54 - Chiang Mai Universitycmuir.cmu.ac.th/bitstream/6653943832/39695/6/CHAPTER 4.pdf · 54...
25
53 บทที่ 4 ผลการค้นคว้าและอภิปรายผลการค้นคว้า 4.1 การสกัด คลอโรพลาสต์ ดีเอ็นเอจากตัวอย่างใบของพะยูงด้วยชุดน ้ายาสาเร็จรูป NucleoSpin ® Plant II จาก การสกัดคลอโรพลาสต์ดีเอ็นเอจากตัวอย่างใบอ่อนของต้นกล้าพะยูงทั ้งหมด 39 ตัวอย่าง ด้วยชุดน ้ ายาสาเร็จรูป NucleoSpin ® Plant II เพื่อให้ได้คลอโรพลาสต์ดีเอ็นเอจากตัวอย่างใบอ่อนจาก กล้าพะยูงดังขั ้นตอนที่ 3.2.2 จากการทดลองพบว่าเมื่อนาคลอโรพลาสต์ ดีเอ็นเอที่สกัดได้มาตรวจสอบ คุณภาพและขนาดดีเอ็นเอด้วยวิธี 1% (w/v) อะกาโรสเจลอิเล็กโทรฟอรีซิสโดยใช้ VC Lamda/EcoRI + HindIII เป็นดีเอ็นเอมาตรฐานเพื่อเปรียบเทียบขนาดคลอโรพลาสต์ดีเอ็นเอของตัวอย่างใบอ่อนจาก กล้าพะยูง ทั ้งหมด 39 ตัวอย่าง พบว่าคลอโรพลาสต์ ดีเอ็นเอที่สกัดได้ของตัวอย่างทั ้งหมดมีขนาด ประมาณ 20,000 คู่เบส(ดังแสดงในรูปที่ 4.1 4.2 และ 4.3)ได้แก่ตัวอย่างคลอโรพลาสต์ ดีเอ็นเอที่สกัด จากใบอ่อนพะยูงจากจังหวัดสกลนคร พิษณุโลก อุดรธานี และอุบลราชธานี ตามลาดับ รูปที่ 4.1การตรวจสอบคุณภาพและขนาด คลอโรพลาสต์ ดีเอ็นเอที่สกัดได้จากตัวอย่างพะยูงจังหวัด สกลนคร และพิษณุโลก รหัส SN01 SN02 SN03 SN04 SN05 PL01 PL02 PL03 PL04 และ PL05 ด้วยวิธี อะกาโรสเจลอิเล็กโทรฟอรีซิส โดยใช้ VC Lamda/EcoRI + HindIII เป็ นดีเอ็นเอ มาตรฐาน (แถว M) SN PL M 01 02 03 04 05 M 01 02 03 04 05 bp 21226 5148 4256 3530 2027 1904 1584 947 831 564
Transcript of 54 - Chiang Mai Universitycmuir.cmu.ac.th/bitstream/6653943832/39695/6/CHAPTER 4.pdf · 54...
53
บทท 4
ผลการคนควาและอภปรายผลการคนควา
4.1 การสกดคลอโรพลาสตดเอนเอจากตวอยางใบของพะยงดวยชดน ายาส าเรจรปNucleoSpin® Plant II
จากการสกดคลอโรพลาสตดเอนเอจากตวอยางใบออนของตนกลาพะยงทงหมด 39 ตวอยางดวยชดน ายาส าเรจรป NucleoSpin® Plant II เพอใหไดคลอโรพลาสตดเอนเอจากตวอยางใบออนจากกลาพะยงดงขนตอนท 3.2.2 จากการทดลองพบวาเมอน าคลอโรพลาสตดเอนเอทสกดไดมาตรวจสอบคณภาพและขนาดดเอนเอดวยวธ 1% (w/v) อะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซสโดยใช VC Lamda/EcoRI + HindIII เปนดเอนเอมาตรฐานเพอเปรยบเทยบขนาดคลอโรพลาสตดเอนเอของตวอยางใบออนจากกลาพะยง ทงหมด 39 ตวอยาง พบวาคลอโรพลาสตดเอนเอทสกดไดของตวอยางท งหมดมขนาดประมาณ 20,000 คเบส(ดงแสดงในรปท 4.1 4.2 และ 4.3)ไดแกตวอยางคลอโรพลาสตดเอนเอทสกดจากใบออนพะยงจากจงหวดสกลนคร พษณโลก อดรธาน และอบลราชธาน ตามล าดบ
รปท 4.1การตรวจสอบคณภาพและขนาดคลอโรพลาสตดเอนเอทสกดไดจากตวอยางพะยงจงหวดสกลนคร และพษณโลก รหส SN01 SN02 SN03 SN04 SN05 PL01 PL02 PL03 PL04 และ PL05 ดวยวธอะกาโรสเจลอ เลกโทรฟอรซสโดยใช VC Lamda/EcoRI + HindIII เปนด เอน เอมาตรฐาน (แถว M)
SN PL M 01 02 03 04 05 M 01 02 03 04 05 bp
21226 5148 4256 3530 2027 1904 1584 947 831 564
54
รปท 4.2การตรวจสอบคณภาพและขนาดดเอนเอทสกดไดจากตวอยางพะยงจงหวดอดรธาน รหส UD01 UD02 UD03 UD04 และ UD05 ดวยว ธอะกาโรส เจล อ เล กโทรฟอ รซส โดยใช VC Lamda/EcoRI+HindIII เปนดเอนเอมาตรฐาน (แถว M)
รปท 4.3การตรวจสอบคณภาพและขนาดดเอนเอทสกดไดจากตวอยางพะยงจงหวดอบลราชธาน รหส UB01 UB02 UB03 UB04 UB05 และ UB06 ดวยวธอะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซสโดยใช VC Lamda/EcoRI + HindIII เปนดเอนเอมาตรฐาน (แถว M)
UD M 01 02 03 04 05 bp
21226 5148 4256 3530 2027 1904 1584 947 831 564
UB M 01 02 03 04 05 06 bp
21226 5148 4256 3530 2027 1904 1584 947 831 564
55
นอกจากนคลอโรพลาสตดเอนเอทสกดจากตวอยางใบออนจากจงหวด ขอนแกน ศรสะเกษ สกลนคร พษณโลก และฉะเชงเทรา รวมทงหมด 39 ตวอยาง (ดงแสดงใน ภาคผนวก ข) สามารถสกดคลอโรพลาสตดเอนเอจากใบออนพะยงของแตละจงหวดไดทงหมด และมขนาดของคลอโร-พลาสต ดเอนเอเทากบ 20,000 คเบสเชนเดยวกน เมอเปรยบเทยบจากการศกษาการของ Asif ในป ค.ศ. 2005 ไดศกษาวธสกดคลอโรพลาสตดเอนเอจากพช Gonystylus bancanus ดวยการเปรยบเทยบประสทธภาพของวธการสกดตวอยาง จากใบ ล าตน และไมแหงพบวาคลอโรพลาสตดเอนเอทสกดไดมขนาดอยในชวง 50 คเบสถง 10,000 คเบส โดยผลการทดลองชชดวาตวอยางจากใบจะมคณภาพและ ขนาดของคลอโรพลาสตด เอนเอมากท สด ตอมาในป ค.ศ. 2014 Li และคณะไดศกษาความหลากหลายในระดบโมเลกลของพช Auriculalia auricular-judaeโดยไดท าการสกดดเอนเอจากคลอ-โรพลาสตดเอนเอเพอน ามาศกษาความหลากหลายพบวา คลอโรพลาสตดเอนเอทสกดไดเมอตรวจสอบแลวพบวามขนาดประมาณ 11,000 คเบส ซงสามารถน าไปเพมปรมาณดเอนเอไดอยางมประสทธภาพ ดงนนจากการศกษาคณภาพของดเอนเอทไดจากคลอโรพลาสตดเอนดของงานวจยอนๆ ชใหเหนวาคลอโรพลาสตดเอนเอทสกดไดจากตวอยางใบออนของตนกลาพะยงทงหมดมขนาด และคณภาพด สามารถน าไปเปนแมแบบในการเพมปรมาณดเอนเอบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL และ trnL-trnF ในคลอโรพลาสตดเอนเอของพะยงดวยเทคนคพซอารตอไป
4.2 การเพมปรมาณดเอนเอบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนงtrnL-trnL และ trnL-trnFในคลอโรพลาสตดเอนเอของพะยงดวยเทคนคพซอาร
