15

บทท 3

อปกรณและวธการวจย

การวจยนเปนการศกษาวฏจกรเซลลของเซลลเชอสาย 3 ชนด ไดแก เซลลเชอสายมะเรงปากมดลกคอ HeLa เซลลเชอสายมะเรงปอดม 2 เชอสายคอ A-549 และ NCI-H1299 โดยประเมนจากขนาดของนวเคลยสของเซลลทเกาะอยบนพนขวดเลยง (adherent) และทท าใหหลดออกมาเปนเซลลลอยอยในอาหารเลยงเซลล (suspension) การวจยประกอบดวยขนตอนทงหมด 4 ขนตอน คอ (3.1) การศกษาสณฐานวทยาของเซลล (3.2) การศกษาวฏจกรเซลลในสภาวะปกต (ไมไดรบสารพษใดๆ) (3.3) การศกษาวฏจกรเซลลหลงจากไดรบ cisplatin และ (3.4) การวเคราะหการเปลยนแปลงวฏจกรเซลลหลงไดรบ cisplatin ท งนยงมการรวบรวมกระบวนการทเปนวธการโดยทวไปซงเกยวของกบงานวจยนไวในหวขอ (3.5) วธการทางหองปฎบตการทวไป และนอกจากนยงไดจดท าสอการสอน (3.6) เพอน าผลจากการวจยบางสวนไปใชประโยชนในดานการเรยนการสอนในระดบมธยมศกษาตอนปลายตอไป

อปกรณและสารเคมพรอมทงรายละเอยดไดรวบรวมไวในภาคผนวก ก

3.1 การศกษาสณฐานวทยาของเซลล

ขนตอนการทดลองนมวตถประสงคเพอศกษาสณฐานวทยาของเซลลทง 3 เชอสายซงอยในสภาวะมาตรฐานของการเลยง (ด 3.5.1) ทงในสถานะทเซลลมการยดเกาะกบพนผวและสถานะทเซลลลอยหลงจากการท า trypsinization (ในการทดลองนหากกลาวถงสถานะเซลลลอยจะหมายถง สถานะทเซลลเปนอสระจากการเกาะและหลดออกมาจากพนภาชนะหลงจากการ trypsinization ในลกษณะ suspension) นอกจากนยงมการยอมเซลลทงสองสถานะดวยส aceto-orcein เพอใหสามารถเหนสณฐานของเซลลไดชดเจนมากขน 3.1.1 ท าการเพาะเลยงเซลลแตละเชอสายในอาหารเลยงเซลลทเหมาะสม ตามวธในขอ

3.5.1 เปนการเพาะเลยงกอนการใชงาน ซงจะไดเซลลจ านวนมากในภาชนะเลยงเซลล (culture flask) ขนาด 25 cm2

3.1.2 เมอท าการเพาะเลยงเซลลจนถงระยะ subconfluent จงท าการ trypsinization ตามวธในขอ 3.5.2 ซงขนตอนนเปนการท าใหเซลลหลดออกจากพนขวดเลยง

16

3.1.3 นบเซลลโดยใช hemocytometer โดยน าเซลลทไดจากการ trypsinization มานบ แลวค านวณจ านวนเซลล (ภาคผนวก ค ขอ 2) จะท าใหทราบจ านวนเซลลใน 1 ml

3.1.4 ท าการเจอจางเซลลโดยใชอาหารเลยงเซลล ใหไดจ านวนตามทตองการ ซงในแตละเซลลเชอสายอาจแตกตางกนไป ซงในการทดลองนใชจ านวนเซลลทไดมการรายงานมาแลวดงน HeLa 70,000 cell/ml (เบญจวรรณ, 2554), A-549 70,000 cell/ml (ไพบลย, 2554) และ NCI- H1299 50,000 cell/ml (วลยลกษณ,2554) ซงจ านวนเซลลดงกลาวไดม การทดลองมาแลววา เปน จ านวนทเมอเพาะเลยงครบเวลา 72 ชวโมง เซลลสามารถแบงตวเพมจ านวนได โดยไมไดรบผลของการแตะหยด (contact inhibition) และในขณะเดยวกน กไมไดรบผลจากการหยดชะงกการเจรญเนองจากเซลลอยหางกนมากเกนไป (paracrine effect)

