Fokadvies

1

H1 genetische diversiteit

H1 Beperkingen van de genetische diversiteit

Is van belang omdat het een invloed heeft op de gezondheid van het ras en dus ook de

overlevingskansen op de lange termijn

- Rassen met nauwe genetische basis = ↑ risico > rassen met brede genetische basis =

diversiteit verschil

- Genetische diversiteit wordt bepaald door:

o De grootte van de populatie en de manier van fokken: grote rassen = ↓ F

o Tijdsgebonden schommelingen

o De wijze van fokken: ad random paring bijv kan in kleine populatie zorgen vr ↑

diversiteit

Dit komt allemaal samen in Ne = effectieve populatiegrootte (zie onder)

4 mechanismen die de genetische diversiteit hondenrassen vnl doet ↓

Founder effect:

o Meeste hondenrassen zijn pas 200 jaar geleden ontstaan uit beperkt aantal

fokdieren op basis van uiterlijk en vaak maar op een enkel kenmerk bijv pelskleur

o Dit beperkte aantal stichters/founders werd onderling gekruist inteeltkruisingen

en dieren die niet voldeden werden eruit gegooid

Genetische diversiteit is behoorlijk eng

Bottle neck effect:

o De populatie doorgaat een periode waarbij het aantal dieren in de populatie sterk

terugloopt (oorlog, infectie) later weer toename

o Effect is idem stichterseffect dr de genetische diversiteit vd uiteindelijke populatie

gebaseerd is op een zeer klein aantal dieren

o Voorbeeld: leonberger na WWI nog slechts 5 dieren overbleven…

Popular sire (Matador) effect:

o Het veelvuldig gebruik van een populair fokdier = extreme daling diversiteit en in

extreme gevallen zelfs het bestaan van het ras bedreigen

o Vaak gaat het veelvuldig gebruik van populair fokdier samen met inteeltkruisingen

o Dit dier kan drager zijn van recessieve of multifactoriële aandoening

o Voorbeeld: spondyloepiphyseale dysplasie bij de miniatuur poedel

Autosomaal recessief, dieren met korte poten dr groeivertraging t.h.v

heupen en schouders.

De 7 aangetaste nakomelingen zijn allen van dezelfde reu

Optichting FCI met opstelling richtlijnen: geen enkel dier mag meer dan 5% vd

nakomelingen hebben in een populatie geregistreerd in een periode van 5 jaar

Inteelt op populatieniveau:

o Ne = effectieve populatiegrootte en is de grootte van de ideale populatie, maar in de

praktijk altijd kleiner tgv:

Δ in aantallen mannen en vrouwelijke dieren die zich voortplanten

Fluctuaties in de populatiegrootte over de tijd

Variatie in het aantal nakomelingen per familie

Inteelt

Fokadvies

2

Genetische drift = het mechanisme voor verandering in de genetische samenstelling van een populatie. In zéér grote populaties

zal, op basis van bovenstaande waarschijnlijkheid van 50%, de frequentie van de verschillende allelen in de populatie dezelfde

blijven over de generaties heen.

In een kleine populatie daarentegen, liggen de zaken anders. Stel een laboratoriumpopulatie van 10 fruitvliegen met in

opeenvolgende generaties ook steeds 10 individuen. In de eerste generatie van deze populatie komt het allel voor rode ogen

voor bij 5 individuen. In de tweede generatie kunnen er door toeval 3 vliegen zijn met het rode-ogen-allel en 7 zonder dit allel.

Voor de 3 overblijvende vliegen is er nu weer een kans van 50% dat het allel voor rode ogen wordt overgedragen op een

nakomeling. Zo is het statistisch perfect mogelijk dat in de derde generatie geen enkel van de 10 individuen het allel nog bezit

en we uitkomen op een populatie van 10 individuen waar het allel voor rode ogen niet meer in voorkomt.

Reproductielft

Geografische distributie

o Conclusie: de populatie dient niet alleen groot genoeg te zijn ook de keuze van

fokdieren is cruciaal

o Genetische drift zal in kleinere populatie groter effect hebben en kan zorgen voor

fixatie of verdwijnen van bepaalde allelen:

De inteeltcoefficient F: o Inteelt = de paring ss twee genetisch verwante individuen o Δ met andere assortieve paringen: inteelt heeft een effect op alle genen en niet

uitsluitend op die genen die kenmerk bepalen o Kan op inteelt wordt groter naarmate de populaite kleiner wordt o Gevolg: identieke allelen afkomstig van gemeenschappelijke voorouder komen in

homozygote toestand terecht bij een nakomeling er is een selectie tegen heterozygoten en ↑ vh % homozygoten

o Hoe meten we inteelt: F = inteeltcoefficient en is een maat voor de kans dat twee allelen identiek zijn door afstamming

0: willekeurige paring tot 1: alle allelen zijn identiek dr afstamming

Berekend op basis van stambomen: Fx = ∑(1/2)m+n+1(1+Fa) met Fx= o wnn geen gemeenschappelijke voorouders langs ouderszijde

of reductie in heterozygositeit Inteelt is niet definitief, kan gecorrigeerd w: zwaar ingeteelde X niet verwante = Fx=0

H2 Kruisingstypes

Inkruisen (inteelt)

- Inteelt is voor vele populaties nadelig omdat het de kans ↑ dat nadelige recessieve allelen in

homozygote toestand terecht komen, drom heeft FCO verboden ouder – nakomeling en

broer/zuster kruisingen te gebruiken

o Extreme inteelt fixering positieve en negatieve kenmerken

!!! Inteelt is geen nieuwe mutaties, tis enkel het effect van recessieve allelen

in homozygote toestand brengen met fenoytpe uitdrukking

- Inteeltdepressie: ↓ vruchtbaarheid, vitaliteit en levensverwachting, ↑ kanker, autoimmuun

Lijnenteelt:

- Is een vorm van inteeltfok waarbij dieren gekruist worden met een of meerdere

gemeenschappelijke voorouders of verdere verwant waarbij de inteeltgraad relatief laag

gehouden wordt en problemen met inteeltdepressie tot een minimum beperkt

- Doel:

Fokadvies

3

o Bepaalde karakteristieken versterken

o Genetische afwijkingen eruit fokken: eerder theoretisch want om dit te knn dient

men te beschikken over goede kennis stamboom van beide fokdieren van 5

generaties + werkt niet voor polygenische en multifactoriële aandoeningen (2/3e

erfelijke aandoeningen…)

- Wat:

o Het is een compromis tussen inteeltfok en uitkruisen wrbij negatieve effecten inteelt

beperkt + wisselvalligheden dr uitkruising vermeden

o Het geeft een snelle vooruitgang nr verkrijgen van bepaald kenmerk in de lijn = snelle

fixering

- Voordelen: je weet min of meer wat je kan verwachten en kan bepaalde karakteristieken in

de lijn fixeren

- Nadelen: fixering van bepaalde negatieve of ongewenste kenmerken, daarnaast werkt het

niet altijd, gewenste karakteristieken treden niet altijd op. Tenslotte is het enkel korte

termijn denken wat fokkers doen, te zien binnen tal van rassen wr problemen.

Uitkruisen

- Kruisen van onverwante dieren behorende tot hetzelfde ras ↔ binnen meeste rassen

onbestaande aangezien het aantal dieren eerder beperkt en allemaal wel ergens voorouder

- Strikt gezien: uitkruisen het kruisen van twee dieren behorende tot een Δ lijn met

nakomelingen die F1 hybriden zijn

- Praktijk: uitkruisen om bepaalde niet aanwezige kenmerken in een lijn te brengen om

vervolgens via inteeltfok of lijnenteelt te bestendigen

- Wordt vaak niet gebruikt omdat:

o Schrik fokker: verdunning al reeds aanwezige kenmerken… zelden wan er is al

selectie op type geweest

o Het nieuwe mutant zou nieuwe recessieve allelen in de populaite knn brengen, dit is

waar maar wnn Ne groot genoeg zal de frequentie ↓ blijven

Het is beter om meedere genetische defecten te hebben aan een ↓ frequentie dan 1

erfelijk gebrek aan ↑ frequentie

Kruisen

- Fokken met dieren van Δ rassen, het maken van hybriden brengt nieuw kenmerk binnen

o Voorbeeld: rassen met chondrodysplasie 19 rassen 1 enkele mutatie

verantwoordelijk nl retrgen van fibroblast groeifactor 4 (FGF4)

- Wild type allel inbrengen in ras wr mutant allel overhand heeft gekregen en niet meer d.m.v.

selectie in de hand te houden

o Voorbeeld: dalmatier – allen zijn homozygoot vr allel urolithiasis

H3 Types van overerving

Monogenische overervingd

- 90% alle monogenische aandoeningen hond en kat erft autosomaal recessief over

Autosomaal recessieve overerving Autosomaal dominante overerving:

Kenmerk kan generaties overslaan Alle nakomelingen van 2 ouders met het kenmerk

Kenmerk slaat geen enkele generatie over Elke nakomeling met kenmer heeft minstens 1 ouder

