Automatische analyse van dicentrische...

Automatische analyse van dicentrische

chromosoomaberraties voor het bepalen

van de opgelopen dosis tijdens een

stralingsaccident.

Eline CASTELEIN

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Anne VRAL

Vakgroep: Medische basiswetenschappen

Academiejaar 2015-2016

VOORWOORD

Zonder de steun van velen zou deze thesis niet tot stand gekomen zijn. Daarom zou ik graag

willen beginnen met een woord van dank.

Een eerste welgemeende dank-je-wel gaat uit naar prof. Dr. Vral. Tijdens mijn 1e masterjaar

heeft haar majorvak mij de nodige kennis bijgebracht om met voldoende inzicht aan deze

masterproef te kunnen beginnen. Ook daarna was zij steeds bereid om haar kennis en expertise

te delen. Ik wil haar ook bedanken voor het nalezen van mijn werk en het geven van feedback.

Daarnaast verdient uiteraard ook mijn begeleidster Julie Depuydt een woord van dank. Ondanks

dat zij het dit jaar heel druk had met het afwerken van haar doctoraat kon ik steeds bij haar

terecht met mijn vele vragen, voor het maken van grafieken en zoveel meer. Ik ben erg dankbaar

voor de nuttige feedback die ik steeds van haar gekregen heb.

Ook wil ik graag Leen bedanken. Ze was steeds bereid mijn vragen over de praktische

uitvoering van zaken in het labo te beantwoorden.

Annelot, bedankt voor al je hulp met het inscannen met de Metafer. Ook al ging het niet altijd

even vlot en staken frustraties de kop op, ik kon steeds rekenen op jouw geduld en

vastberadenheid.

Ik wil ook mijn medestudenten op het labo bedanken voor de aangename pauzes en babbels!

Uiteraard verdienen mijn ouders een bijzonder woord van dank, hun onvoorwaardelijke steun

tijdens mijn studie was essentieel voor mijn slagen. Bedankt om mij tijdens de moeilijke

momenten te steunen en mij altijd de moed gegeven te hebben door te zetten.

Tot slot wil ik mijn vriend Colin bedanken om mij gedurende mijn studiejaren te steunen.

Dankzij delen van je ervaring, jouw vele tips en je hulp bij de opmaak is mijn masterproef

geworden tot wat hij nu is.

INHOUD

Voorwoord .................................................................................................................................. i

Inhoud ......................................................................................................................................... ii

Samenvatting .............................................................................................................................. 1

Abstract ...................................................................................................................................... 2

1. Inleiding .............................................................................................................................. 3

1.1. Stralingsaccidenten ..................................................................................................... 3

1.2. Ioniserende straling .................................................................................................... 4

1.2.1. Wat en welke types ............................................................................................ 4

1.2.2. DNA-schade ....................................................................................................... 7

1.2.3. Gezondheidseffecten en klinische symptomen .................................................. 9

1.3. Dosisbepaling: dosimetrie ........................................................................................ 11

1.3.1. Klinische symptomen ....................................................................................... 11

1.3.2. Fysische dosimetrie .......................................................................................... 11

1.3.3. Biologische dosimetrie ..................................................................................... 12

1.4. Partiële lichaamsbestraling ....................................................................................... 16

1.5. Automatische detective ............................................................................................ 18

1.6. Fluorescente in-situ hybridisatie .............................................................................. 18

1.7. Doelstelling .............................................................................................................. 19

2. Materialen en methoden .................................................................................................... 20

2.1. De dicentrische test .................................................................................................. 20

2.1.1. Principe ............................................................................................................. 20

2.1.2. Methodologie ................................................................................................... 20

2.1.3. Analyse ............................................................................................................. 22

2.1.4. Verwerking resultaten ...................................................................................... 22

2.2. FISH met centromeer en telomeer probes ................................................................ 23

2.2.1. Principes ........................................................................................................... 23

2.2.2. Methodologie ................................................................................................... 23

2.2.3. Analyse ............................................................................................................. 24

2.2.4. Verwerking resultaten ...................................................................................... 24

3. Resultaten .......................................................................................................................... 25

3.1. Dosis-respons curves ................................................................................................ 25

3.1.1. Dosis-respons curves Giemsa ........................................................................... 25

3.1.2. Dosis-respons curve Fish ................................................................................. 27

3.1.3. Vergelijking dosis-respons curves fish- en giemsa-gekleurde preparaten ....... 29

3.2. partiële lichaamsbestraling ....................................................................................... 31

3.2.1. Scoring dicentrische chromosomen en mn ....................................................... 32

3.2.2. Vergelijking correctheid van de voorspelling op basis van scoring van

dicentrische chromosomen vs MN ................................................................................... 35

4. Bespreking ........................................................................................................................ 39

4.1. Celdeling .................................................................................................................. 39

4.2. Dosis respons curves ................................................................................................ 41

4.3. Partiële lichaamsbestraling ....................................................................................... 43

5. Algemeen besluit .............................................................................................................. 46

6. Referentielijst .................................................................................................................... 47

1

SAMENVATTING

Wanneer zich een stralingsaccident voordoet is het van belang de slachtoffers in een korte

tijdspanne te kunnen triëren volgens de ernst van blootstelling zodat men de blootgestelde

slachtoffers snel de aangepaste medische hulp kan bieden. De ontvangen dosis kan het best

bepaald worden op basis van biologische dosimetrie gezien hierbij rekening gehouden wordt

met de individuele stralingsgevoeligheid van personen. Dicentrische chromosomen zijn de

gouden standaard voor biologische dosimetrie bij volledige lichaamsbestraling omdat ze

nauwelijks voorkomen in onbestraalde cellen en er weinig individuele verschillen zijn.

Tijdens accidentele bestraling vindt er echter vaker een partiële lichaamsbestraling plaats. Tot

op heden wordt de scoring van dicentrische chromosomen beschouwd als de methode voor het

bepalen van de dosis opgelopen tijdens zo’n partiële lichaamsbestraling. In dit onderzoek wordt

een vergelijking gemaakt van verschillende methodes voor scoring van dicentische aberraties

in kader van stralingsaccidenten (automatisch, semi-automatisch en manueel). Daarna wordt in

het kader van partiële lichaamsbestraling een vergelijking gemaakt tussen scoring van

dicentrische chromosomen en de scoring van MN, deze laatste laten op zich al een snellere en

meer eenvoudige scoring toe. Naast onderzoek naar partiële lichaamsbestraling wordt in deze

masterproef ook nagegaan of FISH-TC-gekleurde preparaten eenvoudiger te scoren zijn dan

Giemsa-gekleurde slides.

Resultaten uit dit onderzoek bevestigen de bevinding resulterend uit eerder onderzoek, namelijk

dat een automatische scoring van Giemsa-gekleurde preparaten slechts 50% van de manueel

gescoorde dicentrische chromosomen oplevert. Op basis van een vergelijking tussen de curves

voor Giemsa- en FISH-TC-gekleurde slides komt een vermoedelijke mis-scoring bij Giemsa-

gekleurde preparaten naar voor. De scoring van FISH-TC-gekleurde slides blijkt uit onze

preliminaire resultaten sneller en met meer accuraatheid een predictie te kunnen geven van de

opgelopen dosis. Uit de resultaten voor partiële lichaamsbestraling kon geen duidelijk bewijs

gevonden worden van de superioriteit van dosisbepaling op basis van scoring van micronucleï

of scoring van dicentrische chromosomen. Verdere optimalisatie van detectie van partiële

lichaamsbestraling dient te gebeuren. Een combinatie met FISH-TC-kleuring zou hiervoor een

interessante mogelijkheid kunnen zijn aangezien uit dit onderzoek blijkt dat scoring van FISH-

TC-gekleurde slides eenvoudiger verloopt.

2

ABSTRACT

Background: The dicentric chromosome aberration is the all-round accepted gold-standard

method for biodosimetry. Automatic scoring in cases of mass-casualty events is needed. In this

study, we established dose-response curves for different types of scoring for Giemsa (automatic,

semi-automatic and manual) and FISH-centromere-telomere (FISH-TC) staining (manual). We

also compared the dicentric and micronucleus (MN) assay for detection of partial-body

irradiation. (PBI)

Methods: For establishment of the curves, blood of 2 healthy donors was irradiated with 60Co

γ-rays, doses between 0 and 4,5 Gy. The slides were stained with Giemsa or FISH-TC-staining),

and dicentrics were scored. For PBI, blood of 2 healthy donors was irradiated with 60Co γ-rays,

doses between 0 and 4 Gy, and mixed with unirradiated blood in different proportions to

simulate PBI. Slides were stained with Giemsa and scored for dicentrics. Also micronucleus

slides, stained with DAPI, were analysed.

Results: Our results confirm what has been described in earlier research: automatic scoring of

dicentrics only detects 50% of the manually scored dicentrics. Preliminary results derived from

comparison between Giemsa- and FISH-TC-stained slides suggest a mis-detection of dicentrics

in Giemsa-stained slides. Comparison between micronuclei and dicentrics for detection of PBI

did not result in a preference for one of both methods.

Conclusions: We could not conclude a significant difference between scoring of micronuclei

and dicentrics for detection of PBI. A further optimization for determining PBI is necessary. In

this research, it has been confirmed that FISH-TC-staining results in a more efficient scoring.

A combination of FISH-TC-staining and PBI should be further investigated in the future.

3

1. INLEIDING

1.1. STRALINGSACCIDENTEN

Een stralingsaccident wordt door het International Atomic Energy Agency (IAEA) gedefinieerd

als zijnde een gebeurtenis (straling) die geleid heeft tot significante gevolgen voor mens, milieu

of faciliteiten. Dit behelst dodelijke effecten voor het individu, vrijkomen van grote hoeveelheid

radioactiviteit in de omgeving en het smelten van een reactorkern. Een voorbeeld van één van

de grootste stralingsaccidenten is de kernramp van Chernobyl in 1986. [1] Wereldwijd zijn al

99 geregistreerde accidenten gebeurd met nucleaire energiecentrales, 57 daarvan hebben

plaatsgevonden sinds de ramp in Tsjernobyl. [2] Een ander voorbeeld van een stralingsaccident

is het Goiânia-incident. In 1985 veranderde een privaat instituut voor radiotherapie van locatie.

Een verouderd toestel met cesiumchloride-bron (cesium-137) werd op de oude locatie

achtergelaten. De bron kwam in handen van daklozen die het gebouw binnengedrongen hadden,

waarna nog een groot aantal mensen in contact kwamen met de bron. Het duurde twee weken

alvorens men de schadelijkheid ervan ontdekte en de overheid kon ingrijpen. Uiteindelijk zijn

vier mensen overleden ten gevolge van contact met de bron, 20 personen hadden medische

behandeling nodig en 249 personen bleken een verhoogde hoeveelheid straling te hebben

ontvangen. [3]

Alhoewel de kans op zo’n grootschalig stralingsaccident klein is, is het toch van belang een

algemene aanpak klaar te hebben voor wanneer een grootschalig stralingsaccident zou

plaatsvinden. Onderdeel daarvan is het snel kunnen bepalen van de opgelopen dosis van een

grote groep individuen zodat de slachtoffers de nodige medische hulp geboden kan worden. De

focus ligt in zo’n geval dus in eerste instantie op snelle triage, niet op het nauwkeurig bepalen

van de opgelopen dosis.

Echter, naast grootschalige accidenten gebeuren ook accidenten waarbij slechts één of enkele

personen betrokken zijn. Zo werd in Fleurus op 11 maart 2006 een operator blootgesteld aan

4,4-4,8 Gy tijdens een interventie in een bestralingscel. De persoon in kwestie was zich hier

echter niet van bewust. Enige tijd later kreeg de operator last van misselijkheid en

braakneigingen maar er werd geen verband gelegd met zijn interventie in de bestralingscel. Zijn

huisarts was van oordeel dat hij spijsverteringsproblemen had. Ongeveer drie weken later

klaagde hij bij de arbeidsgeneesheer over haarverlies, waardoor het vermoeden rees dat hij aan

4

straling was blootgesteld. Het bloedonderzoek dat toen onmiddellijk werd uitgevoerd, liet

veronderstellen dat hij aan een stralingsdosis tot 4 Gy werd blootgesteld. Op 31 maart werd de

operator naar een ziekenhuis in Frankrijk overgebracht dat gespecialiseerd is in de behandeling

van bestraalde personen. Daarbij werd bevestigd dat hij over het volledige lichaam bestraald is

geweest en dat de dosis waaraan hij werd blootgesteld lag tussen 4,4 Gy en 4,8 Gy. [4]

Ook anno 2015 vinden individuele stralingsaccidenten plaats. Zo werd het FANC door een

dienst radiotherapie op de hoogte gebracht van een bestralingsfout bij een patiënte met

borstkanker. Bij een retrospectieve studie werd ontdekt dat de patiënte een dosis van 30 Gy had

gekregen in de regio van de borst, in plaats van de voorgeschreven 7,95 Gy. [5]

Gezien de frequentie van voorkomen van individuele of kleinschalige accidenten hoger is dan

deze voor grootschalige accidenten is het van belang ook in deze gevallen een passend protocol

te hebben. De focus ligt hierbij echter wel op nauwkeurige dosisbepaling, bovendien betreft het

eerder partiële lichaamsbestraling met kleinere dosissen.

Het feit dat de kans op nucleaire catastrofes tegenwoordig minder tot een mogelijkheid aanzien

wordt, steunt op het wereldwijde beleid waarin concepten zoals ‘geen losse kernwapens’ en

‘geen nieuwe nucleaire staat’ centraal staan. Dit beleid heeft het risico op ontploffing van een

kernwapen waarbij een grote populatie een volledige lichaamsbestraling ondergaat schijnbaar

geminimaliseerd. Toch blijft de kans op een nucleaire of radiologische blootstelling bestaan:

accidenten met kernreactoren of energiecentrales, potentieel terrorisme waarbij kernwapens

gebruikt worden etc. De verschuiving naar deze types van blootstelling verhogen de kans op

een gedeeltelijke lichaamsbestraling. Dit illustreert de nood aan de verdere ontwikkeling van

aangepaste beoordelingsmethodes voor gedeeltelijke lichaamsbestraling. [6]

1.2. IONISERENDE STRALING

1.2.1. WAT EN WELKE TYPES

Ioniserende straling zijn deeltjes of elektromagnetische golven die voldoende energie bezitten

om excitaties en ionisaties te veroorzaken in het medium waar ze doortrekken. Deze ionisaties

en excitaties gebeuren door fysische interactieprocessen zoals elektrische aantrekking of

afstoting, botsingsprocessen,..