3.1.5 ใสเซลลแตละชนดลงในจานเลยงขนาดเสนผานศนยกลาง 3.5 mm จานละ 1 ml.ซงภายในจานมแผน cover slips ชนดกลมจ านวน 3 แผน

3.1.6 คอยๆ เขยาเบาๆ ในแนวระนาบหรออาจใช pasture pipette ดดเปาเบาๆ เพอใหเซลลกระจายทวทงจานเลยง และตรวจสอบดวาแผน cover slips ตดอยกบพนจานจนสนท ไมลอยขนมา

3.1.7 บมเซลลไวเปนเวลา 24 ชวโมงในสภาวะมาตรฐาน (ดขอ 3.5.1) เพอใหเซลลลงเกาะบนแผน cover slips

3.1.8 น าเซลลทเกาะบน cover slips มาถายภาพเซลลสดมชวตตามวธขอ 3.5.4 โดยท าcover slips ละ 1 ภาพ ดงนน เซลลแตละเชอสายมจ านวน 3 ภาพ น ามาเปรยบเทยบกนเพอศกษาสณฐานวทยาของเซลลในสถานะเกาะ

3.1.9 น า cover slips ออกจากจานเลยงและท าการยอมเซลลทเกาะบน cover slips ดวยส aceto-orcein ซงไดอธบายในขอ 3.5.3 และน าไปถายภาพตามวธในขอ 3.5.4 เชนเดยวกบขอ 3.1.8 เพอน าภาพไปศกษาสณฐานวทยาของเซลลสถานะเกาะทยอมสใหเหนนวเคลยสภายใน

3.1.10 ในจานเลยงจากขอ 3.1.9 หลงจากน าเอา cover slips ออกไปแลว มเซลลทเหลอเกาะอยบนพนจานเลยงจ านวนมาก ไดท าการ trypsinization ตามวธในขอ 3.5.2 และน าเซลลทหลดออกจากการเกาะทงหมดลงใน microcentrifuge tube ขนาด 1.5 ml. เพอใหเซลลมความเขมขนมากขน ท าใหงายตอการถายภาพ

17

3.1.11 ดดเซลลทมความเขมขนในสถานะลอย suspension ปรมาณ 50 µl. หยดลงบนกระจกสไลดและปดดวย cover slips จากนนน าไปถายภาพตามวธการเดยวกบขอ 3.1.8 เพอศกษาสณฐานวทยาของเซลลมชวตในสถานะเซลลลอยเปน suspension

3.1.12 เซลลทเหลอใน microcentrifuge tube น าไปยอมส aceto-orcein ตามวธการในขอ3.5.3.2

3.1.13 น าเซลลทยอมสแลวมาหยดลงบนแผนสไลด ปดดวย cover slips แลวจงน าไปถายภาพตามวธในขอ 3.5.4 เพอน าภาพไปศกษาสณฐานวทยาของเซลลและนวเคลยสในสถานะเซลลลอยและยอมส aceto-orcein

3.2 การศกษาวฏจกรเซลลในสภาวะปกต

การทดลองในขนตอนน มวตถประสงคเพอตรวจสอบวฏจกรของเซลลในสภาวะปกตซงท าการเพาะเลยงนาน 72 ชวโมง และเกบขอมลส าหรบใชเปนกลมควบคมในงานวจยน โดยการทดลองในหวขอน ประกอบดวย 2 ขนตอน คอ (3.2.1) การเตรยมเซลลเพอวดขนาดนวเคลยส และ (3.2.2) การจดจ าแนกเซลลในวฏจกรเซลล

3.2.1 การเตรยมเซลลเพอวดขนาดนวเคลยส ประกอบดวยขนตอนตางๆ ดงน ก. เตรยมเซลลแตละเชอสายท าเหมอนขนตอนท 3.1.1-3.1.4 จะไดเซลลใน

สถานะลอย ข. เตรยมจานเลยงเซลลขนาด 3.5 มม. ทใส cover slips ไวจานละ 3 แผน โดยให

มจ านวน 3 จาน ส าหรบเซลลแตละเชอสาย แตละจานจงเปนเสมอนหนวยการทดลองแตละซ า รวม 3 ซ า (replicate)

