«ВОЕННО МИНИСТЕРСТВА ОБОРОНЫ РОССИЙСКОЙ...

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ВОЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО

ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ВОЕННО-МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМ. С.М. КИРОВА»

МИНИСТЕРСТВА ОБОРОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

ХОДЬКО Светлана Владимировна

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРИРОДНОГО

ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ ВОСПАЛЕНИЯ

ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

14.03.03 – патологическая физиология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Шабанов Петр Дмитриевич

доктор медицинских наук Макарова Марина Николаевна

Санкт-Петербург

2015

2

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 4

ГЛАВА 1. ПАТОФИЗИОЛОГИЯ, ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ И

ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

(ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)......................................................................................... 11

1.1. Классификация, эпидемиология, описание заболеваний верхних

дыхательных путей .................................................................................................... 11

1.2. Патофизиология воспаления верхних дыхательных путей ............................ 15

1.3. Экспериментальные модели заболеваний верхних дыхательных путей ...... 24

1.4. Лечение заболеваний верхних дыхательных путей ........................................ 30

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................................... 40

2.1. Исследуемые препараты ................................................................................. 40

2.2. Тест-система ..................................................................................................... 51

2.3. Оборудование ................................................................................................... 55

2.4. Реагенты ............................................................................................................ 55

2.5. Провоспалительные агенты ............................................................................ 56

2.6. Разработка и валидация экспериментальной модели острого шейного

лимфаденита ............................................................................................................ 58

2.7. Оценка эффективности КЛС-04 в сравнении с тантум верде,

диклофенаком и дексаметазоном на экспериментальной модели острого

шейного лимфаденита ............................................................................................ 63

2.8. Разработка и валидация экспериментальной модели острого риносинусита

................................................................................................................................... 65

2.9. Оценка эффективности препарата фрешнос в сравнении с виброцилом и

аквамарисом на экспериментальной модели острого риносинусита ................ 72

2.10. Манипуляции с животными .......................................................................... 73

2.11. Методы биохимического анализа ................................................................ 73

2.12. Методы гематологического анализа ............................................................ 74

3

2.13. Патофизиологическиие методы исследования ........................................... 75

2.14. Методы патоморфологического анализа ..................................................... 75

2.15. Статистическая обработка данных .............................................................. 77

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ........................... 79

3.1. РЕЗУЛЬТАТЫ РАЗРАБОТКИ И ВАЛИДАЦИИ НОВОЙ МОДЕЛИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТРОГО ШЕЙНОГО ЛИМФАДЕНИТА. .......... 79

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛС-04 В СРАВНЕНИИ С

ТАНТУМ ВЕРДЕ, ДИКЛОФЕНАКОМ И ДЕКСАМЕТАЗОНОМ НА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ОСТРОГО ШЕЙНОГО ЛИМФАДЕНИТА

...................................................................................................................................... 99


ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТРОГО РИНОСИНУСИТА ............................. 112

3.4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА ФРЕШНОС В

СРАВНЕНИИ С ВИБРОЦИЛОМ И АКВАМАРИСОМ НА МОДЕЛИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТРОГО РИНОСИНУСИТА ............................. 122

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ............................................................ 133

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................... 148

ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 150

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ..................................................................... 152

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................... 153

ПРИЛОЖЕНИЕ 1



4

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

По статистическим данным, представленным в Государственном докладе

«О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в

Российской Федерации в 2013 году», в Российской Федерации зарегистрировано

более 33 млн. инфекционных заболеваний, при этом доля острых респираторных

вирусных инфекций (ОРВИ) и гриппа составляет более 90%.

ОРВИ представляет собой гетерогенную группу заболеваний,

этиологическими агентами которых являются респираторные вирусы,

преимущественно поражающие эпителий верхних дыхательных путей (Оковитый

С.В., 2011). Наиболее распространенным заболеванием данной группы является

острый риносинусит, его вклад в структуре ОРВИ составляет до 80% (Зайцев

А.А., 2009).

Согласно Европейским рекомендациям по риносинуситу (Fokkens W. J.,

2012 г.), острый риносинусит – острое воспаление слизистой оболочки полости

носа и придаточных пазух (появившееся внезапно и продолжающееся не более 12

недель), характеризующееся заложенностью носа и/или наличием выделений из

носа или по задней стенке глотки. Понятие «острый риносинусит» охватывает

широкий спектр различных нозологических состояний, начиная от банальной

ОРВИ до тяжелой бактериальной инфекции. Около 5% ОРВИ осложняются

острым бактериальным риносинуситом (Wang D. Y, 2011), при котором в 30%

случаев назначаются антибактериальные препараты (Gill J. M., 2006).

Острый тонзиллит наряду с острым риносинуситом также является широко

распространенным заболеванием. Острый тонзиллит – острое воспаление

преимущественно небных миндалин, сопровождающееся их отеком, гиперемией,

наличием экссудата, а также повышением температуры тела и реакцией

периферических лимфатических узлов (Полякова А.С., 2014). В данное время

установлено, что причиной острого тонзиллита в большинстве случаев является

вирусная, а не бактериальная инфекция (Hsieh T.H., 2011), при этом системная

5

антибактериальная терапия в отношении вирусных тонзиллитов не эффективна

(Полякова А.С., 2014).

На сегодняшний день наиболее широко применяемыми препаратами для

лечения заболеваний верхних дыхательных путей являются антибактериальные

препараты и нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). Для

эффективного лечения антибактериальными препаратами требуются

дополнительные исследования, которые зачастую требуют времени, а

использование НПВС влечет за собой развитие побочных эффектов. Поэтому

сегодня остается актуальным поиск новых эффективных и безопасных

лекарственных средств для лечения воспалительных заболеваний верхних

дыхательных путей.

В литературе широко представлено описание экспериментальных моделей

аллергического и бактериального ринита, но отсутствует описание

экспериментальных моделей асептического риносинусита и острого тонзиллита,

что делает актуальным поиск новых экспериментальных методов для оценки

эффективности лекарственных средств, используемых в терапии заболеваний

верхних дыхательных путей (Руководство ..., 2012).

Степень разработанности темы исследования

Предлагаемые к изучению препараты фрешнос и КЛС-04 являются новыми

лекарственными средствами. Растения, экстракты которых были использованы

при создании препарата фрешнос, широко изучены и представлены в литературе.

Однако сочетание экстрактов шалфея, травы тысячелистника обыкновенного,

травы зверобоя продырявленного и побегов багульника болотного в виде

назальных капель до настоящего времени не изучались. Эти растения широко

известны своими противовоспалительными, антибактериальными,

противовирусными и эндотелийпротекторными свойствами. Кроме того, в состав

препарата входит мятное эфирное масло, которое широко применяется в

препаратах, предназначенных для лечения воспалительных заболеваний верхних

дыхательных путей (Dicpinigaitis P.V., 2003, Pereira E. J. et al., 2013) и тимол,

который часто применяется в комплексных препаратах как антисептическое

6

средство (Учайкин В.Ф. 2004, Руженцова Т.А., 2014). Таким образом, основными

действующими веществами исследуемого препарата, являются летучие

компоненты эфирных масел и флавоноиды, которые обеспечивают широкий

спектр фармакологических эффектов данного препарата (Макарова М.Н.,

Макаров В.Г., 2010).

Новое лекарственное средство КЛС-04, представляет собой липидный

комплекс, полученный по оригинальной технологии в соответствии с патентом

РФ 2420213 (Шиков А. и др., 2012) из свежемороженой печени трески (Gadus

morhua L.) в лекарственной форме спрея. Ранее были изучены инъекционная и

наружная формы препарата на моделях воспаления: каррагениновый воздушный

мешочек у крыс и контактный дерматит у мышей (Рыбакова А.В., 2012, Крышень

К.Л., 2013). В этих работах было показано, что производные ω-3-

полиненасыщенных жирных кислот (резолвины, протектины), входящие в состав

препарата, играют важнейшую роль в разрешении острого воспалительного

процесса и действуют на несколько молекулярных мишеней, включая ЦОГ-2, 5-

ЛОГ и H1-гистаминовые рецепторы.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилась оценка эффективности новых

препаратов природного происхождения фрешнос и КЛС-04 с использованием

разработанных и валидированных моделей асептического острого риносинусита и

острого шейного лимфаденита.

Задачи исследования:

1. Разработать и валидировать новую экспериментальную модель

асептического острого шейного лимфаденита с учетом биохимических,

гематологических, патофизиологических и патоморфологических показателей.

2. Разработать и валидировать новую экспериментальную модель

асептического острого риносинусита на основании патофизиологических и

патоморфологических параметров.

7

3. Оценить эффективность нового отечественного препарата в форме

спрея КЛС-04, на экспериментальной модели острого шейного лимфаденита в

сравнении с тантум верде, диклофенаком и дексаметазоном.

4. Оценить эффективность нового отечественного препарата фрешнос в

форме капель назальных на экспериментальной модели острого риносинусита в

сравнении с виброцилом и аквамарисом.

Научная новизна

Впервые разработаны и валидированы экспериментальные методы оценки

эффективности лекарственных средств на моделях асептического воспаления

верхних дыхательных путей. Показано, что для индукции острого шейного

лимфаденита в качестве провоспалительного агента наиболее целесообразно

использование липополисахарида клеточной стенки бактерий E.coli (ЛПС) в дозе

0,1 мг/кг и каррагенина в дозе 0,8 мг/кг, а для развития острого риносинусита –

формалина в дозе 12 мг/кг. Доказано, что при формировании острого шейного

лимфаденита патогенетически значимым является определение концентрации

провоспалительного цитокина в крови экспериментальных животных TNF-α –

через 4 ч от момента индукции патологии и уровня С-реактивного белка (СРБ)

через 72 ч от момента индукции патологии. В то же время в процессе

формирования острого риносинусита патогенетически значимым является

степень увеличения количества бокаловидных клеток и выраженность клеточной

инфильтрации носовых ходов.

Впервые осуществлена проверка эффективности применения разных доз

нового противовоспалительного препарата КЛС-04 в форме спрея для

купирования патологических процессов, сопровождающих развитие

асептического лимфаденита, при этом доказаны преимущества применения КЛС-

04 в сравнении с тантум верде, диклофенаком и дексаметазоном. Также впервые в

широком диапазоне доз проведена оценка противовоспалительной эффективности

нового комплексного лекарственного препарата фрешнос на модели

асептического острого риносинусита в сравнении с виброцилом и аквамарисом,

8

что позволило установить диапазон эффективных доз препарата для последующей

клинической апробации.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическое значение работы состоит в апробации и валидации новых

экспериментальных моделей острого шейного лимфаденита и острого

риносинусита у крыс. Результаты экспериментального исследования препарата

КЛС-04 вошли в досье на препарат для получения разрешения на проведение

клинических испытаний. Досье на препарат фрешнос сформировано, проведены

клинические испытания на базе отоларингологического отделения Городской

клинической больницы №1 им. Н.И.Пирогова г. Москвы под руководством

члена-корреспондента РАН профессора В.Т. Пальчуна и на базе ФГБУ «Санкт-

Петербургский НИИ ЛОР» Минздрава России под руководством члена-

корреспондента РАН профессора Ю.К. Янова.

Материалы диссертации вошли в учебные программы и используются в

лекционных курсах и на практических занятиях кафедр фармакологии и биологии

ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им.

И.И. Мечникова» МЗ РФ.

Методология и методы исследования

Эксперименты включали в себя разработку и валидацию новых

фармакологических моделей острого шейного лимфаденита и острого

риносинусита у крыс, а также оценку эффективности препаратов различных

фармакологических групп в данных моделях. Методология исследования

предполагала оценку показателей эффективности коррекции острого воспаления

препаратами природного происхождения с помощью фармакологических,

биохимических, патофизиологических и гистологических методов. Исследование

выполнено с соблюдением всех правил доказательной медицины.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработана новая экспериментальная модель острого шейного

лимфаденита, которая инициируется путем введения под капсулу в

мезенхимальную ткань шейных лимфатических узлов крыс растворов ЛПС в дозе

http://szgmu.ru/rus/pdo/k/129/

9

0,1 мг/кг или каррагенина в дозе 0,8 мг/кг. Экспериментальная модель острого

шейного лимфаденита валидирована по показателям правильность (точность) и

сходимость. Модель воспроизводима вне зависимости от времени года.

2. На разработанной и валидированной модели экспериментального

острого шейного лимфаденита установлен противовоспалительный и

противоотечный эффекты исследуемого противовоспалительного препарата

КЛС-04.

3. Разработана новая экспериментальная модель острого риносинусита

путем закапывания в носовую полость крыс раствора формалина в дозе 12 мг/кг.

Экспериментальная модель острого шейного лимфаденита валидирована по

показателю сходимость. Модель воспроизводима вне зависимости от времени

года.

4. На разработанной и валидированной модели экспериментального

острого риносинусита был установлен противовоспалительный эффект нового

препарата растительного происхождения фрешнос, обусловленный входящими в

состав препарата флавоноидами и терпенами.

Степень достоверности и апробация материалов исследования

Степень достоверности

Степень достоверности определяется достаточным количеством

экспериментальных данных, полученных с использованием 530 крыс,

применением современных методов рандомизации, включением в исследование

интактной, контрольной групп и групп сравнения, сроками наблюдения,

достаточными для экстраполяции полученных данных в клинику, выбором

адекватных методов физиологического, биохимического и патоморфологического

исследования, использованием современных методов медицинской статистики.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на XIII

Международном съезде «Phytopharm-2009» (Bonn, Germany, 07.2009),

Межрегиональной конференции с международным участием, посвященной 100-

летию кафедры биологической химии с курсом биоорганической химии (Санкт-

10

Петербург, Россия, 2009), Научно-практической конференции СПбГМА им.

И.И.Мечникова Актуальные проблемы медицины и биологии (Санкт-Петербург,

Россия, 2010 г), Международном съезде «Phytopharm-2013» (Vienna, Austria,

2013), Международном съезде «Phytopharm-2014» (Санкт-Петербург, Россия, 2014

г).

По теме диссертации опубликованы 5 статей в журналах, рекомендованных

ВАК РФ, и 4 тезиса. Апробация диссертации прошла в ФГБВОУ ВПО «Военно-

медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ.

Личный вклад автора в проведенное исследование и получение научных

результатов

Исследования были выполнены на базе ЗАО «Санкт-Петербургский

институт фармации». Автор лично осуществлял планирование экспериментов и

их непосредственное выполнение (95%), статистическую обработку полученных

результатов (100%), обсуждение (90%), написание статей, тезисов и докладов,

диссертации и автореферата (95%).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов

и методов исследования, главы результатов собственных исследований, главы

обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций,

списка литературы и приложений. Работа изложена на 170 страницах

машинописного текста, иллюстрирована 42 рисунками и 42 таблицами.

Библиографический указатель содержит 172 наименования, в том числе 74

отечественных и 98 иностранных.

11

ГЛАВА 1. ПАТОФИЗИОЛОГИЯ, ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ И

ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

(ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1. Классификация, эпидемиология, описание заболеваний верхних дыхательных

путей

Согласно международной классификации болезней (МКБ-10) к

воспалительным заболеваниям верхних дыхательных путей относятся:

J00 Острый назофарингит;

J01 Острый синусит;

J02 Острый фарингит;

J03 Острый тонзиллит;

J04 Острый ларингит и трахеит;

J05 Острый обструктивный ларингит и эпиглотит;

J06 Острые инфекции верхних дыхательных путей множественной и

неуточненной локализации.

Данные заболевания широко распространены: они встречаются у каждого

четвертого жителя нашей планеты. В России инфекционные заболевания верхних

дыхательных путей диагностируются круглогодично, но в период с середины

сентября по середину апреля они приобретают массовый характер и связаны с

острыми респираторными вирусными инфекциями. ОРВИ является самым

распространенным инфекционным заболеванием в развитых странах, в среднем за

год взрослый болеет ОРВИ не реже 2–3 раз, а ребенок – 6–10 раз в год (Челенкова

И.Н. и соавт., 2010).

По данным Федеральной Службы Государственной Статистики в 2011 году

в России было зарегистрировано 324 тысячи случаев заболеваний верхних

дыхательных путей, выявленных впервые, и 30730 тысяч случаев заболевания

http://www.rlsnet.ru/mkb_index_id_4100.htm








12

ОРВИ. При этом реальное количество заболевших зафиксировать не

представляется возможным, так как в настоящее время многие не обращаются за

квалифицированной медицинской помощью и лечатся самостоятельно или по

советам провизоров, работающих в аптеках.

В данной работе будут рассмотрены следующие, наиболее часто

встречающиеся заболевания верхних дыхательных путей: острый риносинусит и

острый тонзиллит.

Известно, что основным проявлением ОРВИ зачастую является ринит. В

патологический процесс при этом вовлекается не только слизистая оболочка

носовой полости, но и околоносовые пазухи, где выявляется катаральное

воспаление, проявляющееся отеком и застоем секрета. Именно поэтому в

зарубежной медицинской литературе чаще употребляется термин «риносинусит»,

а не «ринит» (Кривопустов С.П., 2009; Лопатин А.С., Свистушкин В.М., 2008;

Chow A.W. et al., 2012; Desrosiers M. et al., 2011).

Острый риносинусит — частое осложнение острой респираторной вирусной

инфекции. Обследование пациентов с симптомами острого респираторного

заболевания длительностью более 48 часов показало наличие рентгенологических

признаков синусита в 87% случаев. Острые респираторные вирусные инфекции

осложняются бактериальным риносинуситом в 0,5–2% случаев у взрослых и в 5–

10% случаев у детей. В России, по расчетным данным, острый риносинусит

ежегодно переносят около 10 млн. человек, в то время как в США — около 31

млн. (Гучев И.А., Колосов А.А., 2007; Кунельская Н.Л. и соавт., 2012).

Помимо того, что риносинусит является очень распространенным

заболеванием, он наносит весьма ощутимый материальный урон обществу, так

как наибольшее число больных приходится на возраст от 18 до 55 лет, т.е. на

наиболее трудоспособную часть населения (Сакович А.Р., 2009).

В зависимости от длительности заболевания различают:

1) острый риносинусит (длительность болезни менее 12 недель и полное

исчезновение симптомов после выздоровления),

13

2) рецидивирующий риносинусит (от 1 до 4 эпизодов острого синусита в

год, периоды между обострениями длятся не менее 8 недель, в это время

симптомы заболевания отсутствуют, лечение не проводится),

3) хронический риносинусит (наличие симптомов в течение более чем 12

недель).

Острый риносинусит – воспаление слизистой оболочки околоносовых

пазух, сопровождающееся воспалительными изменениями слизистой оболочки

полости носа, с длительностью болезни менее 12 недель и полным исчезновением

симптомов после выздоровления.

1. Этиопатогенез острого риносинусита преимущественно обусловлен

риногенным инфицированием околоносовых пазух через естественные соустья,

посредством которых осуществляется аэрация и дренирование пазух. Пусковым

моментом в развитии острого риносинусита, как правило, является вирусная

инфекция, при которой околоносовые пазухи поражаются почти в 90% случаев.

Под воздействием вируса на мерцательный эпителий полости носа и

околоносовых пазух эпителиальные клетки теряют реснички, эпителий

становится рыхлым, развивается отек слизистой оболочки, воспаление.

Следствием этого является нарушение аэрации синусов, инактивация

мукоцилиарного клиренса и скопление серозного экссудата в просвете синусов

(рисунок 1) (Ходзицкая В.К., Ходзицкая С.В., 2008). Снижение скорости

мукоцилиарного транспорта способствует увеличению времени контакта

патогенных бактерий со слизистой оболочкой и создает предпосылки для

бактериального инфицирования (Петрова Л.Г., 2012).

14

Рисунок 1 – норма и патология слизистой оболочки носовых пазух

млекопитающих

Таким образом, в развитии риносинусита наиболее важными факторами

являются воспаление и отек слизистой носа и синусов, нарушение их аэрации и

дренирования, бактериальная инфекция. Начальная назофарингеальная инфекция

может распространяться на смежные структуры, в результате чего могут

развиться синусит, средний отит, эпиглотит, ларингит, бронхит и пневмония

(Дюран М. и соавт., 2002).

Важную роль в лечении риносинуситов играет антибактериальная терапия.

Синусит занимает пятое место среди заболеваний по частоте назначения

антибиотиков. Эффективность лечения во многом зависит от правильного выбора

и назначения антибактериального препарата. К сожалению, во многих случаях

антибактериальная терапия проводится нерационально, что приводит к

хронизации заболеваний и развитию резистентности микроорганизмов (Young J.

et al.,2008; Петрова Л.Г., 2012).

В настоящее время идет активный поиск новых препаратов, которые

позволили бы интенсифицировать лечебный процесс и уменьшить

воспалительную реакцию со снижением гнойного воспаления и глубоких

повреждений в виде язвенно-некротических дефектов, уменьшить количество

осложнений, а также препятствовать переходу заболевания в хроническую форму.

Таким образом, развитие и внедрение новых лекарственных препаратов остается

актуальной задачей современной фармакологии.

15

Острый тонзиллит (ангина) – это острое воспаление, которое поражает

небные миндалины (в большинстве случаев), язычную миндалину, глоточную

миндалину, боковые валики или гортань. Чаще всего ангиной болеют дети и

взрослые до 35–40 лет. Возбудителями ангины являются такие микроорганизмы,

как стафилококки, стрептококки, грибки рода Candida и т.д.

Предрасполагающими факторами к развитию ангины относятся переохлаждение,

перегревание, снижение иммунитета, задымленность и запыленность воздуха,

механические повреждения миндалин. Инфицирование при ангине может

происходить двумя путями: экзогенным (в большинстве случаев) и эндогенным.

Экзогенное инфицирование происходит воздушно–капельным и алиментарным

путем, эндогенное инфицирование – вследствие наличия в полости рта или

носоглотки очага воспаления (кариес, болезни десен, хронический тонзиллит и

т.д.). Различают четыре разновидности ангины: катаральную, фолликулярную,

лакунарную и флегмозную (Челенкова И.Н. и соавт., 2010).

Любая из форм ангины может привести к таким осложнениям, как острый

отит, отек гортани, острый ларингит, флегмона шеи, острый шейный лимфаденит,

окологлоточный абсцесс. Диагностируют ангину посредством анамнеза,

фарингоскопии и лабораторных исследований (бактериологических,

цитологических и т.д.). Больных ангиной необходимо по мере возможностей

оградить от контактов с другими людьми (особенно детьми), так как данное

заболевание относится к разряду острых инфекционных. Лечат ангину, как

правило, на дому. В качестве лечения используют антибиотики, местные

противомикробные препараты, жаропонижающие и общеукрепляющие средства.

В особо тяжелых случаях пациентов госпитализируют (Челенкова И.Н. и соавт.,

2010).

1.2. Патофизиология воспаления верхних дыхательных путей

Начальным отделом дыхательной системы является нос, который выполняет

несколько необходимых для организма человека функций: дыхательную,

обонятельную, защитную, увлажнения и согревания поступающего воздуха

(Пальчун В.Т., 2010).

16

Дыхательная функция носа это транспорт вдыхаемого и выдыхаемого воздуха.

Проходя через полость носа, воздушный поток испытывает сопротивление со

стороны внутриносовых структур. Приблизительно две трети всего

сопротивления приходится на область самого узкого места верхних дыхательных

путей, располагающегося на уровне переднего конца нижней носовой раковины –

носового клапана, оставшаяся одна треть – на подвижную часть преддверия носа

(Морозова С.В., Митюк А.М., 2011; Гуров А.В., Мужичкова А.В., 2014).

Степень носового сопротивления воздушному потоку обусловлена различными

факторами. В первую очередь носовая резистентность зависит от сосудов нижних

носовых раковин. Застой крови в пещеристых венозных сплетениях приводит к

набуханию раковин, которые увеличиваются в размерах, что приводит к сужению

просвета носового клапана, вплоть до полной обструкции полости носа. На

резистентность носа могут повлиять различные внешние факторы и

патологические процессы слизистой полости носа: воспаление, аллергические

реакции, гипервентиляция, вдыхание холодного воздуха и др. Резистеность носа

зависит от положения тела в пространстве – повышается в положении лежа. При

применении сосудосуживающих препаратов, физической нагрузке, атрофических

процессах в полости носа – снижается (Морозова С.В., Митюк А.М., 2011).

Воздушный поток, проходящий через обе половины носа, неравномерен. Чаще

всего у человека наблюдается цикличность изменений резистентности носа

воздушному потоку, проходящему через левую и правую половины носа, при

этом суммарное сопротивление остается постоянным. В слизистой оболочке

полости носа находится кавернозная венозная ткань, состоянием которой

регулируется прохождение воздушного потока через полость носа. При

увеличении размеров кавернозной ткани возникает сужение просвета носовых

ходов и сопротивление потоку воздуха повышается. Описанный процесс носит

название носового цикла (Лопатин А.С., 2010; Пискунов Г.З., Пискунов С.З.,

2006).

Носовой цикл – циклические изменения степени набухания слизистой

оболочки полости носа. Длительность носового цикла составляет в среднем от 1

17

до 6 часов. Классический носовой цикл состоит из фазы вазоконстрикции

(рабочей) и фазы вазодилатации (отдыха). При условии, если перегородка носа не

имеет выраженной деформации и находится по средней линии, изменение

резистентности воздушного потока является строго периодичным. В противном

случае происходит нарушение циклических изменений резистентности, что может

привести к развитию хронического ринита. Таким образом, формирование

половин полости носа, то есть парного органа является основной

физиологической функцией перегородки (Лопатин А.С., 2010; Пискунов Г.З.,

Пискунов С.З., 2006.).

Слизистая оболочка носа с момента рождения постоянно подвергается

воздействию различных факторов: инфекционных, химических, физических

(температура, влажность, газы и др.). В полости носа происходит увлажнение,

согревание и очищение вдыхаемого воздуха от бактерий, вирусов, грибковых

спор и взвешенных частиц. Таким образом выполняется одна из важнейших

функций полости носа – защитная (Лопатин А.С., 2010; Пискунов Г.З., Пискунов

С.З., 2006.).

Мукоцилиарный клиренс (от англ. clearance – очищение) – выведение

ринобронхиального секрета, которое обусловлено колебательными движениями

ресничек однослойного многорядного мерцательного эпителия слизистой

оболочки (Морозова С.В., Митюк А.М., 2011).

Мукоцилиарный транспорт – один из основных механизмов системы

местной защиты, обеспечивающий санацию дыхательных путей, необходимый

потенциал барьерной, иммунной и очистительной функции дыхательного тракта.

Очищение дыхательных путей от чужеродных частиц, бактерий, химических

веществ происходит благодаря оседанию их на слизистых оболочках и

последующему выведению вместе со слизью (Лопатин А.С., 2010; Пискунов Г.З.,

Пискунов С.З., 2006.).

Секрет – это постоянно обновляющийся фильтр. Верхний слой секрета

формируется главным образом за счет муцинов, 5–10% его составляют

нейтральные и кислые гликопротеины, обусловливающие вязкость бронхиального

18

секрета (это зависит в основном от внутри– и межмолекулярных дисульфидных и

водородных связей, при разрушении которых вязкость уменьшается), 0,3–0,5% –

липиды (фосфолипиды из альвеол и бронхиол) (Лопатин А.С., 2010; Ходзицкая

В.К., 2010) (таблица 1).

Источником образования бронхиального секрета являются бокаловидные

клетки, бронхиальные железы, эпителий терминальных бронхиол и альвеол.

Рисунок 2 – образование ринобронхиального секрета

(цит. по Ходзицкая В.К., 2010)

19

Таблица 1

Биологически активные вещества, входящие в состав ринобронхиального секрета

БАВ Место выработки/синтеза Функции

IgA функционально

активен в

проксимальных

отделах

респираторного

тракта

Плазматические клетки

респираторного тракта подавляет адгезию ряда бактерий к клеткам респираторного эпителия и

предотвращает массивное микробное заселение слизистых, чем снижает риск

развития респираторных инфекций;

активно участвует в регуляции иммунного ответа;

усиливает фагоцитоз;

потенцирует антибактериальные эффекты лизоцима и лактоферрина;

активирует систему комплемента по альтернативному пути;

подавляет NK–клеточную активность и антителозависимую клеточную

цитотоксичность.

имеет способность предотвращать репликацию вирусов. Его молекулы

могут соединяться с тканевыми и чужеродными белковыми агентами, удаляя их из

циркуляции и не давая образовываться аутоантителам.

IgG Плазматические клетки

респираторного тракта противомикробная защита дистальных отделов бронхиального дерева;

опсонизация и взаимодействие с компонентами системы комплемента,

ускорение фагоцитоза микробных клеток при взаимодействии IgG с Fc–

рецепторами на поверхности нейтрофилов, моноцитов, макрофагов и естественных

киллеров.

Лизоцим Тканевые макрофаги и

нейтрофилы

Расщепляет мукополисахариды и мукопептиды клеточной стенки множества

бактерий, действует как муколитический фермент, что обусловливает его

бактерицидное действие, и эффективно противостоит грибковой инвазии.

Лактоферрин белок Железистые клетки эпителия Связывает ионы железа, делая его недоступным для метаболизма железозависимых

бактерий; таким образом, действует бактериостатически и защищает ткани от

повреждающего действия гидроксильных радикалов.

Фибронектин Структурный белок.

Синтезируется практически

любыми видами клеток.

Предотвращает адгезию бактерий.

Интерфероны Макрофаги, В-лимфоциты. Противовирусная активность.

20

Реологические свойства ринобронхиального секрета

В соответствии с концепцией двухслойности секрета слизь состоит из

наружного гелеобразного слоя толщиной 2 мкм (гель) – и лежащего под ним

более жидкого слоя (золь) толщиной 2–4 мкм (Геппе Н.А., Малахов А.Б., 1999;

Мизерницкий Ю.Л. и соавт., 2011; Трушенко Н.В., 2011).

Золь обволакивает непосредственно слизистую оболочку; в нем "плавают" и

сокращаются реснички. Согласованные биения ресничек (16–17 раз в секунду)

способствуют продвижению и выведению секрета в проксимальном направлении.

В состав золя входят электролиты, сывороточные компоненты, местно

секретируемые белки, биологически активные вещества, ферменты и их

ингибиторы. По мере продвижения слизи секрет смешивается с содержимым

бокаловидных клеток и мукоидных желез, формируя гель.

Гель состоит из капель и комков слизи, осевших на поверхности золя.

Гликопротеины геля формируют фибриллярную структуру, представляющую

собой ячеистую сеть, "прошитую" водородными связями. Гель способен

перемещаться только после превышения предела текучести, т. е. тогда, когда

разрываются связанные между собой ригидные цепи (поперечные дисульфидные

и водородные связи) (Геппе Н.А., Малахов А.Б., 1999).