Fokadvies

4

vertonen het kenmerk Kenmerk komt aan dezelfde frequentie voor bij

mannelijke en vrouwelijke ind Indien het kenmerk zeldzaam is zullen:

Meeste nakomelingen met kenmerk ontstaan uit kruising van heterozygote ouders (1/4)

Paringen ss een ouder met het kenmerk en 1 zonder het kenmerk = nakomelingen zonder

Kruising niet verwante ind wrvan 1 kenmerk = meestal aa x AA met alle nakomelingen drager maar geen enkele kenmerk

met kenmerk Nakomelingen zonder kenmerk afkomstig van ouders

wrvan 1 kenmerk zal zelf enkel nakomelingen hebben zonder kenmerk

Kenmerk komt aan de zelfde frequentie vr man en vrouw Indien het een niet letaal, zeldzaam kenmerk betreft

meest kruisingen waaruit nakomelingen met kenmerk afkomstig van aa x Aa = 50% elk gelsact kenmerk

Veel aandoeningen heir zijn letaal in homozygote toestand (embryo)

Criteria X :

X gebonden recessief X gebonden dominant

- Kenmerk kan generaties overslaan - Alle nakomelingen van 2 ouders met kenmerk

vertonen kenmerk - Kenmerk komt ↓ vr bij v dan man - Indien het kenmerk zeldzaam is zullen:

Meeste nakomenlingen met man zijn en ontstaan uit kruising hetero v met normale m

Paring van een v met x m zonder – alle m kenmerk maar geen van de v (wel allemaal drager)

- M individuen geven dit door aan al hun dochters mr nooit aan hun zonen en hebben zelf mama met

- V ind met geven dit dr aan 50% nakomelingen m en v - Elke nakomeling met heeft minstens 1 ouder met - Indien zeldzaam is het aantal v met 2 maal zo ↑ als m

met

Polygenische overerving:

- Kenmerk w bepaald dr meerdere genen (10) zonder invloed milieu

- Er zijn geen duidelijke tendensen en geen geslachtsΔ

- Negatieve allelen zijn verdeeld over beide ouders

- Voorbeeld = maagtorsie Ierse Setter: dominant met onvolledige penetrantie – er is een hoofdgen

dat in combi met beperkt aantal ander genen (minor genes) defect veroorzaakt

Multifactoriële overerving:

- Kenmerk w bepaald dr meerdere genen(>10) en invloed milieu,

- Negatieve allelen verdeeld over beide ouders, 2/3e is milieu bijv HD

1. Invloed milieu:

- Start al bij moeder: voeding bijv invloed fenotype en vervoglens erfelijk overdraagbaar via

epigenetische Δ = aanpassingen chromatinestructuur zonder Δ genetische code

- Belangrijkste: voeding, hormonen, chemische stoffen, omgevingsfactoren (temp, behuizing)

- Fenokopie: wnn een fenotype veroorzaakt door omgevingsfactoren identiek is aan een fenotype

veroorzaakt door een bepaald genotype

Voorbeeld: Brodifacoum = fenokopie van hemofilie, een nest van 13 pups van 1 jarige teef –

8 doodgeboren of sterfte binnen 48 uur door interne bloedingen, teef niks dus: volwassen

dieren minder gevoelig dan foetus

Voorbeeld: ↓ foliumzuur in de voeding (milieu) van de teef kan leiden tot gespleten

gehemelte bij de nakomelingen

Fokadvies

5

P= G + E E kan zowel + als – zijn - Monogenische kenmerken met 100% penetrantie P= G - Kenmerken uitsluitend bepaald door milieu P= E - Multifactoriële kenmerken: P = G+E

- Onvolledige penetrantie/variabele expressie: de invloed vh milieu zorgt voor een variatie in het

fenotype (bepaald door genotype)

Voorbeeld: enzymen werken optimaal bij een welbepaalde temperatuur en helemaal niet bij

een te ↑ of te ↓ Cs allel vh tyrosinasegen bij de siamese kat. Dit is een enzym dat de

omzetting vh aminozuur tyrosine naar melanine katalyseert – het mutant allel Cs produceert

tyrosinasevariant enkel werkzaam bij temperaturen ↓ 25C

2. Invloed van genvariaties

- Naast de milieuinvloeden die een min of meer sterke invloed hebben op een kenmerk oefenen

alle genen hun functie uit in een netwerk van genen maw: genen staan onder invloed van Δ

genen + oefenen zelf een invloed uit op andere genen

- Additief geneffect: een kenmerk wordt bepaald door verschillende genen + milieu

normaalverdeling v/h kenmerk

3. Fokwaarde/erfelijkheidsgraad

- Sv hierboven: een fenotype (P) = het gevolg van de wisselwerking ss alle inwerkende

omgevingsfactoren (E) + alle genetische factoren (G)

Genotypische waarde refereert naar het gecombineerde effect van alle genen, allelen en

genotypen met een invloed op het onderzochte kenmerk. G = bepaald bij bevruchting

Omgevingsfactoren (E) is het gecombineerde effect van aale factoren die het kenmerk

beïnvloed

- Op basis van bovenstaande is de term erfelijkheidsgraad ontstaan: het aandeel van de

fenotypische variatie v/e populatie die wordt veroorzaakt dr genetische factoren maw: het is

een reflectie v/h aandeel v/d genen en milieufactoren op het tot stand komen van een bepaald

kenmerk.

- h2 = genetische variatie/ totale variatie totale = (G variatie +M variatie)

- H2 = de relatieve bijdrage van Vg (genotypische variatie) op de Vp (fenotypische variatie)

H2 = 0 de fenotypische variatie wordt volledig bepaald dr milieufactoren

H2 = 1 de fenotypische variatie wordt volledig bepaald dr genetische factoren

H2 houdt dus rekening met alle vormen van genetische variatie van dominantie,

epistasie tot additief geneneffect

- Praktisch belang?

Kenmerken met een ↓ erfelijkheidsgraad zijn niet praktisch voor selectie

- Voorbeeld: Fokdieren – selectie :

H2 = 0 de top 20 qua gewicht worden geselecteerd – nakomelingen zijn gem alle kandidaten

want gewicht wordt enkel bepaald door milieu invloeden

De respons op selectie (R) = 0

H2 = 1 de top 20 selectie nakomelingen geeft die het gem van die top 20 leveren, welke hoger

ligt dan de rest van de groep omdat het kenmerk genetisch bepaald is

De respons op selectie (R) = S (de selectiedifferentiaal)

Fokadvies

6

R=h2S

de erfelijkheidsgraad is de proportie vd fenotypische superioriteit vd ouders zichtbaar in de nakomelingen

maw: het is belangrijk de erfelijkheidsgraad te kennen om het effect van selectie op een bepaald kenmerk

te knn schatten

S = de gemiddelde fenotypische superioriteit vd geselecteerde kandidaten = gem

fenotypisch waarde selectie – gem fenotypische waarde populatie waaruit selectie is

bepaald

Een aantal belangrijke beperkingen vd erfelijkheidsgraad zijn:

1. De erfelijkheidsgraad zegt niets over de mate waarin een kenmerk genetisch bepaald is.

!!!De erfelijkheidsgraad is een functie vd genetische variatie niet vd mate waarin genen

bijdragen bij het tot stand komen vh kenmerk

Erfelijkheidsgraad zegt dus niets over betrokkenheid van genen bij de ontwikkeling v/e

kenmerk, maar wel over de betrokkenheid van de genen bij de variatie v/h kenmerk.

Voorbeeld: polydactylie kan veroorzaakt w dr genmutaties + milieuinvloeden

2. De erfelijkheidsgraad (zowel in enge als in brede zin) slaat niet op het individu, maar op een

groep individuen of populatie

Het is onmogelijk om erfelijkheidsgraad v/e kenmerk voor 1 individu te berekenen

Lichaamsgewicht hondenpop heeft h2 van 0,55 = 55% vd variatie i/h LG is te wijten aan

variatie i/h additief geneneffect

3. De erfelijkheidsgraad is geen gefixeerde waarde voor een bepaalde populatie, ras of soort

Een erfelijkheidsgraad mag niet geextrapoleerd worden van de ene populatie op de andere

