebruikt worden. Algemeen kunnen de interessante peptiden geïdentificeerd worden

via hun capaciteit tumorspecifieke T-cellen in vitro te expanderen (Finn, 2008).

Als eerste criterium moet een immuunrespons tegen het tumor antigen een tumordodende

capaciteit hebben zonder normale, levensnoodzakelijke cellen aan te vallen. Het tweede

criterium betreft de status van het antigen in de tumor en de vatbaarheid ervan voor mutatie en

dus tumor escape. Derde criterium, een brede toepasbaarheid van de therapie gericht op het

antigen d.w.z. dat meerdere tumoren van een bepaald type of verschillende types tumoren

doelwit kunnen zijn van dezelfde therapie (Finn, 2008).

Er zijn verschillende strategieën beschreven binnen de immunotherapie. Men maakt een

onderscheid tussen passieve en actieve immunotherapie. Bij passieve immunotherapie worden

de effectorantilichamen / effectorcellen zelf geïnjecteerd in de patiënt. De opties hierbij zijn

het toedienen van monoklonale antilichamen gericht tegen tumor antigenen (e.g. Trastuzumab

voor de therapie van HER2+ mammacarcinoom, Retuximab bij B-cel lymfoom) en het

toedienen van in vitro gekweekte of geëxpandeerde autologe T-cellen. Treffende toepassingen

van dit laatste zijn beschreven in fase 1 studies door Yee et al. (2002) en Mackensen et al.

(2006). Yee et al. (2002) slaagden erin bij 8 op 10 patiënten met metastatisch melanoom een

regressie van de metastasen te bekomen na injectie met CD8SP T-cellen specifiek voor de

melanoma antigenen MelanA en glycoproteïne100. Deze antigeenspecifieke CD8SP T-cellen

werden bekomen door perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) te verzamelen uit iedere

patiënt. Via stimulatie met MelanA of glycoproteïne100 beladen dendritische cellen werden

binnen de PBMC selectief de antigeenspecifieke T-cellen geëxpandeerd. De klonen die

specifieke lyse toonden werden geselecteerd, geëxpandeerd en gebruikt voor de studie.

Mackensen et al. (2006) toonden binnen een populatie van 11 melanoma patiënten 1 volledige

en 1 partiële regressie na therapie met MelanA specifieke T-cellen. Deze cellen werden

verkregen door in vitro stimulatie van CD8SP perifeer bloed lymfocyten met autologe

dendritische cellen waarop een HLA-A2 bindend MelanA peptide werd aangeboden. Ex vivo-


geëxpandeerde melanoominfiltrerende lymfocyten die samen met IL-2 werden toegediend na

cytoreductieve therapie leidden tot klinische respons in tot 50% van de geëvalueerde patiënten

(Dudley et al., 2002 ; Robbins et al., 2004). De meest recente toepassing is het transduceren

van autologe perifeer bloed T-cellen met een MelanA-specifieke TCR afkomstig uit sterk

reactieve tumor infiltrating lymfocyten. Morgan et al. (2006) bereikten hiermee regressie van

lever en longhilus metastasen bij 2 op 16 patiënten met gemetastaseerd melanoom. Deze twee

patiënten waren 2 jaar later ziekte-vrij (Rosenberg et al., 2008). Recent zijn TCR met een veel

hogere affiniteit geïdentificeerd en deze worden momenteel geëvalueerd in klinische trials

(Rosenberg et al., 2008).

De resultaten van deze studies zijn echter beperkt en de kosten en moeite die met

gepersonaliseerde cellulaire therapie gepaard gaan kunnen gezondheidseconomisch

onverantwoord lijken. Hierbij een belangrijke kanttekening : dit zijn fase 1 studies, bij

patiënten met progressieve, therapieresistente ziekte. Onder deze ongunstige omstandigheden

zijn zelfs marginale resultaten belangrijk (Finn, 2008).

Naast de passieve immunotherapie is er ook actieve immunotherapie. Hierbij stimuleert men

het immuunsysteem van de patiënt in zijn reactie tegen de tumor d.m.v. kankervaccins

(Gattinoni et al., 2006). De meest gebruikte technieken zijn: vaccins met peptiden afkomstig

van tumor antigenen, vaccins met dendritische cellen gepulseerd met tumor antigenen,

vaccins met autologe tumorcellen en tumorlysaat, vaccins met allogene tumorcellen en

tumorlysaat, vaccins met genetisch gemodificeerde tumorcellen en vaccins met heat shock

proteins (Disis et al., 2009). Het nadeel van passieve immunotherapie is dat tumorspecifieke

cellen reeds aanwezig moeten zijn in de patiënt voor de aanvang van de therapie. Als er geen

cellen zijn om te stimuleren, kan deze therapie niet lukken.

Tot slot is er de integratie van immunotherapie in huidige standaardtherapieën. Dit is, in het

bijzonder voor de kankervaccins (actieve immunotherapie), een uitdaging omwille van de

immunosuppressieve effecten van de meeste standaardtherapieën (Finn, 2008).


4. Projectbeschrijving en kader

4.1. Kader

Dit project kadert binnen onderzoek naar het verder ontrafelen van de humane T-cel

ontwikkeling en het gebruiken van verworven en bestaande inzichten voor klinische

toepassingen. Het laboratorium onder leiding van Prof. Dr. J. Plum van het Departement voor

Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie van het Universitair Ziekenhuis Gent

heeft mij de mogelijkheid geboden een bijdrage te leveren aan hun ononderbroken zoektocht

naar verheldering van de fysiologie en pathofysiologie van het immuunsysteem en de

toepassing hiervan in medische hulpverlening.

4.2. Doelstelling

Prof. Dr. B. Vandekerckhove heeft mij binnen eigen onderzoek een project aangeboden

waarin ik kennis kon maken met diverse laboratoriumtechnieken en dat als doel had het

genereren van hoog-affiene tumorspecifieke T-cellen vanuit HSC.

De doelstelling van dit onderzoek is een verklaring vinden voor het beperkte succes van

immunotherapie in huidig bestaande toepassingsvormen. Naast het door Finn (2008)

aangehaalde probleem dat studies enkel gebeuren bij patiënten met progressieve,

therapieresistente ziekte willen we zoeken naar bijkomende verklaringen. Het is mogelijk dat

de aanwezigheid van tumor antigenen in de thymus via negatieve selectie zorgt voor de

deletie van T-cellen met een hoge affiniteit voor deze tumorantigenen en dat hierdoor de

reactiviteit tegen deze antigenen zo zwak is. Daarom is het belangrijk dat we de ontwikkeling

van tumorspecifieke T-cellen nader gaan bestuderen en met deze kennis verder op zoek gaan

naar nieuwe en betere vormen van immunotherapie.

De antigeenspecificiteit van T-cellen wordt louter bepaald door de TCR. T-cel specificiteit

kan gericht worden door HSC te transduceren met de genen coderend voor de TCRα en TCRβ

ketens van een TCR met gekende specificiteit (Kessels, 2001). De genen coderend voor de

TCR ketens van een MelanA, een HA2 en een Cytomegalovirus (CMV) specifieke TCR

werden aangewend om antigeenspecifieke T-cellen te genereren. Deze genen werden via

retrovirale vectoren getransduceerd in humane foetale lever CD34+ cellen, deze kunnen

beschouwd worden als HSC. Na transductie werden de HSC overgebracht in twee

studiemodellen: het SCID-hu Thy/Liv injectie model en het SCID-hu Thy/Liv hanging drop


model. In toekomstig onderzoek wordt gepland ook het OP9-DL1 cultuursysteem te

gebruiken. Deze systemen laten toe dat HSC uitgroeien tot T-cellen (De Smedt et al., 2004).

In de twee eerstgenoemde studiemodellen konden de HSC uitgroeien tot T-cellen waarvan op

verschillende tijdstippen de transductiestatus bepaald werd. In geval van geslaagde

transductie werd de specificiteit voor het antigen doelwit van de geïntroduceerde TCR

bepaald m.b.v. tetrameerkleuringen. Vier verschillende celgroepen konden per experiment

bestudeerd worden: de TCRα only, de TCRβ only, de TCRαβ getransduceerde cellen en de

niet-getransduceerde cellen. De TCRαβ getransduceerde T-cellen, die verwacht werden de

complete MelanA of CMV specifieke TCR tot expressie te brengen, zouden een vaste

affiniteit moeten hebben voor het betreffend antigen (Hughes et al., 2005). Bij de TCRα only

en TCRβ only getransduceerde T-cel precursoren verwachten we endogene herschikking van

de complementaire TCR keten met als gevolg een spectrum van TCR met variërende

specificiteit en affiniteit (Zehn and Bevan, 2006). De doelstelling was op deze wijze een beter

inzicht te krijgen in de bijdrage van de TCRα en TCRβ keten aan de specificiteit en affiniteit

van de TCR. Verwacht werd dat de TCRαβ getransduceerde cellen de grootste fractie

antigeenspecifieke T-cellen zouden bevatten, gevolgd door de TCRα only getransduceerde

cellen. Dietrich et al. (2003) gaven namelijk evidentie voor de dominantie van de TCRα keten

in de herkenning van het MelanA : HLA-A2 complex. Om de specificiteit van

getransduceerde T-cellen optimaal te kunnen beoordelen was de bepaling van een geschikte

labelingsbuffer voor tetrameerkleuringen noodzakelijk alsook de bepaling van de

werkzaamheid van de tetrameerkleuringen t.o.v. een negatieve controle. Onverwachte

hindernissen werden ontmoet waarmee dankzij dit onderzoek rekening gehouden kan worden

in verdere pogingen tot de generatie van tumorspecifieke T-cellen.

Dit project kan gezien worden als een zijtraject binnen het doctoraat ‘Manipulatie van het

MelanA/MART-1 specifieke T-cel repertoire in experimentele systemen van T-cel

differentiatie’ van Ph.D. studente S. Van Coppernole (afgestudeerd in de Biomedische

Wetenschappen).

4.3. Bijdrage van de verschillende betrokkenen

In het onderzoek zijn S. Van Coppernole en ikzelf er in geslaagd de TCRα en TCRβ keten

van een MelanA specifieke TCR (ons ter beschikking gesteld door T. Schumacher, NKI,

Amsterdam) over te brengen in 2 LZRS vectoren.


De TCRα en TCRβ keten van een HA2 en een CMV specifieke TCR (ons ter beschikking

gesteld door M. Heemskerk, Universiteit Leiden) zijn door S. Van Coppernole ingebracht in

HSC en deze zijn door haar overgebracht in een SCID-hu Thy/Liv injectie model en in een

SCID-hu hanging drop model. In deze modellen zijn de HSC uitgegroeid tot T-cellen. Het

verzamelen van de cellen en de analyse van transductiestatus en specificiteit is een gedeeld

werk geweest van S. Van Coppernole, I. Velghe en mezelf. De eruit verkregen resultaten heb

ik verzameld in deze thesis.

Voor optimaal gebruik van de tetrameerkleuring werd afgegaan op een bestaand protocol ter

beschikking gesteld door P. Coulie (Université catholique de Louvain) en mijn analyse naar

de meest geschikte buffer voor de tetrameerkleuringen.