Рисунок 3 – Двухслойный секрет слизи

(цит. по Оковитый С.В., Анисимова Н.А., 2011)

21

Реснички имеют очень короткий период расслабления, они передают свою

кинетическую энергию наружному гелеобразному слою. Суточный объем

ринобронхиального секрета в среднем составляет 0,1–0,75 мл/кг массы тела. При

нормальной деятельности мукоцилиарной транспортной системы бактерии в

секрете движутся со скоростью 10 клеток слизистой бронхов за 1 с и за время

контакта с клеткой (до 0,1 с) не имеют возможности прикрепиться к эпителию

слизистой оболочки. Скорость мукоцилиарного транспорта у здорового человека

– примерно 4–20 мм в минуту. За сутки в норме транспортируется от 10 до 100 мл

секрета, который, попадая в глотку, проглатывается или выкашливается. Часть

бронхиального секрета поступает в бронхи из альвеол. Это в основном

фосфолипиды сурфактанта, образующегося в терминальных бронхиолах и

альвеолах. При нарушении мукоцилиарного клиренса в результате различных

заболеваний (инфекционных, аллергических и др.) наблюдаются клинические

проявления в виде кашля, отхождения вязкой слизистой мокроты, хрипов,

бронхиальной обструкции и одышки (Лопатин А.С., 2010; Пискунов Г.З.,

Пискунов С.З., 2006.; Рязанцев С.В., Кочеровец В.И., 2008).

Обонятельная функция слизистой оболочки носа обусловлена наличием

окончаний обонятельного нерва в области обонятельной щели. Взаимодействие

между молекулами пахучих веществ и рецепторами, которые находятся на

ресничках обонятельных клеток, возможно только при соединении с,

расположенными в слизи полости носа, обонятельными связывающими белками.

При проникновении молекул пахучего вещества в обонятельную область

происходит мозаичное возбуждение группы нейронов, характерной только для

конкретного запаха, то есть обонятельные нейроны взаимодействуют только с

определенным, запрограммированным для данной клетки набором пахучих

веществ (Савватеева Д.М., 2010).

При различных заболеваниях может происходить нарушение обоняния:

гипосмия (снижение обоняния) и гиперосмия (усиление обоняния). Данная

патология может быть результатом патологии окончаний обонятельного нерва

или может быть связана с нарушением доставки пахучих веществ к обонятельным

22

клеткам. В случае острого риносинусита характерным клиническим признаком

является гипосмия (Морозова С.В. и соавт., 2007; Рязанцев С.В., Кочеровец

В.И.,2008; Лопатин А.С., 2010).

Полость носа выполняет функцию согревания и увлажнения воздуха.

Поток вдыхаемого воздуха, проходя через полость носа, увлажняется и

согревается практически до температуры тела человека, что предотвращает

попадание холодного воздуха в нижние дыхательные пути.

Слизистая оболочка полости носа имеет своеобразное строение сосудов

(артериовенозные анастомозы, дроссельные вены, замыкательные артерии) и их

эндотелия, что обуславливает способность полости носа к терморегуляции. При

этом скоростью и объемом кровотока в полости носа регулируется сужение и

расширение полости носа и толщина слизистой оболочки в ответ на изменения

температуры и условий окружающей среды (Молдавская А.А. и соавт., 2005;

Молдавская А.А. и соавт., 2006) (таблица 2).

Несмотря на происходящее увлажнение поступающего воздуха на всем

протяжении дыхательного тракта вплоть до долевых бронхов, основным отделом,

где осуществляется регуляция влажности, является полость носа. Таким образом

именно носовая полость обеспечивает оптимальные условия для газообмена в

легких (Лопатин А.С., 2010; Пискунов Г.З., Пискунов С.З., 2006.; Рязанцев С.В.,

Кочеровец В.И., 2008).

23

Таблица 2

Изменения в полости носа в ответ на различные патологические процессы

Патологический процесс Сосудистая реакция в

носовой полости

Результат/клинические

проявления

Вирусная или бактериальная

инфекция

Реакция вазодилатации Максимальное

повышение

поверхностной

температуры слизистой

оболочки

Повышение давления в

сосудах

микроциркуляторного русла

Ускорение кровотока Местная гиперемия

Аллергический и

вазомоторный риниты

Застой венозной крови

в пещеристых сосудах

носовых раковин

Незначительное

повышение

поверхностной

температуры слизистой

оболочки

Атрофический ринит Нарушение

кровообращения в

слизистой оболочке в

связи с

патологическими

изменениями стенок

сосудов по типу

облитерирующего

эндартериита

Ухудшение

кровоснабжения,

нарушение

микроциркуляции,

понижение температуры

слизистой оболочки

Физиологическая роль носового дыхания

При вдохе воздушный поток проходит носовой клапан, закручиваясь при этом

в спираль, затем турбулентное вихреобразное движение становится ламинарным,

и поток воздуха идет к хоане по кривой линии в общем носовом ходе вдоль

средней носовой раковины. При этом в верхних дыхательных путях при помощи

мышц грудной клетки создается отрицательное давление, которое приводит к

выходу части согретого увлажненного воздуха из околоносовых пазух и

присоединению его к воздушному потоку, идущему в легкие. При выдохе через

хоану воздух попадает в полость носа и распространяется во все носовые ходы, но

значительная часть потока воздуха при этом идет через общий носовой ход на

уровне нижней носовой раковины. В полости носа создается положительное

24

давление, благодаря чему часть выдыхаемого воздуха направляется обратно в

околоносовые пазухи.

Если дыхание осуществляется через рот, то сопротивление воздушному потоку

меньше, что приводит к исчезновению разницы между отрицательным и

положительным давлением в грудной и брюшной полостях, необходимой для

нормального функционирования сердечно–сосудистой системы. При дыхании

через рот вентиляция легких уменьшается на 25–30%, что в значительной мере

влияет на насыщение крови кислородом и углекислым газом (Лопатин А.С., 2010;

Пискунов Г.З., Пискунов С.З., 2006.; Рязанцев С.В., Кочеровец В.И., 2008).

1.3. Экспериментальные модели заболеваний верхних дыхательных путей

При анализе литературных данных обращает на себя внимание, что в 50-х –

80-х годах прошлого века наиболее актуальными вопросами экспериментальной

фармакологии в отношении дыхательной системы были инфекционные (гнойные)

заболевания (Козлов В.А. и соавт., 1982; Херобян Ф.А., 1954; Шапиро М.Я., 1965;

Файзулин М.Х., Михайлов М.К., 1971; Единак Е.Н. и соавт., 1985). Такой интерес

был связан с высокой заболеваемостью в те годы гнойными заболеваниями, что, в

свою очередь, было связано с недостаточно широкой распространенностью

антибиотиков для лечения инфекционных заболеваний и не все эффекты

антибактериальных препаратов были известны на тот момент.

Для формирования экспериментальных моделей ученые тех лет выбирали

крупных животных (кролики, собаки, кошки), что было обусловлено

недостаточным количеством методов диагностики экспериментальной патологии

у животных (таблица 3).

25

Таблица 3

Экспериментальные модели риносинуситов

№ Литературный

источник

Вид

экспериментальной

патологии

Модельные условия

Вид

экспериментальн

ых животных

1. Johansson P.,

Kumlien J. et al.,

1988

Односторонний

гнойный синусит

Вскрытие и обтурация

верхнечелюстной

пазухи, введение

культуры Streptoccocus

pneumonia.

Кролики

2. Козлов В.А. и

соавт., 1982

Хронический синусит Удаление IV зуба,

извлечение корневой

пульпы и перфорация

дна челюстной пазухи.

Собаки

3. Херобян Ф.А.,

1954

Фронтит Введение в лобные

пазухи химических

веществ через

хлорвиниловую трубку:

нашатырный спирт,

скипидар, 96% винный

спирт.

Собаки

4. Шапиро М.Я.,

1965

Фронтит Инфицирование лобных

пазух через

просверленное

отверстие в передней

стенке пазухи

эмульсией суточной

культуры золотистого

стафилококка.

Кошки

5 Единак Е.Н. и

соавт., 1985

Синусит (гайморит) Вскрытие

верхнечелюстных

пазух, введение в

отверстие

полихлорвиниловой

канюли в виде

трубочки, введение в

пазухи 4–5 капель

нашатырного спирта.

Через 1 час введение

взвеси суточной

бульонной культуры

золотистого

стафилококка

Кролики

шиншилла

6 Файзулин М.Х.,

Михайлов М.К.,

1971

Фронтит Монтаж смотровой

трубки из плексиглаза

диаметром 14 мм в

лобную пазуху.

Введение суточной

бульонной культуры

золотистого

стафилококка

Собаки

26

В современной науке эффективность антибактериальной терапии весьма

велика, и гнойные синуситы достаточно быстро вылечиваются. Но, в то же время,

на передний план выходят риниты с аллергической компонентой, в силу чего

абсолютное большинство современных экспериментальных исследований

заболеваний верхних дыхательных путей посвящено аллергическому риниту. На

сегодняшний день распространенность аллергического ринита составляет от 1 до

40%. В большинстве европейских стран 10—25% населения страдают

аллергическим ринитом (Bousquet J. et al., 2001; Ильина Н.И., Польнер С.А., 2001;

Bousquet J. et al., 2008).

В экспериментальной фармакологии появилось значительное количество

методов диагностики экспериментальной патологии и эффективности препаратов,

используемых для лечения данных заболеваний, что позволяет использовать в

исследованиях мелких лабораторных животных.

Основными критериями оценки экспериментального аллергического ринита

является:

Клинические проявления (почесывание, чихание, истечение из носа)

(Yamasaki M. et al., 2002, Ying-Ying Xu et al., 2012; Qiang-Min Xie et al., 2006).

Гистологическая оценка тканей носовых ходов (Yamasaki M. et al., 2002;

KleinJan A. et al., 2006; Hyo Won Jung et al., 2012; Qiang-Min Xie et al., 2006; Fortin

M. et al., 2010).

Оценка клеточного состава, а также медиаторов воспаления в смывах из

носовых ходов (Yamasaki M. et al., 2002; Wang H. et al., 2007; Guibas G.V. et al.,

2013).

Появились принципиально новые современные методы диагностики

экспериментальной патологии (таблица 4):

Измерение удельного сопротивления дыхательных путей.

Иммуногистохимические исследования слизистой оболочки

дыхательных путей.

ПЦР-диагноcтика.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wang%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23934070

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Guibas%20GV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23307410

27

Таблица 4

Экспериментальные модели аллергического ринита

№ Литературный

источник Вид патологии

Повреждающий

агент

Вид

животных

Клинические


Оценка

клеточного

состава смыва

из носовой

полости

Оценка

медиаторов

воспаления

в носовой

полости

(смыв)

Гистологи

ческая

оценка

тканей

носовых

ходов

Измерение

удельного

сопротивления

дыхательных

путей

1

Yamasaki M.

et al., 2002

Аллергический

ринит

Экстракт

пыльцы кедра,

анти-

интерлейкин-5

антитела

(TRFK5)

Морские

свинки + + + + +

2 KleinJan A. et

al., 2006


ринит Овальбумин Мыши - + + + -

3

Hyo Won

Jung, 2012


ринит Овальбумин

Мыши Balb/c

и крысы

Sprague-

Dawley(SD)

- - - + -

4 Ying-Ying Xu

et al., 2012



Крысы

Sprague

Dawley (SD)

+ - + - -

5 Qiang-Min Xie

et al., 2006



Крысы

Sprague

Dawley (SD)

+ + + + +

6 Fortin M. et

al., 2010



Крысы Brown

Norway (BN) - - + + -

7 Vishnu N. et

al., 2013



Морские

свинки + - + + -

8 Oh H.A. et

al.,2014


ринит Овальбумин Крысы - - + - -

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Oh%20HA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24131540

28

Продолжение таблицы 4

№ Литературны

й источник Вид патологии

Повреждающий

агент

Вид

животных

Клинические


Оценка

клеточного

состава смыва

из носовой

полости

Оценка

медиаторов

воспаления

в носовой

полости

(смыв)

Гистологи

ческая

оценка

тканей

носовых

ходов

Измерение

удельного

сопротивления

дыхательных

путей

9 Wang H. et

al.,2007



Крысы

Sprague

Dawley (SD)

+ + + - -

10 Juneja L.,

Parmar H.S.,

2013


ринит Овальбумин Крысы - - + - -

11 Guibas G.V. et

al., 2013


ринит Овальбумин Крысы - + + - -

12 Li Y., Chen X.

2012



Крысы

Sprague

Dawley (SD)

- - - + -

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Juneja%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23477548

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Parmar%20HS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23477548

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Guibas%20GV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23307410

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Li%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23272499

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chen%20X%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23272499

29

Также существуют данные о широком использовании морских свинок в

качестве тест-систем для моделирования аллергических заболеваний, таких как:

Бронхиальная астма;

Аллергический ринит;

Аллергический конъюнктивит;

Пищевая аллергия;

Контактный дерматит.

Это обусловлено тем, что:

активация гистаминовых H1-рецепторов у морских свинок вызывает

мощный спазм гладкой мускулатуры бронхов, что делает возможным

изучение анафилактического шока;

у морских свинок высокий уровень анафилактических антител;

у морских свинок наблюдается мощный аллергический ответ как

немедленного, так и замедленного типов;

характерной чертой аллергического воспаления в легких как у

человека так и морской свинки является эозинофилия.

структура эпителия трахеи морской свинки имеет сходное строение с

эпителием трахеи человека по плотности расположения ресничек

мерцательного эпителия по данным электронной микроскопии.

Таким образом, по литературным данным показано, что для моделирования

воспалительного ответа могут использоваться разные виды экспериментальных

животных и многообразные методы оценки патологии.

На сегодняшний день воспаление лимфатических узлов у животных

моделируют различным путем, в зависимости от расположения целевых узлов,

например, путем инъекции раствора конковалина А в подушечку задней лапы –

подколенные лимфатические узлы (Kanagawa M. et al., 2003), введение 10 мкг или

20 мкг липополисахарида непосредственно в подколенные лимфоузлы (Mattacks

C.A. et al., 2003).

30

Мезентериальные лимфадениты возникают у крыс как следствие

заболеваний брюшной полости, например, гранулеметозного колита (Sogawa M. et

al., 2003), кишечной непроходимости (Akyildiz M. et al., 2000).

Воспалительные реакции в подчелюстной, околоушной и слезных железах

развивается у крыс как реакция отторжения в исследованиях имплантов

(Peszkowski M.J. et al., 1996).

Системный лимфаденит возникает у крыс при введении 7,12-

диметилбенз(а)антрацена (Corning B.F. et al., 1991).

Выраженный иммунный ответ шейных лимфатических узлов в виде

увеличения продукции Ig Е возникает в ответ на сенсибилизацию овальбумином

(Ahlstedt S. et al., 1985).

Оценку противовоспалительного и иммунного ответа лимфатических узлов

оценивают по массе пораженных узлов (Quigley R.L., 1994), оценке концентрации

медиаторов воспаления (Morishita K. et al., 2014).

Однако в доступной литературе не удалось найти сведений об

экспериментальных моделях шейного лимфаденита у животных, сопоставимых с

ангиной человека.

1.4. Лечение заболеваний верхних дыхательных путей

Лечение воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей в целом,

без учета особенностей каждой конкретной болезни, сводится к следующим

мероприятиям:

• уменьшение отека слизистой и восстановление проходимости

дыхательных путей. С этой целью применяют -симпатомиметики, которые,

обладая выраженным сосудосуживающим действием, снижают трофические

процессы в слизистой носа, могут оказывать системное влияние на артериальное

давление;

• применение местных противомикробных средств (мазей, спреев и т.д.).

Эти средства эффективны на ранних стадиях заболевания. На более поздних

стадиях они дополняют и усиливают (а в некоторых случаях и заменяют)

системную антибиотикотерапию. Антибиотики местного действия, используемые

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Morishita%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24553526

31

для лечения ринитов, высокоактивны в отношении Staphylococcus aureus, однако,

они способствуют развитию дисбактериоза в полости носа и возникновению

вторичной инфекции (Электронный ресурс: http://www.vidal.ru/);

• подавление патогенной бактериальной флоры (системная

антибиотикотерапия) Побочные эффекты на фоне применения системных

антибиотиков наблюдаются нередко, особенно со стороны желудка и кишечника.

Некоторые побочные эффекты потенциально жизнеопасны – в частности,

удлинение интервала QT, наблюдающееся при применении макролидов и

некоторых фторхинолонов. Аллергические реакции при применении

пенициллинов имеют место примерно в 5% случаев. Некоторые аллергические

реакции наблюдаются редко, но потенциально фатальны – например, синдром

Стивенса-Джонсона на фоне применения ко-тримоксазола. Наконец, избыточное

применение системных антибиотиков способствует возникновению и

распространению в популяции резистентных штаммов микроорганизмов, в

частности, наиболее значимых респираторных патогенов – Streptococcus

pneumoniae и Streptococcus pyogenes;

• устранение застоя слизи в полостях верхних дыхательных путей. С этой

целью используются муколитики на основе карбоцистеина или ацетилцистеина, а

также препараты растительного происхождения (Коваленко С.Л., 2010).

• при воспалительных процессах немикробного происхождения показаны

интраназальные препараты, содержащие глюкокортикоиды. Поскольку

глюкокортикоиды довольно хорошо всасываются, возможно проявление их

резорбтивного действия.

Побочные эффекты многих современных препаратов синтетического

происхождения для интраназального применения связаны с тем, что в их

производстве нередко используются вспомогательные вещества, обладающие

высокой цитотоксической активностью (бензалкония хлорид), а также основы,

применение которых приводит к высушиванию слизистых оболочек

(полиэтиленоксиды) (Лесиовская Е.Е. и соавт., 2000).

32

В настоящее время массовый характер носит применение препаратов,

относящихся к группе комбинированных средств для устранения симптомов ОРЗ

и «простуды», таких как Антигриппин, Фервекс, Колдрекс и т.д. (Крюков А.И.,

Туровский А.Б., 2005; Лучшева Ю.В., Изотова Г.Н., 2011; Лучихин Л.А. и соавт.,

2013) Фармакологическое действие этой группы препаратов определяется

компонентами, входящими в их состав. Парацетамол оказывает

жаропонижающее, анальгезирующее, сосудосуживающее действие, устраняет

симптомы «простуды». Фенилэфрин суживает сосуды носа, устраняет отёк

слизистой оболочки полости носа и носоглотки. Аскорбиновая кислота

восполняет дефицит витамина С при «простудных» заболеваниях.

Таким образом, основной эффект данной группы препаратов обусловлен

Парацетамолом, относящимся к классу ненаркотических анальгетиков и

нестероидных противовоспалительных средств (Электронный ресурс:

http://www.vidal.ru/).

Нестероидные противовоспалительные средства относятся к большой

фармакологической группе, в которую входит более 70 разных химических

соединений. По данным ВОЗ около 20 % населения нашей планеты регулярно

принимают НПВС.

Механизм действия НПВС весьма сложен. Жаропонижающее действие

(сопровождающееся увеличением теплоотдачи из-за расширения сосудов кожи и

усиленного потоотделения) в значительной мере сопряжено с успокаивающим

влиянием на измененную под воздействием патологического процесса

возбудимость теплорегулирующих центров промежуточного мозга (Белоусов

Ю.Б. и соавт., 1997; Харкевич Д.А., 2010).

Противовоспалительный эффект НПВС связан с влиянием на разные звенья

регуляции гемостаза.

Одним из основных элементов их действия является нормализующее

влияние на повышенную проницаемость капилляров и на процессы

микроциркуляции. Некоторые НПВС уменьшают влияние на проницаемость

сосудов брадикинина, гистамина и иных биогенных веществ (медиаторов

33

воспаления). Они тормозят также активность некоторых ферментов, участвующих

в образовании медиаторов воспаления. Препараты этой группы тормозят

образование АТФ и уменьшают, таким образом, энергетическое обеспечение

биохимических процессов, играющих роль в воспалении (увеличивающих, в

частности, сосудистую проницаемость и миграцию лейкоцитов). По всей

вероятности, определенное значение в улучшении микроциркуляции имеет

фибринолитическая активность индометацина, производных пиразолона и т.д. Не

исключено, что в механизме действия НПВС играет роль иммуносупрессивный

эффект.

Важным в механизме действия НПВС является их ингибирующее влияние

на синтез простагландинов – биогенных веществ, имеющих большое значение в

развитии воспаления и болевого синдрома, причем противовоспалительная

активность часто коррелирует с силой этого ингибирующего эффекта.

Характерным для действия этих препаратов является стабилизирующее

влияние на мембраны лизосом и как следствие – торможение клеточной реакции

на флогогенное раздражение.

Основной механизм действия НПВС заключается в угнетении фермента

циклооксигеназы (ЦОГ), ответственной за синтез простагландинов,

простациклинов и тромбоксанов, играющих основную роль в развитии

воспалительного процесса (Страчунский Л.С., Козлов С.Н., 2008; Игнатов Ю.Д. и

соавт., 2010).

Описано три различных изофермента ЦОГ:

ЦОГ-1 является конститутивным (естественным) ферментом во многих

тканях, например, она регулирует синтез гомеостатических и цитопротекторных

простагландинов в слизистой ЖКТ, эндотелии, тромбоцитах и канальцах почек.

ЦОГ-2 является естественной для костной ткани, половых желез,

юкстагломерулярного аппарата почек, но продукция данного фермента

увеличивается под влиянием бактериальных токсинов, факторов роста, цитокинов

и катализирует синтез провоспалительных простагландинов, ведущих к развитию

воспаления (Stables M., Gilroy D., 2011).

34

Недавно описанная ЦОГ-3 является ферментом нервной системы и, по-

видимому, участвует в процессах регуляции температуры тела, влияя на синтез

простагландинов в гипоталамусе.

Современная классификация НПВС основана на их селективности

воздействия на ЦОГ, как одно из ведущих звеньев процесса воспаления.

А. Селективные ингибиторы ЦОГ-1 (низкие дозы ацетилсалициловой

кислоты).

Б. Ингибиторы ЦОГ-1 и ЦОГ-2 (большинство НПВС).

В. Селективные ингибиторы ЦОГ-2 (нимесулид, мелоксикам, этодолак).

Г. Высокоселективные ингибиторы ЦОГ-2 (целекоксиб, рофекоксиб,

вальдекоксиб, парекоксиб, люмирококсиб).

Д. Ингибиторы ЦОГ-3 (парацетамол).

Основные фармакологические эффекты НПВС включают в себя:

- противовоспалительный – обусловленный уменьшением проницаемости

сосудистой стенки и снижением ее чувствительности к гистамину, серотонину,

брадикинину, которые вызываются простагландинами;

- антипиретический (жаропонижающий) – вследствие снижения

чувствительности гипоталамических центров к действию вторичных пирогенных

веществ, например интерлейкина-1;

- анальгетический (обезболивающий) – вследствие увеличения порога

болевой чувствительности ноцицепторов.

Также НПВС способны оказывать антиагрегантное действие посредством

угнетения синтеза тромбоксана А2 в тромбоцитах, причем это свойство наиболее

выражено у ацетилсалициловой кислоты, вследствие присущему только ей

свойству угнетать ЦОГ-1 тромбоцитов необратимо (в отличие от других НПВС),

что позволяет добиться пролонгирования антиагрегантного эффекта и нашло свое

применение в практике кардиологов и невропатологов.

НПВС являются одной из самых назначаемых групп лекарственных средств.

Они показаны при воспалении мягких тканей, опорно-двигательного аппарата,

после операций и травм, при неспецифических поражениях миокарда,

35

паренхиматозных органов, аднексите, проктите, ревматических заболеваниях

(ревматоидный артрит, ювенильные артриты, ревматизм, анкилозирующий

спондилит, болезнь Стилла, синдром Рейтера, системная красная волчанка,

фибромиалгии), псориатическом артрите, тендовагинитах, меналгиях,

периодонтитах и др. НПВС крайне широко используют для симптоматической

терапии болевого синдрома различного генеза и лихорадочных состояниях

(Celotti F., Laufer S., 2001).

Однако чрезмерное и длительное применение в качестве терапии НПВС

является мощным фактором, оказывающим влияние на функциональную

активность иммунной системы, вызывая либо активацию всей системы или ее

отдельных звеньев, либо ее супрессию, что, в свою очередь, может приводить к

развитию иммунологической недостаточности (Garcia Rodriguez L. at al., 2008;

Bertolini A. et al., 2001; Kumar K., 2011).

В процессе лечения НПВС у больных развивается вторичный

иммунодефицит, приводящий к более легкому заражению инфекциями и их

тяжелым течением.

Использование лекарственного растительного сырья в лечении этих

заболеваний весьма актуально, так как препараты растительного происхождения

не обладают иммуносупрессивным действием.

В настоящее время терапия препаратами природного происхождения

широко используется в мировой медицинской практике. Такие препараты находят

применение для лечения и профилактики, а также в комплексной терапии

заболеваний верхних дыхательных путей (Позднякова М.Г. и соавт., 2011; Ciuman

R.R., 2012; Прилепина И.А., 2013; Руженцова Т.А. и соавт., 2014; Лавренова Г.В.,

Баранская С.В., 2014).

Известно множество лекарственных средств на основе экстрактов

растительного происхождения, разрешенные для медицинского применения.

Противовоспалительные вещества растительного происхождения

Фрешнос – новый растительный препарат, содержащий экстракты:

- травы тысячелистника обыкновенного;

36

- листьев шалфея лекарственного;

- травы зверобоя продырявленного;

- побегов багульника болотного.

Активность и лечебные эффекты тысячелистника определяют эфирное

масло, в составе которого преобладают сесквитерпеновые лактоны и их

производные – азулены (Коновалов Д.А. и соавт., 1990; Яцюк В.Я., 1996;

Коновалов Д.А., 2000, Платонов В.В. и соавт., 2014), флавоноиды, кумарины,

каротиноиды, макро- и микроэлементы (Попов А.И., Попков В.А. 1992; Платонов

В.В. и соавт., 2014). При этом противовоспалительные свойства обусловливают

сесквитерпеновые лактоны и продукт их превращения – хамазулен, а также сумма

флавоноидов, особенно апигенин, лютеолин, кверцетин, рутин, гиперозид,

кверцитрин, изокверцитрин и их гликозиды (Барабой В.А., 1984; Саратиков А.С. и

соавт., 1986; Сербин А.Г. и соавт., 1987, Платонов В.В. и соавт., 2014, Keser S. et

al., 2013).

В листьях шалфея содержатся эфирное масло (примерно 0,5–2,5%),

флавоноиды, алкалоиды, дубильные вещества, тритерпеноиды шалфея

флавоноиды, алкалоиды, дубильные вещества, тритерпеноиды (урсоловая и

олеаноловая кислоты), уваол и парадифенол. В состав эфирного масла входят:

цинеол, туйон, пинен, сальвен, борнеол, камфора и цедрен. Из сырья выделены

флавоноиды: ацетилпектолинарин, пектолинарин, лютеолин, цинарозид,

лютеолин-7--D-глюкуронид, апигенин, космосиин, апигенин-7--D-ксилозид,

термопсозид, хризоэриол-7--D-глюкуронид, хризоэриол-7--D-ксилозид

(Смирнова Л.П., 1976). Антибактериальную и антивирусную активность шалфея

определяют, в основном, флавоноиды и терпеноиды (Платонов В.Г. и соавт., 1995;

Коваленко Н.А., 2010; Kozics К. et al., 2013).

Химический состав зверобоя продырявленного отличается большим

разнообразием. В нем обнаружено несколько групп биологически активных

веществ, обладающих противовоспалительным (флавоноиды, дубильные

вещества), антибактериальным (гиперицин и другие конденсированные

антраценпроизводные; фенолкарбоновые кислоты, тритерпеноиды),

37

иммуномодулирующим действием. Кроме того, флавоноиды, а также катехины и

антоцианы проявляют Р-витаминную активность, нормализуя проницаемость

кровеносных капилляров (Соколов С.Я., Замотаев И.П., 1993; Huang N. et al.,

2011; Altun L. et al., 2013).

В состав эфирного масла багульника входят: ледол, палюстрол,

геранилацетат, мирцен, п-цимол, -пинен. В побегах также имеются дубильные

вещества, смолы, фитонциды, кверцетин, арбутин, аскорбиновая кислота (170-190

мг%), уваол, тараксерол, урсоловая кислота, (Соколов С.Я., Замотаев И.П., 1993;

Bozin B. et al., 2007; Rašković A. et al., 2014).

В качестве вспомогательных веществ в состав препарата входит мятное

эфирное масло, которое используется при воспалительных заболеваниях верхних

дыхательных путей в виде смазываний, ингаляций и капель для носа и тимол – 2-

изоприл-5-метилфенол, который часто применяется как антисептическое

средство.

Таким образом, основными действующими веществами исследуемого

препарата, являются летучие компоненты эфирных масел и флавоноиды, которые

обеспечиваю широкий спектр фармакологических эффектов данного препарата.

КЛС-04

КЛС-04 разработан на основе пептидно-фосфолипидного комплекса,

выделенного из печени рыб семейства тресковых.

В настоящее время продукты переработки гидробионтов, в том числе и

рыбы, все больше привлекают ученых не только как пищевые продукты для

людей и животных, а также как источники уникальных пептидов, обладающих

широким спектром биологической активности (Helmy M. et al., 2001; Nayak, A. K.,

2010; Khora S.S., 2013).

Следует отметить, что большинство гидробионтов на протяжении всей

своей жизнедеятельности, как правило, не подвержены активной миграции, т.е.

локализованы на одном участке среды обитания. Следовательно, не могут

активно избегать неблагоприятных воздействий. Поэтому у гидробионтов

эволюционно на протяжении миллионов лет вырабатывались защитные

http://pubs.acs.org/action/doSearch?ContribStored=Bozin%2C+B

38

механизмы, позволяющие им защищаться от воздействия микробов, вирусов,

эукариотических организмов, неблагоприятных физико-химических факторов,

которые могли бы возникать вследствие избыточно возраставшего количества

особей своего вида на единицу занимаемой площади (объёма) или

неблагоприятного физико-химического воздействия других организмов. В

широком понимании, у гидробионтов возникла система «гигиенической» защиты,

которая также включает защиту от патогенов (Sepčić K., Turk T., 2006).

Поскольку морская среда обитания является достаточно жесткой и

агрессивной, морские организмы вынуждены продуцировать вещества с

огромным спектром биологической активности. В связи с этим, гидробионты

являются прекрасным источником биологически активных соединений (Carté

B.K., 1993; Elias R.J. et al., 2008; Kim S.K, Wijesekara I., 2010; Khora S.S., 2013).

Для многих веществ морского биогенеза характерна химическая структура

отличная от соединений, полученных из растений и животных. При этом часто

вещества морского происхождения оказывают существенно больший эффект, чем

известные вещества из растений и животных суши (Pomponi S.A., 1999; Bhakuni

D.S., Rawat D.S., 2005; Khora S.S., 2013).

На сегодняшний день по литературным данным известно множество

фармакологических эффектов гидролизатов разных видов рыб (таблица 5).

Учитывая вышесказанное, представлялось актуальным разработать

экспериментальные модели острого риносинусита и шейного лимфаденита.

Охарактеризовать и валидировать данные модели по наиболее информативным

показателям.

На экспериментальных моделях изучить новые лекарственные средства, на

основе природных компонентов, предназначенные для лечения воспалительных

заболеваний верхних дыхательных путей в сравнении с зарегистрированными в

РФ лекарственными средствами.