De waarde vd erfelijkheidsgraad vr een bepaald kenmerk is specifiek vr een bepaalde

populatie in een welomschreven milieu op het moment van de meting

VB: polydactely hierboven erfelijkheidsgraad = 0, enkel homozygotie vr normale allel, stel

andere populatie met mutante allel = ↑ erfelijkheidsgraad

4. Ook wnn de erfelijkheidsgraad hoog is kan milieu invloed hebben op een kenmerk

↑ erfelijkheidsgraad wil zeggen dat de populatie op dat moment niet onderhevig was aan

milieu invloeden met impact op de variatie vh kenmerk

5. De erfelijkheidsgraad zegt niets over de aard van populatieverschillen voor een bepaald kenmerk

Het geeft geen verklaring waarom populaties van elkaar Δ vr dat kenmerk

VB: groep honden 1 + goed dieet = kenmerk LG vertoont enige variatie tgv genetische Δ +

erfelijkheidsgraad ↑ want voeding (milieufactor) is idem voor groep ↔ groep 2 + slecht

dieet zelfde verhaal en ook ↑ erfelijkheidsfactor MAAR gewicht gem zal 1>2 zijn men zou

verkeerdelijk knn interpreteren als te wijten aan genetica, terwijl tgv dieet

H4 Terugdringen van erfelijke aandoeningen

- Elk dier is drager van een aantal ongewenste kenmerken en allelen ↔ fokkers vaak idee normaal

dier zonder problemen, da kan dus nie he…

- Probleem om genetische defecten te bestrijden doordat fokkers wnn abnormale pup homzygoot

vr recessief overervende aandoening fokker verzwijgt

Aandoeningen als gevolg van hypertypes

Fokadvies

7

De rasstandaard:

- Ras = groep van dieren met gemeenschappelijke voorouders en welbepaalde karakteristieken –

deze karakteristieken w dr fokkers als rasstandaard beschreven en doen alsof dit een gefixeerd

is = onzin soorten en ook rassen evolueren in de tijd en nieuwe types zullen opduiken

- Deze morfologische Δ knn zeer snel gaan en zijn te wijten aan:

Een duidelijke correlatie ss het aantal eenheden in een tandem repeat Runx 2 gen +

ontwikkeling middengelaat – hoe ↑ verhouding glutamines:alanines in repeats hoe ↑ groei

Pyrenese berghond = homozygoot voor allel Alx4… bilaterale polydactyly 1ste teen

achterpoten. Uitzondering zonder raskenmerk haf wild type Alc4 allel

Gevolgen van selectie op hypertypes:

- Hypertypes knn ontstaan tgv selectie op uiterlijk bij moderne hondenrassen – enkele vb:

Overdreven gerimpelde huid vd sharpei met levenslange huidproblemen

Ahsst bulldogs en pekinezen dr ingedeukte gezicht

Open fontanel chihuahua dr overdreven selecte nr kleine dieren

Syringomyelie of chiari malformatie bij cavalier king charles dr overdreven selectie wrbij de

schedel te klein is wrd cerebellum drheen foramen magnum problemen CSV rm

holtevorming ih rm = erg pijnlijk en euthanasie ↔ 50% ontwikkelt dit…

Terugdringing van hypertypes is eenvoudig terug te dringen dr bijschaven van

rasstandaarden, hierbij moet echter de weerstand overwonnen worden van aantal

fokkers

Twee voorbeelden van hypertypes in detail:

1. Dermoid sinus bij de Rhodesian Ridgeback

- Haarkam op de rug = rasstandaard = dominant kenmerk 10% heeft dermoid sinus =

weefselbuisjes die vanuit de huid dieper ih weefsel dringen en tot op rm (zelden zo ver)

o Buisjes voelen als touwtjes onder de huid en knn + haarzakjes zijn operatief te verwijd

- Wegens de opening nr buiten toe zijn de sinussen in gevaar voor infectie cyste vorming

- Genetica:

Duplicatie van 4 volledige genen en deel 5e : FGF3, FGF4 en FGF9 wat fibroblast

groeifactoren zijn van belang vr embryonale ontw en morfogenese haarfollikels + regulatie

haargroei en huid – hoe de genen gelinkt zijn aan dermoid sinus = nog onduidelijk

Daarnaast blijken honden met dermoid allemaal homozygoot voor de mutatie de selectie

dr fokkers komt dus neer op selectie ten voordele van heterozygoten en kruising van dieren

met haarkam levert 25% homo op met dus ↑ risico

Maar hoe kan het dan dat slechts 10% DS heeft? Dit komt doordat het een onvolledige

penetrantie betreft + afsterven van ernstige gevallen tijdens embryonale ontw + verzwijgen

2. Sensorineuronale doofheid

- Witte pelskleur en doofheid = associatie bij hond en kat.

- F: van het ras is het een dominant kenmerk, recessief of polygenisch defect

- Dalmatier: hoogste prevalentie en associatie met oogkleur

- Distributie melanocyten = beïnvloed dr S of spotting gen welke minstens 4 allelen heeft waarvan

Het dominante S allel een uniforme pigmentering geeft

Sw extreem witte kleur

Fokadvies

8

- De 4 allelen zijn onvolledig dominant over elkaar: S is dominant over si maar niet over andere

twee; si is dominant over sp en sw

- Het is vrl het sw allel dat geassocieerd w met doofheid (dalmatier, bull terrier en engelse setter)

- Er zijn Δ types van doofheid veroorzaakt dr Δ genen, hier spreken we over sensorineuronaal

waarbij pigmentcellen verantwoordelijk zijn vr de normale ontw vh binnenoor (stria vascularis)

– afwezigheid pigmentcellen = degeneratie stria = ↓ bloedtoevoer cochlea en afsterven van

sensoriele haarcellen

Ook hier zou halvering doofheid haalbaar zijn, maar in conflict met rasstandaard

selectie tegen blauwe ogen betekent goed gehoor en aanwezigheid ‘patches’=

pigmentvlekken geboorte, welke niet gewenst zijn

Aandoeningen als gevolg van sporadische mutaties

Algemeen: - Het genoom vd hond heeft sinds domesticatie een accumulatie aan mutaties vergaard - Heel wat mensen denken dat wnn je raszuivere dieren uitkruist fenotype wolf bekomt = onzin - Andere misvatting is dat alle genetische diversiteit nu aanwezig was in ancestrale populatie =

onzin – continu nieuwe mutaties - De kans op spreiding van een mutatie is f: grootte populatie – klein>groot , maar voorkomen van

nieuwe mutaties: grote populatie>kleine Problemen bij selectie tegen erfelijke aandoeningen - Agressieve fokprogramma’s inteelt en lijnenfok in gesloten populaties = ↑ genetische

defecten. Lijnenfok heeft ze niet gecreëerd maar wel frequentie doen ↑ - Honden > 500 Δ erfelijke defecten

Van tumoren, hartafw, doofheid, blindheid, huidafw tot bloederziekten en auto imm

Ongeveer 50% in 1 ras, andere zoals HD komt bij meerdere rassen voor

Van ong 300 is de overerving gekend: o 200 daarvan is polygenisch/multifactorieel o 100 monogenisch waarvan 90% recessief

- Katten > 300 erfelijke aandoeningen beschreven

200 type overerving gekend met 140 polygenisch/multifactorieel !! In tegenstelling tot terugdringen van afwijkingen tgv selectie nr hypertypes, sporadische mutaties is niet eenvoudig:

o Hoe sterk moet de selectie zijn? o Mag er verder w gefokt met aangetaste en dragers? o Wie draagt verantwoordelijkheid?

Daarnaast zijn er 7 complicaties die terugdringen van sporadische mutaties bemoeilijken… 1. Recessieve allelen:

o Hond: 90% monogenische is recessief – selectie is niet efficiënt indien enkel op het fenotype geselecteerd kan w. Er zijn veel heterozygoten oftwel drager die niet zichtbaar zijn en wrd mutant allel ↑ blijft in frequentie

↓ o Selectie tegen een recessief kenmerk is niet efficiënt!

Volledige selectie kan niet, er blijven nog maar weinig geschikte dieren over = ↓ genetische diversiteit, creëren soort van bottleneck

Opl = wnn dragers opgespoord knn w.. hoe dan vervolgens selectie (volledig of trager) is f: beginfrequentie allel + grootte populatie

Praktijk opletten met matador effect = vertraging van de daling

Fokadvies

9

2. Geringe diversiteit in het ras(lijn) o Veel rassen bestaan uit relatief beperkt aantal dieren en systemisch dragers uit de

fokkerij weren is dan niet handig… men kan anagetast dier in fok houden ovw dat dier enkel x homzygoot normaal dier gekruist wordt geen bijkomende aangetaste dieren w gefokt en de spreiding van dit allel op de boet gevolgd (DNA test)

3. Hoge frequentie vd aandoening o Sommige rassen is de afwijking zo frequent dat het uitgesloten is om enkel met normale

dieren te fokken wil men de genetische diversiteit behouden… Dobie 35-70% homo vr VwF mutatie ↔ DNA test Dalmatier urolithiasis Bedlington terrier: ziekte van Wilson (koperaccumulatie) Katten 38% perzen PKD

4. Genetische heterogeniteit

o Erfelijk defect kan worden veroorzaakt dr Δ mutaties met overerving vh kenmerk bij de

ene familie/ras/soort recessief en bij de ander dominant ?