ค. ใสเซลลแตละชนดลงในจานทง 3 จาน จานละ 1 ml. จากนนท าเหมอนขนตอน 3.1.6 – 3.1.7

ง. เมอครบการบมเพาะเลยงเปนเวลา 24 ชวโมงแลวท าตามวธการขอ 3.1.9 เพอน าภาพของเซลลเกาะทย อมดวยส aceto-orcein ไปท าการวดขนาดของนวเคลยสและค านวณพนทนวเคลยส ตามวธการขอ 3.5.5 โดยแตละชนดของเซลลใชจ านวนเซลลทนบไดจากภาพถายจ านวนประมาณ 400 เซลล

จ. เรยงขอมลพนทนวเคลยสจากนอยไปหามาก แลวท าการแจกแจงวาในแตละความถของพนทนวเคลยสมจ านวนกเซลล จากนนน าไปสรางกราฟการกระจายของจ านวนเซลลตามพนทนวเคลยส

18

ฉ. เมอน า cover slips ออกจากจานเลยงเซลลในขอ ค ไปใชงาน หมดแลว บนพนจานเลยงจะมเซลลเหลอเกาะอยจ านวนมาก ไดท ากระบวนการเตรยมเซลลลอยเหมอนกบวธการขอ 3.1.10 และน าเซลลลอยทไดไปยอมส aceto-orcein ตามวธการขอ 3.5.3.2

ช. ท าเหมอนกบขอ 3.1.13 โดยจะไดภาพถายเซลลลอยทยอมส aceto-orcein โดยเซลลแตละชนดใชจ านวนประมาณ 400 เซลล

ซ. จดเรยงขอมลพนทนวเคลยสของเซลลลอยทไดเชนเดยวกบทไดท ากบเซลลเกาะในขอ จ.

3.2.2 การจดจ าแนกเซลลในวฏจกรเซลล

ในการจดจ าแนกเซลลนนจะท าเหมอนกนทงเซลลในสถานะเกาะและลอย โดยเปรยบเทยบขอมลกบวธ flow cytometry ซงอางองมาจากงานวจยอนทใชเซลลเชอสายเดยวกน ซงขอมลนนจะเปนรอยละของจ านวนเซลลทอยในระยะ G1, S และ G2 ของวฏจกรเซลลจากนนจงน าคารอยละนน มาคดใหเปนจ านวนเซลลในระยะตางๆ และน ามาเทยบกบคาทไดจากการนบ เพอท าการจดวฏจกรของเซลล ซงวธการโดยละเอยดมดงตอไปน

ก. ท าการเรยงขอมลขนาดนวเคลยสจากเลกไปหาใหญ ตอจากนนสรางกราฟการกระจายของเซลลตามพนทนวเคลยส

ข. จดเซลลใหอยในระยะ G1, S และ G2 โดยอางองจากขอมลทไดจากวธ flow cytometry ซงขอมลทไดจะมคาระยะตางๆ เปนรอยละ จากนนท าตามวธ ดงน

19

4 3 3 2

12 9

1 3

13

52

2 2

11

45

1 1

28

1

14

4

19

1

51

1 4 5

2

46

20

6 2

9

21

1 5

1 1 2 1 1 1 1 1 1 0

10

20

30

40

50

60

พนทนวเคลยส (μm2)

(ข.1) ค านวณจ านวนเซลลทงหมดทท าการนบ โดยน าจ านวนเซลลท กระจายแตละแทงมาบวกกน

ตวเลขบนยอดกราฟน ามารวมกนเปนจ านวนเซลลท งหมด = 421 เซลล

(ข.2) น าขอมลจากวธ flow cytometry ซงเปนรอยละมาค านวณใหเปน จ านวนเซลล ทละระยะโดยใชสตร ดงน

= ตวอยาง เชน

- เซลลทอยในระยะ G1จากงานวจยอนมรอยละ 68.35

- มเซลลทท าการนบทงหมด 421 เซลล

ค านวณได ดงน จ านวนเซลลในระยะตางๆ = (68.35×421)/100

= 287.75 เซลล

จ ำนวนเซลล

จ ำนวนเซลล ในระยะตำงๆ

รอยละของเซลลจำก flow cytometry

จ ำนวนเซลลทนบ

×

100

20

(ข.3) เมอแปลงขอมลจากรอยละมาเปนจ านวนเซลลแลว น าจ านวนเซลลทไดจากวธ flow cytometry มาเปรยบเทยบกบขอมลทไดจากการนบของการทดลองน แลวจงท าการจดวฏจกรเซลล โดยพยายามจดใหมคาใกลเคยงกบขอมลจาก flow cytometry ใหมากทสด ดงตวอยาง

