basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
32
basistechnieken van de recombinant-DNA- technologie door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven Deel 2
description
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie. Deel 2. door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie. DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning - PowerPoint PPT Presentation
Transcript of basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
door Peter RoelsMonitoraat Wetenschappen
K.U. Leuven
Deel 2
• DNA-dubbelhelix
• inleiding: 3 pijlers
• restrictiefragment-lengtepolymorfisme
• Southern-vlektechniek
• genkloning
• polymerase-kettingreactie
• DNA-sequentiebepaling
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
polymerase-kettingreactie
DNA-dubbelhelix
RENATURATIESTAP 40-60°C
enkelstrengs DNA+ primer
5’...ATTCGCTCGCAATATAGATCTC 3’3’ GCGTTATATCTCGAG 5’
DENATURATIESTAP 92°C
enkelstrengs DNA
polymerase-kettingreactie
DNA-dubbelhelix
RENATURATIESTAP 40-60°C
enkelstrengs DNA+ primer
DENATURATIESTAP 92°C
enkelstrengs DNA
POLYMERISATIESTAP 72°C
bijna voltooide DNA-dubbelhelices
polymerase-kettingreactie
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
nieuwe streng
polymerase-kettingreactie
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
nieuwe streng
polymerase-kettingreactie
polymerase-kettingreactie
polymerase-kettingreactie
polymerase-kettingreactie
polymerase-kettingreactie
cyclus gewenste fragmenten totaal aantal ds % gewenst/totaal
1 0 2 0
2 0 4 0
3 2 8 25
4 8 16 50
…
20 1.048.536 1.048.576 > 99,9
30 1.073.741.764 1.073.741.824 >>99,9
polymerase-kettingreactie:meer over primers…
5’ …GCGGTGCAAG… 3’3’ CACGT 5’ 45°Cspecifiek
3’ CACGT 5’5’ …GCGGTGCAAG… 3’ 40°Caspecifiek
5’ …GCGGTGCAAG… 3’
3’ CACGT 5’
50°Cgeen
binding temperatuur
polymerase-kettingreactie:meer over primers…
geenpolymerisatie
5’ …GCGATGCAAG… 3’3’ CACGT 5’
nietcomplementair
aan 3’-einde primer
polymerisatie5’ …GCGGTGCGAG… 3’3’ CACGT 5’
nietcomplementair
aan 5’-einde primer
polymerisatie5’ …GCGGTGCAAG… 3’3’ CACGT 5’
complementair
PCR versus celkloning
PCR Celkloningsnel, makkelijk omslachtig
in principe vanaf 1 cel voldoende uitgangsmateriaal nodig
PCR versus celkloning
PCR Celkloningsnel, makkelijk omslachtig
in principe vanaf 1 cel voldoende uitgangsmateriaal nodig
kennis sequentie flankerende gebieden nodig
geen a priori kennis sequentie nodig
relatief korte fragmenten lange fragmenten
• DNA-dubbelhelix
• inleiding: 3 pijlers
• restrictiefragment-lengtepolymorfisme
• Southern-vlektechniek
• genkloning
• polymerase-kettingreactie
• DNA-sequentiebepaling
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
DNA-sequentiebepaling: reacties
5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’
stop A stop C stop G stop T
stop A
DNA-sequentiebepaling: reactiesstop A
5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’
+
polymerase
nucleotiden(A, C, G, T*)
primer (5’ ACCG 3’)
stopnucleotide A
stop A
5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCGTGACGAT 3’
3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCGTGACGAT 3’
3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCGTGACGAT 3’
3’ TGGCACTGCTA 5’
3’ TGGCACTGCTA 5’5’ ACCG 3’
3’ TGGCACTGCTA 5’5’ ACCG 3’
3’ TGGCACTGCTA 5’5’ ACCG 3’
5’ ACCG 3’ 5’ ACCG 3’ 5’ ACCG 3’
TGA TGACGA TGACGAT
stop A
5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCGTGACGAT 3’
3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCGTGACGAT 3’
3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCGTGACGAT 3’
3’ TGGCACTGCTA 5’
5’ ACCG 3’ 5’ ACCG 3’ 5’ ACCG 3’
5’ ACCG 3’ 5’ ACCG 3’ 5’ ACCG 3’
TGA TGACGA TGACGAT
stop A
DNA-sequentiebepaling: reacties
stop A stop C stop G stop T
DNA-sequentiebepaling: elektroforese
-
+
stop A stop C stop G stop T stop A stop C stop G stop T
DNA-sequentiebepaling: interpretatie
stop A stop C stop G stop T
5’ ACCGT
DNA-sequentiebepaling: interpretatie
stop A stop C stop G stop T
5’ ACCGTG
DNA-sequentiebepaling: interpretatie
stop A stop C stop G stop T
5’ ACCGTGA
DNA-sequentiebepaling: interpretatie
stop A stop C stop G stop T
5’ ACCGTGAC
DNA-sequentiebepaling: interpretatie
stop A stop C stop G stop T
5’ ACCGTGACG
DNA-sequentiebepaling: interpretatie
stop A stop C stop G stop T
5’ ACCGTGACGA
DNA-sequentiebepaling: interpretatie
stop A stop C stop G stop T
5’ ACCGTGACGA? 3’
DNA-sequentiebepaling: interpretatie
stop A stop C stop G stop T
5’ ACCGTGACGA? 3’3’ TGGCACTGCT? 5’
DNA-sequentiebepaling:cycle sequencing
simulatie
http://www.dnalc.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htm
DNA-sequentiebepaling:cycle sequencing