5

Een eerste type van ioniserende straling zijn hoog energetisch geladen deeltjes zoals α- en β-

straling die vrijkomen bij radioactief verval. Het zijn direct ioniserende stralingen omdat het de

primaire deeltjes op zich zijn die de ionisaties veroorzaken zonder dat er zijn secundaire deeltjes

nodig om dit te bewerkstelligen. [7] α-deeltjes worden uitgezonden tijdens α-verval. Ze zijn

samengesteld uit 2 protonen en 2 neutronen en mogen gelijkgesteld worden aan een 4He kern.

� → �� + ��

��

��

β-deeltjes worden uitgestuurd tijdens β- verval en β+ verval. Ze zijn afkomstig uit de kern van

het vervallende element en hebben de massa van een elektron. Ze kunnen positief (β+-deeltjes

of positronen) of negatief (β--deeltjes of negatronen) geladen zijn.

��: � → � + �� + ��

��

��: � → � + �� + ��

��

Een tweede type zijn de niet-geladen deeltjes zoals neutronen en elektromagnetische golven

zoals X- en gamma-stralen. Doordat ze ongeladen zijn kunnen deze niet zelf voor de ionisaties

zorgen. Ionisaties gebeuren door de secundaire geladen deeltjes die vrijgemaakt zijn door de

elektrisch neutrale primaire straling. Deze secundaire geladen deeltjes zijn elektronen en

positronen. Hierdoor wordt dit tweede type ook indirect ioniserende straling genoemd. [7]

De afstand die straling door een medium kan afleggen, de range, hangt af van verschillende

factoren zoals de energie van het ioniserend deeltje, de lading van het partikel, de massa van

het ioniserende deeltje en het atoomnummer (Z) of massagetal (A) van het medium waar de

straling door gaat. α-deeltjes zijn zware, geladen deeltjes (He-kernen) en verliezen op heel korte

afstand hun energie in de vorm van ionisaties, de zogeheten ionisatiedichtheid is dus groot.

(Fig. 1) Een β-deeltje met eenzelfde energie-inhoud als een α-deeltje zal een veel grotere

snelheid hebben dan het α-deeltje aangezien zijn veel massa kleiner is. De ionisatiedichtheid is

dus veel kleiner dan bij α-deeltjes. Er is minder beschikbare tijd voor interactie door de hoge

snelheid van het β-deeltje.

6

Gevolg van dit verschil in ionisatiedichtheid tussen beide direct ioniserende stralingen is dat

de DNA-schade veroorzaakt door α-straling complexer zal zijn dan bij β-straling. [8]

Fig. 1: Vergelijking ionisatiedichtheid voor α- en β-straling. [9]

Voor de kwantitatieve beschrijving van de ruimtelijke verdeling van de energieafgifte werd de

grootheid LET (Linear Energy Transfer) ingevoerd. Dit is de hoeveelheid energie afgegeven

per eenheid van afgelegde weg van het ioniserend deeltje, uitgedrukt in KeV/micron. (Fig. 2)

Bij lage LET-straling, zoals β-deeltjes en X- en gamma-stralen, wordt de energie vooral afgezet

onder de vorm van verspreide of geïsoleerde ionisaties en excitaties.

Bij hoge LET-straling zoals snelle neutronen en α-deeltjes wordt de energie afgezet onder de

vorm van grote ionisatieclusters.

Het feit dat de ionisaties al dan niet dicht op elkaar volgen in tijd en ruimte vormt de verklaring

voor het verschil in biologisch effect tussen hoge en lage LET-straling. Hoe dichter de ionisaties

zijn in tijd en ruimte, hoe meer DNA-schade wordt veroorzaakt. [10]

Om de biologische effectiviteit van straling uit te drukken werd in de radiobiologie de relatieve

biologische effectiviteit ingevoerd, kortweg RBE. Dit is de verhouding van de dosis

röntgenstraling of gammastraling voor een bepaald biologisch effect, met de dosis van de soort

ioniserende straling in kwestie die nodig is om hetzelfde effect te verkrijgen. Zo is de RBE dus

afhankelijk van de LET. Daarnaast zal de RBE ook afhankelijk zijn van de stralingsdosis, het

dosistempo en het eindpunt. [10] [11]

Fig. 2: Vergelijking tussen energiedepositie in de cel voor lage en hoge LET. [12]

7

1.2.2. DNA-SCHADE

Ioniserende straling veroorzaakt zoals eerder vermeld schade aan het DNA in de celkern. De

voornaamste vormen van schade zijn baseschade, dubbelstrengige- en enkelstrengige breuken

in het DNA. [13] Vooral DNA dubbelstrengbreuken worden biologisch als belangrijk

beschouwd omdat hun herstel intrinsiek moeilijker is dan voor andere soorten DNA-schade.

Foutief of geen herstel van dubbelstrengbreuken leidt tot chromosoomaberraties zoals

dicentrische chromosomen en acentrische fragmenten, deleties, inversies,… (Fig. 3) Een

voorbeeld van een dicentrisch chromosoom staat afgebeeld in Fig. 4. Dicentrische

chromosomen zijn het resultaat van foutief herstel tussen twee dubbelstrengbreuken gelegen op

twee verschillende chromosomen die dicht bij elkaar gelegen zijn, zowel in tijd als in ruimte.

Wanneer een dicentrisch chromosoom gevormd wordt, ontstaat ook een acentrisch fragment.

Dit is een fragment zonder centromeer [10].

Fig. 3: Diagramvoorstelling van de vorming van chromosoomaberraties gevormd door ioniserende straling. De omcirkelde zaken zijn fragmenten die aanleiding kunnen geven tot micronucleï. [10]

8

Fig. 4: Dicentrisch chromosoom (D) (bron: eigen experiment)

Naast vorming van dicentrische chromosomen kunnen ook micronucleï (MN) gevormd worden

ten gevolge van schade aan het DNA. (Fig. 5). MN worden gevormd tijdens de metafase-

anafase transitie van de mitose. Ze bevatten volledige chromosomen of

chromosoomfragmenten zonder centromeer (acentrische fragmenten). In beide gevallen zijn

deze er niet in geslaagd om in de dochtercellen te worden geïncorporeerd. MN kunnen spontaan

gevormd worden maar de hoeveelheid kan ook toenemen door bepaalde endogene en exogene

factoren. In Fig. 3 staan alle acentrische fragmenten omcirkeld die aanleiding kunnen geven tot

MN. [14] [15]

Fig. 5: Binucleaire cel zonder en met micronucleus (bron: eigen materiaal)

9

1.2.3. GEZONDHEIDSEFFECTEN EN KLINISCHE SYMPTOMEN

Gezondheidsschade ten gevolge van ioniserende straling is afhankelijk van het feit of het een

hoge of een lage dosis van opgelopen straling betreft.

Een hoge dosis geeft aanleiding tot deterministische effecten. Bij deze hangt de ernst van een

effect samen met de opgelopen dosis. Een deterministisch effect heeft een drempelwaarde

waaronder het effect niet voorkomt. De drempelwaarde kan variëren van persoon tot persoon.

Echter, eenmaal de drempelwaarde overschreden treedt het effect zeker op en neemt de ernst

van het effect ook toe met de dosis. Deterministische effecten worden ook acute effecten

genoemd omdat ze binnen uren tot enkele maanden na bestraling optreden. [10]

Tot de deterministische effecten behoort het acute radiation syndrome (ARS). Het wordt

gedefinieerd als de symptomen die verschijnen nadat een significant deel van het lichaam

(minimum 60%) blootgesteld werd aan >1 Gy totale dosis ioniserende straling, opgelopen aan

een relatief hoog dosistempo. [16] De symptomen verschijnen uren tot weken na de

blootstelling. In Fig. 6 wordt het benaderd tijdsverloop van de klinische manifestaties

weergegeven. Het optreden van de klinische symptomen gebeurt in drie verschillende maar

overlappende fasen: de prodromale fase, de latente fase en de fase van manifeste ziekte. In de

prodromale fase (periode vooraf aan de ziekte) fase treden klinische symptomen gewoonlijk op

binnen de eerste 48 uur na blootstelling. Deze klinische symptomen zijn hematopoietische

veranderingen, gastro-intestinale symptomen en neurologische symptomen. De latente fase

persisteert gedurende 2-20 dagen en wordt gekenmerkt door een verbetering van de

symptomen. Dit geeft de valse impressie dat herstel is ingezet, alhoewel typisch cytopenie

persisteert. De duur van de latente fase is invers gecorreleerd met de geabsorbeerde dosis (zie

Fig. 6). De fase van manifeste ziekte duurt 2-60 dagen waarin symptomen optreden omwille

van beschadiging van één of meer organen. Bij personen die werden blootgesteld aan een dosis

hoger dan 10-12 Gy ligt de mortaliteit op bijna 100%. Alhoewel deze klinische symptomen niet

stralingsspecifiek zijn, zouden de symptomen in combinatie met een mogelijke blootstelling

herkenbaar moeten zijn voor instanties die de eerste hulp leveren aan slachtoffers. De bepalende

factor voor bruikbaarheid van de symptomen is de tijd tussen bestraling en manifesteren van

het symptoom. [17]

10

Fig. 6: Benaderd tijdsverloop van klinische manifestaties. [17]

Een blootstelling aan lage stralingsdosis veroorzaakt stochastische effecten. Deze hebben in

tegenstelling tot deterministische effecten een toevalskarakter. Er is geen drempelwaarde

waarbij men met zekerheid kan stellen dat het effect zal voorkomen. Bij stochastische effecten

stijgt de kans van voorkomen met toenemende dosis. Echter, de ernst van de effecten stijgt

hierbij niet. Tot de stochastische effecten behoren kankerinductie (mutaties in somatische

cellen) of overerfbare genetische effecten (mutaties in geslachtscellen) als gevolg van

blootstelling aan straling. Men krijgt kanker of men krijgt het niet, maar men kan niet met

zekerheid stellen dat kanker zal geïnduceerd worden vanaf een bepaalde dosis. [18][10]

Onmiddellijke stralingsgeïnduceerde genetische schade kan bijdragen tot veranderingen in

weefsel- en tumorresponsen. Bij 50% van alle kankers is er bijvoorbeeld een mutatie vastgesteld

in de tumor suppressor p53. Een aantal fundamentele cellulaire functies die normaliter tumor

suppressief zijn onder controle van wildtype p53 ontsporen onder invloed van het mutante p53.

Het mutante p53 zorgt voor een verstoring van de normaal streng gecontroleerde fundamentele

processen inclusief controle over de celcyclus waardoor ongecontroleerde celdeling mogelijk

is leidend tot tumoren. [19] Het risico op een stralingsgeïnduceerde kanker is afhankelijk van

de leeftijd waarop men bestraald wordt, de ontvangen dosis, het bestraalde volume normaal

weefsel alsook de familiegeschiedenis van de patiënt op vlak van kanker (genetica). Aangezien

het risico levenslang blijft gelden en cumulatief is, is het risico op stralingsgeïnduceerde kanker

het grootst voor kinderen en jongvolwassenen die kankertherapie overleefd hebben. [20]

11

1.3. DOSISBEPALING: DOSIMETRIE

1.3.1. KLINISCHE SYMPTOMEN

Wanneer één individu tijdens een werkongeval een overbestraling heeft opgelopen, is het van

belang de exacte dosis te kunnen bepalen waaraan de persoon werd blootgesteld. Klinische

symptomen zijn hiervoor niet altijd voldoende, bijvoorbeeld bij lage dosis bloostelling. Na een

grootschalig stralingsaccident is het van cruciaal belang de slachtoffers in een zo korte

mogelijke tijdspanne te kunnen triëren volgens de ernst van blootstelling. Triage moet gebeuren

volgens drie categorieën zijnde ‘<1 Gy’, ‘1-2 Gy’ en ‘>2 Gy’, zodat men de blootgestelde

slachtoffers snel de aangepaste medische hulp kan bieden. [21] Daarvoor dient de ontvangen

dosis snel bepaald te kunnen worden. Klinische symptomen kunnen na accidentele bestraling

gebruikt worden voor triage, deze zijn echter niet altijd stralingsspecifiek, zoals misselijkheid,

overgeven... Mensen die weten dat ze misschien bestraald werden zullen zich al snel onwel

voelen uit angst. Dit wordt in de literatuur genoemd als ‘worried well’. Gebruik van klinische

symptomen kan dus al snel leiden tot een foute diagnose. [22] Vaststellen van de dosis gebeurt

daarom beter via fysische of biologische dosimetrie omdat deze in wezen veel objectiever zijn.

1.3.2. FYSISCHE DOSIMETRIE

Bij fysische dosimetrie wordt gebruik gemaakt van een persoonlijke dosimeter (bv. Filmbadge).

Deze meet de blootstelling aan ioniserende straling door fysische verandering in een bepaald

materiaal. Een persoon die werkt in een risico-omgeving waarbij bestraling mogelijk is draagt

normaliter een dosimeter. Hetzelfde geldt echter niet voor een accidenteel bestraald persoon uit

de algemene populatie (bv. grootschalig stralingsaccident). Daarom werden alternatieve

methodes zoals de mobiele telefoon als dosimeter reeds nader onderzocht, gezien tegenwoordig

heel wat mensen deze altijd bij zich hebben. Een eerste voorbeeld van het gebruik van de

mobiele telefoon als dosimeter is ‘Electron Paramagnetic Resonance’, kortweg EPR. Dit is

een spectroscopische techniek die steunt op het feit dat ioniserende straling radicalen induceert

in biologische of artificiële materalen. Zo zal ioniserende straling ook radicalen induceren in

het glazen scherm van de mobiele telefoon. Het voordeel van EPR is de hoge specificiteit en

goede sensitiviteit bij blootstelling aan hoge dosissen (>1 Gy) en het feit dat de geïnduceerde

radicalen maanden na bestraling nog bruikbaar zijn voor dosisbepaling. Nadeel is dan weer de

lage sensitiviteit voor dosissen lager dan 1 Gy. Echter, dosissen van die grootteorde zijn bij

12

triage niet van belang, enkel slachtoffers blootgesteld aan meer dan 1 Gy hebben dringende

medische verzorging nodig. EPR heeft naast de mobiele telefoon ook nog andere toepassingen.