เมอท าการจดเซลลใหอยในระยะตางๆแลวจะท าใหทราบชวงขนาดพนทของเซลล เชน จากตวอยาง พบวาเซลลในระยะ G1 ทไดจากการนบจะมชวงขนาดตงแต 24.18-90.62 μm2

ค. ท าขอ ก และ ข กบขอมลทงสามซ า แลวจงน าขนาดนวเคลยสมาหาคาเฉลย (mean) และสวนเบยงเบนมาตรฐาน (standard deviation) จะไดขนาดเฉลยของนวเคลยสในระยะ G1, S และ G2 และทราบวาในระยะตางๆ มจ านวนเซลลเทาใด

ง. ค านวณจ านวนเซลลในระยะตางๆ ออกเปนอตราสวนรอยละ แลวน าไปสรางกราฟการกระจายแบบวงกลม เพอแสดงการกระจายของเซลลในระยะตางๆของวฏจกรเซลล

4 3 3 2

12 9

1 3

13

52

2 2

11

45

1 1

28

1

14

4

19

1

51

1 4 5

2

46

20

6 2

9

21

1 5

1 1 2 1 1 1 1 1 1 0

10

20

30

40

50

60

24

.18

36

.27

45

.33

49

.87

54.4

0

63

.47

68

.00

74

.05

75

.56

81

.60

84

.62

90

.67

95

.20

98

.22

10

8.8

0

117

.87

12

6.9

3

14

5.0

7

15

4.1

3

16

9.2

5

21

1.5

6

39

8.9

4

พนทนวเคลยส (μm2)

G1 = 282 เซลล =

21

3.3 การศกษาวฏจกรเซลลหลงจากไดรบ cisplatin

ขนตอนนมวตถประสงคเพอศกษาวฏจกรเซลลและการยบย งการเพมจ านวนของเซลล หลงจากไดรบ cisplatin ทความเขมขนทท าใหเซลลตายรอยละ 20 หรอ IC20 เปนเวลา 72 ชวโมง โดยการยบย งการเพมจ านวนของเซลล หมายถง ความสามารถยบย งไมใหเซลล มการแบงตวภายใน 72 ชวโมง ซงโดยปกตเซลลจะแบงตวไดประมาณ 2-3 รอบ ประกอบดวย 2 ขนตอน เชนเดยวกบขอท 3.2 คอ การเตรยมเซลลเพอวดขนาดนวเคลยสและ การจดจ าแนกเซลลในวฏจกรเซลล

3.3.1 การเตรยมเซลลเพอวดขนาดนวเคลยส ก. ท าเชนเดยวกบขนตอนท 3.2.1 ก-ค ข. หลงจากนนบมเพาะเลยงเซลลเปนเวลา 24 ชวโมง เมอครบใช pipette ดด

อาหารเลยงเกาออก และเตมอาหารทมสาร cisplatin ลงไป โดยใช cisplatin ท IC20 แกเซลลแตละเชอสาย ซงจะมคาแตกตางกนไป โดยอางองความเขมขน คา IC20 จากของการทดลองอน ในเซลลทงสามเชอสาย ซงมคาดงน เซลล HeLa ใช 0.83 µg/ml (เบญจวรรณ, 2554), เซลล A-549 ใช 0.32 µg/ml (ไพบลย, 2554) และ เซลล NCI-H1299 ใช 3.0 µg/ml (วลยลกษณ, 2554)

ค. ท าการเพาะเลยงตอจนครบเวลา 72 ชวโมง ตอมาน า cover slips ออกจากจานเลยงและมายอมดวยส aceto-orcein ดงขอ 3.5.3 และถายภาพตามขอ 3.5.4 ตามล าดบ

ง. น าภาพถายทไดมาวดขนาดของนวเคลยสและค านวณพนทนวเคลยส ตามวธการขอ 3.5.5

จ. เมอไดขอมลพนทนวเคลยสแลว ท าเหมอนขนตอนท 3.2.1 จ-ซ

3.3.2 การจดจ าแนกเซลลในวฏจกรเซลล เมอท าการก าหนดชวงของขนาดนวเคลยสของเซลลในสภาวะปกต โดย