Methodologie

1. Genereren van MelanA specifieke T-cellen

1.1. Constructie van retrovirale vectoren

Uitgangspositie was een MelanA specifieke TCR waarvan de TCRα en de TCRβ keten onder

het merkergen enhanced green fluorescent protein (eGFP) in een pmXs vector zaten. De

sequenties van de MelanA-specifieke TCR ketens werden gekloneerd in een LZRS vector

tussen Not1 en BamH1 restrictie-enzym knipplaatsen. De TCRα keten werd onder het

merkergen enhanced green fluorescent protein (eGFP) gebracht, de TCRβ keten onder Nerve

Growth Factor Receptor (NGFR). Hiervoor werd per keten 2µg LZRS vector overnacht

geknipt bij 37°C met Not1 en BamH1 restrictie-enzymen (New England Biolabs) en 2µg

pmXs vector (overnacht, bij 37°C) met dezelfde restrictie-enzymen. De enzymactiviteit werd

gestopt door 15min incubatie bij 65°C. De digesten werden op een 1% Agarose MP gel (BD

Biosciences) gelaten en een elektrisch veld van 150V en 100mA werd aangelegd. Na 30min

werden de fragmenten die we nodig hadden met behulp van gel-extractie (Qiaquick gel

extraction kit, Qiagen) geïsoleerd. De concentratie nucleïnezuur werd bepaald met een

spectrofotometer (Nanodrop, Thermo Fisher Scientific). De geknipte vectoren werden

gedefosforyleerd door 250ng vector samen met 5µl Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)

gedurende 15 – 30min te incuberen achtereenvolgens bij 37°C, 65°C en 4°C. Tot slot werd

het insert in de vector ingebouwd door insert en vector in een verhouding van 3:1 samen te

incuberen gedurende 30min bij 16°C. Op deze wijze werd een LZRS vector bekomen die de

TCRα keten bevat onder het merkergen eGFP en een LZRS vector die de TCRβ keten bevat

onder NGFR. Voor elk werd een negatieve controle (insert-vector verhouding 0:1)

meegenomen, een LZRS vector met het merkergen eGFP zonder TCR en een LZRS vector

met NGFR zonder TCR keten (figuur 2).


De verkregen vectoren werden vervolgens geamplificeerd door competente Escherichia coli

DH5α bacteriën met de vectoren te transformeren en de bacteriën overnacht bij 37°C te laten

groeien eerst in vloeibaar LB medium bouillon, nadien op LB-Amp (0,1% ampicilline) platen.

De LZRS vector bevatte een resistentiegen voor ampicilline en op deze wijze konden

getransformeerde cellen uitgeselecteerd worden. De gevormde kolonies op de LB-Amp platen

werden geteld en opgezuiverd, eerst via Miniprep, vervolgens via Maxiprep (NucleoBond

plasmid purification, Macherey-Nagel). De plasmide opbrengst werd bepaald met UV

spectrofotometrie en de plasmide integriteit werd bevestigd met agarose gel-elektroforese.

Om de lengte van de verkregen ligatiebandjes te bepalen werd een 1kb DNA ladder

(GeneRuler 1kb DNA ladder, Fermentas) gebruikt.

Figuur 2. Constructie van retrovirale vectoren. Vertrekkende van 2 pmXs vectoren, de AIG en de BIG

vector, werden de TCRα en TCRβ keten van een MelanA specifieke TCR vanuit deze vectoren

overgebracht naar LZRS vectoren waar de TCRα en TCRβ keten onder een verschillend merkergen zitten,

respectievelijk eGFP en NGFR, in respectievelijk de LIE en de LIN vector. Hiervoor werd het gensegment

coderend voor de TCR keten geknipt uit de pmXs vectoren en geplakt in de LZRS vectoren tussen de

restrictie-enzym knipplaatsen voor Not1 en BamH1. (AIG = α-IRES-eGFP, BIG = β-IRES-eGFP, LIE =

LZRS-IRES-eGFP, LIN = LZRS-IRES-NGFR, eGFP = enhanced green fluorescent protein, NGFR = nerve

growthfactor receptor, LTR = long terminal repeat, IRES = internal ribosomal entry site, ψ =

verpakkingssignaal)


1.2. Transductie van HSC

Dit deel van het onderzoek werd uitgevoerd door doctoraatstudente S. Van Coppernole. Het

principe van dit onderdeel: de verkregen TCRα en TCRβ bevattende vectoren worden

ingebracht in een retrovirus door middel van de amfotrope verpakkingscellijn Phoenix (Nolan

Lab, Stanford University). De unieke eigenschap van deze cellijn is dat ze gemakkelijk

transfecteerbaar is, o.a. via calciumfosfaat gemedieerde transfectie. Phoenix cellen worden

uitgezaaid op petrischaaltjes, de TCRα en TCRβ bevattende vectoren worden erin gebracht

via calciumfosfaat gemedieerde transfectie en de Phoenix cellijn zal deze vectoren verpakken

met virale verpakkingseiwitten. Het resultaat is een verzameling retrovirussen die de TCRα of

TCRβ keten van een MelanA specifieke TCR bevatten. Deze retrovirussen worden gebruikt

voor stabiele transductie van humane HSC. In het DNA van de HSC bouwen we op deze

manier een deel in coderend voor één of beide TCR ketens van een specifieke TCR. We

hebben gekozen voor dubbele transductie met aparte TCRα en TCRβ bevattende vectoren om

de differentiële uitkomst van celpopulaties die één, geen of beide TCR ketens verkregen te

kunnen bestuderen.

2. SCID-hu Thy/Liv injectie model

2.1. Maken van het studiemodel

Dit deel van het onderzoek werd uitgevoerd door doctoraatstudente S. Van Coppernolle. De

SCID muizen waren afkomstig uit de kweekfaciliteit van het laboratorium voor Immunologie

UZ Gent. Deze muizen werden getransplanteerd met fragmenten van humane foetale thymus

en humane foetale lever onder het linker nierkapsel. Na 8 tot 16 weken werden deze muizen

bestraald met 200Gy door de dienst Radiotherapie UZ Gent, in bijzondere samenwerking met

Dr. T. Boterberg. De muizen werden vervolgens geïnjecteerd met humane HSC afkomstig

van foetale lever. De dieren werden behandeld volgens de richtlijnen van de Ethische

Commissie Dierproeven van het UZ Gent.

2.2. Verzamelen van geproduceerde cellen

Het verzamelen van de in het Thy/Liv orgaantje geproduceerde cellen is een gedeelde taak

geweest van S. Van Coppernole, I. Velghe en mezelf. De vroegste analyses zijn gebeurd 27

dagen na injectie van de HSC, de laatste analyses 97 dagen na injectie. Op de dag van analyse

werden de muizen gedood door cervicale dislocatie. Het Thy/Liv orgaantje werd opgezocht


onder het kapsel van de linker nier en vrij gedissecteerd. Het orgaantje werd in een

petrischaaltje met 2ml Tris-buffer geplaatst. Vervolgens werd het orgaantje en de 2ml Tris

buffer overgebracht in een proefbuis waarin het orgaantje met behulp van een pletter

mechanisch werd beschadigd. De inhoud van de proefbuis, inclusief de restanten van het

orgaantje, werden via een 70µm filter overgebracht in een tweede proefbuis. Het orgaantje,

tegengehouden door de filter, werd teruggebracht in de eerste proefbuis. In die eerste

proefbuis werd opnieuw 2ml Tris buffer gedaan, het orgaantje werd opnieuw mechanische

beschadigd en de inhoud werd opnieuw via de 70µm filter overgebracht in de tweede

proefbuis. De verkregen celsuspensie in de tweede proefbuis werd bewaard bij 4°C (op ijs).

3. SCID-hu Thy/Liv hanging drop model

Getransduceerde humane foetale lever CD34+ cellen werden geïncubeerd met humane foetale

thymus lobi in een hanging drop cultuur. De hieruit verkregen orgaantjes werden

getransplanteerd onder het nierkapsel van SCID muizen. Zowel het maken van het

studiemodel als de flowcytometrische analyse van de eruit verkregen cellen zijn gedaan door

S. Van Coppernole.

4. Flowcytometrische analyse

4.1. Monoklonale antilichamen en tetrameren

De volgende muis-anti-humane monoklonale antilichamen (Mab) werden gebruikt: CD1a,

CD3, CD4, CD7, CD8, CD34, CD45, TCRαβ en TCRγδ (BD Biosciences), Vβ2, Vβ5, Vβ7,

Vβ8, Vβ12, Vβ13, Vβ17 en Vβ22 (Beckman Coulter), HLA-A2 (American Type Culture

Collection). Deze waren gelabeld met pacific blue (PB), fluoresceïne isothyocyanaat (FITC),

phycoërythrine (PE), phycoërythrine-cy 7 (PE-Cy7), allophycocyanine-cy 7 (APC-Cy7) of

allophycocyanine (APC). Anders gelabelde anti-humane Mab waren: HLA-ABC biotine (BD

Biosciences), Nerve Growth Factor Receptor (NGFR) biotine (Myltenyi Biotech). Deze

bevatten geen fluorochroom, maar kunnen in een tweede stap gevisualiseerd worden met

streptavidine (SA) PerCP-Cy55 of SA APC-Cy7 (eBioscience).

De volgende tetrameren werden gebruikt: CMV tetrameer PE en HA2 tetrameer PE (ons ter

beschikking gesteld door M. Heemskerk, Universiteit Leiden), MelanA tetrameer PE gericht

tegen het ELAGIGILTV peptide HLA-A2 gerestricteerd en EBV BHLF1.A*0201 APC


tetrameer gericht tegen het peptide GLCTLVAHL (ons ter beschikking gesteld door P.

Coulie, Université catholique de Louvain).

4.2. Buffers, labeling en flowcytometers

De buffers gebruikt om de stalen te labelen waren: Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)

(Lonza) 1% Foetaal Kalf Serum (FKS), Phosphate Buffered Saline (PBS) (Lonza) 1% FKS en

klassieke labelingsbuffer van het labo (PBS, 1% Bovine Serum Albumine, 0.1% NaN3, 275-

285 mOsm, pH 7.2 - 7.3).

Klassieke labeling gebeurde door toevoeging van Mab (benodigd volume afhankelijk van het

merk, de concentratie en het type, zie individuele verpakkingen) aan een celsuspensie en

incubatie gedurende 30min, op ijs, in het donker. Tetrameerkleuringen gebeurden in het

donker bij 37°C, gedurende 15min. Bij tweestapslabelingen werden de cellen tussen de 2

stappen 2 maal gewassen (centrifugeren aan 1500rpm op zelfde temperatuur als kleuring)

doorgaans met PBS 1% FKS (behalve in ‘Optimalisatie van tetrameerkleuring door bepalen

van ideale buffer voor kleuring (2.1)’ waar de 3 verschillende te testen buffers gebruikt

werden). Labeling werd steeds afgesloten door de celsuspensie te wassen met de voor het

experiment gebruikte buffer en door het supernatans af te gieten.

Cellen werden geanalyseerd met een BD FACSCalibur flowcytometer (BD Immunocytometry

Systems) of met een BD LSR II flowcytometer (BD Immunocytometry Systems) afhankelijk

van het aantal gebruikte fluorescente labels. Dode cellen werden uitgeselecteerd d.m.v.

propidium iodide exclusie (PI) (Life Technologies).

