1. Functionele morfologie van de cel + organellen en cytoskelet + intermediare filamenten

InleidingDe cel vormt de kleinste functionele een heid waarbinnen biochemische, fysiologische en pathologische processen optreden.

Het is duidelijk dat het begin van het ontstaan van de cel ontstond met het vormen van een afscherming; het plasmamembraan. Dit biomembraan heeft een aantal specifieke, doch cruciale eigenschappen:

Het universele biomembraan bestaat uit een fosfolipiden-dubbellaag, en kan zo specifieke functies verwezenlijken:

Het vormt zo, mede door zijn hydrofoob karakter, een uiterst functionele barrière. Het kan via aangehechte membraanproteïnen transport van een zeer uiteenlopende groep

moleculen reguleren (en dus ook blokkeren). Het kan een aanhechtingsmedium vormen voor membraanproteïnen, voor (hemi)desmosomen

ter celaanhechting resp. matrixaanhechting. Draagt receptoren die gevoelig zijn voor hormonen, neurotransmitters of groeifactoren.

CelorganellenOm de cel zijn functies te kunnen laten verrichten, heeft het celorganellen nodig. Hiervan zijn sommige omgeven door een dubbel membraan en hebben dus ook een intermembranaire ruimte (kern en mitochondria). Andere organellen zijn slecht omgeven door een enkel membraan (lysosomen; peroxisomen; ER en het Golgi-complex).

Endosomen.Endosoom → Ionen en kleine moleculen gaan cel binnen via transport-eiwitten in celmembraan, maar eiwitten en macromoleculen in het extracell. Milieu worden opgenomen via ENDOCYTOSE. = invaginatie van segment van plasma membraan ovv coated pit (coated met clathrine); pit snoert af , wordt membraan-gebonden vesikel die versmelt met vroeg endosoom dat fungeert als sorteerstation. Van hieruit gaan sommige eiwitten terug naar celmembraan; andere gaan naar laat endosoom waar verdere sortering gebeurt. Tenslotte levert het late endosoom inhoud af aan lysosoom tbv afbraak.

Lysosomen.Lysosoom → afbraak van schadelijke of overtollige componenten in zuur milieu via zure hydrolasen.

1

Het interne milieu wordt verzuurd door speciale membraanpompen die H+- pompen. Een elektrische gradiënt wordt voorkomen door cotransport van Cl--ionen. Wanneer het milieu sterk wordt verzuurd ondergaan de zure hydrolasen een conformatieverandering en worden zo geactiveerd (nucleasen; proteasen of fosfatasen).

Ziekte van Tay-Sachs; door een defect lysosomaal enzym (hexosaminidase A) kunnen de gangliosiden niet worden afgebroken in het lysosoom. Hierdoor worden deze gangliosiden geaccumuleerd in de zenuwcellen wat leidt tot malfunctie. Deze malfunctie uit zich in schrikachtig gedrag, vertraagde verstandelijke & motorische ontwikkeling, te lage spierspanning en uiteindelijk blindheid en dementie. Kinderen overlijden meestal voor hun derde levensjaar.

PeroxisomenPeroxisoom → een celorganel dat toxische moleculen en vetzuren kan degraderen. Het degradeert door gebruik te maken van oxidasen enzymen die zuurstof gebruiken om organische substanties te oxideren waarbij corrosief H2O2 wordt gevormd. Het catalase enzymen degenereren H2O2 tot water en zuurstof. Het komt met name frequent voor in levercellen en in niercellen. Deze enzymen worden in een pas gevormd peroxisoom (ontstaan uit ER membraan) ingebracht vanuit het cytosol via een peroxisomaal membraan proteïne.

Syndroom van Zellweger; een stofwisselingsziekte waarbij er een defect is in een membraanproteïne waardoor eiwitten (enzymen) niet geïmporteerd kunnen worden in de peroxisomen. Hierdoor zullen levercirrose, dementie en gaten in de hersenen optreden. Met name dit laatste leidt tot fouten in de aanleg en ontwikkeling van de hersenen.

Endoplasmatisch ReticulumEndoplasmatisch reticulum (ER) → Er bestaan 2 varianten; een SER (Smooth endoplasmatisch retculum, geen ribosomen) en een RER (rough endoplasmatisch reticulum, wel ribosomen):

Functies ER:

SER: synthese van vetzuren en fosfolipiden: Levercel → detoxificatie van hydrofobe producten tot wateroplosbare producten. Spiercel → afzondering en opslag van Ca2+

Bijniercel → steroïdmetabolisme/ hormoonproductie RER: synthese van bepaalde proteïnen:

Bevat chaperones en kan zo bepaalde peptiden helpen vouwen Eiwitten bestemd voor secretie; deze blijven in het lumen van het ER voor glycosylatie en

vorming van zwavelbruggen Eiwitten voor membranen en organellen; deze blijven op het membraan van ER.

Golgi-complexGolgi-complex → een reeks afgeplatte cisternen omgeven door vesikels. Dit complex is ingedeeld in verschillende regio’s; het begin vormt het cis-Golgi gevolgd door het midden-Golgi) en trans-Golgi. In het Golgi vindt de enzymatische bewerking van proteïnen plaats. Transport gebeurt dan via transport-vesikels aan transzijde naar celmembraan of naar lysosoom of andere organellen.

2

De celkernDe nucleaire enveloppen is een dubbelmembraan dat de nucleus scheid van het cytoplasma. Het binnenste membraan begrenst nucleus en de buitenste membraan en de intermembranaire ruimte zijn continu met het ER. Lamine vormt een netwerk over het binnenste membraan, waardoor de nucleus vorm heeft. Transport van ribonucleoproteinen (RNPs) en andere macromoleculen mogelijk doorheen kern-poriën. rRNA wordt in de nucleolus gesynthetiseerd. mRNA en tRNA wordt in de nucleuplasma gesynthetiseerd

Het buitenste membraan is continu met RER. Het binnenste membraan is bedekt met lamine; een intermediair filament voor de stevigheid. Hierbinnen zit DNA, waar het wordt getranscribeerd naar mRNA dat vervolgens de kern kan verlaten via de kernporiën. In het lumen van de nucleus zit zgn. nucleoplasma, wat het DNA bevat in eu- of heterochromatische vorm (het DNA is opgevouwen volgens het solenoïde model; euchromatine: losse strengen DNA die licht gekleurd zijn en waarvan het DNA kan worden afgelezen, transcript; heterochromatine: DNA in kluwen, donkere kleur, niet aleesbaar, geen transcriptie).Let wel; alle vormen van RNA worden hier aangemaakt, alleen wordt rRNA aangemaakt in de nucleolus en kan mRNA binden aan een proteïne tot vorming van een ribonucleoproteine partikel. Deze kernporiën verzorgen naast het mRNA-transport ook inwaarts transport van histonen, DNA- en RNA-polymerasen, boodschapperproteïnen en ribosomale proteïnen. En het uitwaarts transport voor RNA. Het transport gebeurt via de kernporiën, dus hoe kleiner het molecule, hoe sneller het transport; hoe groter het molecule, hoe trager het transport. Grotere eiwitten kunnen ook doorheen het membraan mbv een nuclear localisation signal; hierdoor vindt er binding plaats aan fibrillen zodat deze proteïnen actief getransporteerd kunnen worden.

De nucleolus (“kern in kern”)Het kernlichaampje is verdeeld in 3 gedeelten:

1. Het Pars Amorfa → het gedeelte van de nucleolus dat in contact staat met de DNA-sequenties die coderen voor rRNA (via RNA-polymerase I). In de tekst staat nog het N.O.R. genoemd; dit staat voor de Nucleolus Organiserende Regio; de plaats waar de nucleolus gevormd wordt; namelijk rond specifieke genetische loci.

2. Pars fibrosa → deel dat het rRNA en meer dan 80 eiwitten bevat. Dit kan gevisualiseerd worden met zilverkleuring. Het proteïne nucleoline kleurt hierbij aan.

3. Pars granulosa → in dit deel vindt de assemblage van de ribosomale subunits plaats.

Toepassing: Nucleolus en kanker: hoe groter (zowel aantal als vorm) de nucleolus tov de kern, hoe kwaadaardiger de kanker

MitochondriaMen denkt dat deze terecht zijn gekomen in de eukaryote cellen volgens de endosymbiosetheorie; dit wordt ondermeer ondersteund door de aanwezigheid van mitochondriaal DNA. Deze organellen kunnen bv. via de citroenzuurcyclus die plaatsvindt in de matrix NADH synthetiseren en vormen zo een uiterst belangrijk intermediair in het energiemetabolisme. Een mitochondrion heeft een dubbel membraan, waarbij het buitenste membraan zeer permeabel is i.v.m. aanwezigheid van porines. Het binnenste membraan vormt cristae en is bovendien zeer impermeabel. Dit verschil in permeabiliteit ontstaat door de membraanopbouw. Het buitenste membraan bestaat uit ongeveer 50% lipiden en 50% proteïnen, terwijl het binnenste membraan een verhouding van 20/80 heeft. De buitenste membraanporines zijn volledig permeabel voor moleculen kleiner dan 10 kD. Op deze cristae van het binnenste membraan vindt de oxidatieve fosforylatie plaats voor de ATP-synthese. Alleen bij steroïdsecreterende cellen is het binnenste membraan gevouwen in tubulaire uitstulpingen. In beide gevallen is er plaats voor ATP-synthasen, transportproteïnen voor ADP; P i en ATP én er zit nog een proteïne in dat de protonen tegen kan houden; het cardiolipine. Het organel bevat zijn eigen DNA, zijn eigen tRNA en zijn eigen ribosomen, die zich in de matrix bevinden.

3

Het cytoskeletHet cytoskelet bestaat uit polymeren van eiwit-subunits die op verschillende manieren zijn opgebouwd en ontstaan uit verschillende bouwstenen:

1. Microfilamenten; bestaande uit actine. Dit zijn subunits van 8 à 9 nm diameter die een gedraaide dubbelstreng van monomerische actine-subunits vormen, heel sterk.

2. Intermediaire filamenten; subunits met een diameter van 10 nm die een koordstructuur kunnen vormen wat verschilt per celtype (weefselherkenning)

3. Microtubuli; de subunits zijn α- resp. β-tubuline die dimere subunits vormen en uiteindelijk polymeriseren tot een holle buis. De diameter hiervan is zo’n 24 nm. De dimere subunits vormen eerst protofilamenten, en die polymeriseren tot een microtubulus.

Het cytoskelet is een van de voornaamste organellen in de eukaryote cel; dit om de onderstaande redenen:

Het zorgt voor het behoud van de celvorm Het maakt gecoördineerde beweging mogelijk (microfilamenten), zowel integraal als intern via

schikking; dit wordt overigens mogelijk gemaakt door zijn dynamsiche structuur → cytomusculatuur

Het zorgt voor de verdeling van chromosomen tijdens de celdeling (micro tubuli) Het kan cellen onderling aan elkaar vasthechten en zo weefsels verstevigen (epitheel)

Het cytoskelet is opgebouwd uit 3 verschillende onderdelen; deze zijn ook nog allemaal verschillend gelokaliseerd:

Het actine is geassocieerd aan de celjuncties en kan zo de vorm van de cel bepalen. Het komt dus met name voor in de cel-cortex.

De intermediaire filamenten (IF) vormen een netwerk door de gehele cel. Dit wordt vastgemaakt aan de lamines die onder het kernmembraan liggen, waardoor verankering aan de celjuncties plaatsvindt.

De microtubuli (MT) liggen nabij organellen (en zijn dus uitermate geschikt voor intern transport van bijvoorbeeld proteïnen.)

Hierboven is bovendien duidelijk gemaakt dat het cytoskelet bundels kan vormen → parallel gerangschikte filamenten, of netwerken → kris-kras verlopende filamenten, dit kan echter 2D en 3D voorkomen. 2D met name in de nucleaire- en het plasmamembraan en 3D in het cytosol.

De intermediaire filamenten.De IF kunnen een netwerk vormen tussen de kernenveloppe en het plasmamembraan (dit speelt waarschijnlijk ook een rol bij de over het algemene centrale ligging van de nucleus). Bovendien kunnen ze krachten goed verdelen en komen dus ook vaak voor bij het plasmamembraan; geïllustreerd met 2 voorbeelden:

1. Lamine A en -C-netwerk; vormt een nucleaire lamina die vastgehecht is aan de binnenzijde van het kernmembraan via ankers op lamine B.

2. De concentratie aan plasmamembraan in (hemi)desmosomen.

De structuur van IF is uitermate structureel en kan zo zeer stevige structuren opbouwen, zoals in haar en nagels. Bovendien is het uitermate stabiel, dit in tegenstelling tot MT en MF; de enige methode van extractie is via detergenten. Doordat de onderdelen α-helices kunnen vormen ontstaan er koordachtige filamenten.

4

De IF vormen een superfamilie; de classificatie vindt plaats volgens weefseldistributie en zeer specifieke; weefselspecifieke expressie → ze vormen zo een mogelijkheid in de diagnostiek van bepaalde tumoren: door te kijken naar de IF kan men achterhalen waar de kanker begonnen is en zo een behandeling starten. Bovendien zijn er nu meer dan 40 pathologieën gekend die veroorzaakt worden door een fout in de IF-coderende genen.

De opbouw van IF begint met de vorming van een dimeer → de bouwsteen van de IF die bestaat uit een centrale α-helix (coiled-coil) die aan beide uiteinden een globulaire C- resp. N-terminus bezit. Als die dimeren dan gevormd zijn, vindt er laterale antiparallele associatie plaats van 2 dimeren; dit vormt dan een tetrameer. Deze tetrameren kunnen dan aan de uiteinden associëren tot vorming van protofilamenten. 4 protofilamenten zullen dan lateraal associëren tot een protofibril. 4 van deze protofibrillen vormen dan via laterale associatie een intermediair filament met een diameter van zo’n 10 nm. Deze structuur is dus niet gepolariseerd; bovendien verklaart deze strikte opbouw meteen zijn mogelijkheid tot het weerstaan van grote krachten. De N- en C-terminus zijn overigens geen toeval; de N-terminus is sterk van belang bij de assemblage, terwijl de C-terminus van belang is voor de cellulaire organisatie.

Zoals al eerder is vermeld, zijn deze uitermate sterke structuren toch zeer dynamisch; dit is mogelijk doordat de subunits (tetrameren) kunnen ‘oplossen’ tot vorming van een cellulaire ‘pool’. Deze subunits kunnen constant associëren resp. dissociëren. Een zeer duidelijk voorbeeld hiervan is de vroege resp. late mitose; bij de vroege mitose vindt er afbraak plaats van de laminefilamenten door fosforylatie via Cdk2 en bij de late mitose zorgen andere fosfatasen voor de herassemblage van de IF.

De superfamilie van de IF is ingedeeld in 5 klassen:

Klasse I (zuur) en klasse II (basisch) associëren samen; het zijn keratines. Ze kunnen dus heteropolymeren vormen door associatie van I en II tot vorming van een heterodimeer.Hier bestaan ook weer varianten in; namelijk zachte en harde keratines. De harde keratines verkrijgen hun harde structuur door oxidatie van de vele cysteïnes tot vorming van zwavelbruggen. Het spreekt voor zich dat dit vaak voorkomt in nagels en haren. De zachte keratines zijn met name breed gedistribueerd in de epithelen. Ze kunnen associëren met desmosoomjuncties voor de celstevigheid Men denkt dat ze belangrijk zijn bij de organisatie van de organellen in het cytoplasma en dat

ze een rol spelen in de signaaltransductie. Elke cel heeft bovendien een karakteristieke combinatie van klasse I en klasse II keratines. Dit alles wordt gecodeerd door zo’n 50 genen.

Klasse III; kan homo- of heteropolymeren vormen: Vimentine → vormt met name de bouwsteen in mesenchymale cellen (vb. fibroblasten;

endotheel; witte bloedcellen; bepaalde epitheelcellen); het heeft een functie in: Membraansteun Kernorganisatie en organelorganisatie Ligt samen met de MT

Desmine → een bouwsteen in spiercellen; hierdoor worden de volgende eigenschappen van spierweefsel mogelijk: Starheid (contractiegeleiding) door hechting van contraherende units aan een membraan,

bovendien kan de cel zo zijn vorm behouden gedurende contractie, waardoor contractie überhaupt mogelijk wordt.

Het speelt dus een rol in de organisatie van de celorganellen, omdat het ook aanhecht aan de nucleus en de mitochondria.