De radicalen geproduceerd in materiaal door ioniserende straling hebben een heel korte

levensduur (nanoseconden) in waterige omgeving zoals de meeste biologische weefsels. Echter,

in niet waterige media zoals tanden, bot, vingernagels en haar kunnen de radicalen wel extreem

stabiel zijn. Tegenwoordig zijn er drie toepassingen met een potentiële waarde in het schatten

van de geabsorbeerde dosis bij noodgevallen: in vivo meting bij tanden, in vitro meting bij

kleine stukjes tand en in vitro meting van stukjes vinger- of teennagels. Elk van deze EPR-

gebaseerde technieken zijn niet invasief of minimaal invasief en bieden een direct resultaat op

gelijk welk tijdstip na blootstelling, zelfs wanneer het uitvoerend personeel minimaal getraind

is. Metingen van stralingsgeïnduceerde veranderingen in tanden kunnen gebeuren tot

honderden zelfs duizenden jaren na blootstelling. Metingen in vingernagels kunnen tot 30 dagen

na blootstelling gebeuren. Als de vingernagels binnen enkele uren na blootstelling gecollecteerd

worden en bewaard worden bij lage temperatuur kunnen later ook nog metingen uitgevoerd

worden. [17] Naast EPR kan ook ‘Optically Stimulated Luminescence’ ofwel OSL gebruikt

worden in combinatie met de mobiele telefoon. Hierbij wordt de dosis aan ioniserende straling

bepaald door meten van licht uitgezonden door bestraalde objecten. OSL heeft dan wel een heel

hoge specificiteit en sensitiviteit (mGy tot Gy), het te meten effect verdwijnt veel sneller dan

bij ERP. 50% van het signaal verdwijnt in de eerste 10 dagen na bestraling. [22]

1.3.3. BIOLOGISCHE DOSIMETRIE

1.3.3.1. ALGEMENE WERKWIJZE

Voor biologische dosimetrie geldt telkens dezelfde werkwijze. Door bloedstalen te bestralen

met verschillende dosissen en bij deze dosissen telkens de respons te meten, kan een in-vivo

dosis-respons curve opgesteld worden. Deze dient dan als calibratiecurve om in vivo

dosisblootstelling bij een accident te onderzoeken. Hierdoor kan de geobserveerde schade

gelinkt worden aan de dosis. [17]

Voor chromosoomaberraties volgt de curve volgende vergelijking: Y = C + αD + βD² voor lage

LET-straling en Y = C + αD voor hoge LET straling. (Fig. 7) In de lineaire component (αD), is

α de fractie van de aberraties gevormd door één enkele elektronenbaan. Deze is dus

onafhankelijk van het dosistempo. In de kwadratische component βD² stelt β de fractie van

aberraties voor die gevormd worden door twee verschillende elektronenbanen. Hierbij speelt

13

dosistempo dus wel een rol aangezien de twee elektronenbanen niet alleen in ruimte maar ook

in tijd voldoende dicht bij elkaar gelegen moeten zijn. Wanneer er te veel tijd zit tussen beide

gebeurtenissen, zal er meer tijd zijn voor herstel van DNA-schade door DNA-

herstelmechanismen. [14]

Voor de dosimetrie is het van belang om zowel LET als dosistempo van de straling waaraan

men blootgesteld werd te kennen zodat de juiste dosis-respons curve gebruikt kan worden bij

bepaling van de dosis.

Fig. 7: Algemene dosis-respons curves voor chromosoomaberraties geïnduceerd door verschillende types van ioniserende straling. (a) Hoge LET (b) Lage LET en hoog dosistempo (c) Lage LET en laag dosistempo. [14]

1.3.3.2. VERSCHILLENDE BIOLOGISCHE TESTSYSTEMEN

Onder biologische dosimetrie verstaat men het evalueren van de opgelopen stralingsdosis door

middel van biologische testsystemen waarbij stralingsgeïnduceerde veranderingen in het

menselijk lichaam worden bepaald. [10] Op die manier wordt dus rekening gehouden met de

individuele gevoeligheid van personen, dit in tegenstelling tot fysische dosimetrie. Zoals eerder

aangehaald onder ‘DNA-schade’ zijn dicentrische chromosoomaberraties en micronucleï

voorbeelden van zo’n stralingsgeïnduceerde veranderingen die waargenomen kunnen worden

in respectievelijk cellen in metafase en in interfase cellen. De micronucleï (MN) kunnen

waargenomen worden in cellen die één keer gedeeld hebben. [14]

Deze micronucleï worden gebruikt in de MN test voor biologische dosimetrie. (Fig. 8) Bij de

‘cytokinesis-block micronucleus’ assay (CBMN) worden lymfocyten in cultuur gebracht en

gestimuleerd met phytohemagglutinine (PHA). Cytochalasine-B wordt toegevoegd zodat

14

celdeling geïnhibeerd wordt terwijl kerndeling wel plaatsgevonden heeft. Dit resulteert in

binucleaire cellen waarin men de eventuele micronucleï kan scoren. Dankzij de eenvoudige en

snelle scoring is deze MN-test goede optie voor triage, de test is echter niet zo gevoelig in het

lage dosisgebied (<0,2 Gy) door de variabele en hoge spontane frequentie van MN. [14]

Fig. 8: Celdeling in CBMN assay. [23]

Dicentrische chromosomen zijn echter de gouden standaard voor biologische dosimetrie omdat

ze normaal nauwelijks voorkomen in onbestraalde cellen (1-2 dic/1000 metafasen) en er weinig

individuele verschillen zijn. Dicentrische chromosomen kunnen waargenomen worden in

metafase cellen. In de dicentrische test worden bloedculturen opgestart en de lymfocyten

worden tot deling gebracht door middel van fytohemagglutinine (PHA). De lymfocyten worden

geblokkeerd in de metafase door toevoegen van colcemid. De dicentrische chromosomen

kunnen gescoord worden in de metafase lymfocyten na kleuring met Giemsa. (Fig. 9) Door

bloedstalen met verschillende dosissen te bestralen kan een dosis-respons curve opgesteld

worden. Deze dient als calibratiecurve om in vivo dosisblootstelling bij een accident te

onderzoeken. Hierdoor kan geobserveerde schade, namelijk het aantal dicentrische aberraties

per cel, gelinkt worden aan de dosis. [17]

Fig. 9: Verloop dicentrisch assay (bron: eigen afbeelding)

Bij stralingsaccidenten is het van belang zo snel mogelijk een beeld te hebben van de ontvangen

dosis per slachtoffer. Alhoewel het dicentrisch assay aanzien wordt als de meest specifieke en

15

gevoelige methode om dosisbepalingen te doen van recente blootstellingen aan ioniserende

straling, is het niet de snelste methode. Om dit nadeel te omzeilen kan men ervoor kiezen om

slechts 50 metafasecellen te scoren in plaats van 500. [17] RENEB (Realising the European

Network of Biodosimetry), een Europees project met als doel het realiseren van een duurzaam

netwerk voor biodosimetrie in Europa, voerde in 2015 een onderzoek uit naar hoeveel

metafasecellen gescoord moeten worden om een schatting te kunnen maken van de dosis zodat

deze zich binnen de betrouwbaarheidsinterval bevindt voor de betreffende dosis. Hieruit bleek

dat de correctheid van de dosisbepalingen steeg naarmate het aantal gescoorde metafasecellen

toenam van 20 naar 30. Bij scoring van 50 metafasecellen werd echter geen verbetering

vastgesteld in de resultaten ten opzichte van de 30 gescoorde metafasecellen. [24] Het scoren

laten plaatsvinden in bepaalde centrale laboratoria door getrainde personen kan de capaciteit

van de analyse verhogen. Als laatste kan ook software gebruikt worden om metafasen en

dicentrische chromosomen op te sporen. (zie verder bij ‘1.5. Automatische detectie’) [17]

Naast MN en dicentrische chromosomen bestaan ook andere cytogenetische testen als

biologische dosimeters. Eén daarvan is schade in een cel nagaan door middel van premature

chromosoom condensatie (PCC). Deze techniek laat toe om chromosoomaberraties in interfase

cellen te visualiseren. In de klassieke PCC-test worden mitotische ‘Chinese hamster ovary’

(CHO) cellen gefuseerd met perifere bloed lymfocyten (PBL) in aanwezigheid van

polyethyleen glycol (PEG). (Fig. 10) Hierdoor verdwijnt de kernmembraan en kunnen de

‘mitose promoting factors’ (MPF’s) afkomstig van de mitotische cellen zorgen voor een

premature condensatie van de testcellen (PBL). De 46 chromatiden worden zichtbaar en in

combinatie met FISH kunnen breuken, dicentrische aberraties etc. gedetecteerd worden. De

snelle uitvoering van de test en het feit dat geen celdeling nodig is zijn voordelen van deze test.

Nadelig aan de PCC-test is de noodzakelijkheid van expertise. [25][10]

Fig. 10: Fusie van lymfocyten met mitotische CHO cellen in suspensie zoals zichtbaar onder de microscoop. (a) 10 min na fusie, (b) 60 min na fusie. Mitotische CHO-cellen zijn groter dan lymfocyten. Gefuseerde cellen hebben een ander uitzicht dan zowel de lymfocyten als de mitotische CHO-cellen. [26]

16

Ook detectie van DNA-dubbelstrengschade kan gebruikt worden om de ontvangen dosis voor

een bestraald individu vast te stellen. Een voorbeeld hiervan is de γ-H2AX foci test. H2AX is

één van de drie types geconserveerde H2A histoneiwitten. Het verschilt van de andere twee

types door een absoluut geconserveerd serine-glutamine (SQ) motief in de C-terminale regio

van het eiwit. Wanneer een cel blootgesteld wordt aan ioniserende straling worden H2AX

histoneiwitten in de buurt van een dubbelstrengbreuk snel gefosforyleerd ter hoogte van het γ-

serine (serine 139) in het SQ-motief. Deze worden de γ-H2AX foci genoemd. Deze fosforylatie

van het H2AX eiwit trekt andere eiwitten van de DNA-schade-respons pathway aan. Het aantal

geïnduceerde foci is proportioneel (1:1) voor het aantal geïnduceerde dubbelstrengbreuken.

Door gebruik te maken van een fluorescent antilichaam specifiek voor γ-H2AX worden de foci

gevisualiseerd, het aantal dubbelstrengbreuken kan via fluorescentie microscopie bekeken

worden.[27][28][10] Het voordeel van de γ-H2AX test is onder andere de mogelijkheid deze te

gebruiken om stralingsgeïnduceerde schade te kwantificeren bij lage dosis blootstellingen. [29]

Daarnaast bewijst deze test in geval van grootschalig stralingsaccident zijn nut door heel snel

leveren van resultaten (uren) en ‘high throughput’ in vergelijking met chromosoom dosimetrie

assays. Op die manier kunnen personen blootgesteld aan kritische dosissen heel snel

onderscheiden worden van ‘worried well’. Nadeel is wel het snel verdwijnen van de foci na

vorming naarmate herstel van dubbelstrengbreuken plaatsvindt.

1.4. PARTIËLE LICHAAMSBESTRALING

Bij de meeste stralingsaccidenten wordt een gedeeltelijke lichaamsbestraling opgelopen in

plaats van een volledige. Analyse van dicentrische chromosoomaberraties blijkt ook hier het

meest geschikt voor identificatie van gedeeltelijke lichaamsbestraling, in tegenstelling tot de

micronucleus test. [30] Bij volledige lichaamsbestraling volgt de verdeling van het aantal

dicentrische aberraties per cel een Poissondistributie. Dit is een discrete kansverdeling dat de

kans uitdrukt dat een gegeven aantal gebeurtenissen voorkomt in een bepaalde tijd of ruimte.

(Fig. 11) Echter, bij gedeeltelijke lichaamsbestraling is er een overdispersie van de frequentie

distributie t.o.v. de Poissondistributie. Bij een grote dosis op een heel klein gedeelte van het

lichaam werden de meeste cellen niet bestraald waardoor heel veel cellen geobserveerd worden

zonder dicentrische chromosomen, terwijl een klein deel van de cellen wel veel dicentrische

kunnen bevatten.

17

Fig. 11: Poisson-distributie (licht grijs) en overdispersie op de Poisson-distributie (zwart)

Een gedeeltelijke lichaamsbestraling kan opgespoord worden met de Dolphin methode. Eerste

stap in deze methode is het bepalen van de ratio van variatie op het gemiddelde, de dispersie-

index genaamd (σ2/y), en de waarde van de µ-test. Er wordt bepaald of de ratio significant

afwijkt. Een µ-waarde groter dan 1,96 wijst op een overdispersie. Wanneer geconcludeerd

wordt dat de data niet-Poisson verdeeld is, kan verder gewerkt worden met de Dolphin methode

om de partiële lichaamsdosis in te schatten. Deze methode beschouwt de overdispersie van de

distributie van dicentrische chromosomen onder alle gescoorde cellen. De geobserveerde

distributie wordt beschouwd als de som van (a) de Poissondistributie die de bestraalde fractie

van het lichaam voorstelt en (b) de overige onbestraalde fractie. Cellen die aberraties bevatten

behoren tot het bestraalde deel van het lichaam, onbeschadigde cellen bestaan uit twee

subpopulaties: diegene die niet blootgesteld werden en diegene die bestraald werden maar geen

schade opgelopen hebben. [31]

In een recente studie van Valente et al. (2015) werd onderzocht of een volledige

lichaamsbestraling (Total-body irradiation of TBI) en gedeeltelijke lichaamsbestraling

(Partial-body irratiation of PBI) van elkaar onderscheiden kunnen worden door gebruik van

bepaalde biomerkers waaronder het dicentrisch chromosoom. In deze studie onderging de ene

groep bavianen een totale lichaamsbestraling, de andere groep werd slechts gedeeltelijk

blootgesteld. De verschillende biomerkers konden dan bij deze dieren vergeleken worden.