5. Negatieve isolatie met behulp van magnetische beads

Magnetische beads op schaap-anti-muis Mab (Dynal Biotech) werden gebruikt om

celsuspensies aan te rijken voor cellen die niet gebonden werden door muis Mab. De negatief

te selecteren cellen werden gemerkt via de klassieke labelingsmethode met Mab beschreven

in ‘Buffers, labeling en flowcytometers (4.2)’. Vervolgens werden schaap-anti-muis Mab

gelabeld met magnetische beads toegevoegd. Na 30min incubatie op ijs werd het geheel

gedurende 1min in een magneet geplaatst. De cellen die niet door de Mab gebonden werden,

dus niet gelabeld werden met magnetische beads en dus niet aan de magneet kleefden, werden

met een pasteurpipet overgebracht naar een nieuwe proefbuis. De initiële proefbuis werd uit

de magneet gehaald, nogmaals gespoeld met de respectievelijke buffer, teruggeplaatst in de


magneet voor 1min en de niet-gebonden cellen werden opnieuw afgenomen en overgebracht.

Op deze indirecte manier werd een aanrijking bekomen van de cellen die niet gebonden waren

met de gebruikte Mab.

6. Buffy coats en mononucleaire cellen

Het bloedtransfusie centrum, Rode Kruis Vlaanderen, Gent stelde buffy coats te beschikking

voor het onderzoek. De buffy coat is de witte bloedcellen en bloedplaatjes bevattende fractie

van geanticoaguleerd bloed. Na centrifugatie bevindt deze fractie zich tussen de rode

bloedcellen en het plasma. Uit de buffy coats werd de mononucleaire fractie (monocyten en

lymfocyten) geïsoleerd via Lymfoprep (Axis-Shield) scheiding op basis van het

densiteitsgradiënt. Buffy coat eenheden werden 1 over 5 verdund in PBS, waarna ze verdeeld

werden aan 30ml per 50ml buis. Bij iedere 50ml buis werd 15ml Lymfoprep onder het bloed

gebracht. De buizen werden gecentrifugeerd (2310rpm, 15min, 22°C), waarna de

mononucleaire celfractie opgevangen werd met een pasteurpipet (figuur 3).

7. CMV kloon

Deze cellijn bestaat uit T-cellen die een CMV specifieke TCR tot expressie brengen. Ze werd

gebruikt als positieve controle in de CMV tetrameerkleuringen. De kloon werd ter

beschikking gesteld door M. Heemskerk (Universiteit Leiden).

Figuur 3. Scheiding van bloed-

componenten op basis van densiteit met

behulp van Lymfoprep. Onder de Buffy

coat (vnl. monocyten en bloedplaatjes)

wordt Lymfoprep gebracht. Het geheel

wordt gecentrifugeerd aan 2310rpm,

gedurende 15min bij 22°C. De bekomen

densiteitfracties kunnen op het zicht van

elkaar worden gescheiden. Met een

pasteurpipet kan de fractie monocyten en

lymfocyten uit het geheel gehaald

worden.


8. Celaantallen bepalen via een Bürker telkamer

Om celaantallen te bepalen werden 10µl celsuspensie en 10µl tripaan blauw (Life

Technologies) gemengd. De suspensie werd op de Bürker telkamer aangebracht en 25 hokjes

werden geteld. Het totale celaantal kon dan bepaald worden doordat 25 hokjes overeenkomen

met een volume van 5x10-8l. Via een eenvoudige formule kon het totaal aantal cellen

berekend worden (figuur 4). Tripaan blauw is erg geschikt om het onderscheid tussen levende

en dode cellen te zien. De getelde niet-gekleurde cellen zijn de levende cellen.

totaal celaantal (cellen/ml) = geteld aantal (in 25 hokjes) x 2 (verdunningsfactor) x 104 x totaal volume (ml)

Figuur 4. Formule voor het berekenen van het totaal aantal cellen in een oplossing met behulp van een Bürker

telkamer en tripaan blauw.

Een alternatieve methode is tellen met TÜRK (Merck), de verhouding is dan 10µl

celsuspensie en 90µl TÜRK. Hier geldt een andere formule om het totaal celaantal te

berekenen (figuur 5). TÜRK lyseert de rode bloedcellen en is dus zeer geschikt om specifiek

de mononucleaire cellen te tellen.

totaal celaantal (cellen/ml) = geteld aantal (in 25 hokjes) x 10 (verdunningsfactor) x 104 x totaal volume (ml)

Figuur 5. Formule voor het berekenen van het totaal aantal cellen in een oplossing met behulp van een Bürker

telkamer en TÜRK.


Resultaten

1. Genereren van MelanA specifieke T-cellen

Het proces kon worden onderverdeeld in 4 stappen. We zijn vertrokken vanuit een situatie

waarin de genen coderend voor de TCRα en de TCRβ keten van een antigeenspecifieke TCR

in twee afzonderlijke pmXs vectoren (plasmiden) zaten. Deze plasmiden transfecteerden we

na amplificatie in Escherichia coli DHα naar de amfotrope verpakkingscellijn Phoenix. Deze

verpakkingscellijn heeft retrovirussen geproduceerd waarin de coderende sequentie van één

van de TCR ketens zat. Met de verkregen virussen hebben we HSC afkomstig uit foetale lever

besmet en op deze wijze werden de TCR keten genen ingebouwd in het DNA van de HSC. Er

ontstonden 4 groepen HSC: niet-getransduceerde, TCRα only getransduceerde, TCRβ only

getransduceerde en TCRαβ getransduceerde. De finale stap was het laten uitdifferentiëren van

de HSC tot T-cellen in een studiemodel. Hiervoor zijn zowel het SCID-hu Thy/Liv injectie

model als het SCID-hu hanging drop model gebruikt. De getransduceerde T-cellen brachten

een TCR tot expressie die één of beide TCR ketens van de tumorspecifieke TCR kon dragen.

De specificiteit van de TCR van de verkregen T-cellen werd ten slotte nagegaan d.m.v.

flowcytometrische analyse met tetrameerkleuring (figuur 6).

Figuur 6. Genereren van tumorspecifieke T-cellen. Het proces kon worden onderverdeeld in 4 stappen. De

genen coderend voor de TCRα en de TCRβ keten van een antigeenspecifieke TCR zaten in twee

afzonderlijke plasmiden. Deze plasmiden hebben we getransfecteerd naar een verpakkingscellijn, deze heeft

retrovirussen geproduceerd waarin de coderende sequentie van één van de TCR ketens zat. Met de

verkregen virussen hebben we HSC besmet en op deze wijze werden de TCR keten genen ingebouwd in het

DNA van de HSC. De finale stap was het laten uitdifferentiëren van de HSC tot T-cellen in een

studiemodel.


1.1. Constructie van retrovirale vectoren

De TCRα en TCRβ ketens van een MelanA specifieke TCR werden overgebracht vanuit 2

pmXs vectoren, beide met eGFP als merkergen, naar respectievelijk de LZRS-IRES-eGFP

(LIE) en de LZRS-IRES-NGFR (LIN) vectoren volgens het protocol beschreven in

methodologie ‘Constructie van retrovirale vectoren (1.1)’. Zo kwam de TCRα keten onder het

merkergen eGFP (LIE+TCRα) en de TCRβ keten onder het merkergen NGFR (LIN+TCRβ)

terecht (figuur 2). De vectoren werden geamplificeerd in Escherichia coli DH5α. Het slagen

van het kloneringsproces werd geëvalueerd door de vectoren te knippen met de restrictie-

enzymen Not1 en BamH1 en vervolgens het verknippingsproduct te evalueren m.b.v. gel-

elektroforese. De gel-elektroforese toonde inderdaad zowel voor de LIE+TCRα als voor de

LIN+TCRβ ligatiebandjes aan van de verwachte lengte (de TCRα keten was 800bp, de TCRβ

keten 900bp) en dus konden we besluiten dat de klonering geslaagd was en de vectoren

gebruikt konden worden voor virusproductie (figuur 7).

Deze nieuw geconstrueerde vectoren boden het voordeel dat na transductie het onderscheid

gemaakt kon worden tussen de TCRα only, de TCRβ only en de TCRαβ getransduceerde

cellen doordat beide TCR ketens onder een verschillend merkergen gebracht waren. Het

merkergen eGFP van de TCRα keten fluoresceerde in het FITC kanaal bij flowcytometrische

analyse, NGFR van de TCRβ keten kon via een biotine-streptavidine tweestapslabeling

gevisualiseerd worden in een kanaal naar keuze.

250

500

750

1000

1500

2000

10000

bp

250

500

750

1000

1500

2000

10000

bp

Figuur 7. Gel-elektroforese na

verknipping van de LIE+TCRα en

LIN+TCRβ ligatieproducten. Het eerste en

het tiende laantje bevatten een 1kb DNA

ladder. Het derde laantje bevatte

LIN+TCRβ, het vierde LIE+TCRα. Het

zevende en achtste laantje waren de

respectievelijke negatieve controles.

Andere laantjes waren niet relevant voor

deze thesis. In laantje 3 en 4 waren twee

stukken te onderscheiden waarvan het

onderste (kortste) de TCR keten was.


2. Voorbereiding analyse gegenereerde T-cellen

2.1. Optimalisatie van tetrameerkleuring door bepalen van ideale

buffer voor kleuring

In een klassieke kleuring worden met fluorochroom gelabelde Mab toegevoegd aan een

celsuspensie. Klassieke Mab kleuringen kunnen echter niet gebruikt worden om de

antigeenspecificiteit van T-cellen aan te tonen. De meest directe manier om

antigeenspecifieke T-cellen aan te tonen is m.b.v. tetrameerkleuringen. Een tetrameerkleuring

bestaat uit 4 peptide : MHC complexen die centraal verbonden zijn met een streptavidine

molecule via biotine. T-cellen met een TCR die bindt op een specifiek peptide : MHC

complex zullen zo via flowcytometrische analyse gevisualiseerd kunnen worden. Het

structureel verschil van de tetrameerkleuring met de Mab brengt fysicochemische verschillen

mee en protocollen voor kleuring met Mab kunnen niet blind overgenomen worden. Het labo

van P. Coulie (Université catholique de Louvain), dat ons het MelanA tetrameer PE en het

EBV BHLF1.A*0201 APC tetrameer ter beschikking gesteld heeft, gebruikt volgende

condities voor haar tetrameerkleuringen: 15min bij kamertemperatuur in HCF 1% FKS. Deze

buffer was echter niet beschikbaar op ons labo en vandaar dat we op zoek gegaan zijn naar

een alternatief. Drie verschillende buffers zijn getest: een HBSS 1% FKS, een PBS 1% FKS

en wasbuffer (WB) 1% FKS wat de klassieke labelingsbuffer is die gebruikt wordt op het labo

voor de Mab kleuringen.

In de 3 verschillende buffers werden PBMC, verkregen na Lymfoprep scheiding (‘Buffy

Coats en mononucleaire cellen (6)’) van buffy coats, gekleurd met CD4 (T-helpercel merker),

CD19 (B-cel merker) en glycophorine A (erythrocyt merker) muis-anti-humaan Mab volgens

het Mab labelingsprotocol beschreven in ‘Buffers, labeling en flowcytometers (4.2)’. Volgens

hetzelfde protocol (4.2) werden vervolgens schaap anti-muis Mab gelabeld met magnetische

beads toegevoegd. Volgens het protocol ‘Negatieve isolatie met behulp van magnetische

beads (5)’ werd een aanrijking voor CD8+ T-cellen, die CD4-, CD19- en glycophorine A-

zijn, bekomen.