เมอไดคลอโรพลาสตดเอนเอทสกดไดจากตวอยางพะยงทงหมด 39 ตวอยาง ดวยชดน ายาส าเรจรป NucleoSpin®Plant II จากขนตอนท 3.2.4 เพอใชเปนดเอนเอแมแบบในการเพมปรมาณดเอนเอบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL และ trnL-trnF ในคลอโรพลาสตดเอนเอของพะยงดวยเทคนคพซอารดงแสดงในขนตอนท 3.2.4 จากการศกษาการหาอณหภมทเหมาะสมในการจบกนของไพรเมอรกบดเอนเอแมแบบโดยอางองจากขอมลของผลตภณฑ PhusionFlash High-Fidelity PCRMaster Mix บรษทผผลต Thermo scientific ทใชในการท าปฏกรยาพซอารอณหภมทเหมาะสมในการจบกนระหวางไพรเมอรกบดเอนเอแมแบบคอ58องศาเซลเซยสจากนนจงเลอกใชอณหภมท 58 องศาเซลเซยส ในการเรมปฏกรยาพซอารแลวจงน าผลตภณฑพซอารมาตรวจสอบคณภาพและขนาดดวย 1.5% (w/v) อะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซสโดยใช VC 100 bp plus DNA Ladder เปนดเอนเอมาตรฐานเพอเทยบขนาดของผลตภณฑพซอารไดผลการทดลองดงแสดงในรปท 4.4 4.5 4.6 และ 4.7 ตามล าดบ
จากผลการทดลองในรปท 4.4 และ 4.5 พบผลตภณฑพซอารบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL ของตวอยางจากจงหวดสกลนคร พษณโลกอบลราชธาน อดรธาน ขอนแกน
56
ศรษะเกษ และฉะเชงเทราตามล าดบ เมอใชไพรเมอรค trnL 5'exon Forward และ trnL 3'exon Reverse ในการท าปฏกรยาพซอารโดยพบวามแถบดเอนเอเพยงแถบเดยวทขนาดประมาณ 550 คเบส
จากผลการทดลองในรปท 4.6 และ 4.7 พบผลตภณฑพซอารบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnF ของตวอยางจากจงหวดสกลนคร พษณโลกอบลราชธาน อดรธาน ขอนแกน ศรษะเกษ และฉะเชงเทราตามล าดบ เมอใชไพรเมอรค trnL3'exon Forward และ trnF Reverse ในการท าปฏกรยาพซอารโดยพบวาวามแถบดเอนเอเพยงแถบเดยวทขนาดประมาณ 470คเบส
รปท 4.4 การตรวจสอบคณภาพและขนาดผลตภณฑพซอารบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL ของตวอยางจากจงหวดสกลนคร และพษณโลก รหส SN01 SN02 SN03 SN04 SN05 PL01 PL02 PL03 PL04 และ PL05 ดวย 1.5% (w/v) อะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซสโดยใช VC 100 bp plus DNA Ladder เปนดเอนเอมาตรฐาน (แถว M)
bp 3000 2500 2000 1500 1200 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
SN PL M 01 02 03 04 05 M 01 02 03 04 05
57
รปท 4.5 การตรวจสอบคณภาพและขนาดผลตภณฑพซอารบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL ของตวอยางจากจงหวดอบลราชธาน อดรธาน ขอนแกน และศรษะเกษ รหส UB01 UB02 UB03 UB04 UB05 UB06 UD01 UD02 UD03 UD04 UD05 KK01 KK02 KK03 KK04 KK05 SK01 SK03 SK05 และ SK06 ดวย 1.5% (w/v) อะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซสโดยใช VC 100 bp plus DNA Ladder เปนดเอนเอมาตรฐาน (แถว M)
รปท 4.6 การตรวจสอบคณภาพและขนาดผลตภณฑพซอารบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnFของตวอยางจากจงหวดสกลนคร และพษณโลก รหส SN01 SN02 SN03 SN04 SN05 PL01 PL02 PL03 PL04 และ PL05 ดวย 1.5% (w/v) อะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซสโดยใช VC 100 bp plus DNA Ladder เปนดเอนเอมาตรฐาน (แถว M)
bp 3000 2500 2000 1500 1200 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
bp 3000 2500 2000 1500 1200 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
UB UD KK SK M 01 02 03 04 05 06 M 01 02 03 04 05 M 01 02 03 04 05 M 01 03 05 06
SN PL M 01 02 03 04 05 M 01 02 03 04 05
58
รปท 4.7 การตรวจสอบคณภาพและขนาดผลตภณฑพซอารบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnFของตวอยางจากจงหวดอบลราชธาน และอดรธาน รหส UB01 UB02 UB03 UB04 UB05 UB06 UD01 UD02 UD03 UD04 และ UD05 ดวย 1.5% (w/v) อะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซสโดยใช VC 100 bp plus DNA Ladder เปนดเอนเอมาตรฐาน (แถว M)
จากการศกษาของ Ferri และคณะในป ค.ศ.2009 ไดศกษาการระบสปชสของชววตถพยานในพชดวยดวยยนบารโคดหลายๆ ต าแหนง พบวาการเพมปรมาณดเอนเอบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL–trnF ในพชจ านวน 63 ชนด จากทงหมด 33 สกลพช มอตราการเพมจ านวนดเอนเอจากเทคนคพซอารสงคดเปนรอยละ 100 โดยมขนาดของผลตภณฑพซอารอยระหวาง 173 ถง 608 คเบส ซงมคาเฉลยของผลตภณฑพซอารเปน 399 คเบส และในปเดยวกน Rachmayanti และคณะไดศกษาความแตกตางของดเอนเอจากไมแปรรป และไมซงจ านวน 406 ตวอยาง ซงเปนตวอยางทมาจากประเทศแถบเอเชยตะวนออกเฉยงใตโดยไดเลอกต าแหนง trnL–trnL และ trnL–trnF มาใชในการศกษาครงนดวย พบวาหลงจากเพมปรมาณดเอนเอทบรเวณดงกลาวแลวมขนาดผลตภณฑพซอารทต าแหนง trnL–trnL ประมาณ 600 คเบส และมขนาดของผลตภณฑพซอารทต าแหนง trnL–trnF เทากบ 380 คเบส โดยจากการศกษาการใชไพรเมอรสากลในการเพมปรมาณคลอโรพลาสตดเอนเอในบรเวณทไมไดใชเปนแมแบบในการสรางโปรตนของ Taberlet ในป ค.ศ. 1991 พบวาทบรเวณ trnL–trnLintergenic spacer มประสทธภาพในการศกษาววฒนาการสง
จากการศกษาคณภาพและขนาดของผลตภณฑพซอารจากงานวจยดงกลาว เมอตรวจสอบผลตภณฑพซอารของตวอยางพะยงทงหมดจ านวน 39 ตวอยางบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนงtrnL-trnL และ trnL-trnF พบวามขนาด 550 และ 470 คเบสตามล าดบซงมปรมาณสง เมอเทยบกบผลตภณฑพซอารทบรเวณเดยวกนในพชชนดอนดงนนขนตอนตอไปจะตองท าใหผลตภณฑพซอาร