Alhoewel de studie niet werd uitgevoerd op de mens, wordt de baviaan als waardig alternatief

aanvaard wegens het feit dat hij dicht bij de mens staat qua genetica en fysiologie. Een baviaan

blootgesteld aan 2 Gy TBI ontwikkelt ook een klassieke ARS (Acute Radiation Syndrome) zoals

de mens. Uit deze studie bleek dat een PBI het best onderscheiden kan worden op basis van het

dicentrisch assay 1 dag na blootstelling. Later, tussen dag 28 en dag 200 in deze studie, kon

18

PBI ook nog onderscheiden worden maar nam het aantal van vals positieven wel toe ten

opzichte van dag 1. Dit komt doordat het moeilijker werd om PBI te onderscheiden van TBI.

[32]

1.5. AUTOMATISCHE DETECTIVE

Dicentrische chromosomen kunnen na kleuring (Giemsa) geanalyseerd worden met een

eenvoudige lichtmicroscoop. Hierbij dient echter opgemerkt te worden dat zo’n manuele telling

heel erg tijdrovend is en dat dit bovendien de nodige expertise vergt. Omwille van die

tijdrovendheid is automatische detectie van dicentrische chromosomen gewenst. In

verschillende biologische dosimetrie labo’s wordt automatische detectie momenteel op punt

gesteld. De meeste groepen maken hierbij gebruik van het microscopie Metafer

scanningplatform van Metasystems. Met behulp van de Metafer worden de metafase preparaten

ingescand (10x vergroting), de MSearch module detecteert de metafasen en met behulp van de

Autocapt module wordt daarna een opname gemaakt op grote vergroting (63x) van de

geselecteerde metafasen. Automatische detectie van dicentrische chromosomen kan gebeuren

met behulp van de DCScore module. Een studie uitgevoerd door Vaurijoux et al. toonde aan

dat automatische detectie van dicentrische chromosomen driemaal sneller gaat dan manuele

detectie. [21] Echter, tevens blijkt dat de huidige software (DCScore) slechts 50% van de

manueel gescoorde dicentrische chromosomen detecteert. [33] Er is dus een verdere

optimalisatie nodig van het automatisch systeem.

1.6. FLUORESCENTE IN-SITU HYBRIDISATIE

Dicentrische chromosomen kunnen ook gevisualiseerd worden door gebruik te maken van

fluorescente in-situ hybridisatie (FISH), dit zou kunnen resulteren in een meer accurate detectie

van dicentrische chromosomen aangezien herkenning van een dicentrisch chromosoom veel

eenvoudiger is dan bij gebruik van een Giemsa-kleuring. Bij deze methode worden fluorescent

gelabelde DNA-probes gebruikt. De gebruikte fluorescente probes zijn specifiek voor

sequenties ter hoogte van centromeer (pan-centromeerprobe) en telomeer (pan-telomeerprobe).

(Fig. 12) Gecombineerd gebruik van telomeer- en centromeer DNA probes werd eerder reeds

bekeken als mogelijkheid ter detectie van alle asymmetrische chromosomale aberraties en dit

met hoge accuraatheid. [34]

19

Fig. 12: Voorbeeld van gebruik van PNA probes voor opsporen van dicentrische chromosomen. (TRITC=telomeerprobe (rood), FITC=centromeerprobe (groen)) (bron: eigen foto)

In de studie van M’kachter et al [33] rond gebruik van telomeer- en centromeerprobes werd

aangetoond dat deze kleuring een grote verbetering oplevert qua gevoeligheid voor biologische

dosimetrie. Wanneer met deze probes een in-situ hybridisatie wordt uitgevoerd op

metafasepreparaten wordt m.b.v. een fluorescentiemicroscoop zichtbaar waar de dicentrische

chromosomen zich bevinden. Zo worden overlappende chromosomen veel beter herkend, ook

centromeren die dicht bij elkaar of tegen telomeren liggen worden veel beter gedetecteerd.

Detectie gebeurde in deze studie met eigen ontwikkelde software (TCScore), deze bleek 95%

van de manueel gescoorde dicentrische chromosomen te detecteren tegenover de eerder

vermelde 50% bij gebruik van DCScore sofware.

Nadeel van het uitvoeren van een FISH voor detectie van dicentrische chromosomen is de

tijdsduur van het protocol, het neemt een ganse dag in beslag naast de twee dagen die nodig

zijn voor uitvoeren van het eigenlijke protocol voor opsporen van dicentrische chromosomen.

Voor het vaststellen van de schade bij een beperkt aantal patiëntstalen of voor wetenschappelijk

onderzoek is dit geen punt, echter, bij een grootschalig stralingsaccident ligt het belang bij een

snelle en grove triage eerder dan een nauwkeurige bepaling van de dosis. Onderzoek naar

gebruik van FISH voor opsporen van dicentrische chromosomen en hieraan gekoppeld de

ontvangen dosis staat dus voorlopig los van het gebruik ervan bij grootschalig stralingsaccident.

1.7. DOELSTELLING

Het doel van dit onderzoek is eerst het opstellen van een dosis-respons curve voor dicentrische

chromosoomaberraties via verschillende scoringsmethoden. Daarna wordt de bruikbaarheid

van de scoring van dicentrische chromosomen versus MN vergeleken voor partiële

lichaamsbestraling. Finaal wordt ook nog nagegaan of FISH-TC-gekleurde preparaten

eenvoudiger te scoren zijn dan Giemsa-gekleurde slides.

20

2. MATERIALEN EN METHODEN

2.1. DE DICENTRISCHE TEST

2.1.1. PRINCIPE

Wanneer door straling DNA-dubbelstrengbreuken ontstaan, kunnen deze aanleiding geven tot

dicentrische chromosoomaberraties. Met de dicentrische test worden deze aberraties

opgespoord en gekwantificeerd. Door bloedstalen in-vitro te bestralen met verschillende

dosissen kan een dosis-respons curve worden opgesteld. Deze kan dan gebruikt worden als

calibratiecurve om in vivo dosisblootstelling bij een accident te onderzoeken. Na het in-vitro

bestralen van de bloedstalen worden de lymfocyten gestimuleerd worden tot deling door middel

van PHA. De delende lymfocyten worden m.b.v. colcemid stilgelegd in metafase. De

verzamelde metafasen worden gekleurd via de Romanowsky-Giesma kleuring en in beeld

gebracht via een Zeiss lichtmicroscoop met het Metafer scanningplatform en beeldanalyse

systeem.

2.1.2. METHODOLOGIE

2.1.2.1. BESTRALING

Bloedstalen afkomstig van vrijwillige donoren worden bestraald bij 37°C (warmwaterbad) met

verschillende dosissen gaande van 0-4,5 Gy gammastralen (60Co bron), dosistempo 1 Gy per 7

minuten. Voor het onderzoek van partiële lichaamsbestraling wordt bestraald bloed (met

verschillende dosissen) gemengd worden met onbestraald bloed in verschillende verhoudingen.

2.1.2.2. BLOEDCULTUREN

Per dosispunt worden twee cultuurflessen (25cm2) bereid met daarin 4 ml cRPMI (500 ml

RPMI-1640 (Gibco) + 5 ml L-glutamine (Gibco)+ 2,5 ml peniciline/streptomycine(Gibco))

0,5ml FCS (Gico), 0,5 ml bloed en 100µl PHA (Gibco). De cultuurflessen worden in een

incubator (5% CO2) geplaatst (37°C). Na 24uur wordt 50µl colcemid (10µg/ml) (Serva)

toegevoegd. (0,5µg in 5ml cultuur) Na 48uur worden de culturen geoogst.

21

2.1.2.3. OOGSTEN VAN DE CULTUREN EN FIXEREN VAN DE CELLEN

De bloedculturen worden overgebracht in proefbuizen en gecentrifugeerd (8min, 1000 rpm).

Het supernatant wordt verwijderd en 5ml KCl (75 mM, 37°C) (Sigma) wordt langzaam

toegevoegd al vortexend . Dit wordt gedurende 15min geïncubeerd bij 37°C. Daarna wordt de

celsuspensie gecentrifugeerd (8min, 1000 rpm), het supernatant wordt weer verwijderd. 5ml

methanol/azijnzuur (3/1, 4°C) oplossing wordt traag toegevoegd al vortexend. Na opnieuw 8

min te centrifugeren bij 1000 rpm wordt het supernatant verwijderd. De fixatiestappen worden

tot 3 keer herhaald, tot het fixatief boven de cellen helder is.

Voor het maken van de preparaten wordt gebruik gemaakt van glaasjes die bewaard worden in

een gekoelde methanoloplossing (1% methanol in aq. dest., 4°C). Op een nog nat draagglas

wordt 40 µl celsuspensie gedruppeld. Eenzelfde volume fixatief (methanol/ijsazijn, 3:1) wordt

vervolgens op de slides aangebracht voor een betere spreiding van de metafasen.

2.1.2.4. ROMANOWSKY-GIEMSA KLEURING

Bereiden van de oplossing:

De Romanowsky-Giesma oplossing bestaat uit 80 ml Azuur B en 20 ml Eosine Y. (Merck)

De Hepesbuffer-werkoplossing wordt gemaakt door 300ml Hepesbuffer-stockoplossing samen

te voegen met 700 ml gedestilleerd water (0,03 M, pH 6,5) (Serva-Heidelberg). Voor de

hepesbuffer-stockoplossing wordt 900 ml oplossing A samengebracht met 100 ml oplossing B

(0.1 M, pH 6.5).

Oplossing A (Hepes-zuur) bestaat uit 23,83 g in 200 ml gedestilleerd water aangelengd tot 1

liter. Oplossing B (Hepes-zout) bestaat uit 26 g opgelost in 200 ml gedestilleerd water

aangelengd tot 1 liter.

Hepesbuffer-stockoplossing kan verschillende maanden bewaard worden op 4°C.

Een kleuringscuvet wordt gevuld met 3ml R-G kleuring + 75ml Hepes bufferoplossing (1/25).

Deze oplossing wordt gemaakt net voor gebruik, ze blijft stabiel gedurende 1u en wordt slechts

éénmaal gebruikt.

De slides worden gekleurd door 3 min in de kleuringscuvet te laten, gedurende deze tijd dient

alles afgeschermd te worden van licht door gebruik van een pot met daarrond aluminiumfolie

aangebracht. Na 3 min worden de slides gespoeld in 2 baden van gedestilleerd water.

Daarna dienen de slides aan de lucht gedroogd te worden, afgeschermd van stof. Na enkele uren

drogen kan afgedekt worden door middel van DPX (3 druppels).

Dit dient tenslotte 1 dag in een oven van 50°C gedroogd te worden.

22

2.1.3. ANALYSE

Voor analyse worden de met Giemsa gekleurde metafase preparaten ingescand met de Metafer

op een 10X vergroting. De MSearch module detecteert automatisch de metafasen op het

ingescande preparaat. De gedetecteerde metafasen worden met de Autocapt module vervolgens

op grote vergroting (63X) gescand. Voor een automatische scoring van dicentrische

chromosomen wordt na het inscannen van de preparaten gebruik gemaakt van de DCScore

module. Deze detecteert op een volledig automatische manier de dicentrische chromosomen in

de ingescande metafasen. Een semi-automatische scoring is ook mogelijk door de metafasen

waarin de DCscore module één of meerdere dicentrische chromosomen detecteerde te

overlopen en te corrigeren voor vals positieve of niet-gedetecteerde dicentrische chromosomen.

Tenslotte kan er ook manueel gescoord worden door alle ingescande metafasen manueel te

analyseren voor dicentrische chromosomen.

2.1.4. VERWERKING RESULTATEN

2.1.4.1. DOSIS-RESPONS CURVES VOLLEDIGE LICHAAMSBESTRALING

Giemsa-gekleurde preparaten voor 12 dosispunten afkomstig van 2 gezonde donoren worden

gescoord op de 3 mogelijke scoringswijzen. Voor elke donor worden twee slides per dosispunt

gescoord. Op basis van de scoringsresultaten wordt een dosis-respons curve opgesteld. De

dosis-respons curves voor de drie verschillende scoringsmethodes worden opgesteld. Het

bepalen van de exacte vergelijking gebeurt met behulp de software DoseEstimate die specifiek

ontwikkeld is voor biologische dosimetrie-doeleinden. In de optie ‘Yield curve fitting’ wordt

op basis van ingevoerde scoringsresultaten (Dosis, aantal gescoorde metafasen en aantal

gescoorde aberraties) de vergelijking van de hiermee overeenkomstige curve bepaald.

Voor het bepalen van de statistische significantie tussen de curves wordt de Wilcoxon signed-

rank test gebruikt. Voor deze test hoeven de populaties enkel dezelfde soort verdeling te

hebben, een normale verdeling is niet vereist in tegenstelling tot de t-test.

2.1.4.2. PARTIËLE LICHAAMSBESTRALING

Op basis van bloedculturen afkomstig van 2 gezonde donoren zijn preparaten beschikbaar die

20 situaties van partiële lichaamsbestraling nabootsen. De preparaten zijn beschikbaar voor

zowel dicentrische chromosomen als micronucleï en dit voor identieke situaties van partiële

23

lichaamsbestraling. Voor elke donor is een A- en B-slide beschikbaar voor 20 verschillende

situaties van partiële lichaamsbestraling. Er worden dus voor alle 20 situaties 2 slides per donor

gescoord en dit op een manuele manier. Voor de verdere verwerking van de scoringsresultaten

wordt gebruik gemaakt van de sofware CABAS. [35] Per slide wordt het scoringsresultaat

ingevoerd waarna de software een schatting maken van de Whole body dose (WBD), Partial

body dose (PBD) en %Exposed. De PBD is de dosis waaraan het bestraalde lichaamsvolume

blootgesteld werd, %Exposed is het volume van het lichaam dat bestraald werd en de WBD is

een fictieve dosis dat waaraan het volledige lichaam blootgesteld zou zijn als het geen partiële

maar volledige lichaamsbestraling zou betreffen.