ใชขอมลรอยละของจ านวนเซลลทไดจากการท า flow cytometry จากการอางองงานวจยทเลอกมาแลว จะท าใหทราบวาเซลลแตละเชอสายทอยในวฏจกรเซลลทง 3 ระยะ คอ G1, S และ G2 ควรจะมขนาดนวเคลยสเทาใด ชวงขนาดของนวเคลยสของเซลลทง 3 ชวงนจะถกน ามาก าหนดเปนชวงขนาดนวเคลยสมาตรฐานของเซลลแตละเชอสาย เพอน าไปเทยบกบชดขอมลของขนาดนวเคลยสของเซลลเชอ

22

สายนนๆ หลงจากไดรบสาร cisplatin ไปแลว ซงจะท าใหทราบวา ชวงขนาดของนวเคลยสของแตละขนในวฏจกรเซลลมรอยละของจ านวนเซลลเปลยนแปลงอยางไร ดงตวอยางทแสดงเกยวเนองกบวธการขอ 3.2.2 (ข.3)

ก. จากขอ 3.2.2 (ข.3) จะไดวาเซลลในขน G1 มชวงขนาดนวเคลยสอยระหวาง 24.18-90.62 µm2 ซงในขณะนจะถอวาเปนชวงขนาดนวเคลยสมาตรฐานของเซลลเชอสายนในสภาวะปกต ในระยะ G1

4 3 3 2

12 9

1 3

13

52

2 2

11

45

1 1

28

1

14

4

19

1

51

1 4 5

2

46

20

6 2

9

21

1 5

1 1 2 1 1 1 1 1 1 0

10

20

30

40

50

60

24

.18

36

.27

45

.33

49

.87

54

.40

63

.47

68

.00

74

.05

75

.56

81

.60

84

.62

90

.67

95

.20

98

.22

10

8.8

0

11

7.8

7

12

6.9

3

14

5.0

7

15

4.1

3

16

9.2

5

21

1.5

6

39

8.9

4พนทนวเคลยส (μm2)

G1

23

ข. สมมตวาเซลลเชอสายเดยวกนนเมอไดรบ cisplatin แลวมการกระจายของขนาดนวเคลยสตามจ านวนเซลลดงกราฟขางลางน (ซงจะตางจากกราฟในขอ 3.2.2 (ข.3))

ค. น าคาชวงขนาดนวเคลยสมาตรฐานของเซลลนจากขอ ก. คอ 24.18-90.62 µm2 มาก าหนดลงในกราฟของเซลลทไดรบ cisplatin ขางบนน จะไดชวงของ G1 ของเซลลหลงจากไดรบ cisplatin ดงแสดงในกราฟขางลางน

6

1 1 5

12

1

20

1

15

2

13 17

2 3 1

28

15

1

19

43

11

1 3

35

25 24

12 12

6 2

6 8

1 3 2 2 2 1 1 2

0

10

20

30

40

50

18

.13

21

.16

27

.20

36

.27

48

.36

54

.40

63

.47

68

.00

75

.56

84

.62

96

.71

99

.73

12

0.8

9

13

6.0

0

14

8.0

9

16

3.2

0

18

1.3

4

19

3.4

2

21

7.6

0

24

1.7

8

พนทนวเคลยส(µm2)

6

1 1 5

12

1

20

1

15

2

13 17

2 3 1

28

15

1

19

43

11

1 3

35

25 24

12 12

6 2

6 8

1 3 2 2 2 1 1 2

0

10

20

30

40

50

18

.13

21

.16

27

.20

36

.27

48

.36

54

.40

63

.47

68

.00

75

.56

84

.62

96

.71

99

.73

12

0.8

9

13

6.0

0

14

8.0

9

16

3.2

0

18

1.3

4

19

3.4

2

21

7.6

0

24

1.7

8

พนทนวเคลยส(µm2)

24

ง. จะไดวาในชวงขนาดของนวเคลยสของเซลลหลงจากไดรบ cisplatin ทอยในระยะ G1ซงคดเปนรอยละ 45.64 ของเซลลทงหมด