Δ types defecten in hetzelfde gen

Defecten in Δ genen met hetzelfde fenotype tot gevolg

o Belang voor DNA testen die vaak mutatie specifiek zijn ↔ interpretatie..

o Er zijn genen die ↑ gevoelig zijn voor mutatie en kennen drd ↑ genetische

heterogeniteit:

Bloedstollingsfacotren 8 en 9 hemofilie A/B

VwF

Ziektes komen bij tal van rassen voor maar vaak rasspecifieke mutatie:

Rhodesian Ridgeback: gen F-IX missense mutatie met glycine omgezet in

glutaminezuur

Labrador: deletie ganse gen F-IX

Aandoening hemostase: vWf met Mucosale bloedingen, bloeduitstortingen en 3 types: - Type 1 = meest voorkomende met volledige afwezigheid van vwf multimeren en totaal vwf

- Type 2 = deficiëntie plasma vWF – duiste pointers

- Type 3 = letaal met totale afweigheid vwf

Severed combined immunodeficiency (SCID) - Heterogene groep van genetische defecten gekenmerkt dr ernstige abnormaliteiten in zowel de

humorale als cellulaire imm respons

- Meest voorkomende vorm = X chromosoom gebonden recessief

- Kliniek: ↑ gevoeligheid chronische en dodelijke infecties vroeg in het leven

Idiopathische epilepsie - Alle rassen start 1-3 jaar 5%

- Erfelijke aanleg + heterogene overering en soms polygenisch/multi

- Erfelijkheidsgraad in enge zin w geschat op 0,7 – 0,9; Belgische tervuren h2 =0,75 – hier 1

hoofdgen en aantal minor genes + milieufactoren

Progressieve myoklonische epilepsie van Lafora bij de miniatuur teckel - Epm2b-gen door expansie van een herhalingssequentie

4. Multifactoriële overerving

- HD met naast genetische invloed ook milieufactoren (voeding, intensiteit beweging)

Fokadvies

10

- Schattingen erfelijkheidsgraad variëren enorm ss studies – geschat 20-40%

- Complicaties:

o RX beoordeling subjectief

o Δ erfelijkheidsgraad ss rassen

- Tot 20 Δ loci betrokken bij DH + 1 hoofdgen berekening genomische waarde + bepaling vd

norberghoek (beter dan enkel rx..)

o Norberghoek = middelpunt heupkoppen waarvanuit lijn langs voorste rand heupkom

hoek welke min 90o = de norbergerhoek vr dat gewricht li en re optellen

5. Milde aandoening ne/of laattijdig optreden

- Urolithiasis dalmatier en milde vorm vwf, PRA, cataract

- Probleem: er zijn al nakomelingen wnn defect aan het licht komt

- PRA = progressieve retina atrofie:

Groep van afwijkingen met zeer heterogene genetische basis (>50 genen)

Overwegend monogenisch met Δ genen verantwoordelijk vnl autosomaal recessief

(enkele dominante x gebonden Husky)

Rasspecifieke defecten allelen ↔ DNA test per ras

Kliniek: bilaterale nachtblindheid geleidelijk verlies dagzicht + evt volledige blindheid

o Verlies staafjes kegeltjes apoptotische celdood neurale retina

o 3 groepen:

Vroege types ERG nooit normaal

Middelste type: ERG abno vanaf enkele mnd

Late types = normale ontwikkeling dan degeneratie

- Cataract = genetisch heterogeen met Δ etiologie ss rassen

o Behoorlijk wat vormen zijn dominante overerving of secundair aan diabetes/PRA

o Een van de meest frequente voorkomende oogziekten bij rashonden ↔ fokkers zien

geen prioriteit in selecteren tegen wrss vanwege late optreden en chirurgie

voorhanden

o Rassen: terrier, poedel en spaniel

- PKD bij pers

o Cysten op de nieren, lever en pancreas en is autosomaal dominant

o 38% van de perzen zijn positief voor PKD

o Oorzaak = nonsense mutatie PKD1 gen en uit studie blijkt alle aangetaste dieren

heterozygoot zijn wat betekent dat homozygoot embryonaal letaal is

o PKD kent grote variatie wat betreft ernst en progressie ziekte – duidt op bijkomende

modificcerende genen en of omg factoren

o Frequentie PKD kan teruggedreven w dr DNA test + ultrasound alvorens te kweken

o Fokken met twee + dieren gebeurt regelmatig:

Nog geen kliniek

Veel fokkers niet bewust van bestaan PKD

DNA te duur

Fokbeslissing alvorens adquate dx

Frequentie = hoog wrd verlies van fokpopulatie in gedrang komt

- Aantal aandoeningen lijken mild omdat zwaarste sn bij homo – maar vaak is kenmerk behorend

bij homozy is onderdeel rasstandaard: brachyurie bobtails, merle en harlekijnpatroon…

o Korte staart = drager dominante T allel Tbox gen homo TT niet leefbaar

Fokadvies

11

o Kat Manx – dominante mutatie M rumpy<riser<stumpy

o Rumxrum en risx ris vermijden = homo MM letaal

- Pelger Huet anomalie: nucleaire hyposegmentatie en w voorgesteld als niet pathologische

afwijking neutrofielenontwikkeling – niet correct, homoz = letaal in utero en alle levenden zijn

heteroz

o Chromatine = compact en korrelig

o Overerving autosomaal dominant – onvolledige penetrantie

o Geen kruising ss 2 PH

o DX: microscopische analyse bloeduitstrijkje nucleaire hyposegmentatie

6. Het type van overerving is niet gekend

- Verschillende aandoeningen hebben gelijkaardige/algemene sn en zijn niet van mekaar te

onderscheiden

- Hetzelfde gendefect kan Δ sn veroorzaken

- Autoimmun die allergische reacties en huidaandoeningen veroorzaken

H5 Fokadvies

Doelstelling:

I. DDX – bepaling fenotype

II. Bepaling of het defect (kenmerk) erfelijk is

Milieuinvloeden (fenokopieen)

Analse matched controls

Bepalen of het kenmerk familiaal of rasgebonden is

Bepalen van het type overerving via stambomen, testkruisingen

III. Bepaling manier van overerven: eenvoudig vs complex

IV. Stamboomanalyse evt + risiscobepaling obv populatiegegevens

V. Frequentiebepaling aandoening in de populatie-

- Gefundeerd oordeel vellen = praktijkstudies en om die uit te voeren is inzicht in mendeliaanse

overerving, populatiegen en elementaire statistiek nodig

- Wnn genen sskomen in de etiologie van defect/ziekte dan w aangenomen dat de kans dat x

aangetast is groter is wnn ↑ verwatnschap

o Families/rassen

o MAAR geen strikt bewijs –bijv milieufactoren…

Stap 1: uitschakelen milieufactoren of in aanmerking nemen (vergelijkbare controle individuen) - Vastleggen van fokdoel (uiterlijk, type?) - Analyse stamboom - Geef informatie over erfelijke aandoeningen in het ras en/of betreffende lijn - Geef info over frequentie aandoeningen in het ras (meestal niet voorhanden ) - Zijn er DNA testen beschikbaar? - Stel degelijk fok/verkoopcontract op Het belang van DNA testen/ genotypering - Dragers identificeren wnn beide ouders drager 1/4e kans op aangetaste nakomeling - Ideaal: staat los van aan of afwezigheid stamboom Bloedgroepen - Vooral bij de kat van belang neonatale icterus (NI) kittens ↔ hond minder problematisch

Fokadvies

12

HOND - 8 hoofdbloedgroepen aangeduid met DEA (dog erythrocyte antigen): DEA1.1 DEA1.2 zijn vrl van

belang

- Honden knn positief zijn voor 1 van beiden, negatief kan tesamen <3

- Er is een afdalende dominantie: 1.1>1.2>1.3>1.4

- Geproduceerde As zijn IgM en IgG

- Bepalen DEA1.1 door kit obv monoklonale antilichamen in agglutinatiereactie positieve rbc

agglutineren binnen 2 minuten oiv het monoklonaal

- Acute hemolytische reacties = DEA1.1. en DEA1.2 negatieve dieren – hebben geen natuurlijke As,

dus reactie is pas na meermalig contact met het Ag

- Neonatale icterus is beschreven bij kruisingen ss DEA1.1. negatieve teven x DEA1.1. + reuen

KAT - 1 bloedgroep AB systeem welke van belang is:

o katten met A bloedgroep bezitten N-glycol-neuroaminezuur (Neugc) in RBC membraan

o Katten met B bloedgroep bezitten N-acetyl-neuraminezuur (NeuAc) in RBC membraan

o Katten met AB bezitten gelijke hoeveelheden van beide

- B katten bezitten geen functioneel hydroxylase enzym dat N-acetyl-neuraminezuur (NeuAc)

omzet in in het N-glycol-neuroaminezuur (Neugc)

Dus is B een mutant allel van A en is A dominant over B

AB overerving nog niet duidelijk, mr dus ≠ zeker heterozygoot, freq algemeen AB ↓

- 3 allelen erkend met volgende afdaling qua dominantie: A>aab>b

- 95% B katten bezit natuurlijke As tegen A, dit zijn IgM en zijn sterke agglutininen en hemolysineB

o B Kat + 1 ml A bloed = shock met binnen enkele minuten hypotensie, defecatie, braken,