Bedoeling van het bepalen van deze waarden is om op basis van de scoringsresultaten te

bekijken of een partiële lichaamsbestraling gedetecteerd kan worden aan de hand van de

verdeling van het aantal gescoorde dicentrische chromosomen. (Poisson-verdeling of niet)

2.2. FISH MET CENTROMEER EN TELOMEER PROBES

2.2.1. PRINCIPES

Naast de Romanowsky-Giesma kleuring, die de vorm van het dicentrisch chromosoom

duidelijk weergeeft, kunnen fluorescente DNA probes gebruikt worden om bepaalde delen van

de chromosomen aan te kleuren. Pan-centromeer en pan-telomeer probes zullen via in-situ

hybridisatie respectievelijk met alle centromeren en telomeren hybridiseren. De pan-

centromeer probe is gelabeld met FITC (Fluorescein isothiocyanate), de pan-telomeer probe is

gelabeld met TRITC (Tetramethylrhodamine). DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool) DNA-

kleuring wordt gebruikt om de chromosomen aan te kleuren. De combinatie van de fluorescente

probes met DAPI geeft met behulp van fluorescentie-microscopie een duidelijk beeld van

uitwisselingen tussen chromosomen.

2.2.2. METHODOLOGIE

De metafase preparaten verkregen na het fixeren van de cellen (zonder Giesma kleuring)

worden gewassen in PBS (1x 5min, kamertemperatuur). Daarna worden ze gefixeerd met 4%

paraformaldehyde in PBS gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Na nog 3 wasbeurten in

PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur kan 100µl pepsine (0,1mg/ml) aangebracht

24

worden op elke slide waarna een dekglaasje aangebracht wordt. De preparaten worden 7 min

in een incubator (37°C) gestoken. Hierna worden de was-fixatie-was stappen herhaald. Eenmaal

dit gebeurd is wordt nog eens in een Triton was-oplossing gewassen, 2x SSC met 1% Triton in

waterbad van 37°C. Na nog 2 wasbeurten met PBS gedurende 5 min bij kamertemperatuur

worden de preparaten gedehydrateerd met ethanol (50%-70%-100%), telkens 5 min bij

kamertemperatuur. De preparaten moeten minstens 20 min drogen aan de lucht alvorens verder

gegaan kan worden. De probes worden verdund in hybridisatiebuffer (70% formamide, 1%

blocking agent in 10mM Tris pH 7,2) (telomeerprobe: 1/100, centromeerprobe: 1/200)

(Eurogenetec). Op elk preparaat wordt 25µl gebracht waarna een dekglaasje aangebracht wordt.

De celpreparaten worden gedenatureerd in de thermobrite (80°C, 3min). Hybridisatie van de

probes vindt de daaropvolgende 2 uren plaats bij kamertemperatuur. Na hybridisatie worden

niet gebonden probes weggewassen m.b.v. wasbeurt I (70% formamide/10mM Tris pH 7,2, 2x

15min) en wasbeurt II (50mM Tris pH 7,2/ 150 mM NaCl pH 7,5 / 0,05% Tween-20, 3x 5min).

Tenslotte worden de slides 1x snel in PBS gewassen. Als laatste worden 2 druppels Dapi-

vectashield (Vector Laboratories) per slide aangebracht. De slides kunnen 1 maand bewaard

worden bij 4°C.

2.2.3. ANALYSE

De preparaten worden ingescand (10x vergroting) met de Metafer met de DAPI-filter. De

MSearch module zoekt hierin de metafasen. Daarna zal de Autocapt module de gevonden

metafasen op 63x vergroting inscannen in de drie gebruikte kleurkanalen (DAPI (blauw), FITC

(groen) en TRITC (rood)). Tenslotte gebeurt een manuele scoring van de dicentrische

chromosomen in de opgenomen metafasen.

2.2.4. VERWERKING RESULTATEN

De dosis-respons curve voor manuele scoring wordt opgesteld, de vergelijking van de curve

werd bepaald via de software DoseEstimate op dezelfde wijze als besproken in 2.1.4.1.Voor

het nagaan van de statistische significantie van het verschil tussen de dosis-respons curves voor

Giemsa- en FISH-gekleurde preparaten wordt opnieuw gebruik gemaakt van de Wilcoxon

signed-rank test aangezien het hier ook niet-normaal verdeelde data betreft.

25

3. RESULTATEN

3.1. DOSIS-RESPONS CURVES

3.1.1. DOSIS-RESPONS CURVES GIEMSA

Ingescande preparaten voor 12 dosispunten afkomstig van twee verschillende donoren werden

gescoord. De scoring gebeurde op drie verschillende manieren: automatische, semi-

automatische en manuele scoring. Voor een samenvatting het aantal gescoorde dicentrische

chromosomen per dosispunt per scoringsmethode zie Tabel 1.

Tabel 1: Samenvattende scoringsresultaten van de Giemsa-gekleurde preparaten

Automatisch Semi-automatisch Manueel

Dosis (Gy) # Dicentrische per 1000

# Dicentrische per 1000


0 32,0 1,1 1,0

0,1 32,6 3,5 4,5

0,2 33,1 8,4 18,5

0,5 48,7 21,5 33,5

0,75 59,7 30,6 61,0

1 78,2 46,0 129,0

1,5 130,1 93,1 252,5

2 209,8 166,9 367,5

2,5 304,8 261,0 504,0

3 370,5 318,6 778,0

4 573,8 505,1 1119,5

4,5 726,4 641,5 1266,0

Op basis van deze scoringsresultaten kon een dosis-respons curve opgesteld worden voor de

drie verschillende scoringsmethodes (Fig. 13). Een bepaling van de vergelijkingen van de

curves gebeurde via DoseEstimate (Tabel 2).

26

Fig. 13: dosis-respons curves voor scoring van dicentrische chromosomen geanalyseerd in Giemsa-gekleurde preparaten

Het verloop van de dosis-respons curves voor de drie methoden blijkt lineair-kwadratisch, wat

binnen de verwachtingen valt. De automatische methode blijkt slechts een 50% van de

chromosomen te detecteren die bij de manuele methode gedetecteerd worden. De curve voor

semi-automatisch ligt nog lager dan deze voor automatisch. Bij de semi-automatische methode

worden de vals-positieven die als dicentrische gedetecteerd worden bij de automatische

methode, manueel gecorrigeerd. Deze vals-positieven zijn bijvoorbeeld 2 overlappende

chromosomen die als één dicentrisch chromosoom aanzien worden. Gezien de curve voor semi-

automatisch meer dan 50% lager ligt dan de curve voor manueel, herkent de DCScore module

duidelijk veel dicentrische chromosomen niet als dusdanig. De significantie van het verschil

tussen de dosis-respons curves werd nagegaan met behulp van de Wilcoxon signed-rank test,

de curves voor automatisch en semi-automatisch bleken niet significant verschillend van elkaar

(p>0,05).

Tabel 2: Samenvatting factoren voor de vergelijkingen van de dosis-respons curves Giemsa

c α β

Automatisch 0,0285 (+/-0,0035) 0,028 (+/- 0,0076) 0,0285 (+/- 0,0022)

Semi-automatisch 0,001 (+/- 0,009 ) 0,026 (+/- 0,0048 ) 0,0262 (+/- 0,0016 )

Manueel 0,0006 (+/- 0,0016 ) 0,0721 (+/- 0,0142 ) 0,0517 (+/- 0,0049 )

Dosis (Gy)

0 1 2 3 4 5

# D

ic p

er

cel

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Automatisch Semi-automatisch Manueel

27

3.1.2. DOSIS-RESPONS CURVE FISH

Voor de FISH-TC-gekleurde preparaten werd enkel een manuele scoring uitgevoerd. Hierbij

werden de preparaten ingescand met behulp van de Metafer, de MSearch module detecteerde

de metafasen. De scoring gebeurde voor 2 donoren (Tabel 3).

Tabel 3: Samenvattende scoringsresultaten manueel FISH D01, D02 en gemiddelde van beide

D01 D02 D01 en D02 (**)

Dosis (Gy)


# Metafasen geteld


# Metafasen geteld


# Metafasen geteld

0 0,0 473 0,0 468 0,0 941

0,1 5,7 703 3,0 338 3,9 1041

0,2 (**) 12,6 717 12,6 717

0,25 10,5 381 (**) 10,5 381

0,5 23,2 474 9,5 210 16,4 684

0,75 (*)(**) 44,3 429 44,3 448

1 91,2 329 78,9 431 85,0 760

1,5 195,4 394 104,8 372 150,1 766

2 336,0 247 261,1 1122 298,6 1369

2,5 421,5 223 465,6 131 443,6 354

3 650,3 143 589,7 234 620,0 377

4 981,4 269 935,8 109 958,6 378

4,5 1310,3 116 1191,2 68 1250,8 184

(*) onvoldoende repesentatief (**) Waarden voor 0,2; 0,25 en 0,75 Gy geen

gemiddelde

Merk op dat hoe hoger de dosis van bestraling werd, hoe minder metafasen gedetecteerd konden

worden door de Metafer. Dit is het logische gevolg van een daling in celoverleving bij hogere

dosissen van bestraling. Voor D01 werd de scoring voor dosis 0,75 Gy onvoldoende

representatief bevonden waardoor beslist werd deze waarde niet te gebruiken voor verdere

verwerking. Op basis van de resultaten van de scoring werd voor elke donor apart een dosis-

respons curve opgesteld (Fig. 14). De curves blijken zoals verwacht ook een lineair-kwadratisch

verloop te hebben. De exacte vergelijking van de curve werd bekomen door invoeren van de

scoringsresultaten in DoseEstimate (Tabel 4).

28

Fig. 14: Dosis-respons curves D01 en D02

Tabel 4: Samenvatting factoren voor vergelijkingen van de dosis-respons curves FISH manuele scoring

c α β

D01 0,0000 0,0376 0,0553

D02 0,0000 0,0216 0,0542

Gemiddelde 0,0000 0,0095 0,0431

Door combineren van de scoringsresultaten van beide donoren werd de dosis-respons curve

‘Dosis-respons manueel FISH-TC’ bekomen (Fig. 15). Uit de resultaten blijkt dat ook deze

curve een lineair-kwadratisch verloop heeft, dit stemt overeen met de verwachtingen. De

vergelijking van de curve bekomen via DoseEstimate staat weergegeven in Tabel 4.

Dosis (Gy)

0 1 2 3 4 5

# D

ic/c

el

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

D02 D01 D02D01

29

Fig. 15: Dosis-respons manueel FISH-TC

3.1.3. VERGELIJKING DOSIS-RESPONS CURVES FISH- EN GIEMSA-GEKLEURDE

PREPARATEN

De bekomen dosis-repons curve voor manuele scoring van FISH-TC-gekleurde preparaten

werd samengevoegd op één figuur met de reeds bestaande curves voor scoring van Giemsa-

gekleurde preparaten zodat een vergelijking gemaakt kan worden (Fig. 16). Uit de vergelijkende

figuur komt duidelijk naar voor dat de dosis-respons curve voor manuele scoring van FISH-

TC-gekleurde preparaten iets lager ligt dan deze voor manuele scoring van Giemsa-gekleurde

preparaten.

Dosis (Gy)

0 1 2 3 4 5

#D

ic p

er

cel

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

30

Fig. 16: Vergelijking dosis-respons curves FISH-CT en Giemsa

Om resultaten verkregen in het lage dosisgebied beter te kunnen interpreteren werd ook een

figuur opgesteld voor het dosisgebied gaande van 0-1 Gy (Fig. 17). De datapunten voor manuele

scoring van Giemsa-gekleurde preparaten blijken voornamelijk hoger te liggen dan de

datapunten van de andere scoringsmethodes, in het lage dosisgebied ligt de curve voor

automatische scoring het hoogst. Dit als gevolg van een overdetectie van dicentrische

chromosomen bij lage dosissen. De datapunten voor semi-automatische scoring van Giemsa-

gekleurde preparaten blijven ongeveer de laagste, zowel in het lage dosisgebied als bij de

hogere dosissen. Tenslotte liggen de datapunten voor manuele scoring van FISH-TC gekleurde

preparaten ongeveer het laagst in het lage dosisgebied, in het hogere dosisgebied liggen de

datapunten steeds onder de datapunten voor manuele scoring van Giemsa-gekleurde preparaten.

De significantie van de verschillen tussen de curves werd getest met behulp van de Wilcoxon

signed-rank test, allen bleken significant verschillend van elkaar te zijn (p<0,05) met

uitzondering van de curves voor ‘auto Giemsa’ en ‘semi-auto Giemsa’ (p>0,05).

Dosis (Gy)

0 1 2 3 4 5

#D

ic p

er

ce

l

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

DIC manueel GIEMSA DIC Semi-auto GIEMSA DIC auto GIEMSA DIC manueel FISH

31

Fig. 17: Vergelijking Giemsa en FISH-TC laag dosisgebied


Bestraald en onbestraald bloed werd in verschillende verhoudingen gemengd om partiële

lichaamsbestraling na te bootsen, zo werden 20 situaties van partiële lichaamsbestraling

gecreëerd (Tabel 5). Tijdens uitvoering van deze studie werden preparaten gemaakt met de

bloedstalen voor de 20 verschillende situaties. Slides voor scoren van micronucleï (MN) waren

reeds gemaakt, ingescand en beschikbaar voor scoring.

Dosis (Gy)

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

#D

ic p

er

ce

l

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

DIC manueel GIEMSA DIC Semi-auto GIEMSA DIC auto GIEMSA DIC manueel FISH

32

Tabel 5: De gehanteerde situaties voor nabootsing partiële lichaamsbestraling

WBD (Gy) PBD (Gy) % exp

Situatie 1 0 0 0

Situatie 2 0,25 1 25

Situatie 3 0,5 1 50

Situatie 4 0,75 1 75

Situatie 5 1 1 100

Situatie 6 0,25 2 12,5

Situatie 7 0,5 2 25

Situatie 8 0,75 2 37,5

Situatie 9 1 2 50

Situatie 10 2 2 100

Situatie 11 0,25 4 6,25

Situatie 12 0,5 4 12,5

Situatie 13 0,75 4 18,75

Situatie 14 1 4 25

Situatie 15 2 4 50

Situatie 16 0,25 6 4,17

Situatie 17 0,5 6 8,33

Situatie 18 0,75 6 12,5

Situatie 19 1 6 16,67

Situatie 20 2 6 33

3.2.1. SCORING DICENTRISCHE CHROMOSOMEN EN MN

Er werd een manuele scoring uitgevoerd op slides afkomstig van 2 verschillende donoren. De

scoringsresultaten werden vervolgens verder verwerkt in CABAS. Voor de resultaten zie Tabel

6. Bedoeling hiervan was om op basis van de scoringsresultaten te bekijken of een partiële

lichaamsbestraling gedetecteerd kan worden aan de hand van de verdeling van het aantal

gescoorde dicentrische chromosomen of MN (Poissonverdeling of niet). Volgende waarden

werden berekend door het programma: ‘Dispersion Index’, ‘Whole body dose’, ‘Partial body

dose’ en ‘Percent of body exposed’. Hiermee kon verder gewerkt worden voor het bepalen van

de correctheid van de voorspelling.