จ. ดงนนจะเหนวาเซลลทไดรบ cisplatin ซงมขน G1 รอยละ45.64 เปลยนแปลงไปจากเซลลเชอสายเดยวกนน กอนไดรบ cisplatin ซงมรอยละ 69.37 (จากอางอง flow cytometry และจาก 3.2.2 (ข))

3.4 การวเคราะหการเปลยนแปลงวฏจกรเซลล เมอท าตามขนตอนท 3.2 การศกษาวฏจกรเซลลในสภาวะปกตและ 3.3

การศกษาวฏจกรเซลลหลงจากไดรบ cisplatin จะไดกราฟการกระจายตวของเซลลตามขนาดนวเคลยสและเมอน าไปจดใหอยในวฏจกรเซลล ท าใหทราบจ านวนเซลลในระยะ G1, S และ G2 จากนนน าขอมลมาท าการวเคราะหตามขนตอน ดงน

3.4.1 น าขอมลจ านวนเซลลในระยะ G1, S และ G2 ทงทเปนเซลลในสภาวะปกตและเซลลทไดรบ cisplatin (วเคราะหแลวในขอ 3.2.2 และ 3.3.2) มาสรางแผนภาพวงกลม เพอใหสามารถเหนรอยละของจ านวนเซลลในแตละระยะไดชดเจนขน โดยการท าแผนภาพวงกลมน จะรวมรอยละของการแบงตวแบบไมโตซสและการตายแบบอะโพโทซสดวย เพอใหครบรอยละของวฏจกรจ านวนเซลลทงหมด ดงตวอยางทยกมาตงแตหวขอ 3.2.2 (ข)

เซลลเกาะในสภาวะปกตเมอนบจ านวนจากกราฟ จะไดจ านวนเซลลทงหมด 421 เซลล คดเปนรอยละ 100 ดงนนเมอคดจ านวนเซลลและรอยละของแตละขนในวฏจกรเซลล จะไดผลดงตารางทแสดง

ระยะในวฏจกรเซลล จ านวน คดเปนรอยละ G1 282 66.98 S 58 13.78 G2 70 16.63 M (ไมโตซส) 11 2.61 A (apoptosis) - -

25

ตวอยางขางตนเปนคาของการทดลอง 1 ซ าทงหมดท า 3 ซ า (ดภาคผนวก ง ) แลวจงน ามาหาคาเฉลยเพอน าไปสรางกราฟวงกลมตอไป ดงนนจะเหนวาคารอยละของจ านวนเซลลในแตละขนจะแตกตางจากคา flow cytometry (โดยเซลล HeLa และเซลล NCI-H1299 อางองคา flow cytometry จาก จรยา (2553) เซลล A549 อางองจาก สพตรา (2552)) เชน G1 68.35 แตจากการค านวณในการทดลองได 66.98

3.4.2 น าขอมลรอยละของเซลลในระยะตางๆ มาเปรยบเปรยบเทยบกบวธ Paired t-test จากนนท าตารางแสดงความตางทางสถต ระหวางทงสองวธ

3.4.3 น าขอมลเซลลทมการตายแบบอะโพโทซสและการแบงตวแบบไมโตซสมาค า นวณเปนรอยละ จากน นท าตารางแสดงรอยละการตายแบบอะโพโทซส (apoptotic index)(ดขอ 3.5.6) และรอยละการแบงตวแบบไมโตซส(mitotic index) (ดขอ 3.5.7)

3.5 วธการทางหองปฎบตการทวไป

3.5.1. การเพาะเลยงเซลลเชอสาย เรมตนจากการน าเซลลทแชแขงทอณหภม -196 ºC ออกมาละลายเพอ

เลยงใหเพมจ านวนในภาชนะเลยงเซลลขนาด 25 cm2 โดยแตละเซลลเชอสายใชอาหารส าเรจรป ดงน HeLa ใชอาหารชนด DMEM, A-549 ใชอาหารชนด Ham-12 และ NCI-H1299ใชอาหารชนด RPMI ซงแตละชนดผสมกบ 10% fetal bovine serum (FBS)จากนนน าไปเลยงในตอบคารบอนไดออกไซด (CO2 incubator) ทอณหภม 37 º C มความเขมขนของ CO2 5% และความชนสมพทธ 95% ซงเปนสภาวะมาตรฐานทใชเลยงเซลลตลอดการทดลองน ตรวจดการเจรญของเซลลภายใตกลองจลทรรศนแบบเลนสวตถอยดานลาง เมอเซลลเจรญเตบโตประมาณ 80% ของพนภาชนะ หรอทเรยกวาสภาพ subconfluent จงท าการเพาะเลยงแยก (subculture)