5

Dan zijn er nog de GFAP’s (Glia Fibrillary Acid Protein), die met name voorkomen in de gliacellen; het zorgt in bijv. astrocyten voor het behoud van de mechanische kracht en vorm. Bovendien speelt het een rol in het functioneren van de bloed-hersenbarrière.

Klasse IV; de neurofilamenten: Het kan heterodimeren vormen, met NF-L (light); NF-M (medium) en NF-H (heavy) Het speelt een rol in de groei en het behoud van de diameter in een axon.

Klasse V; de lamines Het is de progenitor van alle IF Het biedt steun aan het binnenste kernmembraan Het wordt gecodeerd door 3 genen (1 A en 2 B’s); hiervan komen de B-lamines voor in alle

cellen Het speelt in een rol in de organisatie van chromatine en de afstand tussen de kernporiën. Bij de mitose kan het gehyperfosforyleerd worden waardoor het wordt afgebroken, om dan in

de telofase opnieuw te worden geassembleerd via herfosforylatie.

Dan zijn er nog proteïnen die associëren met de IF’s om zo bepaalde functies te kunnen vervullen; de IFAP’s (Intermediate Filament Associated Proteins). Deze kunnen zowel onderling als met een (cel)membraan crosslinken zodat er een bundel resp. netwerk gevormd wordt door tussenkomst in:

De organisatie van het IF-skelet Integratie van de IF met het MF- en MT-skelet Vasthechting van de IF aan het membraan

Een voorbeeld van een IFAP is plakine (plectrine); dit proteïne kan een IF (vimentine) crosslinken/verbinden met MT en MF. Dit vimentine wordt aan actine gehecht, door het N-terminaal calponine-homologie domein van de plakines. Verder komt deze IFAP in axonen voor om de neurofilamenten te kunnen verbinden aan MT via een armpje van NF-H.

De steun aan membranen wordt geleverd door het netwerk van verschillende IF:

De nucleaire lamina; lamine A en C vormen een netwerk; dit is verbonden aan lamine B, dat kan binden aan een lamine-B-receptor (IFAP) die in het kernmembraan zit verankerd.

Vimentine kan binden aan ankyrine (dit proteïne kan actine binden) en aan plectrine (zit vast aan een integrine) die verankerd liggen in het celmembraan.

Desmine zit via IFAP’s verankerd aan het celmembraan en rond een sarcomeer. Keratine zit verankerd in de hemidesmosomen van het celmembraan.

Gezien de cruciale rol van de IF wat betreft steun en celfunctie, is het op zich logisch dat hier tevens een aantal ernstige pathologieën aan zijn verbonden; een aantal hiervan staan hieronder genoteerd:

Musculaire dystrofie → door mutaties in lamine A ontstaan te zwakke spieren. (Te fragiele kernen?)

Progeria → door mutatie in lamine A wordt het verouderings proces sterk versneld. De dood treedt meestal in rond het 20e levensjaar.

Epidermolysis bullosa simplex → door een mutatie in het K14 keratine gen (hangt vast in celmembraan en zorgt voor vasthechting van cellen) ontstaan er heterodimeren met K4 maar geen protofilamenten. Epidermolyse met blaarvorming; het vormt een groep van zeldzame

6

huidziekten die erfelijk zijn. Er treedt blaarvorming op, evenals het loslaten van de epiderma als reactie op druk of letsel.

7

2. Technieken om wellen en weefsle te bestuderen + immunohistochemische technieken + afzonderen van cellen,

organellen en eiwitten

InleidingCellen en weefsels moeten bestudeerd worden; dit gebeurt in de geneeskunde, in de biomedische wetenschappen (het onderzoek), in farmaceutisch onderzoek etc.

De afkomst van deze weefsels en cellen kan komen via:

Operatieve wegname van een orgaan resp. weefsel Biopsie; endoscopisch (met een tangetje slijm wegnemen), naaldbiopsie of chirurgisch Afzonderlijke cellen; aspiratie (zuigend cellen wegnemen), punctie, bloedafname, speeksel, urine of

schraapsel Levende of dode cellen; let wel: bij dode cellen is fixatie essentieel!

VisualisatieHet visualiseren van cellen en organellen kan op verschillende manieren:

De meest bekende is de lichtmicroscoop: De lichtmicroscoop heeft een resolutie van zo’n 200 nm De vergroting wordt bepaald door het objectief te vermenigvuldigen met het oculair. Hij is bruikbaar voor fasecontrast- en differentiële interferentie-contrastmicroscopie →

visualisatie van beweging: Weinig detail zichtbaar Bruikbaar voor afzonderlijke cellen of dunne cellagen Voor levende cellen

Fluorescentie-microscopie; de weefselcoupe geeft een fluorescerend signaal af, bijvoorbeeld afkomstig van GFP (Green Fluorescent Protein): Lokalisatie en kwantificatie van fluorescerende moleculen in levende cellen, alvorens het GFP-

gen geïntroduceerd is in cellen in cultuur, Het visualiseren van bepaalde proteïnen gebeurt dan door fusie van het GFP-gen aan een ander

gen; er ontstaat een chimeer eiwit (verbonden lokalisatie van een proteïne) Een andere manier van kleuring is via het tetracysteine tagging en ReAsH; bindt aan C-C-X-X-C-

C en levert een rode kleur op. Via fluorochromen (eiwitten die fluo licht uitzenden)kun je ionenconcentraties bepalen;

verschillende soorten: Fura-2 bindt aan Ca2+-ionen en levert fluorescentie op Snarf-1 visualiseert de protonenconcentratie.

Elektronenmicroscopie (zie verder) Convocale scanning microscopie (lezen in MCB blz. 189 - 190)

Histologische techniekenVerschillende stappen moeten doorlopen worden alvorens een coupe onder de microscoop gelegd kan worden; hierbij is de volgorde van cruciaal belang.

De lichtmicroscoop Fixatie → techniek waarbij alle levensprocessen worden stilgelegd en de oorspronkelijke structuur

zo goed mogelijk blijft behouden. Zo wordt autolyse voorkomen → ontledingsproces van cellen

8

doordat bepaalde toxische stoffen ophopen door zuurstofgebrek. Het is van cruciaal belang dat dit onmiddellijk gebeurt na wegname van het weefsel. De stoffen die hiervoor gebruikt worden zijn fixativa → stoffen die covalente verbindingen vormen met de N-groepen van proteïnen (cross-linking.) Het nadeel hier van is dat het heel lang duurt, zo’n mm³ per uur. Fixativa zorgen dus voor het stilleggen van de levensprocessen Het zorgt voor de immobilisatie van de cellen in het weefsel Cellen worden permeabel voor kleurstoffen Enkele voorbeelden: formaldehyde; glutaraldehyde N.B. Crosslinking kan ook tussen andere groepen o.i.v. andere stoffen

Dehydratatie met alcohol (→ water uit weefsel halen), zodat daarna inbedden in paraffine (waterafstotend) mogelijk wordt: Startend met 80°; 90° en 100° alcohol (specifieke alcoholgraden) Daarna hetzelfde proces herhalen in tolueen

Inbedden in paraffine of plastic tot vorming van een hard blok Snijden in coupes van 5 micron met een microtoom; hierdoor kan het licht erdoorheen vallen. Deze

coupes komen nu op draagglaasjes te liggen Rehydratatie; gebeurt in de omgekeerde volgorde: tolueen → alcohol → water Kleuring; rehydratatie gebeurt omdat de kleurmiddelen wateroplosbaar zijn.

Kleuring berust op selectieve kleuring van celcompartimenten: Haematoxyline (basisch) → bindt aan zure componenten (DNA, RNA en zure eiwitten) en geeft

een blauwe kleur Eosine (zuur) → bindt aan basische componenten en kleurt rood.Aantonen van specifieke moleculen in preparaten mbv histochemie, enzyme-histochemie, immunohistochemie, immunofluorescentie; zie verder.

Dehydratatie; opnieuw in alcohol gevolgd door tolueen; luchtbellen worden zo voorkomen Monteren met een dekglaasje

Het nadeel van fixativa is dat het fixatieproces zijn tijd neemt; zo’n mm3 per uur. Bovendien wordt het RNA in stukken verkapt. Een alternatief is invriezen tot vorming van vriescoupes:

Het vriesproces gebeurt in vloeibare stikstof (bij -180°C) en gekoelde isopentaan (-160°C) Dit heeft zowel voor- als nadelen:

Voordelen: De snelheid wordt gigantisch verhoogd (zo’n 10 sec) Je hoeft daarna niet in te bedden Proteïnen blijven bewaard in de oorspronkelijke, natieve toestand.

Nadelen: Er is een sterke kwaliteitsdaling van de coupe.

De elektronenmicroscoopAlgemeen is dit proces veel gevoeliger en heeft meer vereisten dan de lichtmicroscoop:

Er moeten zeer dunne coupes gesneden worden (zo’n 50 nm) Zeer sterke fixatie door glutaraldehyde Beeld berust op verschillende mate van absorptie waardoor elektronen op verschillende wijzen

worden verstrooid. Het ‘kleuren’ gebeurt d.m.v. OsO4; kleurt de vetbindingen zwart (om accenten te leggen) Zwarte regio’s duiden op elektronenverstrooiing

9

Immuno-elektronmicroscopie wordt hiermee gevisualiseerd; hierbij zijn antistoffen met Au gelabeld.

Aantonen specifieke moleculenZoals beschreven is bij de lichtmicroscopie kan dit via 4 methoden:

Histochemie.Histochemie → techniek waarbij bepaalde componenten worden gevisualiseerd door bepaalde stoffen; zeer globaal! Verschillende stoffen :

PAS-kleuring (Periodic Acid Schiff); kleurt suikers en suikergroepen (vb. glycolipiden) rood PAS na α-amylase of na diastase; hierdoor zijn de vrije suikers verteerd en kleuren dus enkel de

suikergroepen rood (geglycosyleerde proteïnen) Toluidine-blauw; Giemsa → kleurstof is blauw, maar kleurt de eosinofiele korrels van granulocyten

rood (metachromatisch) Alcian Blue → kleurt zure mucopolysachariden blauw Zilverkleuringen → kleurt de reticuline-vezels uit de ECM Van Gieson-kleuring → kleuring van meerdere componenten:

Collageen wordt rood gekleurd Elastine wordt zwart gemaakt Spiercellen kleuren geel

Enzymhistochemie.Enzymhistochemie → een techniek die gebruikt wordt om enzymen te lokaliseren in coupes door gebruik te maken van hun enzymatische activiteit.

Incubatie van een coupe in het substraat met zijn co-factoren. Het substraat moet zodanig gekozen zijn dat er een onoplosbaar precipaat ontstaat op de plaats

van enzymatische activiteit Vriescoupes zijn meestal nodig, omdat fixativa proteïnen ‘fixeren’:

Voor zenuwcellen wordt acetylcholinesterase gebruikt Voor lysosomen zure fosfatasen Voor peroxisomen peroxidasen.

Immunologische detectiemethoden.Immunologische detectie → verschillende technieken die gebruikt worden om een antigen (een eiwit) aan te tonen in een coupe via een immunologische reactie. Dit gebeurt via een antigen-antistofreactie, waarvoor specifieke antistoffen vereist zijn, gericht tegen het antigen dat gedetecteerd moet worden. Vervolgens moet het ook nog gedetecteerd worden in de coupe wat gebeurt via fluorescentie (enkel vriescoupes zijn bruikbaar) of immunohistochemie (vries- of paraffinecoupes)

ImmunofluorescentieHet aantonen van een molecuul gebeurt d.m.v. een fluorochroom. Dit bindt covalent aan een antistof tegen het gezochte molecuul (het antigen). Dit fluorochroom is wel zichtbaar omdat het licht uitzendt van een andere golflente na absorptie van licht dat lagere golflengten heeft.Enkele voorbeelden van fluorochromen zijn Rhodamine, Texas Rood en FITC, een combinatie voor co-lokalisatie is mogelijk.Hier zijn toch ook wel enkele nadelen aan verbonden:

1. Vriescoupes zijn essentieel (kwaliteitsdaling)2. De immunofluorescentie zal geleidelijk aan verdwijnen; de preparaten zijn niet permanent

10

3. De achtergrond is donker, dus de architectuur van het weefsel is niet zichtbaar4. Fluorescentiesignalen uit verschillende delen van de cel kunnen elkaar overlappen

Immunohistochemie.Immunohistochemie → het aantonen van een antigen m.b.v. de antigen-antistof reactie. De antistof is hierbij afkomstig van een proefdier en al dan niet gelabeld, het antigeen is vaak een eiwit. Antistoffen (antilichamen) zijn immunoglobulinen die zowel monoclonaal als polyclonaal kunnen zijn:Monoklonale antistoffen → antistoffen afkomstig van één kloon van lymfocyten en gericht tegen één epitoop. Meestal gefuseerd met myelomacellen/kankercellen zodat ze onsterfelijk worden.Polyklonale antistoffen → een mengsel van antistoffen, die gemaakt zijn door verschillende klonen van lymfocyten en gericht zijn tegen verschillende epitopen.Epitoop → elke plaats op een antigen die een reactie van het immuunsysteem uitlokt.

Nadat de reactie dan heeft plaatsgevonden, moet het nog gevisualiseerd worden d.m.v. labeling, hiervoor kunnen ook weer verschillende methoden gebruikt worden:

1. Fluorescerende moleculen, maar hiervoor is een fluorescentiemicroscoop nodig, en bovendien heb je geen zicht op de celarchitectuur

2. Enzymen (vb. peroxidase) gevolgd door enzymhistochemie en vorming van een onoplosbaar gekleurd substraat. Hiervoor volstaat de lichtmicroscoop en heb je ook zicht op de weefselarchitectuur

3. Goudbolletjes, meestal voor immuno-EM. Deze goudbolletjes worden dan gehecht aan de antistof, en daarna wordt het behandeld met zilver, wat zal neerslaan op het goud.

Het resultaat is dan nog afhankelijk van:

Specificiteit van de antistoffen (mono- > polyklonaal) Affiniteit van de antistoffen Signaal/ruis-verhouding (het is onzeker of de antistof alleen heeft gebonden aan het antigen) Mate van denaturatie van het antigen t.g.v. de voorafgaande fixatie, daarom:

Kun je gebruik maken van vriescoupes Probleem met epitope-retrieval; door hitte zullen enzymen denaturen en mogelijk terug

natureren in een andere conformatie, waardoor de antistof niet meer bindt. Een oplossing zit in het doorbreken van de crosslinks m.b.v. proteolytische enzymen.

Technieken.Er bestaan verschillende stap-technieken:

1. Directe techniek (1 stap):a. Elke antistof heeft 2 bindingsplaatsen, maar omdat het maar één-staps is, moet elk antistof

gelabeld worden wat zijn invloed uitoefent op de prijs. 2. Indirecte techniek (2 staps):

a. Er wordt gebruik gemaakt van een antistof voor de antistof. Het tweede antistof draagt hier het label.

b. Het tweede antistof kan worden hergebruikt omdat deze bindt met alle antistoffe3. Indirecte 3-staps techniek:

a. Nu draagt zowel de secundair als de tertiaire antistof een label.b. Je moet het zien in een 3D-toestand, waardoor er tenminste 10 labels ontstaan per

bindingsplaats, wat een veel grotere verhouding label/bindingsplaats heeft en het dus beter visualiseert.

11

4. 3-staps ongelabelde peroxidase-antiperoxidase techniek (PAP):a. Er wordt gebruik gemaakt van een primaire antistof om het eiwit te detecteren,b. Vervolgens wordt een secundair antistof toegevoegd die de uiteinden van antistof 1 en van het

antiperoxidase complex herkentc. Dan ontstaat door het toevoegen van peroxidase (wat straks tevens reageert met de kleurstof)

en het antiperoxidase (antistof tegen peroxidase) een peroxidase-antiperoxidase-complex.N.B. de antistoffen moeten niet gelabeld zijn!

5. Avidine-Biotine complex techniek (ABC):a. Opnieuw bindt de primaire antistof aan het antigenb. Een secundaire antistof gelabeld met biotine bindt aan de primaire antistofc. Vervolgens wordt een complex van avidine en peroxidase-gelabeld biotine toegevoegd; avidine

heeft een extreem hoge affiniteit voor biotine, zodat deze binding snel plaatsvindt.d. Bovendien heeft avidine 4 bindingsplaatsen voor biotine, en de meeste proteïnen kunnen

verbonden worden met verschillende biotine-moleculen waardoor gemakkelijk grote, dus detecteerbare, ABC-complexen gevormd kunnen worden.