HBemie, AHsst

- A katten bezitten natuurlijke As tegen B, dit zijn IgG en IgM, zijn relatief zwak agglutininen en

hemolysinen wrd mildere reactie

Vooraleer transfusie check compatibiliteit ss donor (RBC) en receptor (As)

A kater x B katting = NI

Voornaamste fokkenmerken:

Uiterlijk

- Vormen de basis van de rasstandaard- velen zijn mono/polygenisch en sterke selectie is mogelijk

- Kenmerken mbt conformatie bijv grootte vertonen continue variatie, het zijn multifactoriële

kenmerken met ↑ erfelijkheidsgraad – en redelijk makkelijk qua selectie

- Pelskleur en haartype bepaald dr aantal genen

o Korte haren = wild type allel vr de 3 fibroblast groeifactoren: FGF5, RSP02 en keratine 17

o Sfinx en devon rex is mutatie Keratine 17 gen

o Zoals eerder vermeld vertonen nogal wat genen die de pelskleur bepalen ene pleiotroop

effect met negatieve gevolgen gezondheid

Merle homozygoot semi letaal: veroorzaakt lappenpatroon zwart/grijsblauw

Heterozyg Mm is merle

Homozyg MM is nagenoeg volledig wit, blauwe iris, microoftalmie, doof,

steriel

Liefst Mm x mm paringen

Collie, shetland sheppie teckel en corgi

Fokadvies

13

S gen betrokken bij doofheid

Harlekijn homo letaal

Duitse/deense dog: genotype MmHh en merle = Mmhh

Dilutie = alopecie dobie

Dilutiegen D

Dilutiegen CN wat verblekend effect geeft van zowel eumelanine als

pheomelanine CN zet zwarte kleur om in grijs en rood naar

beige+neustop lichtbruin

o CN is semiletaal – neutrofielendeficientie bij homoz

Temperament

- Werkhonden, politiehonden

- Reukzin: bepaald dr genen coderend voor olfactor rec

Genen behoren tot G proteïne gekoppelde receptoren = grootste familie genen ih genoom

dus moeilijk te onderzoeken

Overgrote deel vd kenmerken is multifactorieel

- Pelskleur:

Werden al eerder in verband gebracht met de ontw v/e aantal afwijkingen

Labrador + gedragissue + vergelijking 3 haarkleuren: zwart, geel, choco blijkt geel ↑ agressief

dan choco – 3 verklaringen:

o Associatie is toeval

o Gen met invloed oh gedrag is chromosomaal gelinkt aan kleurgen

o Het kleurgen heeft tevens een impact op gedrag

- BSL = breed specific legislation is lijt met rassen in VS die niet meer gehouden mogen worden

zoals pitbull, bulldog, dobie, rottweiler, mastiffs…

o Springer spaniel staat er niet in terwijl wel vaak agressief – Δ in hoeveelheid NT (↓5-HT

en DA) wijst naar genetische oorzaak wrss monogenisch

- Onderzoeken naar intelligentie, gehoorzaamheid e.d.

- Genen verantwoordelijk voor gedragsissues: D4 dopaminereceptor

- Genoomsequentie hond wrd andere benadering

Erfelijke aandoeningen zie punt 4

Farmacogenetica

- De manier waarop een mens of dier reageert op gm kan beschouwd worden als een

multifactorieel kenmerk beïnvloed door omgeving + genen

- De reactie van dier of mens op medicatie is moeilijk te voorspellen - en zo blijkt uit studie VS

naar ADR’s (adverse drug reactions) dat β blokkers bij 1/3e vd patiënten ineffectief alsook

antidepressiva bij 50% vd patiënten

- Maw: geneesmiddelen hebben op de ‘gemiddelde’patiënt een goede reactie

- Katten en honden: NSAID bijv caprofen

Waaraan dus duidelijke noodzaak ishet ontwikkelen van methoden im ADRs te

voorkomen dit is het terrein van

o Pharmacogenetica: de studie vd erfelijke overdracht van Δ in GM metabolisme en reactie

op toediening GM

o Pharmacogenomics: de studie vd genen die het effect van GM beïnvloeden

Wat veroorzaakt het verschil in werking v/e stof in Δ individuen?

Fokadvies

14

Genetische variatie ss individuen:

a. Transport: Normale werking eiwit dat actieve stof nr doelcel/weefsel brengt is

verstoord

b. Activatie: enzymen die het bestanddeel dienen te activeren weken niet zoals het hoo

c. Eliminatie: enzymen/ eiwitten die bestanddeel afbreken/verwijderen werken niet

d. Interactie: de receptor waarmee bestanddeel bindt is Δ/afwezig.verkeere plaats

e. Tolerantie: variatie in de genen verantwoordelijk voor immuniteit knn ervoor zorgen

dat actieve stoffen niet of slecht worden verdragen door lichaam

Welke genen zijn betrokken bij het metabolisme van GM? 1. Cytochroom P450 genfamilie vormt een vd belangrijkste groepen genen betrokken bij

metabolisme gm en toxische stoffen

o Aantal Δ P450 genen Δ ss specie dong 60-300

o Genproducten zijn enzymen die behoren tot de groep van mono oxygenasen en allemaal

1 of meerdere haem ringen

o Expressie genen = lever

o = 1ste verdedigingslinie tegen vreemde stoffen met hydroxylatie, dehalogenatie,

dealkylatie detoxificatie

o Veel van deze genen w gekenmerkt dr ↑↑ graad van polymorfisme (variatie) wat zich

uit in effect van medicatie

Warfarine: - Antistollingsmiddel dat blokkeert vitamine K welke essentieel zijn voor de stollingsfactoren om te

functioneren

- Hoe?

Vitamine K is een cofactor vd carboxylatie wrbij bepaalde glutaminezuren (glu) w omgezet in

gamma-carboxyglutaminezuur (gla) onder begeleiding van het enzym: y-glutamylcarboxylase

Gevolg: stollingsfactoren knn calcium binden wat de initatie vd bloedstolling is

Vitamine K w tijdens carboxylatie omgezet in vit K epoxide recyclage dr enzym epoxide

reductase

Warfarine is structureel gelijkend aan vitamine K en bindt met epoxide reductase en

inhibeert de recyclage ↑↑ vitamine K epoxide en ↓↓ vitamine L

- Warfarine resisitente dieren: best gekende is autosomaal recessief en veroorzaakt dr mutaties ih

gen voor epoxide reductase ↓ affiniteit vr warfarine en vitamine K homozygote dieren

hebben een ↑ behoefte aan vit K in de voeding (x20) om te compenseren

Beagles: - mutatie CYP1A2 gen welke w aangemaakt in de lever en is betrokken bij hydroxylatie –

homozygote zijn PM poor metabolizers (40%)

- mutatie CYP2D15 wrd andere metabolisatie van celecoxib (NSAID)

2. N-acetyltransferase

o Van belang voor acetylaties – mutante allelen resulteren in vertraagde deactivatie van

sulfonamiden, dapsone etc

o Kat heeft NAT, hond is negatief en dus hypergevoelig voor sulfonamiden

3. Thiopurine S-methyltransferase

o Thiopurines w gebruikt in azathioprine als cytotoxische agentia bij tx neoplasie

Fokadvies

15

o Mutaties bij de kat in TPMT 56% - ↓ activiteit in de rbc

4. Multidrug resistance gen 1

o Bekendste voorbeeld ADR hond = ivermectinegevoeligheid ruw/gladharige collies

MDR1gen welke codeert voor P glycoproteine van belang voor transport t.h.v BBB

o Oorzaak overgevoeligheid: deletiemutatn in het MDR1 gen wrd geen functioneel P

glycoproteine

o Mutatie heeft ↑ frequentie met 30% homoz en 40% hetero

o Mutatie = partieel dominant, hetero gevoeliger dan homo

o DX: DNA test MDR1 gen

5. Multifactorieel effect:

o Meestal zijn het meerdere genen + milieueffecten met normaalverdeling vd plasma[] vd

actieve stof. Probleem is dat men vooraf niet weet waar patiënt in curve thuishoort en

wat het effect dus gaat zijn van de actieve stof

Hoe zal genvariatie gebruikt worden om de reactie op toediening van een chemische stof te voorspellen? - Momenteel velen studies naar genetische Δ i/h genoom van de kat en hond te identificeren en

catelogeren

- Er wordt vrl gekeken naar SNP’s = single nucleotide polymorfisme wat een verzamelnaam is vr

alle substitutiemutaties met bi-allelisch karakter

- Deze snips knn gebruikt w als diagnostisch middel om de reactie van een individu tegenover een

gm te voorspellen

- Hiervoor moeten snips voro ieder individu in grote getalen getypeerd w DNA microarray

technologie om SNP profiel op te maken

Wat zijn de verwachte voordelen van pharmacogenetica? - Het houdt de belofte ooit medicijnen te ontwikkelen die aangepast zijn aan de genetische

samenstelling v/e individu wrd ADR effect vermeden wordt en ↑efficaciteit v/h gm

Efficiëntere medicatie: medicijn ontwikkeling obv proteinen, enzymen en RNA geassocieerd

met bepaalde ziekten wrd meer specifiek en dus ↑ therap effect en ↓ schade omliggende

celletjes

Ipv trial and error methode vh SNP profiel zal nu gerichte therapie de methode zijn, wat de

herstelperiode inkort

Leeftijd en gewicht voor bepaling dosis zal vervangen w dr dosis bepaald obv genetisch

profiel ↔ ↓ overdosage

Genetisch profiel kennen op jonge lft levensstijl en omgeving kan aangepast w om

genetisch defect te minimaliseren

Verbetering in de ontwikkeling en testen van nieuwe medicijnen, met ↓ kosten en risico’s

↓ vd algemene kosten dr alle bovenstaande

Betere kennis genetische samenstelling v/e individu moet het ook toelaten om efficientere

vaccins te ontwikkelen (DNA/RNA vaccins)

Wat zijn de limiterende factoren van farmacogenetica?