bp 3000 2500 2000 1500 1200 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
UB UD M 01 02 03 04 05 06 M 01 02 03 04 05
59
บรสทธดวยชดน ายาส าเรจรป NucleoSpin®Extract II กอนจะน าไปวเคราะหหาล าดบนวคลโอไทดตอไป
4.3 การท าผลตภณฑพซอารใหบรสทธดวยชดน ายาส าเรจรปNucleoSpin® Extract II
เมอไดผลตภณฑพซอารทท าการเพมปรมาณดเอนเอบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL และ trnL-trnF ของตวอยางท งหมด 39 ตวอยาง จากน นน าผลตภณฑพซอารมาท าใหมความบรสทธดวยชดน ายาส าเรจรป NucleoSpin®ExtractII ดงแสดงในขนตอนท 3.2.5 เพอก าจดสารรบกวนทเจอปนจากขนตอนการท าปฏกรยาพซอารเชน แมกนเซยมดออกซนวคลโอไทดไตรฟอสเฟต (Deoxy nucleotide triphosphate หรอ dNTP) เอนไซมดเอนเอพอลเมอรเรสและสารละลายบฟเฟอรตางๆหลงจากน าผลตภณฑพซอารทท าใหบรสทธของตวอยางพะยงทงหมดมาตรวจสอบคณภาพและขนาดดวย 1.5% (w/v) อะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซสโดยใช VC 100 bp plus DNA Ladder เปน ดเอนเอมาตรฐานเพอเทยบขนาดของผลตภณฑพซอารบรสทธไดผลการทดลองการเพมปรมาณ ดเอนเอบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL และ trnL-trnF ดงแสดงในรปท 4.8 และ 4.9
รปท 4.8การตรวจสอบคณภาพและขนาดผลตภณฑพซอารบรสทธบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL ของตวอยางจากจงหวดจงหวดอดรธาน ขอนแกน ศรษะเกษ และพษณโลก รหส UD01 UD02 UD03 UD04 UD05 KK01 KK02 KK03 KK04 KK05 SN01 SN02 SN03 SN04 SN05 PL01 PL02 PL03 PL04 และ PL05 ดวย 1.5% (w/v) อะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซสโดยใช VC 100 bp plus DNA Ladder เปนดเอนเอมาตรฐาน (แถว M)
bp 3000 2500 2000 1500 1200 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
UD KK SN PL M 01 02 03 04 05 M 01 02 03 04 05 M 01 02 03 04 05 M 01 02 03 04 05
60
รปท 4.9 การตรวจสอบคณภาพและขนาดผลตภณฑพซอารบรสทธบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnF ของตวอยางจากจงหวดอดรธาน ขอนแกน ศรษะเกษ และพษณโลก รหส UD01 UD02 UD03 UD04 UD05 KK01 KK02 KK03 KK04 KK05 SN01 SN02 SN03 SN04 SN05 PL01 PL02 PL03 PL04 และ PL05 ดวย 1.5% (w/v) อะกาโรสเจลอเลกโทรฟอรซสโดยใช VC 100 bp plus DNA Ladder เปนดเอนเอมาตรฐาน (แถว M)
จากรปท 4.8 และ 4.9 แสดงคณภาพและขนาดของผลตภณฑพซอารบรสทธบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL และ trnL-trnF ตามล าดบ ของตวอยางจากจงหวดอบลราชธาน อดรธาน ขอนแกน สกลนคร และพษณโลก พบวาปรากฏแถบเดยวทมขนาดเทาเดมในทกตวอยางคอเทากบ550 คเบสทบรเวณต าแหนง trnL-trnL และ 470 คเบสทบรวเณต าแหนง trnL-trnF หลงจากนนน าผลตภณฑพซอารท งสองบรเวณไปวเคราะหหาล าดบนวคลโอไทดในแตละตวอยางดวยเทคนคBigdye terminator โดยสงตวอยางท งหมด 78 ตวอยางไปวเคราะหทบรษทแปซฟคไซเอนซจ ากด (Pacific Science Co.,LTD.) ประเทศไทย
4.4 การวเคราะหล าดบนวคลโอไทดดวยโปรแกรม BioEdit version 7.2.5
เมอไดผลวเคราะหล าดบนวคลโอไทดดวยเทคนค Bigdye terminator จากบรษทแปซฟค ไซเอนซจ ากด (Pacific Science Co.,LTD.) ประเทศไทย ของตวอยางพะยงท งหมด 39ตวอยางทบรเวณ intergenic spacer ในต าแหนง trnL-trnL และ trnL-trnF แลวไดผลการทดลองแสดงดงรปท4.10 และ 4.11ตามล าดบโดยแสดงเฉพาะตวอยางพะยงรหส UD01 จากนนตรวจสอบการซอนทบกนของพคบนโครมาโทแกรมใหตรงกบล าดบนวคลโอไทดทได จงน าล าดบนวคลโอไทดมาวเคราะหตอเพอท าการจ าแนกสายพนธของมะไฟจนดวยโปรแกรมส าเรจรป Biological sequence alignment editor (BioEdit) ดงแสดงในขนตอนท 3.2.6
bp 3000 2500 2000 1500 1200 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
bp 3000 2500 2000 1500 1200 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
UD KK SN PL M 01 02 03 04 05 M 01 02 03 04 05 M 01 02 03 04 05 M 01 02 03 04 05
61
รปท4.10โครมาโทแกรมของตวอยางพะยงรหส UD01ในบรเวณ trnL-trnLintergenic spacer โดยใชไพรเมอร trnL 3' exon Reverse (Tab D) ส าหรบการหาล าดบนวคลโอไทด
62
รปท 4.11โครมาโทแกรมของตวอยางพะยงรหส UD01 ในบรเวณ trnL-trnF intergenic spacer โดยใชไพรเมอร trnF Reverse (Tab F) ส าหรบการหาล าดบนวคลโอไทด
เมอเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดบรเวณ trnL-trnL intergenic spacer ของตวอยางพะยงทงหมด 39 ตวอยางดวยโปรแกรม BioEdit version 7.2.5โดยใชไพรเมอร trnL 3' exon Reverseในการหาล าดบนวคลโอไทดพบวาล าดบนวคลโอไทดในทกตวอยางมความคลายคลงกน และในตวอยางพะยงรหส UB05 และ CC04 พบการเปลยนแปลงล าดบนวคลโอไทดแบบ transversion ในต าแหนงท 138 โดยเปนการแทนทของเบสอะดนน (Adenine) เปนไซโทซน (Cytosine) (A→C) ดงแสดงผลในรปท 4.12 ส าหรบล าดบนวคลโอไทดบรเวณ trnL-trnF intergenic spacer เมอใชไพรเมอร trnF Reverse ในการหาล าดบนวคลโอไทด พบวาไมมความแตกตางกนของล าดบนวคลโอไทดในทกตวอยาง จากน นจงน าล าดบนวคลโอไทดของตวอยางพะยงท งหมดจากท งสองบรเวณมาท าการตรวจสอบเปรยบเทยบกบฐานขอมลออนไลน NCBI เพอระบสายพนธพช
63
รปท 4.12 ล าดบนวคลโอไทดของตวอยางพะยงบรเวณ trnL-trnL intergenic spacer ทต าแหนง 89-184 พบการเปลยนแปลงแบบ transversion ของไนโตรจนสเบสจาก A→C ในต าแหนงท 138 ของตวอยางพะยงรหส UB05 และ CC04