6. Envision-techniek:a. De primaire antistof bindt wederom aan het antigenb. De secundaire antistof bindt aan de primaire antistof, maar deze is gelabeld met een

dextraanketen waaraan peroxidasen aan vast zijn gehecht.

Nu echter alles gelabeld is, is het nog niet per definitie zichtbaar:

Visualisatie m.b.v. enzym-histochemische reacties Peroxidase met 3,3’ diaminobenzidine en waterstofperoxide → bruine neerslag Peroxidase wederom → 3-amino-9-ethylcarbazole en waterstofperoxide → rode neerslag Alkalisch fosfatase → fast blue B → blauwe neerslag

Toch bestaan al deze technieken niet zonder problemen:

Het weefsel bevat per definitie endogene peroxidasen, dit wordt geinhibeerd door H2O2 (en kunnen dus geen reactie meer aangaan)

Endogene biotine (lever), zit dus ook al in het weefsel, daarom wordt de coupe eerst bedekt met avidine (proteïne), zodat het gelabelde biotine hier niet meer aan kan binden.

Endogene alkalische fosfatase.

OrganelzuiveringenOok hiervoor zijn verschillende methoden ontwikkeld:

De celsuspensie in een isotone oplossing:Sonicatie (ultra-hoge tonen) of centrifugatie; beide methoden zorgen voor membraanruptuur waardoor de celorganelle vrijkomen.

Tissue homogenizer → onder zeer hoge druk door zeer kleine openingen duwen Ruptuur verwekken door de cellen in een hypotone oplossing te doen bij 0°C, dit veroorzaakt

osmotische zwelling.Na de membraanruptuur kunnen de organellen van elkaar worden gescheiden door differentiële centrifugering of door densiteitscentrifuge m.b.v. een sucrosegradiënt.

Bovendien vormt een weefsel een mengsel van verschillende cellen, daarom zijn er verschillende methoden ontwikkeld van celopzuivering:

12

1. Centrifugatie; werkt via densiteitsverschillen2. Flowcytometrie; door verschil in uitgezonden licht3. Op basis van binding van cellen aan fluorescerende antistof m.b.v. fluorescence activated cell

sorter (FACS). Een voorbeeld hiervan zijn de T/B-lymfocyten. Je moet dus zelf het fluorescent toevoegen, waardoor je nauwkeuriger kunt werken.

4. Op basis van antistoffen, die gebonden zijn aan magnetic beads; er ontstaat een magneet.

Als controle op een effectieve zuivering kun je gebruik maken van verschillende factoren:

7. Onderzoek m.b.v. de elektronenmicroscoop8. Via kwantificering van organel-specifieke merkers, dus controle op de aanwezigheid van bepaalde

stoffen die specifiek zijn voor bepaalde organellen:a. Mitochondria → Cytochroom Cb. Peroxisoom → Catalasec. Lysosoom → zure fosfatased. RER → ribosomen (proteïnen)

9. Via organel-specifieke monoklonale antistoffen.

Het spreekt voor zich dat het niet mogelijk is om membraanproteïnen hiermee te bestuderen, hiervoor heb je andere technieken nodig; via detergenten:

Detergenten vormen aan kritische concentratie micellen (CMC) De ionische detergenten → geladen, binden aan hydrofobe gebieden en verbreken daar de

ionische- en waterstofbruginteracties wat leidt tot denaturatie (nadeel, nooit het oorspronklijk eiwit uit het membraan). Een voorbeeld hiervan is Na-deoxycholaat of Na-dodecylsulfaat.

De niet-ionische detergenten → niet geladen, een voorbeeld is triton X: In concentratie lager dan de CMC lossen ze de biomembranen op en vormen gemengde

micellen In hogere concentraties dan CMC binden ze aan de hydrofobe regio’s en maken eiwitten

wateroplosbaar, waardoor ze niet kunnen aggregeren en dus precipiteren. Voor de verschillende vormen van micellen die gevormd worden: zie blz. 19-II nr. 2

13

3. Epithelen en juncties tussen cellen

Om te beginnen een aantal begrippen: Progenitorcel → cel die nog kan differentiëren tot cellen met een specifieke structuur, inhoud en

functie (al naargelang weefseltype waarin het terecht komt) Gelijkaardige cel → vormen weefsels met een gemeenschappelijke functie

Enkelvoudig vs. samengestelde weefsels. Vb: bindweefsel = steuncellen + de extracellulaire matrix (ECM)

Weefselgroep → orgaan of een systeem; de vorm zegt vaak iets over de functie; heterogene weefsels: verschillende soorten weefsels vb bloedvaten, zenuwen

Om de verschillende weefsels hun functie te kunnen uitvoeren, zijn op z’n minst onderlinge interacties nodig. Om dit te realiseren zijn er moleculaire interacties tussen cellen, die tevens weefsels assembleren. Dit wordt echter op verschillende niveaus gerealiseerd:

Cel-cel-adhesie; mogelijk via CAM’s (celadhesiemoleculen) in het celmembraanCAM’s → proteïnen die verspreid voorkomen in het membraan, geconcentreerd in juncties; ze maken interacties tussen dezelfde celtypes mogelijk (homotypische adhesie) of tussen verschillende typen (heterotypisch). Bovendien kan er nog interactie plaatsvinden tussen identieke CAM’s of verschillende; (homofiele adhesie resp. heterofiele adhesie)

Cel-matrix-adhesie; mogelijk via membranaire adhesie; receptoren en liganden in de ECM

Juncties.Juncties bevatten CAM-clusters, wat het weefsel zijn stevigheid geeft. CAM’s bevatten extracellulaire domeinen, zodat ze een rol kunnen spelen in de bidirectionele overdracht van informatie van buiten naar binnen en van binnen naar buiten en controle op de transcellulaire passage van moleculen kunnen uitoefenen, evenals de beweging van moleculen tussen naburige cellen. De CAM’s bestaan uit 4 families:

10. E-cadherines; deze familie vormt dimeren; homofiele interacties11. Immunoglobuline-superfamilie; kan zowel homo- als heterofiele interacties ondergaan (enkele

voorbeelden: ICAM; NCAM (neurale); MelCAM (melanine))12. Integrines; vormen heterodimeren (uit α- en β-) en vormen zo een receptor voor heterofiele

matrixproteïnen, zoals laminine en FN ( belangrijke binding van cel aan ECM)13. Selectines; tevens dimerisch, (een lectine-familie) en bevatten dus ook lectine-domeinen. Ze

kunnen heterofiele interacties ondergaan. Het lectine-domein bindt daarbij aan suikers van bijvoorbeeld glycoproteïnen.

CAM’s zijn Cel-Adhesie-Moleculen; zij zijn ingebed in het plasmamembraan en aan de cytosolische zijde verbonden aan het cytoskelet of aan signaal-transductieproteïnen via adapterproteïnen. De functie van de CAM’s wordt bepaald door de omgeving waarin ze zitten (outside-in effect).Aan de buitenkant interageren ze met moleculen die afhankelijk zijn van de vorm en functie van de cel. Hier geldt het inside-out-effect → de cel beïnvloedt de omgeving. Er zijn twee typen van interactie die de moleculen kunnen ondergaan:

1. Cis; laterale interactie. Dit vormt homodimeren en uiteindelijk oligodimeren die samen kunnen clusteren. De onderdelen van de moleculen die kunnen deelnemen in deze interacties variëren al naargelang de verschillende CAM’s.

2. Trans; intercellulair tussen distale domeinen van CAM’s van naburige cellen genereren een soort ritsstructuur tussen de cellen. Beide interacties staan dus dwars op elkaar.

14

De adhesie van de CAM’s wordt bepaald door verschillende factoren die milieuafhankelijk zijn:

Bindingsaffiniteit; afhankelijk van de thermodynamische eigenschappen van de moleculen Associatie- en dissociatieconstanten; (kinetische eigenschappen Distributie en dichtheid van de CAM’s Actieve of inactieve vorm (biochemisch) (actief: wel binden; inactief: niet binden aan buitenkant) Uitwendige krachten; de flow (dit is uitsluitend mechanisch)

De structuren die de CAM’s zullen vormen zijn de juncties. Deze juncties komen voor in verschillende weefselsoorten, zoals epithelen, bindweefsels, zenuwweefsels, bloed- en bloedvormende weefsels.

Epithelen.Een epitheelweefsel dient voor de bekleding van zowel de binnenkant van een orgaan als de buitenkant, en is opgebouwd uit gepolariseerde cellen (hebben dus per definitie een apicale en een basolaterale zijde).Aan de basale zijde ligt een basale lamina, die de epitheelcellen scheidt van de extracellulaire matrix. Hierop zijn de epitheelcellen verankerd via juncties.Het spreekt voor zich dat er verschillende soorten epitheelweefsels zijn, de morfologie daarvan is afhankelijk van de lokalisatie en de functie van het epitheel. De verschillende soorten en opbouw :

Meerlagig epitheel → barrièrefunctie: De huid; heeft een plaveiselig, meerlagig epitheel dat bekleed is met keratine (overschot van

dode cellen) en zo de ondoorlaatbare en stevige eigenschappen van de huid kan realiseren De urineblaas; meerlagig overgangsepitheel

Pseudogestratifieerd epitheel; het lijkt meerlagig door de verschillende kernhoogten, maar alle cellen zijn ingeplant op de basale lamina. Vb luchtwegen en cilia

Enkelvoudig prismatisch epiheel → transportfunctie van ionen en kleine moleculen; bevatten meestal cellen die een mucusproducerende functie hebben: In de maag; een speciaal slijmnapepitheel Slijmbekercellen in de darm die continu zijn met mucussecreterende klieren; de acini Microvilli; apicale structuren waarvan de structuur mogelijk gemaakt wordt door de centrale

actinebundels. Enkelvoudig kuboïdaal epitheel → bekleding van lichaamsholten;

Mesothelen → epitheel dat de bekleding vormt van de sereuze vliezen (buikvlies etc.) Enkelvoudig plaveiselig epitheel → bekleding van bloedvaten;

Endothelen

Om deze functies goed te kunnen uitvoeren, zijn de verschillende juncties essentieel. Er worden 2 vormen van adhesie onderscheiden:

14. Cel-cel-adhesie; gebeurt via CAM’s, aangehecht aan het cytoskelet via o.a. adapterproteïnen15. Cel-matrix-adhesie; met name via integrines, die aanhechten aan proteoglycanen, collagenen en

oplosbare matrixproteïnen (fibronectine) van de ECM. a. De samenstelling van de ECM verschilt per weefsels en orgaanb. Er vindt een continue remodelling plaats van de ECM en kan daardoor invloed uitoefenen op de

interacties tussen de cel en zijn omgevingc. De matrix vormt een reservoir van signaalmoleculen, evenals een netwerk waar cellen

doorheen kunnen migreren.

15

Er bestaan 3 junctietypen:

16. Tightjunctions; deze juncties zijn een voorbeeld van cel-cel-adhesie en cellen kunnen zo de controle houden over de intercellulaire flow in epithelen. Zijn eigenschappen:a. Ze liggen net onder het apicale oppervlak van de gepolariseerde cel;b. Hierdoor blijft de polariteit van de cel behouden; er vindt geen diffusie plaats van

membraanproteïnen en glycolipiden tussen apicaal en basolateraalc. Het vormt een barrière tegen intercellulair transportd. Het ontwikkelt een gordel van transmembranaire eiwitten die in contact liggen met dezelfde

bundel van de buurcel door een dubbele rij te vormen van 3-4 nm proteïnen → occludine en claudine. Beiden hebben 4 transmembranaire domeinen.

e. Verder leveren Junctional Adhesion Molecules (JAM) nog een belangrijke bijdrage aan de homofiele adhesie → ondoorgankelijk voor wateroplosbare moleculen. Zij zorgen overigens ook nog voor andere eigenschappen van de tight-junction. De JAM’s behoren overigens tot de Ig-superfamilie van de CAM’s.

f. Om de tight-junction te kunnen vormen, is Ca2+ vereist (dit is overigens ook essentieel voor de cel-cel-adhesie gemedieerd door catherinen)

g. Ondanks het feit dat bovenstaande uiteenzetting het idee geeft dat tight-junctions absoluut ondoorgankelijk zijn voor elk molecuul resp. ion, is dit niet het geval. Er bestaat namelijk een paracellulaire en transcellulaire pathway (een ‘lek’ door en tussen de cellen), die afhankelijk is van verschillende factoren:

I. Er bestaan verschillende isoformen van claudineII. De tight-junctions staan onder invloed van G-proteïnen en cAMP-concentraties in de cel

wat betreft doorgankelijkheid.Mutaties in bepaalde claudines kunnen leiden tot:

Een abnormaal eiwit met verschillende gevolgen: Geen normale paracellulaire flow van Mg2+ in de nier, wat leidt tot

convulsies (stuiptrekkingen) Gewijzigd transport in het binnenoor → aangeboren doofheid

Vibria cholerae → door toxines ontstaat er een wijziging in de samenstelling of de activiteit van de tight-junction, hierdoor ontstaat diarrhee en daaraan gekoppeld dehydratatie.

17. Verankerende; adhererende juncties; eveneens cel-adhesie en vormen 3 typen in de epitheelcellen. Ze leggen de connectie tussen de laterale membranen van de epitheelcellen en liggen precies onder de tightjunctions. Ze zijn binnen de cel verbonden via adapterproteïnen aan een gordel van actine- en myosine-filamenten, waardoor een soort trekkabel ontstaat die de vorm van de cel kan behouden.a. Adhererende junctie; de CAM’s behorende tot deze juncties zijn met name de cadherines1:

I. De klassieke Cadherines (E-; P-; en N-); elk cadherine heeft een karakteristieke weefseldistributie, hiermee kun je dus het weefseltype achterhalen:

i. E-Cadherine in epithelen, ook buiten de adhererende junctieII. Desmosomale Cadherines

III. Proto-cadherinesi. Ze spelen een belangrijke rol in de morfogenese en kanker-invasie via

op/neerregulatie. Verder zijn ze belangrijk bij de embryonale ontwikkeling.

1 De Cadherines kunnen een grote familie vormen van 100 leden, onderverdeeld in 6 subfamilies doordat ze gecodeerd worden door multipele genen en een alternatieve RNA-splicing ondergaan.

16

ii. Cadherines ondergaan homofiele interacties; afhankelijk van de Ca2+-bindende plaatsen tussen de cadherine-domeinen; er ontstaan rigide oligomeren die trans-interacties kunnen ondergaan die vervolgens laterale interacties ondergaan waardoor een rits-structuur ontstaat.

iii. De cis- en transinteracties ontstaan o.b.v. tenminste 3 van de 5 extracellulaire cadherine-domeinen

iv. E-Cadherines in de adhererende junctie:a) De C-terminus hecht aan actine via α- en β-catenine of via p120-catenine;

Borstkanker kan ontstaan door een mutatie waardoor E-Cadherine verloren gaat.

Mutaties in β-catenine in tumorcellen kan leiden tot een verstoorde cel-cel-adhesie, evenals het ontstaan van vrije β-catenine die kunnen migreren naar de kern. Wanneer dit in de kern terecht komt, kunnen ze de celcyclus stimuleren via de Wnt-pathway

b. Desmosomen; deze komen voornamelijk voor in epitheelcellen, evenals gladde spiercellen en zorgen voor de adhesie aan de buurcel waardoor mechanische krachten verdeeld kunnen worden. Intracellulair zijn ze verbonden aan de IF

I. De CAM’s van de desmosomen zijn desmogleine en desmocolline (desmosomale CAM’s). Hiervan interageert het cytosolisch domein via de adapterproteïnen plakoglobine (analoog aan β-catenine) en plakofilines aan de IF.

II. Het zijn de adapterproteïnen die de ‘plaques’ vormen op een elektronmicroscopische foto

Pemphigus Vulgaris → pathologie waarbij het lichaam antistoffen aanmaakt tegen desmogleine; het lichaam kan deze juncties niet gebruiken voor de aanhechting aan de basale lamina en er ontstaan blaren. Oplossing: steroïden geven

c. Hemi-desmosomen; dit type lijkt sterk op de desmosoom; alleen komt hij voor aan de basale pool van epithelen en zorgt daar voor de verankering aan de basale lamina. In het cytosol zijn ze verbonden met IF.