33

Tabel 6: Gehanteerde situaties partiële lichaamsbestraling met bijhorende berekende waarden voor WBD (Gy), PBD (Gy), %exp µ-value en dispersion index.

True Calculated

Situatie WBD (Gy)

PBD (Gy) % exp

WBD MN (Gy)

WBD DIC (Gy)

PBD MN (Gy)

PBD DIC (Gy)

% Exposed MN

% Exposed DIC

µ-value MN

µ-value DIC

Dispersion Index MN

Dispersion Index DIC

1 0 0 0 0,00 0,00 1,54 0,00 2,29 0,00 3,25 1,13

2 0,25 1 25 0,26 0,30 1,39 1,28 9,16 10,72 1,94 1,12 1,09 1,09

3 0,5 1 50 0,48 0,49 1,27 1,24 22,38 19,31 2,30 1,00 1,10 1,06

4 0,75 1 75 0,66 0,54 1,89 1,49 40,80 36,13 6,39 2,11 1,28 1,16

5 1 1 100 0,89 0,74 1,54 2,12 25,24 37,54 1,93 2,35 1,09 1,27

6 0,25 2 12,5 0,33 0,42 2,05 1,62 22,04 25,25 7,09 3,07 1,31 1,28

7 0,5 2 25 0,57 0,51 2,24 1,47 32,27 33,10 8,44 2,71 1,41 1,15

8 0,75 2 37,5 0,84 0,64 2,53 2,23 40,91 14,97 10,31 2,98 1,46 1,23

9 1 2 50 0,83 0,69 2,28 1,98 42,10 36,70 6,28 4,51 1,29 1,26

10 2 2 100 1,81 1,22 2,18 1,96 86,76 20,17 3,14 2,14 1,14 1,13

11 0,25 4 6,25 0,19 0,39 1,76 3,25 18,85 14,78 4,77 15,38 1,21 1,84

12 0,5 4 12,5 0,45 0,48 2,90 2,48 20,94 21,06 13,71 7,08 1,61 1,41

13 0,75 4 18,75 0,36 0,64 3,04 3,10 17,13 24,96 13,71 8,95 1,61 1,63

14 1 4 25 0,54 0,81 3,53 3,21 21,50 31,46 18,19 10,88 1,81 1,71

15 2 4 50 1,01 1,27 3,45 3,09 38,05 51,05 14,31 6,36 1,64 1,51

16 0,25 6 4,17 0,17 0,31 3,79 2,16 0,79 14,56 2,54 4,97 1,11 1,33

17 0,5 6 8,33 0,19 0,46 3,06 3,86 13,70 16,09 16,12 15,78 1,71 1,92

18 0,75 6 12,5 0,35 0,79 3,07 3,64 17,99 29,04 18,44 9,26 1,81 1,80

19 1 6 16,67 0,18 1,07 2,59 4,96 13,07 36,13 11,23 21,66 1,49 2,35

20 2 6 33 0,70 1,83 4,14 5,31 25,42 58,26 26,87 20,50 2,19 2,44

34

Uit tabel 6 blijkt dat de voorspelling van de WBD redelijk goed is voor PBD van 1 en 2 Gy, dit

geldt zowel voor MN als dicentrische chromosomen. Voor hogere waarden van PBD (4 en 6

Gy) blijkt scoring van dicentrische chromosomen een betere voorspelling van de WBD te geven

dan de scoring van MN. Opvallend is dat de situaties met volledige lichaamsbestraling (situaties

5 en 10) toch niet als dusdanig herkend worden, de voorspelde waarde voor percentage

bestraald lichaamsvolume wijkt volledig af van 100%. En dit terwijl de voorspelling van PBD

en WBD wel een aanvaardbaar resultaat oplevert, behalve de berekende WBD op basis van

scoring van dicentrische chromosomen voor situatie 10 (1,22 ipv 2 Gy) Voor scoring van

dicentrische chromosomen werden 15 van 17 situaties voor partiële lichaamsbestraling als

dusdanig herkend (µ>1,96). Voor de scoring van micronucleï werden 16 van de 17 situaties

correct herkend als partiële lichaamsbestraling (µ>1,96). In Tabel 7 werd een rangschikking

gedaan van de situaties met bijhorende waarden voor WBD, PBD en % exp volgens oplopende

µ-waarde. De situaties die fout ingeschat werden (partiële lichaamsbestraling aanzien als

volledige lichaamsbestraling of omgekeerd) betreffen steeds lagere PBD’en van 1 of 2 Gy. Het

juist inschatten als partiële lichaamsbestraling zegt echter nog niets over de juistheid van de

geschatte waarden (WBD, PBD en % exp).

Tabel 7: Rangschikking situaties volgens oplopende µ-waarde

Situatie WBD (Gy) PBD (Gy) % exp

U-value MN Situatie WBD (Gy) PBD (Gy) % exp

U-value DIC

5 1 1 100 1,9292 3 0,5 1 50 1,00215

2 0,25 1 25 1,94295 2 0,25 1 25 1,11535

3 0,5 1 50 2,2976 16 0,25 6 4,166667 2,111

16 0,25 6 4,166667 2,54235 6 0,25 2 12,5 2,1443

10 2 2 100 3,1377 10 2 2 100 2,35235

1 0 0 0 3,2487 11 0,25 4 6,25 2,71485

11 0,25 4 6,25 4,77365 9 1 2 50 2,98475

9 1 2 50 6,27715 1 0 0 0 3,06775

4 0,75 1 75 6,3903 4 0,75 1 75 4,51035

6 0,25 2 12,5 7,08685 15 2 4 50 4,9733

7 0,5 2 25 8,44285 12 0,5 4 12,5 6,3578

8 0,75 2 37,5 10,30805 8 0,75 2 37,5 7,0828

19 1 6 16,66667 11,228 19 1 6 16,66667 8,94875

13 0,75 4 18,75 13,70725 14 1 4 25 9,2633

12 0,5 4 12,5 13,71265 13 0,75 4 18,75 10,87955

15 2 4 50 14,3127 7 0,5 2 25 15,3828

17 0,5 6 8,333333 16,1184 17 0,5 6 8,333333 15,78275

14 1 4 25 18,1918 20 2 6 33 20,50385

18 0,75 6 12,5 18,44175 18 0,75 6 12,5 21,66465

20 2 6 33 26,8699 5 1 1 100

35

3.2.2. VERGELIJKING CORRECTHEID VAN DE VOORSPELLING OP BASIS VAN

SCORING VAN DICENTRISCHE CHROMOSOMEN VS MN

Om te kunnen vergelijken welke van de twee methodes het meest gepast is om partiële

lichaamsbestraling te kunnen detecteren en bovendien de juistheid van de berekende waarden

te kunnen bespreken werden verschillende grafieken opgemaakt voor berekende Whole body

dose (WBD), Partial body dose (PBD) en Percentage of the body exposed (% exp) allen in

functie van de echte waarde. Tot slot werd ook de Dispersion index uitgezet in functie van %

exp.

3.2.2.1. WHOLE BODY DOSE (WBD)

Fig. 18: Bubblesize in functie van PBD

In Fig. 18 werd de berekende WBD uitgezet in functie van de echte WBD waarbij de grootte

van de ‘bubble’ gecorreleerd is met de werkelijke PBD. Er is duidelijk een onderschatting van

True WBD (Gy)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

calc

ula

ted

WB

D (

Gy)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

MNWBD (Gy) vs WBD DIC (Gy)

MN DIC

36

de berekende WBD tov de echte WBD voor MN. De onderschatting is telkens het grootst voor

grote PBD. Voor dicentrische chromosomen is er ook een lichte onderschatting naarmate de

WBD stijgt, de situaties met grote PBD geven echter in tegenstelling tot bij MN wel een meer

correcte inschatting van de WBD.

3.2.2.2. PARTIAL BODY DOSE (PBD)

Fig. 19: Bubblesize in functie van WBD

In Fig. 19 werd de berekende PBD uitgezet in functie van de echte PBD waarbij de grootte van

de ‘bubbles’ samenhangt met de werkelijke WBD. Voor lage dosissen van PBD is er een

overschatting van de berekende op de echte waarde terwijl er voor hoge dosissen van PBD

duidelijk een onderschatting is. Dit geldt zowel voor MN als voor dicentrische, voor

dicentrische is de over- en onderschatting echter het kleinst. De onder- en overschatting voor

MN blijkt enkel bij kleine tot middelgrote WBD. Voor situaties met grotere WBD blijkt de

schatting van de PBD correcter.

true PBD (Gy)

0 1 2 3 4 5 6 7

calc

ula

ted P

BD

(G

y)

0

1

2

3

4

5

6

7

MNPBD (Gy) vs PBD DIC (Gy)

MN DIC

37

3.2.2.3. PERCENTAGE OF THE BODY EXPOSED

Fig. 20: Bubble size in functie van WBD

In Fig. 20 staat de berekende ‘% body exposed’ uitgezet in functie van de echte ‘% body

exposed’, de grootte van de ‘bubble’ is gecorreleerd met de werkelijke WBD. Bij een lager

percentage bestraald lichaamsvolume is er voor beide een overschatting van de berekende op

de echte waarde voor ‘% exp’ terwijl voor een hoger percentage bestraald lichaamsvolume voor

beide een onderschatting gedaan wordt. De overschatting is gecorreleerd met een lagere WBD.

De over- en onderschatting is telkens het kleinst voor MN.

true % exposed

0 20 40 60 80 100 120

calc

ula

ted

% e

xpo

sed

0

20

40

60

80

100

120

% exp vs % Exposed MN % exp vs % Exposed DIC DIC

MN

38

3.2.2.4. DISPERSION INDEX IN FUNCTIE VAN ‘% OF THE BODY EXPOSED’

Fig. 21: 'Dispersion index' in functie van '% body exposed'

Op Fig. 21 werd de dispersie-index uitgezet in functie van het percentage bestraald

lichaamsvolume. Er is een duidelijk verband te zien voor DIC, de curve is dalend. De dispersion

index daalt wanneer het ‘% body exposed’ stijgt. Er is dus minder spreiding van de resultaten

wanneer een groter deel van het lichaam blootgesteld werd. De curve voor MN is ook dalend

maar beduidend minder dan deze voor DIC, richtingscoëfficiënt van de curve is lager.

% body exposed

0 20 40 60 80 100 120

Dis

pe

rsio

n in

de

x

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

MN DIC

39

4. BESPREKING

Deze masterproef bestond uit twee grote luiken. Het eerste luik werd gewijd aan opstellen van

in-vitro dosis-respons curves voor zowel Giemsa-gekleurde preparaten als FISH-TC-gekleurde

preparaten. Deze in-vitro calibratiecurves kunnen gebruikt worden om in-vivo

stralingsblootstelling te schatten bij stralingsaccident. In dit onderzoek werd een vergelijking

gemaakt tussen de dosis-respons curves verkregen via verschillende scoringsmethodes voor

Giemsa- en FISH-TC-gekleurde preparaten. Deze verschillende methodes waren automatische,

semi-automatische en manuele scoring voor Giemsa-gekleurde preparaten. Voor FISH-TC-

gekleurde preparaten werd enkel manueel gescoord. Voor opstellen van alle dosis-respons

curves werd gebruik gemaakt van bloedstalen afkomstig van twee gezonde vrijwillige donoren

die in-vitro bestraald werden met 60Co γ-stralen, met dosissen tussen 0 en 4,5 Gy. Op basis van

de gemiddelde scoringsresultaten van beide donoren werd één dosis-respons curve opgesteld

die representatief is voor een bepaalde scoringsmethode.

Tweede luik in deze masterproef was het vergelijken van de micronucleus test ten opzichte van

de dicentrische test voor detectie van partiële lichaamsbestraling. Hiervoor werd bloed bestraald

met 60Co γ-straling, met dosissen tussen 1 en 6 Gy. Dit bestraalde bloed werd in verschillende

verhoudingen gemengd om een partiële lichaamsbestraling na te bootsen. De slides voor

scoring van micronucleï werden gekleurd met DAPI en deze voor scoring van dicentrische

chromosomen werden gekleurd met Giemsa, daarna werd een scoring uitgevoerd. De

scoringsresultaten werden verwerkt met de software CABAS waarna beide methodes vergeleken

konden worden op basis van de berekende waarden: Whole body dose, Partial body dose, % of

the body exposed en dispersion index.

4.1. CELDELING

Een probleem gerezen bij dit onderzoek was het lage aantal metafasen bij culturen bestraald

met hoge dosissen. Voldoende metafasen kunnen scoren is essentieel om een zo representatief

mogelijk resultaat te kunnen bekomen. Hoe hoger de dosis van bestraling, hoe lager celdeling

ten gevolge van de geïnduceerde DNA-celschade. Dit zorgt ervoor dat preparaten van

bloedcultuur bestraald met een dosis vanaf 4-4,5 Gy steeds een laag aantal metafasen bevatten.

40

Voor deze dosissen moesten extra preparaten gescoord worden om aan het uiteindelijke totaal

aantal gescoorde metafasen te kunnen komen. Een techniek die beter geschikt is voor

dosisbepaling na blootstelling aan hoge dosissen is premature chromosoom condensatie (PCC).

PCC zorgt voor directe visualisatie van chromosoomaberraties in interfase cellen, een celdeling

is niet nodig bij deze techniek. Uit onderzoek van Lamadrid Boada et al. (2013) is gebleken dat

dit een geschikte methode is als biodosimeter voor volledige lichaamsbestraling met hoge

dosissen van ioniserende straling. [36] In een studie van M’kacher et al. werd eveneens de

combinatie van telomeer- en centromeerprobes met PCC gebruikt om dicentrische

chromosomen te detecteren. Voordeel hiervan is dat een PCC heel snel uitgevoerd kan worden.