Staat in de kinderschoentjes

Alle SNP’s moeten gevonden worden (1 per 300bp 3x109 bp… 107 Δ SNPs per soort…) +

variaties in meerdere genen tegelijk

Fokadvies

16

Er zijn vaak maar beperkt aantal medicijnen, als geen een ideaal voor individu houdt het

alsnog op

Farmaceutica verdient geld, en medicatie doet op zich zijn gemiddelde werk waarom extra

kosten

Extra diagnostische stap betekent ↑ kennis DA van genetica

H6 Praktische toepassingen

Het herkennen van dragers - De stille spreiding van recessieve mutante allelen persisterend in heterozygote dragers kan

behoorlijke problemen opleveren vooral wnn veelvuldig gebruikt in fok (matador effect) =

veelvuldige spreiding genen bijv via KI

o Er zijn rassen wr reu > 100 worpen heeft voortgebracht en er zal pas probleem aan het

licht komen wnn hetero x hetero homozygoot recessief nakomelingetje

- Selectie tegen recessieve allelen enkel op basis van fenotype is niet voldoende want mist dragers

(heterozygoten)

- Hoe dan wel?

1. Goedkoopste is stamboomanalyse mr niet altijd bruikbaar want niet altijd gegevens

2. Proefkruisingen: testkruisingen met de te onderzoeken ouder

o Homozygoot recessief individu dd x Nd (ervanuit gaande dat teo drager is):

2 normale + 2 aangetaste is de verwachting

Kans op geen detectie bij 1 nakomeling is dus 50% en 2 nakom = 25% in ieder

geval is er nooit 100% zekerheid

Maar wel meest efficiënt!!!

o Gekend heterozygoot individu Nd maal ouder Nd met 3/4e normale nakomelingen, kans

op niet detectie = (0,75)n

o Eigen nakomelingen hier is de toestand gecompliceerder, de teo heeft al nakomelingen

= teslt voor alle ongewenste genen met kans op niet detectie = 0,875)n

o Ad random gekozen individu

Maar in praktijk niet altijd mogelijk, bijv te kleine populaties en ↓ medewerking

fokkers

+ steeds nakomelingen vooraleer conclusie genotype

Resultaat kan twee van de volgende zijn:

Nakomeling is aangetast en dus dd en 1 d is sowieso afkomstig van ouder

die Nd is

Nakomeling is normaal afkomstig van:

Ouder die homo NN is

Ouder die Nd is en dus een drager en bij toeval niet ontdekt

3. DNA testen

a) Genotypering = beste manier om dragers (heterozygoten) te onderscheiden van beide types

homozygoten, de allelen knn van elkaar onderscheiden w obv sequentie samenstelling

Belangrijkste beperking: vele defecten of kenmerken is de oorzakelijke mutatie nog

niet gekend, maar wat betreft monogenetische defecten is er vooruitgang!

Methode = PCR-RFLP (restrictie fragment lengte polymorfisme): door mutaite kan er

een RE (restrictie enzym) vernietigd of gecreëerd worden met een Δ in lengte vd

ontstane en originele restrictie fragmenten tot gevolg.

Fokadvies

17

Een stukje DNA waarin het te detecteren mutatie vervat zit wordt via PCR

geamplificeerd en behandeld met RE fragmenten worden gescheiden en

gevisualiseerd op agarosagel bandenpatroon en zo kan men onderscheid maken

ss de 3 genotypen

Praktijk: DNA testen op bloedstalen, haarwortels of mondswabs

b) Marker assisted selection (MAS)

o Oorzakelijke mutatie is niet gekend onrechtstreekse DNA test die gebruik maakt van

DNA merker die chromosomaal sterk is gelinkt met ziekte en dus MAS genoemd

o Stoelt op principe van linkage analyse – hoe dichter bij mekaar gelegen genen hoe ↓

kans op overkruising/recombi

o Voorbeeld: Wilson ziekte Bedlington terriers = autosomaal recessief met stapeling koper

en leverproblemen

25% aangetast en 50% drager mutante allel

Linkage analyse toonde dat gen gelegen is op chromosoom 10 en in bepaalde

regio

Sterk gelinkte DNA merker met allelen 1 en 2 werd gebruikt in MAS homo 1 1

en heter 1 2 bleken in 96% normaal, terwijl homo 2 2 aangetast. Het is dus

merker allel 2 die gelinkt is aan mutante allel en allel 1 aan wild type en dus zijn 1

2 dieren heterozygoot drager

o MAS is vrl interessant voor multifactoriële aandoeningen en kenmerken wrv in de

meeste gevallen geen oorzakelijke mutaties zijn gekend

Identificatie – controle op de stamboekwerking

- Goed fokadvies staat of valt met de betrouwbaarheid van de afstamming gegevens

- Tegenwoordig: lengtebepalingen microsatelieten, de gebruikte satellieten zijn op Δ

chromosomen gelegen wrd ze onafh overerven

- KMSH wr stamboeken verplicht om bij elke worp DNA profiel minstens 1 pup te bepalen en te

vergelijken met ouders (kat geen verplichting)

- Lengtebepaling van microsatellieten gebeurt via PCR en scheiding van fragmenten in PAGE

- Meeste microsatellieten zijn deze met een herhaling van dinucleotide CA – Can met n = 4 tot 40

Fokadvies in de praktijk

- Fokker zoekt naar reu of teef en keuze meestal obv gemak, kostprijs, stamboom (aantal

kampioenen), aantal nakomelingen, voorouders

- Op zichzelf zijn deze criteria niet voldoende, het zegt niks over de kwaliteiten of gebreken met

zou ook rekening moeten houden met: Gezondheid, temperament, kwaliteiten in nakomelingen.

- Aan te raden: maak lijst van 10 fokdieren en maak lijst per dier met kenmerken met selectie obv

o Freq gewenste kenmerken bij voorouders (min 3 generaties)

o Frequentie gewenste kenmerken bij nestgenoten

o Aantal dragers en aangetaste nestgenoten en voorouders

o Aantal nakomelingen geproduceerd met gewenste kenmerken

Schema om genetisch fokadvies te geven aan fokkers:

- Wat is het fokdoel mbt gezondheid, conformatie, temperament en performantie

- Beschrijf genetische problemen eigen aan ras

- Beschrijf en beveel testen aan

- Verzamel fenotypische en genotypische informatie dichte verwanten

Fokadvies

18

- Ga na of er schattingen zijn vd erfelijkheidsgraad van de kenmerken die de fokker waardevol acht

- Evalueer – en + kenmerken in 3 generaties voordien

- Bereken kans dat pups voldoen

- Wnn risico op gen defecten > kans bekomen superieure pups stel alternatieven voor

- Maak fokker attent op maken van goede contracten bij plaatsen pups

Potentiele rol fokverenigingen bij terugdringen genetische defecten

- Ierse setter club UK CLAD DNA test verplicht wnn kweken en dragerxdrager w afgeraden,

dragerx normaal mag wnn pups dna test ondergaan

Examenvragen

1. Bloedtransfusies kan bij katten ernstige problemen veroorzaken, verklaar

2. De reactie van een patiënt op de toediening van een GM kan vanuit genetisch standpunt

beschouwd worden als een multifactorieel kenmerk, verklaar

3. H1 Lijnenteelt wordt veel toegepast in de fokkerij van KHD. Is dit verantwoord, specificeer

4. H1 Weeg de voor- en nadelen van lijnenteelt af tegenover uitkruisen

5. Hoe wordt het best te werk gegaan bij het selecteren van geschikte fokdieren

6. De erfelijkheidsgraad van ‘moed’ bij de DH werd in een studie geschat op 0,26.

a. Wat betekent dit?

b. Wat betekent dit voor andere rassen?