3.5.2 การท า trypsinization 3.5.2.1 ดดอาหารเลยงเซลลเดมทอยในภาชนะออกใหหมด จากนนลางดวย 1X

phosphate buffer saline (PBS) 1 ml เพอลางอาหารเลยงเซลลออกใหหมด

26

เนองจากในอาหารเลยงเซลลประกอบดวยสารทไปขดขวางการท างาน ของ 0.1% trypsin-EDTA

3.5.2.2 วางภาชนะทม PBS อยภายในไวประมาณ30 วนาท แลวดดทงจนหมด 3.5.2.3 เตม 0.5 ml 0.1% trypsin-EDTA ปดฝา แลวเอยงให 0.1% trypsin-

EDTA คลมทวผวดานทเซลลเกาะอยของ culture flask แลวน าไปบมใน ตอบ 37 ºC เปนเวลา 2-5 นาท

3.5.2.4 ระหวางชวงเวลารอการบมตามขอ (3.5.2.3) ใหน ามาสองดการหลดของ เซลลจากพนภาชนะเลยง ดวยกลองจลทรรศนเลนสวตถอยดานลาง เปนระยะโดยเซลลจะคอยๆ ยกตวและกลมขนและหลดจากพน เมอเซลลหลด ออกเปนสวนใหญแลว ใหเคาะภาชนะเลยงกบฝามอเบาๆ (โดยไมใหของ เหลวภายในกระเดนหรอลนไปทฝาของภาชนะเลยง) เพอใหมนใจวาเซลลสวนใหญหลดจากพนผวแลว

3.5.2.5 หยดการท างานของ 0.1% trypsin/EDTA solution โดยการเตมอาหาร DMEMทเสรมดวย 0.1% trypsin-EDTA แลวใช pasteur pipette ดดเปาเพอใหเซลลกระจายออกจากกนเปนเซลลเดยวและสามารถน าไปใชตอได

3.5.3 การยอมส aceto – orcein 3.5.3.1 การยอมสในขณะทเซลลเกาะ

(ก) ลางแผน cover slips ทมเซลลเกาะอย ดวย 1X PBS (ข) หยดส aceto –orcein ลงไป พอทวม cover slips พกไว 1 นาท (ค) คว าแผน cover slip ลงบน slide ซบสสวนเกนออก

3.5.3.2 การยอมสหลงจากการท า trypsinization (ก) ท าการ trypsinization (ขอ 3.5.2 ) ใสลงใน centrifuge tube ขนาด

15 ml (ข) น าไปปนเหวยงท 1,200 g เปนเวลา 10 นาท (ค) ดดอาหารเลยงเซลลออกใหเหลอนอยทสด จากนนใช micropipette ดดเซลลปรมาณ 20 µl ใสใน microcentrifuge tube ขนาด 1.5 ml (ง) เตมส aceto –orcein ลงไป 1 หยด ดดเปาใหเขากน (จ) เซลลทผสมสแลว มาหยดบนแผนสไลด ปดดวย cover slips

27

3.5.4 การถายภาพเซลล น าเซลลทตองการถายภาพยอม มาท าการถายภาพภายใตกลองจลทรรศน

เลนสประกอบ ทก าลงขยาย 28.6 เทา จ านวนหลายภาพ การถายภาพนนควรปรบใหภาพมความคมชดและตองถายดวยความรวดเรว เนองจากหากเปนสยอม aceto-orcein จะแหงไดเรว เมอแผนสไลดทมเซลลอยเกดการแหง ท าใหภาพทไดไมสวยงามและไมคมชด

3.5.5 การวดขนาดนวเคลยสและค านวณพนทนวเคลยส จากการทดลองท 3.2 และ 3.3 เมอท าการถายภาพเซลลเสรจแลว น าเซลล