18. Gap-junctions; cytosolische doorgang tussen 2 cellen waardoor een snelle diffusie van kleine wateroplosbare moleculen mogelijk wordt. Deze juncties komen bovendien ook voor in niet-epitheliale weefsels. Ze vormen clusters in laterale celmembranen in hexagonale structurena. Deze vrije doorgang van partikels kleiner dan 2000 D (1; 2 nm diameter) wordt mogelijk

gemaakt door de rijke eiwitstructuur. Let wel; er bestaat een grens op de 1200 D; daaronder is er absoluut vrije doorgang (dus voor ionen, precursoren van macromoleculen, intermediaire metabolieten en kleine signaalmoleculen), daarboven is de passage variabel en gelimiteerd.

b. Een gap-junction bestaat uit 12 transmembranaire connexines, waarbij 6 connexines de cilinder vormen van één membraan; een connexon hemichannel. Het andere membraan vormt ook 6 connexines die tegen elkaar aan komen te liggen

c. Elk connexine bestaat uit 6 transmembranaire domeinen. d. Er bestaat meer dan 20 soorten connexinen, die onderling verschillen per celsoort.e. Er bestaan homotypische gap junctiekanalen → cellen die slechts één type connexine tot

expressie brengen, maar meestal zijn het twee of meerdere connexinen → heterotypische gapjunctie kalanen, hierdoor wordt overigens ook verschillende doorgankelijkheid per connexon mogelijk gemaakt. Het is zeer belangrijk te realiseren dat de pH, Ca2+ en fosforylatie invloed hebben op de permeabiliteit van de gapjunctie

17

f. Functioneel:I. Door het bestaan van deze juncties in chemische synapsen is er een 1000x snellere

transmissie mogelijk van signalenII. Gecoördineerde contractie in de hartspier wordt mogelijk door ionuitwisseling tussen

spiercellenIII. In hormoongevoelige weefsels wordt de vorming van IInd

messengers geïnduceerd waarmee de buurcellen gestimuleerd

IV. Ze zijn belangrijk in de metabole koppeling tussen cellen (bouwsteenuitwisseling of intermediaire metabolietuitwisseling).

18

4. Samenstelling van extracellulaire matrix en hechting van (niet-) epitheliale cellen aan ECM + extravasatie van WBC bij ontsteking

InleidingDe cel-matrix-adhesie wordt mogelijk gemaakt via adhesie-receptoren in de intercel-matrix-ruimte en aan proteïnen in de ECM. Deze adhesiereceptoren behoren tot de integrinefamilie. Dan kun je al onderscheid maken tussen epitheelweefsel en niet-epitheelweefsel:

De epitheelcellen hechten via integrines aan de basale lamina, terwijl niet-epitheliale cellen aanhechten via andere CAM’s

De epitheelcellen hechten aan een multi-adhesief-proteïne in een 2D-ECM: de basale lamina, terwijl de proteïnen in niet-epitheliale weefsels aanhechten aan een 3D-ECM.

De basale laminaDe integrines die de verbinding leggen tussen de epitheelcel en de ECM liggen voornamelijk geclusterd in het hemidesmosoom, maar ook daarbuiten.De basale lamina bevat dan 3 soorten moleculen:

1. De proteoglycanen; een schokdemper omdat hij water aantrekt en moleculen kan binden2. Collagene vezels om de mechanische krachten te weerstaan3. Oplosbare adhesieve ECM-proteïnen, die receptoren binden en crosslinken op het cel-oppervlak.

Deze verschillende bouwstenen vormen zo twee lagen; de lamina lucida en de lamina densa.

Microscopische structuur van de basale lamina:

Het is een laag van zo’n 60 tot 120 micron dik, bestaande uit een plat 2D netwerk van ECM Het ligt onder elk epitheel of rond elke cel bij spier- of vetweefsel. De basale lamina speelt een cruciale rol bij weefselregeneratie en bij de embryonale ontwikkeling

(zo blijft een 4-8-cellig embryo rond door de basale lamina) Bij de ontwikkeling van het zenuwstelsel kunnen neuronen migreren langs ECM-pathways die

bestaan uit de basale lamina. Het maakt het bestaan van de bloed-hersenbarriere in de hersenen mogelijk, evenals het filter in

de nefronen van de nier. De componenten van de basale lamina worden aangemaakt door de bovenliggende cellen:

Type IV collageen die het 2D-netwerk vormt Laminine (eiwit); vormt het 2D-netwerk met collageen en legt de verbinding met integrines. Entactine/nidogen (eiwit); het zorgt voor de crosslinking/verbinding van collageen met

laminine Perlecan (proteoglycan); het bindt en crosslinked ECM-componenten en cel-oppervlak-

moleculen, waaronder collageen IV De connectie met bovenliggend weefsel wordt gemaakt door adhesie van de α6β4-integrines

(epitheelcelreceptor) aan de laminines (indirect aan collageen) van de basale lamina Aan de onderkant ligt het vast in bindweefsel via collageen-vezels, die ingebed liggen in de

proteoglycanrijke matrix (vb. huid: collageen type VII)

Basale membraan = de basale lamina + de collageen-bevattende lagen van epitheel- resp. bindweefsel.

Verdieping voornaamste structuren. Collageen type IV:

g. Trimeer proteïne; bestaande uit 3 α-ketens

19

h. Het proteïne kan een homo- of heterotrimeer vormen (dezelfde of verschillende helices)i. Één keten = repeterende set van de 3 aminozuren (glycine - proline - OH-proline)

Als glycine vervangen wordt door een ander AZ ontstaat er een mutatie en wordt het collageen onstabiel, glycine is ALTIJD aanwezig in collageen

j. Als dan de triple helix is gevormd, moet deze nog assembleren tot een netwerk, opnieuw geïllustreerd in de bijlagen:

I. De C-terminus vormt per definitie de kopII. 2 C-termini dimeriseren tot een dimeer

III. Vervolgens kunnen de N-termini tetrameriseren tot een tetrameerk. Draaiing: elke keten in linksom gedraaid in ene helix zodat de H atomen van glycine in het

centrum van de helix liggen en de 3 ketens zijn rechtsom gedraaid in een triple helix Laminine:

l. Dit proteïne is cruciaal voor de crosslinking van collageen aan de integrinesm. Het is een multi-adhesief eiwit, dat enkel aanwezig is in de basale lamina waar het zorgt voor

de organisatie van ECM-componenten, regeling van de cel-matrix-adhesie en verantwoordelijk is voor migratie en celvorm.

n. Het bestaat uit een α, een β en een γ-keten (en is dus heterotrimerisch) die assembleren in een kruisvorm

o. De (enkele) C-terminus is een α-keten die bestaat uit een globulair LG-domein voor Ca2+-afhankelijke binding aan de integrines in de hemidesmosomen en aan proteoglycanen

Crosslinkende proteïnen:p. Proteoglycanen → glycoproteïnen met covalent gebonden polysacharideketens (de zgn.

glycosaminoglycanen (GAG))q. Komen voor aan het celoppervlak of zijn gesecreteerd door de celr. GAG → lange, lineaire polymeer van disachariden, die samen met een glycoproteïne een

proteoglycan vormt (sterk wateraantrekkend). Ze zijn ingedeeld in 4 grote groepen; zie prof. Van Lint.

s. In de basale lamina zit perlecan die de meeste andere bestanddelen van de basale lamina kan crosslinken.

Mutaties in dit perlecan kunnen leiden tot dwerggroei en spierafwijkingen.De extracellulaire matrix van niet-epitheliale weefselsZoals hierboven al is aangegeven, hebben deze weefsels geen basale lamina, maar ondergaan wel cel-cel- en cel-matrix-interacties door gelijkaardige moleculen.Bindweefsel geeft een voorbeeld:

De hoeveelheid matrix is sterk overheersend over de celhoeveelheid De ECM wordt geproduceerd door vnl. fibroblasten en bestaat hier uit:

Fibrillaire collagenen (type I, II en III) Fibronectine; een multi-adhesief eiwit (equivalent van integrine) Proteoglycanen Hyaluronan → niet gesulfateerd GAG Eventueel nog elastine

CollageenEr bestaan dus verschillende typen collageen, ingedeeld in 5 verschillende groepen. De vorming van collageen is een zeer strikt proces:

20

19. Aan de pro-α-ketens afkomstig van het RER worden oligosachariden aangehecht tot vorming van een propeptide

20. Deze propeptiden associëren tot vorming van trimeren, die gestabiliseerd wordt door disulfidebruggen.

21. Vervolgens wordt proline (soms lysine) gehydrolyseerd, waarbij vitamine C van essentieel belang is. Dit geeft de verklaring waarom scheurbuik op kan treden bij vitamine-C gebrek

22. 3 trimeren draaien rechtsdraaiend in elkaar tot vorming van een triple-helix dat gestabiliseerd wordt door de binding aan Hsp47 (chaperone) → procollageen

23. Het procollageen wordt getransporteerd naar het Golgi-complex waar er laterale associatie plaatsvindt en er korte bundels gesynthetiseerd worden. Deze worden gesecreteerd en de N- en C-termini er nog afgehaald via extracellulaire enzymatische activiteit (peptidasen, vb. bone-morphogenetic protein-1)

24. De typerende dwarse streping van de fibrillen ontstaat door de schuivende zijdelingse associatie (50-200 nm).

25. De fibrillen crosslinken (Lys en hydroxy-Lys) vervolgens covalent (via vorming reactieve aldehyden), dit geeft korte, niet-gedraaide segmenten aan het eind die zorgen voor stabilisatie en stevigheid.

Collageen fibril

Variatie in de verschillende soorten collageen kan optreden in:

1. Het aantal en de lengte van de triple-helix segmenten2. Flankerende of onderbrekende (de niet-gedraaide) segmenten wat verschil oplevert in de 3D-

structuur (en daarmee verbonden de flexibiliteit)3. Variatie in de covalente interacties in α-ketens (hydroxylatie, glycolysering, oxidatie of crosslinking)4. Specifiek voor IV → 2D-netwerk via kop-kop, staart-staart en zijdelingse interacties

Bespreking van de verschillende soorten collageen. Type I collageen (meest frequent in het menselijk lichaam):

Vormt parallelle bundels ipv dikke vezels, waardoor het grote trekkrachten kan weerstaan (vb. pezen en botten)

Het kan type V incorporeren waardoor er dunnere vezels ontstaan Het kan dikkere vezels vormen door te binden aan type VI en aan proteoglycans

Osteogenesis imperfecta → mutaties in type I die de glycine muteert en dus zorgen voor een instabiele structuur van de collageen-helix. Patienten zullen dus bij het minst geringste trauma hun botten breken

Type II collageen: De bundel is dunner dan type I Lopen variabel door de proteoglycanmatrix Kris-kras gecrosslinked aan de visceuze matrix-proteoglycans door type IX; géén fibrillen In kraakbeen zorgt het voor de kracht en weerstand tegen vervorming doordat het

geassocieerd is met bepaalde proteoglycans.Mutaties in collageen-gerelateerde genen kunnen leiden tot verschillende

pathologieën: Ehlers-Danlos-syndroom; leidt tot een abnormaal type eiwit door

mutaties in: Collageen I of V → hypermobiliteit Collageen III → vaat-ruptuur Lysyl-hydroxylase

21

Pseudo-xanthoma elasticum → autosomaal erfelijke systeemziekte gekenmerkt door elastose (degeneratie van de elastische vezels; weefsel kan je uitrekken maar het gaat niet meer terug naar de oorspronkelijke vorm.)

Marfan syndroom → mutatie in fibrilline-1-gen die aanleiding geeft tot fout in een component van de microfibrillen, die in de ECM zorgen voor de elasticiteit. Dit gen is nodig op plaatsen van mechanische stress en onder de basale lamina; bv. in de aorta. Bij de (te) sterke uitzetting (verhoogde bloeddruk) kan dit leiden tot aneurysma (uitzetting, maar geen inkrimping: zakvorming) → dood. Opvallend zijn de lange vingers en ledematen.

Proteoglycanen in de ECMZoals al eerder is beschreven, is een proteoglycan een combinatie van een glycoproteine en een GAG (glycoaminoglycanen)(meestal 2 verschillende GAG’s). De GAG’s vormen 4 groepen:

26. Hyaluronzuur, dit is niet gesulfateerd en wordt gesecreteerd in de extracellulaire ruimte waar het kan binden aan een celoppervlak via CD44.a. Kan cellen scheiden omdat het een losse, gehydrateerde en poreuze substantie vormt.b. Het speelt een rol bij de celbeweging; meestal gecorreleerd aan een daling van hyaluronan

door een stijging van extracellulair hyaluronidase. Daardoor daalt CD44 ook en de celbeweging stopt, zodat cel-cel-adhesie geïnduceerd kan worden

c. Het kan een gel vormen wanneer het random-coils vormt. (Een flexibele, waterbindende structuur)

d. Doordat het water kan binden, zal het opzwellen en zo een rol spelen in drukresistentiee. Wanneer vele hyaluronans assembleren tot een lang molecuul waarop aggrecan-moleculen

niet-covalent binden vormt het een kraakbeenstructuur27. Chondroitinesulfaat en dermatansulfaat28. Heraparansulfaat en heparine (hypergesulfateerd)29. Keratansulfaat

De synthese start in het ER met het kernproteïne, vervolgens worden de O-linked of N-linked GAG-ketens erop aangehecht in het Golgi-complex. Deze GAG’s kunnen dan eventueel nog verlengd of gemodificeerd (sulfatering) worden. Deze proteoglycanen (verder onder PG) hebben een uitgebreide functionaliteit, zo komen ze o.a. voor in de ECM als wel aan het celoppervlak. De erop aangehechte GAG’s blijken essentieel te zijn voor de functie van het PG, omdat wanneer deze GAG-keten wordt gewijzigd, de functie mee veranderd; 2 belangrijke voorbeelden zijn:

1. Perlecan (basale lamina); is een groot core-proteïne waarop 3 of 4 GAG’s staan ingepland. 2. Syndecan; komt voor aan het celoppervlak en zorgt voor de celverankering via binding aan

collageen en fibronectine (komt dus voor in niet-epitheliale cellen)

Fibronectine vormt de equivalent van laminine uit de epitheelcel en wordt door veel celtypen gemaakt. Het komt zowel voor in de ECM als aan het celoppervlak. Het wordt gecodeerd door één gen, maar toch bestaan er meer dan 20 isovormen. Dit proteïne heeft een uitgebreide functionaliteit:

Het speelt een rol in de migratie en differentiatie in de embryonale ontwikkeling van cellen Het is belangrijk bij de bloedstolling en migratie van bloedstollende factoren (wondheling) Het slaat dus de brug tussen de integrines en collageen/heparansulfaat PG (hechting van cellen)

22

Een fibronectine is een homodimeer van 2 polypeptiden die C terminaal aan elkaar gebonden zijn via 2 disulfide bruggen. Elke keten bezit 6 functionele regio’s met verschillende ligand-bindende eigenschappen

De integrine-binding:In epitheelcellen zijn de integrines verbonden met de IF, en zorgen zo voor de verbinding aan de basale lamina (cel-ECM-adhesie) terwijl de integrines in niet-epitheliaal weefsel zijn verbonden met actine (stressvezels). In niet-epitheliaal weefsel zijn deze verbindingen variabel, dus kort- of langdurend, maar de verbinding wordt opnieuw gemaakt via de integrines (fibroblasten en witte bloedcellen) en de proteoglycanen op het celoppervlak die binden aan fibronectine. Intracellulair zijn ze verbonden met het actine-netwerk of via andere CAM’s (vb. N-CAM). Een praktisch voorbeeld wordt gevormd door de witte bloedcellen die binden aan het endotheel van de bloedvatwand voor de extravasatie.