39

Таблица 5

Известные фармакологические эффекты пептидных/белковых субстанций,

полученных путем переработки гидробионтов

Эффект Литературный источник

Антигипертензивное действие

Sugiyama K. et al., 1991

Matsui T. et al., 1993.

Jeon Y.J. et al., 1999

Bordenave S. et al., 2002

Je J.Y. et al., 2004

Jung W.K. et al., 2006

Cinq-Mars C.D. et al., 2008

Khora S.S., 2013

Антикоагулянтное и

антритромботическое действия

Fujita H, Yoshikawa M., 1999

Rajapakse N. et al., 2005

Je J.Y. et al., 2004


Kim S.K, Wijesekara I., 2010

Khora S.S., 2013

Антиоксидантное действие

Jeon Y.J. et al., 1999

Jun S.Y. et al., 2004


Elias R.J. et al., 2008

Klompong V. et al., 2009

Khora S.S., 2013

Иммуномодулирующий эффект

Gildberg A. et al., 1996

Jun S.Y. et al., 2004


Khora S.S., 2013

40

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Исследуемые препараты

Фрешнос

Производитель: "Scandic Pharma Oy" (Финляндия).

Торговое патентованное название препарата: «Fresh Nose» (Certificate of

registration No 009707811).

Лекарственная форма: капли назальные.

Состав: Трава тысячелистника обыкновенного, листья шалфея

лекарственного, трава зверобоя продырявленного, побеги багульника болотного,

спирт этиловый, масло оливковое, димексид, тимол, масло мяты перечной.

Фармакотерапевтическая группа:

Антиконгестант. Капли в нос.

Фармакологические свойства: обладает противовоспалительным и

противоотечным действием.

Фармакодинамика: Препарат обладает противовоспалительным,

противомикробным и противовирусным действием, усиливает репаративные

процессы, оказывает местный иммуностимулирующий эффект. Даже при

длительном применении хорошо переносится, не вызывает повреждений

слизистой.

Фармакокинетика. Определение фармакокинетики фрешноса не

представляется возможным в связи с большим набором различных биологически

активных веществ, входящих в состав компонентов препарата.

Показания к применению: Острые и хронические воспалительные процессы

слизистой носа и околоносовых пазух.

Противопоказания: Не применять при повышенной чувствительности к

ментолу или другим компонентам препарата. Не назначать детям младше двух

лет.

41

Способ применения и дозы: Закапывать в обе ноздри по 1–3 капли

несколько раз в день. Детям по 1–2 капле 3–4 раза в день.

Побочное действие: Иногда непродолжительное ощущение жжения.

Передозировка: Не выявлено.

Взаимодействие с другими лекарственными средствами: Не выявлено.

КЛС-04

Лекарственная форма: раствор 0,1% в виде дозированного спрея для

местного применения

Состав: 0,1% раствор содержит в качестве действующего вещества 1 мг

пептидно-фосфолипидного комплекса (7–10 кДа), а в качестве вспомогательных

веществ: 50 мг полиоксиэтиленгликоля 660 гидроксистеарат, 7,6 мг хлорида натрия,

1мг метилпарабена, 0,2 мг пропилпарабена, 100 мг спирта этилового и воду для

инъекций до 1 мл.

Основные идентифицированные фосфолипиды:

фосфатидилхолин – пальмитиновую (23,0%), эйкозапентаеновую

(14,5%) и олеиновую кислоты (11,9%);

фосфатидилэтаноламин – эйкозапентаеновую (14,0%), олеиновую

(12,8%) и пальмитиновую (10,2%) кислоты;

фосфатидилинозитол – стеариновую (17,8%), олеиновую (15,7%),

эйкозапентаеновая (10,9%) и пальмитиновую (10,8%) кислоты.

Предполагаемая фармакотерапевтическая группа: противовоспалительное

средство.

Предполагаемые фармакологические свойства: обладает

противовоспалительным, противомикробным и противовирусным действием,

усиливает репаративные процессы.

Показания к применению:

Воспалительные заболевания полости рта и ЛОР-органов:

— гингивит, глоссит, стоматит (в т.ч. после лучевой и химиотерапии);

— ангина, фарингит, ларингит, тонзиллит;

42

— после оперативных вмешательств и травм (в т.ч. тонзиллэктомия,

переломы челюсти);

— после лечения или удаления зубов;

— пародонтоз.

Способ применения и дозы: распыление в ротовой полости и на заднюю

стенку глотки по 1 дозе (0,2 мл) 4–8 доз спрея каждые 1,5–3 ч.

Побочное действие: возможны аллергические реакции на отдельные

компоненты препарата.

Передозировка: Не выявлено.

Взаимодействие с другими лекарственными средствами: Не выявлено.

Условия и сроки хранения: Препарат следует хранить в защищенном от

света, недоступном для детей месте при температуре не выше 25°С.

Тантум верде

Серия: № R000402

Годен до: 05.2013 г.

Производитель: Си Эс Си Лтд. (Италия).

Лекарственная форма: спрей д/местного применения дозированный 255

мкг/1 доза: фл. 30 мл (176 доз).

Состав: бензидамина гидрохлорид 1 доза – 255 мкг.

Вспомогательные вещества: этанол 96%, глицерол,

метилпарагидроксибензоат, ароматизатор ментоловый, сахарин, натрия

гидрокарбонат, полисорбат 20, вода очищенная.

Фармакологическое действие: НПВС из группы индозолов для местного

применения в ЛОР-практике и в стоматологии. Оказывает противовоспалительное

и местное анальгезирующее действие. Механизм действия препарата связан со

стабилизацией клеточных мембран и ингибированием синтеза простагландинов.

При местном применении препарат хорошо абсорбируется через слизистые

оболочки и проникает в воспаленные ткани.

Фармакокинетика: Бензидамин выводится почками и через кишечник.

http://www.vidal.ru/drugs/company/203

43

Показания:

Воспалительные заболевания полости рта и ЛОР-органов:

— гингивит, глоссит, стоматит (в т.ч. после лучевой и химиотерапии);

— ангина, фарингит, ларингит, тонзиллит;

— кандидоз (в составе комбинированной терапии);

— калькулезное воспаление слюнных желез;

— после оперативных вмешательств и травм (в т.ч. тонзиллэктомия,

переломы челюсти);

— после лечения или удаления зубов;

— пародонтоз.

При инфекционно-воспалительных заболеваниях необходимо применение

тантум Верде в составе комбинированной терапии.

Режим дозирования:

Таблетки для рассасывания назначают по 1 таб. 3–4 раза/сут.

Раствор для местного применения применяют по 1 столовой ложке (15 мл)

препарата для полоскания рта или горла каждые 1,5–3 ч для облегчения боли.

После полоскания раствор необходимо выплюнуть.

Взрослым (в т.ч. лицам пожилого возраста) назначают по 4–8 доз спрея

каждые 1,5–3 ч. Детям в возрасте 6–12 лет – по 4 дозы; детям младше 6 лет дозу

устанавливают из расчета по 1 дозе на каждые 4 кг массы тела (максимально 4

дозы) каждые 1,5 – 3 ч.

Побочное действие:

Местные реакции: сухость во рту, чувство онемения, жжения в ротовой

полости.

Аллергические реакции: кожная сыпь.

Прочие: сонливость.

Противопоказания к применению:

— детский возраст до 12 лет (для раствора для местного применения);

— фенилкетонурия (для таблеток);

— повышенная чувствительность к компонентам препарата.

44

Применение при беременности и кормлении грудью: Возможно применение

препарата при беременности и в период лактации (грудного вскармливания) по

показаниям.

Применение у детей: Препарат противопоказан детям до 12 лет (для

раствора для местного применения). Детям в возрасте 6–12 лет – по 4 дозы; детям

младше 6 лет дозу устанавливают из расчета по 1 дозе на каждые 4 кг массы тела

(максимально 4 дозы) каждые 1,5–3 ч.

Особые указания: Следует избегать попадания спрея в глаза. Если при

применении раствора возникает ощущение жжения, то раствор следует разбавить

водой в 2 раза путем доведения уровня воды до риски в градуированном

стаканчике.

Передозировка: В настоящее время о случаях передозировки препарата

Тантум Верде не сообщалось.

Лекарственное взаимодействие: Клинически значимое лекарственное

взаимодействие препарата Тантум Верде не установлено.

Условия отпуска из аптек: Препарат разрешен к применению в качестве

средства безрецептурного отпуска.

Условия и сроки хранения: Препарат следует хранить в защищенном от

света, недоступном для детей месте при температуре не выше 25°С. Срок

годности – 4 года.

Диклофенак

Серия №: R000402

Срок годности: 052013

Производитель: Хемофарм А. Д. (Сербия)

Лекарственная форма: таблетки, покрытые кишечнорастворимой

оболочкой

Состав препарата: диклофенак натрия 50 мг; вспомогательные вещества:

лактозы моногидрат, кукурузный крахмал, повидон-К30, натрия лаурисульфат,

карбоксиметилкрахмал натрия, кремния диоксид коллоидный, магния стеарат;

45

оболочка: метакриловой кислоты и метилметакрилата сополимер, макрогол –

6000, тальк, титана диоксид Е 171, краситель солнечный закат желтый.

Фармакологические свойства: Диклофенак – нестероидный

противовоспалительный препарат , производное метилуксусной кислоты.

Обладает противовоспалительным, обезболивающим, антиагрегантным и

жаропонижающим действием. Неизбирательно угнетая циклооксигеназу 1 и 2,

нарушает метаболизм арахидоновой кислоты, уменьшает биосинтез

простагландинов и миграцию лейкоцитов. При ревматических заболеваниях

противовоспалительное и анальгезирующее действие диклофенака способствует

значительному уменьшению выраженности боли, утренней скованности,

припухлости суставов, что улучшает функциональное состояние суставов. При

травмах, в послеоперационном периоде диклофенак уменьшает болевые

ощущения и воспалительный отек.

После перорального приема абсорбируется полностью, максимальная

концентрация достигается через 2–3 ч. Концентрация в плазме находится в

линейной зависимости от величины вводимой дозы. Изменения фармакокинетики

на фоне многократного введения не отмечается. Биодоступность – 50%. Связь с

белками плазмы – более 99%.

Метаболизм: 50% активного вещества подвергается метаболизму во время

«первого прохождения» через печень. Метаболизм происходит в результате

многократного или однократного гидроксилирования и конъюгирования с

глюкуроновой кислотой. Фармакологическая активность метаболитов ниже, чем

диклофенака. Период полувыведения из плазмы составляет в среднем около 2,5

часа. 65% введенной дозы выводится в виде метаболитов почками; менее 1%

выводится в неизменном виде, остальная часть дозы выводится в виде

метаболитов с желчью.


Симптоматическое лечение заболеваний опорно-двигательного аппарата;

подагрический артрит, ревматическое поражение мягких тканей, остеоартроз

46

периферических суставов и позвоночника, в том числе с радикулярным

синдромом, тендовагинит, бурсит.

Препарат снимает или уменьшает боль и воспаление в период лечения, при

этом не влияет на прогрессирование заболевания.

Болевой синдром слабой или умеренной выраженности: невралгия, миалгия,

люмбоишиалгия, посттравматический болевой синдром, сопровождающийся

воспалением, послеоперационная боль, головная боль, мигрень, альгодисменорея,

аднексит, проктит, зубная боль.

В составе комплексной терапии инфекционно-воспалительных заболеваний

уха, горла, носа с выраженным болевым синдромом (фарингит, тонзиллит, отит).

Дексаметазон

Серия №: А47531

Срок годности: 012015

Производитель: КРКА (Словения)

Лекарственная форма: раствор для инъекций

Состав препарата: Дексаметазон 4 мг, прочие ингредиенты: динатрия

эдетат, натрия гидрофосфат дигидрат, вода для инъекций, глицерол.

Фармакологические свойства: Дексаметазон – синтетический

глюкокортикостероид длительного действия, не имеющий

минералокортикоидных эффектов. Оказывает выраженное

противовоспалительное, противоаллергическое, десенсибилизирующее,

иммунодепрессивное, противошоковое и антитоксическое действие.

Противовоспалительный эффект связан с угнетением высвобождения

эозинофилами и тучными клетками медиаторов воспаления; индуцированием

образования липокортинов и уменьшения количества тучных клеток,

вырабатывающих гиалуроновую кислоту; с уменьшением проницаемости

капилляров; стабилизацией клеточных мембран (в том числе лизосомальных).

Действует на все этапы воспалительного процесса: ингибирует синтез

простагландинов на уровне арахидоновой кислоты, синтез

47

«провоспалителительных цитокинов». По активности примерно в 25 раз

превосходит гидрокортизон. Максимальный эффект при однократном

пероральном приеме достигается через 1–2 ч. Дексаметазон хорошо

абсорбируется в пищеварительном тракте, распределяясь в тканях организма.

Объем распределения подобен у больных всех возрастных групп.

Метаболизируется в печени. Максимальная концентрация Дексаметазона в

ликворе определяется через 4 ч после в/в введения и составляет 15–20% от

концентрации в плазме крови. Выделяется почками, незначительное количество

выводится с желчью. Период полувыведения из плазмы – 3–5 ч. Около 80%

Дексаметазона экскретируется с мочой в виде глюкуронида на протяжении 24 ч.


Эндокринные нарушения — острая недостаточность коры надпочечников;

при подготовке к оперативному вмешательству или в случае тяжелой

травмы/заболевания у пациентов с недостаточностью коры надпочечников или

недостаточным адренокортикальным резервом.

Шок различной этиологии при неэффективности других методов лечения,

анафилактический шок, шок у пациентов с недостаточностью коры

надпочечников.

Отек мозга при первичных опухолях головного мозга или метастазах в

мозгу, при краниотомии или черепно-мозговых травмах.

Системные заболевания соединительной ткани.

Злокачественные заболевания – паллиативное лечение лейкозов и лимфомы

у взрослых, острый лейкоз у детей, гиперкальциемия у пациентов со

злокачественными опухолями.

Заболевания крови – острые гемолитические анемии, агранулоцитоз,

идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура у взрослых.

Тяжелые инфекционные заболевания.

Диагностический тест для выявления гиперфункции коры надпочечников.

Обострение хронического обструктивного бронхита и бронхиальной астмы.

48

Внутрисуставное введение применяется при тяжелых формах

ревматоидного артрита с нарушением функции сустава и отсутствием эффекта от

традиционной терапии, при других заболеваниях, сопровождающихся развитием

синовита с накоплением выпота в полости сустава (препарат вводят после

аспирации синовиальной жидкости).

Местное применение (введение в пораженный участок) показано при

склеротическом фолликулите, кольцевидной гранулеме и саркоидозе кожи.

Субконъюнктивальное, ретробульбарное и парабульбарное введение

показано при угрозе утраты зрения, аллергических заболеваниях,

иммунодефиците, пролиферативных изменениях в глазной ямке, симпатическом

офтальмите и терапии иммунодепрессантами после трансплантации роговицы.

Аквамарис

Серия №: 1391

Дата выпуска: 06.2011

Годен до: 06.2013

Производитель: АО «ЯДРАН», Хорватия

Лекарственная форма: капли назальные

Состав препарата: 100 мл раствора содержат 30 мл воды Адриатического

моря с натуральными микроэлементами и 70 мл воды очищенной. Не содержит

консервантов.

Присутствие ионов:

Na+ – не менее 2,50 мг/мл;

Ca2+ – не менее 0,08 мг/мл;

Mg2+ – не менее 0,35 мг/мл;

Cl- – не менее 5,50 мг/мл;

SO42- – не менее 0,60 мг/мл;

HCO3 - – не менее 0,03 мг/мл.

Фармакологические свойства: Стерилизованная изотоническая морская

вода способствует поддержанию нормального физиологического состояния

49

слизистой оболочки полости носа. Препарат способствует разжижению слизи и

нормализации ее выработки в бокаловидных клетках слизистой оболочки носовой

полости. Микроэлементы, входящие в состав препарата, улучшают функцию

мерцательного эпителия, оказывают противовоспалительное, очищающее,

стимулирующее, восстановительное действие на слизистую оболочку полости

носа. При аллергических и вазомоторных ринитах препарат способствует

смыванию и удалению аллергенов и гаптенов со слизистой носа, уменьшению

местного воспалительного процесса. Аквамарис, применяемый с гигиеническими

целями, способствует очищению слизистой от осевшей на ней уличной и

комнатной пыли.

Показания:

- острые и хронические воспалительные заболевания полости носа,

придаточных пазух и носоглотки;

- аденоиды;

- послеоперационный период (после операций на полости носа);

- аллергические и вазомоторные риниты (особенно у лиц,

предрасположенных или страдающих повышенной чувствительностью к

лекарственным препаратам, в том числе у беременных женщин и в период

лактации);

- профилактика и лечение в составе комплексной терапии инфекций

полости носа в осенне-зимний период (в том числе у беременных женщин и в

период лактации);

- сухость слизистой оболочки полости носа; сохранение физиологических

характеристик слизистой оболочки полости носа в измененных

микроклиматических условиях – у лиц, живущих и работающих в помещениях с

кондиционированным воздухом и/или центральным отоплением; у людей,

слизистая оболочка верхних дыхательных путей которых постоянно подвергается

вредным воздействиям (курильщики, водители автотранспорта, люди,

работающие в горячих и запыленных цехах, а также находящиеся в регионах с

суровыми климатическими условиями).

50

Побочное действие: возможны аллергические реакции.

Виброцил

Серия №: L02097C

Дата выпуска: 06.2011

Годен до: 05.2014

Производитель: Новартис Консьюмер Хелс СА (Швейцария)

Лекарственная форма: капли назальные

Состав препарата: в 1 мл содержатся: фенилэфрин 2,5 мг, диметиндена

малеат 250 мкг. Вспомогательные вещества: бензалкония хлорид (консервант),

лимонная кислота моногидрат, динатрия фосфат безводный, сорбитол,

детерпеновый экстракт из лаванды, вода очищенная.

Фармакологические свойства: виброцил – комбинированный препарат,

содержащий фенилэфрин и диметинден. Фенилэфрин – симпатомиметическое

средство, при местном применении оказывает умеренное сосудосуживающее

действие (за счет стимуляции альфа1-адренорецепторов, расположенных в

венозных сосудах слизистой оболочки носа), устраняет отёк слизистой оболочки

носа и его придаточных пазух. Диметинден является противоаллергическим

средством – антагонистом гистаминовых Н1-рецепторов; не снижает активность

мерцательного эпителия слизистой носа.

Показания: острый ринит (в т.ч., насморк при простудных заболеваниях);

аллергический ринит (в т.ч. при сенной лихорадке); вазомоторный ринит;

хронический ринит; острый и хронический синусит; острый средний отит (в

качестве вспомогательного метода лечения). Подготовка к хирургическим

вмешательствам в области носа и устранение отёка слизистой оболочки носа

и придаточных пазух после хирургических вмешательств в этой области.

Побочное действие: при случайном приеме виброцила внутрь маленькими

детьми не отмечено каких-либо серьезных побочных эффектов. В большинстве

случаев симптомы передозировки отсутствовали, однако, иногда сообщалось о

таких симптомах как чувство усталости, боль в области желудка, тахикардия,

51

артериальная гипертензия, возбуждение, бессонница, бледность кожных покровов

(чаще у детей при случайном приеме внутрь).

2.2. Тест-система

Биологической тест-системой во всех экспериментальных исследованиях,

выполненных в рамках данной диссертационной работы, являлись лабораторные

животные – крысы, линии Вистар, полученные из питомника лабораторных

животных РАМН «Рапполово».

Вес животных к началу исследования составлял в среднем 200 г (таблица 6).

Таблица 6

Экспериментальные животные

Экспериментальная работа Пол Количество

животных

Вес, г

M±m

Ветеринарное

свидетельство №

Разработка новой модели

экспериментального острого

шейного лимфаденита

♂

♀

80

80

204±5

188±5

247№0032003 от

4 марта 2010 г.

Валидация новой модели



(Серия 1)

♀ 20 197±6

247№0032289 от

25 марта 2010 г.




(Серия 2)

♀ 20 195±5

247№0032800 от

7 июня 2010 г.




(Серия 3)

♀ 20 196±6

247№0042964 от

16 сентября 2010 г.

52


Экспериментальная работа Пол Количество

животных

Вес, г

M±m

Ветеринарное

свидетельство №

Разработка новой модели


риносунусита

♂

♀

40

40

204±4

197±4

247№0032003 от

4 марта 2010 г.




(Серия 1)

♀ 20 200±6

247№0032289 от

25 марта 2010 г.




(Серия 2)

♀ 20 203±6

247№0042365 от

5 июля 2010 г.




(Серия 3)

♀ 20 202±6

247№0042964 от

6 сентября 2010 г.

Изучение специфической

фармакологической

активности КЛС-04 на новой

модели экспериментального

острого шейного лимфаденита

♀ 100 197±2

247№0043394 от

1 октября 2010 г.

Изучение специфической

фармакологической

активности препарата

фрешнос на новой модели


риносинусита

♀ 70 197±2

247№0043394 от

1 октября 2010 г.

53

Адаптация и отбор животных для исследования

Лабораторные животные до начала исследования содержались не менее 3-х

дней для адаптации при групповом содержании в клетках. Во время этого периода

у животных каждый день контролировали клиническое состояние путем

визуального осмотра. Животные с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями

в экспериментальные группы включены не были.

Перед началом исследования животные, отвечающие критериям включения

в эксперимент, были распределены на группы.

Распределение по группам

Для исключения влияния предпочтений исследователя на формирование

экспериментальных групп, отбор животных осуществлялся при помощи метода

модифицированной блочной рандомизации (Bland M., 2000). Для этого всех

поступивших из питомника животных случайным образом помещали в ячейки

блока рандомизации (число ячеек блока рандомизации кратно числу групп в

эксперименте). Далее, пользуясь генератором случайных чисел (статистическая

программа Statistica 6.0), получали перечень данных содержащий номера ячеек с

животными и соответствующие им номера групп, куда в дальнейшем были

размещены животные (Altman D.G. et al., 1999).

Идентификация животных

Маркировка клетки кодировала пол животных, породу, дату индукции

патологии, дату начала введения препаратов, название группы. Каждому

отобранному в исследование животному был присвоен индивидуальный номер.

Индивидуальная маркировка животных была проведена методом отметки на

хвосте.

Содержание животных

Животные содержались в стандартных условиях в соответствии с:

Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 2.2.1.3218-14

«Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и

содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» (утв.

54

постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29 августа

2014 г. № 51).

Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2009

«Принципы надлежащей лабораторной практики».

Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского

Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных

целях.

Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от

23 августа 2010 г. № 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики".

В период акклиматизации и эксперимента животных содержали в

стандартных прозрачных пластиковых клетках со стальными решетчатыми

крышками с кормовым углублением (площадь пола 1696 см2). В каждой клетке

животные были размещены таким образом, чтобы площадь пола на одно

животное была не менее 250 см2 в соответствии с Директивой 2010/63/EU

Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года

по охране животных, используемых в научных целях.

Уборка клеток и смена подстила производилась минимум 2 раза в неделю.

В период адаптации животных кормили комбикормом «Корм для

содержания лабораторных животных» ПК-120-1, приготовленным по ГОСТ Р

50258-92 в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР №755 от

12.08.77 г.

Животные получали воду, соответствующую ГОСТу «Вода питьевая» 2874-

82. Корм и вода давались ad libitum в кормовое углубление стальной решетчатой

крышки клетки.

В качестве подстила использовали древесные гранулы (ООО «Биосфера»,

Санкт-Петербург, Россия).

Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды

(20–26°C и относительной влажности воздуха 30–70%). Световой режим

составлял 12 часов света и 12 часов темноты. При изменении погодных условий

воздухообмен в помещении контролировался с помощью анемометра и путем

http://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/70688904/?prime#0

55

измерения содержания в воздухе углекислого газа и аммиака. Устанавливали

режим проветривания, обеспечивающий около 15 объемов помещения в час,

концентрацию CO2 не более 0,15 объемных %, аммиака — не более 10 мг/м3.

Температура и влажность воздуха регистрировались ежедневно. Никаких

существенных отклонений этих параметров в период адаптации и в ходе

экспериментов не произошло.

2.3. Оборудование

Весы электронные настольные общего назначения МК-3.2-А20, зав.

№ 05454;

Весы аналитические «Adventurer», модель RV 214 сер. № 8727306370;

Центрифуга Z 216 МК;

Биохимический анализатор А-25;

Анализатор гематологический Abacus junior vet;

Микроскоп Axio Scope. A1;

Система для наркотизации животных (СО2-камера);

Сушилка-морозилка (лиофильная сушка) ALPHA 1-2 LDplus.

2.4. Реагенты

Каррагенин (липополисахарид клеточной стенки красных

водорослей), Flucka, Германия.

Липополисахарид клеточной стенки бактерий E.coli, Sigma-Aldrich,

США.

Золетил 50, Vibrac, Франция.

АХД, Санкт-Петербург, Россия.

Формалин, Санкт-Петербург, Россия.

Декальцинирующий электролитный раствор, Санкт-Петербург,

Россия.

Набор реагентов для определения TNFα – Rat TNFα Platinum ELISA,

Вioscience, США.

56

Набор реагентов для определения IFN-γ – Rat IFN-γ BD

OptEIA™ ELISA Set, BD, США.

Набор реагентов для определения С-реактивного белка – Rat C-

reactive protein (CRP) ELISA Kit, BD, США.

Набор реагентов для определения общего белка, BioSystems, Италия.

Набор реагентов для определения альбуминов, BioSystems, Италия.

Спирты для гистологической проводки.

2.5. Провоспалительные агенты

Выбор провоспалительных агентов был обусловлен литературными

данными о том, что на сегодняшний день существует множество

экспериментальных моделей воспалительных заболеваний бронхолегочной

системы, индуцируемых такими провоспалительными агентами как ЛПС (Herber-

Jonat S. et al., 2011; Patial S. et al., 2011), каррагенин (Dugo L. et al., 2004;

Mochizuki M. et al., 2005; Ceccarelli M. et al., 2009; Rossi A. et al., 2010) и формалин

(Руководство…, 2012).

ЛПС – липополисахарид является основным компонентом клеточной стенки

грамотрицательных бактерий, обеспечивая структурную целостность

бактериальной клетки и защищая мембрану от агрессивных воздействий

окружающей среды (Beutler, B., Rietschel E.T., 2003; Caroff, M., Karibian, D., 2003).

Структура ЛПС включает 3 ковалентно-связанных компонента: липид А,

центральный олигосахарид и О-антиген. Липид А – липид, состоящий из

дисахарида с несколькими соединёнными цепями гидроксимиристиновой жирной

кислоты, который «заякоривает» молекулу ЛПС в бактериальной мембране.

После разрушения бактериальной клетки липид А высвобождается в кровь и

может вызывать тяжёлые токсические последствия вплоть до септического шока.

Центральный олигосахарид состоит из кетодезоксиоктулозоната и гептозы,

служит молекулярным мостиком и соединяет липид А с О-антигеном. Он

является эндотоксином и при высвобождении в кровь, также, как и липид А,

может вызывать явления интоксикации вплоть до септического шока, хотя и в

http://www.bdbiosciences.com/eu/applications/research/t-cell-immunology/th-1-cells/immunoassays/elisa/rat/rat-ifn--elisa-set/p/558861

http://www.bdbiosciences.com/eu/applications/research/t-cell-immunology/th-1-cells/immunoassays/elisa/rat/rat-ifn--elisa-set/p/558861

57

меньшей степени, чем липид А. О-антиген представляет собой полисахаридные

цепи, которые соединены с центральным олигосахаридом. Эта часть ЛПС

экспонирована в окружающую среду. Состав О-антигена варьирует в зависимости

от штамма бактерии. Эта часть ЛПС является наиболее иммуногенной и легко

распознаётся иммунной системой хозяина.

ЛПС, присоединяясь к CD14/TLR4/MD2-рецепторному комплексу на

поверхности иммунокомпетентных клеток (в основном макрофагов), вызывает

секрецию провоспалительных цитокинов, в том числе фактор некроза опухоли

(TNF-α), интерлейкина 1 (IL-1), и других, тем самым запускает неспецифический

каскад воспалительных реакций. В связи с этим, ЛПС используется в качестве

экспериментального фактора в науке, медицине и фармакологии как для изучения

механизмов воспаления, так и для разработки и апробации новых

фармакологических средств, направленных на подавление разных звеньев

воспалительной реакции. При этом в зависимости от дозы и способа введения

ЛПС можно моделировать разные виды патологии.

Каррагенин представляет собой группу неразветвленных сульфатированных

полисахаридов, молекулы которых построены из остатков производных D-

галактопиранозы со строгим чередованием α-1,3- и β-1,4 связей между ними.

Каррагенин получают из красных морских водорослей. Различия между

отдельными представителями каррагенинов обусловлены тем, что в качестве 4-О-

замещенного моносахаридного остатка может выступать не только D-галактоза,

но и 3,6-ангидро-D-галактоза, при этом гидроксильные группы могут быть

сульфатированы, изредка метилированы, а в качестве 3-О-замещенного остатка в

молекуле иногда содержится 4,6-О-(1'-карбокси)этилиденовое производное D-

галактозы. Каррагенины, построенные из наиболее часто встречающихся

дисахаридных повторяющихся звеньев, принято обозначать греческими буквами.

В настоящем исследовании использовался λ-каррагенин, который достаточно

хорошо растворяется в воде.

Формалин – водный раствор, содержащий 40% формальдегида, 8%

метилового спирта и 52% воды. Попадание формалина на живую ткань слизистых

58

носа и дыхательных путей вызывает повреждение по типу коагуляционного

некроза и воспаление прилежащих тканей. Введение формалина в носовые ходы

крыс приводит к распространению воспаления на прилежащие ткани, в результате

чего развивается клиническая картина сходная с симптомами острого

риносинусита у человека.

При этом по литературным данным известно, что для получения ответной

воспалительной реакции организма на введение ЛПС и каррагенина необходимо

значимое время экспозиции, для ЛПС минимальное время экспозиции по

литературным данным составляет 4 часа (Liu Y. Et al., 2008; Сергеева Т.Н.,

Сергеева В.Г., 2011), для каррагенина – 3 часа (Winter C. et al., 1962; Тесакова С.В.

и соавт., 2011).

При введении формалина предполагается повреждение ex temporo.

2.6. Разработка и валидация экспериментальной модели острого шейного

лимфаденита

Все эксперименты проводили в соответствии с:

Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета

Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных,

используемых в научных целях.

Guide for the care and use of laboratory animals 8th edition. Copyright

2011 by the National Academy of Sciences. All rights reserved. - Washington, D.C.

2010.

Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р-53434-

2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ

от 23 августа 2010 г. № 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики".

Эксперименты проводили согласно плану испытаний, который был одобрен

биоэтической комиссией ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации».

С целью разработки и валидации фармакологической модели

экспериментального острого шейного лимфаденита было протестировано 3

59

провоспалительных агента, вызывающих воспалительную реакцию в тканях: ЛПС

в дозе 0,1 мг/кг водный раствор, каррагенин 0,8 мг/кг водный раствор и формалин

8 мг/кг водный раствор. Вещества вводили непосредственно в ткань

лимфатического узла Inn. Cervicales superficiales.