รปท 4.13 ล าดบนวคลโอไทดของตวอยางพะยงบรเวณ trnL-trnF intergenic spacer ทต าแหนง 1-100
64
4.5 การตรวจสอบระบสายพนธพชกบฐานขอมลออนไลน
ในการตรวจสอบระบสายพนธพชกบฐานขอมลออนไลน NCBI ดวยโปรแกรม BLAST โดยใชล าดบนวคลโอไทดบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL และ trnL-trnF ในคลอโร-พลาสตดเอนเอของพะยงกบพชใกลเคยง ดงแสดงในขนตอนท 3.2.7 ไดผลการทดลองแสดงรปท 4.14 และ 4.20 จากการทดลองพบวาล าดบนวคลโอไทดของตวอยางพะยงในบรเวณ trnL-trnL intergenic spacer มความใกลเคยงกบล าดบนวคลโอไทดของ Dalbergia cochinchinensis voucher VNMN:B0001132 ซงมคาการระบเอกลกษณสงสด (maximum identities score) เทากบรอยละ 100 ดงแสดงการเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดในรปท 4.15
นอกจาก น ย ง ม ค วาม ใกล เค ยงกบพ ชตระก ล Dalbergianigra haplotype B tRNA-Leu (trnL)gene Dalbergia melanoxylon tRNA-Leu (trnL) gene Dalbergia congestiflora tRNA-Leu (trnL) gene และ Dalbergia miscolobium haplotype C10 tRNA-Leu (trnL) gene ซ งม ค าก ารระบเอกลกษณสงสด เทากบรอยละ97 เทากนในพชทงสตระกลขางตนดงแสดงการเปรยบเทยบล าดบ นวคลโอไทดในรปท 4.16 4.17 4.18 และ 4.19ตามล าดบสวนล าดบนวคลโอไทดของตวอยางพะยงในบรเวณ trnL-trnF intergenic spacer มความใกลเค ยงกบล าดบนวคลโอไทดของ Dalbergia lanceolaria voucher Sirichamorn YSM 2009-02 ซงมคาการระบเอกลกษณสงสดเทากบรอยละ 96 ดงแสดงการเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดในรปท 4.21
รปท 4.14 การตรวจสอบระบสายพนธพะยงบรเวณ trnL-trnL intergenic spacer กบฐานขอมลออนไลน NCBI
65
Score = 832 bits (450), Expect = 0.0
Identities = 450/450 (100%), Gaps = 0/450 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 61 ACCCGGGAATTAACAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCCGTTTTCTGAAAGTAAAGAAAA 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1 ACCCGGGAATTAACAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCCGTTTTCTGAAAGTAAAGAAAA 60
Query 121 GTTACGAAAACGAGAATAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACA 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 61 GTTACGAAAACGAGAATAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACA 120
Query 181 AATGGGGTTGACGATATTTCCTTTCGTGTTAGGAAAGGAATCCTTCCATCGAAATTTAAA 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 121 AATGGGGTTGACGATATTTCCTTTCGTGTTAGGAAAGGAATCCTTCCATCGAAATTTAAA 180
Query 241 AGAAGGATATATATACGTATTTGTACTGAAATATTATTTCAATTGATTAATGAAGACTCC 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 181 AGAAGGATATATATACGTATTTGTACTGAAATATTATTTCAATTGATTAATGAAGACTCC 240
Query 301 CAATTTCTATTTGTGAATCGTTATATCACAATTGAAAGATGTGAATCAAATCAATTCCAA 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 241 CAATTTCTATTTGTGAATCGTTATATCACAATTGAAAGATGTGAATCAAATCAATTCCAA 300
Query 361 GTTGAAGAAAGAATTTAATATTCACTGATCAAATCATTCACTCCATCATAGTCTGATAGA 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 301 GTTGAAGAAAGAATTTAATATTCACTGATCAAATCATTCACTCCATCATAGTCTGATAGA 360
Query 421 TCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGACGAGAATAAAGAGAGAGTCCCATTCTACATGTCAA 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 361 TCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGACGAGAATAAAGAGAGAGTCCCATTCTACATGTCAA 420
Query 481 TACTGACAACAATGAAATTTATAGTAAGAG 510
||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 421 TACTGACAACAATGAAATTTATAGTAAGAG 450
รปท 4.15 ล าดบนวคลโอไทดของตวอยางพะยง UD01 บรเวณ trnL-trnL (แถวบน) เปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของ D. cochinchinensis voucher VNMN:B0001132(แถวลาง) จากฐานขอมลออนไลน
66
Score = 841 bits (455), Expect = 0.0
Identities = 485/499 (97%), Gaps = 4/499 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 31 TACCAAGTGATAACTTTCAAATTCAGAGAAACCCGGGAATTAACAATGGGCAATCCTGAG 90
|||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1 TACCAAGTGATAACTTTCAAATTCAGAGAAACCCCGGAATTAACAATGGGCAATCCTGAG 60
Query 91 CCAAATCCCGTTTTCTGAAAGTAAAGAAAAGTTACGAAAACGAGAAT-AAAAAAGGATAG 149
||||||||||||||||||||| |||||||||| | |||| ||||||| ||||||||||||
Sbjct 61 CCAAATCCCGTTTTCTGAAAGCAAAGAAAAGTAAAGAAAGCGAGAATAAAAAAAGGATAG 120
Query 150 GTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACAAATGGGGTTGACGATATTTCCTTTCGTGT 209
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 121 GTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACAAATGGGGTTGACGATATTTCCTTTCGTGT 180
Query 210 TAGGAAAGGAATCCTTCCATCGAAATT-TA-AAA-GAAGGATATATATACGTATTTGTAC 266
||||||||||||||||||||||||||| || ||| || ||||||||||||||||||||