De N-CAM’s (Neuraal cel adhesie molecule)(Ig-CAM) worden gecodeerd door 1 gen, maar er zijn wederom meerdere isovormen. Extracellulair bevat hij 5 Ig-repeats en 2 FN type III-repeats en is intracellulair verbonden met het cel-skelet. Het kan siaalzuren binden, die sterk negatief geladen zijn. Wanneer er veel moleculen worden gebonden, zal dit onderlinge afstoting teweegbrengen, wat cellen op een afstand houdt. Daarom bestaat ongeveer 25% van de N-CAM’s in een embryo uit siaalzuren, wat later reduceert tot 8%. Dit maakt o.a. de weg vrij voor bijvoorbeeld axonengroei.Integrines zijn heterodimeren opgebouwd uit α- en β en vaak celsoort-specifiek. Ze spelen een centrale rol in de celadhesie, -migratie en in ontstekingsreacties (migratie van de witte bloedcellen). Ze zijn afkomstig van 2 subgroepen:

De groep die bindt aan RGD-sequenties (FN) En een groep bindend aan laminine

Sommige α-subunits dragen een I-domein voor binding aan collagenen of CAM’s

De adhesie wordt bepaald door de bindingsactiviteit van de integrines; de integrines hebben dan ook 2 conformaties die ze kunnen aannemen:

1. Low-affinity → het αβ-dimeer is gebogen en de cytoplasmatische C-termini zijn samengebonden. Dit is de vorm die niet bindt, inactief is, wat bepaald wordt door de cel

2. High-affinity → de integrine is uitgestrekt en de ligand-bindende plaats is nu toegankelijk, omdat de C-termini uit elkaar staan, het is actief

Deze conformatie van de integrines bepaalt de outside-in-signalling:

Integrine bindt aan RGD-sequentie (ECM of CAM) → de C-termini wijken uit elkaar Adapterproteïnen reageren hierop en gaan signaalmoleculen aanmaken De signaalmoleculen worden naar de kern getransporteerd waar ze hun functie op de

gentranscriptie kunnen uitoefenen. De veranderende metabole status leidt tot binding of dissociatie van intracellulaire

signaalmoleculen aan/van de C-termini → scheiding/associatie van de C-termini → activatie of inactivatie van het integrine (vb. de bloedplaatjes)

De adhesie wordt vervolgens weer bepaald door het aantal integrines op het celoppervlak:

Alleen de rijpe RBC en WBC mogen het beenmerg verlaten en naar het bloed gaan, de voorlopers blijven in het merg

Deze voorlopercellen hechten aan de FN van de ECM en aan V-CAM op stromacellen via α4β1-integrine wat leidt tot hechting, deling en differentiatie.

23

Na de rijping/differentiatie treedt er een daling van het aantal integrines op WBC en RBC op, en die komen los van de matrix en stromacellen en komen terecht in de bloedcirculatie.

Leukocytmigratie uit de weefselsHet hele proces wordt geïnitieerd door een opeenvolging van bindingen en loslatingen tussen de WBC en het endotheel van het bloedvat. Dit vindt enkel plaats in gebieden van ontstekingen. Deze selectiviteit wordt mogelijk gemaakt door de aanwezigheid van P-selectine op endotheelcellen:

1. Selectief door het Ca2+-dependent lectine-domein dat bepaalde oligosachariden herkent2. Het verschijnt na activatie van endotheel o.i.v. oplosbare mediatoren → chemokines.

De leukocyt-interactie gebeurt via een 5-staps-reactie, geïllustreerd in de bijlagen.

Leukocyte adhesion deficiency:1. Type I → defect in de suikeraanmaak dat het ligand vormt voor selectine-

P → rolling is niet mogelijk2. Type II → defect in de synthese van β2-subunits, de rolling kan wel

geïnduceerd worden, maar stevige adhesie blijft uit en de WBC kan dus niet uittreden

Beide zullen tenminste leiden tot chronische ontstekingen.

24

5. Actine + actine (de)polymerisatie + actine bindende eiwitten

InleidingHet cytoskelet bestaat uit 3 bouwstenen; de microfilamenten, de intermediaire filamenten en de microtubuli

De microfilamentenDe microfilamenten worden gevormd door actinepolymerisatie en komen voor in:

Epitheelcellen: Ze vormen daar het centrum van microvilli Ze vormen een netwerk onder de plasmamembraan; de celcortex Ze vormen een adherens band → de band die in verbinding staat met de adhererende junctie

In migrerende cellen Netwerk in ‘leading edge’ via lamellipodium/filopodium

Tijdens celdeling voor de contractiele ring

ActineActine is een zeer belangrijk eiwit in de cel. Het vormt zo’n 1-5% van alle eiwitten in de cel en is uitermate veelzijdig. Het wordt gecodeerd door 6 genen, die verschillende isovormen hebben (4α voor contractiele structuren, 1β in de celcortex en de leading-edge (beweging) en 1γ in stress-fibers).De monomere vorm is G-actine (globulair), wat een filament van polymeren kan vormen → F-actine. Dit F-actine is een gedraaide streng van ‘knopen’ van 7-9 nm die zichtbaar zijn bij EM. Elke ‘knoop’ is 1 subunit.Het gevormde actine-cytoskelet is zeer flexibel en dynamisch, en heeft een aantal cruciale eigenschappen:

De filamenten kunnen verschillende lengten hebben (i.v.m. de dynamiek) Door crosslinking ontstaan bundels en netwerken Snelle assemblage en afbraak is mogelijk waardoor de cel mobiel wordt en celvormvariatie mogelijk

maakt. De polymerisatie tot F-actine gebeurt in 3 stappen, met bepaalde omgevingsfactoren:

G- en F-actine-Mg2+ vormt een complex met ATP of ADP (ATP-G-actine en ADP-F-actine) G-actine: 2 lobben + ATPase gleuf met activiteit waar ATP en Mg2+ gebonden kan worden

Wanneer er geen nucleotide (ATP) bindt → denaturatie/afbraak Wel nucleotide-binding → conformatieverandering, en als dan Mg2+ aanwezig is, zal G-

actine polymeriseren tot F-actine en ATP gehydrolyseerd worden.

Het gevormde F-actine is een filament → een gedraaid koord van 2 subunit-rijen, en een unit bestaat uit (2x14) 28 subunits, verdeeld over een afstand van 72 nm. Hierin wijzen alle subunits in dezelfde richting waardoor er polariteit ontstaat: de -kant is de kant waar de gleuf open ligt, en de +kant is de kant waar de gleuf contact maakt met de andere subunit.Een rij subunits is een gedraaide helix waarin iedere subunit (knoop) wordt omgeven door 4 andere subunits. Het filament is dus dynamisch; polymerisatie of depolymerisatie zal optreden:

25

Wanneer G-actine voorkomt in een ionenrijke oplossing (Na+, K+ of Mg2+) zal er polymerisatie optreden tot F-actine, hierbij zijn géén bijkomende proteïnen nodig.

Wanneer F-actine terecht komt in een ionenarme omgeving, zal het depolymeriseren, wat gepaard gaat met ATP-hydrolyse.

De polymerisatie tot F-actine is via verschillende methoden te bestuderen:

1. Viscometrie → wanneer F-actine langer wordt is de oplossing viskeuzer en is er minder flow.2. Sedimentatie (ultracentrifugatie) → F-actine zit in de pellet, G-actine in het supernatans3. Fluorescentie-spectroscopie → methode om de opbouw en afbraak zichtbaar te maken, omdat

fluorescerend F-actine een ander fluorescerend spectrum heeft dan G-actine4. Fluorescentie video-microscopie → hiermee wordt de groei van F-actine gevisualiseerd.

Polymerisatie van G-actine tot F-actine: Hierbij wordt geïllustreerd dat de polymerisatie veel sneller verloopt wanneer er reeds een nucleus is gevormd → een startpunt voor de polymerisatie, bestaande uit tenminste 3 al gepolymeriseerde G-actines.De daadwerkelijke polymerisatie verloopt dan als volgt:

1. Het proces wordt geïnitieerd doordat ATP-gebonden G-actine-monomeren onstabiele oligomeren vormen; de lag-phase. Deze worden stabiel als er een nucleus ontstaat en dan terecht komt in de nucleation phase.

2. Doordat er al een nucleus is gevormd, kan de elongatie veel sneller verlopen aan beide kanten via toevoeging van ATP-G-actine tot vorming van ATP-F-actine tot er een evenwicht ontstaat tussen G- en F-actine → de steady state.

3. De steady-state-phase is niet statisch, maar dynamisch; er is constante uitwisseling van G-actine, maar er vindt géén wijziging plaats van de lengte van de filamenten.

Het bestaan van de kritische concentratie van G-actine-monomeren (CC) vormt de grens tussen opbouw en afbraak:

Onder de CC vindt er geen assemblage plaats van filamenten, maar vanaf de CC wel. De steady-state wordt dus gekenmerkt door de exacte CC: 0,1 micromolair:

Minder dan 0,1 μM aanwezig in de cel leidt tot afbraak van F-actine Meer dan 0,1 μM leidt tot polymerisatie van G-actine. Op deze wijze blijft de intracellulaire

concentratie van G-actine-monomeren redelijk constant.

Specifieke eigenschappen van beide zijden van F-actine:

De +kant verlengt zo’n 5-10 keer sneller dan aan de -kant en is afhankelijk van ATP-gebonden G-actine. Dissociatie is bijna hetzelfde als aan de -kant en onafhankelijk van G-actine-monomeerconcentratie.

De -zijde verlengt dus 5-10 keer trager en is eveneens afhankelijk van ATP-gebonden G-actine. De dissociatie is bijna gelijk aan de +zijde, en onafhankelijk van de concentratie van de G-actine-monomeren t.g.v. verschil in CC-waarden aan de +- en -kant2.

De gevolgen die optreden wanneer de CC aan beide zijden verschilt; 3 fasen te onderscheiden:

1. Wanneer de concentratie van ATP-gebonden G-actine minder is dan 0,1 μM (< CC+) → géén filamentaangroei

2 De CC-waarde aan de +kant → 0,12 μM De CC-waarde aan de -kant → 0,60 μM

26

2. Wanneer de concentratie ligt tussen de 0,1 - 0,6 μM: tussen CC+ en CC- → aangroei aan alleen de +kant

3. Wanneer de concentratie hoger is dan 0,6 μM: > CC- → groei zal optreden aan beide zijden, alleen zal de +kant sneller groeien dan de -kant.

Wanneer de steady-state is bereikt (concentratie ligt in situatie 2) kan er groei aan de +kant optreden, maar afbraak aan de -kant → lengte blijft constant, maar er treedt treadmilling op → door afbraak aan één zijde en opbouw aan de andere kant zal er beweging ontstaan. Hierbij liggen de oudste ingebouwde monomeren aan de -kant; ATP-G-actine bouwt in, wordt gehydrolyseerd, maar omdat P i traag het filament verlaat → assymmetrie.

De controle op de actinepolymerisatie wordt als volgt gevormd:De CC ligt op 0,1 μM, maar de totale concentratie in de cel is 0,5 mM, met als gevolg dat de G-actine-concentratie boven de CC ligt. Toch is maar 60% gepolymeriseerd:

Via stimulerende proteïnen die binden aan G-actine en de treadmilling bevorderen: Een Nucleotide Exchange Factor bindt en opent de gleuf waardoor ADP het complex kan

verlaten en ATP opnieuw kan binden; stimulatie van de polymerisatie. (vb. Profiline) Het helpt bij de toevoeging van monomeren aan de +kant, omdat het bindt tegenover het

ATP-bindend domein; daarna komt het los Controle op de actine-assemblage bij de celmembraan.

Via inhiberende G-actine bindende proteïnen: Thymosine β-4; blokkeert het ATP-bindend domein in G-actine

Door de blokkering fungeert het als buffer voor monomerisch actine Wanneer de concentratie van dit proteïne stijgt, stijgt Tβ-4-G-actine en dus minder F-

actine; geïllustreerd voor beide proteïnen in de bijlagen.

Treadmilling kan gestimuleerd worden door profiline en cofiline:

1. Cofiline bindt aan een ADP-subunit in F-actine waardoor het een conformatieverandering ondergaat en het filament afbreekt, wat depolarisatie in de hand werkt, omdat er een tweede -kant ontstaat. Vervolgens komt het los van de ADP-monomeren en kan het opnieuw binden aan ADP-F-actine

2. De vrije ADP-monomeren kunnen herladen worden door profiline → inbouw aan de +kant

In het begin is reeds aangegeven dat actine onder verschillende verschijningsvormen kan voorkomen, hier enigszins uitgebreid. De voorkomenstoestand wordt geregeld door de CH-domein superfamilie:

30. Netwerkvorming; in vitro31. In vivo; zeer gevarieerd:

a. Bundels (microvilli); bindingsplaatsen liggen dicht bij elkaar (fimbrine en α-actinine)b. Netwerken; frontvorming van de bewegende celc. Via actine-crosslinkende eiwitten met 2 bindingsplaatsen voor F-actined. 2 plaatsen op 1 eiwit (fimbrine)e. Grote afstand tussen bindingsplaatsen: spectrinef. Flexibel tussen bindingsplaatsen: filamine

Wanneer de bindingsplaatsen voorkomen op afstand en flexibele zijarmen: netwerk in de cel-cortex (spectrine, dystrofine, filamine), of wanneer eiwitten binden aan eiwitten van het celmembraan kan er ook nog een netwerk ontstaan in de cel-cortex.

27

De CH-domein-proteïnen (calpoline homoline) die je moet kennen:

Proteïne Domein-organisatie LokatieFimbrine Microvilli, sterocilia, adhesieplaques, gist-

actinekabelsα-actinine Filopodia, lamellipodia, stressfibers,

adhesieplaquesSpectrine

Corticale netwerkenFilamine (elastisch → beweging)

Filopodia, pseudopodia, stressfibers

De verbinding tussen de actinefilamenten en het celmembraan moet op een andere manier worden gevormd, namelijk via adapterproteïnen die lateraal op het actinefilament liggen of aan het einde zijn gebonden. Een voorbeeld is de rode bloedcel:

Een RBC heeft een netwerk van korte filamenten (14 subunits) onder het membraan De -kant wordt gestabiliseerd door tropomoduline Zijdelings stabilisatie gebeurt door tropomyosine Onder het plasmamembraan ligt een 2D-netwerk van filamenten die gecrosslinked zijn door 6

flexibele spectrineproteïnen; er ontstaat een soort visnet waardoor stevigheid én veerkracht gewaarborgd zijn.

Spectrine is vervolgens aan het membraan verankerd via ankyrine en glycophorine. Vervolgens zullen Band 3 en glycophorine een tweede manier van verankering vormen, zie de bijlage. Hier is ook duidelijk geworden hoe het komt dat de RBC zo’n flexibele vorm heeft; door de lange (dunne) spectrines en de korte bindingen kan de cel snel van vorm veranderen. Soms moet een cel zeer stabiel (constante lengte) en zeer elastisch zijn, dit kan enkel worden bereikt als het F-actine kort wordt gehouden, wat mogelijk is door capping. Dit gebeurt dus o.a. in de RBC, of in de spiercellen aan of de +kant of de -kant:

32. CapZ → een capping-proteïne dat aanhecht aan de +kant:a. Dit proteïne is in hoge concentraties aanwezig; géén polymerisatie aan de +kantb. Het staat onder invloed van PIP2, PIP2 kan CapZ inhiberen en d.m.v. regulatorische proteïnen zal

er toch groei plaatsvinden aan de +kant33. Gelsoline bindt aan de +kant nadat Ca2+ heeft gebonden; dit leidt tot een insertie in F-actine

waardoor er een breuk optreedt en er een nieuwe -kant ontstaat. Gelsoline blijft gebonden aan de +kant, zodat er daar geen opbouw kan plaatsvinden.

34. Tropomoduline bindt aan de -kant met behulp van tropomyosine:a. In cellen waar actine een constante lengte moet hebben (sarcomeren of in RBC)b. Het zorgt voor stabilisatie van F-actine door te binden aan de -kant en aan tropomyosine, wat

gebonden zit aan de zijkant van F-actine

28

Het cytoskelet vormt een essentieel onderdeel voor de cel om te kunnen overleven of te delen; daarom vormt het een gewild richtpunt voor toxines. Een aantal staan hieronder genoemd:

1. Cytochalasine → proteïne dat bindt aan de +kant waardoor er depolymerisatie optreedt en er geen motiliteit meer mogelijk is

2. Latrunculine → proteïne dat bindt aan G-actine, zodat het niet meer kan polymeriseren3. Falloidine → verbindt de subunits in F-actine zodat er geen depolymerisatie op kan treden, zelfs

niet wanneer de concentratie onder de CC-waarde komt te liggen.