ไปตดเลขต งแต 1-400 ดวยโปรแกรมตกแตงภาพ จากนนท าการวดขนาดนวเคลยสโดยมวธการ ดงน

3.5.5.1 วดขนาดนวเคลยสของเซลลจากภาพถาย โดยใชไมบรรทดวดในบรเวณ กวางทสดและยาวทสด เนองจากนวเคลยสของเซลลอาจมหลายรปราง เชน ทรงกลม ทรงร หรอรปเมดถวซงไมสมมาตรกน จากขนตอนนจะ ไดความกวางและความยาวนวเคลยส ในหนวยเซนตเมตร (cm)

3.5.5.2 วดขนาดนวเคลยสจากเซลล ท 1-400 ตามล าดบ จากนนกรอกขอมล ความกวางและความยาว ลงในตาราง

3.5.5.3 ค านวณพนทของนวเคลยส โดยใชสตร

พนทของนวเคลยส (cm) =

โดย a คอ ความกวางและ b คอความยาว

3.5.5.4 น าพนทในหนวย cm มาเปลยนใหอยในหนวย μm โดยน ามาคณกบ 385 ซงเปนคาทไดจากการเทยบภายใตกลองจลทรรศน 1 cm = 385 μm จากขนตอนนจะไดพนทนวเคลยสของทกเซลลในหนวย μm2

3.5.5.5 กรอกขอมลทไดลงในโปรแกรม Microsoft Excel 3.5.5.6 เซลลทมการตายแบบอะโพโทซสและเซลลทมการแบงตวแบบไมโตซส

ใหแยกแลวเกบขอมลจ านวนเซลลไว เพอน าไปค านวณรอยละการตาย แบบอะโพโทซสตามและรอยละการแบงตวแบบไมโตซสตามขอ 3.5.8

28

3.5.6 รอยละการตายแบบอะโพโทซส (apoptotic index) ก. นบจ านวนเซลลทมการตายแบบอะโพโทซส

ข. น าขอมลทไดมาเขาสตร ดงน

3.5.7 การวดการแบงตวแบบไมโตซส (mitotic index)

ก. นบจ านวนเซลลทมการแบงตว ในระยะ M phaseไดแก prophase metaphase anaphase และ telophase

ข. น าขอมลทไดมาเขาสตร ดงน

ค. สรางแผนภมเปรยบเทยบดรรชนการแบงตวแบบไมโตซสของเซลลทง

สามเชอสายเมออยในสภาวะปกตและสภาวะทไดรบสารนาน 72 ชวโมง 3.6 การจดท าสอการสอน

จดท าเอกสารประกอบการสอนและโปสเตอรเพอเผยแพรความรและสามารถน าไปใชประกอบในการเรยนการสอนในระดบชนมธยมศกษาตอนปลาย 3.6.1 น าภาพถายเซลลในระยะ G1, S และ G2 รวมทงระยะ M phase มาใชประกอบใน

เอกสารประกอบการสอนระดบมธยมศกษาปท 4 หนวยท 2 เรอง หนวยของสงมชวต มาตรฐานการเรยนร ว 1.1 : เขาใจหนวยพนฐานของสงมชวต ความสมพนธของโครงสรางและหนาทของระบบตาง ๆ ของสงมชวตทท างานสมพนธกน มกระบวนการสบเสาะหาความร สอสารสงทเรยนรและน าความรไปใชในการด ารงชวตของตนเองและดแลสงมชวต

3.6.2 จดท าโปสเตอรเพอเผยแพรความร โดยจดแสดงเซลลมะเรงในสถานะเกาะ , สถานะเกาะยอมส aceto-orcein, เซลลสถานะลอย และเซลลสถานะลอยทยอมส

เซลลทมกำรแบงตวแบบไมโตซส

เซลลทงหมด

เซลลทมกำรตำยแบบอะโพโทซส

เซลลทงหมด

ดรรชนกำรแบงตวแบบไมโตซส

(รอยละ) = × 100

รอยละกำรตำยแบบอะโพโทซส = × 100

29

aceto-orcein และแสดงเปนวฏจกรของเซลลในระยะตางๆ ไดแก G1, S, G2 และระยะ M phase ซงเปนการน าภาพถายเซลลสถานะตางๆ รวมถงระยะตางๆ ของวฏจกรเซลลจากการทดลองมาประกอบ