В исследовании использовали 80 крыс-самок и 80 крыс-самцов линии

Вистар, средней массой к началу исследования 200 г (таблица 7).

Таблица 7

Дизайн исследования по разработке экспериментальной модели острого

шейного лимфаденита (выбор провоспалительного агента)

Группа Количество

животных Пол

Вес, г

M±m

Группа 1 Интактные

(ложнооперированные)

20

20

Самцы

Самки

200±10

195±10

Группа 2 Индукция патологии

ЛПС 0,1 мг/кг

20

20

Самцы

Самки

206±11

187±9


каррагенин 0,8 мг/кг

20

20

Самцы

Самки

198±9

188±12


формалин 8 мг/кг

20

20

Самцы

Самки

211±12

182±4

Выбор доз провоспалительных агентов

Выбор доз для ЛПС и каррагенина был обусловлен литературными

данными, где для создания большинства экспериментальных моделей ЛПС

используется в дозе 100 мкг/кг (Тюренков И.Н., Самотруева Н.Н., 2011;

Samotrueva M.A. et al., 2011). λ-каррагенин используется в виде 1% водного

раствора (Posadas I., 2004; Zheng Xu et al., 2012), эти данные были пересчитаны на

1 кг массы тела животных с учетом объема введения 20 мкл.

Доза водного раствора формалина была определена экспериментальным

путем. При введении более высоких доз формалина (16 и 12 мг/кг) наблюдались

некротические изменения ткани лимфатических узлов, т.е. поражение было

значительно более сильным, нежели острая воспалительная реакция. При

использовании более низких доз раствора формалина (6 и 4 мг/кг) у животных

либо развивалась недостаточно выраженная картина острого воспаления (6 мг/кг),

либо наступало самоизлечение (4 мг/кг).

60

Индукцию острого лимфаденита проводили путем введения

провоспалительных агентов в верхний лимфатический узел справа (Inn. Cervicales

superficiales) (рисунок 4).

Рисунок 4 – Расположение шейных лимфатических узлов крысы

(16 – Inn. Cervicales superficiales)

Осуществление доступа к шейным лимфатическим узлам, введение

провоспалительных агентов в шейные лимфатические узлы, извлечение

лимфатических узлов

Животных наркотизировали «Золетил» + «Ксила».

После наступления устойчивого наркоза животное фиксировали на

операционном столике спиной вниз (рисунок 5).

Дезинфицирующим раствором обрабатывали переднюю поверхность шеи

животного (рисунок 6).

В области операционного поля срезали шерсть (рисунок 6).

61

Рисунок 5 – Фиксация животного Рисунок 6 – Обработка операционного

поля

Выполняли срединный разрез кожи около 2 см (рисунок 7).

Отпрепаровывали фасции тупым способом при помощи анатомического

пинцета с узкими браншами, обнажая лимфатические узлы (рисунок 7).

С помощью инсулинового шприца вводили провоспалительный агент в

объеме 10 мкл в верхний лимфатический узел справа (рисунок 8).

Рисунок 7 – Обнажение лимфатических

узлов

Рисунок 8 – Введение

провоспалительного агента в

лимфатический узел

После операции рану послойно ушивали. Рану обрабатывали антисептиком.

Прооперированное животное помещали в чистую клетку.

После эвтаназии доступ к лимфатическим узлам осуществлялся аналогично

(рисунок 6), лимфатические узлы извлекали при помощи хирургических

инструментов.

62

Известно, что наиболее выраженные клинические проявления ангины у

людей наблюдаются на 3 сутки заболевания, в связи с этим было принято

решение проводить эвтаназию экспериментальных животных через 72 часа от

момента введения провоспалительных агентов и через 120 часов, для того чтобы

оценить динамику развития воспалительного ответа.

Для оценки экспериментальной модели исследовали следующие показатели:

содержание С-реактивного белка в плазме крови (см. п. 2.11.);

определение основных провоспалительных цитокинов TNF-α и INF-γ

в сыворотке крови (см. п. 2.11.);

определение гематологических показателей крови (см. п. 2.12.);

разницу в массе пораженного и интактного лимфатических узлов;

процент потери массы пораженного лимфатического узла при

лиофильном высушивании (см. п. 2.13);

морфологический анализ лимфатических узлов (см. п. 2.14.).

Для проверки правильности (точности) и сходимости показателей,

характеризующих развитие экспериментальной патологии, было проведено три

серии экспериментов. Эксперименты проводились на самках линии Вистар в

различные сезоны (весна, лето, осень) (Cook C.D., Nikerson M.D., 2005; Lariviere

W.R. et al., 2006) (таблица 8):

Первая серия экспериментов была проведена с 23.03.10 по 26.03.10

Вторая серия экспериментов была проведена с 21.06.10 по 24.06.10

Третья серия экспериментов была проведена с 14.10.10 по 17.10.10

Таблица 8

Дизайн исследования по валидации экспериментальной модели шейного

лимфаденита на самках крыс линии Вистар, M±m, n=10

Группа Вес, г

Серия 1 Серия 2 Серия 3

Группа 1 Интактные (ложнооперированные) 198±10 197±9 196±6

Группа 2 Индукция патологии 195±7 192±6 195±10

63

2.7. Оценка эффективности КЛС-04 в сравнении с тантум верде,

диклофенаком и дексаметазоном на экспериментальной модели острого шейного


По результатам разработки и валидации экспериментальной модели острого

шейного лимфаденита было выбрано введение самкам крыс линии Вистар в

лимфатический узел водного рствора ЛПС в дозе 0,1 мг/кг.

Для оценки эффективности КЛС-04 проводили оценку показателей С-

реактивного белка, TNF-α и INF-γ, биометрическую оценку разницы массы

пораженного и интактного лимфатических узлов, патоморфологическую оценку

ткани лимфатических узлов.

Эксперимент был выполнен на 100 крысах-самках линии Вистар. Было

сформировано 10 экспериментальных групп по 10 животных в каждой группе.

В качестве препаратов сравнения были выбраны зарегистрированные на

территории РФ препараты тантум верде, диклофенак и дексаметазон, обладающие

выраженным противовоспалительным эффектом.

Расчет доз и путь введения препаратов:


В 30 мл готовой лекарственной формы тантум верде содержится 176 доз.

Одна доза (один впрыск) тантум верде составляет 0,17 мл, в которой

содержится 255 мкг действующего вещества. В качестве терапевтической дозы

для одного животного со средней массой 250 г было выбрано введение 0,2 мл

тантум верде, терапевтическая доза для крыс составила 1,2 мг/кг.

Путь введения – распыление на заднюю стенку глотки, аналогично пути

применения в клинической практике.


Максимальная терапевтическая доза препарата сравнения диклофенак для

человека, массой 70 кг – составляет 150 мг в сутки. На 1 кг веса человека 150/70=

2 мг/кг. С учетом метаболического коэффициента максимальная терапевтическая

доза для крысы составляет: 2 × 39 / 7 = 11 мг/кг.

64

Путь введения – внутрижелудочно, аналогично пути применения в

клинической практике (пероральному).


Средняя суточная доза дексаметазона для взрослых составляет 60 мг.

На 1 кг веса человека = 60/70 = 0,9 мг/кг, для крысы = 0,9*39/7 = 5 мг/кг.

Путь введения – внутримышечно, аналогично пути применения в

клинической практике.

КЛС-04

Для выявления широты терапевтического действия был изучен диапазон доз

КЛС-04: 0,4; 0,8; 1,6, 3,2 и 6,4 мг/кг, учитывая, что раствор КЛС-04 имеет

концентрацию 0,1%, объемы для введения составили 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 и 1,6 мл

соответственно (таблица 9).

Путь введения – распыление на заднюю стенку глотки, аналогично

планируемому пути применения в клинической практике.

Исследуемый препарат и препараты сравнения вводили животным один раз

в сутки, на протяжении 10-ти дней до индукции лимфаденита и 3 дня после.

Таблица 9

Дизайн исследования по оценке эффективности КЛС-04 в сравнении с тантум

верде, диклофенаком и дексаметазоном на экспериментальной модели острого

шейного лимфаденита на самках крыс линии Вистар

Описание группы Количество

животных

Вес, г

M±m Доза, мг/кг Доза, мл/животное

Интактные 10 204±7 0 0

Патология без лечения 10 193±9 0 0

Патология + Тантум верде 10 192±11 1,2 0,2

Патология + Диклофенак 10 198±15 11 -

Патология + Дексаметазон 10 193±10 5 -

Патология + КЛС-04 10 197±5 0,4 0,1

Патология + КЛС-04 10 199±4 0,8 0,2

Патология + КЛС-04 10 196±5 1,6 0,4

Патология + КЛС-04 10 200±4 3,2 0,8

Патология + КЛС-04 10 197±8 6,4 1,6

После эвтаназии экспериментальных животных все интактные и

пораженные лимфатические узлы были взвешены, затем от 5 животных из каждой

экспериментальной группы лимфатические узлы были подвержены лиофильному

65

высушиванию для оценки противоотечного эффекта исследуемых препаратов,

затем снова были взвешены. От оставшихся 5 животных из каждой

экспериментальной группы лимфатические узлы были зафиксированы в 10%

нейтральном формалине и подвергнуты гистологическому исследованию.

Введение препаратов осуществляли с помощью специального шприца и

зонда для эндотрахеального введения (IA-1C-M Penn-Century Inc., USA) (рисунок

9).

Рисунок 9 – Ааэрозоллер модель IA-1C-M

Интактным и контрольным животным вводили физиологический раствор в

объеме 0,5 мл.

2.8. Разработка и валидация экспериментальной модели острого


Известно, что острый риносинусит возникает в результате воздействия на

слизистую оболочку носовой полости вирусной или бактериальной инфекции.

На фоне вирусной инфекции и воспалительного процесса в полости носа

возникает отек слизистой оболочки полости носа и остиомеатального комплекса

(система очень узких пространств, куда открываются околоносовые пазухи). В

связи с указанными изменениями давление в околоносовых пазухах становится

ниже атмосферного, что вызывает усиление транссудации в пазухи с параллельно

существующим нарушением эвакуации слизи (транссудата) обусловленным

угнетением мукоцилиарного транспорта вплоть до его полной остановки. Все это

делает возможным вторичную бактериальную инвазию. Микробная флора

66

находит для себя благоприятную среду обитания в виде серозного, слизисто–

серозного и слизистого отделяемого, начинает активно размножаться, а

замедление движения мерцательного эпителия продлевает контакт патогенных

микробов с клеткой. Вследствие указанных процессов асептическое воспаление

переходит в септическое гнойное воспаление, и в клинической картине начинают

доминировать симптомы инфекционного воспаления околоносовых пазух.

Таким образом, первичным проявлением риносинусита при ОРВИ в

клинике является асептическое воспаление.

Адекватной модели, по этиологии и патогенезу близкой к естественному

пути заражения и распространения возбудителя, без предварительного

раздражения или повреждения тканей, не было создано, что открывает широкие

возможности для экспериментальных исследований (Чистюхина И.О., 1998)

На сегодняшний день в доступной литературе наиболее широко

представлено описание экспериментальных риносинуситов аллергической

природы (Yamasaki M. et al., 2002; Fukuda S. et al., 2003; KleinJan A., 2006; Wang

H. et al., 2007; Jung H.W. et al., 2013).

Также существует множество экспериментальных моделей воспалительных

заболеваний бронхолегочной системы, индуцируемых данными

провоспалительными агентами (Dugo L. et al., 2004; Mochizuki M. et al., 2005;

Ceccarelli M. et al., 2009; Rossi A. et al., 2010; Herber-Jonat S. et al., 2011; Patial S. et

al., 2011).

При этом в современной доступной литературе отсутствует описание

экспериментальной модели риносинусита с помощью какого-либо

провоспалительного агента.

Для оценки экспериментального ринита используется большое количество

методов и показателей, в зависимости от целей и задач исследования:

Оценка клеточного состава смыва из носовой полости (Yamasaki

M. et al., 2002);

67

Гистологическая оценка тканей носовых ходов (Yamasaki M. et al.,

2002; KleinJan A. et al., 2006; Jung H.W. et al., 2013). Оценка количества

бокаловидных клеток (Yamasaki M. et al. 2002);

Измерение удельного сопротивления дыхательных путей

(плетизмограф) (Yamasaki M. et al., 2002);

Иммуногистохимический анализ слизистой оболочки носа

(KleinJan A. et al., 2006; Jung H.W. et al., 2013).

При моделировании острого риносинусита необходимо учитывать, что

нормальная анатомия околоносовых пазух белых крыс в значительной степени

отличается от таковой у человека (рисунок 10). Пазухи крысы довольно обширны,

что создает благоприятные условия для моделирования комбинированной

патологии – риносинусит.

а б

Рисунок 10 – Анатомическое строение околоносовых пазух крыс (а) и

человека (б)

Учитывая приведенные выше сведения о значимой роли асептического

воспаления при инфекционных ринитах, целью данной работы явилась разработка

универсальной экспериментальной модели асептического воспаления носовых

ходов и синусов.

С целью разработки фармакологической модели острого риносинусита было

протестировано 3 провоспалительных агента, вызывающих воспалительную

68

реакцию в тканях: ЛПС в дозе 0,1 мг/кг водный раствор, каррагенин в дозе 0,8

мг/кг и формалин в дозе 12 мг/кг водный раствор.

Выбор доз провоспалительных агентов

В данном случае выбор доз для ЛПС и каррагенина также был обусловлен

литературными данными, ЛПС в дозе 100 мкг/кг (Тюренков И.Н., Самотруева

Н.Н., 2011; Samotrueva M.A. et al., 2011); доза λ-каррагенина после пересчета на 1

кг массы тела животного с учетом объема введения 40 мкл (20 мкл в каждый

носовой ход) составила 1,6 мг/кг (Posadas I., 2004; Xu Zh.et al., 2012).

Доза формалина была определена экспериментальным путем. При введении

более высокой дозы формалина (16 мг/кг) наблюдались некротические изменения

тканей носовых ходов, а при использовании более низкой дозы (8 мг/кг) у

животных развивалась недостаточно выраженная картина острого воспаления.

Провоспалительные агенты вводили непосредственно в носовые ходы крыс

путем дозированного закапывания с использованием механических дозаторов с

пластиковыми наконечниками.

Через 7 дней животных эвтаназировали.

Также представлялось интересным сравнить реакцию на поступление

провоспалительного агента самцов и самок крыс. Существуют литературные

данные о том, что использование самок является предпочтительным выбором, т.к.

у самок крыс наблюдается более выраженный воспалительный ответ в ответ на

введение повреждающих агентов (Cook C.D., Nikerson M.D., 2005; Lariviere W.R.

et al., 2006).

Готовые растворы провоспалительных агентов закапывали в каждый

носовой ход (рисунок 11).

Дизайн исследования по разработке экспериментальной модели острого

риносинусита представлен в таблице 10.

69

Рисунок 11 – Интраназальное введение раствора крысе с помощью дозатора

Таблица 10

Дизайн эксперимента по разработке экспериментальной модели острого




Вес, г

M±m

Группа 1 Интактные 10

10

Самцы

самки

200±10

195±10



10

10

Самцы

самки

206±11

187±9



10

10

Самцы

самки

198±9

188±12



10

10

Самцы

самки

211±12

182±4

Извлечение носовых ходов крыс

После эвтаназии животных декапитировали большими ножницами.

Отрезали нижнюю челюсть, ведя хирургические ножницы в ротовую полость над

языком (рисунок 12 – 16);

Осторожно, избегая повреждения рук верхними резцами, производили

разрез за глазами, отделяя тем самым препарат верхней челюсти (рисунок 12 –

15);

70

Рисунок 12 – Отделение

нижней челюсти

Рисунок 13 – Отделение

нижней челюсти

Рисунок 14 – Разрез за глазами Рисунок 15 – Отделение препарата

верхней челюсти

С полученного препарата верхней челюсти с помощью хирургических

ножниц убирали кожу и мышцы, оставляя целостными костные структуры

носовых ходов и синусов (рисунок 16 – 18).

Рисунок 16 – Отделение кожи и мышц

71

Рисунок 17 – Препарат верхней

челюсти после отделения кожи и мышц

Рисунок 18 – Препарат верхней челюсти

после отделения кожи и мышц


морфологическое исследование слизистой оболочки и подслизистого

слоя обоих носовых ходов (дыхательная и обонятельная область)

экспериментальных животных (см. п. 2.14.);

Для проверки сходимости показателей, характеризующих развитие

экспериментальной патологии, было проведено три серии экспериментов.

Эксперименты проводились на самках линии Вистар в различные сезоны (весна,

лето, осень):

Первая серия экспериментов была проведена с 15.04.10 по 21.04.10

Вторая серия экспериментов была проведена с 17.07.10 по 23.07.10

Третья серия экспериментов была проведена с 01.10.10 по 07.10.10

Дизайн исследования по валидации экспериментальной модели острого

риносинусита на самках крыс линии Вистар представлен в таблице 11.

Таблица 11

Дизайн исследования по валидации экспериментальной модели острого

риносинусита на самках крыс линии Вистар, M±m, n=10



Группа 1 Интактные 199±9 207±7 206±6


72

Для валидации экспериментальной модели исследовали следующие

показатели:

морфологическое исследование слизистой оболочки и подслизистого

слоя обоих носовых ходов (дыхательная и обонятельная область)

экспериментальных животных (см. п. 2.14.);

2.9. Оценка эффективности препарата фрешнос в сравнении с виброцилом и

аквамарисом на экспериментальной модели острого риносинусита

Индукцию острого риносинусита проводили путем дозированного

интраназального введения 20 мкл раствора формалина в каждый носовой ход в

дозе 12 мг/кг.

Препаратами сравнения были выбраны аквамарис и виброцил, как широко

применяемые средства.

В качестве пути введения препаратов крысам использовали интраназальное

введение как наиболее близкий к применению препаратов в клинической

практике. Введение препаратов проводили путем дозированного закапывания с

использованием механических дозаторов с пластиковыми наконечниками.


в сутки, на протяжении 7-и дней с момента индукции острого риносинусита:

аквамарис и виброцил дозе 50 мкл/100 г массы тела, фрешнос в дозах 10, 20 и 30

мкл/100 г массы тела в каждый носовой ход. Интактным и контрольным

животным вводили физиологический раствор (таблица 12).

73

Таблица 12

Дизайн исследования по оценке эффективности препарата фрешнос в сравнении с

виброцилом и аквамарисом на экспериментальной модели острого риносинусита

на самках крыс линии Вистар

Описание

группы Количество животных

Вес, г

M±m

Доза,

мкл/100 г массы тела

Интактные 10 197±3 -

Патология без лечения 10 200±4 -

Патология + Аквамарис 10 190±5 50

Патология + Виброцил 10 202±3 50

Патология + Фрешнос 10 190±4 10



2.10. Манипуляции с животными

2.10.1. Прижизненный забор крови для исследования

Прижизненный забор крови для исследования осуществлялся методом

забора крови из хвостовой вены с помощью катетера.

2.10.2. Эвтаназия

В соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и

Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях

от 22 сентября 2010 г. животных эвтаназировали помещением в СО2-камеру, в

условиях постепенного заполнения камеры диоксидом углерода. Данный вид

эвтаназии животных сопровождается минимумом боли, страдания и дистресса.

2.11. Методы биохимического анализа

Содержание TNFα, IFNγ и С-реактивного белка определяли методом

твердофазного иммуноферментного анализа.

Принцип метода заключается в связывании первичных антител,

иммобилизированных на дне лунок планшета для иммуно-ферментного анализа, и

74

исследуемого белка в пробах. Количество связанного белка выявляли с помощью

добавления вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, и

проведением ферментативной реакции с хромогенным субстратом

(тетраметилбензидин). Интенсивность окраски реакционной смеси прямо

пропорциональна количеству тестируемого белка. Построение калибровочного

графика после проведения реакции со стандартными пробами позволяет

определить количественно уровень тестируемого белка.

2.12. Методы гематологического анализа

Проводили определение следующих гематологических показателей:

1. Количество эритроцитов (RBC);

2. Количество лейкоцитов (WBC);

3. Количество тромбоцитов (PLT);

4. Лейкоформула:

- лимфоциты (LYM);

- моноциты (MID);

- гранулоциты (GRA);

- % лимфоцитов (LY%);

- % моноцитов/эозинофилов (MI%);

- % гранулоцитов (GR%).

Данные показатели определяли в цельной крови с помощью полностью

автоматического гематологического анализатора Abacus junior vet производства

Diatron, в котором подсчет клеток осуществляется методом импеданса. Метод

заключается в определении количества и размера клеток в зависимости от

изменения электрического сопротивления, когда частица (клетка) в

токопроводящей жидкости проходит через апертуру. Проходя через апертуру,

клетка вызывает изменение импеданса проводящей суспензии клеток крови. Это

изменение регистрируется как повышение напряжения между электродами.

Количество импульсов определяет количество клеток. Амплитуда импульса

пропорциональна объему клетки. Импульсы подсчитываются только в границах,

75

которые находятся между заранее установленными нижними и верхними

пределами.

Линейность методики до 15*1012

клеток/л, воспроизводимость более 97%,

погрешность между пробами менее 1%.

2.13. Патофизиологическиие методы исследования

Лимфатические узлы замораживали в морозильной камере при температуре

-250С в течение 72 часов, затем сушили в лиофильной сушилке ALPHA 1-2

LDplus (Германия) и взвешивали на весах Ohaus Adventurer (Швейцария),

точность 0,0001 г.

На модели острого шейного лифаденита оценивали потерю в массе

пораженных лимфатических узлов при лиофильном высушивании, разницу в

массе пораженного и интактного лимфатических узлов.

2.14. Методы патоморфологического анализа

Автор выражает глубокую признательность Самусенко Игорю Алексеевичу

и Мужикяну Арману Артушовичу за помощь в анализе гистологических

препаратов.

2.14.1. Микроскопическое исследование ткани лимфатических узлов

При оценке выраженности патологических изменений на модели острого

шейного лимфаденита у лабораторных животных была проведена

гистологическая оценка пораженных лимфатических узлов.

С этой целью после эвтаназии интактный и пораженный лимфатические

узлы извлекали, фиксировали не менее 24 ч в 10% нейтральном забуференном

формалине. После стандартной гистологической проводки через спирты

возрастающей концентрации (70–95%) и пропитывания в хлороформе ткань

заливали в парафин. С парафиновых блоков делали срезы толщиной 4–6 мкм,

окрашивали гематоксилином и эозином для выявления типовых патологических

процессов и изучения необходимых параметров при помощи светооптического

микроскопа Leica DM LS при увеличении микроскопа 200 и 400.

76

Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры

Leica DC320.

Для оценки специфической фармакологической активности препаратов

проводили сравнительную гистологическую и морфометрическую оценку их

влияния на стимуляцию макрофагов, гистиоцитов и В-лимфоцитов пораженных и

интактных (контрлатеральных) лимфатических узлов шеи у крыс. Для этого была

оценена:

Структура лимфатических узлов;

Диаметр герминативных центров вторичных фолликулов;

Гистиоцитоз синусов – содержание гистиоцитов и макрофагов в синусах по

периметру лимфатического узла – полуколичественно:

0 баллов – отсутствие;

1 балл – до 1/3 периметра синусов;

2 балла – от 1/3 до 2/3 периметра синусов;

3 балла – более 2/3 периметра синусов;

4 балла – весь периметр синуса.

2.14.2. Микроскопическое исследование носовых ходов

С целью оценки выраженности патологических изменений при

моделировании острого риносинусита было произведено морфологическое

исследование слизистой оболочки и подслизистого слоя обоих носовых ходов

(дыхательная и обонятельная область) экспериментальных животных.

После окончания клинической фазы эксперимента материал от животных

фиксировали в течение 24 часов в 10 % растворе формалина, далее в течение 3-х

суток декальцинировали в 12% смеси де Кастро, после чего, материал проходил

стандартную обработку в спиртах нарастающей концентрации (70–95%), ксилоле

и парафине для изготовления гистологических препаратов с толщиной серийных

парафиновых срезов 3–5 мкм. Для микроскопического исследования срезы

окрашивались гематоксилином и эозином. С целью выявления кислых

мукополисахаридов, продукция которых увеличивается при воспалении,

применялось гистохимическое окрашивание альциановым синим при рН 2,5.

77

Изучение необходимых параметров проводилось при помощи светооптического

микроскопа Leica DM LS при увеличении микроскопа 200.

Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры

Leica DC320.

Сопоставление и гистологическую оценку изменений проводили в

сравнении с группой интактных крыс.

С целью выявления степени патологических изменений при

гистологическом, гистохимическом и морфометрическом исследовании

полуколичественным методом были оценены основные патологические процессы,

характерные для острого риносинусита: в слизистой оболочке – полнокровие,

гиперплазия и некроз эпителия, количество бокаловидных клеток на протяжении

1 мм слизистой носовой перегородки, характер воспаления и степень

выраженности инфильтрации мононуклеарами (лимфоциты, плазматические

клетки и гистиоциты) и лейкоцитами. В подслизистом слое – характер и степень


клетки и гистиоциты) и лейкоцитами, реакция слизи желез. Степень

выраженности воспаления оценивалась полуколичественно:

0 баллов – отсутствие ифильтрации;

1 балл – слабо выраженная степень инфильтрации;

2 балла – умеренно выраженная степень инфильтрации;

3 балла – выраженная степень инфильтрации.

2.15. Статистическая обработка данных

Для всех данных была применена описательная статистика: данные

проверены на соответствие закону нормального распределения. Проверка на

соответствие закону нормального распределения осуществлялась с помощью

критерия Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения были подсчитаны

среднее значение и стандартная ошибка среднего, которые вместе со значением n

представлены в итоговых таблицах. Для оценки данных с признаками

нормального распределения был использован однофакторный дисперсионный

анализ (ANOVA), с последующим межгрупповым сравнением (post hoc analysis) с

78

использованием теста Стьюдента. Различия были определены при 0,05 уровне

значимости.

Статистический анализ выполнялся с помощью программного обеспечения

Statistica 6.0. (StatSoft, Россия).

79

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ


ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТРОГО ШЕЙНОГО ЛИМФАДЕНИТА.

Учитывая высокую распространенность острого шейного лимфаденита

создание валидированной экспериментальной модели для оценки эффективности

лекарственных средств является важной проблемой.

Эксперименты были выполнены на крысах-самках и крысах-самцах линии

Вистар. Предстояло определить оптимальный пол животных для изучения

воспалительного ответа на этой модели. Следует отметить, на других моделях

острого воспаления у самок крыс наблюдается более выраженная воспалительная

реакция в ответ на введение провоспалительных агентов (Cook C.D., Nikerson

M.D., 2005; Lariviere W.R. et al., 2006).

Результаты разработки новой модели экспериментального острого шейного


Исследовали три провоспалительных агента, вызывающих асептическую

воспалительную реакцию в тканях: водные растворы ЛПС, каррагенина и

формалина. Растворы провоспалительных агентов вводили с помощью

инсулинового шприца с интегрированной иглой в субкапсулярную область

верхнего лимфатического узла.

Индукцию острого шейного лимфаденита и оценку развития патологии

осуществляли, как описано в главе материалы и методы.

C-реактивный белок – белок плазмы крови, относящийся к группе белков

острой фазы, концентрация которых повышается при воспалении. В клинической

диагностике С-реактивный белок используется в качестве индикатора воспаления.

Как видно из приведенных в таблице 13 данных, уровень СРБ до индукции

шейного лимфаденита был одинаков во всех экспериментальных группах, а в

интактной группе его уровень не изменялся на протяжении 120 часов, что

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%91%D0%B5%D0%BB%D0%BE%D0%BA

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D0%BB%D0%B0%D0%B7%D0%BC%D0%B0_%D0%BA%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%B8

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D1%80%D0%BE%D0%B2%D1%8C

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%92%D0%BE%D1%81%D0%BF%D0%B0%D0%BB%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D0%B5

80

свидетельствует о стабильности данного показателя у здоровых животных и

отсутствии влияния на данный показатель оперативного вмешательства.

Представленные в таблице 13 данные свидетельствуют о том, что при

введении экспериментальным животным в качестве провоспалительных агентов

растворов ЛПС и каррагенина на протяжении 72 часов наблюдалось повышение

уровня С-реактивного белка, что свидетельствует о развитии острого

воспалительного ответа.

Через 96 и 120 часов в группах, получивших ЛПС и каррагенин,

происходило снижение данного показателя. Полученные данные позволяют

сделать вывод о том, что у крыс, аналогично человеку, наиболее выраженная

воспалительная реакция в ответ на проникновение провоспалительного агента

развивается через трое суток.

Крайне важным является наличие статистически значимых отличий уровня

С-реактивного белка у самцов и самок групп, получивших в качестве

провоспалительных агентов растворы ЛПС и каррагенина. У самок

воспалительный ответ значимо превышал таковой у самцов, что подтверждает

литературные данные (Cook C.D., Nikerson M.D., 2005; Lariviere W.R. et al., 2006)

(рисунок 19).

Рисунок 19 – Сравнительная оценка уровня С-реактивного белка в динамике

в крови экспериментальных животных

81

Таблица 13

Результаты оценки СРБ крови при разработке экспериментальной модели острого шейного лимфаденита, M±m

Группа

Количество

и пол

животных

СРБ, г/л Количество

и пол

животных

СРБ, г/л

До

операции 24 часа 48 часов 72 часа 96 часов

120

часов



20♂

20♀

26,9±1,3

28,8±1,1

25,4±0,9

29,5±1,6

26,6±1,2

29,2±1,5

28,5±0,6

27,9±1,0

10♂

10♀

28,0±1,3

27,0±1,7

27,7±1,5

26,5±1,6

Группа 2 Индукция

патологии


20♂

20♀

25,0±0,8

27,7±1,5

32,5±0,9

38,7±1,8*

34,3±0,8*

45,8±1,8*

34,9±1,7

48,2±3,3*●

10♂

10♀

31,2±1,6

42,1±3,4*●

29,9±0,9

36,5±2,1


патологии


20♂

20♀

27,8±0,7

26,3±0,8

31,2±1,6

31,8±1,2

30,0±1,5

42,2±0,5*

30,8±1,2

43,0±2,5*●

10♂

10♀

30,4±2,1

37,0±2,5

30,5±2,7

31,2±1,8


патологии


20♂

20♀

26,0±1,2

26,5±1,0

27,5±0,9

30,1±0,9

29,9±0,7

30,4±0,9

31,1±1,2

28,8±1,0

10♂

10♀

30,0±2,9

28,0±1,1

29,8±2,1

27,4±1,6

Примечание: * – отличие статистически значимо по сравнению с интакной группой по критерию Стьюдента, при

р<0,05

● – отличие статистически значимо по сравнению с самцами идентичной группы по критерию Стьюдента, при

р<0,05

82

Таким образом, наиболее выраженные изменения уровня С-реактивного

белка были отмечены у самок крыс через 72 часа после введения раствора ЛПС и

каррагенина. Повышение данного показателя составило 73% и 54 %

соответственно, по сравнению с интактными животными.