Zoals in het begin al was aangegeven, gebeurt de vorming van een nieuw filament makkelijker wanneer er reeds een nucleus beschikbaar is. De nucleatiefase bepaalt dus waar en hoeveel F-actine gevormd wordt in de cel. Ook hiervoor zijn er weer speciale actine-nucleatieproteïnen:

1. Formine → een proteïne dat bestaat uit 2 FH2-domeinen die associëren tot 2 halve ringen en binden aan de twee terminale actine-monomeren met de +kant naar FH2. Hierop kunnen nieuwe subunits binden, waarbij de 2 domeinen steeds alternerend aan de nieuw gebonden subunit hechten en zo aan het uiteinde (de +kant) kunnen blijven. Het FH1-domeine vormt een landingsplaats voor profiline (het proteïne dat ATP-gebonden G-actine synthetiseert). Het dimeer dat gevormd wordt is uitermate flexibel, en kan zo overigens ook richtingsbepalend werken. Formine wordt gebruikt voor de vorming van lange filamenten. Mede doordat formine gebonden blijft, kan CapZ niet binden en kan het filament blijven groeien. Het spreekt voor zich dat teveel formine ook niet goed is; daarom zal het eerst geactiveerd moeten worden door een membraangebonden Rho-GTP; dit bindt aan de RBD-sequentie dat in de sequentie van formine zit geïntegreerd waardoor het kan openvouwen en in werking zal treden.

2. Arp2/3 complex; dit proteïne is specifiek voor netwerkvorming en bestaat uit een complex van 7 proteïnen waarvan 2 actine-related-proteins zijn. De nucleatie wordt geactiveerd wanneer het complex gebonden is aan WASp (proteïne) en aan een voorgevormd actine-filament. Het kan dan binden aan de zijkant van een filament met als gevolg dat het Arp2 en 3 lijken op de +kant van actine, waardoor actine verder kan groeien onder een hoek van 70°. Ook dit staat onder controle van WASp; dit is normaalgesproken dichtgevouwen, maar wanneer GTP-cdc42 bindt, kan WASp openen en wordt het toegankelijk voor Arp2/3.

29

6. Microtubuli + interacties tussen cytoskeletcomponenten

InleidingDe microtubuli vormen de grootste component van het cytoskelet. Ze spelen een rol in de celbeweging (cilia en flagella) en zijn belangrijk bij vesikeltransport in het cytoplasma via (de)polymerisatie of via motorproteïnen. Bovendien zijn ze essentieel in het aangeven van de richting bij axonengroei en zorgen voor de scheiding van de chromosomen bij de celdeling (dynamische microtubuli)

De organisatie van de microtubuli start bij het ‘MTOC’→ het MicroTubuli Organiserend Centrum, dit zorgt eveneens voor de organisatie van de celpolariteit.

Opbouw van de microtubuliMicrotubuli bestaan uit een polymeer van globulaire tubuline subunits die samen een cilinder vormen met zo’n 25 nm diameter. Ze zijn (globaal) onder te verdelen in:

Stabiele microtubuli (richting geven aan cel + transport); deze komen voor in: Niet-delende cellen Cilia Zenuwuitlopers; axonen In de periferie van RBC en bloedplaatjes

Niet-stabiele microtubuli (transport): Mitose; het vrijgekomen tubuline wordt dan gebruikt voor de aanmaak van het spoelfiguur.

De bouwstenen van microtubuli zijn de volgende:

1. De subunits van microtubuli zijn α- en β-tubuline die tubuline-dimeren vormen2. α-tubuline kan diep GTP binden, zonder dat er hydrolyse plaatsvindt en β-tubuline bindt GTP aan

het oppervlak, wat het zal hydrolyseren nadat het is ingebouwd in een microtubulus.

De tubuline-dimeren kunnen vervolgens polymeriseren tot een protofilament. 13 protofilamenten vormen een bladstructuur die zal roteren en zo omvormt tot een 25 nm tubulus met een α-subunit aan de -kant en een β-subunit aan de +kant. Vervolgens sluit de structuur en vormt er een ‘seam’; een naad waar α tegen β komt te liggen. Er ontstaat een microtubulus van 13 protofilamenten die bij voorkeur polymeriseert aan de +kant (waar GDP gebonden is)

Een microtubulus komt voor in verschillende vormen:

35. Singlet microtubulus; deze zit in het cytosol36. Een duplet in cilia en flagella, dit bestaat uit een volledige ‘cirkel’ en een onvolledige;

a. De volledige microtubulus bestaat uit 13 protofilamentenb. De aangehechte bestaat uit slechts 10 protofilamenten.

37. Triplets; voorkomende in centriolen en de ‘basal body’, vormt 1 volledige en 2 onvolledige:a. Principe is hetzelfde als bij het duplet; één volledige, bestaande uit 13 protofilamentenb. Twee microtubuli bestaande uit 10 protofilamenten

De microfilamenten kunnen ook niet ‘spontaan’ polymeriseren, hiervoor is een nucleus nodig; de nucleus wordt hier gevormd door het MTOC, waarbij de -kant verankerd blijft op het MTOC. Let wel: in mitotische cellen zijn er dus per definitie 2 MTOC’s, waaruit het volledige spoelfiguur ontstaat. Een cilia of flaggelum

30

ontstaat vanuit een basal body.In niet-delende cellen migreert het MTOC altijd naar het centrum van de cel = centrosoom!

Centrosoom → structuur bestaande uit 2 centriolen die zijn omgeven door pericentriolair materiaal.Centriool → 9 sets van triplet-microtubuli.pericentriolair materiaal → dit is de daadwerkelijke plaats waarde nucleatie plaatsvindt; en wel vanuit het γ-tubuline ring complex.

Zoals het geval is met de microfilamenten, zijn de microtubuli ook dynamisch, met een uiterst variabele levensduur; van de deling van een cel tot de levensduur van een axon (levenslang):

De polymerisatie van de αβ-dimeren gebeurt in de aanwezigheid van MAP’s → Microtubule Associated Proteins. Die zorgen voor afbraak (per definitie) bij 4°C en re-assemblage bij 37°C

Zoals zichtbaar is in de grafiek gebeurt de nucleatiefase langzaam, maar de assemblage gaat daarentegen zeer snel totdat de steady-state is bereikt (merk de analogie op bij actine)

Ook het principe van de CC is hier gelijk; de CC ligt hier echter op 0,03 μM van αβ-dimeren. De groei gebeurt preferentieel aan de +kant (de kant van het β-tubuline) omdat de –kant gevangen

zit in MTOC Opnieuw geldt dat de CC+ lager is dan de CC- (dus verschil in CC aan de - en +kant) waardoor

treadmilling (= groei aan + en verlies aan – kant) mogelijk is (soort transport, ~ actine) De cytosolconcentratie ligt rond de 10-20 μM; er dus treedt er preferentieel polymerisatie op. (Hoe

lager de CC, hoe liever er polymerisatie optreedt)

Maar…, niet alle MT gedragen zich hetzelfde wanneer de dimeerconcentratie rond de CC ligt; er bestaan namelijk catastrofes en rescues → periodes van extreme verkorting of extreme groei. Dit is onafhankelijk van treadmilling, maar gebaseerd op de verschillende aspecten van de + en -uiteinden.

Β-tubuline aan de +kant en hydrolyse van het gebonden GTP bij toevoeging van een nieuwe dimeer: Wanneer terminaal een GTP-gebonden β-tubuline zit: recht uiteinde tijdens snelle groei, want

er ontstaat een GTP-cap (de hydrolyse gebeurt langzamer dan de dimeerbinding) Hydrolyse van GTP-β-tubuline tot GDP in terminaal β-tubuline leidt tot kromming; de vorming

van zgn. ramshorens. GDP-β-tubuline op het uiteinde → per definitie een gekromd uiteinde (oude MT) en er treedt

verkorting op (catastrophe)

Ook dit proces wordt weer door bepaalde proteïnen beinvloedt:

1. Colchicine → dit proteïne bindt aan de tubuline-dimeren, waardoor ze niet kunnen worden ingebouwd, maar er vindt nog steeds afbraak plaats van de bestaande MT → de celdeling kan niet mogelijk worden gemaakt. (Wordt toegepast bij jichtbehandeling)

2. Taxol → toxische stof die bindt aan de MT waardoor er geen verkorting mogelijk wordt en er dus ook geen mitose op kan treden; dit is een gekend medicijn voor de chemokuren van borst- en eierstokkankerbehandeling.

3. Vinblastine→ bindt aan + kant waardoor er geen dynamica meer mogelijk is; behandeling van kanker

De verdeling van de MT in de cel is afhankelijk van de plaats van de MTOC (bij een niet-mitotische cel) en van search-and-capture → stabilisatie van een MT doordat er een eiwit bindt aan de +kant en het MT geen catastrophes kan ondergaan.

31

Het MT verdwijnt wanneer het veel catastrophes ondergaat en weinig rescues; bij een groeiproces gebeurt exact het omgekeerde.

Bij het ontmoeten van een structuur of organel dat de +kant stabiliseert treedt er search-and-capture op: de +kant bindt, dit werkt stabiliserend en catastrophes zijn nu onmogelijk.

De eerder genoemde MAP’s hebben invloed op de dynamiek van de MT, deze zijn aanwezig wanneer assemblage vereist is.:

38. MT-stabiliserende eiwitten → proteïnen die de MT’s bekleden door MAP’s: er treden minder catastrophes op of versnelde groei:a. Ze hebben een basisch domein (positief geladen → binding aan de negatieve zijde van de

tubuline C-terminus),b. Hebben een zuur-projectie-domein (van variabele lengte) waardoor ze aan een membraan

kunnen binden via IF of andere MT → spacing.c. Na fosforylatie van het projectiedomein d.m.v. MAP-kinase of CDK → geen binding aan MT,

waardoor de MT’s kunnen afbreken.Dit ‘spacing’ zorgt ervoor dat er een strikt geordende structuur van MT onderling ontstaat omdat ze door bepaalde MAP’s andere MT op een afstand kunnen houden; het MAP bindt dan (welke MAP is afhankelijk van het celtype) en door een dwars-uitstaande uitloper houden ze anderen op een afstand. Dan zijn er nog de TIP’s → microtubuli-stabiliserende-proteïnen die binden aan de +kant van (groeiende) MT: Er treden minder catastrophes op, maar meer rescues → blijvende groei Het vormt een capture-proteïne voor binding van groeiende MT.

MT-destabiliserende proteïnen: Kinesine-13-proteïnen → proteïnen die binden en zo de uiteinden van de protofilamenten

krommen in GDP-β-tubuline-configuratie; met als gevolg dat de dimeren worden verwijderd o.i.v. ATP-hydrolyse (afbraak MT)

Stathmine → proteïne dat 2 dimeren bindt op een zodanige manier dat ze krommen op het einde van de MT → de ramshoorn-vorm treedt gedwongen in en er vinden catastrophes plaats. Dit proteïne is inactief na fosforylering

Tot slot vormt niet elk van de cytoskelet-onderdelen een afzonderlijk skelet; alle 3 de vormen werken samen om zo één stabiel, dynamisch en intact cytoskelet te vormen. De coördinatie en samenwerking tussen de verschillende onderdelen wordt geregeld door IFAP’s → Intermediate Filaments Associated Proteins; proteïnen die de IF’s crosslinken met andere celskeletstructuren waardoor bundels, netwerken en andere celstructuren kunnen ontstaan:

39. De plakines (familie van IFAP’s) van bv. de (hemi)desmosomen 40. De plakines die de IF verbinden met de MF en de MT, zoals plectine

Kankerbehandeling via ‘tubulin-binding agents’ (TBAs):TBAs zorgen ervoor dat kanker stopt met groeien en de cel dood gaat. Maar kankercellen passen zich er aan aan door TBA naar buiten te pompen of door andere tubulines aan te maken zodat TBA niet kan binden

32

7. Algemene begrippen over kanker + introductie kankergenetica

InleidingKanker → pathologie die ontstaat door een fout in de balans tussen celdeling en celdood. In welke richting de balans is doorgeslagen is afhankelijk van het celtype. Zo bestaan er (altijd) labiele cellen → cellen die gedurende het hele leven blijven delen zoals bloedcellen, darmcellen of huidcellen; en stabiele cellen → cellen die niet meer delen na differentiatie; hartspier- zenuw of levercellen.

Deze verstoorde balans is het gevolg van DNA-beschadiging in de (proto-)oncogenen → genen die de celgroei bevorderen; of een beschadiging van de tumorsuppressorgenen → de genen die de celdood kunnen induceren wanneer dit nodig is. Het controle gen is ook gemuteerd

DNA-beschadigingOm kanker te ontwikkelen, moeten dus DNA-beschadigingen op specifieke plaatsen optreden:

41. Activatie van de proto-oncogenen (in alle normale cellen aanwezig) tot oncogenen (aanwezig in kankercellen) door mutaties:a. Mogelijk dat er een verhoogde genexpressie optreedt en er een abnormale hoeveelheid

normaal eiwit wordt geproduceerdb. Mogelijk dat er een abnormaal proteïne wordt gevormd wat hyperactief is.

42. Verlies van de tumorsuppressorgenen door mutaties; deleties of hypermethylering (dit zorgt ervoor dat het gen niet meer kan worden afgelezen omdat de transcriptiefactoren niet meer kunnen werken). Hierdoor zal er verminderde of volledig afwezige gen-expessie optreden

43. Inactivatie van de caretaker-genes → de genen die de integriteit van het genoom bewaren; wanneer deze worden geïnactiveerd treden er steeds meer en steeds sneller mutaties op die niet meer gerepareerd worden

Alledrie de bovenstaande gengroepen zijn actief in de regulatie van (in volgorde):44. De celdeling en de celcyclus45. Cel-dood via apoptose46. DNA-herstel

Deze DNA-fouten kunnen geïnduceerd worden door verschillende factoren; een voorbeeld is de blootstelling aan carcinogenen (UV-straling; chemische agentia), hierdoor worden mutaties in somatische cellen geïnduceerd die worden doorgegeven aan de dochtercellen. Dit vormt zo een kloon van gemuteerde cellen die aanleiding kunnen geven tot een tumor. Let wel: dit is relatief; één toevallige mutatie geeft niet per definitie aanleiding tot kanker; het zal een serie van mutaties zijn in tal van verschillende genen die dan na verschillende jaren mogelijk aanleiding kunnen geven tot kanker. Doordat dit een mutatie-afhankelijk proces is en gezien de lengte van het menselijk genoom (60 miljard basenparen), kunnen er praktisch oneindig veel soorten kankers ontstaan. Toch hebben al deze kankers 7 eigenschappen gemeenschappelijk

1. Onafhankelijke proliferatie van de externe signalen2. Ongevoelig voor de externe remmende signalen3. Ze blijven leven zonder in apoptose te gaan door externe signalen; ze zijn onsterfelijk4. Hebben een gewijzigde hechting aan cellen en aan de matrix, zodat ze kunnen loskomen en

migreren en uitzaaien5. Ze hebben een gewijzigd microscopisch aspect van cellen: hoe meer ze afwijken van normale cellen

hoe kwaadaardiger de kanker6. Ze kunnen bloedvatgroei induceren binnenin de tumor7. Ze kunnen metastaseren/uitzaaien

33

Toch wordt er ook op basis van bovenstaande eigenschappen onderscheid gemaakt tussen tumoren:

1. Benigne tumoren → goedaardig, dit zijn meestal kleine, omgeven door een fibreus kapsel, celgroepjes die scherp zijn afgelijnd. Bovendien lijken ze op hun normale tegenhangers en ondergaan een normale adhesie. Let wel; goedaardig betekent niet meteen niet-bedreigend; wanneer zo’n tumor voorkomt in de hersenen, lijkt de schade me duidelijk.

2. Maligne tumoren → kwaadaardig. Snellere groei, geen normale sterfte en gaan naburig weefsel invaderen; ze kunnen zo metastaseren en bovendien zijn ze minder gedifferentieerd, waardoor ze niet meer lijken op de oorspronkelijke cel. De cellen hebben meestal ook een grillige vorm, een uiterst dense kern etc; alle signalen die duiden op sterk verhoogde activiteit.

Carcinoom → tumoren afkomstig van epitheelweefselSarcoom → tumor in niet-epitheliale, mesenchymale weefsels, bijv. spieren, ECM, bot etc.Leukemie → tumoren in de bloedvormende cellen en weefsels.

MetastaseringMetastasering → uitzaaiing van tumorcellen op afstand.Dit proces is niet makkelijk; dit wordt geïllustreerd aan de hand van een epitheliaal carcinoom. Stappen:

1. Oorspronkelijk is hierbij de kanker dus ontstaan in het epitheel, om verplaatsing überhaupt mogelijk te maken, zullen de tumorcellen zich dus door de basale lamina moeten bewegen.Dit kan op twee manieren:- Enzymactivatie; bv. de plasminogeen-activator; dit kan plasmine (proteolytisch enzym) vormen

uit plasminogeen wat leidt tot plaatselijke vertering van de basale lamina.- Migratie langs de basale lamina tot een punt waar het eruit kan treden, of tot een punt elders

in het epitheel waar het een nieuwe tumor veroorzaakt.2. Via invadopodia kan de tumorcel nu de ECM invaderen en erdoorheen migreren. 3. Om nu vervoerd te kunnen worden door het bloed, zullen ze de basale lamina van het bloedvat ook

moeten doordringen4. Ze komen nu terecht in het bloedvat resp. lymfevat, waar ze toch ook zullen moeten overleven,

terwijl ze in een vreemd milieu zitten, waar bovendien een uitermate actief immuunsysteem aanwezig is.