In een tweede stap werden de 3 stalen (in de 3 verschillende buffers) gekleurd met MelanA

tetrameer PE en met een controle tetrameer (EBV BHLF1.A*0201 APC) volgens het

tetrameer labelingsprotocol beschreven in ‘Buffers, labeling en flowcytometers (4.2)’ .


In een laatste stap werden de stalen met een muis anti-humaan anti-CD8 Mab gekleurd

volgens het Mab labelingsprotocol (4.2) om de CD8SP en eventuele overblijvende DP T-

cellen te kunnen bestuderen.

Iedere buffy coat werd in een aparte kleuring gecontroleerd op zijn HLA-A2 status via een

labeling met HLA-A2 FITC Mab volgens het Mab labelingsprotocol (4.2). De MelanA

tetrameren presenteren het ELAGIGILTV peptide in de groeve van MHC klasse 1, HLA-A2.

Vandaar dat we enkel tetrameeraankleuring verwachtten bij HLA-A2+ buffy coats.

Dit experiment werd gedaan om eventuele grote verschillen in labeling op te sporen tussen de

3 verschillende buffers. Wanneer één buffer opvallend minder achtergrondkleuring zou geven

met het MelanA tetrameer, dan zou deze verkozen worden. Slechts 2 van de 7 personen waren

HLA-A2+ en konden bijgevolg MelanA specifieke T-cellen hebben in hun T-celpopulatie.

Het uit de literatuur gekende percentage van 0,01% MelanA specifieke T-cellen binnen het

CD8+ T-cel repertoire van HLA-A2+ individuen kon niet aangetoond worden. Steeds werd

een hoger percentage bekomen wat kan wijzen op een aspecifieke aankleuring. Het controle

tetrameer EBV BHLF1.A*0201, HLA-A2 specifiek, werd gebruikt om die aspecifieke

kleuring uit te schakelen. Positieve aankleuring voor beide tetrameren is immers onmogelijk

tenzij ze aspecifiek is. Het hoogste percentage aankleuring voor zowel het MelanA tetrameer

als het controle tetrameer werd steeds gezien in WB 1% FKS. Tussen PBS 1% FKS en HBSS

1% FKS zijn echter geen significante verschillen gezien (figuur 8).

Deze resultaten leren ons dat WB 1% FKS de minst geschikte van de 3 geteste buffers is.

Zowel PBS 1% FKS als HBSS 1% FKS gaven beiden weinig achtergrondkleuring met de

tetrameren. In alle volgende experimenten werd de PBS 1% FKS buffer gebruikt bij

tetrameerkleuringen.


Figuur 8. Tetrameerkleuring op CD8+ aangerijkte perifeer bloed lymfocyten afkomstig van buffy coats in 3

verschillende buffers: HBSS 1% FKS (linker kolom), PBS 1% FKS (middenkolom) en WB 1% FKS (rechter

kolom). De aankleuring met het MelanA tetrameer PE en een irrelevant (controle) EBV tetrameer APC wordt

hier getoond binnen de CD8+ lymfocyten populatie van 3 donoren. Van de 7 geteste stalen zijn hier 3 stalen

weergegeven waaronder de twee HLA-A2+ stalen.

Het MelanA model en de gecreëerde vectoren (zie ‘Constructie van retrovirale vectoren

(1.1)’), die de TCRα en TCRβ keten van de MelanA specifieke TCR bevatten, zullen gebruikt

worden in toekomstig onderzoek op het labo. De verdere analyses die aan bod komen in deze

thesis zijn gebeurt op analoge CMV en HA2 modellen die in de toekomst als positieve

controle zullen dienen voor het MelanA model.


2.2. Testen van de tetrameerkleuring op T-cel klonen

Om na te gaan of de CMV tetrameerkleuring een duidelijk en specifiek signaal geeft, werd de

CMV tetrameerkleuring getest op een CMV specifieke T-cel lijn, een CMV T-cel kloon. De

CMV kloon werd gekleurd met het CMV tetrameer en met een HA2 tetrameer als negatieve

controle volgens het tetrameer labelingsprotocol (4.2). De aankleuring was duidelijk positief

met het CMV tetrameer en negatief met het HA2 tetrameer. Op deze manier werd aangetoond

dat het CMV tetrameer een duidelijke en specifieke binding geeft (figuur 9).

Figuur 9. Tetrameerkleuringen op CMV T-cel kloon. Een CMV T-cel kloon werd gelabeld met respectievelijk

het CMV tetrameer PE (links) en een HA2 tetrameer PE (midden). Rechts wordt het PE signaal weergegeven

wanneer geen PE label toegevoegd werd.

3. Analyse van gegenereerde T-cellen

3.1. SCID-hu Thy/Liv injectie model

3.1.1. Transductiestatus

De geproduceerde T-cellen werden verzameld uit het Thy/Liv orgaantje gegroeid onder het

nierkapsel van SCID-hu muizen. Deze procedure is beschreven in ‘Verzamelen van

geproduceerde cellen (2.2)’. De cellen werden bewaard en getransporteerd op ijs. De kleuring

gebeurde in 4 stappen: (1) NGFR biotine kleuring, (2) Streptavidine APC-Cy7 kleuring (om

biotine gelabelde cellen te visualiseren), (3) CMV tetrameer PE kleuring en tot slot (4)

kleuring voor CD3 (PE-Cy7) en CD8 (APC). Gebruikte protocollen zijn beschreven in

‘Buffers, labeling en flowcytometers (4.2)’.


Het gemiddelde percentage getransduceerde cellen lag het hoogst op 27 dagen na injectie voor

de TCRαβ transductie (1,7%) (figuur 10, A), op 94 dagen na injectie voor de TCRα

transductie (25,8%) (figuur 11, A) en op 53 dagen na injectie voor de TCRβ transductie

(20,35%) (figuur 12, A). Het gemiddelde percentage TCRα getransduceerde cellen op 94

dagen was echter gebaseerd op het gemiddelde van 2 erg uiteenlopende waarden waarvan de

maximale waarde 49% was. Deze uitschietende waarde leek verdacht, het op één na hoogste

gemiddelde percentage werd gemeten op 27 dagen na injectie en kwam met 19,26% in de

buurt van het hoogste gemiddelde percentage (figuur 11, A).

In absolute aantallen lag het gemiddelde voor de TCRαβ transductie (577,5.10^3) het hoogst

op 32 dagen na injectie (figuur 10, B), op 70 dagen na injectie voor de TCRα transductie

(2977.10^3) (figuur 11, B) en op 53 dagen na injectie voor de TCRβ transductie

(6880,5.10^3) (figuur 12, B). De absolute aantallen en de percentages voor de TCRαβ en

TCRβ transductiestatus waren in de tijd erg gelijklopend wat betreft de gemiddelde opbrengst.

Dit gold ook voor de TCRα transductiestatus indien we geen rekening hielden met de

analyses op dag 94, wat te verdedigen viel o.b.v. het grote verschil tussen de twee gemeten

waarden die dag.

Figuur 10. Evolutie van de TCRαβ transductiestatus in de tijd (gemiddelde, 95% betrouwbaarheidsinterval,

minimum en maximum). Procentueel (A), absoluut (B). Acht muizen zijn geanalyseerd geweest op dag 27 post-

injectie, 2 op dag 32, 2 op dag 45, 2 op dag 53, 3 op dag 70, 4 op dag 63, 9 op dag 82, 2 op dag 94 en 2 op dag

95. In totaal zijn 34 muizen geanalyseerd.


Figuur 11. Evolutie van de TCRα transductiestatus in de tijd (gemiddelde, 95% betrouwbaarheidsinterval,




Figuur 12. Evolutie van de TCRβ transductiestatus in de tijd (gemiddelde, 95% betrouwbaarheidsinterval,





Uit bovenstaande gegevens werd duidelijk dat de transductiestatus geen constante was in de

tijd. Dankzij deze data kan de verdere evaluatie van de verschillende getransduceerde

populaties in het SCID-hu Thy/Liv model in de toekomst beter gepland worden in de tijd. Wat

betreft TCRαβ transductie leverden vooral de analyses op 32 dagen en op 70 dagen na injectie

hoge percentages en absolute aantallen op, vanaf 73 dagen waren de percentages en absolute

aantallen TCRαβ getransduceerde cellen erg laag (figuur 10). De TCRα transductie was in

percentages erg hoog op 27, 70 en 94 dagen, in absolute aantallen op 53, 70 en 94 dagen.

Vooral de analyse op 70 dagen was erg overtuigend. De percentages en absolute aantallen

TCRα getransduceerde cellen waren laag op 45, 73, 82 en 95 dagen, wat wil zeggen dat met

uitzondering van de uitschieter op 94 dagen er ook weinig TCRα getransduceerde cellen

gevonden werden vanaf 73 dagen (figuur 11). Voor TCRβ werden de hoogste percentages en

absolute aantallen gezien op 27, 53 en 70 dagen, vooral de analyse op dag 53 leek hier

overtuigend. In de lijn van de resultaten voor TCRαβ en TCRα getransduceerde cellen,

werden vanaf 73 dagen na injectie weinig TCRβ cellen teruggevonden (figuur 12). In totaal

werden 34 muizen uit het SCID-hu Thy/Liv injectie model geanalyseerd, hun individuele

transductiestatus is terug te vinden in ‘Transductiestatus SCID-hu Thy/Liv injectie model

(bijlage 1)’.

De vrij lage waarden vanaf 73 dagen deden vermoeden dat het dan te laat was om naar

getransduceerde cellen te kijken. Analyse zou zich moeten concentreren op de periode die

ervoor ligt, de eerste 70 dagen na transductie. Binnen die 70 dagen is het moeilijk om één

optimaal tijdstip voor zowel TCRαβ, TCRα als TCRβ getransduceerde cellen te vinden,

analyse tussen 53 dagen en 70 dagen na injectie lijkt ideaal.

3.1.2. Nagaan van Vβ13 status

De TCRβ keten van de gebruikte CMV-specifieke TCR bevat een Vβ13 domein. Dit domein

kan gedetecteerd worden m.b.v. een Mab wanneer deze TCRβ keten gebruikt wordt in de

TCR van de getransduceerde T-cellen. Van de NGFR+ en dus TCRβ getransduceerde cellen

werd theoretisch verwacht dat 100% Vβ13+ zou zijn. Verbazend genoeg was dit slechts

52,0% (figuur 13). Ondanks het feit dat de cellen reeds over een volledig herschikte TCRβ

keten beschikten, hebben er zich waarschijnlijk nog endogene TCRβ genherschikkingen

voorgedaan. Uit deze resultaten leren we dat wanneer T-cellen een getransduceerde TCRβ

keten bezitten, dit niet betekent dat ze deze sowieso gebruiken voor de assemblage van hun

TCR.


Figuur 13. Vβ13 labeling in getransduceerde en niet-getransduceerde T-cellen. Cellen werden gelabeld met

NGFR-biotine / SA APC-Cy7, CD3 APC en Vβ13 PE Mab. De linkse figuur toont de gating strategie, de

middenste en rechtse toont Vβ13 aankleuring van respectievelijk NGFR+ en NGFR- cellen. Analyse dag 28

post-injectie.