Sbjct 181 TAGGAAAGGAATCCTTCCATCGAAATTATATAAAGGATATATATATATACGTATTTGTAC 240
Query 267 TGAAATATTATTTCAATTGATTAATGAAGACTCCCAATTTCTATTTGTGAATCGTTATAT 326
||||||| |||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||
Sbjct 241 TGAAATACTATTTCAATTGATTAATGAAGACTCCAAATTTCTATTTGTGAATCGTTATAT 300
Query 327 CACAATTGAAAGATGTGAATCAAATCAATTCCAAGTTGAAGAAAGAATTTAATATTCACT 386
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 301 CACAATTGAAAGATGTGAATCAAATCAATTCCAAGTTGAAGAAAGAATTTAATATTCACT 360
Query 387 GATCAAATCATTCACTCCATCATAGTCTGATAGATCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGAC 446
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 361 GATCAAATCATTCACTCCATCATAGTCTGATAGATCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGAC 420
Query 447 GAGAATAAAGAGAGAGTCCCATTCTACATGTCAATACTGACAACAATGAAATTTATAGTA 506
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 421 GAGAATAAAGAGAGAGTCCCATTCTACATGTCAATACTGACAACAATGAAATTTATAGTA 480
Query 507 AGAGGAAAATCCGTCGACT 525
|||||||||||||||||||
Sbjct 481 AGAGGAAAATCCGTCGACT 499
รปท 4.16 ล าดบนวคลโอไทดของตวอยางพะยง UD01 บรเวณ trnL-trnL (แถวบน) เปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของ D.nigra haplotype B tRNA-Leu (trnL) gene (แถวลาง) จากฐานขอมลออนไลน
67
Score = 880 bits (476), Expect = 0.0
Identities = 508/523 (97%), Gaps = 3/523 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 TTAATTGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACGTACCAAGTGATAACTTTCAAATTCAGAGAA 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||
Sbjct 1 TTAATTGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACGTACCAAGTGAGAACTTTCAAATTCAGAGAA 60
Query 61 ACCCGGGAATTAACAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCCGTTTTCTGAAAGTAAAGAAAA 120
|||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||
Sbjct 61 ACCCCGGAATTAACAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCCGTTTTCTGAAAGCAAAGAAAA 120
Query 121 GTTACGAAAACGAGAAT-AAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAAC 179
|||| |||| ||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 121 GTTAAGAAAGCGAGAATAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAAC 180
Query 180 AAATGGGGTTGACGATATTTCCTTTCGTGTTAGGAAAGGAATCCTTCCATCGAAATTTAA 239
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |
Sbjct 181 AAATGGGGTTGACGATATTTCCTTTCGTGTTAGGAAAGGAATCCTTCCATCGAAATTAGA 240
Query 240 AAGAAGG--ATATATATACGTATTTGTACTGAAATATTATTTCAATTGATTAATGAAGAC 297
|| |||| ||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||
Sbjct 241 AAAAAGGATATATATATACGTATTTGTACTGAAATACTATTTCAATTGATTAATGAAGAC 300
Query 298 TCCCAATTTCTATTTGTGAATCGTTATATCACAATTGAAAGATGTGAATCAAATCAATTC 357
||| ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 301 TCCAAATTTCTATTTGTGAATCGTTCTATCACAATTGAAAGATGTGAATCAAATCAATTC 360
Query 358 CAAGTTGAAGAAAGAATTTAATATTCACTGATCAAATCATTCACTCCATCATAGTCTGAT 417
|||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 361 CAAGTTGAAGAAAGAATTGAATATTCACTGATCAAATCATTCACTCCATCATAGTCTGAT 420
Query 418 AGATCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGACGAGAATAAAGAGAGAGTCCCATTCTACATGT 477
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 421 AGATCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGACGAGAATAAAGAGAGAGTCCCATTCTACATGT 480
Query 478 CAATACTGACAACAATGAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCGT 520
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 481 CAATACTGACAACAATGAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCGT 523
รปท 4.17 ล าดบนวคลโอไทดของตวอยางพะยง UD01 บรเวณ trnL-trnL (แถวบน) เปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของ D. melanoxylon tRNA-Leu (trnL) gene (แถวลาง) จากฐานขอมลออนไลน
68
Score = 881 bits (477), Expect = 0.0
Identities = 510/526 (97%), Gaps = 2/526 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 TTAATTGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACGTACCAAGTGATAACTTTCAAATTCAGAGAA 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 16 TTAATTGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACGTACCAAGTGATAACTTTCAAATTCAGAGAA 75
Query 61 ACCCGGGAATTAACAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCCGTTTTCTGAAAGTAAAGAAAA 120
|||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||
Sbjct 76 ACCCCGGAATTAACAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCCGTTTTCTGAAAGCAAAGAAAA 135
Query 121 GTTACGAAAACGAGAAT-AAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAAC 179