7. Vanuit het standpunt van de fokkerij knn genetische defecten in twee grote groepen worden

ingedeeld

a. Welke?

b. Hoe kan binnen elke groep de frequentie vd defecten worden teruggedrongen? Stip

daarbij de moelijkheden en kanttekeneningen aan

8. Wat is het belang van de effectieve populatiegrootte mbt de gezondheid van een populatie/ras

en welke factoren spelen hierbij een belangrijke rol? En hoe past genetische drift in dit verhaal?

9. Wat zijn de te verwachte voordelen vd toepassingen van de farmacogenetica tegenover de

situatie?

10. Behoorlijk veel collies zijn ivermectine overgevoelig. Waardoor wordt dit veroorzaakt?

Fokadvies

19

Deel gentherapie:

Bespreek kort hoe gentherapie en RNAi werken. Welke van de twee is volgens u het meest efficiënt en verklaar One strategy uses antisense specific to the target gene to disrupt the transcription of the faulty gene. Another uses small molecules of RNA called siRNA to signal the cell to cleave specific unique sequences in the mRNA transcript of the faulty gene, disrupting translation of the faulty mRNA, and therefore expression of the gene.

Gentherapie: Bij gentherapie breng je een functioneel gen of een genfragment in bij een patiënt om

zo fouten te herstellen of om de cel een nieuwe functie te geven. Oftewel het gebruik van

nucleïnezuren ter behandeling of preventie van erfelijke of verworven aandoeningen. Het is een

genezende therapie.

- - - - - - - -

Verschillende principes: 1. Genadditie: Bij genadditie wordt een extra gen ingebracht in de cel. Dit gen wordt

vervolgens vertaald in het eiwit dat in de zieke cel niet of onvoldoende aanwezig was. Zo kan het eiwit zijn genezende functie uitvoeren. Er is een mogelijkheid dat het nieuwe gen zich inplant in het chromosoom van de ontvangende cel, waarna het als een nieuw kenmerk wordt doorgegeven aan de dochtercellen. Zelfs als het zich niet integreert in het chromosoom van de doelwitcel kan het bij niet-delende cellen (zoals spier- of levercellen) aanleiding geven tot langdurige genexpressie. In delende cellen zal het toegediende gen geleidelijk verdwijnen waardoor genexpressie gradueel vermindert.

Monogenische aandoeningen 2. Genetische vaccinatie: gen gebruiken dat codeert voor antigen en deze steek je in een

plasmide. Plasmide breng je in de cel en wordt omgezet in mRNA cel produceert viraal proteïne en viraal Ag waardoor verbeterde respons op virale infectie

Virale en bacteriële infecties (kanker) 3. ‘Suicide gentherapie’: Het inbrengen van genen in tumorcellen die de code bevatten voor

een bepaald enzym. Dit enzym is in staat om een bepaalde stof, die na de gentherapie wordt

geïnjecteerd, om te zetten in een gifstof. Op deze manier doden de tumorcellen zichzelf,

terwijl de rest van het lichaam onbeschadigd blijft. Deze vorm van lokale chemotherapie

wordt ook wel 'zelfmoord'-gentherapie genoemd.

Kanker: Het ontwikkelen van gentherapie voor kanker is erg ingewikkeld omdat er meer dan één gen defect is. In kankercellen is gemiddeld 30 procent van de genen defect. Bij kanker is sprake van ongecontroleerde groei van lichaamscellen, waardoor een tumor kan ontstaan.

Hoe bekom ik grote hoeveelheden van mijn DNA therapeuticum? - Aanmaak van pDNA met doelwitgen:

Fokadvies

20

1. Gen in plasmide dat codeert voor eiwit dat zorgt voor Ab resistentie 2. Gezond gen zonder mutatie uitknippen met restrictie enzyme 3. Gezond gen inbrengen in plasmide plasmide in bacteriën (amplificatie organisme)

kloning op antibiotica medium waar xxx bacteriën enkel deze dankzij Ab resistent gen en dus meer plasmide met interessante gen

4. In cultuur brengen en DNA purificatie - virus of mRNA:

1. bacterie + plasmide met gekloond normaal gen + inactief retrovirus gen in virus

RNAi = Genonderdrukking: Doel:

Onderdrukken van virale genen Onderdrukken van oncogenen Onderzoek naar de functie van genen (“functional genomics”)

Hoe: a. RNAi = RNA interfering

ER zijn twee types RNA betrokken bij RNAi: siRNA en microRNA.

RNA is het directe product van genen en kan binden aan mRNA moleculen en zo de activiteit van mRNA verhogen of onderdrukken.

RNA interferentie speelt een belangrijke rol in veel eukaryote cellen in de verdediging tegen indringers zoals bijv een virus en in regulatie van de genexpressie iha.

Initiatie van RNA interferentie vindt plaats door DICER, een enzyme (endoribonuclease) behorend tot de RNase III familie

DICER knipt dsRNA en microRNA (miRNA) tot korte dsRNA fragmenten bestaande uit 20-25 base paren lang met een overhang van 2 basen aan het 3'- einde = siRNAs.

Iedere siRNA wordt ontrold tot 2 ssRNAs: een passenger en guide strand.

De passenger strand ondergaat degradatie, terwijl de guides strand geincorporeerd wordt in RISC (RNA induced silencing complex).

De guide strand bindt aan complementaire sequentie van het mRNA dit induceert de afbraak van het mRNA door argonaute

b. Antisense oligonucleotiden: korte enkelstrengige DNA moleculen = uitschakeling van

bepaalde genen waardoor deze niet tot uitdrukking komen. Hoe: door

Fokadvies

21

complementaire (AT/CG) nucleinezuur die bindt met mRNA waardoor inactivatie want mRNA moet enkelstrengig zijn om translatie te doorgaan. Het gen is geinactiveerd. RNA interferentie is beter omdat hier niet altijd optimale complimentering

i. - Indicatie :Retinitis t.g.v. cytomegalovirus (HIV)

Hoe krijgt men nucleïnezuren in cellen? DNA en RNA - Grootte moleculen - Sterk negatief geladen - Geringe stabiliteit (snelle afbraak door nucleasen)

afgiftesystemen nodig om therapeutische nucleïnezuren in cellen te brengen Verdere uitdagingen op in vivo niveau - Gen of stukje DNA/RNA moet doelwitcellen bereiken - Gen of stukje DNA/RNA moet stabiel blijven in het lichaam (daarom in virus brengen) - 1 gram weefsel bevat ± 109 cellen => therapeutisch gen of stukje DNA/RNA moet ↑ cellen

bereiken Oplossing gebruik van “gendragers” = vectoren, afgiftesystemen, transfectanten of

fysische technieken Gendragers & fysische methoden 1) Afgiftesystemen op basis van virussen = virale vectoren - Gebruikte virussen:

Retrovirussen (lentivirussen zoals HIV)

Adenovirussen (Ad)

Adeno geassocieerde virussen (AAV)

(Herpes simplex virussen (HSV))

- Integratie in genoom => stabiele expressie

- Enkel transfectie van actief delende cellen, Uitz.: lentivirale vectoren transfecteren delende als niet-delende cellen

- Maximale omvang transgen (insert): ±9 kbp

- lage transfectie in vivo - wekt immuunrespons op

- Geen integratie in genoom => transiënte expressie

- Transfectie is onafhankelijk van de celcyclus

- Maximale omvang transgen (insert): ± 8 kbp

- hoge transfectie in vivo - wekt immuunrespons op

- Integratie in genoom of episomaal => stabiele expressie

- Transfectie is onafhankelijk van de celcyclus, maar beter tijdens celdeling

- Maximale omvang transgen (insert): ± 4,7 kbp (zijn klein)

- Hoge transfectie in vivo - zijn minder immunogeen

Fokadvies

22

Hoe worden virussen omgezet in niet schadelijke virussen om als virale vectoren te dienen?

Voor en nadelen virale vectoren:

Voordelen Nadelen

- Hoge transfectie efficiëntie - Transiënte of constitutieve expressie

- Immunogeen - Niet 100% veilig (recombinatie met wild type virus) - Insertionele oncogenese - Hoge productiekosten

2) Niet-virale vectoren Veel weefsels kunnen alleen worden bereikt door systemische toediening van de geneeskrachtige

stof (1). In het geval van mRNA is dat een probleem gezien de relatief geringe stabiliteit van het

molecuul. Bovendien is mRNA te groot en te negatief geladen om celmembranen te kunnen

passeren. Deze barrières kunnen worden overkomen door het gebruik van niet-virale

afgiftesystemen.

Algemeen:De delivery vectoren moeten het mRNA eerst condenseren tot een positief geladen

complex. In het geval van liposomen, gaat het kationische deel van de liposoom elektrostratische

interacties aan met het negatief geladen mRNA. Hierdoor raakt het nucleïnezuur gecondenseerd en

ontstaan compacte lipoplexen . Ook polykationen hebben een netto positieve lading waardoor ze in

staat zijn het nucleïnezuur te condenseren en polyplexen te vormen.