Bovendien is door gebruik van de probes visualisering mogelijk van dicentrische chromosomen

in interfase cellen. Er werd zowel een automatische als een manuele scoring uitgevoerd.

Automatische scoring was mogelijk met gebruik van een eigen ontwikkelde software

(TCScore) voor automatische detectie van dicentrische chromosomen na FISH-kleuring met

pan-centromeer- en pan-telomeerprobes (FISH-TC-kleuring). Er werd een dosis-respons curve

opgesteld voor dosissen tot 8 Gy voor beide scoringsmethodes. De resultaten bleken niet

significant verschillend te zijn van elkaar waaruit men concludeerde dat manuele scoring niet

nodig is en aldus volledig automatisch gescoord kan worden. [37] Aangezien er in het

onderzoek van deze masterproef gewerkt is met dosissen tot 4,5 Gy en dit al problemen

opleverde om tot een voldoende aantal te scoren metafasen te komen lijkt PCC inderdaad de

betere optie voor dosisbepaling bij hogere dosissen.

In dit onderzoek situeerde het probleem van een laag aantal metafasen zich vooral in de scoring

FISH-TC-gekleurde slides. Bij de Giemsa-gekleurde slides konden telkens 2000-3000

metafasen per dosis gescoord worden ongeacht de dosis waarmee het bloed bestraald werd. Bij

de FISH-TC-gekleurde slides konden slechts maximum 1400 metafasen gescoord worden voor

één dosis. Het aantal metafasen daalde dus niet alleen bij hogere dosis, voor elke dosis werden

reeds veel minder metafasen gedetecteerd op de preparaten van de FISH-TC gekleurde slides.

Dat de slides voor beide donoren door twee verschillende personen werden gemaakt, sluit uit

dat het probleem zich situeert in de manier van slides maken. Het vermoeden is dat ofwel de

FISH-TC-kleuring ervoor zorgt dat metafasen weggewassen worden, ofwel dat de classifiers

ingesteld voor detectie van de metafasen door de Metafer niet optimaal zijn waardoor veel

metafasen gewoon niet gedetecteerd worden door de MSearch module. Verder onderzoek naar

de oorzaak van het probleem is zeker nodig.

41

4.2. DOSIS RESPONS CURVES

Via een dosis-respons curve kan geobserveerde schade gelinkt worden aan de opgelopen dosis.

Voor vergelijken van scoringsmethodes werden de dosis-respons curves voor automatische,

semi-automatische en manuele scoring opgesteld voor Giemsa-gekleurde preparaten. (Fig. 13)

Alle curves bleken een lineair-kwadratisch verloop te hebben, wat binnen de verwachtingen

valt. Het is reeds lang bekend dat dosis-respons curves voor chromosoomaberraties veroorzaakt

door lage LET-straling een lineair-kwadratisch verloop kennen met vergelijking Y = C + αD +

βD2, waarbij α en β respectievelijk de coëfficiënten zijn van de lineaire en kwadratische term.

[38][39] Voor de automatische methode werd slechts 50% van de dicentrische

chromosoomaberraties gedetecteerd in vergelijking met de manuele methode. De DCScore

software kan dus heel veel dicentrische chromosomen niet als dusdanig detecteren. Dit stemt

overeen met de bevindingen van M’Kacher et al. (2014) en Romm et al. (2013). [33][40] De

curve voor de semi-automatische scoringsmethode ligt nog lager dan deze voor automatische

scoring. Dit kan verklaard worden doordat er een correctie gedaan werd van de vals positieven

die bij de automatische methode wel meegerekend worden in de scoring. Het aantal vals-

positieven is vooral een probleem bij lage dosissen. Onze resultaten stemmen overeen met de

bevindingen van Romm et al. (2013) die concludeert dat het niet mogelijk is om een volledig

automatische scoring te hanteren voor dosisbepaling gezien het hoge aantal gedetecteerde

dicentrische chromosomen bij lage dosissen, vele daarvan zijn vals-positieven die manueel

gereject moeten worden. Een volledig manuele scoring van Giemsa-gekleurde preparaten die

resulteert in betere resultaten is heel tijdrovend. Voor semi-automatische scoring van 150

metafasen waren slechts twee minuten nodig om de kandidaat-dicentrische chromosomen

manueel te checken tegenover het manueel analyseren van 50 metafasen per uur voor manuele

scoring.[40] Wanneer zich een grootschalig stralingsaccident voordoet is het van essentieel

belang zo snel mogelijk een ruwe dosisbepaling te kunnen doen. Voor triage is een manuele

scoring geen optie wegens de te lange tijdsduur. De automatische of semi-automatische

methode is wel bruikbaar voor heel snelle triage. Na deze snelle triage kan dan een manuele

scoring uitgevoerd worden die een meer correcte dosisbepaling oplevert.

Naast de curves voor Giemsa-gekleurde preparaten werd ook een dosis-respons curve voor

manuele scoring van FISH-TC-gekleurde preparaten opgesteld. (Fig. 15) Deze heeft zoals

verwacht een lineair-kwadratisch verloop. De datapunten bekomen voor manuele scoring van

Giemsa-gekleurde preparaten liggen systematisch hoger dan diegene voor manuele scoring van

42

FISH-TC-gekleurde preparaten. Dit suggereert een overdetectie van dicentrische chromosomen

op Giemsa-gekleurde preparaten. In de studie van Bhavani et al. (2014) werd tevens de manuele

scoring van Giemsa- ten opzichte van FISH-TC-gekleurde preparaten vergeleken. [41] Daarbij

werd ook vastgesteld dat de scoringsresultaten voor Giemsa-gekleurde preparaten steeds hoger

liggen dan voor FISH-gekleurde preparaten. Er werd echter geen statistische significantie

vastgesteld behalve voor hogere dosissen (4 en 5 Gy). Deze resultaten suggereren een

mogelijkheid van mis-scoring van dicentrische chromosomen door conventionele Giemsa-

kleuring, wat ook reeds eerder gesuggereerd geweest is.[42] Deze bevindingen correleren

echter niet met de bevindingen van de eerder besproken studie van M’kacher et al. (2014). [33]

Uit de resultaten van deze studie bleek na manuele scoring van FISH-TC-gekleurde preparaten

een significant hogere frequentie aan dicentrische chromosomen te zijn gedetecteerd in

vergelijking met uniforme kleuring. Verklaring van dit resultaat legt men bij de verbeterde

detectie van dicentrische chromosomen die overlappend zijn bij de FISH-TC-gekleurde

preparaten resulterend in een hoger aantal gedetecteerde dicentrische chromosomen. Om deze

inconsistentie tussen de resultaten uit de studie van M’kacher et al. (2014) enerzijds en deze uit

de studie van Bhavani et al. (2014) en deze masterproef anderzijds te kunnen verklaren werden

de scoringsresultaten voor manuele scoring van de FISH-TC-gekleurde preparaten uit onze

studie vergeleken met deze uit de studie van M’kacher et al. (2014). Een goede overeenkomst

werd gevonden voor de scoring van Giemsa-gekleurde preparaten. Het verschil werd gevonden

in de scoring van FISH-TC-gekleurde preparaten. Voor het verschil in frequentie gescoorde

dicentrische chromosomen kon geen verklaring gevonden worden aan de hand van het artikel.

Vergelijken van de scoringstijd van dicentrische chromosomen in FISH-TC-gekleurde en

Giemsa-gekleurde preparaten doet besluiten dat de scoring van de FISH-TC gekleurde

preparaten veel sneller verloopt. Naast de tijdswinst die scoring van FISH-TC gekleurde

preparaten oplevert, is er ook het voordeel dat de beelden veel minder ruimte laten voor twijfel

over het feit of men met twee chromosomen die tegen elkaar liggen te maken heeft of met een

dicentrisch chromosoom. Waar bij Giemsa enkel kan afgegaan worden op de vorm van het

chromosoom om dicentrische chromosomen te detecteren, kan men bij FISH-TC-gekleurde

preparaten kijken naar de vorm (bekomen door de DAPI-kleuring) én de aanwezigheid van rood

en groen signaal op respectievelijk de telomeren en het centromeer van een chromosoom. Bij

FISH-TC-gekleurde preparaten met een geslaagde kleuring bestaat er nooit twijfel over de vorm

van een bepaald chromosoom door de aanwezige fluorescente probes op telomeren en

centromeer. Wanneer twee chromosomen overlappen of tegen elkaar liggen zijn ze nog steeds

43

duidelijk te herkennen als twee afzonderlijke chromosomen. Ook uit de studie van M’kacher et

al. (2014) bleek dat de scoring van FISH-TC-gekleurde preparaten veel minder afhankelijk is

van de expertise van de operator, men stelde een grote reproduceerbaarheid van de scoring vast.

[33] Nadelig aan de FISH-TC-kleuring is de tijdrovendheid van de kleuring ten opzichte van

Giemsa-kleuring. Waar Giemsa-kleuring in enkele minuten uitgevoerd wordt, neemt FISH-TC-

kleuring enkele uren in beslag. Ook het inscannen van FISH-TC-gekleurde preparaten neemt

aanzienlijk meer tijd in beslag dan het inscannen van Giemsa-gekleurde preparaten. Daar waar

automatische en semi-automatische scoring van Giemsa-gekleurde preparaten een goede

analysemethode vormt bij grootschalige stralingsaccidenten, heeft manuele scoring van FISH-

TC-gekleurde preparaten eerder zijn nut bij accurate dosisbepaling van een klein aantal stalen.

Ook in het lage dosisgebied is het nuttig om gebruik te maken van een FISH-TC-kleuring gezien

accuraatheid van scoren essentieel is om een inschatting van een lage dosis te kunnen maken.


Uit tabel 6 blijkt dat de voorspelling van de WBD redelijk goed is voor PBD van 1 en 2 Gy. Dit

geldt zowel voor MN als dicentrische chromosomen. Voor hogere waarden van PBD (4 en 6

Gy) blijkt scoring van dicentrische chromosomen een betere voorspelling van de WBD op te

leveren dan de scoring van MN. Verklaring hiervoor is het feit dat bij hogere dosissen de

geïnduceerde celschade ervoor zorgt dat de cel niet verder geraakt in de mitose en aldus geen

kerndeling kan plaatsvinden. Hierdoor kunnen in deze cellen geen miconucleï gescoord

worden.

Opvallend is dat de situaties met volledige lichaamsbestraling (situaties 5 en 10) toch niet als

dusdanig herkend worden, de voorspelde waarde voor ‘% exp’ wijkt volledig af van 100%. En

dit terwijl de voorspelling van PBD en WBD wel een aanvaardbaar resultaat oplevert in deze

situaties, behalve de berekende WBD op basis van scoring van dicentrische chromosomen voor

situatie 10 (1,22 ipv 2 Gy).

In dit onderzoek bleken de waarden voor berekende whole body dose (WBD) (Fig. 18) een

duidelijke onderschatting te zijn op de werkelijke waarden, zowel voor MN als voor

dicentrische chromosomen. De onderschatting was het grootst voor MN. Hoe hoger de echte

WBD, hoe groter de onderschatting werd. Voor dicentrische chromosomen is er ook een lichte

44

onderschatting naarmate de WBD stijgt, de situaties met grote PBD geven echter in

tegenstelling tot bij MN wel een meer correcte inschatting van de WBD. Deze resultaten komen

niet overeen met de studie van Venkatachalam et al. (1999) waarin biodosimetrie gebruik

makend van het micronucleus assay getest werd voor partiële lichaamsbestraling bij therapie.

[43] Hier stelde men een overschatting van de WBD vast. De vergelijkbaarheid van de studie is

echter beperkt gezien het over een in vivo situatie gaat waarbij de patiënten allen dezelfde dosis

van bestraling toegediend kregen. Bovendien werd in deze studie een berekende WBD van

1,8 Gy en PBD van 8 Gy met ‘% exp’ van 16,6% gehanteerd terwijl in deze masterproef slechts

tot 6 Gy PBD voor eenzelfde ‘% exp’.

Op de curve voor partial body dose (Fig. 19) was er voor lage dosissen een overschatting van

de berekende op de echte waarde voor PBD te zien terwijl er voor hoge dosissen duidelijk een

onderschatting was. Dit geldt zowel voor MN als voor dicentrische chromosomen, voor

dicentrische chromosomen was de over- en onderschatting echter het kleinst. De onder- en

overschatting voor MN komt voor enkel bij kleine tot middelgrote WBD. Voor situaties met

grotere WBD blijkt de schatting van de PBD correcter.

Wat betreft de voorspelling van het percentage bestraald lichaamsvolume was er een

overschatting bij laag percentage bestraald lichaamsvolume en een onderschatting voor

situaties met een hoger percentage bestraald lichaamsvolume, zowel bij MN als bij dicentrische

chromosomen. De overschatting is gecorreleerd met een lagere WBD MN bleken over het

algemeen de beste schatting te geven. (Fig. 20)

Wanneer de dispersion index uitgezet werd in functie van het percentage bestraald

lichaamsvolume (Fig. 21) was er een duidelijk verband te zien voor DIC. De dispersion index

daalde wanneer het percentage bestraald lichaamsvolume steeg. Er was dus minder spreiding

van de resultaten wanneer een groter deel van het lichaam blootgesteld werd.

Samengevat blijkt uit onze preliminaire resultaten dat op basis van de scoring van dicentrische

chromosomen een betere voorspelling gemaakt kan worden van de WBD en PBD bij werkelijke

PBD van 4 en 6 Gy, de schatting van het percentage bestraald lichaamsvolume bleek het best

op basis van de scoring van MN, alhoewel op basis van scoring van dicentrische chromosomen

een betere reproduceerbaarheid bereikt kan worden.

45

Veel literatuur om de bevindingen mee te vergelijken bestaat er tot op heden nog niet. De meeste

studies rond PBD werken uitsluitend met de dicentrische test. Alhoewel de dicentrische test

beschouwd wordt als de methode om partiële lichaamsbestraling te detecteren, werd in dit

onderzoek geopteerd om een vergelijking te maken tussen dicentrische- en micronucleus-test

zodat nagegaan kon worden of deze laatste toch eventueel bruikbaar kan zijn bij een partiële

lichaamsbestraling. Een studie uitgevoerd in het kader van het MULTIBIODOSE project

(2014) onderzocht de mogelijkheid van automatisch scoren van MN voor triage-doeleinden.