Al met al zal slechts 1 op de 10.000 tumorcellen deze metastase overleven, met als gevolg dat de wel overlevende tumorcel nieuwe eigenschappen moet gaan ontwikkelen → tumorprogressie; dit leidt echter tot een betere adaptatie en dus hogere overlevingskansen. Nieuwe eigenschappen:

- Nieuwe oppervlaktereceptoren voor makkelijkere binding voor invasie- Veranderingen in het celskelet voor migratie- De genen voor overleving zullen zich beter aanpassen; mutaties van DNA.

Recent heeft men een theorie opgesteld over het feit dat sommige kankers steeds terug blijven komen ondanks het feit dat de tumor is uitgeroeid. Realiseer je hier het feit dat mutaties in delende cellen worden doorgegeven aan de dochtercellen, en dat mutaties in niet-delende cellen weinig invloed hebben omdat ze deze toch niet door worden geven. Men denkt dus dat alleen de stamcellen kwaadaardig (slechts een kleine hoeveelheid) zijn en zo een continue delingsactiviteit ontwikkelen wat leidt tot foutief gedifferentieerde dochtercellen. Deze stamcellen zijn van nature al weerstandiger en zijn dus (omdat het nu zgn. tumor-stamcellen zijn) nu nog moeilijker uit te roeien door radio- resp. chemotherapie, wat tevens de hoge dosages verklaard bij sommige kankers. Wanneer deze stamcellen aanleiding geven tot kanker, is blijkbaar de controle op dit mechanisme al

34

weggevallen en zal er dus een accumulatie optreden van oncogene mutaties, wat wordt doorgegeven aan de dochtercellen die niet normaal zullen differentiëren en opnieuw aanleiding geven tot kanker.

Als een tumorstamcel deelt; ontstaat hieruit een nieuwe (tumor)stamcel, evenals een iets sterker gedifferentieerde cel (met minder delingsvermogen). Deze tumorstamcellen zijn dus onsterfelijk. Volgens bovenstaand concept zouden tumoren dus uit oorspronkelijk slechts één cel ontstaan, maar wel heterogeen zijn → bestaande uit een tumorstamcel, en zijn dochtercel en uit de cellen afkomstig van verdere deling van de tumordochtercel.Dit betekent ook dat een minderheid van de cellen daadwerkelijk gevaarlijk is. Bovendien heeft men ondertussen kunnen aantonen dat de tumorgroei sterk afhankelijk is van zijn omgeving; de niche → de omgeving van een tumor(cel) die zorgt voor de juiste delingsomstandigheden. Deze zouden dus optimaal moeten zijn in een niche van de tumorstamcellen.

Directe omgevingZoals hierboven reeds uiteen is gezet, kunnen tumoromgevende cellen dus stimuli geven voor de tumorgroei:

1. Mutaties in de niche leiden zo tot een explosieve groei van normale stamcellen → transformatie naar tumorstamcellen; dus overmatige stimulatie vanuit de omgeving

2. Mutatie in de tumorstamcellen en aanpassing van de niche kunnen eveneens leiden tot een explosieve tumorontwikkeling

3. Stamcellen die onafhankelijk zijn geworden van signalen uit de niche zullen zich transformeren naar tumorcellen

4. Mutaties in de (beperkt delende) progenitorcellen → transformatie naar tumorstamcellen met een onbeperkte delingscapaciteit.

Bovenstaand verhaal is allemaal leuk en aardig, maar wanneer de tumor blijft groeien, zal hij op den duur moeten sterven aan zuurstoftekort evenals voedingstekort. Helaas heeft de tumor een manier gevonden om bloedvaten te laten ingroeien → neo-angiogenese. Was dit namelijk niet het geval, zou een tumor een maximale grootte kunnen bereiken van zo’n 106 cellen (overeenkomstig aan zo’n 2 mm; let wel: de ernst kan hier evenwel aanwezig zijn wanneer zo’n tumor bv. optreedt in de hersenen). Wat overigens dan op zal treden is dat er een balans ontstaat tussen bijkomende tumorcellen aan de buitenkant en afsterving aan de binnenkant.Maar over het algemeen maakt de tumor dus nieuwe bloedvaten aan via het volgende proces:

Bestaande bloedvaten worden praktisch naar binnen getrokken door de heersende hypoxie; de tumor zal een transcriptiefactor gaan produceren → Hypoxia Inducing Factor.

HIF1 zorgt voor de aanmaak van VEGF → Vascular Endothelial Growth Factor, wat instaat voor de vorming van nieuwe bloedvaten vertrekkende van bestaande bloedvaten; nu: Moet de basale lamina van het bloedvat gedegradeerd worden en migreren in de tumor De bloedvatendotheelcellen moeten aangezet worden tot deling En uiteindelijk moet de basale lamina terug hersteld worden.

De transformatie van cellen in cultuur naar tumor-cellen (tevens in cultuur) gebeurde als volgt; men had 3T3-muizen-fibroblasten via transfectie (→ een techniek waarbij vreemd DNA in een eukaryote cel wordt gebracht, meestal gevolgd door expressie van een of meerdere genen van het vreemd DNA), in cultuur gebracht met humaan kanker-DNA. Toen men dit na incubatie bekeek, zag men dat de cellen afgerond waren, minder adhesief en 3D-clusters begonnen te vormen. Dit werd verklaard door een geactiveerd ras-

35

oncogen en een mutant ras-proteïne. Wanneer er transfectie plaatsvond van normale fibroblasten met hetzelfde humane kanker, nam men géén fenotypische wijzigingen waar.

Het multi-hit model (clonale selectie → tumoren afkomstig van slechts één cel)Met het begrip multi-hit doelt men op ingetreden mutaties; er zijn dus meerdere mutaties nodig om een normale lichaamscel te veranderingen in een kankercel. Hierbij geldt het algemeen principe van ‘survival of the fittest’:

Mutatie nr. 1 treedt op in de eerste cel; deze cel ontwikkelt (bij toeval) een groeivoordeel Mutatie 2 treedt in in een van de dochtercellen, waardoor ongecontroleerde groei ontstaat. Let

wel: je spreekt hier nog altijd van een eventueel ontstane benigne tumor Mutatie nr. 3; dit kan mogelijk leiden tot nog meer groeivoordeel. Tot hier heb je dus een celmassa

met 3 mutaties (op een ‘juiste’ plaats) Een volgende mutatie kan aanleiding geven tot invasie in weefsels, maar nog geen overleving Pas op zijn vroegst de 5e mutatie zou kunnen leiden tot metastasering. Al met al heb je dus

tenminste 5 tot 6 hits nodig op exact de juiste plaats.

Uit bovenstaande theorie wordt duidelijk dat (1) alle kankercellen bepaalde mutaties gemeenschappelijk hebben. In de praktijk is dit o.a. ook geïllustreerd bij de random inactivatie van het x-chromosoom bij een vrouwelijk individu; cellen van een vrouwelijke tumor zijn dus clonaal. En (2) dat de kankerincidentie stijgt met de leeftijd, omdat het grootste deel van de mutaties in jonge individuen nog hersteld kan worden via reparatiemechanismen en dat ‘slechts’ een accumulatie van mutaties kan leiden tot kanker. Hoe meer mutaties in een cel, hoe kwaadaardiger de kanker, hoe sneller men sterft.

Colonkanker (darm) is zeer zorgvuldig bestudeerd. Men zag dat de mutaties optraden in een bepaalde volgorde:

1. Er treedt verlies of inactivatie van beide allelen op van de tumorsuppressor Adenomatosis polyposis Coli (APC-gen) waardoor er een stijging optreedt van de celdeling door c-myc-activatie.

2. Door die activatie treedt er overexpressie op van de myc-transcriptiefactor waardoor de celcyclus explosief toeneemt. Nu is er pas sprake van een goedaardige poliep. (Meestal ontwikkelen er meerdere poliepen.)

3. Er moet nu een activerende mutatie optreden in het ras-gen; deze ontwikkelt zich tot een oncogen en er treedt een ongecontroleerde celdeling op → adenoom (goedaardig!)

4. Vervolgens treedt er verlies op van een regio (welke is onbekend) op chromosoom 18, welke leidt tot de inactivatie van het tumorsuppressorgen p53; nu is er sprake van een carcinoom.

N.B. de volgorde moet kloppen; sommige mutaties zijn namelijk nodig voor de kankervorming, andere maken invasie mogelijk etc. In een poliep zijn ongeveer 11.000 mutaties per cel ingetreden; kankers leiden dus aan genetische instabiliteit → überhaupt het mogelijk zijn van zoveel optredende mutaties. Dit is te wijten aan het verlies van de care-takergenes.

Kanker en genetische koppelingBepaalde mutaties in bepaalde genen kunnen makkelijker aanleiding geven tot kanker; hieronder staan een aantal genen genoemd die daartoe behoren:

Mutaties of amplificaties in proto-oncogenen; dit leidt tot een gain of function. Mutaties, deleties of silencing van tumorsuppressoren en caretaker-genes; loss of function. Combinatie van oncogen- en tumorsuppressormutaties

36

De proto-oncogenen coderen voor proteïnen die celgroei en celdeling stimuleren.Tumor-suppressorgenen controleren deze celgroei en celdeling op bepaalde checkpoints na DNA-beschadiging of na onjuiste voorafgaande stappen.Fouten kunnen dus optreden in stap IV, omdat de transcriptiefactoren niet meer loslaten en het DNA tot expressie blijft komen en de receptoren constant geactiveerd blijven.

Proto-oncogenenOncogeen → elk gen dat codeert voor een proteïne dat cellen in cultuur óf kan transformeren óf kanker kan induceren in proefdieren. Deze oncogenen zijn een gemuteerde vorm van de proto-oncogenen die in elke cel voorkomen omdat ze nodig zijn voor de celdeling. Enkele voorbeelden:

1. Signaaltransductieiwitten (Ras; belangrijkste proto-oncogen)2. Groei-stimulerende eiwitten en/of hun receptoren3. Anti-apoptotische proteïnen4. Transcriptiefactoren (c-myc)

Maar, niet zo maar elke mutatie in deze genen zorgt voor de transformatie van een proto-oncogen naar een oncogen. Let wel: dit gebeurt via gain of function, waarbij slechts 1 allel moet muteren:

Via een puntmutatie in 1 basenpaar die aanleiding geeft tot hyperactiviteit of constitutieve activiteit (de rem valt weg) of aanleiding geeft tot abnormaal proteïne (een oncoproteïne) owv andere conformatie

Chromosomale translocatie (gen wordt van chromosoom 1 naar chromosoom 2 getransporteerd; een nieuw hybride fusie-gen ontstaat, die aanleiding geeft tot een constitutief actief hybride abnormaal eiwit (een oncoproteïne)

Chromosomale translocatie waardoor het groeiregulerend gen onder een nieuwe, constant actieve promotor valt en dus constant tot expressie komt van een normaal eiwit

Amplificatie → abnormale DNA-replicatie; er ontstaan meer dan 2 kopieën op 1 chromosoom of op ‘minute-chromosomen’; er treedt weer overproductie op van het normaal eiwit.

TumorsuppressorgenenDeze mutatie moet een inactiverende werking hebben wil het aanleiding geven tot kanker. Er zijn 5 eiwitgroepen die de celproliferatie remmen. Hiervoor moeten beide allelen gemuteerd zijn in dezelfde cel3:

1. P16, Rb → proteïnen die een rol spelen bij de progressieregulatie/inhibitie van de celcyclus2. TGF β → receptoren voor hormonen of signaaltransducers (werken inhiberend)3. P53 → proteïnen die op een checkpoint de celcyclus controleren en kunnen stoppen.4. Apoptose-bevorderende eiwitten5. Enzymen voor DNA-reparatie; deze laten nu het voortbestaan van andere mutaties toe.

Bovenstaande mutaties kunnen worden doorgegeven aan het nageslacht; er ontstaat zo een erfelijke voorbeschiktheid om bepaalde kankers te ontwikkelen.Zo kan in germ-line (gameten) een mutatie optreden in een allel, maar er wordt dan nog net voldoende TS-proteïne geproduceerd om de cel normaal te laten functioneren. Vervolgens kan er een somatische mutatie optreden of een methylering van het andere allel wat aanleiding geeft tot een inactief gen en dus compleet verlies van TS-productie door die cel. Op deze manier kunnen kankers bij zeer jonge individuen voorkomen. Een aantal voorbeelden:

3 Deze mutatie moet homozygoot optreden (dus in beide allelen) in tegenstelling tot heterozygoot bij de proto-oncogenen omdat er hier mogelijk nog net voldoende proteïneproductie is om geen tumoren te ontwikkelen.

37

De retinoblastoma; dit illustreert de rol van spontane somatische mutaties. Men observeerde dat bilaterale tumoren meestal voorkwamen bij jonge kinderen, terwijl unilateraal voornamelijk voorkwam bij volwassenen. Dit komt omdat kinderen bijna per definitie al een defect allel genetisch hebben meegekregen. Dit ene allel zorgt voor de ontwikkeling van beide ogen en een hit is dus voldoende om kanker te doen ontstaan aan beide ogen. Bij volwassenen moet er dus 1 hit optreden zijn in een somatische cel, waarbij de kans zeer klein is dat dit bilateraal gebeurd, met als gevolg dat volwassenen eerder unilaterale retinoblastoma’s ontwikkelen.

Overgeërfde mutaties in TSG die darmkanker kunnen veroorzaken; het individu heeft in zijn voortplantingscellen een mutatie in een APC-allel, waardoor hij zeer gemakkelijk 1000den poliepen kan ontwikkelen en de kans dat hij of zij voor zijn 50e levensjaar kanker heeft ontwikkeld zeer groot wordt.

Het laatste voorbeeld van genetisch overerfbare kankers is borstkanker; in de germline zit een mutatie in één BRCA1-allel (breast-cancer 1) waardoor het individu 60% kans heeft om borstkanker te ontwikkelen tegen 2% van de normale populatie. Dit BRCA1 is een DNA-reparatiegen, maar is niet betrokken in de sporadische borstkanker.

Toch zijn bijkomende hits bij genetisch overerfbare kankers nodig; een individu heterozygoot voor een beschadigd TSG-gen zal de helft van zijn nakomelingen het goede allel meegeven en de andere helft het slechte, en dus moet er nog een bijkomende hit optreden waarbij er verlies optreedt van het heterozygote karakter (Loss Of Heterozygosity) via:

1. Een deletie of een mutatie van een normaal genkopie (een hit), afkomstig van buitenaf2. Foutieve celdeling; bv. non-disjunctie → het niet scheiden van de chromosomen (anafase)3. Mitotische recombinatie

En dan nog zijn aanvullende mutaties vereist. Dit LOH wordt geïllustreerd in de bijlagen.

38

8. Moleculaire genetica van kanker: oncogenen en tumorsupressorgenen

Zoals in het eerste college over kanker al beschreven is, kan het veroorzaakt worden door 2 verschillende mutaties:

1. Mutaties in tumorsuppressoren, zodat ze onderdrukt worden2. Mutaties in de proto-oncogenen, zodat ze geactiveerd worden tot oncogenen. Dit leidt tot het

ontstaan van:a. Abnormale eiwittenb. Teveel normale eiwitten

Bovenstaand is eigenlijk te sterk gesimplificeerd; het gaat namelijk om pathways, en dus kunnen mutaties die kanker veroorzaken op verschillende plaatsen in de pathway voorkomen:

Mutaties: Het geactiveerde oncogen is dominant, dus één hit is voldoende om problemen te veroorzaken.