3.1.3. Nagaan Vβ-repertoire en aanwezigheid van TCRγδ T-cellen.

Om na te gaan welke Vβ domeinen gebruikt werden naast Vβ13 in de TCR van de

geanalyseerde T-cellen werden een aantal extra kleuringen met Mab uitgevoerd. De

aanwezigheid van Vβ2, Vβ5, Vβ7, Vβ8, Vβ12, Vβ17 en Vβ22 werd nagegaan naast Vβ13 en

TCRγδ. Om de resultaten van deze kleuringen te bestuderen, werden de cellen opgesplitst in

een NGFR positieve en een NGFR negatieve populatie. Slechts 0,10% van de NGFR

positieve populatie was TCRγδ+ en slechts 0,50% van de NGFR negatieve populatie. Dit

bewijst dat de bestudeerde cellen (die dezelfde zijn als in ‘Nagaan van Vβ13 status (0)’)

voornamelijk bestonden uit bonafide TCRαβ T-cellen. Er zijn immers T-cellen bekend die op

hun membraan naast TCRαβ ook TCRγδ tot expressie kunnen brengen (Sim et al., 1995). De

NGFR positieve populatie bevat een beduidend hoger percentage Vβ13+ cellen en lagere

percentages van de overige geteste Vβ domeinen in vergelijking met de NGFR negatieve

populatie (Tabel 1). Binnen de NGFR+ cellen kwamen voor de eGFP+ en de eGFP- cellen de

percentages van het gebruik van Vβ domeinen sterk overeen, hetzelfde gold binnen de NGFR-

cellen wanneer opnieuw eGPF- met eGFP+ werd vergeleken (bijlage 2). Deze resultaten leren

ons dat de introductie van een TCRβ keten in T-cellen zorgt voor een lagere prevalentie van

andere TCRβ ketens in die getransduceerde T-cellen vergeleken met niet-getransduceerde T-

cellen.


%

totaal

TCRγδ

(%)

Vβ13

(%)

Vβ2

(%)

Vβ5

(%)

Vβ7

(%)

Vβ8

(%)

Vβ12

(%)

Vβ17

(%)

Vβ22

(%)

NGFR+ 4,05 0,50 43,98 0,15 0,75 1,55 1,30 1,50 2,25 0,35

NGFR- 45,95 0,10 2,50 4,80 1,65 2,20 2,55 2,00 4,45 2,00

Tabel 1. Nagaan Vβ-repertoire en aanwezigheid van TCRγδ T-cellen binnen CMV-specifieke TCR

getransduceerde cellen gegenereerd in een SCID-hu Thy/Liv injectie model (analyse dag 28 post-injectie). De

weergegeven cijfers zijn percentages van het totaal aantal levende lymfocyten, de eerste kolom (%totaal) geeft

aan wat de verhouding NGFR+ en NGFR- cellen is binnen die populatie, de andere kolommen geven aan in

welk percentage van de cellen het onderzochte Vβ domein (of de TCRγδ) teruggevonden werd. De cijfers in de

kolommen %totaal en Vβ13(%) zijn het gemiddelde van 2 metingen (die zeer goed overeenkomen), de cijfers in

de andere kolommen zijn afkomstig uit een eenmalige meting.

3.1.4. De specificiteit van de getransduceerde cellen

De specificiteit van T-cellen werd nagekeken m.b.v. tetrameerkleuringen. Een

tetrameerkleuring bestaat uit 4 peptide : MHC complexen die centraal verbonden zijn met een

streptavidine molecule via biotine. T-cellen met een TCR die bindt op een specifiek peptide :

MHC complex kunnen zo via flowcytometrische analyse gevisualiseerd kunnen worden.

De eerste voorwaarde voor resultaten in dit onderdeel was dat voldoende getransduceerde

cellen aanwezig zijn. Vandaar dat de specificiteit van de getransduceerde cellen niet voor alle

muizen bepaald werd. Op dag 25 post-injectie zijn 3 muizen geanalyseerd waarbij de

transductie erg succesvol was. Op deze 3 muizen zijn dan ook tetrameerkleuringen gedaan

volgens het protocol beschreven in ‘4.2’. In elk van deze muizen was de tetrameerkleuring

positief. Twee van deze muizen waren geïnjecteerd geweest met CMV TCR getransduceerde

HSC, deze muizen hadden binnen hun TCRαβ getransduceerde populatie respectievelijk

31,0% (figuur 14, A) en 11,6% (figuur 14, B) CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen.

Binnen de niet-getransduceerde cellen was in beide muizen 0,0% CMV tetrameer+ (figuur 14,

A en B). Binnen de TCRα getransduceerde cellen zaten respectievelijk 0,6% (figuur 14, A) en

0,9% (figuur 14, B) CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen. De TCRβ getransduceerde

cellen hadden 0,0% CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen. De derde muis, ditmaal een met

HA2 TCR getransduceerde HSC geïnjecteerde, bevatte binnen haar TCRαβ getransduceerde

populatie 4,8% HA2 tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen. In de niet-getransduceerde populatie

was dit slechts 0,1%. Haar TCRα getransduceerde cellen bevatten 0,3% HA2 tetrameer+

CD3+ CD8α+ T-cellen, haar TCRβ getransduceerde cellen 0,1% (figuur 14, C). De TCRαβ


getransduceerde cellen hadden dus steeds het hoogste percentage tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-

cellen. Het percentage was al behoorlijk lager voor de TCRα only getransduceerde cellen en

in de TCRβ only en de niet-getransduceerde T-cellen waren er zo goed als geen tetrameer+

CD3+ CD8α+ T-cellen.

Verwacht werd dat enkel CD8α+ T-cellen tetrameer+ zouden zijn, aangezien de

tetrameerkleuring een zwakke affiniteit heeft in vergelijking met de klassieke Mab kleuringen

en de CD8 co-receptor binding tussen T-cellen en MHC type 1 moleculen versterkt (Janeway,

2005). CD8α- T-cellen kleurden echter ook aan voor de tetrameerkleuring, zij het in mindere

mate dan CD8α+ T-cellen. De ratio tetrameer+ CD8α+ T-cellen over tetrameer+ CD8α- T-

cellen binnen de TCRαβ getransduceerde populatie was gemiddeld 3,1. Hieruit bleek

inderdaad een preferentiële tetrameeraankleuring van de TCRαβ getransduceerde CD3+

CD8α+ T-cellen, zoals theoretisch verwacht werd. In dit experiment kon het fenotype van de

tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen niet verder gespecificeerd worden, de populatie was

CD8SP of DP.


Figuur 14. Transductiestatus en tetrameerkleuring van getransduceerde CD3+ T-cellen bij analyse op dag

25 van 3 muizen (A, B en C). De linker grafiek toont telkens de transductiestatus en de gating strategie, de 4

grafieken er rechts van tonen de aankleuring voor tetrameer (in A en B: CMV tetrameer PE, in C: HA2

tetrameer PE) en de CD8α status van de cellen. Rechtsboven staat de situatie voor de TCRαβ

getransduceerde T-cellen afgebeeld, linksboven voor de TCRα only getransduceerde T-cellen, rechtsonder

voor de TCRβ only getransduceerde T-cellen en linksonder voor de niet-getransduceerde T-cellen.

Gebruikte labels: CD3 PE-Cy7, NGFR-biotine / SA APC-Cy7, CMV tetrameer PE, HA2 tetrameer PE,

CD8a APC. Studiemodel: SCID-hu Thy/Liv injectie.


Op dag 32 na injectie werd opnieuw een muis gevonden die veel CMV TCR getransduceerde

cellen bezat. De verzamelde cellen uit deze muis bevatten 5,3% TCRαβ getransduceerde T-

cellen. Van de TCRαβ getransduceerde T-cellen was 11,9% CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+.

De TCRα getransduceerde T-cellen bevatten 0,8% CMV tetrameer+ CD8α+ T-cellen. De

TCRβ getransduceerde T-cellen bevatten 2,7% CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen en de

niet-getransduceerde T-cellen bevatten 0,0% CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen.

Wanneer gekeken werd naar het ontwikkelingsstadium van de CMV tetrameer+ CD3+

CD8α+ cellen bleek dat de bulk hiervan (97,5% - 100%) zich in het CD4+CD8+ DP stadium

bevond met 0,0% tot 2,5% van de cellen in het CD8SP, mature stadium (figuur 15).

Uit deze resultaten leren we dat niet alle TCRαβ getransduceerde T-cellen antigeenspecifiek

zijn. In onze experimenten was gemiddeld slechts 14,68% van de TCRαβ getransduceerde T-

cellen antigeenspecifiek. TCRα only en TCRβ only getransduceerde T-cellen bezaten zeer

weinig tot geen antigeenspecifieke T-cellen, een toestand vergelijkbaar met niet-

getransduceerde T-cellen. Tetrameerpositieve T-cellen waren meestal CD8α+, maar ook

CD8α- antigeenspecifieke T-cellen werden gevonden, ondanks de zwakke affiniteit van de

tetrameerkleuringen. Het merendeel van de tetrameerpositieve T-cellen was CD4+ CD8+ DP.

De aanwezigheid van enkele CD8SP T-cellen wees op de aanwezigheid van negatieve selectie

in het SCID-hu Thy/Liv injectie model en dus op ondersteuning van volledige T-cel

differentiatie.

Figuur 15. Transductiestatus en gating strategie van getransduceerde CD3+ T-cellen

(A). Tetrameerkleuring van getransduceerde CD3+ T-cellen (B). Fenotype karakterisatie

van tetrameer+ cellen (C). In B en C staat rechtsboven telkens de situatie voor de

TCRαβ getransduceerde T-cellen afgebeeld, rechtsonder voor de TCRα only

getransduceerde T-cellen, linksboven voor de TCRβ only getransduceerde T-cellen en

linksonder voor de niet-getransduceerde T-cellen. Gebruikte labels: CD3 APC-Cy7,

NGFR-biotine / SA PerCP-Cy55, CMV tetrameer PE, CD8a APC, CD4 PE-Cy7.

Studiemodel: SCID-hu Thy/Liv injectie.


3.2. SCID-hu hanging drop model

3.2.1. Transductiestatus

Het verzamelen en kleuren van de in dit model geproduceerde T-cellen werd gedaan door S.

Van Coppernole.

Het gemiddelde percentage getransduceerde cellen lag het hoogst op 35 dagen na injectie voor

de TCRαβ transductie (2,66%) (figuur 16, A), op 35 dagen na transplantatie voor de TCRα

transductie (13,3%) (figuur 17, A) en op 35 dagen na transplantatie voor de TCRβ transductie

(5,46%) (figuur 18, A). In absolute aantallen lag het gemiddelde voor de TCRαβ transductie

(89.10^3) het hoogst op 35 dagen na transplantatie (figuur 16, B), op 64 dagen na

transplantatie voor de TCRα transductie (799,31.10^3) (figuur 17, B) en op 73 dagen na

transplantatie voor de TCRβ transductie (103,62.10^3) (figuur 18, B). Opvallend in

vergelijking met het SCID-hu Thy/Liv injectie model was dat de procentuele TCRβ

transductie het veel lager lag (hoogste gemiddelde 5,46% versus 20,35% in het SCID-hu

Thy/Liv model). De gemiddelde absolute celaantallen gegenereerd met het SCID-hu hanging

drop model lagen veel lager dan bij het SCID-hu Thy/Liv injectie model (hoogste gemiddelde

TCRαβ 6,5 keer lager, TCRα 3,7 keer lager en TCRβ 66,4 keer lager).