|||| |||| ||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 136 GTTAAGAAAGCGAGAATAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAAC 195
Query 180 AAATGGGGTTGACGATATTTCCTTTCGTGTTAGGAAAGGAATCCTTCCATCGAAATTTAA 239
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| |
Sbjct 196 AAATGGGGTTGACGATATTTCCTTTCGTGTTAGGAAAGGAATCGTTCCATCGAAATTATA 255
Query 240 AAGAAGGATATATATACGTATTTGTACTGAAATATTATTTCAATTGATTAATGAAGACTC 299
| ||||||||||||||| ||||||||||||||| ||||||||||||||||||| |||||
Sbjct 256 TA-AAGGATATATATACGGATTTGTACTGAAATACTATTTCAATTGATTAATGAGGACTC 314
Query 300 CCAATTTCTATTTGTGAATCGTTATATCACAATTGAAAGATGTGAATCAAATCAATTCCA 359
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 315 CAAATTTCTATTTGTGAATCGTTATATCACAATTGAAAGATGTGAATCAAATCAATTCCA 374
Query 360 AGTTGAAGAAAGAATTTAATATTCACTGATCAAATCATTCACTCCATCATAGTCTGATAG 419
| |||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 375 AATTGAAGAAAGAATTGAATATTCACTGATCAAATCATTCACTCCATCATAGTCTGATAG 434
Query 420 ATCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGACGAGAATAAAGAGAGAGTCCCATTCTACATGTCA 479
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 435 ATCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGACGAGAATAAAGAGAGAGTCCCATTCTACATGTCA 494
Query 480 ATACTGACAACAATGAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACT 525
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 495 ATACTGACAACAATGAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACT 540
รปท 4.18 ล าดบนวคลโอไทดของตวอยางพะยง UD01 บรเวณ trnL-trnL (แถวบน) เปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของ D. congestiflora tRNA-Leu (trnL) gene (แถวลาง) จากฐานขอมลออนไลน
69
Score = 870 bits (471), Expect = 0.0
Identities = 508/526 (97%), Gaps = 2/526 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 TTAATTGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACGTACCAAGTGATAACTTTCAAATTCAGAGAA 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 2 TTAATTGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACGTACCAAGTGATAACTTTCAAATTCAGAGAA 61
Query 61 ACCCGGGAATTAACAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCCGTTTTCTGAAAGTAAAGAAAA 120
|||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||
Sbjct 62 ACCCCGGAATTAACAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCCGTTTTCTGAAAGCAAAGAAAA 121
Query 121 GTTACGAAAACGAGAATA-AAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAAC 179
|||| |||| |||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 122 GTTAAGAAAGCGAGAATACAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAAC 181
Query 180 AAATGGGGTTGACGATATTTCCTTTCGTGTTAGGAAAGGAATCCTTCCATCGAAATTTAA 239
|||||||||| |||| ||||||||||||||||| |||||||||||| |||||||||| |
Sbjct 182 AAATGGGGTTAACGACATTTCCTTTCGTGTTAGAAAAGGAATCCTTTCATCGAAATTATA 241
Query 240 AAGAAGGATATATATACGTATTTGTACTGAAATATTATTTCAATTGATTAATGAAGACTC 299
| ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||
Sbjct 242 TA-AAGGATATATATACGTATTTGTACTGAAATACTATTTCAATTGATTAATGAAGACTC 300
Query 300 CCAATTTCTATTTGTGAATCGTTATATCACAATTGAAAGATGTGAATCAAATCAATTCCA 359
| |||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 301 CAAATTTCGATTTGTGAATCGTTATATCACAATTGAAAGATGTGAATCAAATCAATTCCA 360
Query 360 AGTTGAAGAAAGAATTTAATATTCACTGATCAAATCATTCACTCCATCATAGTCTGATAG 419
|||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 361 AGTTGAAGAAAGAATTGAATATTCACTGATCAAATCATTCACTCCATCATAGTCTGATAG 420
Query 420 ATCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGACGAGAATAAAGAGAGAGTCCCATTCTACATGTCA 479
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 421 ATCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGACGAGAATAAAGAGAGAGTCCCATTCTACATGTCA 480
Query 480 ATACTGACAACAATGAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACT 525
|||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 481 ATACTGACAACAATAAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACT 526
รปท 4.19 ล าดบนวคลโอไทดของตวอยางพะยง UD01 บรเวณ trnL-trnL (แถวบน) เปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของ D. miscolobium haplotype C10 tRNA-Leu (trnL) gene (แถวลาง) จากฐานขอมลออนไลน
70
รปท 4.20 การตรวจสอบระบสายพนธพะยงบรเวณ trnL-trnF intergenic spacer กบฐานขอมลออนไลนNCBI Score = 673 bits (364), Expect = 0.0
Identities = 406/425 (96%), Gaps = 7/425 (1%)
Strand=Plus/Plus
Query 4 AAAGGATCGC-TTAACTCTATAATTCTTTTTACTATATGCTCTTTTTAAAAA-TTCGTTA 61