3) Fysische methoden - Gene gun doorheen huid en spier tot in cellen, vaccinatie varkens - Electroporatie: gaten maken in celmembraan d.m.v. stroom = in pulsen door de stroom

zulle geladen moleculen zich gaan herorienteren wrd openingen in de membraan ontstaan o Nadien herstellen de membraan zich weer, maar ondertussen in RNA wel binnen

Fokadvies

23

- Sonoporatie of ultrasound geassisteerde genafgifte waarbij geluidsgolven perforaties in de celmembraan veroorzaken en genafgifte kan plaatsvinden

Ex vivo (letterlijk: buiten het lichaam): artsen isoleren lichaamscellen van de patiënt en brengen die in een laboratorium in contact met het therapeutisch gen. De cellen die het genezende gen opnamen, worden opnieuw toegediend aan de patiënt. De ex vivo methode past men vooral toe op bloedcellen en beenmergcellen. In vivo (letterlijk: in het lichaam): artsen injecteren de vector met het gen in de bloedstroom van de patiënt. Het zoekt zijn weg naar de doelwitcel om zijn therapeutisch gen af te leveren. Als gentherapie de hooggespannen verwachtingen wil inlossen, moet in vivo therapie verder ontwikkeld worden tot een routinematige behandeling. Sommige onderzoekers gaan nog een stapje verder. Ze zoeken methoden om genen via een pilletje toe te dienen. “De reis” van therapeutische nucleïnezuren naar de celkern of cytoplasma van de doelwitcellen

Virussen ‘kennen de weg’ naar de celkern of cytoplasma Niet-virale afgiftesystemen ‘kennen de weg’ niet naar de celkern of cytoplasma en

Onderzoekers proberen ze daarom ‘intelligent’ te maken

Wat zijn de Δ cellulaire obstakels die een polyplex moet overwinnen vooral het DNA in het complex tot expressie kan komen. Welke van deze obstakels vormt het grootste probleem en verklaar - Extracellulaire injectie: extravasatie of IV - Intracellulair: 1. Binding aan het celoppervlak - De delivery vectoren moeten het mRNA eerst condenseren tot een positief geladen complex. - In het geval van liposomen, gaat het kationische deel van de liposoom elektrostratische

interacties aan met het negatief geladen mRNA. Hierdoor raakt het nucleïnezuur gecondenseerd en ontstaan compacte lipoplexen .

- Ook polykationen hebben een netto positieve lading waardoor ze in staat zijn het nucleïnezuur te condenseren en polyplexen te vormen

2. Cellulaire opname - Ook makkelijk, massale opname door positieve lading 3. Endosomale escape - Vrijkomen uit de endosomen om afbraak door lysosomen te voorkomen, hoe dit effectief

gebeurt is nog onbekend 4. Transport naar de nucleus - Dit is het grootste obstakel voor niet virale vectoren - Na cellulaire opname worden (de vesikels met) gendragers langs microtubili getransporteerd 5. Intranucleaire afgifte van het DNA - DNA moeilijk in de kern geraakt, maar dat je dat kan oplossen door gebruik te maken van mRNa

zodat het niet in de kern hoeft te gaan Therapeutische toespassingsmogelijkheden - Monogenetische, vasculaire, infectieuze, kanker en andere kunnen behandeld w met gentherapi - Gentherapie w vnl gebruikt voor tumoren Geregistreerde gentherapeutica vr DGK - 3 geregistreerde DNA vaccins en 1 DNA dat codeert voor GHRH (australie) - Principe DNA vaccin:

Ontstaan uit bacteriële plasmiden met Ag expressie site en bacteriële sequentie vr replicatie

Bacteriële plasmiden + vaccin on bacteriën wr amplificatie = kloning van plasmide

Fokadvies

24

DNA purificatie van bacterie dr splitsen van circulair plasmide van beel groter bacterieel DNA

Vaccin is klaar

Im toegediend want de huid is immunogeen dr ↑ [dendritische celln]

Mechanisme: o plasmide vector IC verwerkt tot peptiden MHCI presentatie CD8+ cytotoxic T

cells (CTL) cytolyse met vrijkomen van Ag o Presentatie MHCII Th cellen activatie (CD4+) B cellen activatie As

ontwikkeling Voorbeelden: 1. Apex-IHN® - profylactisch vaccin tegen “infectious hematopoietic necrosis virus” - Bied zalmen bescherming tegen infectie en symptomen wanneer ze bij besmette zalmen komen - IM injectie naakt pDNA - Op de markt in Canada (Aqua Health (Novartis)) - Puur plasmide DNA dus zonder carrier en werkt wnn IM in spiercellen waar omzetting naar

eiwitten - Efficiëntie is onderzocht bij zalmen dr 2 groepen + vaccin, 2 + luciferase en 1 co groep na 45dg

injectie virus met survival groep 1 en 2 = 78% tov 4, 1 en 0% 2. West Nile-Innovator DNA® - Prophylactisch vaccin tegen West Nile virus infectie bij paarden - IM injectie naakt pDNA met adjuvans MetaStim (op basis van een olie) - Marketed in USA by Fort Dodge Animal Health (recent van de markt genomen) 3. Kankervaccinatie: OnceptTM (Canine Melanoma Vaccine, DNA ) - Therapeutisch vaccin tegen canine melanoma - IM injectie van pDNA (naakt plasmide):

o Tumor Ag werkt op tumor cel en gewone cel o Therapeutische tumor Ag = immuunsysteem leren om tumor Ag terug aan te vallen o Melanoma = tyrosinase is tumor Ag = proteïne welke tot overexpressie komt o Er wordt plasmide gebruikt die codeert vr tyrosinase vd mens

- Geen genezing maar 3 maal langere overlevingsduur 4. Gendicine = het eerste aanvaarde gentherapeuticum (+radiotx) = humaan - First human therapy is approved in China in 2003 - Gendicine levert p53 tumor supressor genen via een Adenovirus vector - Lokale (herhaalde) injectie van adenovirale vector in tumor - >1500 patients treated, mostly for head and neck cancer - Werking: essentiele genen worden uit het virus weggehaald (geen deling) in de plaats word

P53 gen ingebracht inspuiten van virusdeeltjes in tumorcel + straling = GTRT beste resultaat 5. Beloftevolle studies KHD: tx van kanker via IL12 gentherapie - Bleomycine/IL 12 electrochemogentherapie

o IL12 gaat NK cellen stimuleren om tumor aan te vallen o Angiogenese in tumor wordt onderdrukt

- Injectie van plasmide die codeert vr IL12 en bleomycine electroporatie wrd ↑ permeabiliteit en intrede cel

- 3 vd 5 patiënten genezen d.m.v. il12 gentherapie

Waarom is volgens u DNA vaccinatie realistischer in levende dieren dan bijvoorbeeld correctie van een mutant gen in de pancreas Is dat niet omdat je om te vaccineren gewoon om het even welk celtype kan gebruiken als doelwit, het moet toch maar het antigen produceren, niets meer? Om de pancreas te corrigeren, moet je immers de cellen van dat orgaan kunnen bereiken met je gecorrigeerd gensegment (in vivo) en hopen dat het er geraakt... Ofwel kan je trachten ex vivo de cellen te corrigeren en dan inspuiten,

Fokadvies

25

hopen dat ze de gewenste cellen gaan bereiken en daar gaan koloniseren. Dat blijkt voor vele organen niet mogelijk. Ik combineerde slides 7 en 18.

Leg kort uit wat genetische vaccinatie is en geef één voorbeeld van een genetisch vaccin dat in de diergeneeskunde wordt gebruikt. - Het vaccin bevat DNA met zijn gen en expressie site. Parenterale injectie transfectie in de

cellen gastheer waar expressie van het gen en productie van Ag met een humorale en cellulaire reactie tot gevolg.

- Ontstaan uit bacteriële plasmiden met Ag expressie site en bacteriële sequentie vr replicatie - Bacteriële plasmiden + vaccin on bacteriën wr amplificatie = kloning van plasmide - DNA purificatie van bacterie dr splitsen van circulair plasmide van beel groter bacterieel DNA - Vaccin is klaar - Im toegediend want de huid is immunogeen dr ↑ [dendritische celln] - Mechanisme:

o plasmide vector IC verwerkt tot peptiden MHCI presentatie CD8+ cytotoxic T cells (CTL) cytolyse met vrijkomen van Ag

o Presentatie MHCII Th cellen activatie (CD4+) B cellen activatie As ontwikkeling

- Kankervaccinatie: OnceptTM (Canine Melanoma Vaccine, DNA ) - Therapeutisch vaccin tegen canine melanoma - IM injectie van pDNA (naakt plasmide):

o Tumor Ag werkt op tumor cel en gewone cel o Therapeutische tumor Ag = immuunsysteem leren om tumor Ag terug aan te vallen o Melanoma = tyrosinase is tumor Ag = proteïne welke tot overexpressie komt o Er wordt plasmide gebruikt die codeert vr tyrosinase vd mens

- Geen genezing maar 3 maal langere overlevingsduur