Figuur 16. Evolutie van de TCRαβ transductiestatus in de tijd (gemiddelde, 95% betrouwbaarheidsinterval,

minimum en maximum). Procentueel (A), absoluut (B). Vijf muizen zijn geanalyseerd geweest op dag 35 post-

transplantatie, 13 op dag 64, 7 op dag 72 en 6 op dag 73. In totaal zijn 31 muizen geanalyseerd.


Figuur 17. Evolutie van de TCRα transductiestatus in de tijd (gemiddelde, 95% betrouwbaarheidsinterval,



Figuur 18. Evolutie van de TCRβ transductiestatus in de tijd (gemiddelde, 95% betrouwbaarheidsinterval,




Wanneer gekeken wordt naar de gemiddelden van de percentages en absolute aantallen

getransduceerde cellen op een bepaald analysetijdstip zien we dat wat betreft TCRαβ

transductie de analyses op 35 dagen na transplantatie de hoogste percentages en absolute

aantallen opleverden. In het algemeen lagen de percentages en absolute aantallen erg laag

(figuur 16). De TCRα transductie was zowel in percentage als in absolute aantallen hoog op

35 en 64 dagen. De percentages en absolute aantallen TCRα getransduceerde cellen waren

opvallend lager vanaf 65 dagen (figuur 17). Voor TCRβ werden de hoogste percentages

gezien op 35 en 73 dagen, de hoogste absolute aantallen op 64 en 73 dagen. De TCRβ

transductie status was vrij stabiel in de periode 35 tot 73 dagen, maar erg laag (figuur 18). In

totaal werden 31 muizen uit het SCID-hu hanging drop model geanalyseerd, hun individuele

transductiestatus is terug te vinden in ‘Transductiestatus SCID-hu hanging drop model

(bijlage 3)’.

Het SCID-hu hanging drop model leek minder efficiënt in het genereren van getransduceerde

T-cellen dan het SCID-hu Thy/Liv injectie model. Analyse voor 64 dagen post-transplantatie

lijkt optimaal, de tijdbeperkende factor is hierbij voornamelijk de TCRα getransduceerde

fractie.

3.2.2. De specificiteit van de getransduceerde cellen

De tetrameerkleuringen uitgevoerd op de succesvol getransduceerde muizen binnen het

SCID-hu hanging drop model waren negatief. Mogelijks waren de gebruikte tetrameren te

oud en niet meer functioneel. De experimenten zijn nog niet opnieuw uitgevoerd, zodat deze

hypothese niet bevestigd kon worden.


Discussie

1. Resultaten van het onderzoek

Onze data bevestigen dat door HSC te transduceren met de genen coderend voor de TCRα en

TCRβ keten van een antigeenspecifieke TCR en vervolgens te laten uitrijpen in een SCID-hu

Thy/Liv injectie model, antigeenspecifieke T-cellen gemaakt kunnen worden. In het SCID-hu

Thy/Liv hanging drop model is het nog niet gelukt antigeenspecifieke T-cellen te maken. Vier

muizen van het SCID-hu Thy/Liv injectie model werden geanalyseerd naar specificiteit en

leverden wel degelijk antigeenspecifieke T-cellen op. Binnen de TCRαβ getransduceerde

fractie kleurde gemiddeld 14,8% aan met tetrameer. Binnen de TCRα only getransduceerde

fractie werd 0,3% tot 0,9% antigeenspecifieke T-cellen gevonden en binnen de TCRβ only

getransduceerde fractie 0,0% tot 2,7%. De hypothese dat TCRα only en TCRβ only

getransduceerde T-cellen vaker een antigeenspecifieke TCR zouden tot expressie brengen dan

niet-getransduceerde T-cellen kon niet aangetoond worden. Op basis van de analyse op dag

32 na injectie (figuur 15, B) zou dit vermoed kunnen worden, maar de analyse op dag 25 na

injectie (figuur 14) levert tegenstrijdige evidentie wat betreft de TCRβ only getransduceerde

T-cellen (‘de specificiteit van de getransduceerde T-cellen (3.1.4)’). Verder onderzoek is

bijgevolg nodig om deze hypothese te bevestigen. Van de bestudeerde celpopulaties uit deze 4

muizen (zowel getransduceerde als niet-getransduceerde cellen) is 86,4% tot 96,2% CD4+

CD8+ DP en bevindt 1,2% tot 4,5% van de cellen zich in het CD8 SP, mature stadium en

2,6% tot 8,5% in het CD4 SP, mature stadium. In het SCID-hu Thy/Liv injectie model vond

negatieve selectie plaats. Dit bleek uit de aanwezigheid van 0,6% tot 2,5% CD8SP cellen

binnen de CMV tetrameer+ CD3+ CD8α+ T-cellen (figuur 15, C). Hieruit kan geconcludeerd

worden dat het SCID-hu Thy/Liv model de volledige uitrijping van T-cellen ondersteund. Een

laatste conclusie uit onze resultaten betreft het tijdstip van analyse. Het heeft weinig zin in het

SCID-hu Thy/Liv injectie model analyses te doen later dan 70 dagen post-injectie. Analyses

worden best gedaan tussen de 27 en de 70 dagen post-injectie. Voor het SCID-hu hanging

drop model geldt dezelfde conclusie, analyse best tussen de 35 en 64 dagen post-

transplantatie.

Deze enkele successen wijzen op de mogelijkheden van de techniek. Het doel is positieve en

negatieve selectie verder te bestuderen en deze kennis vervolgens toe te passen op het OP9-

DL1 co-cultuur systeem om efficiënte generatie van tumorspecifieke T-cellen te bekomen die


in de kliniek gebruikt kan worden. Om na te gaan welke de inefficiënte en dus voor

verbetering vatbare schakels zijn in het productieproces van antigeenspecifieke T-cellen

werden bijkomende experimenten gedaan. Uit experimenten met T-cel klonen blijkt dat de

CMV en de HA2 tetrameren specifiek die T-cellen aankleuren die de respectievelijke

antigeenspecifieke TCR tot expressie brengen. De TCRαβ getransduceerde cellen zijn echter

niet allemaal specifiek voor het bedoelde antigeen. De idee dat TCRαβ getransduceerde cellen

een vaste specificiteit zouden hebben bepaald door de specificiteit van de getransduceerde

TCR blijkt onjuist. Bij deze stelling werd geen rekening gehouden met het uiteindelijke

gebruik van de getransduceerde TCR ketens in de assemblage van een TCR. CMV TCRβ

getransduceerde cellen bleken slechts in 52% van de gevallen de CMV TCRβ keten effectief

op hun membraan te hebben en dus in maximaal in 52% van de gevallen te gebruiken voor

hun TCR. Mogelijks zijn in de gebruikte foetale lever CD34+ cellen, die beschouwd worden

als HSC, cellen aanwezig die reeds TCR genherschikkingen achter de rug hebben en

mogelijks is deze populatie dus niet zo zuiver als we dachten. Er werd echter geen literatuur

gevonden om deze hypothese te ondersteunen. Een andere hypothese om de discrepantie

tussen de aanwezigheid van NGFR, en het dus getransduceerd zijn met de TCRβ keten, en de

afwezigheid van Vβ13 te verklaren is dat hoewel de T-cellen getransduceerd zijn met het

TCRβ gen van een antigeenspecifieke TCR, ze toch een andere, endogeen herschikte TCRβ

keten gekozen hebben om hun TCR te assembleren. Vanuit het in vivo T-cel

ontwikkelingsmodel is dit niet zo verwonderlijk, TCRβ herschikking treedt op tot wanneer

een pre-TCR een stopsignaal zendt. Dit zou impliceren dat het introduceren van een TCRβ

keten in HSC niet noodzakelijkerwijs aanleiding geeft tot β-selectie en tot stop van TCRβ

genherschikking zoals in natuurlijke omstandigheden het geval is. Mogelijks speelt de

insertieplaats hier een rol, de insertie van het TCRβ gen gebeurt immers op een willekeurige

plaats in het DNA van de HSC. Een tweede mogelijkheid is dat de pTα absoluut noodzakelijk

is voor β-selectie en dat die pTα nog niet geëxpresseerd wordt in HSC. Mogelijks moeten

eerst endogene TCRβ herschikkingen plaatsgrijpen vooraleer pTα geëxpresseerd wordt. In de

literatuur vinden we echter terug dat TCRα de pTα kan vervangen, dus bij dubbel

getransduceerde cellen wordt dit probleem niet verwacht, althans o.b.v de literatuur (Buer,

1997). Een boeiend gegeven is dat we in de NGFR positieve populatie met uitzondering van

Vβ13 lagere frequenties van andere Vβ domeinen zien t.o.v. de NGFR negatieve populatie,

wat er op wijst dat endogene herschikking in zekere mate toch geremd wordt, maar mogelijks

niet even efficiënt als in vivo. Als endogene TCRβ herschikking doorgaat na transductie dan

kunnen TCRαβ getransduceerde cellen ofwel de geïntroduceerde TCR tot expressie brengen,


ofwel een hybride waarvan specificiteit en affiniteit onvoorspelbaar zijn, ofwel een volledig

endogene TCR gezien TCRα genherschikking sowieso doorgaat tot op het moment van

positieve selectie. De tetrameer positieve cellen die gevonden werden in 2 van onze

experimenten vormen geen mooi afgezonderde populatie. Tetrameerpositiviteit toont zich als

een ‘smeer’ overgaand van negatief naar positief. Dit beeld ondersteunt de hypothese van de

hybride TCR en van continuïteit in TCRβ genherschikking na transductie.

2. Risico’s van getransduceerde T-cellen

Boven geformuleerde hypothese is erg relevant in het kader van het grootste gevaar van het

via transductie richten van T-cellen: heterologe paring. Heterologe paring is het assembleren

van een TCR met een endogene TCR keten en een geïntroduceerde TCR keten. De

specificiteit van een hieruit verkregen hybride TCR is niet voorspelbaar en kan mogelijks

leiden tot auto-immuniteit. Dit is één van de grote risico’s die deze vorm van cellulaire

immunotherapie zou hebben in de klinische praktijk. Indien dit niet alleen in TCRα only en

TCRβ only getransduceerde, maar ook in TCRαβ getransduceerde T-cellen zou gelden, zou

steeds moeten worden nagegaan of TCRαβ getransduceerde T-cellen de geïntroduceerde TCR

keten genen effectief gebruiken in hun TCR. Een test na transductie om de

antigeenspecificiteit van de getransduceerde T-cellen na te gaan zou steeds nodig zijn.