||||| ||| |||||||||||||||||||||||||||||| |||| ||||| |||||||
Sbjct 2 AAAGGGCCGCATTAACTCTATAATTCTTTTTACTATATGCTTTTTTAAAAAATTTCGTTA 61
Query 62TGTGTCTTATGTTATGCGTTTTATTCAGTATAtttttttCATAAATGGATCC-ttttttt 120
|||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| |||||||||| |||||||
Sbjct 62 TGTGTCTTATGTTATGTGTTTTATTCAGTATATTTTTTTCACAAATGGATCCTTTTTTTT 121
Query 121ttatttctttttCTGATCACAATCCCAAGTCTTAGAatatatttggaatatataatgata 180
|| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 122 TTCTTTCTTTTTCTGATCACAATCCCAAGTCTTAGAATATATTTGGAATATATAATGATA 181
Query 181tatatgataCACGTACAATATTC-ttttttttATAAACGTACAAATGAGCATCTTATCCT 239
||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 182 TATATGATACACGTACAATATTCTTTTTTTTTATAAACGTACAAATGAGCATCTTATCCT 241
Query 240 TGAGGAACGAATCCTCATATGAATGATTAACACTACATGATCATTACTCCTACTGAAATT 299
|||| ||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |
Sbjct 242 TGAGAAACGAATCCTCATGTGAATGATTAACACTACATGATCATTACTCCTACTGAAA-T 300
Query 300TACAAAGTCTTATAttttttttcgtcgtcttttttttttt-GTTGACATAGAGTCATTGA 358
|||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||
Sbjct 301 TACAAAGTCTTATA-TTTTTTTCGTCGTCTTTTTTTTTTTAGTTGACATAGAGTCATTGA 359
Query 359 CATATACTTAAGTAATCTCATAAAATTAAGATGATGCGCCAAGAATGGTCGGGATAGCTC 418
||||||||||||||||||||||||||||| |||| ||| |||||||||||||||||||||
Sbjct 360 CATATACTTAAGTAATCTCATAAAATTAAAATGAGGCGTCAAGAATGGTCGGGATAGCTC 419
Query 419 AGCTG 423
|||||
Sbjct 420 AGCTG 424
รปท 4.21 ล าดบนวคลโอไทดของตวอยางพะยง UD01 บรเวณ trnL-trnF (แถวบน) เปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของ D. lanceolaria voucher Sirichamorn YSM 2009-02 (แถวลาง) จากฐานขอมลออนไลน
71
เมอน าล าดบนวคลโอไทดทบรเวณ trnL-trnL intergenic spacer ของพชตระกล Dalbergia cochinchinensis voucher VNMN:B0 0 0 1 1 3 2 Dalbergianigra haplotype B tRNA-Leu (trnL) gene Dalbergia melanoxylon tRNA-Leu (trnL) gene Dalbergia congestiflora tRNA-Leu (trnL) gene และ Dalbergia miscolobium haplotype C10 tRNA-Leu (trnL) gene ทอางองจากฐานขอมลออนไลนมาจดเรยงเปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของพะยงท ง 39 ตวอยางอยางละเอยดดวยโปรแกรม BioEdit พบวาล าดบนวคลโอไทดของตวอยางพะยงทง 39 ตวอยางเหมอนกบล าดบนวคลโอไทดของ D. cochinchinensis voucher VNMN:B0001132 ทกล าดบนวคลโอไทด แสดงถงไมมความแตกตางกนของล าดบนวคลโอไทดระหวางสายพนธทศกษา กบสายพนธจากประเทศเวยดนามแตพบการหายไปของล าดบนวคลโอไทด (deletion) การเพมล าดบนวคลโอไทด (Insertion) และการแทนทของล าดบนวคลโอไทด (substitution) ในหลายต าแหนงเมอเปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของ Dalbergianigra haplotype B tRNA-Leu (trnL) gene Dalbergia melanoxylon tRNA-Leu (trnL) gene Dalbergia congestiflora tRNA-Leu (trnL) gene และ Dalbergia miscolobium haplotype C10 tRNA-Leu (trnL) gene
โดยพบความหลากหลายของนวคลโอไทดจ านวน 10 ต าแหนง เมอเปรยบเทยบกบสายพนธ D. nigra พบความหลากหลายของนวคลโอไทดจ านวน 15 ต าแหนง เมอเปรยบเทยบกบสายพนธ D. melanoxylon พบความหลากหลายของนวคลโอไทดจ านวน 16 ต าแหนง เมอเปรยบเทยบกบสายพนธD. congestiflora และพบความหลากหลายของนวคลโอไทดจ านวน 18 ต าแหนง เมอเปรยบเทยบกบสายพนธ D. miscolobium ดงแสดงผลการเปลยนแปลงล าดบนวคลโอไทดในตารางท 4.1
72
ตารางท 4.1ล าดบนวคลโอไทดบรเวณ trnL-trnL intergenic spacer ของตวอยางพะยงจ านวน39ตวอยางเปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของ Dalbergia nigra D. congestiflora D. melanoxylon และ D. miscolobium
ชนดของการเปลยนแปลง ล าดบนวคลโอไทด
D. nigra D. congestiflora D. melanoxylon D. miscolobium
นวคลโอไทด ต าแหนง นวคลโอไทด ต าแหนง นวคลโอไทด ต าแหนง นวคลโอไทด ต าแหนง
การหายไปของล าดบ นวคลโอไทด
A T,G
138 และ 233 236 และ 241 A 138
A AT
138 247-248
C 139
การเพมล าดบ นวคลโอไทด
G 242 G 242
การแทนทของล าดบ นวคลโอไทด
C→G C→T A→T A→C G→A T→A A→G T→G
64 112 และ 274
123 125 และ 301
130 244 245 246
C→G C→T A→C G→A G→C T→A A→T G→T C→A A→G
65 112 และ 274
125 130 และ 294
222 224 238 และ 240
237 258 และ 376
301 361
G→T C→G C→T A→C G→A A→T A→G C→A
41 และ 376 65
112 และ 274 125 และ 301 130 และ 238
237 242 324
C→G C→T A→C G→A A→G T→C A→T T→A G→T
65 112 195 274 125 และ 301
130 190 213 494
226 237
238 และ 240
308 และ 376
73
ส าหรบล าดบนวคลโอไทดทบรเวณ trnL-trnF intergenic spacer ของพชตระกล D. lanceolaria voucher Sirichamorn YSM 2009-02 ทอางองจากฐานขอมลออนไลนมาจดเรยงเปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของพะยงทง 39 ตวอยางอยางละเอยดดวยโปรแกรม BioEdit พบการหายไปของล าดบ นวคลโอไทด (deletion) การเพมล าดบนวคลโอไทด (Insertion) และการแทนทของล าดบนวคลโอ-ไทด (substitution) ทงหมด 19 ต าแหนง ดงแสดงรายระเอยดการเปลยนแปลงล าดบนวคลโอไทดในตารางท 4.2