Уровень С-реактивного белка при введении экспериментальным животным

в качестве повреждающего агента формалина ни в одной временной точке

статистически значимо не превышал данный показатель интактных животных.

Полученные данные свидетельствуют том, что наиболее подходящим

агентом для формирования экспериментальной патологии острого шейного

лимфаденита являются ЛПС и каррагенин, оптимально подходящей тест-

системой – самки крыс линии Вистар, экспозиция должна составлять 72 часа.

Представленные в таблице 14 данные свидетельствуют о том, что при

развитии воспаления, через 72 часа от момента индукции патологии, отмечалось

статистически значимое увеличение лейкоцитов во всех экспериментальных

группах по сравнению с интактными животными. Наиболее выраженные

изменения были получены у самок крыс на фоне введения ЛПС и каррагенина. В

лейкоцитарной формуле наблюдался гранулоцитарный сдвиг, что свидетельствует

о снижении иммунного ответа.

В этих же группах у самок отмечалось статистически значимое увеличение

количества тромбоцитов, что может быть связано с высвобождением фактора

активации тромбоцитов гранулоцитами, макрофагами и моноцитами при

воспалительной реакции.

Через 120 часов от момента индукции патологии наблюдалась аналогичная

картина (таблица 15), во всех экспериментальных группах уровень лейкоцитов

был статистически значимо выше данного показателя интактных животных,

однако по сравнению с данными полученными через 72 часа, уровень

повышенного количества лейкоцитов был значимо ниже.

83

Таблица 14

Результаты оценки гематологических показателей крови при разработке экспериментальной модели шейного

лимфаденита через 72 часа от момента индукции патологии, M±m

Исследуемые показатели Количество и

пол животных



Группа 2

Индукция

патологии


Группа 3

Индукция

патологии

каррагенин 0,8

мг/кг

Группа 4

Индукция

патологии

формалин 8

мг/кг

HGB Гемоглобин, г/л 20♂

20♀

141,7±2,2

137,9±1,7

145,6±1,6

131,0±2,4

145,5±1,4

139,7±1,4

142,2±2,4

143,9±3,0

HCT Гематокрит, % 20♂

20♀

45,2±0,4

45,4±0,5

44,5±1,3

47,1±0,6

45,0±0,7

47,2±0,8

42,1±1,0

46,3±1,3

RBC Эритроциты, 1012/л

20♂

20♀

7,1±0,1

7,6±0,1

6,9±0,1

7,4±0,2

7,0±0,2

8,0±0,2

7,2±0,1

7,5±0,1

WBC Лейкоциты, 109/л

20♂

20♀

6,7±0,1

7,6±0,6

16,5±0,3*

20,5±0,6*

16,9±0,1*

18,1±0,4*

10,4±0,4*

10,0±0,7*

GRA Гранулоциты, % 20♂

20♀

18,1±0,4

21,7±1,0

28,2±0,6*

27,1±0,8*

29,4±0,4*

31,2±1,1*

25,7±1,0*

24,0±1,3

MID

Моноциты/Эозинофилы,

%

20♂

20♀

2,9±0,1

2,5±0,1

2,6±0,1

2,9±0,1

2,8±0,1

3,1±0,1*

3,5±0,1*

3,4±0,1*

LYM Лимфоциты, % 20♂

20♀

78,9±0,4

75,9±1,0

69,1±0,6*

70,0±0,8*

67,8±0,4*

65,7±1,2*

70,8±1,0*

72,6±1,3

PLT Тромбоциты, 109/л

20♂

20♀

632,8±15,4

661,2±23,5

645,6±18,7

861,1±21,4*

653,0±17,6

783,3±21,6*

624,5±7,5

648,9±18,7

Примечание: * – отличие статистически значимо по сравнению с интактной группой по критерию Стьюдента, при

р<0,05

84

Таблица 15

Результаты оценки гематологических показателей крови при разработке экспериментальной модели шейного

лимфаденита через 120 часов от момента индукции патологии, M±m

Исследуемые показатели

Количество и

пол

животных



Группа 2

Индукция

патологии

ЛПС 0,1

мг/кг

Группа 3

Индукция

патологии

каррагенин

0,8 мг/кг

Группа 4

Индукция

патологии

формалин 8

мг/кг

HGB Гемоглобин, г/л 10♂

10♀

143,1±2,3

137,3±2,2

144,6±1,8

136,7±2,9

144,4±2,7

140,8±2,6

141,5±3,2

144,3±3,3

HCT Гематокрит, % 10♂

10♀

45,4±1,8

45,5±0,8

43,5±1,3

46,2±0,9

44,8±1,1

46,4±1,0

41,7±1,2

46,8±1,3

RBC Эритроциты, 1012/л

10♂

10♀

7,3±0,2

7,5±0,2

7,0±0,1

7,6±0,2

7,2±0,2

7,7±0,2

6,9±0,2

7,4±0,2

WBC Лейкоциты, 109/л

10♂

10♀

6,1±0,2

6,2±0,6

11,9±0,5*

12,9 ± 1,1*

11,8±0,3*

10,2 ± 0,4*

10,1±0,6*

10,3±0,7*

GRA Гранулоциты, % 10♂

10♀

17,5±0,5

20,1±1,7

23,1±0,8*

24,0±1,1

23,9±0,9*

24,3±1,7

20,4±1,3

19,6±1,7

MID

Моноциты/Эозинофилы, %

10♂

10♀

2,9±0,1

2,8±0,2

2,8±0,2

2,9±0,2

2,7±0,1

3,1±0,2

3,4±0,2

3,9±0,1

LYM Лимфоциты, % 10♂

10♀

79,6±0,6

77,1±1,6

74,1±0,8*

68,2±1,3*

73,4±0,9*

65,2±1,7*

76,2±1,4

71,5±1,8

PLT Тромбоциты, 109/л

10♂

10♀

639,9±28,1

669,4±24,0

719,5±16,4

709,9±19,3

638,3±17,9

677,0±28,1

620,6±19,2

619,2±24,4


р<0,05

85

Таким образом, при оценке гематологических показателей крови было

показано, что только уровень лейкоцитов через 72 часа от момента индукции

патологии представляется информативным для оценки экспериментальной

патологии острого шейного лимфаденита.

Фактор некроза опухолей (TNF-α) и интерферон- γ (INF-γ)

Для оценки выраженности воспалительного ответа при введении различных

провоспалительных агентов было проведено поределение основных

провоспалительных цитокинов TNF-α и INF-γ в сыворотке крови

экспериментальных животных через 4 и 16 часов соответственно от момента

введения в ткань лимфатических узлов провоспалительных агентов.

Полученные данные представлены в таблице 16.

Таблица 16

Оценка уровня провоспалительных цитокинов, M±m

Группа Количество и

пол животных

Показатели

иммунологического статуса

животных

TNF-α, пг/мл

через 4 часа

INF-γ, нг/мл

через 16 часов



20♂

20♀

18±2,1

20±1,8

0,0±0,0

0,0±0,0



20♂

20♀

255 ± 11,2*

278± 9,5*

56,7±6,3*

61,5±7,4*



20♂

20♀

119±6,0*

122±4,5*

25,6±4,2*

32,7±3,4*



20♂

20♀

41±2,7

36±1,3

3,6±0,3*

2,0±0,1*

Примечание: * – отличие статистически значимо по сравнению с интактной

группой по критерию Стьюдента, при р<0,05

Представленные в таблице 16 данные демонстрируют статистически

значимое повышение уровня основного провоспалительного цитокина TNF-α в

86

сыворотке крови экспериментальных животных на фоне введения в качестве

провоспалительных агентов ЛПС и каррагенина.

В ответ на введение внутрь лимфатического узла раствора каррагенина

увеличение данного показателя составило 6,6 раза для самцов и 6,8 раза для

самок. На фоне введения раствора ЛПС увеличение составило 14 раз для самцов и

15 раз для самок. На фоне введения в лимфатический узел формалина

выраженного воспалительного ответа отмечено не было.

Нами показано, что максимально выраженная картина воспаления при

оценке TNF-α наблюдалась на фоне введения в лимфатические узлы раствора

ЛПС.

IFN-γ также является важнейшим провоспалительным медиатором,

продуцируется, в основном, Т-лимфоцитами и выполняет ряд важных функций в

регулировании патологического процесса воспаления, в том числе стимулирует

эффекторные функции макрофагов.

В группе животных, которым вводили ЛПС уровень этого медиатора,

подобно TNF-α вырос наиболее значимо.

Результаты оценки биометрических параметров

После эвтаназии половины каждой экспериментальной группы через 72

часа и оставшейся половины через 120 часов у животных были выделены

поврежденный и интактный лимфатические узлы с целью их взвешивания для

оценки степени выраженности отека пораженных лимфатических узлов.

После взвешивания половина пораженных лимфатических узлов (по 5 из

каждой экспериментальной группы) была подвергнута лиофильному

высушиванию также для оценки степени отека пораженных лимфатических узлов.

Оставшиеся 5 лимфатических узлов из каждой экспериментальной группы были

зафиксированы в формалине.

Полученные результаты оценки разницы массы пораженного и интакного

лимфатических узлов представлены в таблице 17.

87

Таблица 17

Разница веса пораженного и интактного лимфатических узлов

экспериментальных животных, M±m

Группа


и пол

животных

Разница массы

пораженного и

интактного

лимфатических

узлов при эвтаназии

через 72 часа после

индукции

воспаления, мг

Разница массы

пораженного и

интактного

лимфатических

узлов при эвтаназии

через 120 часов

после индукции

воспаления, мг



10♂

10♀

11,3±1,1

9,9±1,1

10,8±1,0

10,9±0,8


патологии


10♂

10♀

39,7 ± 2,0*

42,4 ± 3,9*

28,5 ± 1,9*

32,1 ± 2,8*


патологии


10♂

10♀

21,1±1,2*

23,2±1,4*

18,2±0,9*

20,2±1,1*


патологии


10♂

10♀

15,3±1,7

14,2±1,8

13,4±1,3

11,6±2,0

Примечание: * – отличие статистически значимо по сравнению с интакной


Представленные в таблице 17 данные свидетельствуют о том, что через 72

часа от момента введения в ткань лимфатических узлов растворов ЛПС и

каррагенина наблюдался ярко выраженный отек пораженного лимфатического

узла, так как разница веса пораженного и интактного лимфатических узлов

статистически значимо превышала данный показатель интактных животных.

Более выраженные изменения были отмечены при введении экспериментальным

животным раствора ЛПС, повышение данного показателя для самцов составило

3,5, для самок – 4,3 раза.

При оценке данных показателей у экспериментальных животных через 120

часов от момента индукции патологии была показана аналогичная картина для

всех экспериментальных групп, однако была отмечена тенденция к снижению

выраженности отека лимфатических узлов.

88

Таким образом, наиболее выраженный отек лимфатических узлов был

показан через 72 часа от момента введения в лимфоидную ткань раствора ЛПС.

Для дополнительной оценки отека ткани лимфатические узлы от 5

животных из каждой группы высушивали лиофильно при температуре -56°С.

Процент потери массы пораженного лимфатического узла при высушивании

характеризует воспалительный отек лимфатической ткани. Полученные данные

представлены в таблице 18.

Таблица 18

% потери массы пораженного лимфатического узла при лиофильном

высушивании, M±m

Группа


и пол

животных

% потери массы

пораженного

лимфатического

узла через 72 часа от

момента индукции

патологии, %

% потери массы

пораженного

лимфатического

узла через 120 часов

от момента

индукции патологии,

%



5♂

5♀

13,7 ± 1,4

12,1 ±0,9

14,5 ± 1,6

13,2 ±1,1


патологии


5♂

5♀

32,6 ± 3,2*

35,1 ± 5,5*

22,1 ± 1,2*

27,3 ± 2,8*


патологии


5♂

5♀

29,0 ± 2,2*

33,1 ± 3,5*

20,3 ± 1,2*

24,1 ± 2,3*


патологии


5♂

5♀

16,9 ± 1,4

18,9 ± 0,6

15,1 ± 0,9

16,7 ± 1,0



Представленные в таблице 18 данные свидетельствуют о развитии

значительного отека пораженного лимфатического узла у животных, которым в

ткань лимфатического узла вводили ЛПС и каррагенин. Наиболее выраженные

изменения были выявлены у самок, которым вводили ЛПС через 72 часа от

момента индукции патологии – увеличение показателя потери массы пораженного

89

лимфатического узла после лиофильного высушивания в 2,9 раза отличался от

данного показателя интактной группы.

Через 120 часов было показано схожее распределение данного показателя

для всех экспериментальных групп, при этом аналогично показателю разницы

массы пораженного и интактного лимфатических узлов наблюдалась тенденция к

снижению выраженности отека лимфатических узлов.

Учитывая, приведенные выше данные о наиболее выраженном

воспалительном ответе у животных через 72 часа от момента введения

провоспалительных агентов, для оценки гистологических изменений в ткани

лимфатического узла при введении провоспалительных агентов были

использованы лимфатические узлы от 5-ти животных из каждой

экспериментальной группы, эвтаназированных через 72 часа от момента

индукции воспаления.

Установлено, что в интактной группе животных поверхность

лимфатических узлов была покрыта соединительнотканной капсулой. От капсулы

внутрь узла отходили трабекулы, образованные соединительной тканью. Между

капсулой, трабекулами и скоплениями лимфоидной ткани в лимфатических узлах

располагались синусы, содержавшие небольшое количество макрофагов.

Корковая зона состояла из первичных и вторичных фолликулов и

паракортикальной зоны. Первичные фолликулы содержали непролиферирующие

В-лимфоциты, вторичные – имели герминативные (светлые) центры размножения

и состояли из пролиферировавших В-лимфоцитов, макрофагов. Количество

вторичных фолликулов в лимфатических узлах было незначительным. Мозговая

зона состояла из В-лимфоцитов и плазматических клеток, густо заполняющих эту

часть лимфатических узлов. Гистиоцитов в синусах лимфатических узлов не

наблюдалось (рисунок 20).

В лимфатических узлах группы, получавшей ЛПС, имела место картина

острого неспецифического лимфаденита. Гистологическое строение оставалось

сохраненным, наблюдалось увеличение фолликулов в корковом слое –

гиперплазия и увеличение количества фолликулов с герминативными центрами

90

размножения (рисунок 21). При этом площадь герминативных центров

лимфатических узлов была статистически значимо увеличена почти в два раза по

сравнению с интактной группой (таблица 19).

В синусах лимфатических узлов наблюдался умеренно выраженный и

выраженный гистиоцитоз от 1 до 3 баллов (рисунок 21), что также имело

статистически значимые отличия от интактной группы. В мозговой зоне

лимфатических узлов наблюдалось увеличение количества плазматических

клеток (плазматизация) (таблица 19).

Рисунок 20 – Интактная крыса самка.

Лимфатический узел. Вторичный лимфоидный

фолликул с небольшим герминативным

центром размножения (стрелка). Окраска

гематоксилином и эозином. Увеличение 100

Рисунок 21 – Крыса самка, получившая ЛПС.

Пораженный лимфатический узел.

Герминативные центры вторичных

лимфоидных фолликулов (стрелка).

Гистиоцитоз синуса (двойная стрелка).

Окраска гематоксилином и эозином.

Увеличение 100

В лимфатических узлах животных на фоне применения каррагенина имело

место острое воспаление с картиной лимфаденита (рисунок 22), выраженное

несколько в меньшей степени по сравнению с группой, получившей ЛПС однако

статистически не отличавшееся от него (таблица 19).

В лимфатических узлах крыс, получивших формалин (рисунок 23), также

наблюдалась картина острого неспецифического лимфаденита, что проявилось в

гиперплазии лимфоидных фолликулов коркового слоя за счет вторичных

фолликулов. Первичные фолликулы без светлых центров размножения были

единичными. Площадь герминативных центров возрастала в пораженных

91

лимфатических узлах. В синусах таких узлов наблюдался выраженный

гистиоцитоз (2–4 балла). В мозговой зоне была выявлена выраженная

плазматизация ткани.

Рисунок 22 – Крыса самка, получившая

каррагенин. Пораженный лимфатический

узел. Герминативные центры вторичных

лимфоидных фолликулов (стрелка). Окраска


Рисунок 23 – Крыса самка, получившая

формалин. Пораженный лимфатический

узел. Увеличенный герминативный центр

вторичного лимфоидного фолликула

(стрелка). Окраска гематоксилином и

эозином. Увеличение 100

Таблица 19

Площадь герминативных центров лимфоидных фолликулов и гистиоцитоз

синусов в пораженных лимфатических узлах шеи крыс через 72 часа от момента

индукции патологии, M±m

Группа


и пол

животных

Площадь

герминативных

центров лимфоидных

фолликулов в

пораженных ЛУ, мм2

×10-3

Гистиоцитоз

синусов

пораженных

ЛУ, баллы



5♂

5♀

47 ± 2

41±4

0,2±0,2

0,2±0,2


патологии


5♂

5♀

89 ± 10*

85±5*

3,2±0,4*

3,2±0,5*


патологии


5♂

5♀

79 ± 7*

69±5*

2,4±0,5*

2,0±0,4*


патологии


5♂

5♀

73 ± 9

68±6*

1,8±0,4*

1,8±0,4*

92



Таким образом, гистологически подтверждено, что при экспериментальном

моделировании острого шейного лимфаденита в группах крыс, получавших

разные провоспалительные агенты, в регионарных лимфатических узлах

развивалась картина острого неспецифического лимфаденита, которая

характеризовалась увеличением площади герминативных центров лимфоидных

фолликулов в пораженных лимфатических узлах и увеличением выраженности

гистиоцитоза синусов.

В ходе разработки экспериментальной модели острого шейного

лимфаденита было установлено, что наиболее выраженный воспалительный ответ

по гистологическим показателям был показан при введении в ткань

лимфатического узла самок крыс раствора ЛПС в дозе 0,1 мг/кг и каррагенина в

дозе 0,8 мг/кг.

Сформирован перечень наиболее информативных показателей,

характеризующих данную экспериментальную патологию с точки зрения

дальнейшей оценки эффективности лекарственных средств:

1. Концентрация С-реактивного белка в плазме крови через 72 часа.

2. Уровень лейкоцитов в крови через 72 часа.

3. Уровень медиаторов воспаления в сыворотке крови: TNF-α через 4 часа и

INF-γ через 16 часов.

4. Оценка степени отека пораженных лимфатических узлов через 72 часа

(разница массы пораженного и интактного лимфатических узлов и процент

потери массы пораженного лимфатического узла при лиофильном высушивании).

5. Гистометрия герминативных центров лимфоидных фолликулов и степени

гистиоцитоза пораженных лимфатических узлов.

93

Результаты валидации новой модели экспериментального острого шейного


По результатам разработки новой экспериментальной модели острого

шейного лимфаденита у крыс в качестве провоспалительного агента для

проведения эксперимента был использован ЛПС, как наиболее коммерчески

доступный агент, в дозе 0,1 мг/кг.

Для проверки сходимости основных отобранных показателей,

характеризующих развитие экспериментальной патологии, было проведено три

серии экспериментов. Эксперименты проводились на самках линии Вистар с

использованием в качестве провоспалительного агента ЛПС в дозе 0,1 мг/кг в

различные сезоны (весна, лето, осень):

Первая серия экспериментов была проведена с 23.03.10 по 26.03.10.

Вторая серия экспериментов была проведена с 06.06.10 по 09.06.10.

Третья серия экспериментов была проведена с 14.10.10 по 17.10.10.

В качестве показателей для оценки сходимости были выбраны:

1. Концентрация С-реактивного белка в плазме крови через 72 часа.

2. Уровень лейкоцитов в крови через 72 часа.

3. Уровень медиаторов воспаления в сыворотке крови: TNF-α через 4 часа и

INF-γ через 16 часов.

4. Оценка степени отека пораженных лимфатических узлов через 72 часа

(разница массы пораженного и интактного лимфатических узлов и процент


Масса тела экспериментальных животных в эксперименте по валидации

экспериментальной модели шейного лимфаденита на самках крыс линии Вистар

представлена в таблице 20.

94

Таблица 20

Масса тела экспериментальных животных в эксперименте по валидации

экспериментальной модели шейного лимфаденита на самках крыс линии Вистар,

M±m, n=10

Группа Масса тела, г



(ложнооперированные) 188±10 197±9 185±7


патологии 196±6 192±6 190±5

Оценку сходимости показателя концентрации С-реактивного белка в плазме

крови при индукции острого шейного лимфаденита в различные сезоны года

проводили через 72 часа от момента индукции экспериментальной патологии

(таблица 21).

Таблица 21

Концентрация С-реактивного белка в сыворотке крови экспериментальных

животных в различных сериях экспериментов, M±m, n=10

Группа СРБ, г/л




16,9 ± 3,2

RSD=61%

18,9 ± 2,8

RSD=48%

15,7 ± 2,7

RSD=54%


патологии

27,7 ± 3,7*

RSD=42%

28,1 ± 3,1*

RSD=35%

26,3 ± 1,9*

RSD=22%



Представленные в таблице 21 данные свидетельствуют о том, что уровень

С-реактивного белка не имел статистически значимых отличий между сериями

эксперимента по критерию Стьюдента. При этом в каждой серии эксперимента

данный показатель статистически значимо отличался от уровня интактных

95

животных в среднем на 55%. Такие данные свидетельствуют о том, что

экспериментальная модель острого шейного лимфаденита по показателю СРБ

воспроизводима, не зависимо от сезона, в который выполняли эксперимент.

Показатель относительного стандартного отклонения в экспериментальных

группах имел значения от 22 до 61%. Для аналитических методов за стандарт

принято значение RSD≤20 %, тогда методика может считаться валидированной по

показателю сходимость. На сегодняшний день в доступной литературе не удается

найти данные по желаемым величинам данного показателя для

фармакологических моделей.

Оценку сходимости показателя уровня лейкоцитов в крови

экспериментальных животных при индукции острого шейного лимфаденита в

различные сезоны года проводили через 72 часа от момента индукции патологии


Таблица 22

Оценка уровня лейкоцитов экспериментальных животных, M±m, n=10

Группа Лейкоциты,×10

9 /л




6,4 ± 0,4

RSD=19%

6,7 ± 0,6

RSD=29%

7,1 ± 0,5

RSD=22%

Группа 2 Индукция патологии 17,2 ± 0,6*

RSD=10%

18,6 ± 0,7*

RSD=13%

17,7 ± 0,7*

RSD=13%



Представленные в таблице 22 данные свидетельствуют о том, что уровень

лейкоцитов не имел статистически значимых отличий между сериями

эксперимента. При этом в каждой серии эксперимента данный показатель

статистически значимо отличался от уровня интактных животных в среднем в 2,5

раза. Такие данные свидетельствуют о том, что экспериментальная модель

острого шейного лимфаденита воспроизводима по показателю уровень

лейкоцитов, не зависимо от времени года.

96


группах имел значения от 10 до 29%, что очень близко по значениям для

аналитических методов и может свидетельствовать о том, что методика

валидирована по показателю сходимость.

Полученные данные имеют подтверждение в справочной литературе (Weiss

D.J., Wardrop K.J., 2010; Макаров В.Г., Макарова М.Н., 2013), что свидетельствует

о том, что данная экспериментальная модель валидирована по показателю

правильность (точность).

Проверку сходимости показателя уровня TNF-α и INF-γ в сыворотке крови

при индукции острого шейного лимфаденита в различные сезоны года проводили

через 4 и 16 часов соответственно, после индукции экспериментальной патологии

(таблицы 23, 24).

Таблица 23

Оценка уровня TNF-α экспериментальных животных, M±m, n=10

Группа TNF-α, пг/мл


Группа 1 Интактные (ложнооперированные) 19±1,5

RSD=26%

21±2,1

RSD=32%

18±1,8

RSD=32%

Группа 2 Индукция патологии 249±7,6

*

RSD=10%

237 ± 9,2*

RSD=13%

258± 10,1*

RSD=13%



Таблица 24

Оценка уровня INF-γ экспериментальных животных, M±m, n=10

Группа INF-γ, нг/мл


Группа 1 Интактные (ложнооперированные) 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0

Группа 2 Индукция патологии 66,3 ± 5,3

*

RSD=29%

62,2 ± 6,3*

RSD=32%

59,5 ± 3,3*

RSD=19%

97



Представленные в таблицах 23 и 24 данные свидетельствуют о том, что

уровень провоспалительных цитокинов не имел статистически значимых отличий

между сериями эксперимента. При этом в каждой серии эксперимента данные

показатели статистически значимо отличались от уровня интактных животных.

TNF-α в среднем увеличивался в 12 раз, INF-γ от нулевых значений достигал

значений 60 нг/мл. Такие данные свидетельствуют о том, что экспериментальная

модель острого шейного лимфаденита по показателям TNF-α и INF-γ

воспроизводима, не зависимо от времени года.


группах имел значения от 10 до 32%, что очень близко по значениям для

аналитических методов и может свидетельствовать о том, что методика


Проверку сходимости показателя массы лимфатических узлов и % потери

массы пораженного лимфатического узла при высушивании проводили после

эвтаназии экспериментальных животных через 72 часа от момента индукции

патологии (таблица 25, 26).

Таблица 25

Разница веса пораженного и интактного лимфатических узлов

экспериментальных животных, M±m, n=10

Группа Серия 1 Серия 2 Серия 3

Группа 1 Интактные (ложнооперированные) 10,3±1,5

RSD=48%

11,8±1,3

RSD=35%

9,5 ± 2,3

RSD=77%


*

RSD=38%

49,7 ± 6,1*

RSD=38%

45,5 ± 4,3*

RSD=29%



98

Таблица 26

Процент потери массы пораженного лимфатического узла при высушивании,

M±m, n=10

Группа Серия 1 Серия 2 Серия 3

Группа 1 Интактные (ложнооперированные) 11,7 ± 1,2

RSD=32%

12,9 ± 1,3

RSD=32%

11,9 ± 0,9

RSD=26%


*

RSD=42%

34,1 ± 2,5*

RSD=22%

31,9 ± 3,0*

RSD=29%



Представленные в таблицах 25 и 26 данные свидетельствуют о том, что

степень отека пораженных лимфатических узлов не имела статистически

значимых отличий между сериями эксперимента. При этом в каждой серии

эксперимента данные показатели статистически значимо отличались от уровня

интактных животных. Разница веса пораженного и интактного лимфатических

узлов в среднем увеличивалась в 4,3 раза, процент потери массы лимфатического

узла после высушивания – в 2,6 раза. Такие данные свидетельствуют о том, что

экспериментальная модель острого шейного лимфаденита воспроизводима, не

зависимо от времени года.


группах имел значения от 22 до 48%.

Представленные в данном разделе данные по валидации новой

экспериментальной модели острого шейного лимфаденита свидетельствуют о

том, что новая экспериментальная модель острого шейного лимфаденита

валидирована по валидационным характеристикам: правильность или точность и

сходимость.

99

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ КЛС-04 В СРАВНЕНИИ С ТАНТУМ ВЕРДЕ,

ДИКЛОФЕНАКОМ И ДЕКСАМЕТАЗОНОМ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

МОДЕЛИ ОСТРОГО ШЕЙНОГО ЛИМФАДЕНИТА

Оценка смертности в экспериментальных группах

При использовании в данном эксперименте лечебно-профилактической

схемы введения препаратов наблюдалась смертность экспериментальных

животных в результате интоксикации до индукции патологии (таблица 27).

Таблица 27

Смертность в экспериментальных группах

Группа

Количество павших животных/

изначальное количество животных в группе

% смертности

Интактная 0/10 0

Контрольная 0/10 0

Тантум верде 0/10 0

Диклофенак 3/10 30

Дексаметазон 6/10 60

КЛС-04 0,6 мг/кг 0/10 0

КЛС-04 0,8 мг/кг 0/10 0

КЛС-04 1,0 мг/кг 0/10 0

КЛС-04 1,2 мг/кг 0/10 0

Смертность наблюдалась в экспериментальных группах, получавших

препараты сравнения. На фоне применения диклофенака в течение эксперимента

смертность составила 30 %, а на фоне использования препарата сравнения

100

дексаметазон – 60%. В ходе некропсии было установлено, что смерть животных

произошла в результате интоксикации. Животные были сильно истощены.

Оценка показателей крови экспериментальных животных

Кровь для исследования брали из хвостовой вены.

Для оценки системного влияния препаратов на организм оценивали уровень

TNF-α через 4 часа от момента индукции патологии, INF-γ через 16 часов с

момента индукции патологии оценивали уровень СРБ и лейкоцитов.

Полученные данные представлены в таблице 28.

Таблица 28

Оценка TNF-α, INF-γ, СРБ и лейкоцитов в крови экспериментальных животных,

M±m


4 часа

INF-γ, нг/мл

16 часов

СРБ, мг/л

72 часа

Ley, ×109 /л

72 часа

Интактная,

n=10 22±1,9 0,0 ± 0,0 18,3±2,6 6,6±0,4

Контрольная,

n=10 242± 9,5

* 65 ± 5

* 32,9±3,2

* 18,2±0,4

*

Тантум верде 1,2

мг/кг, n=10 105±12,0

*** 59±3

* 21,4±0,4 9,2±0,6

***

Диклофенак 11

мг/кг, n=7 45±3,2** 0,0±0,0** 23,0±2,4 12,2 ± 0,6

***

Дексаметазон 5

мг/кг, n=4 24±2,4** 0,0±0,0** 22,6±1,6 8,3 ± 1,2**

КЛС-04 0,4 мг/кг,

n=10 210±9

*** 68±5

* 27,6±1,4 13,6±0,5

***


n=10 150±15

*** 51±4

* 25,0±5,2 11,2±0,5

***


n=10 123±16

*** 39±5

*** 19,1±2,4** 10,5±0,4

***


n=10 85±6

*** 33±2

*** 16,8±1,4** 8,9±0,4**

101



4 часа

INF-γ, нг/мл

16 часов

СРБ, мг/л

72 часа

Ley, ×109 /л

72 часа


n=10 78±8

*** 32±3

*** 15,2±2,0** 7,9±0,6**

Примечание:

* - отличие статистически значимо по сравнению с интактной группой по

критерию Стьюдента, при р<0,05;

**– отличие статистически значимо по сравнению с контрольной группой

по критерию Стьюдента, при р<0,05

Представленные в таблице 28 данные свидетельствуют о том, что через 4

часа от момента индукции патологии уровень TNF-α у контрольных животных

статистически значимо повышался по сравнению с интактной группой в 11 раз,

что свидетельствует о развитии выраженного острого воспаления на фоне

экспериментальной патологии и подтверждает данные, полученные при

валидации модели. При использовании препарата сравнения тантум верде

наблюдалось снижение данного показателя в 2,3 раза по сравнению с

контрольной группой, что свидетельствует о наличии у данного препарата

противовоспалительного эффекта, однако уровень интактных животных

достигнут не был. При использовании в качестве препаратов сравнения

диклофенака и дексаметазона наблюдалось снижение уровня TNF-α до значений

интактной группы, что свидетельствует о наличии у данных препаратов

выраженного противовоспалительного эффекта. На фоне применения

исследуемого КЛС-04 была отмечена выраженная дозозависимость. В

минимальной дозе противовоспалительного эффекта в отношении уровня TNF-α

отмечено не было, в средних дозах снижение данного показателя составило 1,6 и

2 раза для доз 0,8 и 1,6 мг/кг соответственно. В максимальных дозах КЛС-04 3,2 и

6,4 мг/кг противовоспалительный эффект был выражен максимально и

превосходил препарат сравнения тантум верде, были достигнуты значения

интактных животных.