Automatische en semi-automatische scoring werden vergeleken. Wanneer de ontvangen dosis

groter was dan 3 Gy, bleek het moeilijk om een betrouwbare schatting van de WBD te doen die

enkel gebaseerd is op de opbrengst aan MN. Dit probleem van dosis-afhankelijkheid werd

opgelost door σ2/y te bepalen. Uit de resultaten blijken hoge waarden voor σ2/y (1,8-2,5) een

indicator te zijn voor hoge dosis partiële lichaamsbestralingen waarvoor de schatting van de

WBD onbetrouwbaar is vanwege de inhibitie van proliferatie (>3 Gy). Finaal werd na de

analyse van de overdispersie van de MN-frequentiedistributie σ2/y, verkregen door semi-

automatische scoring, besloten dat de waarde voor deze parameter een teken is van

betrouwbaarheid voor berekende equivalente WBD in geval van een partiële

lichaamsbestraling. [44]

Wat betreft de scoring van dicentrische chromosomen zijn de experimenten uitgevoerd in

studies op het gebied van partiële lichaamsbestraling niet geheel vergelijkbaar omdat telkens

slechts een heel beperkt aantal verschillende situaties gehanteerd werd. In de studie van

bijvoorbeeld Valente et al. (2015) werd partiële lichaamsbestraling onderzocht bij bavianen. De

gehanteerde situaties in deze studie zijn zodanig verschillend van diegene gebruikt in dit

onderzoek dat de resultaten niet te vergelijken zijn. [32] Loyd et al. (1987) onderzocht bijna 30

jaar geleden al de mogelijkheid om op basis van scoring van dicentrische chromosomen een

partiële lichaamsbestraling te detecteren. Partiële lichaamsbestraling werd gesimuleerd door

bestraald bloed te mengen met onbestraald bloed. De enige gehanteerde situatie in dit onderzoek

was een gesimuleerde 50% blootstelling aan 3,5 Gy γ-straling en werd toegepast op 11

verschillende bloedstalen afkomstig van één donor. De scoring werd op een geheel manuele

wijze gedaan. Op basis van de scoring werd een dosisbepaling gedaan met behulp van de

Poisson-methode. Gemiddelde berekende PBD was 2,91 Gy ten opzichte van de werkelijke

3,5 Gy, wat een afwijking van 16,86% betekent. Het gemiddelde geschatte percentage bestraald

lichaamsvolume was 47,18%, er was dus een minimale afwijking op de werkelijke 50%. [45]

In deze masterproef werd geen identieke situatie gehanteerd, de meest vergelijkende situatie is

46

50% bestraald lichaamsvolume en PBD van 4 Gy (situatie 15). Deze situatie werd geschat op

3,09 Gy PBD, wat een afwijking van 22,75% betekent, het %bestraald lichaamsvolume werd

geschat op 51,05%. De scoring van deze situatie leverde in onze studie ook een aanvaardbare

inschatting op. De studie die het meest bruikbaar is voor vergelijking van de resultaten is deze

van Vaurijoux et al. (2012) waarin detectie van partiële lichaamsbestraling door middel van

automatische detectie van dicentrische chromosomen onderzocht werd. [21] Bloedstalen

werden bestraald met 2 Gy 137Cs γ-straling en onder verschillende verhoudingen gemengd met

onbestraald bloed (5%, 15%, 25%, 50%, 75%, 90% en 100%). Na scoring werd de Papworth

µ-test uitgevoerd om overdispersie te bepalen. Voor culturen met 5-75% bestraald bloed werd

een overdispersie vastgesteld (µ>1,96). In onze studie werden 15 van de 20 situaties juist

benoemd als partiële of volledige lichaamsbestraling.

5. ALGEMEEN BESLUIT

Samengevat kan gesteld worden dat alhoewel reeds is aangetoond dat partiële

lichaamsbestraling kan gedetecteerd worden op basis van scoring van dicentrische

chromosomen in Giemsa-gekleurde preparaten, de resultaten van dit onderzoek niet sluitend

zijn wat betreft het verschil tussen MN en dicentrische chromosomen op vlak van detectie van

partiële lichaamsbestraling en bepaling van de opgelopen dosis bij deze partiële

lichaamsbestraling. Op basis van de resultaten is er het vermoeden dat het verschil in

voorspelling door beide methoden niet significant is. Daarom dient verder gegaan te worden

met het optimaliseren van een correcte methode voor bepaling van WBD, PBD en ‘% exp’ bij

partiële lichaamsbestraling. Gezien in deze masterproef ondervonden werd dat het scoren van

dicentrische chromosomen in FISH-TC-gekleurde preparaten een meer eenvoudige en snelle

scoring oplevert dan Giemsa-gekleurde preparaten, moet de combinatie van FISH-TC-kleuring

en partiële lichaamsbestraling zeker onderzocht worden. Waar in dit onderzoek de scoring van

Giemsa-gekleurde preparaten een rol kan gespeeld hebben in het minder correct kunnen

inschatten van de opgelopen dosis tijdens de partiële lichaamsbestraling, zou het interessant

zijn om na te gaan of door scoring van FISH-TC-gekleurde preparaten een betere voorspelling

kan gedaan worden voor WBD, PBD en ‘% exp’ bij partiële lichaamsbestraling.

47

6. REFERENTIELIJST

1 IAEA, OECD/NEA. (2008) INES The International Nuclear and Radiological Event Scale User’s Manual.

2 Sovacoola BK et al. (2010) A Critical Evaluation of Nuclear Power and Renewable Electricity in Asia. J. Contemp. Asia, 40(3), 369–400.

3 IAEA. (1988) The Radiological Accident in Goiânia.

4 http://www.fanc.fgov.be/nl/news/-accidentele-bestraling-van-een-operator-op-de-site-van-sterigenics-te-fleurus-het-fanc-geeft-een-overzicht-van-de-eerste-elementen-van-het-onderzoek-naar-het-bestralingsongeval/78.aspx.

5 http://www.fanc.fgov.be/nl/page/radiotherapie/1033.aspx.

6 Prasanna P, Moroni M, Pellmar T. (2010) Triage dose assessment for partial-body exposure: dicentric analysis. Heal. Phys., 98(2), 244–251.

7 Thierens H. Cursus Stralingsdosimetrie en radioprotectie.

8 Devos F. (2015) Cursus Medische stralingsfysica en kernchemie.

9 Sadeghi M, Enferadi M, Hirazi A. (2010) External and internal radiation therapy: Past and future directions. J. Cancer Res. Ther., 6(3), 239–248.

10 Vral A. (2015) Cursus Radiobiologie.

11 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mesh/?term=relative+biologic+effectiveness.

12 http://www.rerf.jp/radefx/basickno_e/radcell.htm.

13 http://chem.kuleuven.be/veiligheid/info/ioniserende-st.htm#Biologische effecten.

14 Perumal V, Gnana Sekaran T, Raavi V, Basheerudeen S, Kanagaraj K, Chowdhury A, et al. (2015) Radiation signature on exposed cells: Relevance in dose estimation. World J. Radiol., 7(9), 266–278.

15 Torres-Bugarín O, Zavala-Cerna M, Nava A, Flores-García A, Ramos-Ibarra M. (2014) Potential Uses , Limitations , and Basic Procedures of Micronuclei and Nuclear Abnormalities in Buccal Cells. Dis. Markers, 13.

16 Heslet L, Bay C, Nepper-Christensen S. (2012) Acute radiation syndrome (ARS) - treatment of the reduced

48

host defense. Int. J. Gen. Med., 5, 105–115.

17 Alexandera GA, Swartz HM, Amundson SA, Blakely WF, Buddemeier B, Gallez B et al. (2007) BiodosEPR-2006 Meeting: Acute dosimetry consensus committee recommendations on biodosimetry applications in events involving uses of radiation by terrorists and radiation accidents. Radiat. Meas., 42, 972–996.

18 http://radiopaedia.org/articles/deterministic-effects.

19 Haupt S, Raghu D, Haupt Y. (2016) Mutant p53 Drives Cancer by Subverting Multiple Tumor Suppression Pathways. 6, 1–7.

20 Eaton et al. (2015) Secondary Malignancy Risk Following Proton Radiation Therapy. Front. Oncol., 5, 261.

21 Vaurijoux A, Gregoire E, Roch-Lefevre S, Voisin P, Martin C, Voisin P, et al. (2012) Detection of Partial-Body exposure to ionizing radiation by the automatic detection of dicentrics. Radiat. Res., 178(4), 357–364.

22 Jaworska A, Wojcik A, Ainsbury EA, Fattibene P, Lindholm C, Oestreicher U, et al. Guidance for using MULTIBIODOSE tools in Emergencies.

23 Zelazna K, Rudnicka K, Tejs S. (2011) In vitro micronucleus test assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Biotechnol., 7(2), 70–80.

24 Wojcik A et al. (2015) RENEB Deliverable 1.3.

25 Prasanna P, Escalada N, Blakely W. (2000) Induction of premature chromosome condensation by a phosphatase inhibitor and a protein kinase in unstimulated human peripheral blood lymphocytes : a simple and rapid technique to study chromosome aberrations using specific whole-chromosome DNA hybridizat. Mutat. Res., 466(2), 131–141.

26 Hatzi V, Terzoudi G, Paraskevopoulou C, Makropoulos V, Matthopoulos D, Pantelias G. (2006) The Use of Premature Chromosome Condensation to Study the Influence of Environmental Factors on Human Genetic Material in Interphase Cells. TheScientificWorldJournournal, 6, 1174–1190.

27 Mcmanus KJ, Hendzel J. (2005) Phosphorylation of H2AX in Normally Growing Mammalian Cells. Mol. Biol. Cell, 16(10), 5013–5025.

28 Rogakou E, Boon C, Redon C, Bonner W. (1999) Megabase Chromatin Domains Involved in DNA Double-Strand Breaks In Vivo. J. Cell Biol., 146(5), 905–915.

29 Rothkamm K, Löbrich M. (2003) Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acac Sci USA, 100(9), 5057–5062.

30 Ainsbury E, Al-Hafidh J, Bajinskis A, Barnard S, Barquinero JF, Beinke C, et al. (2014) Inter- and intra-laboratory comparison of a multibiodosimetric approach to triage in a simulated, large scale radiation emergency. Int. J. Radiat. Biol., 90(2), 193–202.

49

31 IAEA. (2011) Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies.

32 Valente M, Denis J, Grenier N, Arvers P, Foucher B, Desangles F, et al. (2015) Revisiting Biomarkers of Total-Body and Partial-Body Exposure in a Baboon Model of Irradiation. PLoS One, 10(7), e0132194.

33 M’kacher R, El Maalouf E, Ricoul M, Heidingsfelder L, Laplagne E, Cuceu C, et al. (2014) New tool for biological dosimetry: Reevaluation and automation of the gold standard method following telomere and centromere staining. Mutat. Res. Mol. Mech. Mutagen., 770, 45–53.

34 Boei JJ, Vermeulen S, Natarajan AT et al. (2000) Analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using telomeric and centromeric PNA probes. Int. J. Radiat. Biol., 76(2), 163–167.

35 Deperas J, Szhuinska M, Deperas-Kaminska M, Edwards A, Lloyd D, Lindholm C, et al. (2007) CABAS: A freely available PC program for fitting calibration curves in chromosome aberration dosimetry. Radiat. Prot. Dosimetry, 124(2), 115–123.

36 Lamadrid Boada AI, Romero Aguilera I, Terzoudi GI, González Mesa JE, Pantelias G, García O et al. (2013) Rapid assessment of high-dose radiation exposures through scoring of cell-fusion-induced premature chromosome condensation and ring chromosomes. Mutat. Res., 757(1), 45–51.

37 M’kacher R, El Maalouf E, Terzoudi G, Ricoul M, Heidingsfelder L, Karachristou I, et al. (2015) Detection and Automated Scoring of Dicentric Chromosomes in Nonstimulated Lymphocyte Prematurely Condensed Chromosomes After Telomere and Centromere Staining. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 91(3), 640–649.

38 LEA DE. (1955) Actions of Radiations on Living Cells.

39 Upton AC et al. (1983) Environmental Stndards for Ionizing Radiation : Theoretical Basis for Dose-Response Curves. Environ. Health Perspect., 52, 31–39.

40 Romm H, Ainsbury E, Barnard S, Barrios L, Barquinero J, Beinke C, et al. (2013) Automatic scoring of dicentric chromosomes as a tool in large scale radiation accidents. Mutat. Res., 756(1-2), 174–183.

41 Bhavani M, Tamizh Selvan G, Kaur H, Adhikari JS, Vijayalakshmi J, Venkatachalam P et al. (2014) Dicentric chromosome aberration analysis using giemsa and centromere specific fluorescence in-situ hybridization for biological dosimetry: An inter- and intra-laboratory comparison in Indian laboratories. Appl. Radiat. Isot., 92, 85–90.

42 Lindholm C, Luomahaara S, Koivistoinen A, Ilius T, Edwards A, Salomaa S. (1998) Comparison of dose-response curves for chromosomal aberrations established by chromosome painting and conventional analysis. Int J Radiat Biol, 74(1), 27–34.

43 Venkatachalam P, Solomon F, Prabhu B, Mohankumar M, Gajendiran N, Jeevanram R. (1999) Estimation of dose in cancer patients treated with fractionated radiotherapy using translocation, dicentrics and micronuclei frequency in peripheral blood lymphocytes. Mutat. Res., 429(1), 1–12.

44 Thierens H, Vral A, Vandevoorde C, Vandersickel V, de Gelder V, Romm H, et al. (2014) Is a semi-automated approach indicated in the application of the automated micronucleus assay for triage purposes? Radiat. Prot. Dosimetry, 159(1-4), 87–94.

50

45 Lloyd D, Edwards A, Prosser J, Barjaktarovic N, Brown J, Horva D, et al. (1987) A collaborative exercise on cytogenic dosimetry for simulated whole and partial body accidental irradiation. Mutat. Res. Mol. Mech. Mutagen., 179(2), 197–208.

Automatische analyse van dicentrische...

Documents

Transcript of Automatische analyse van dicentrische...