Bovendien is het niet gezegd dat een toename van affiniteit gepaard gaat met toename van

effector functie. T-cellen met hoge affiniteit zouden een lagere in vivo efficaciteit kunnen

hebben, omdat hun mogelijkheid om van één doelwitcel naar een volgende doelwitcel te

migreren gedaald is (Moss, 2001). Er zijn reeds een aantal oplossingen bedacht om het risico

op auto-immuniteit te verlagen. Een eerste optie is de introductie van cysteines in de

constante regio van de getransduceerde TCRα en TCRβ ketens. Dit zou preferentiële

onderlinge paring promoten en zo de totale oppervlakte expressie van de geïntroduceerde

TCR ketens vergroten en de mismatch met endogene TCR ketens verkleinen (Kuball et al.,

2007). Een tweede optie is de introductie van een mutatie in de getransduceerde TCR genen

die paring met endogene eiwitten kan blokkeren (Moss, 2001). Het genetisch ontwerpen van

T-cellen met een induceerbaar suïcide fenotype via de insertie van een herpes simplex virus

thymidine kinase is een derde optie, bij ernstige auto-immuniteit kunnen de getransduceerde

T-cellen dan gedood worden met acyclovir of ganciclovir (Helene, 1997), waardoor ook de

auto-immuniteit verdwijnt. De vierde en elegantste oplossing zou echter een locatiespecifieke

insertie van de TCR ketens zijn, op de plaats van de endogene TCR ketens. Op die manier

wordt de in vivo situatie maximaal gerespecteerd en verwachten we stopzetting van TCRβ


genherschikking en bijgevolg efficiëntere generatie van antigeenspecifieke T-cellen.

Momenteel is er veel onderzoek aan de gang om retro- en lentivirale insertie in het kader van

gentherapie te oriënteren (Frecha et al., 2008). Hierdoor zal het mogelijk worden in de

toekomst viraal genoom gericht in gastheergenoom te laten incorporeren, zodat nadelige

bijwerkingen door insertionele mutagenese vermeden zullen worden.

3. Vooruitzichten en immunotherapie in breder perspectief

Kanker is één van de belangrijkste oorzaken van sterfte wereldwijd: in 2004 stierven 7,4

miljoen mensen (13% van alle sterfte) ten gevolge van kanker. Long-, maag-, colorectale,

leveren borstkanker staan in voor het merendeel van de kankersterfte (WHO, 2009). Meer

dan 30% van de kankersterfte zou voorkomen kunnen worden. Primaire preventie via

levensstijl- en omgevingsaanpassingen blijft de meest geschikte manier om het probleem

wereldwijd aan te pakken (Danaei et al., 2005). We mogen ons echter niet blindstaren op het

voorkombare aspect. Implementatie van de primaire preventie verloopt langzaam en een

projectie naar de toekomst voorspelt een exponentiële toename van de kankersterfte, met een

geschatte 12 miljoen doden in 2030. Huidige therapie, wanneer zij aan de man komt, heeft

vrij hoge genezingscijfers voor enkele van de meest voorkomende tumoren, zoals

borstcarcinoom, cervixcarcinoom en colorectaal carcinoom. Bepaalde tumoren hebben echter

een slechte prognose, omdat ze met de huidige standaardtherapieën niet goed te behandelen

zijn (WHO, 2009).

De huidige standaardtherapie voor de meeste tumoren is een combinatie van heelkundige

resectie, chemotherapie en radiotherapie. Geen van deze drie technieken valt specifiek de

tumor aan, steeds wordt gezond weefsel mede getroffen door de therapie. Bij heelkundige

resectie is de anatomische onzekerheid over de begrenzing van een tumor de reden om gezond

weefsel dat niet levensnoodzakelijk is mee te verwijderen. Chemotherapie wordt systemisch

toegediend en doodt cellen via directe beschadiging van hun DNA (en RNA). Alle delende

cellen zijn er vatbaar voor en het verschil in delingssnelheid tussen tumoren en normaal

weefsel is niet zo groot. Dit resulteert in een nauw therapeutisch venster tussen effectieve

behandeling van een tumor en toxiciteit voor normaal weefsel. De dosis en het schema van de

chemotherapie zijn beperkt door de tolerantie van de normale weefsels, in het bijzonder de

sneldelende weefsels, zoals het beenmerg en de gastro-intestinale tract mucosa. Radiotherapie

voegt energie toe aan bestraalde weefsels, hierdoor ontstaat ionisatie en excitatie van atomen


en moleculen, wat zich uit in DNA enkelen dubbelstreng breuken en bijgevolg celdood.

Wederom kan niet vermeden worden dat gezond weefsel getroffen wordt (Kumar and Clark,

2005). Tal van ernstige bijwerkingen maken deze klassieke tumorbehandeling erg zwaar voor

de patiënt en in veel gevallen kan genezing niet gegarandeerd worden. Chemotherapie en

radiotherapie hebben de prognose van de meeste tumoren enorm verbeterd, wat maakt dat we

nu steeds vaker geconfronteerd worden met hun lange termijn bijwerkingen. Eén ervan is

uitermate lastig, maar onvermijdbaar, gezien zij intrinsiek is aan het werkingsmechanisme.

Tien tot twintig jaar na genezing van de primaire tumor zien we namelijk het ontstaan van

secundaire tumoren. Zowel chemo- als radiotherapie veroorzaken celdood door het induceren

van mutaties in het genoom. Door hun gebrek aan specificiteit doen ze dit zowel in

tumorcellen als in normale cellen (Kumar and Clark, 2005).

Plaatsen we hier de elegante benadering van de immunotherapie tegenover, dan wordt de

theoretisch superieure kracht ervan duidelijk. Tumorspecifieke T-cellen kunnen specifiek

migreren naar antigeenexprimerende tumorsites onafhankelijk van de locatie ervan in het

lichaam, ze kunnen zelfs diep in de weefsels doordringen. Daarenboven kunnen T-cellen

blijven prolifereren als antwoord op immunogene antigenen geëxpresseerd door de tumor,

totdat alle tumorcellen verdwenen zijn. Tot slot kan een immunologisch geheugen opgebouwd

worden om bij recidief antigeendragende tumoren uit te schakelen (Disis et al., 2009).

Immunotherapie heeft echter ook theoretische nadelen, beperkingen en moeilijkheden. Een

tumor kan gezien worden als een vreemd lichaam, maar meestal wordt hij door het lichaam

gezien als lichaamseigen en is er geen afstotingsreactie. Deze niet-immunogene tumoren zijn

bijgevolg niet direct behandelbaar via actieve immunotherapie (dit is het eigen

immuunsysteem stimuleren e.g. via vaccinatie), passieve immunotherapie (e.g. door toedienen

van tumorspecifieke T-cellen) is hier wel een mogelijkheid. Binnen een tumor kunnen er

cellen zijn met sterk immunogene tumorantigenen en cellen met weinig immunogene

tumorantigenen. Het immuunstelsel zal in staat zijn de ‘afwijkende’ tumorcellen met sterk

immunogene tumorantigenen te doden, maar niet die met weinig immunogene

tumorantigenen. Op deze wijze vindt een selectie plaats van een weinig immunogeen

antigenrepertoire binnen de tumorcellen en stijgt de kans op ontsnapping aan het

immuunstelsel van de overblijvende tumorcellen. Bijkomende moeilijkheden voor

immunotherapie zijn de immunosuppressieve effecten van tumoren gemedieerd door o.a.

TGFβ, oplosbaar Fas ligand en indolamine-2,3-dioxygenase. In de micro-omgeving van een


tumor zijn er naast immunostimulerende dus ook immunosupprimerende factoren en met

immunotherapie doen we de balans overhellen naar de immunostimulerende zijde (Finn, 2008

; WHO, 2009).

In de praktijk bracht immunotherapie ons reeds hoopgevende resultaten bij patiënten met

progressieve, therapieresistente ziekte (Mackensen et al., 2006 ; Morgan et al., 2006 ; Yee et

al., 2002). Maar zoals in de inleiding aangehaald, zijn de resultaten tot nog toe niet in

overeenstemming met de verwachtingen gegroeid uit haar theoretische nulli secundus positie.

De zoektocht naar verklaringen en oplossingen voor het huidig beperkte succes is op volle

gang. Een tumor kan op verschillende manieren ontkomen aan eliminatie door

immunotherapie e.g. door MHC downregulatie op tumorcellen, door verandering van tumor

antigenen, door verlies van de homing capaciteit van in vitro geproduceerde T-cellen, door

tumor geïnduceerde T-cel deletie of door de onderdrukking van T-cel functie via door de

tumor geproduceerde of geïnduceerde factoren (Gabrilovich, 2003). In een recente studie door

Hunder et al. (2008) werd tumor escape voorkomen door de infusie van geëxpandeerde

autologe CD4+ T-cel klonen om tumoraal geïnduceerde immunosuppressie te overwinnen bij

patiënten met gemetastaseerd melanoma. Deze CD4+ T-cellen coördineerden een effectieve,

verlengde anti-tumorale immuunrespons. Deze bredere immuunrespons blokkeert

waarschijnlijk ontsnappingsroutes zoals verlies van expressie van het target antigen, waarmee

de tumor anders de immuuncontrole zou kunnen omzeilen (Weiner, 2008).

Het is een boeiende periode in de ontwikkeling van tumorspecifieke therapieën, waaronder

immunotherapie. Ondanks tot nog toe matig succes blijft het geloof groot. Verder onderzoek

zal ons inzicht in de complexe interactie tussen het immuunstelsel en tumoren vergroten en

ons helpen ons eigen verdedigingssysteem te ondersteunen in haar strijd tegen tumoren.


Referentielijst

ASAI O., LONGO DL., TIAN ZG., HORNUNG P.D., TAUB DD., RUSCETTI FW.,

MURPHY WJ. : Suppression of graft-versus-host disease and amplification of graft-versus-

tumor effects by activated natural killer cells after allogeneic bone marrow transplantation. J

Clin Invest, 1998, 101(9), 1835-42.

BLATTMAN J.N., GREENBERG P.D. : Cancer immunotherapy: a treatment for the masses.

Science, 2004, 305(5681), 200-5.

BLOM B., SPITS H. : Development of human lymphoid cells. Annu. Rev. Immunol., 2006,

24, 287-320.

BUER J., AIFANTIS I., DISANTO JP., FEHLING HJ., VON BOEHMER H. : T-cell

development in the absence of the pre-T-cell receptor. Immunol Lett., 1997, 57(1-3), 5-8.

DAVIS M.M., BJORKMAN P.J. : T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.

Nature, 1988, 334(6181), 395-402.

DE SMEDT M., HOEBEKE I., PLUM J. : Human bone marrow CD34+ progenitor cells

mature to T cells on OP9-DL1 stromal cell line without thymus microenvironment. Blood

Cells Mol Dis., 2004, 33(3), 227-32.

DIETRICH PY., LE GAL FA., DUTOIT V., PITTET MJ., TRAUTMAN L., ZIPPELIUS A.,

COGNET I., WIDMER V., WALKER PR., MICHIELIN O., GUILLAUME P.,

CONNEROTTE T., JOTEREAU F., COULIE PG., ROMERO P., CEROTTINI JC.,

BONNEVILLE M., VALMORI D. : Prevalent role of TCR alpha-chain in the selection of the

preimmune repertoire specific for a human tumor-associated self-antigen. J Immunol., 2003,

170(10), 5103-9.

DAZZI F., SZYDLO RM., CROSS NC., CRADDOCK C., KAEDA J., KANFER E.,

CWYNARSKI K., OLAVARRIA E., YONG A., APPERLEY JF., GOLDMAN JM. :

Durability of responses following donor lymphocyte infusions for patients who relapse after

allogeneic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia. Blood, 2000, 96, 2712-16.

DISIS ML., BERNHARD H., JAFFEE, EM. : Use of tumour-responsive T-cells as cancer

treatment. Lancet, 2009, 373, 673-83.