102

В отношении показателя INF-γ было показано его выраженное увеличение

от нулевых значений в интактной группе до 65 нг/мл у контрольных животных,

что подтверждает данные разработки и валидации данной экспериментальной

модели и свидетельствует о развитии выраженного острого воспаления при

моделировании шейного лимфаденита у экспериментальных животных. При этом

на фоне лечения терапевтический эффект был показан только для препаратов

сравнения диклофенак и дексаметазон, был достигнут уровень интактных

животных. Также значительный терапевтический эффект был показан для

исследуемого КЛС-04 в дозах 1,6; 3,2 и 6,4 мг/кг, уровень INF-γ был

статистически значимо снижен по сравнению с контрольной группой, однако

оставался статистически значимо выше данного показателя у интактных

животных. На фоне применения препарата сравнения тантум верде

терапевтического эффекта в отношении данного показателя отмечено не было.

На третьи сутки после введения в ткань лимфатических узлов

провоспалительного агента в контрольной группе наблюдалось увеличение

уровня СРБ по сравнению с интактными животными на 69 %, что согласуется с

данными по валидации.

На фоне лечения статистически значимый эффект наблюдался только на

фоне применения КЛС-04 в дозах 1,6; 3,2 и 6,4 мг/кг, снижение уровня СРБ

произошло до показателей интактных животных. В остальных дозах КЛС-04 и

при применении в качестве терапии препаратов сравнения статистически

значимого эффекта в отношении уровня СРБ отмечено не было.

Через 72 часа от момента индукции патологии уровень лейкоцитов

увеличился в контрольной группе в 2,8 раза по сравнению с интактными

животными. На фоне лечения препаратом сравнения тантум верде данный

показатель был снижен в 2 раза по сравнению с контролем. Также выраженный

терапевтический эффект был показан для препарата сравнения дексаметазон,

снижение уровня лейкоцитов произошло до значений интактных животных. При

использовании в качестве лечения исследуемого КЛС-04 была показана

дозозависимость и максимально выраженный терапевтический эффект,

103

сопоставимый с препаратом сравнения при использовании максимальнох доз 3,2

и 6,4 мг/кг, при этом, в обоих случаях, был достигнут уровень интактных

животных.

Оценка биометрических показателей лимфатических узлов

экспериментальных животных

С целью установления влияния препаратов на выраженность одного из

основных признаков воспаления – отека, было проведено лиофильное

высушивание пораженных лимфатических узлов.

Наиболее выраженный отек лимфатических узлов наблюдался в

контрольной группе. В этой группе животных определялась значительная потеря

массы пораженных лимфатических узлов после лиофилизации, что

свидетельствует о выраженной предшествующей экссудации, а также об

адекватно вызванном местном воспалении (таблица 29).

Таблица 29

Потеря массы пораженного лимфатического узла экспериментальных животных,

M±m

Группа Разница массы % потери массы пораженного

лимфатического узла, %

Интактная

n=5 10,3±1,3 15,8 ± 1,4

Контрольная

n=5 40,5±1,5

* 38,0 ± 1,8

*

Тантум верде 1,2 мг/кг

n=5 27,6±1,8

*** 19,7 ± 1,7**

Диклофенак 11 мг/кг

n=3 27,9±5,7

*** 17,7 ± 4,7**

Дексаметазон 5 мг/кг

n=2 27,6±10,8

*** 38,2 ± 16,3

*

КЛС-04 0,4 мг/кг

n=10 30,8±1,0

*** 20,0 ± 0,6**


n=10 27,5±0,7

*** 19,5 ± 0,6**


n=10 25,7±0,6

*** 19,6 ± 0,4**


n=10 25,4±0,9

*** 19,8 ± 0,9**

104


Группа Разница массы % потери массы пораженного

лимфатического узла, %


n=10 26,1±0,7

*** 20,0 ± 0,8**


* – отличие статистически значимо по сравнению с интактной группой по




На фоне лечения во всех экспериментальных группах было показано

одинаковое статистически значимое снижение процента потери массы

пораженного лимфатического узла по сравнению с контрольной группой (на 28–

30%), что свидетельствует о наличии у всех исследуемых препаратов во всех

дозах выраженного противоотечного действия, за исключением препарата

сравнения дексаметазон для которого не удалось установить противоотечный

эффект ввиду смертности экспериментальных животных и малого количества

животных в группе.

Результаты патоморфологического исследования лимфатических узлов

Для оценки специфической фармакологической активности КЛС-04 в

различных дозах в сравнении с препаратами тантум верде, диклофенак и

дексаметазон, была проведена сравнительная гистологическая и

морфометрическая оценка их влияния на стимуляцию макрофагов, гистиоцитов и

В-лимфоцитов пораженных лимфатических узлов шеи у крыс.

Интактная группа

Поверхность лимфатических узлов была покрыта соединительнотканной

капсулой, от которой внутрь узла отходили трабекулы – балки, образованные

соединительной тканью. Между капсулой, трабекулами и скоплениями

лимфоидной ткани в лимфатических узлах располагались синусы, содержавшие

небольшое количество макрофагов. В лимфатических узлах наблюдалось две

зоны:

105

1. Корковая зона, которая располагалась под капсулой и состояла из

первичных, вторичных фолликулов, представленных В-лимфоцитами, и

паракортикальной зоны, представленной Т-лимфоцитами. Первичные фолликулы

содержали непролиферирующие В-лимфоциты, вторичные – имели

герминативные (светлые) центры размножения и состояли из пролиферировавших

В-лимфоцитов, макрофагов. Количество вторичных фолликулов в лимфатических

узлах было незначительным.

2. Мозговая зона состояла из В-лимфоцитов и плазматических клеток, густо

заполняющих эту часть лимфатических узлов. Гистиоцитов в синусах

лимфатических узлов не наблюдалось (рисунок 24).

Контрольная группа

В лимфатических узлах данной группы имела место картина острого

неспецифического лимфаденита. Гистологическое строение оставалось

сохраненным, наблюдалось увеличение фолликулов в корковом слое –

гиперплазия и увеличение количества фолликулов с герминативными центрами

размножения (рисунок 25). При этом площадь герминативных центров

лимфатических узлов была статистически значимо увеличена почти в два раза по

сравнению с интактной группой. В мозговой зоне лимфатических узлов

наблюдалось увеличение количества плазматических клеток (плазматизация)

(таблица 30). В синусах лимфатических узлов наблюдался умеренно выраженный

и выраженный гистиоцитоз от 1 до 4 баллов (рисунок 25), что также имело

статистически значимые отличия от интактной группы.

106

Рисунок 24 – Интактная крыса.

Лимфатический узел. Вторичный лимфоидный

фолликул с мелким герминативным центром

размножения (стрелка). Окраска


Рисунок 25 – Крыса контрольной группы.

Пораженный лимфатический узел.

Увеличенные герминативные центры

вторичных лимфоидных фолликулов

(стрелка). Гистиоцитоз синуса (двойная

стрелка) Окраска гематоксилином и эозином.



В лимфатических узлах данной группы сохранялась картина острого

неспецифического лимфаденита, что проявилось в гиперплазии лимфоидных

фолликулов коркового слоя за счет вторичных фолликулов (рисунок 26).

Первичные фолликулы без светлых центров размножения были единичными.

Площадь герминативных центров возрастала в пораженных лимфатических узлах

по сравнению с интактными животными, но статистически значимых отличий

показано не было. В синусах пораженных узлов наблюдался умеренный

гистиоцитоз (в среднем 2 балла). В мозговой зоне была выявлена выраженная

плазмоцитарная реакция.

107

Таблица 30

Площадь герминативных центров лимфоидных фолликулов и гистиоцитоз

синусов в пораженных лимфатических узлах шеи крыс различных групп, M±m

Группа Площадь герминативных центров лимфоидных

фолликулов в пораженных ЛУ, мм2 ×10

-3

Гистиоцитоз

синусов

пораженных

ЛУ, баллы

Интактная

n=5 45 ± 3 0,2±0,2

Контрольная

n=5 91 ± 7

* 3,2±0,4*

Тантум верде 1,2

мг/кг

n=5

63 ± 6 2,0±0,3

Диклофенак 11

мг/кг

n=3

79 ± 7* 2,7 ± 0,3

*

Дексаметазон 5

мг/кг

n=2

12 ± 3** 2,5 ± 0,5


n=5 53 ± 9**

2,2±0,6


n=5 48 ± 8**

2,4±0,5*


n=5 69 ± 9 2,2±0,6


n=5 50 ± 6**

1,8±0,6


n=5 47 ± 8** 2,3±0,8






108

Рисунок 26 – Крыса группы, получавшей

тантум верде. Пораженный лимфатический


лимфоидных фолликулов (стрелка). Окраска



В лимфатических узлах животных на фоне применения препарата

сравнения диклофенак имело место острое воспаление с картиной лимфаденита

(рисунок 27), выраженное несколько в меньшей степени по сравнению с

контрольной группой, однако статистически не отличавшееся от него (таблица

30).


При изучении лимфатических узлов на фоне применения препарата

дексаметазон площадь герминативных центров лимфатических узлов была

значительно меньше таковой интактной группы, что свидетельствует об

угнетении лимфоцитов, а, следовательно, и об уменьшении образования антител,

снижении иммунологического надзора (рисунок 28). Учитывая способность

глюкокортикоидов угнетать фагоцитоз в очаге воспаления, можно объяснить

снижение гистиоцитоза в синусах лимфатических узлов под влиянием

дексаметазона. Однако, необходимо отметить, что в связи с высокой смертностью

животных в данной группе статистически значимых отличий от контрольных

животных отмечено не было (таблица 30).

109


диклофенак. Пораженный лимфатический


лимфатических фолликулов (стрелка).




дексаметазон. Пораженный лимфатический


лимфатических фолликулов (стрелка).



КЛС-04

Отмечалось различное влияние разных доз КЛС-04 на морфологию

лимфатических узлов. В основном противовоспалительное действие КЛС-04

проявлялось в уменьшении площади герминативных центров вторичных

фолликулов, дозозависимости отмечено не было, эффект был примерно

одинаковый во всех группах (рисунок 29, 30). Однако препарат не оказывал

влияние на гистиоцитоз синусов изучаемых лимфатических узлов. Показатели не

отличались от группы контроля, была отмечена тенденция к их снижению. Такие

проявления могут быть связаны с основным влиянием препарата на лимфоциты и

слабым влиянием на макрофагально-гистиоцитарную инфильтрацию.

110


КЛС-04 в дозе 3,2 мг/кг. Пораженный

лимфатический узел. Увеличенные

герминативные центры вторичных

лимфоидных фолликулов (стрелка).




КЛС-04 в дозе 6,4 мг/кг. Пораженный

лимфатический узел. Герминативные

центры вторичных лимфоидных

фолликулов (стрелка). Окраска

гематоксилином и эозином. Увеличение

200

Таким образом, гистологически установлено, что при экспериментальном

моделировании острого шейного лимфаденита в группах крыс без лечения и

получавших лечение препаратами КЛС-04 и тантум верде в регионарных

лимфатических узлах развивалась картина острого неспецифического

лимфаденита, которая характеризовалась изменениями лимфатических узлов с

иммунным ответом по гуморальному типу. При этом максимальный

положительный эффект наблюдался в группах животных, получавших КЛС-04 в

дозах 1,6; 3,2 и 6,4 мг/кг, что проявлялось в основном в ингибировании

пролиферации лимфоцитов, но не макрофагов и гистиоцитов. При применении

препарата сравнения тантум верде противовоспалительный эффект был

сопоставим с исследуемым препаратом КЛС-04. Для препарата сравнения

диклофенак статистически значимых отличий от контрольной группы по

гистологическим показателям отмечено не было. При использовании в качестве

терапии препарата сравнения дексаметазон был показан его выраженный

111

противовоспалительный эффект, однако ввиду высокой смертности животных

статистически значимых отличий от контрольных животных не наблюдалось.

В ходе данного эксперимента было показано, что наиболее выраженным

дозозависимым противовоспалительным действием обладает КЛС-04 в дозах 3,2

и 6,4 мг/кг, что позволяет рекомендовать его для применения в терапии в качестве

противовоспалительного средства.

112


ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТРОГО РИНОСИНУСИТА

Результаты разработки новой модели экспериментального острого


Клиническая картина

При введении в носовые ходы провоспалительных агентов в первые же

сутки у экспериментальных животных отмечались изменения, характерные для

клинической картины острого риносинусита (таблица 32).

У группы животных, которым вводили ЛПС, клиническая картина была

выражена слабо. Наблюдалось – чихание, небольшое покраснение и мокнутие

шерсти вокруг носовых ходов. Различий между клинической картиной у самцов и

самок не отмечалось.

У группы животных, которым вводили каррагенин, острый риносинусит

был несколько более выражен, отмечалось покраснение слизистой оболочки и

кожи, мокнутие шерсти вокруг носа, наблюдались серозные выделения из

носовых ходов, чихание. У самок картина заболевания была несколько более

яркой.

После введения формалина в носовые ходы у экспериментальных животных

развивалась наиболее выраженная клиническая картина острого ринита, которая

проявлялась: затрудненным дыханием, покраснением слизистой оболочки и кожи

вокруг наружных носовых ходов, мокнутием шерсти вокруг носовых ходов,

выделениями серозного или гнойного характера из носовых ходов, чиханием.

Макроскопическая характеристика изменений слизистой оболочки носовых

ходов у крыс

При оценке экспериментальной патологии при введении ЛПС у всех

животных отмечалась гиперемия слизистых оболочек носовых ходов, одинаково

выраженная у самцов и самок, отделяемое отсутствовало.

113

При введении каррагенина также у всех животных, независимо от пола

наблюдалось полнокровие слизистых оболочек носовых ходов, одинаково

выраженное у самцов и самок, отделяемое преимущественно катарального

характера.

У всех животных при введении формалина отмечалось покраснение

слизистых оболочек носовых ходов, более выраженное у самок. Отделяемое

содержимое из носовых ходов носило катаральный, серозный и серозно-гнойный

характер. Интересно отметить, что у самок частота встречаемости гнойного

риносинусита доминировало (у 8 самок из 10). Среди самцов доминировали

проявления серозного риносинусита (у 7 самцов из 10).

Оценка влияния различных провоспалительных агентов на гистологические

изменения слизистой оболочки носовых ходов крыс

Для оценки экспериментальной патологии были использованы

гистологические методы: определение количества бокаловидных клеток, степени


клетки и гистиоциты) и лейкоцитами слизистой оболочки и подслизистого слоя.

При микроскопическом исследовании слизистой оболочки и подслизистого

слоя носовых ходов и придаточных пазух носовых ходов крыс, которым был

введен формалин, были выявлены наиболее выраженные патогистологические

изменения, которые характеризовали острое течение риносинусита:

полнокровие и гиперплазия слизистой;

гиперплазия эпителия обонятельной части носовых ходов за счет

увеличения рядности клеток;

очаговый некроз эпителия носовых ходов;

увеличение количества бокаловидных клеток;

различная степень инфильтрации слизистой оболочки и

подслизистого слоя лейкоцитами, плазматическими клетками, гистиоцитами и

макрофагами;

расширенные железы подслизистого слоя;

114

гиперпродукция кислой слизи железами подслизистого слоя (рисунок

32).

При введении в качестве провоспалительных агентов каррагенина (рисунок

33) и ЛПС (рисунок 34) также наблюдалась картина острого риносинусита, была

отмечена гиперплазия бокаловидных клеток и воспалительная инфильтрация

слизистой оболочки и подслизистого слоя. Однако данные признаки были

значительно менее выраженными, нежели на фоне введения в носовые ходы

формалина.

Рисунок 33 – Крыса с острым ринитом,

индуцированным каррагенином. Слизистая

носа с умеренно выраженной гиперплазией

бокаловидных клеток (↑) и умеренной

воспалительной инфильтрацией (↑)

Рисунок 34 – Крыса с острым ринитом,

индуцированным введением ЛПС.

Слизистая носа с умеренно выраженной

гиперплазией бокаловидных клеток (↑) и

умеренной воспалительной инфильтрацией

(↑)

При изучении экспериментальной патологии оценивалось количество

бокаловидных клеток слизистой носовых ходов, содержавших кислую слизь.

Форма и число бокаловидных клеток зависит от функционального

состояния слизистой оболочки. При катаральном воспалении слизистой носа

увеличивается число бокаловидных клеток, вследствие чего изменяется их

нормальное соотношение с мерцательными клетками эпителия. Это приводит к

нарушению работы мукоцилиарной транспортной системы, обеспечивающей

перемещение продуктов секреции слизистой оболочки и оседающих на ее

поверхности микроорганизмов и различных чужеродных частиц в сторону

носоглотки, т.е. ее очищение – клиренс.

115

Таблица 31

Полуколичественная оценка клинических проявлений острого риносинусита у экспериментальных животных, n=10



Затрудненное

дыхание

Покраснение


и кожи вокруг

наружных носовых

ходов

Мокнутие

шерсти

вокруг

носовых

ходов

Выделения из

носа серозного

или гнойного

характера

Чихание

Группа 1

Интактные

10

10

Самцы

самки

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Группа 2

Индукция

патологии

ЛПС 0,1

мг/кг

10

10

Самцы

самки

-

-

+

+

+

+

-

-

+

+

Группа 3

Индукция

патологии

каррагенин

1,6 мг/кг

10

10

Самцы

самки

-

-

+

++

+

++

+

+

+++

+++

Группа 4

Индукция

патологии

формалин 12

мг/кг

10

10

Самцы

самки

+

+

++

+++

+++

+++

++

+++

+++

+++

116

Данные представлены в таблице 32. Представленные в таблице 32 данные

свидетельствуют о наличии воспалительного процесса у животных всех

экспериментальных групп, так как у всех животных, которым вводили

провоспалительные агенты, эпителий обонятельной части носовых ходов был

гиперплазирован за счет увеличения рядности клеток, железы подслизистого слоя

были расширены, количество бокаловидных клеток, содержащих кислую слизь,

было достоверно увеличено по сравнению с группой интактных животных

(p<0,05).

Таблица 32

Количество бокаловидных клеток в экспериментальных группах, M±m, n=10




бокаловидных

клеток/мм2

Группа 1 Интактные 10

10

Самцы

самки

8,3±0,6

7,3±0,2



10

10

Самцы

самки

13,8±0,9*

14,6±0,7*



10

10

Самцы

самки

14,9±0,5*

14,0±0,7*



10

10

Самцы

самки

23,9±1,0*

24,2±0,7*

Примечание: * - отличие статистически значимо по сравнению с интактной


Однако при введении экспериментальным животным ЛПС и каррагенина

количество бокаловидных клеток увеличилось вдвое по сравнению с интактными

животными, а при введении формалина увеличение данного показателя

произошло в 2,9 раза для самцов и в 3,3 раза для самок. Схожие данные были

получены Jung H.W. et al., 2013 на экспериментальной модели аллергического

риносинусита.

Кроме того во всех экспериментальных группах, которым были введены

провоспалительные агенты, слизистая оболочка и подслизистый слой имели

выраженную инфильтрацию клеточными элементами (таблица 33).

Представленные в таблице 33 данные свидетельствуют о том, что наиболее

выраженная инфильтрация слизистой оболочки и подслизистого слоя

117

лейкоцитами была отмечена у самок, которым в качестве провоспалительного

агента был введен формалин. Аналогичные данные были показаны Yamasaki M. et

al. в 2002 году на экспериментальной модели аллергического риносинусита.

Показатель инфильтрации слизистой оболочки и подслизистого слоя

мононуклеарами оказался не информативен при данной экспериментальной

модели.

В ходе разработки экспериментальной модели острого риносинусита было

показано, что наиболее выраженный воспалительный ответ был показан при

введении в носовые ходы самок крыс водного раствора формалина в дозе 12

мг/кг.

Был выделен перечень показателей, характеризующих данную

экспериментальную патологию:

1. Оценка клинической картины.

2. Оценка макроскопических признаков воспаления носовых ходов.

3. Оценка количества бокаловидных клеток.

4. Оценка инфильтрации слизистой оболочки и подслизистого слоя

лейкоцитами.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том, что

была получена адекватная экспериментальная модель острого риносинусита у

крыс самок линии Вистар, путем развития асептического воспаления носовых

ходов.

Сформирован перечень показателей для оценки терапевтической

эффективности лекарственных средств на данной модели. Показано, что под

действием формалина у экспериментальных животных развивается острый

риносинусит по типу: катарального, серозного и серозно-гнойного воспаления.

Микроскопическая характеристика изменений слизистой оболочки носовых

ходов показала, что при формировании острого риносинусита у

экспериментальных животных происходит увеличение количества бокаловидных

клеток и развивается инфильтрация лейкоцитами слизистой оболочки и

подслизистого слоя носовых ходов.

118

Такие данные свидетельствуют о возможности изучения эффективности

препаратов на полученной модели острого риносинусита.

Данная экспериментальная модель, благодаря своей дешевизне и

относительной простоте исполнения, может быть применима для исследований

препаратов, нацеленных на лечение острых риносинуситов, а также для оценки

противовоспалительного, сосудосуживающего и других эффектов препаратов,

применяемых в ЛОР-практике.

Результаты валидации новой модели экспериментального острого


В результате экспериментальной работы по разработке экспериментального

острого риносинусита в качестве провоспалительного агента для проведения

эксперимента был выбран водный раствор формалина в дозе 12 мг/кг.

Масса тела экспериментальных самок крыс линии Вистар при проведении

исследования по валидации экспериментальной модели острого риносинусита

представлена в таблице 34.

Таблица 34

Масса тела экспериментальных самок крыс линии Вистар при проведении

исследования по валидации экспериментальной модели острого риносинусита,

M±m, n=10



Группа 1 Интактные 199±9 207±7 206±6


119

Таблица 33

Сравнительная микроскопическая характеристика изменений в слизистой оболочке и в подслизистом слое носовых ходов у

крыс при развитии экспериментальной модели острого риносинусита в баллах, M±m, n=10

Группа Пол Мононуклеары


Лейкоциты

слизистой

оболочки

Мононуклеары

подслизистого слоя

Лейкоциты

послизистого слоя

Группа 1

Интактные

Самцы

самки

0,1±0,1

0,2±0,1

0,0±0,0

0,0±0,0

0,1±0,1

0,2±0,1

0,0±0,0

0,0±0,0

Группа 2

Индукция

патологии


Самцы

самки

0,1±0,1

0,1±0,1

2,1±0,3*

1,9±0,3*

0,2±0,1

0,1±0,1

1,8±0,4*

1,7±0,3*

Группа 3

Индукция

патологии

каррагенин 1,6

мг/кг

Самцы

самки

0,1±0,1

0,2±0,1

1,6±0,4*

1,6±0,4*

0,1±0,1

0,2±0,1

1,7±0,3*

2,0±0,3*

Группа 4

Индукция

патологии


Самцы

самки

0,1±0,1

0,1±0,1

2,1±0,2*

1,9±0,3*

0,1±0,1

0,0±0,0

1,8±0,3*

2,1±0,4*


р<0,05

120

Критерии клинической картины и макроскопической картины

затруднительно валидировать, поскольку отсутствует объективная

(количественная) оценка, выраженности критерия, поэтому для данных

параметров, валидационная оценка не проводилась.

Проверка валидационной характеристики сходимость была проведена для

показателей количества бокаловидных клеток на 1 мм2 и для инфильтрации

лейкоцитами слизистой оболочки и подслизистого слоя.

Оценка количества бокаловидных клеток

Данные по оценке количества бокаловидных клеток представлены в таблице

35.

Таблица 35

Количество бокаловидных клеток на 1 мм2 слизистой оболочки носовой

перегородки у крыс в разных сериях экспериментов, M±m, n=10

Группа Количество бокаловидных клеток


Группа 1 Интактные 7,3±0,6 6,9±0,6 7,1±0,5

Группа 2 Индукция патологии 14,1±0,7* 14,1±0,7* 14,1±0,9*



Как видно из таблицы 35 количество бокаловидных клеток во всех сериях

экспериментов статистически значимо превышало данный показатель интактных

животных в два раза. При этом показатель количества бокаловидных клеток

между сериями экспериментов не имел статистически значимых отличий по

критерию Стьюдента. Полученные данные свидетельствуют о сходимости данных

по показателю количества бокаловидных клеток и воспроизводимости

экспериментальной модели, независимо от времени года.

Кроме того, оценивался характер воспаления и степень выраженности

инфильтрации лейкоцитами слизистой оболочки и подслизистого слоя носовых

ходов крыс (таблица 36).

121

Таблица 36

Сравнительная микроскопическая характеристика изменений слизистой

носовых ходов у крыс в разных сериях экспериментов в баллах, M±m, n=10

Группа


Лейкоциты

слизистой

оболочки

Лейкоциты

подслизистого

слоя

Лейкоциты

слизистой

оболочки

Лейкоциты


слоя

Лейкоциты

слизистой

оболочки

Лейкоциты


слоя

Группа 1

Интактные 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0

Группа 2

Индукция

патологии

1,7±0,3*

1,7±0,3* 1,7±0,3

* 1,6±0,4

* 1,6±0,4

* 1,7±0,4

*



По данным микроскопии во всех сериях экспериментов у животных

наблюдалась идентичная выраженная лейкоцитарная инфильтрация слизистой

оболочки и подслизистого слоя носовых ходов, что характеризует развитие

острого воспаления.

Однако критерий микроскопической картины изменений слизистой носовых

ходов, затруднительно валидировать, поскольку возможна лишь

полуколичественная оценка (баллы), выраженности критерия, поэтому для

данного параметра, валидационная оценка не проводилась.

Представленные в разделе 3.3. данные свидетельствуют о том, что новая

экспериментальная модель острого риносинусита хорошо воспроизводима и


122

3.4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА ФРЕШНОС В СРАВНЕНИИ С ВИБРОЦИЛОМ И

АКВАМАРИСОМ НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТРОГО

РИНОСИНУСИТА

На основании проведенных исследований по разработке и валидации

экспериментальной модели острого риносинусита (раздел 3.3) в качестве

экспериментальной модели была выбрана модель асептического воспаления

носовых ходов с помощью дозированного закапывания экспериментальным

животным водного раствора формалина в дозе 12 мг/кг.

В исследовании было использовано 70 крыс-самок линии Вистар. Было

сформировано 7 экспериментальных групп, по 10 животных в каждой группе


В качестве препаратов сравнения были использованы лекарственные

средства, зарегистрированные на территории РФ аквамарис и виброцил.

Таблица 37

Дизайн исследования по оценке эффективности препарата фрешнос в сравнении с

виброцилом и аквамарисом на экспериментальной модели острого риносинусита

на самках крыс линии Вистар

Описание

группы Количество животных

Вес, г

M±m

Доза,

мкл/100 г массы тела

Интактные 10 197±3 -

Патология без лечения 10 200±4 -

Патология + Аквамарис 10 190±5 50

Патология + Виброцил 10 202±3 50




123

Через сутки после введения в носовые ходы формалина, аналогично

исследованиям по разработке и валидации экспериментальной модели (раздел 3.3)

у экспериментальных животных были отмечены выраженные клинические

проявления острого риносинусита: затрудненное дыхание, чихание, покраснение

слизистой оболочки и кожи вокруг наружных носовых ходов, мокнутие шерсти

вокруг носовых ходов, выделения из носа серозного или гнойного характера.

Лечение экспериментальных животных осуществлялось по лечебной схеме,

с первого по седьмой день после введения формалина. На фоне лечения у всех

экспериментальных животных наблюдалось снижение интенсивности

клинических проявлений острого риносинусита в динамике (таблица 38).

Для оценки специфической фармакологической активности препарата

фрешнос в дозах 10, 20 и 30 мкл/100 г массы тела в сравнении с препаратами

аквамарис (50 мкл/100 г массы тела) и виброцил (50 мкл/100 г массы тела) была

проведена макроскопическая оценка изменений слизистой оболочки носовых

ходов и гистологическая и гистохимическая оценка влияния препаратов на

количество бокаловидных клеток, а также оценка степени выраженности

инфильтрации слизистой оболочки и подслизистого слоя мононуклеарами и


Макроскопическая характеристика изменений слизистой оболочки носовых

ходов экспериментальных животных

Носовые ходы интактных животных не имели макроскопических признаков

воспаления, были свободны от содержимого, слизистая бледно-розовая,

блестящая, гладкая (таблица 39).

При макроскопической оценке форм воспаления было показано, что острый

ринит у крыс проявлялся как слизистый и слизисто-гнойный катар носовых ходов


В контрольной группе у 20% животных из группы наблюдался слизистый

катар, а у 80% животных – более тяжелая форма воспаления, слизисто-гнойный

катар носовых ходов, что характеризует картину острого гнойного ринита.

124

Таблица 38

Клинические проявления острого риносинусита у экспериментальных животных, n=10

№

группы Группа

Затрудненное

дыхание

Покраснение слизистой

оболочки и кожи вокруг

наружных носовых

ходов

Мокнутие

шерсти вокруг

носовых ходов

Выделения из

носа серозного

или гнойного

характера

Чихание

1-й

день

7-й

день 1-й день 7-й день

1-й

день

7-й

день 1-й день 7-й день

1-й

день

7-й

день

1 Интактные - - - - - - - - - -

2 Контроль +++ ++ +++ ++ +++ + +++ + +++ +

3

Аквамарис 50

мкл/100 г

массы тела

+++ ++ ++ - ++ - ++ - +++ -

4

Виброцил 50

мкл/100 г

массы тела

+++ + +++ + ++ + ++ + +++ -

5

Фрешнос 10

мкл/100 г

массы тела

+++ ++ ++ + ++ - ++ + +++ -

6

Фрешнос 20

мкл/100 г

массы тела

+++ + ++ - ++ - + - ++ -

7

Фрешнос 30

мкл/100 г

массы тела

+++ - + - ++ - + - ++ -

125

Таблица 39

Сравнительная макроскопическая характеристика изменений слизистой

носовых ходов у крыс различных групп, %, n=10

№


Нет

изменений

Слизистый

катар

Слизисто-

гнойный

катар

1 Интактные 100 0 0

2 Контроль 0 20 80

3 Аквамарис 50 мкл/100 г

массы тела 0 40 60

4 Виброцил 50 мкл/100 г


5 Фрешнос 10 мкл/100 г






На фоне применения препарата сравнения аквамарис, обладающего

свойствами снижать вязкость слизи, нормализовать работу бокаловидных клеток

слизистой оболочки носа, стимулировать работу мерцательного эпителия,

улучшать эвакуацию слизи, способствовать выведению инородных частиц

вызывающих аллергию, нормализовать мукоцилиарный клиренс, стимулировать

местный иммунитет, оказывать антибактериальное действие у 40% животных из

группы были выявлены макроскопические признаки слизистого катара и у 60% –

слизисто-гнойного катара, что позволяет сделать вывод о низкой эффективности

препарата на данной модели. Следует отметить, что проявление наиболее тяжелой

формы воспаления – слизисто-гнойного катара было на 20% ниже, чем в

контрольной группе животных.