Mutaties kunnen dan optreden in: Extracellulaire signaalmoleculen (overmaat of abnormale eiwitten) Signaalreceptoren (bv. de Tyr-receptorkinasen); dit leidt tot constante activatie Signaaltransductie-eiwitten Transcriptiefactoren

De tumorsuppressorgenen hebben 2 hits nodig om geinactiveerd te worden. Deze kunnen optreden in: Celcyclus-controlerende eiwitten DNA-hersteleiwitten

De pro- en anti-apoptosegenen (eigenlijk een verzamelnaam voor bovenstaande genen) Pro-apoptosegenen → tumorsuppressoren Anti-apoptosegenen → oncogenen

Kanker door signaalreceptoren.Deze mutaties in receptoren zijn ook weer onderverdeeld; het kan namelijk overgedragen worden door virussen evenals DNA dat gemuteerd raakt door bijvoorbeeld teveel UV-licht of andere redenen (zie prof. Claessens)

Kanker ontstaan door DNA-mutatiesZoals al eerder vermeld staat, is er sprake van een pathway; mutaties die mogelijk aanleiding kunnen geven tot kanker kunnen dus op verschillende plaatsen optreden; evenals verschillende typen mutaties!

De normale pathway verloopt als volgt:

Ligandbinding activeert de receptor-tyrosine-kinases (RTK) → de receptoren dimeriseren → dimerisatie geeft aanleiding tot de activatie van het cytosolisch domein met kinase activiteit → de intracellulaire pathway start en na deze doorlopen te hebben, wordt de celdeling geactiveerd.

47. Een puntmutatie in de receptor geeft aanleiding tot constante dimerisatie en dus constante activatie van de celdelingspathway. Een voorbeeld is de Her2-receptor, die bij mutaties aanleiding geeft tot het neu-oncoproteine.

39

48. Een deletie in het gen coderende voor het extracellulair-ligand-bindend-domein geeft aanleiding tot een geactiveerde oncogen-receptor; een voorbeeld is de Epidermal Growth Factor (EGF)-receptor die muteert naar een ErbB-oncoproteine leidt tot constante celdeling.

In beide bovenstaande gevallen is het ligand niet meer nodig om het signaal te geven. 49. Een amplificatie (genvermenigvuldiging) wat leidt tot overproductie van de normale RTK-receptor.

Dit komt met name voor bij borstkanker; bij lage concentratie van EGF → deling van enkel de kankercellen; niet de normale cellen

50. Een chromosomale translocatie waarbij een gen van chromosoom x wordt verplaatst naar chromosoom y. De volgende translocatie komt vaak voor (Trk):a. Een chimeer eiwit met de N-terminus van tropomyosine i.p.v. het extracellulair domein van de

Trk-receptorb. Tropomyosine zal dimeriseren een aanleiding geven tot een coiled-coil; wat de receptoren bij

elkaar dwingt.c. Constante activatie van het kinase-domeind. Trk-oncoproteine is een cytosolisch eiwit geworden i.p.v. een membraanreceptor voor NGF.

Kanker door oncogene activiteit van virussenZoals al gekend is, kan kanker veroorzaakt worden door virussen; er worden 2 virussen behandeld:

51. Het SFFV; Spleen Focus Forming Virusa. Dit virus kan zorgen voor erythro-leukemie; dit gebeurt als volgt:

I. Het is een retrovirus, dat een mutant eiwit kan overdragen (het gp55) wat de plaats kan innemen van EPO

II. Normaalgesproken is EPO nodig om de EPO-receptoren te activeren zodat er meer erythrocyten worden aangemaakt. Als gp55 bindt, geeft dit aanleiding tot een abnormale toename van het aantal rode bloedcellen

III. Erythro-leukemie ontstaat wel pas na bijkomende mutaties! (Ondanks het feit dat het gp55 niet meer van de receptoren zal komen).

52. Het HPV; Humaan Papilloma Virusa. Kan aanleiding geven tot baarmoederhalskanker

I. Het is een sexueel overdraagbaar DNA-virusII. Vormt een E5-eiwit (transmembranair) wat een stabiel complex vormt met de PDGF-

receptor (Plates Derived Growth Factor)III. Hierdoor zal E5 di- en trimeren vormen, zodat de receptoren eveneens aggregeren →

dimerisatie van de receptoren treedt op waardoor de receptor geactiveerd wordt en er een transformatie tot maligne receptor ontstaat.

Virus geef aanleiding tot viraal eiwit

Kanker door signaaltransductie-eiwittenDeze vorm van kankerveroorzakende mutaties treedt frequenter op dan voorgaand verhaal. Het Ras-proteïne is een voorbeeld.Ras-proteïne → een signaaleiwit tussen geactiveerde receptoren en proteïne-kinasen. Wanneer er in dit proteïne een mutatie optreedt in codon 12, 13 of 61, ontstaat een constant geactiveerd Ras-oncogen wat minder GTPase-activiteit heeft. Hierdoor kan GTP niet of nauwelijks gehydrolyseerd worden en zal het Ras-proteïne blijft constant actief.Ras speelt een rol in de celcyclus; geactiveerd Ras (door een gedimeriseerd RTK zal Ras GTP binden) activeert proteïne kinase 1 → PK2 → MAP-kinase. Wanneer dit MAPK geactiveerd is, kunnen transcriptiefactoren gefosforyleerd worden en aanleiding geven tot de initiatie van de celcyclus.

40

Het is duidelijk dat het Ras geïnactiveerd moet worden nadat het zijn functie heeft uitgevoerd. Hiervoor zorgt het GAP → GTPase Activating Protein; hierdoor wordt GTP gehydrolyseerd en is Ras geïnactiveerd; is dit GAP geïnactiveerd, blijft Ras actief. GAP is dus een tumorsuppressor en Ras is een proto-oncogen.

Hierboven staat de activerende mutatie al beschreven; waarbij GTP-Ras minder GTPase-activiteit heeft of ongevoelig is geworden voor GAP. Een andere mogelijkheid is uiteraard dat GAP geïnactiveerd wordt. Een voorbeeld waarbij dit gebeurt is neurofibromatose → een goedaardige tumor van de zenuwschede. Let wel: er moeten 2 hits gebeuren in beide NF-1-allelen door bv. één erfelijke mutatie en een andere, somatische mutatie in het andere allel.

Een ander voorbeeld is een mutatie in proteïne-kinasen. Hier: c-Abl eiwit → eiwit dat de cytoskelet en celvorm controleert:Een chromosomale translocatie geeft aanleiding tot fusie tussen het c-Abl gen (wat codeert voor cytosolisch non-receptor tyrosine kinase) en het bcr-gen → er ontstaat een bcr-abl-oncogen wat altijd actief is. Dit is een tetramerisch oncoproteine wat een kinase-activiteit heeft en zo signaaltransductie-eiwitten kan fosforyleren. Een voorbeeld is het Philadelphia-chromosoom → translocatie tussen chromosoom 9 en 22 waardoor bepaalde kankers ontstaan. Een voorbeeld is het CML (Chronisch Myeloide Leukemie) wat aanleiding geeft tot een overmaat witte bloedcellen. Ook hier geldt dat een eerste mutatie geen grote ramp is, maar de tweede hit geeft aanleiding tot acute MCL wat dodelijk kan zijn. Nu heeft men een medicijn (Gleevec) gevonden, wat kan binden aan de active site van het fusieproteïne (bcr-abl-proteïne), waardoor het substraat (JAK2 of STAT5) niet meer kan binden en kan het proteïne niet meer gefosforyleerd worden en wordt zo geinhibeerd.

Kanker door abnormale productie van nucleaire transcriptiefactorenVeel oncogenen coderen voor transcriptiefactoren!:

c-myc → proto-oncogen c-jun en c-fos → proto-oncogen die afzonderlijk of na associatie een heterodimeer AP1 vormen. Dit

complex kan DNA binden en zo: Transcriptie stimuleren van groei-bevorderende genen Inhibitie veroorzaken van de transcriptie van groei-onderdrukkende genen

Het is belangrijk te realiseren dat deze transcriptiefactoren zeer instabiel zijn. Het mRNA van deze factoren, evenals de transcriptiefactoren zelf zullen snel verloren gaan. Deze instabiliteit staat uiteraard gecodeerd in het gen, maar wanneer er door mutaties nu een stabiele transcriptiefactor ontstaat, zullen deze uiteraard zorgen voor meer proteïnen met alle gevolgen van dien. Ook hier kunnen verschillende mutaties voor verantwoordelijk zijn:

1. Een deletie in de sequenties die instaan voor de instabiliteit van zowel het mRNA als de transcriptiefactoren; dit leidt tot het ontstaan van een c-fos-oncogen.

2. Een translocatie van c-myc naast die van een actief immunoglobuline-zware-keten. Dit komt namelijk constant tot expressie

3. Amplificatie van c-myc leidt eveneens tot overexpressie.

Nu men er achter begint te komen hoe kanker kan ontstaan is natuurlijk een ding, maar behandeling is vers Behandelingen worden wel steeds vaker gericht op moleculaire bevindingen (borstkanker):

Men neemt een biopsie van het knobbeltje uit de borst, na de diagnose borstkanker is er een mortaliteit van 30-40%.

Als men er vervolgens achter kan komen waardoor het ontstaan is:

41

Overproductie steroidreceptoren → celgroei (bv. de oestrogeen- en progesteronreceptoren); dit zal men behandelen met tamoxifen wat de oestrogeenreceptor inhibeert. De mortaliteit daalt met zo’n 5-15%

Komt het door een amplificatie van Her2/Neu zal men behandeling van herceptine starten, dit bindt op het oncoproteïne, waardoor de mortaliteit nu daalt met zo’n 10-20%

Kanker door mutaties in groeiremmede/celcycluscontrolerende tumorsuppressor genen

Een voorbeeld is het TGFβ en de TGFβ-receptor (Transforming Growth Factor β ) → inductie van de Smad-transcriptiefactoren richting kern waar ze gaan binden aan DNA en zo bepaalde genen gaat aan- of uitzetten. Dit Smad (eiwit) leidt tot expressie van p15 wat leidt tot een stop in de G1-fase.Het TGF + TGFreceptor geeft aanleiding tot PAI-1-transcriptie (plasminogeen Activator Inhibitor).Wanneer er nu mutaties optreden in TGFβ of in Smad:

Geen p15 → celdeling stopt niet. Geen PAI-1 → invasie en metastasering omdat plasmine zorgt voor het oplossen van de

omgevende eiwitten en de kankercel makkelijker kan metastaseren

Andere mutaties in proteïnen die zorgen voor de passage van het controlepunt van G1 naar de S-fase; Dit wordt gecontroleerd door Cycline D, CDK’s en Rb-proteïne:

Cycline D → wordt geïnduceerd door mitogenen en activeert cycline-CDK-complexen (deze hebben een kinase-activiteit)

Het mitogeen verdwijnt waardoor p16 accumuleert; binding aan CDK’s → stop in de G1

Tijdens de G1 → fosforylatie van Rb door actieve cycline-D-CDK-complexen → activatie van E2F-transcriptiefactoren voor DNA-synthese

Hierboven staat de ‘gezonde’ weg geïllustreerd, mogelijke mutaties zijn de volgende: Translocatie van cycline D1 → gen komt onder een nieuwe promotor en verhoogt de expressie van

cycline D1 gedurende de celcyclus → oncoproteïne (lymfomen) Amplificatie van cycline D1 → borstkanker owv te veel kopies Deletie van p164 → geen remming van cycline D-CDK kinase activiteit → overproductie cycline D1

→ hyperfosforylatie Rb (treedt op bij veel kankers) Inactivatie van p16 via promotor-hypermethylatie (longkanker) → geen transcriptie omdat het niet

afleesbaar is owv de methylgroep Inactivatie van Rb door een mutatie of binding aan een eiwit (E7 van HPV)

Kankers door inactivatie van TSG via onderdrukkende chromatine-structuren:

SWI en SNF zijn chromatine-remodelling complexen (CRC): Deze zorgen voor een wijziging in de positie of structuur van de nucleosomen waardoor mogelijke targetgenen (on)toegankelijk worden voor DNA-bindende eiwittenEen voorbeeld is het E2F-gen → onderdrukking leidt tot een stop in de celcyclus

Loss of function-mutatie in het SWI of SNF → celcyclusproblematiek geeft aanleiding tot kanker (bij de mens mogelijk in nier- prostaat- long- en borstkankers)

4 Zoals zichtbaar is in de bijlage houdt p16 het complex bijeen en inactief. Een mutatie kan leiden tot bindingsonmogelijkheid en continue activiteit.

42

P53P53 wordt gezien als het belangrijkste TSG; het wordt daarom ook wel de waakhond van het genoom genoemd. Het zorgt op het G1-checkpoint voor de controle op de aanwezigheid van beschadigd DNA. Mocht dit aanwezig zijn, stopt het de celcyclus en deze kan niet door naar de S-fase.

Dit p53 is instabiel en op een laag concentratieniveau in de cel, stress kan aanleiding geven tot fosforylatie en zo stabilisatie van het p53 wat leidt tot:

Expressie van p21 → bindt en remt cycline-CDK-complex; stop in G1 en de cel kan repareren P21 → stop in G2 → géén mitose P53 remt expressie van cycline B en topo-isomerase II → G2-arrest en géén mitose

Wanneer dit p53 verloren gaat, geeft dit voor 50% zekerheid aanleiding tot kanker → replicatie van beschadigd en gemuteerd DNA en de apoptose wordt niet meer in gang gezet, wat een essentiële bijdrage levert aan de tumorprogressie.

P53 bestaat uit een tetrameer van 4 subunits, wat dus betekent dat slechts 20% nog werkt nadat er één allel is gemuteerd (dominant negatieve mutatie; puntmutatie) Hierdoor kan het niet meer binden aan DNA en wordt gen-expressie niet geactiveerd.

Mutaties in p53 (loss of function) In meer dan de helft van de kanker draagt een replicatie van een beschadigd en gemuteerd DNA en

het gebrek aan apoptose bij aan tomurprogressie Een pintmutaties en 1 p53 allel zorgt voor een abnormale en defecte subunit in bijna alle

tetrameren (p53 is een tetrameer van 4 subunits) waardoor en geen binding met DNA mogelijk is en dus geen activatie van genexpressie

Dominant negatieve mutatie <-> andere tumorsupressorgenen

Inactivatie van p53 Het eiwit mdm2 houdt de activiteit van p53 laag doordat het de DNA-binding verhindert en de

nucleaire export en degradatie in het proteasoom stimuleert. Door fosforylatie wordt p53 gestabiliseerd en wordt mdm2 verplaatst. Er bestaat een p53-feedback-loop waardoor mdm2 zelf transcriptioneel geactiveerd wordt Een amplificatie van mdm2 treedt op (overmaat mdm2) → laag p53 → geen G1-stop en dus géén

apoptose HPV-eiwit E6 → remming van de p53-activiteit HPV-eiwit E7 → remming van de Rb-activiteit E6 en E7 → transformatie → kanker E5 → proliferatie

Apoptose-genenBovenaan staat al dat deze apoptose-genen een verzamelnaam is voor proto-oncogenen en tumorsuppressoren.

Een voorbeeld van kanker is de CLL → Chronisch Lymfatische Leukemie (overmaat lymfocyten; zonder delingsactiviteit na de 1e hit (alleen geen apoptose); de tweede hit veroorzaakt de tumorvorming) Translocatie geeft aanleiding tot oncogene activatie van anti-apoptotisch bcl2 → accumulatie

van niet-actief delende tumorcellen (nog niet dodelijk) Een tweede hit geeft een tumor die wel dodelijk kan zijn.

PTEN-fosfatase:

43

pro-apoptotisch via verlaging van het anti-apoptotische effect van proteïne kinase B inactivatie van PTEN → de cel wordt praktisch ontsterfelijk

P53 Pro-apoptotisch, na stress (zoals hypoxie, DNA-beschadiging door UV)

Inactivatie van DNA-reparatiegenen Vb. bij Xeroderma Pigmentosum.) Algemeen heeft 1/3 van de tumoren een mutatie in DNA-polymerase β (laatste-kans-polymerase, zonder proofreading). BRCA1 en -2 zijn gemuteerd in erfelijke borst- en ovariumkanker. Dit zijn dus ook DNA-reparatiegenen. Bij Loss Of Heterozygosity → géén DNA-herstel

Telomerase-activiteitHet is duidelijk dat dit actief zal moeten zijn in kankercellen, willen ze ‘oneindig’ kunnen delen. Normaalgesproken is dit telomerase alleen aanwezig in embryonale cellen, geslachtscellen en in stamcellen waar het telomeer repaets (TTAGGG) toevoegt. In andere cellen verkorten de telomeren steeds na deling, wat een controlemechanisme vormt. P53 zorgt voor apoptose wanneer de telomeren verloren zijn gegaan.

44