DUDLEY ME., WUNDERLICH JR., ROBBINS PF., YANG JC., HWU P.,

SCHWARTZENTRUBER DJ., TOPALIAN SL., SHERRY R., RESTIFO NP., HUBICKI

AM., ROBINSON MR., RAFFELD M., DURAY P., SEIPP CA., ROGERS-FREEZER L.,

MORTON KE., MAVROUKAKIS SA., WHITE DE., ROSENBERG SA. : Cancer regression


and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science,

2002, 298, 850-4.

DUNN G.P., OLD L.J., SCHREIBER R.D. : The three Es of cancer immunoediting. Annu.

Rev. Immunol., 2004, 22, 329-60.

FINN O.J. : Cancer immunology. N Engl J Med., 2008, 358(25), 2704-15.

FRECHA C., SZECSI J., COSSET FL., VERHOEYEN E. : Strategies for targeting lentiviral

vectors. Curr Gene Ther., 2008, 8(6), 449-60.

GABRILOVICH D., PISAREV V. : Tumor escape from immune response: mechanisms and

targets of activity. Curr Drug Targets, 2003, 4(7), 525-36.

GAO Q., QIU SJ., FAN J., ZHOU J., WANG XY., XIAO YS., XU Y., LI YW., TANG ZY. :

Intratumoral balance of regulatory and cytotoxic T-cells is associated with prognosis of

hepatocellular carcinoma after resection. J Clin Oncol, 2007, 25, 2586-93.

GATTINONI L., POWELL D.J., Jr., ROSENBERG S.A., RESTIFO N.P. : Adoptive

immunotherapy for cancer: building on success. Nat. Rev. Immunol., 2006, 6(5), 383-93.

HELENE M., LAKE-BULLOCK V., BRYSON J.S., JENNINGS C.D., KAPLAN A.M. :

Inhibition of graft-versus-host disease. Use of a T cell-controlled suicide gene. J. Immunol.,

1997, 158, 5079-82.

HUGHES MS., YU Y.Y., DUDLEY ME., ZHENG Z., ROBBINS PF., LI Y., et al. Transfer

of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly

active T-cell effector functions. Hum Gene Ther., 2005, 16(4), 457-72.

JANEWAY C.A., TRAVERS P., WALPORT M., SHLOMCHIK M.J. : Immunobiology.

Garland Science Publishing, New York, 2005.

JENKINSON E.J., FRANCHI LL., KINGSTON R., OWEN J.J. : Effect of deoxyguanosine

on lymphopoiesis in the developing thymus rudiment in vitro: application in the production of

chimeric thymus rudiments. Eur. J. Immunol., 1982, 12(7), 583-7.

KODAMA H., NOSE M., NIIDA S., NISHIKAWA S., NISHIKAWA S. : Involvement of the

c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells. Exp. Hematol.,

1994, 22(10), 979-84.

KINGSTON R., JENKINSON E.J., OWEN J.J. : A single stem cell can recolonize an

embryonic thymus, producing phenotypically distinct T-cell populations. Nature, 1985,

317(6040), 811-3.

LEHAR S.M., BEVAN M.J : T cell development in culture. Immunity, 2002, 17(6), 749-56.

MACKENSEN A., MEIDENBAUER N., VOGL S., LAUMER M., BERGER J.,

ANDREESEN R. : Phase I study of adoptive T-cell therapy using antigen-specific CD8+ T


cells for the treatment of patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol., 2006, 24(31),

5060-9.

LOKHORST HM., SCHATTENBERG A., CORNELISSEN JJ., VAN OERS MHJ., FIBBE

W., RUSSEL I., DONK NWCJ., VERDONCK LF. : Donor lymphocyte infusions for

relapsed multiple myeloma after allogeneic stem-cell transplantation: predictive factors for

response and long-term outcome. J. Clin. Oncol., 2000, 18, 3031-37.

MAILLARD I., FANG T., PEAR WS. : Regulation of lymphoid development, differentiation,

and function by the notch pathway. Annu Rev Immunol., 2005, 23, 945-74.

MCCUNE J.M. : Development and applications of the SCID-hu mouse model. Semin.

Immunol., 1996, 8(4), 187-96.

MCCUNE J.M., NAMIKAWA R., KANESHIMA H., SHULTZ L.D., LIEBERMAN M.,

WEISSMAN I.L. : SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human

hematolymphoid differentiation and function. Science, 1988, 241, 1632–1639.

MORGAN R.A., DUDLEY M.E., WUNDERLICH J.R., HUGHES M.S., YANG J.C.,

SHERRY R.M., ROYAL R.E., TOPALIAN S.L., KAMMULA U.S., RESTIFO N.F.,

ZHENG Z., NAHVI A., DE VRIES C.R., ROGERS-FREEZER L.J., MAVROUKAKIS S.A.,

ROSENBERG S.A. : Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered

lymphocytes. Science, 2006, 314(5796), 126-9.

MOSS P. : Redirecting T cell specificity by TCR gene transfer. Nat Immunol., 2001, 2(10),

900-1.

MUELLER N. : Overview of the epidemiology of malignancy in immune deficiency. J.

Acquir. Immune Defic. Syndr., 1999, 21, Suppl 1: S5-10.

NAMIKAWA R., WEILBAECHER K.N., KANESHIMA H., YEE E.J., MCCUNE J.M. :

Long-term human hematopoiesis in the SCID-hu mouse. J Exp Med., 1990, 172(4), 1055-63.

PAGES F., BERGER A., CAMUS M., SANCHEZ-CABO F., COSTES A.,MOLIDOR R.,

MLECNIK B., KIRILOVSKY A., NILSSON M., DAMOTTE D., MEATCHI T.,

BRUNEVAL P., CUGNENC PH., TRAJANOSKI Z., FRIDMAN WH., GALON J. : Effector

memory T-cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med, 2005, 353,

2654-66.

PLUM J., DE SMEDT M., VERHASSELT B., KERRE T. VANHECKE D.,

VANDEKERCKHOVE B., LECLERCQ G. : Human T lymphopoiesis. In vitro and in vivo

study models. Ann N Y Acad Sci., 2000, 917, 724-31.

ROBBINS PF., DUDLEY ME., WUNDERLICH J., EL-GAMIL M., LI YF., ZHOU J.,

HUANG J., POWELL DJ., ROSENBERG S.A. : Cutting edge: persistence of transferred


lymphocyte clonotypes correlates with cancer regression in patients receiving cell transfer

therapy. J Immunol., 2004, 173, 7125-30.

ROSENBERG SA., RESTIFO NP., YANG JC., MORGAN RA., DUDLEY ME. : Adoptive

cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer, 2008, 8(4),

299-308.

SCHMITT T.M., ZUNIGA-PFLUCKER J.C. : Induction of T cell development from

hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity., 2002, 17(6), 749-56.

SCHMITT T.M., ZUNIGA-PFLUCKER J.C. : T-cell development, doing it in a dish.

Immunol Rev., 2006, 209, 95-102.

SHANKARAN V., IKEDA H., BRUCE A.T., WHITE J.M, SWANSON P.E., OLD L.J.,

SCHREIBER R.D. : IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and

shape tumour immunogenicity. Nature, 2001, 410(6832), 1107-11.

SIM GK., OLSSON C., AUGUSTIN A. : Commitment and maintenance of the alpha beta and

gamma delta T cell lineages. J Immunol., 1995, 154(11), 5821-31.

SPANGRUDE G.J., HEIMFELD S., WEISSMAN I.L. : Purification and characterization of

mouse hematopoietic stem cells. Science, 1988, 241(4861), 58-62.

SPITS H. : Development of alphabeta T cells in the human thymus. Nat. Rev. Immunol.,

2002, 2(10), 760-72.

VERHASSELT B., NAESSENS E., VERHOFSTEDE C., DE SMEDT M., SCHOLLEN S.,

KERRE T., VANHECKE D., PLUM J. : Human immunodeficiency virus nef gene expression

affects generation and function of human T cells, but not dendritic cells. Blood, 1999, 94(8),

2809-18.

WEINER LM. : Cancer immunotherapy -- the endgame begins. N Engl J Med., 2008,

358(25), 2664-5.

WHO : Cancer Factsheet N°297, February 2009. Opgehaald op 7 april 2009, van

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/index.html

YEE C., THOMPSON J.A., BYRD D., RIDDELL S.R., ROCHE P., CELIS E.,

GREENBERG P.D. : Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ T cell clones for

the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and

antitumor effect of transferred T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2002, 99(25), 16168-73.

ZEHN D., BEVAN M.J. : T cells with low avidity for a tissue-restricted antigen routinely

evade central and peripheral tolerance and cause autoimmunity. Immunity, 2006, 25(2), 261-

70.


ZHANG L., CONEJO-GARCIA J.R., KATSAROS D., GIMOTTY P.A., MASSOBRIO M.,

REGNANI G., MAKRIGIANNAKIS A., GRAY H., SCHLIENGER K., LIEBMAN M.N.,

RUBIN S.C., COUCKOS G. : Intratumoral T cells, recurrence, and survival in epithelial

ovarian cancer. N Engl J Med., 2003, 348(3), 203-13.

ZOU W. : Regulatory T-cells, tumor immunity and immunotherapy. Nat. Rev. Immunol,

2006, 6, 295-307.

Bijlage 1: Transductiestatus SCID-hu Thy/Liv injectie model

Figuur 1. Analyse dag 82 post-injectie

Figuur 2.. Analyse dag 27 post-injectie (1)

Figuur 3. Analyse dag 27 post-injectie (2)



Bijlage 2: Nagaan Vβ repertoire en aanwezigheid van TCRγδ T-

cellen

%

totaal

TCRγδ

(%)

Vβ13

(%)

Vβ2

(%)

Vβ5

(%)

Vβ7

(%)

Vβ8

(%)

Vβ12

(%)

Vβ17

(%)

Vβ22

(%)

NGFR+

eGFP+

0,75 0,6 42,90 0,0 1,2 2,4 2,2 2,7 3,4 0,5

NGFR+

eGFP-

7,35 0,4 45,05 0,3 0,3 0,7 0,4 0,3 1,1 0,2

NGFR-

eGFP+

28,05 0,1 2,40 4,6 1,9 2,4 3,1 2,4 4,9 2,1

NGFR-

eGFP-

63,85 0,1 2,60 5,0 1,4 2,0 2,0 1,6 4,0 1,9

Tabel 1. Nagaan Vβ-repertoire en aanwezigheid van TCRγδ T-cellen binnen CMV-specifieke

TCR getransduceerde cellen gegenereerd in een SCID-hu Thy/Liv injectie model (analyse dag

28 post-injectie). De weergegeven cijfers zijn percentages van het totaal aantal levende

lymfocyten, de eerste kolom (%totaal) geeft aan wat de verhouding NGFR+ en NGFR- cellen

is binnen die populatie, de andere kolommen geven aan in welk percentage van de cellen het

onderzochte Vβ domein (of de TCRγδ) teruggevonden werd. De cijfers in de kolommen

%totaal en Vβ13(%) zijn het gemiddelde van 2 metingen (die zeer goed overeenkomen), de

cijfers in de andere kolommen zijn afkomstig uit een eenmalige meting.

Bijlage 3: Transductiestatus SCID-hu hanging drop model

Figuur 1. Analyse dag 66 post-transplantatie

Figuur 2. Analyse dag 72 post-transplantatie (1)

GENERATIE VAN TUMOR SPECIFIEKE T-CELLEN

Documents

Transcript of GENERATIE VAN TUMOR SPECIFIEKE T-CELLEN