При использовании второго препарата сравнения виброцил

макроскопическая картина изменений у экспериментальных животных была

аналогична контрольной группе, что свидетельствует об отсутствии у данного

126

препарата эффективности в отношении клинических проявлений острого


Исследуемый препарат фрешнос оказал достаточно выраженное

противовоспалительное действие во всех экспериментальных группах.

В дозе 10 мкл/100 г массы тела исследуемый препарат оказал незначительно

выраженный противовоспалительный эффект: носовые ходы у 20% животных не

имели признаков воспаления, у 40% животных имелись признаки слизистого

катара и у 40% – слизисто-гнойного катара (таблица 39).

В группе, получавшей препарат фрешнос в дозе 20 мкл/100 г массы тела,

признаки слизисто-гнойного катара определялись у 30% животных, слизистого

катара – у 40%. У 30% животных этой группы носовые ходы были свободны,

слизистая без макроскопически определяемых патологических изменений.

При использовании препарат фрешнос в дозе 30 мкл/100 г массы тела

носовые ходы только у 20% животных содержали мутноватую слизь с серо-

желтым оттенком, а слизистая оболочка была шероховатая, полнокровная, что

соответствовало картине слизисто-гнойного катара. У 80% животных этой группы

носовые ходы были свободны, слизистая бледно-розовая, блестящая, гладкая.

Таким образом, представленные данные макроскопического исследования

свидетельствуют о том, что исследуемый препарат фрешнос оказывает

выраженный дозозависимый противовоспалительный эффект в отношении

экспериментальной патологии. Максимальный эффект был отмечен при

использовании препарата фрешнос в дозе 30 мкл/100 г массы тела.

Микроскопическая характеристика изменений слизистой оболочки носовых

ходов у крыс различных групп

Носовые ходы интактных животных не имели микроскопических признаков

воспаления (рисунок 35)

Основные процессы, характеризующие поражение носовых ходов

(полнокровие слизистой оболочки, очаговый некроз эпителия) были четко

представлены у крыс контрольной группы (рисунок 36).

127

Рисунок 35 – Крыса интактной группы.

Слизистая носа с незначительным

количеством бокаловидных клеток. Окраска

гематоксилином и эозином с докраской

альциановым синим. Увеличение 200

Рисунок 36 – Крыса контрольной группы.

Слизистая носа с выраженной

гиперплазией бокаловидных клеток и

выраженной воспалительной

инфильтрацией. Окраска гематоксилином и

эозином с докраской альциановым синим.


Гистологическая картина слизистой носовых ходов у животных,

получавших исследуемый препарат фрешнос (рисунок 39–41), не отличалась от

таковой у интактных животных. При этом применение препарата в дозе 30

мкл/100 г массы тела оказало наиболее выраженное действие, ввиду уменьшения

инфильтрации мононуклеарами слизистой, что говорит о завершении

воспалительного процесса.

Рисунок 37 – Крыса, получавшая аквамарис.

Окраска гематоксилином и эозином с

докраской альциановым синим. Увеличение

200

Рисунок 38 – Крыса, получавшая виброцил.

Окраска гематоксилином и эозином с

докраской альциановым синим.


128

Рисунок 39 – Крыса, получавшая Фрешнос в

дозе 10 мкл/100 г массы тела. Окраска



Рисунок 40 – Крыса, получавшая Фрешнос

в дозе 20 мкл/100 г массы тела. Окраска



Рисунок 41 – Крыса, получавшая

Фрешнос в дозе 30 мкл/100 г массы

тела. Окраска гематоксилином и

эозином с докраской альциановым

синим. Увеличение 200

При микроскопической оценке экссудативных форм катарального

воспаления, которые развивались у животных при остром риносинусите,

оценивалось количество бокаловидных клеток, содержавших кислую слизь


129

Таблица 40

Количество бокаловидных клеток на 1 мм2 слизистой оболочки носовой

перегородки у крыс разных групп, M±m, n=10

№ группы Группа Количество бокаловидных

клеток слизистой носа на 1 мм2

1 Интактные 7,5±0,5

2 Контроль 21,3±0,6*

3 Аквамарис 50 мкл/100 г

массы тела 13,8±0,7

***



***



***


массы тела 7,9±3,8**


массы тела 7,5±2,6**






Представленные в таблице 42 данные свидетельствуют о развитии

выраженного катарального воспаления у животных контрольной группы, так как

количество бокаловидных клеток в 2 раза превышает данный показатель

интактных животных.

На фоне применения препаратов сравнения аквамарис и виброцил

терапевтического эффекта отмечено не было. Количество бокаловидных клеток

осталось на уровне контрольных животных.

При использовании в качестве терапии исследуемого препарата фрешнос

был показан выраженный дозозависимый противовоспалительный эффект в

отношении количества бокаловидных клеток. Наиболее выраженный

терапевтический эффект наблюдался при использовании исследуемого препарата

130

в дозах 20 и 30 мкл/100 г массы тела, количество бокаловидных клеток было

идентично уровню интактных животных.

Была проведена оценка характера воспаления и степени выраженности

инфильтрации лейкоцитами слизистой оболочки и подслизистого слоя носовых

ходов крыс (таблица 41).

Инфильтрация клеточными элементами при воспалении характеризует

неспецифические факторы защиты слизистых. По данным гистологического

исследования слизистой оболочки носовых ходов крыс интактной группы

инфильтрации лейкоцитами обнаружено не было. В то же время, у животных

контрольной группы, как в слизистом, так и в подслизистом слое обнаруживалась

инфильтрация лейкоцитами, которая значимо отличалась от крыс интактной

группы и характеризовала наличие воспаления.

Таблица 41

Сравнительная микроскопическая характеристика изменений слизистой носовых

ходов у крыс различных групп в баллах, M±m, n=10

№


Лейкоциты


Лейкоциты

подслизистого слоя

1 Интактные 0,1±0,1 0,0±0,0

2 Контроль 2,0±0,4*

1,8±0,4*

3 Аквамарис 50 мкл/100

г массы тела 0,5±0,2** 0,5±0,2**


массы тела 0,5±0,2** 0,4±0,2**


массы тела 0,4±0,2** 0,6±0,3**


массы тела 0,6±0,2** 0,7±0,3**


массы тела 0,7±0,3** 0,6±0,2**




131



На фоне применения всех исследуемых препаратов во всех дозах было

показано выраженное снижение инфильтрации слизистой оболочки и

подслизистого слоя лейкоцитами. Во всех группах данный показатель был

одинаково статистически значимо снижен по сравнению с контрольными

животными. Такие данные свидетельствуют о наличии у всех исследуемых

препаратов выраженного противовоспалительного действия.

Таким образом, при гистологическом исследовании носовых ходов крыс

при экспериментальном моделировании острого риносинусита, был выявлен

выраженный дозозависимый противовоспалительный эффект препарата фрешнос,

что характеризовалось регенерацией эпителия, снижением количества

бокаловидных клеток и степени выраженности инфильтрации слизистой оболочки

и подслизистого слоя лейкоцитами. Установлено, что препарат значимо

превосходил по своему противовоспалительному эффекту препараты сравнения.

По полученным данным можно сделать вывод о том, что в эксперименте на

крысах линии Вистар путем индукции острого риносинусита введением в

носовые ходы водного раствора формалина в дозе 12 мг/кг были получены

выраженные патологические изменения в контрольной группе животных,

характеризующие развитие острого воспалительного процесса в слизистой

оболочке носа. Вызванная патология характеризовалась полнокровием,

гиперплазией и очаговым некрозом слизистой оболочки носовых ходов,

увеличением количества бокаловидных клеток, выраженной инфильтрацией

мононуклеарами и лейкоцитами, гиперпродукцией слизи железами подслизистого

слоя.

Применение исследуемого препарата фрешнос сопровождалось

увеличением регенерации поврежденной слизистой оболочки (отсутствием ее

некроза) и продемонстрировало выраженный дозозависимый

противовоспалительный эффект: снижение количества бокаловидных клеток,

132

продуцировавших кислую слизь, уменьшение выраженности инфильтрации

мононуклеарами и лейкоцитами слизистой оболочки и подслизистого слоя.

В ходе данного исследования было показано, что исследуемый препарат

фрешнос обладает значительным противовоспалительным действием, что

позволяет рекомендовать его для применения в терапии в качестве


Полученные данные об эффективности исследуемого препарата фрешнос

обусловлены его многокомпонетным составом и подтверждаются

многочисленными литературными данными, свидетельствующими об

эффективности его компонентов в отношении различных признаков воспаления.

133

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенные исследования позволили установить эффективность

применения новых препаратов природного происхождения КЛС-04 и фрешнос,

обладающих выраженными противовоспалительными свойствами на новых

разработанных и валидированных экспериментальных моделях заболеваний

верхних дыхательных путей – острого шейного лимфаденита и острого

риносинусита соответственно.

Разработка эффективных препаратов и схем лечения и профилактики

заболеваний верхних дыхательных путей играет одну из ведущих ролей в

современной медицине. Дифференцированный подход к установлению

фармакологической эффективности и механизмов действия препаратов на

доклиническом этапе исследования позволяет прогнозировать состоятельность

новых лекарственных средств в клинике и грамотно планировать клинические

испытания. Использование новых методов получения лекарственных препаратов

и разработка новых лекарственных форм является актуальной задачей

современной фармакологии.

Группа заболеваний, имеющих общее название ОРВИ, вызываемых

различными нозологичесикми агентами наиболее часто проявляются в виде

острого риносинусита и острого тонзиллита. Для лечения этих заболеваний

сегодня широко используются антибактериальные препараты и нестероидные

противовоспалительные средства. Разработка эффективных природных

препаратов, направленных на лечение данной группы заболеваний, остается

актуальной, так как лекарственные средства природного происхождения

способны оказывать выраженные фармакологические эффекты, при этом не

обладают иммуносупрессивным действием. Проведение доклинических

исследований таких препаратов осложняется отсутствием валидированных

фармакологических моделей.

134

Исследованный в данной работе препарат КЛС-04, разработанный на основе

пептидно-фосфолипидного комплекса печени рыб семейства тресковых, обладает

выраженными противовоспалительными свойствами, которые были изучены на

экспериментальных моделях адъювантного артирита (Рыбакова А.В., Крышень

К.Л., 2012) и контактного дерматита (Крышень К.Л. и соавт., 2013). Также для

пептидно-фосфолипидных комплексов, выделенных из гидробионтов, по

литературным данным известны: антигипертензивный (Cinq-Mars C.D. et al., 2008;

Khora S.S., 2013), антикоагулянтный (Rajapakse N. et al., 2005; Kim S.K.,

Wijesekara I., 2010; Khora S.S., 2013) и иммуномодулирующий эффекты (Rajapakse

N. et al., 2005; Khora S.S., 2013). Биоактивные липиды, которые получают из

морских организмов, включают в себя жирные кислоты, сфинголипиды, стеролы,

диацилглицеролы, дитерпены, сапонины (Glaser K., Lock Y., 1995; Huynh C. et al.,

1997; Li D., Sinclair A., 2002).

Компоненты второго исследованного препарата, фрешнос, обладают

известными терапевтическими свойствами. Основными компонентами препарата

являются трава тысячелистника обыкновенного, листья шалфея лекарственного и

трава зверобоя продырявленного.

В данной работе исследования проводились на крысах линии Вистар как

наиболее доступной и широко используемой тест-системе. Были использованы

здоровые половозрелые самцы и самки крыс, с массой тела 200±20 г.

Выбор провоспалительных агентов был обусловлен литературными

данными о том, что на сегодняшний день существует множество

экспериментальных моделей воспалительных заболеваний бронхолегочной

системы, индуцируемых такими провоспалительными агентами как ЛПС (Herber-

Jonat S. et al., 2011; Patial S. et al., 2011), каррагенин (Rossi A. et al., 2010; Ceccarelli

M. et al., 2009; Mochizuki M. et al., 2005; Dugo L. et al., 2004) и формалин

(Руководство…, 2012).

135

Таблица 42

Литературные данные о компонентах препарата фрешнос

Литературные

данные

об эффектах

Компонент

исследуемого

препарата

фрешнос

Противовоспалительный

эффект

Антиоксидантный

эффект

Антибактериальный

эффект

Тысячелистник

обыкновенный

Achilléa

millefólium

Cavero R.Y. et al., 2013

Tropek R. et al., 2013

Farooq U. et al., 2013

Лапин А.А. и

соавт., 2007

Лубсандоржиева

П.Б. и соавт., 2006

-

Шалфей

лекарственный

Salvia officinalis

Baricevic D. et al., 2001

Крышень К.Л. и соавт.,

2009

Зилфикаров И.Н., 2007

Коваленко Н.А., 2010

Kozics К. et al.,

2013

Grzegorczyk I. et al.,

2007

Зилфикаров И.Н.,

2007

Тимофеев Н.П. и

др, 2006

Longaray Delamare

A.P. et al., 2007

Зверобой

продырявленный

Hypéricum

perforátum

Huang N. et al., 2011 Altun L. et al., 2013

Лапин А.А. и

соавт., 2007

Altun L. et al., 2013

Saddiqe Z. et al.,

2010

ЛПС является основным компонентом клеточной стенки

грамотрицательных бактерий E.coli, обеспечивая структурную целостность

бактериальной клетки и защищая мембрану от агрессивных воздействий

окружающей среды (Beutler B., Rietschel E.T., 2003; Caroff M., Karibian D., 2003).

136

Каррагенин получают из красных морских водорослей. Каррагенины,

построенные из наиболее часто встречающихся дисахаридных повторяющихся

звеньев, принято обозначать греческими буквами. В настоящем исследовании

использовался λ-каррагенин, который достаточно хорошо растворяется в воде.

Формалин – водный раствор, содержащий 40% формальдегида, 8%

метилового спирта и 52% воды. Попадание формалина на живую ткань слизистых

носа и дыхательных путей вызывает повреждение по типу коагуляционного

некроза и воспаления прилежащих тканей.

Также выбор провоспалительных агентов был обусловлен отсутствием в их

составе инфекционной составляющей, что упрощает работу исследователя и не

требует специального оборудования и соблюдения строгого санитарного режима.

Для разработки и валидации острого шейного лимфаденита было


реакцию в тканях: ЛПС в дозе 0,1 мг/кг водный раствор, каррагенин 0,8 мг/кг

водный раствор и формалин 8 мг/кг водный раствор. Вещества вводили

непосредственно в ткань лимфатического узла Inn. Cervicales superficiales.


содержание С-реактивного белка в плазме крови, определение основных

провоспалительных цитокинов TNF-α и INF-γ в сыворотке крови, определение

гематологических показателей крови, разницу в массе пораженного и интактного

лимфатических узлов, процент потери массы пораженного лимфатического узла

при лиофильном высушивании, морфологический и морфометрический анализ

лимфатических узлов.

В результате было показано, что наиболее выраженные статистически

значимые изменения уровня С-реактивного белка были отмечены у самок крыс

через 72 часа после введения раствора ЛПС. Повышение данного показателя

составило 42% по сравнению с интактными животными. Также через 72 часа от

момента индукции патологии, отмечалось статистически значимое увеличение

лейкоцитов во всех экспериментальных группах по сравнению с интактными

животными. Наиболее выраженные изменения были получены у самок крыс на

137

фоне введения ЛПС и каррагенина. В лейкоцитарной формуле наблюдался

гранулоцитарный сдвиг, что свидетельствует о снижении иммунного ответа. При

оценке уровня TNF-α, одного из основных цитокинов, в крови

экспериментальных животных было показано, что максимально выраженная

картина воспаления наблюдалась на фоне введения в лимфатические узлы

раствора ЛПС, увеличение данного показателя составило по сравнению с

интакными животными 14 раз для самцов и 15 раз для самок. Уровень IFN-γ

также являющегося важнейшим провоспалительным медиатором, подобно TNF-α

наиболее значимо увеличивался в группе животных, которым вводили ЛПС.

Показатель разницы массы пораженного и интактного лимфатических узлов при

введении в качестве провоспалительных агентов ЛПС и каррагенина

статистически значимо превышал данный показатель интактных животных через

72 и 120 часов от момента индукции патологии. Наиболее выраженные изменения

были отмечены при введении экспериментальным животным раствора ЛПС через

72 часа от момента индукции патологии, повышение данного показателя для

самцов составило 3,5, для самок – 4,3 раза. При проведении дополнительной

оценки отека ткани лимфатических узлов, лиофильного высушивания, наиболее

выраженные изменения были выявлены у животных, которым вводили ЛПС через

72 часа от момента индукции патологии – увеличение показателя потери массы

пораженного лимфатического узла после лиофильного высушивания в 2,9 раза

отличался от данного показателя интактной группы. При проведении

гистологического исследования ткани пораженных лимфатических узлов было

подтверждено, что, что наиболее выраженный воспалительный ответ по

гистологическим показателям был показан при введении в ткань лимфатического

узла самок крыс раствора ЛПС в дозе 0,1 мг/кг и каррагенина в дозе 0,8 мг/кг.

В результате разработки экспериментальной модели острого шейного

лимфаденита:

А. Определен оптимальный провоспалительный агент – ЛПС в дозе 0,1

мг/кг или каррагенин в дозе 0,8 мг/кг.

138

Б. Выбрана наиболее подходящая тест-система – крысы самки линии

Вистар.

В. Сформирован перечень наиболее информативных показателей,



Концентрация С-реактивного белка в плазме крови через 72 часа.

Уровень лейкоцитов в крови через 72 часа.

Уровень медиаторов воспаления в сыворотке крови: TNF-α через 4

часа и INF-γ через 16 часов.

Оценка степени отека пораженных лимфатических узлов через 72

часа (разница массы пораженного и интактного лимфатических узлов и процент


Гистометрия герминативных центров лимфоидных фолликулов и

степени гистиоцитоза пораженных лимфатических узлов.

Разработанная экспериментальная модель была валидирована по

показателям правильность (точность) и сходимость. Модель воспроизводима вне

зависимости от времени года по основным показателям экспериментальной

патологии: уровень СРБ и лейкоцитов через 72 часа от момента индукции

патологии, уровень TNF-α через 4 часа и INF-γ через 16 часов, степень отека

пораженных лимфатических узлов через 72 часа (разница массы пораженного и

интактного лимфатических узлов и процент потери массы пораженного

лимфатического узла при лиофильном высушивании), гистометрия

герминативных центров лимфоидных фолликулов и степень гистиоцитоза

пораженных лимфатических узлов. По результатам статистической обработки

показателей экспериментальной патологии методом ANOVA было показано, что

по всем исследованным показателям дисперсионный анализ не выявил

статистически значимых отличий между серями экспериментов. Таким образом,

можно утверждать, что при соблюдении стандартных условий содержания

лабораторных животных фактор времени года не влияет на результаты

исследования.

139

Для изучения эффективности нового препарата КЛС-04 был выполнен

эксперимент на 100 крысах-самках линии Вистар. Было сформировано 10

экспериментальных групп по 10 животных в каждой группе.

В качестве препаратов сравнения были выбраны зарегистрированные на

территории РФ препараты тантум верде, диклофенак и дексаметазон, обладающие

выраженным противовоспалительным эффектом.

Для установления эффективной дозы препарата КЛС-04 он был изучен в

широком диапазоне доз: 0,4; 0,8; 1,6; 3,2 и 6,4 мг/кг.

Путь введения для КЛС-04 и тантум верде – распыление на заднюю стенку

глотки, аналогично пути применения в клинической практике. Для диклофенака и

дексаметазона были выбраны пути введения, аналогичные клиническому

применению – пероральный и внутримышечный, соответственно, при этом были

использованы терапевтические дозы данных препаратов в пересчете на массу

экспериментальных животных с учетом метаболических коэффициентов.


в сутки, на протяжении 10-ти дней до индукции лимфаденита и 3 дня после.

Введение препаратов осуществляли с помощью специального шприца и

зонда для эндотрахеального введения (IA-1C-M Penn-Century Inc., USA).

При оценке биохимических и гематологических показателей крови было

показано снижение уровня TNF-α у экспериментальных животных через 4 часа от

момента индукции патологии до значений интактных животных на фоне

применения препаратов сравнения диклофенака и дексаметазона, что

свидетельствует о наличии у данных препаратов выраженного

противовоспалительного эффекта. При использовании препарата сравнения

тантум верде наблюдалось снижение данного показателя в 2,3 раза по сравнению

с контрольной группой, что также свидетельствует о наличии у данного препарата

выраженного противовоспалительного эффекта, однако уровень интактных

животных достигнут не был. На фоне применения исследуемого КЛС-04 была

отмечена выраженная дозозависимость. В минимальной дозе

противовоспалительного эффекта в отношении уровня TNF-α отмечено не было, в

140

средних дозах снижение данного показателя составило 1,6 и 2 раза для доз 0,8 и

1,6 мг/кг, соответственно. В максимальных дозах КЛС-04 3,2 и 6,4 мг/кг

противовоспалительный эффект был выражен максимально и превосходил

препарат сравнения тантум верде.

В отношении показателя INF-γ на фоне лечения терапевтический эффект

был показан только для препаратов сравнения диклофенак и дексаметазон, где

был достигнут уровень интактных животных. Также значительный

терапевтический эффект был показан для исследуемого КЛС-04 в максимальных

дозах 3,2 и 6,4 мг/кг, уровень INF-γ был статистически значимо снижен по

сравнению с контрольной группой.

Статистически значимый эффект в отношении уровня СРБ наблюдался

только на фоне применения КЛС-04 в максимальных дозах 3,2 и 6,4 мг/кг,

снижение уровня СРБ произошло до показателей интактных животных.

Через 72 часа от момента индукции патологии уровень лейкоцитов

увеличился в контрольной группе в 2,8 раза по сравнению с интактными

животными. На фоне лечения препаратом сравнения тантум верде данный

показатель был снижен в 2 раза по сравнению с контролем. Также выраженный

терапевтический эффект был показан для препарата сравнения дексаметазон,

снижение уровня лейкоцитов произошло до значений интактных животных. При

использовании в качестве лечения исследуемого КЛС-04 была показана

дозозависимость и максимально выраженный терапевтический эффект,

сопоставимый с препаратом сравнения при использовании максимальной дозы 6,4

мг/кг, при этом был достигнут уровень интактных животных.

На фоне лечения во всех экспериментальных группах было показано

одинаковое статистически значимое снижение процента потери массы

пораженного лимфатического узла по сравнению с контрольной группой (на 28–

30%), что свидетельствует о наличии у всех исследуемых препаратов во всех

дозах выраженного противоотечного действия, за исключением препарата

сравнения дексаметазон для которого не удалось установить противоотечный

эффект ввиду высокой смертности экспериментальных животных.

141

Гистологически установлено, что при экспериментальном моделировании

острого шейного лимфаденита в группах крыс без лечения и получавших лечение

препаратами КЛС-04 и тантум верде в регионарных лимфатических узлах

развивалась картина острого неспецифического лимфаденита, которая

характеризовалась изменениями лимфатических узлов с иммунным ответом по

гуморальному типу. При этом максимальный положительный эффект наблюдался

в группах животных, получавших КЛС-04 в дозах 1,6; 3,2 и 6,4 мг/кг, что

проявлялось в основном в ингибировании пролиферации лимфоцитов, но не

макрофагов и гистиоцитов.

В ходе данного эксперимента было показано, что наиболее выраженным

дозозависимым противовоспалительным действием обладает КЛС-04 в дозах 3,2

и 6,4 мг/кг, что позволяет рекомендовать его для применения в терапии в качестве


Исследование биохимических процессов метаболизма жирных кислот в

последнее десятилетие привело к открытию новых классов липидных медиаторов,

структурно отличающихся от известных ранее простагландинов и лейкотриенов.

К ним относятся резолвины, протектины и марезины (Ishizuka T. еt al., 2008;

Serhan C. et al., 2011). Предшественники этих медиаторов образуются под

действием ЦОГ и ЛОГ из ω-3 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК),

включая эйкозапентаеновую кислоту и докозагексаеновую. Главной

биологической ролью этих медиаторов является участие в завершении острой

фазы воспаления и переход в стадию разрешения (рисунок 42).

142

Рисунок 42 – Участие ω-6 и ω-3 ПНЖК в инициации и развитии острого

воспаления (цит. по Крышень К.Л. и соавт., 2013)

Эти медиаторы блокируют инфильтрацию нейтрофилов, привлекают

моноциты, нормализуют проницаемость сосудов, вызывают апоптоз остатков

нейтрофилов и содействуют их дальнейшиму фагоцитозу, контролируют отток

макрофагов через лимфатические сосуды и облегчают удаление экссудата и

фибрина из воспаленной ткани, что способствует нормальному гомеостазу (Serhan

C. et al., 2008).

Таким образом, можно сделать вывод о том, что КЛС-04 приводит к

торможению синтеза простагландинов и лейкотриенов из арахидоновой кислоты,

и инициирует образование резолвинов, протектинов и марезинов, участвующих в

разрешении воспалительного процесса.

С целью разработки фармакологической модели острого риносинусита было


реакцию в тканях: ЛПС в дозе 0,1 мг/кг водный раствор, каррагенин в дозе 1,6

мг/кг и формалин в дозе 12 мг/кг водный раствор.

143

Провоспалительные агенты вводили непосредственно в носовые ходы крыс

путем дозированного закапывания с использованием механических дозаторов с

пластиковыми наконечниками.

Через 7 дней животных эвтаназировали.

При введении в носовые ходы провоспалительных агентов в первые же

сутки у экспериментальных животных отмечались изменения, характерные для

клинической картины острого риносинусита. Наиболее выраженные изменения

были отмечены после введения в носовые ходы формалина, которые проявлялись

затрудненным дыханием, покраснением слизистой оболочки и кожи вокруг

наружных носовых ходов, мокнутием шерсти вокруг носовых ходов,

выделениями серозного или гнойного характера из носовых ходов, чиханием.

При изучении экспериментальной патологии оценивали количество

бокаловидных клеток слизистой носовых ходов, содержавших кислую слизь.

Количество бокаловидных клеток при введении экспериментальным

животным ЛПС и каррагенина увеличилось вдвое по сравнению с интактными

животными, а при введении формалина увеличение данного показателя

произошло в 2,9 раза для самцов и в 3,3 раза для самок. Схожие данные были

получены Jung H.W. et al., 2013 на экспериментальной модели аллергического


Кроме того во всех экспериментальных группах, которым были введены

провоспалительные агенты, слизистая оболочка и подслизистый слой имели

инфильтрацию клеточными элементами. Наиболее выраженная инфильтрация

слизистой оболочки и подслизистого слоя лейкоцитами была отмечена у самок,

которым в качестве провоспалительного агента был введен формалин.

Аналогичные данные были показаны Yamasaki M. et al. в 2002 году на

экспериментальной модели аллергического риносинусита.

Таким образом, в ходе разработки экспериментальной модели острого

риносинусита установлено:

А. Определен оптимальный провоспалительный агент – формалин в дозе 12

мг/кг водный раствор.

144

Б. Выбрана наиболее подходящая тест-система – крысы самки линии

Вистар.

В. Сформирован перечень наиболее информативных показателей,



Клиническая картина.

Макроскопические признаки воспаления носовых ходов.

Количество бокаловидных клеток.

Инфильтрация слизистой оболочки и подслизистого слоя


Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том, что

была получена адекватная экспериментальная модель острого риносинусита у

крыс самок линии Вистар, путем развития асептического воспаления носовых

ходов.

Данная экспериментальная модель, благодаря своей дешевизне и

относительной простоте исполнения, может быть применима для исследований

препаратов, нацеленных на лечение острых риносинуситов, а также для оценки

противовоспалительного, сосудосуживающего и других эффектов препаратов,

применяемых в ЛОР-практике.

Для проверки сходимости показателей, характеризующих развитие

экспериментальной патологии, было проведено три серии экспериментов.

Эксперименты проводились на самках линии Вистар в различные сезоны (весна,

лето, осень) (Cook C.D., Nikerson M.D., 2005; Lariviere W.R. et al., 2006).

По данным микроскопии во всех сериях экспериментов у животных

наблюдалась идентичная выраженная лейкоцитарная инфильтрация слизистой

оболочки и подслизистого слоя носовых ходов, что характеризует развитие

острого воспаления. Однако критерий микроскопической картины изменений

слизистой носовых ходов, затруднительно валидировать, поскольку возможна

лишь полуколичественная оценка (баллы) выраженности критерия, поэтому для

данного параметра, валидационная оценка не проводилась. Оценить

145

количественно клиническую картину и макроскопические признаки также не

представлялось возможным, поэтому количественная оценка и дисперсионный

анализ были проведены по показателю количества бокаловидных клеток и

инфильтрации лейкоцитами слизистой оболочки и подслизистого слоя.

Дисперсионный анализ по сериям экспериментов не выявил статистически

значимых отличий между серями экспериментов. Таким образом, можно

утверждать, что фактор времени года не влияет на результаты исследования и

новая экспериментальная модель острого риносинусита валидирована по

показателю сходимость.

Для изучения эффективности нового растительного препарата фрешнос был

выполнен эксперимент на 60 крысах-самках линии Вистар. Было сформировано 6

экспериментальных групп по 10 животных в каждой группе.

Была проведена оценка диапазона доз препарата фрешнос 10, 20 и 30

мкл/100 г массы тела в сравнении с препаратами аквамарис (50 мкл/100 г массы

тела) и виброцил (50 мкл/100 г массы тела). Препараты вводили животным путем

дозированного закапывания непосредственно в носовые ходы. Лечение

экспериментальных животных осуществлялось с первого по седьмой день после

введения формалина. На фоне лечения у всех экспериментальных животных

наблюдалось снижение интенсивности клинических проявлений острого

риносинусита в динамике.

В отношении показателя количества бокаловидных клеток на фоне

применения препаратов сравнения аквамарис и виброцил терапевтического

эффекта отмечено не было. При использовании в качестве терапии исследуемого

препарата фрешнос был показан выраженный дозозависимый

противовоспалительный эффект в отношении количества бокаловидных клеток.

Наиболее выраженный терапевтический эффект наблюдался при использовании

исследуемого препарата в дозах 20 и 30 мкл/100 г массы тела, количество

бокаловидных клеток было идентично уровню интактных животных.

На фоне применения всех исследуемых препаратов во всех дозах было

показано выраженное снижение инфильтрации слизистой оболочки и

146

подслизистого слоя лейкоцитами. Во всех группах данный показатель был

одинаково статистически значимо снижен по сравнению с контрольными

животными. Такие данные свидетельствуют о наличии у всех исследуемых

препаратов выраженного противовоспалительного действия.

Таким образом, при гистологическом исследовании носовых ходов крыс в

ходе экспериментального моделирования острого риносинусита, был выявлен

выраженный дозозависимый противовоспалительный эффект препарата фрешнос,

что характеризовалось регенерацией эпителия, снижением количества

бокаловидных клеток и степени выраженности инфильтрации слизистой оболочки

и подслизистого слоя лейкоцитами. Установлено, что препарат значимо

превосходил по своему противовоспалительному эффекту препараты сравнения.