ตารางท 4.2 ล าดบนวคลโอไทดบรเวณ trnL-trnF intergenic spacer ของตวอยางพะยงจ านวน 39 ตวอยางเปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของ Dalbergia lanceolaria YSM 2009-02
ชนดของการเปลยนแปลง ล าดบนวคลโอไทด
D. lanceolaria
นวคลโอไทด ต าแหนง
การหายไปของล าดบนวคลโอไทด A T A
14 54 113 และ 204
339
การเพมล าดบนวคลโอไทด T 298 และ 314
การแทนทของล าดบนวคลโอไทด
G→A C→T T→C A→T C→A A→G G→T
9 และ 258 10 และ 102
43 78 และ 397 48
123 244 และ 388
393
74
จากการตรวจสอบล าดบนวคลโอไทดของพะยงบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnF กบฐานขอมลออนไลนแสดงใหเหนวายงไมมการศกษาล าดบนวคลโอไทดของพะยงในบรเวณดงกลาวและจากผลการตรวจสอบความหลากหลายของนวคลโอไทดพะยงดวยเครองหมายดเอนเอ แสดงใหเหนวาสามารถแยกความแตกตางของพชตระกล Dalbergia ในแตละสปชสไดดวยเครองหมายดเอนเอบรเวณ trnL-trnL และ trnL-trnF intergenic spacer
4.6 การจ าแนกววฒนาการสายพน ธพะยงดวยโปรแกรมMolecular evolutionary genetics analysis (MEGA) version 6.0.6
หลงจากน าล าดบนวคลโอไทดบรเวณ trnL-trnL และ trnL-trnF intergenic spacer ของตวอยางพะยงจ านวน 39 ตวอยางมาเปรยบเทยบการจดเรยงล าดบนวคลโอไทดกบตระกลพชทมล าดบนวคล-โอไทดใกลเคยงกนโดยไดอางองจากฐานขอมลออนไลน NCBI พบวาล าดบนวคลโอไทดบรเวณtrnL-trnL ของตวอยางพะยงมความเหมอนกบ D. cochinchinensis voucher VNMN:B0001132 โดย มคาการระบเอกลกษณสงสดเทากบรอยละ100 และยงมความใกลเคยงกบ D. nigra haplotype B tRNA-Leu (trnL) gene D. melanoxylon tRNA-Leu (trnL) gene D. congestiflora tRNA-Leu (trnL) gene และ D. miscolobium haplotype C10 tRNA-Leu (trnL) gene ซงมคาการระบเอกลกษณสงสดเทากบรอยละ 97 เทากน ส าหรบล าดบนวคลโอไทดบรเวณ trnL-trnF ของตวอยางพะยงมความใกลเคยงกบ D. lanceolaria voucher Sirichamorn YSM 2009-02 มากทสดโดยมคาการระบเอกลกษณสงสดเทากบรอยละ 96 จากนนน าขอมลการเปรยบเทยบเหลานมาจ าแนกววฒนาการสายพนธดวยโปรแกรมส าเรจรป MEGA ตามขนตอนท 3.2.7 ไดแผนผงววฒนาการการจ าแนกสายพนธพะยงในบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL และ trnL-trnF ในคลอโรพลาสตดเอนเอ ดงแสดงในรปท 4.22 และ 4.23 ตามล าดบ
ดงน นจากแผนผงววฒนาการการจ าแนกสายพนธพะยงจ านวน 39 ตวอยางในบรเวณintergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL และ trnL-trnF ในคลอโรพลาสตดเอนเอ ทไดจากโปรแกรมMolecular evolutionary genetics analysis (MEGA) version 6.0.6 พบวาพะยงจ านวน 39 ตวอยางทใชในการศกษาถกจดอยในก ลม เดยวกนกบสายพน ธพ ะยงจากประเทศเวยดน าม (voucher VNMN:B0001132) นอกจาก นพะยงท ศกษ าย ง มความสมพนธ ใกลชดกบสายพน ธของ D. melanoxylon มากท สด รองลงมาคอสายพนธ D.nigra D.congestiflora D. miscolobium และ D. lanceolaria ตามล าดบ
75
รปท 4.22 แผนผงววฒนาการการจ าแนกสายพนธพะยงจ านวน 39 ตวอยางในบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnL ในคลอโรพลาสตดเอนเอ
76
รปท 4.23 แผนผงววฒนาการการจ าแนกสายพนธพะยงจ านวน 39 ตวอยางในบรเวณ intergenic spacer ทต าแหนง trnL-trnF ในคลอโรพลาสตดเอนเอ
77
การศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมพะยง ดวยเครองหมายดเอนเอในครงน มขอจ ากดเปนอยางมากในการเลอกตวอยางเพอน ามาใชในการศกษา เนองจากตองทราบถนก าเนดของเมลดพนธพะยงทใชเพาะกลาอยางแนชด เพอไมใหเกดขอผดพลาดในการเผยแพรขอมลทางการศกษา จงท าใหไมสามารถหาตวอยางไดครบตามทค านวณไว ดงน นส าหรบแนวทางท เหมาะสมในการท าการศกษาตอไปควรใชเครองหมายดเอนเอบรเวณอน อาท matK rbcL rpoB trnH–psbA เพอความหลากหลายของบรเวณเครองหมายดเอนเอทใชส าหรบการแยกความแตกตางทางชวภมศาสตรของพะยง ส าหรบการเลอกตวอยางมาศกษาควรเลอกตวอยางใบจากตนพะยงทมอาย 10-20 ปขนไป ในแตละพนท รวมไปถงท าการศกษาเปรยบเทยบลายเนอไมกบสายพนธใกลเคยง ควบคไปกบการใชเครองหมายดเอนเอ เพอเปนประโยชนทงในดานการตรวจสอบไมผดกฎหมาย ในทางนตวทยาศาสตร และการอนรกษไมพะยงทมลกษณะล าตน และลายไมทสวยงาม ในทางพฤกษศาสตรอกดวย จากขอมลการเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดของพะยงจ านวน 39 ตวอยางดวยเครองหมาย ดเอนเอบรเวณ trnL-trnL และ trnL-trnF inergenic spacer ในคลอโรพลาสตดเอนเอ แสดงใหเหนวา มความหลากหลายภายในกลมตวอยางพะยงทใชในการศกษาครงนนอย จงไมสามารถบอกความแตกตางทางชวภมศาสตรของพะยงไดอยางชดเจน เมอเปรยบเทยบกบการทดลองของ Yooyuen และคณะ ป ค.ศ. 2012 ไดศกษาความหลากหลายของพะยงบรเวณ trnS-trnG trnV-trnM trnC-petN1R โดยใชตวอยางทงหมดจ านวน 108 ตวอยาง ทมาจากพนท 9 จงหวดในประเทศไทย รวมถงไดตวอยางตนพะยงจากประเทศลาว พบวาจากการศกษาความหลากหลายของพะยงดวยเครองหมายดเอนเอทง 3 บรเวณดงกลาว สามารถแบงกลมประชากรทมความสมพนธกนทางภมศาสตร (haplotypes) ได 11 กลม และในจงหวดสระบรพบประชากรทมความสมพนธกนทางภมศาสตรมความเปนเอกลกษณ (unique) มากทสด ส าหรบการศกษาครงตอไปควรเกบรวบรวม และตรวจสอบความหลากหลายของพะยงในพนทอนๆ ตอไป เพอน ามาใชในการระบถนก าเนด หรอทมาทางพนธกรรมของพะยงทมการน าเขา หรอสงออกอยางผดกฎหมายภายในประเทศไทยได