Полученные данные об эффективности исследуемого препарата фрешнос

обусловлены его многокомпонетным составом и подтверждаются

многочисленными литературными данными, свидетельствующими об

эффективности его компонентов в отношении различных признаков воспаления.

Диссертационная работа была выполнена при финансовой поддержке

Министерства образования и науки Российской Федерации, в рамках:

1. Государственного контракта № 16.512.11.2020 от «10» февраля 2011 г.

«Изучение механизмов противоаллергического ветеринарного средства на

основе комплексной переработки печени рыб семейства Gadidae» в рамках

ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития

научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы».

2. Государственного контракта №8330р/13249 от 31.08.2010 «Разработка

субстанции, обладающей противовоспалительным, противомикробным и

противовирусным действием, для получения нового лекарственного средства для

лечения острых и хронических ринитов».

Полученные экспериментальные данные в отношении эффективности

применения препарата фрешнос послужили основанием для проведения

клинических испытаний, которые были инициированы и успешно проведены на

базе отоларингологического отделения Городской Клинической больницы №1 им.

147

Н.И.Пирогова г. Москвы под руководством академика Международной академии

оториноларингологии – Хирургии головы и шеи, члена-корреспондента

Российской академии медицинских наук, заслуженного деятеля науки РФ,

профессора Владимира Тимофеевича Пальчуна и на базе ФГБУ "СПб НИИ ЛОР"

Минздрава России под руководством профессора Юрия Константиновича Янова.

Результаты экспериментального исследования препарата КЛС-04 вошли в

досье на препарат для получения последующего разрешения на проведение

клинических испытаний.

148

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования позволили установить эффективность

применения новых препаратов природного происхождения КЛС-04 и фрешнос,

обладающих выраженными противовоспалительными свойствами на новых

разработанных и валидированных экспериментальных моделях заболеваний

верхних дыхательных путей – острого шейного лимфаденита и острого

риносинусита соответственно.

Были выявлены механизмы реализации препаратами фармакологических

эффектов. Так, при остром шейном лимфадените противовоспалительное

действие препарата КЛС-04 реализуется за счет влияния на неспецифический

каскад воспалительных реакций, что отражается в снижении уровня

провоспалительных цитокинов, С-реактивного белка и лейкоцитов. Также на

экспериментальной модели острого шейного лимфаденита был показан

выраженный противоотечный эффект КЛС-04, что отражалось в снижении

показателя разницы массы пораженного и интактного лимфатических узлов, а

также в проценте потери массы пораженного лимфатического узла после

лиофильного высушивания. Столь выраженный терапевтический эффект КЛС-04

обусловлен торможением синтеза простагландинов и лейкотриенов из

арахидоновой кислоты, и инициацией образования резолвинов, протектинов и

марезинов, участвующих в разрешении воспалительного процесса (Рыбакова

А.В., 2012, Крышень К.Л. 2013).

При оценке эффективности противовоспалительного эффекта исследуемого

препарат фрешнос на основе растительного сырья было показано выраженное

снижение количества бокаловидных клеток в носовых ходах экспериментальных

животных и значительное снижение инфильтрации слизистой оболочки и

подслизистого слоя лейкоцитами. Данный противовоспалительный эффект

обусловлен входящими в состав каждого компонента препарата флавоноидами,

149

обладающими выраженными антиоксидантными свойствами и нашел

подтверждение в ходе проведения клинических исследований.

150

ВЫВОДЫ

1. При разработке экспериментальной модели асептического острого

шейного лимфаденита выбрана наиболее подходящая тест-система для

формирования данной патологии (крысы-самки линии Вистар по причине их

наибольшей чувствительности), определены оптимальные повреждающие агенты

(водные растворы ЛПС 0,1 мг/кг и каррагенина 0,8 мг/кг), установлен срок

максимально выраженного процесса острого воспаления лимфоидной ткани после

введения провоспалительных агентов (72 ч), сформулирован перечень клинико-

диагностических показателей для оценки новой экспериментальной модели

асептического острого шейного лимфаденита.

2. Новая экспериментальная модель асептического острого шейного

лимфаденита валидирована по показателям правильность (точность) и

сходимость. Определено отсутствие влияния времени года на показатели

асептического воспаления регионарных лимфатических узлов при стандартных

условиях содержания экспериментальных животных.

3. Сопоставление эффективности нового отечественного

противовоспалительного препарата КЛС-04 в форме спрея в сравнении с тантум

верде, диклофенаком и дексаметазоном в экспериментальной модели острого

шейного лимфаденита подтвердило выраженное дозозависимое

противовоспалительное и противоотечное действие препарата КЛС-04.

Предполагаемым механизмом его действия является инициация образования

резолвинов, протектинов и марезинов, а также торможение синтеза

простагландинов. Наибольший терапевтический эффект препарата КЛС-04

достигается в дозах 3,2–6,4 мг/кг.

4. При разработке экспериментальной модели асептического острого

риносинусита на основании патофизиологических и патоморфологических

параметров выбрана наиболее подходящая тест-система для данной патологии

(крысы-самки линии Вистар), определен оптимальный повреждающий агент

151

(водный раствор формалина в дозе 12 мг/кг), установлен срок максимально

выраженного процесса острого риносинусита после введения провоспалительного

агента (7 суток), сформулирован перечень клинико-диагностических показателей

для оценки новой экспериментальной модели асептического острого


5. Новая экспериментальная модель асептического острого

риносинусита валидирована по показателю сходимость. Определено отсутствие

влияния времени года на показатели асептического воспаления носовых ходов

при стандартных условиях содержания экспериментальных животных.

6. Сравнение эффективности нового отечественного

противовоспалительного препарата фрешнос на основе травы тысячелистника

обыкновенного, листьев шалфея лекарственного, травы зверобоя

продырявленного, побегов багульника болотного, тимола и масла мяты перечной

в сравнении с виброцилом и аквамарисом в экспериментальной модели острого

риносинусита подтвердило выраженное противовоспалительное дозозависимое

действие фрешноса. Механизм действия препарата связан с

противовоспалительными, противоотечными и антиоксидантыми свойствами

компонентов препарата фрешнос. Максимально выраженный терапевтический

эффект нового препарата фрешнос достигается при его применении в

максимальной дозе 30 мкл/100 г массы тела.

152

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанные и валидированные модели острого риносинусита и острого

шейного лимфаденита рекомендуются для внедрения в доклинические

исследования противовоспалительной активности новых лекарственных средств

для ЛОР-практики.

Результаты экспериментального исследования нового комплексного

противовоспалительного препарата КЛС-04 оформлены в виде досье на препарат

для получения разрешения на проведение клинических испытаний. На этом

основании препарат КЛС-04 может быть рекомендован для клинической

апробации в качестве противовоспалительного и противоотечного средства для

лечения заболеваний верхних дыхательных путей, таких как острый тонзиллит

(ангина), ларингит, фарингит с учетом выявленых эффективных доз.

Установленная противовоспалительная активность нового растительного

препарата фрешнос позволяет рекомендовать его для применения в ЛОР-практике

для лечения острых и хронических ринитов и риносинуситов.

153

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. [ВИДАЛ] VIDAL Справочник лекарственных средств [Электронный

ресурс]. – Режим доступа: http://www.vidal.ru/, свободный (06.04.2015).

http://medi.ru/doc/270116.htm.

2. Антиоксидантные свойства продуктов растительного происхождения /

А.А. Лапин, С.А. Палкин, М.А. Чалкин и [др.] // Химия растительного сырья. –

2007. – № 2. – С. 79-83.

3. Барабой, В.А. Растительные фенолы и здоровье человека / В.А.

Барабой. – М. : Наука, 1984. – 160 с.

4. Белоусов, Ю.Б. Клиническая фармакология и фармакотерапия / Ю.Б.

Белоусов, В.С. Моисеев, В.К. Лепахин. — М.: Универсум паблишинг, 1997. —

531 с.

5. Геппе, Н.А. Муколитические и противокашлевые средства в практике

педиатра (лекция) / Н.А. Геппе, А.Б. Малахов // Детский доктор. – 1999. – №.4. –

С. 42-50.

6. Гуров, А.В. Возможности фитопрепаратов в лечении бактериального

воспаления околоносовых пазух / А. В. Гуров, А. В. Мужичкова // Природная

медицина. Medical Nature. – 2014. – № 1. – С. 6-9.

7. Гучев, И. А. Рациональная антибактериальная терапия острой

инфекции верхних дыхательных путей (риносинусит) / И.А. Гучев, А.А. Колосов

// Лечащий врач. – 2007. – № 9. – С.73-77.

8. Дюран, М. Инфекции верхних дыхательных путей [ Электронный

ресурс] / М. Дюран, М. Джозеф, Э. Бейкер // Harrison's Principles of Internal

Medicine. 14-th edition. – 2002. – Режим доступа:

http://humbio.ru/humbio/har/0029b3ba.htm#00234001.htm.

9. Зайцев, А.А. Острые респираторные вирусные инфекции:

перспективы противовирусной терапии (Генферон)/ А.А Зайцев, А.В. Горелов,

О.И. Клочков // Вестн. семейной медицины. – 2009. – №5. – С. 1-6.

http://www.vidal.ru/

http://humbio.ru/humbio/har/0029b3ba.htm#00234001.htm

154

10. Зилфикаров, И.Н. Дитерпены и полифенолы шалфея лекарственного.

Перспективы медицинского применения (обзор литературы) / И.Н. Зилфикаров //

Вестн. Санкт-Петербургского ун-та – 2007 Сер. Медицина. – № 3. – С. 149-158.

11. Игнатов, Ю.Д. Клиническая фармакология нестероидных

противовоспалительных средств / под ред. Ю.Д. Игнатов, В.Г. Кукес, В.И.

Мазуров. — М. : ГЭОТАР Медиа, 2010. – 256 с.

12. Ильина, Н.И. Круглогодичный аллергический ринит / Н.И. Ильина,

С.А. Польнер // Consilium medicum. – 2001. – Т.3, №8. – С. 384-393

13. Исследование противогриппозной активности тритерпеноидов /

В.Г. Платонов, А.Д. Зорина, М.А. Гордон [и др.] // Хим.-фарм. журн. – 1995. – Т.

29, № 2.– С. 42-46.

14. К механизму противовоспалительного действия комплекса,

выделенного из печени трески. Антиэкссудативное действие. (сообщение №1) /

К.Л. Крышень, Д.В. Демченко, А.Н. Шиков, О.Н. Пожарицкая, М.Н.Макарова,

В.Г. Макаров // Межд. Вестн. ветеринарии. – 2013. – №4. – С.100-106.

15. Коваленко, С.Л. Эффективность противомикробных средств

растительного происхождения в терапии оториноларинголических заболеваний у

детей / С.Л. Коваленко // Рос. оториноларингология. – 2010. – № 2. – С. 161-165.

16. Козлов, В.А. Создание модели хронического синусита / В.А. Козлов,

Г.Б. Трошкова, В.В. Некачалов // Бюллетень. – 1982. – №27. – С. 2.

17. Коновалов, Д.А. Биологически активные вещества Achillea

Millefolium L.S.L. / Д.А. Коновалов, В.А. Коновалова, В.А. Челобитько // Раст.

ресурсы. – 1990. – №26. – С. 598-608.

18. Коновалов, Д.А. Разработка методов хемотаксономического

прогнозирования поиска биологически активных веществ в растениях семейства

Астровые (род тысячелистник и др.): автореф. дис… докт. хим. наук:15.00.02 /

Коновалов Дмитрий Алексеевич. – Пятигорск, 2000. – 42 с.

19. Кривопустов, С.П. Оптимизация лечения заболеваний верхних

дыхательных путей у детей с помощью фитониринговых технологий / С.П.

Кривопустов // Здоров’я України XXI сторіччя. – 2009. – № 1 (2). – С. 30–31.

155

20. Крюков, А.И. Симптоматичсекая терапия при отрых респираторных

заболеваниях / А.И. Крюков, А.Б. Туровский // Справочник поликлинического

врача. Отоларингология. – 2005. – № 4. – С. 39-42

21. Лавренова, Г. В. Опыт применения фитотерапии у больных с

затянувшимся течением острого синусита и обострением хронического синусита /

Г.В. Лавренова, С.В. Баранская // Рус. мед. журн. – 2014. – № 18. – С. 1330-1334.

22. Лопатин, А.С. Острый риносинусит: этиология, патогенез,

диагностика и принципы лечения / А.С. Лопатин, В.М. Свистушкин //

Клинические рекомендации. – 2008. – Режим доступа:

23. Лопатин, А.С. Ринит / А.С. Лопатин. – М.: Литтера, 2010. – С. 122.

24. Лубсандоржиева, П. Б., Антиоксидантные свойства

противовоспалительного сбора in vitro/ Лубсандоржиева, П. Б., Ажунова Т. А.,

Цыбанов К. Б. // Сиб. мед. журн. – 2006. – Т. 64, № 6. – С. 87.

25. Лучихин, Л.А. Заболевания верхних дыхательных путей и уха:

справочник практикующего врача / Л.А. Лучихин, М.М. Магомедов, В.Т.

Пальчун. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2013. – 256 с.

26. Лучшева, Ю.В. Местная терапия при фарингите / Ю. В. Лучшева, Г.

Н. Изотова // Рос. мед. журн.: Независимое издание для практикующих врачей. —

2011. — т. 19, № 6. — С. 420-425.

27. Макаров, В. Г. Физиологические, биохимические и биометрические

показатели нормы экспериментальных животных под ред. В.Г. Макарова, М.Н.

Макаровой. – СПб. : ЛЕМА, 2013. – 116 с.

28. Макарова, М.Н. Молекулярная биология флавоноидов (химия,

биохимия, фармакология): рук. для врачей. / М.Н. Макарова, В.Г. Макаров. – СПб.

: Издатель, 2010. – 428 с.

29. Морозова, С. В., Расстройства обоняния и их коррекция / С.В.

Морозова, Д.М. Савватеева, А.С. Лопатин // Оториноларингология. – 2007. – №5.

– С. 66-70.

156

30. Морозова, С.В. Физиологиечские и клинические аспекты носового

дыхания / С.В. Морозова, А.М. Митюк // Рус. мед. журн. – 2011. – Т.19, 23. – С.

1405-1412.

31. Муколитическая терапия при лечении острых и хронических

риносинуситов / Н.Л. Кунельская, М.Е. Студены, Т.В. Рассказова, А.А. Смолькова

[и др.] // Рус. мед. журн. – 2012. – № 9. – С. 475-479.

32. Новые технологии переработки гидробионтов / Шиков, А.Н.,

Пожарицкая, О.Н., Уракова, И.Н., Рыбакова, А.В., Крышень, К.Л., Макаров, В.Г. //

Мат. конф.: Фармацевтические и медицинские биотехнологии. Биотехнология:

состояние и перспективы развития. – М., 2012. – С. 385.

33. О влиянии пенициллина в различных концентрациях на

ультраструктуру слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи при

экспериментальном гайморите / Е.Н. Единак, И.А. Яшан, С.А. Сморщок, И.А.

Сытник // Журн. ушных, носовых и горловых болезней. – 1985. – №3. – С. 20-24.

34. О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия

населения в Российской Федерациив 2013 году: Гос. доклад / Федеральная служба

по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. – М.,

2014. – 191 с.

35. Оковитый, С. В., Фармакологические подходы к противокашлевой

терапии / С.В. Оковитый, Н.А. Анисимова // Рус. мед. журн. – 2011. – № 23

Болезни дыхательных путей. – С. 1450-1457.

36. Особенности организации слизистой оболочки и сосудистой системы

полости носа: морфо-функциональные и клинические аспекты (обзор) / А.А.

Молдавская, Н.С. Храппо, Б.Н. Левитан, В.В. Петров // Мат. конф.: Современные

проблемы санаторно-курортных и рекреационных регионов России. – 2005. – С.

18.

37. Оценка противоаллергенных свойств нового полипептидного

препарата из печени тресковых / К.Л. Крышень, Д.В. Демченко, А.В. Рыбакова,

В.А. Дадали, А.В. Рыдловская, О.Н. Пожарицкая, М.Н. Макарова, А.Н. Шиков,

157

В.Г. Макаров // Экспериментальная и клин. дерматокосметология. – 2012. – №2. –

С.38-42.

38. Оценка противовоспалительного действия лекарственных препаратов

на основе шалфея / К.Л. Крышень, С.И.Гусева, С.В. Тесакова, А.А. Ацапкина //

Цитокины и воспаление. – 2009. – № 4. – С. 67-72.

39. Пальчун, В.Т. Болезни уха, носа и горла В.Т. Пальчун. – 2-е изд., доп.

и перераб. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 320с.; ил.

40. Патоморфология слизистой оболочки носа и сосудистой стенки при

носовых кровотечениях / А.А. Молдавская, Н.С. Храппо, Б.Н. Левитан, В.В.

Петров / Фундаментальные исследования. – 2006. – № 4. – С. 16-20.

41. Петрова, Л. Г. Этиопатогенез и принципы лечения риносинуситов

[Электронный ресурс] / Л.Г. Петрова // Белорус. мед. акад. постдипломного

образования. – Режим доступа: http://www.belmapo.by/page/20/680.

42. Пискунов, Г.З., Клиническая ринология / Г.З. Пискунов, С.З.

Пискунов. –2–е изд. – М. : Мед. информ. агентство, 2006. – 390 с.

43. Платонов, В.В. Генетическая связь биологической активности

сапропеля Астраханской области с исходным растительным и животным

материалом. [Электронный ресурс] / В.В. Платонов, А.А. Хадарцев, К. Я.

Фридзон // Вестн. новых мед. технологий. – 2014. – № 1. – Режим доступа:

http://www.medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2014-1/00.html

44. Позднякова, М. Г. Эпидемиология ОРВИ и возможность их

профилактики / М.Г. Позднякова, С.Е. Шелехова, М.К. Ерофеева // Рус. мед.

журн. – 2011. – Т. 23. – С. 21-24.

45. Полякова, А.С. Новое в лечении острых тонзиллитов у детей:

избранные лекции / А.С. Полякова, В.К. Таточенко // Рос. мед. журн. – 2014. – №

18. – С. 1339.

46. Попов, А.И. Фронтальный элементный анализ травы тысячелистника /

А.И. Попов, В.А. Попков // Хим.-фарм. журнал. – 1992. – № 26(9/10). – С. 96-97.

http://www.belmapo.by/page/20/680

http://www.medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2014-1/00.html

158

47. Прилепина, И.А. Заболевания верхних дыхательных путей в

педиатрической амбулаторной практике / И.А. Прилепина // Рус. мед. журн. –

2013. – №25. – С.1222-1226.

48. Противовоспалительные свойства эфирных масел тысячелиствника

азиатского и некоторых видов полыни / А.С. Саратиков, Т.П. Прищеп, А.И.

Венгеровский и [др.] // Хим. фарм журн. – 1986. – № 20(5). – С. 585-588.

49. Руженцова, Т.А. Фитотерапия в лечении острых респираторных

инфекций у детей / Т.А. Руженцова, А.В. Будаковская, А.В. Горелов // Рус. мед.

журн. – 2014. – № 21. – С. 1538.

50. Руководство по проведению доклинических исследований

лекарственных средств. – Часть первая / под ред. Миронова А.Н. – М. : Гриф и К,

2012. — 944 с.

51. Рыбакова, А.В. Изучение противовоспалительной активности нового

ветеринарного препарата афлогилекс на модели экспериментального

адъювантного артрита / А.В. Рыбакова, К.Л. Крышень // Межд. вестн.

ветеринарии. – 2012. – №1. – С. 39-43.

52. Рязанцев, С.В., Этиопатогенетическая терапия заболеваний верхних

дыхательных путей и уха. Метод. рек. / С.В. Рязанцев, В.И. Кочеровец. – СПб.,

2008. – 120 с.

53. Савватеева, Д.М. Диагностика и лечение обонятельной дисфункции у

больных острым риносинуситом / Д.М. Савватеева // Рос. ринология. – 2010. –

№2. – С. 8-11.

54. Сакович, А.Р. Синуситы: клинико-эпидемиологический анализ / А.Р.

Сакович // Военная медицина. – 2009. – № 3. – С. 60-63.

55. Сербин, А. Т., Химический состав и лечебное применение видов

Achillea L. / А.Т. Сербин, Л.С. Картмазова, Н.М. Ткаченко // Растительные

ресурсы. – 1987. –Т. 23, № 2.– С. 275-286.

56. Сергеева, Т.Н. Аутоиммунные механизмы паркинсоноподобных

нарушений у крыс / Т.Н. Сергеева, В.Г. Сергеева // Вест. Удмуртского ун-та. –

2011. – Вып.1. Биология. Науки о Земле. – С. 81-87.

159

57. Смирнова, Л.П. Химическое изучение флавоноидов некоторых видов

льнянок и шалфеев: автореф. дис… канд. фарм. наук / Смирнова Лилия

Порфирьевна. – М., 1976. – 25 с.

58. Современные препараты для местного лечения инфекционно-

воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей / Е.Е. Лесиовская, Е.Н.

Саканян, У.Г. Переплеткина, К.Э. Кабишев // Фарм. еxpress. – 2000. – №3 – С. 3-

5.

59. Соколов, С.Я. Справочник по лекарственным растениям / С.Я.

Соколов, И.П. Замотаев. – М. : VITA, 1993. – 512 c.

60. Страчунский, Л.С. Нестероидные противовоспалительные средства:

Методическое пособие / Л.С. Страчунский, С.Н. Козлов; Смоленская гос. мед.

акад., Каф. клин. фармакол. – 2008. – 54 с.

61. Тактика мукоактивной терапии в педиатрической практике / Ю.Л.

Мизерницкий, И.М. Мельникова, Б.Ц. Батожаргалова, Я.В. Логиневская //

Тихоокеанский мед. журн. – 2011. – №2. – С. 14-25

62. Трушенко, Н. В. Мукорегуляторы в терапии заболеваний органов

дыхания / Н.В. Трушенко //Атмосфера. Пульмонология и аллергология. – 2011. –

№4. – С. 24-27.

63. Тюренков, И.Н. Иммуномодулирующие свойства композиции

фенотропила и глутаминовой кислоты / И.Н. Тюренков, М.А. Самотруева, Н.Н.

Гражданцева // Биомедицина. – 2011. – Т.11, №3. – С 63-69.

64. Учайкин, В.Ф. Руководство по инфекционным болезням / В.Ф.

Учайкин. – М.: Гэотар-Мед, 2004. – 824 с.

65. Файзулин, М.Х. Рентгеноморфологическая характеристика

экспериментального фронтита / М.Х. Файзулин, М.К. Михайлов // Журн.

эксперимент, и клин. медицины. – 1971. – T.XI, №6. – С. 18-23.

66. Харкевич, Д.А. Фармакология / Д.А. Харкевич. – 10-е изд. – М. :

ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 908 с.

160

67. Херобян, Ф.А. Клинико-рентгенологические и патогистологические

исследования при воспалительных процессах верхнечелюстных пазух: автореф.

дис. … канд. мед. наук / Ф.А. Херобян. – Ереван, 1954. – 30с.

68. Ходзицкая, В.К. Мукоцилиарный клиренс. Методы коррекции при

заболевании дыхательных путей и ЛОР-органов: пособие для врачей / В.К.

Ходзицкая, С.В. Ходзицкая. – Харьков.: Харьковская мед. акад. последипломного

образования, 2008.—32 с.

69. Ходзицкая, В.К. Нарушение и коррекция мукоцилиарного клиренса

при заболеваниях дыхательных путей и ЛОР-органов [Электронный ресурс] / В.К.

Ходзицкая // Болезни и антибиотики. – 2010. – №1. – Режим доступа:

http://www.mif-ua.com/archive/issue-14554/article-14576/.

70. Челенкова, И.Н. Клинические рекомендации и алгоритмы для

практикующих врачей / И.Н. Челенкова, Д.Б. Утешев, Н.Д. Бунятян // Рус. мед.

журн. – 2010. – № 30. – С. 1878

71. Чистюхина, И.О. Моделирование параназального синусита

(экспериментально-клиническое исследование): автореф. дис. … канд. мед. наук /

И.О. Чистюхина– Ростов н/Д., 1998.– 20 с.

72. Шапиро, М.Я. Значение сосудистого и нервного факторов в

патогенезе фронтита и его осложнений / М.Я. Шапиро // Журн. ушных, носовых и

горловых болезней. – 1965. – №4. – С. 16-21.

73. Экспериментальная модель шейного лимфаденита у крыс для оценки

противовоспалительной эффективности препаратов / С.В. Тесакова, И.А.

Самусенко, И.В. Карачинская [и др.] // Профилактическая и клиническая

медицина. – 2011. – 1(38). – C. 57-63.

74. Яцюк, В.Я. Фармакогностическое исследование растений рода

горицвет и тысячелитник как источников биологически активных веществ :

автореф. дис. … докт. фарм. наук : 15.00.02 / Яцюк Валентина Яковлевна. – М.,

1996: – 39с.

161

75. A murine model of granulomatous colitis with mesenteric lymphadenitis

induced by mycobacterial cord factor / M. Sogawa, T. Matsumoto, H. Yamagami, T.

Yamada [et al.] // Virchows Arch. – 2003. – Vol. 442, №2. – P. 151-158.

76. A novel anticoagulant purified from fish protein hydrolysate inhibits factor

XIIa and platelet aggregation / N. Rajapakse, W-K. Jung, E. Mendis, S-H. Moon [et al.]

// Life Sci. – 2005. – Vol. 76, №22. – P. 2607-2619.

77. Altitudinal variability in anthraquinone constituents from novel cytotypes

of Rumex nepalensis Spreng—a high value medicinal herb of North Western Himalayas

/ U. Farooq, A. Pandith, M. Inder Singh Saggoo, S.K. Lattoo // Industrial Crops and

Products. – 2013. – Vol. 50. – P. 112-117.

78. Amino acid composition and antioxidative peptides from protein

hydrolysates of yellow stripe Trevally (Selaroides leptolepis) / V. Klompong, S.

Benjakul, M. Yachai [et al.] // J Food Sci. – 2009. – Vol. 74, №2. – P.126-133.

79. An essential role for dendritic cells in human and experimental allergic

rhinitis / A. KleinJan, M. Willart, B. Leonie S. van Rijt, G. Braunstahl [et al.] // J.

Allergy. Clin. Immunol. – 2006. – Vol. 5. – P. 1117-1125.

80. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from yellowfin sole

(Limanda aspera) frame protein and its antihypertensive effect in spontaneously

hypertensive rats / W.K. Jung, E., E. Mendis, J.Y. Je [et al.] // Food Chem. – 2006. –

Vol. 94, №.1. – P. 26-34.

81. Antiallergic effect of KOB03, a polyherbal medicine, on mast cell-

mediated allergic responses in ovalbumin-induced allergic rhinitis mouse and human

mast cells [Электронный ресурс] / Hyo Won Jung a, Jin-Ki Jung , Cheong Weon Cho

c [et al.] // J. of Ethnopharmacol. – 2012. – Vol. 142. – P. 684-693. – Режим доступа:

www.elsevier.com/locate/jep

82. Antibiotics for adults with clinically diagnosed acute rhinosinusitis: a meta-

analysis of individual patient data / J. Young, A. De Sutter, D. Merenstein [et al.] //

Lancet. – 2008. – Vol. 371. – P. 908–914.

83. Anti-inflammation effects of hydrogen saline in LPS activated

macrophages and carrageenan induced paw oedema [Электронный ресурс] / Zheng

http://www.elsevier.com/locate/jep

162

Xu, Jiangrui Zhou, Jianmei Cai [et al.] // J. Inflam. – 2012. – Режим доступа:

http://www.journal-inflammation.com/content/9/1/2

84. Anti-inflammatory effects of low molecular weight heparin derivative in a

rat model of carrageenan-induced pleurisy / Ceccarelli, M., Bani, D., Cinci, L. [et al.] //

J. Cell. Mol. Med. – 2009. – Vol. 13, №8. – Р. 2704-2712.

85. Antimicrobial and antioxidant properties of rosemary and sage

(Rosmarinus officinalis L. and Salvia officinalis L., Lamiaceae) essential oils / B.

Bozin, N. Mimica-Dukic, I. Samojlik, E. Jovin // J. agricult. food chem. – 2007. – Vol.

55, №19. – P. 7879-7885.

86. Antioxidant activity of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) essential oil

and its hepatoprotective potential [Электронный ресурс] / A. Rašković, I. Milanović,

N. Pavlović [et al.] // BMC Complementary and Alternative Medicine. – 2014. – Vol.

14. – 225 p. – Режим доступа: http://www.biomedcentral.com/1472-6882/14/225

87. Antioxidant activity, total phenolic and flavonoid contene of water extract

from Accillea Millefolium L. / S. Keser, S. Celik, S. Turkoglu, Ö. Yilmaz [et al.] //

Turk. J. Pharm. Science. – 2013. – Vol. 10, №3. – P. 385-392.

88. Are empiric antibiotics for acute exudative tonsillitis needed in children? /

T.H. Hsieh , P.Y. Chen, F.L. Huang [et al.] // J. Microbiol. Immunol. Infect. – 2011.–

Vol. 44 – Р. 328–332.

89. Assessment of cholinesterase and tyrosinase inhibitory and antioxidant

effects of Hypericum perforatum / M.L. Altun, B.S. Yılmaz, I.E. Orhan, G.S. Citoglu //

Ind. Crops Prod. – 2013. – Vol. 43. – P. 87–92.

90. Atti-Serafini Antibacterial activity of the essential oils of Salvia officinalis

L. and Salvia triloba L. cultivated in South Brazil / A.P. Longaray Delamare, I.T.

Moschen-Pistorello, L. Artico [et al.] // Food Chem. – 2007. – Vol. 100. – P. 603–608.

91. Bertolini, A. Dual acting anti-inflammatory drugs: a reappraisal

pharmacological research / A. Bertolini, A. Ottani, M. Sandrini // Pharmacol. Res. –

2001. – Vol. 44, №6. – P. 437–450.

92. Beutler, B. Innate immune sensing and its roots: the story of endotoxin / В.

Beutler, E. T. Rietschel // Nat. Rev. Immunol. – 2003. – Vol. 3. – P. 169-176.

http://www.journal-inflammation.com/content/9/1/2

https://mail.rambler.ru/m/redirect?url=http%3A//pubs.acs.org/action/doSearch%3FContribStored%3DBozin%252C%2BB&hash=c89423c3afc4785aef27e926d6009ddb

https://mail.rambler.ru/m/redirect?url=http%3A//pubs.acs.org/action/doSearch%3FContribStored%3DBozin%252C%2BB&hash=c89423c3afc4785aef27e926d6009ddb

https://mail.rambler.ru/m/redirect?url=http%3A//pubs.acs.org/action/doSearch%3FContribStored%3DMimica-Dukic%252C%2BN&hash=0a666d1e5a2abb5d86ee0bed9e9d2f25

https://mail.rambler.ru/m/redirect?url=http%3A//pubs.acs.org/action/doSearch%3FContribStored%3DSamojlik%252C%2BI&hash=1e251d851e65e1951d89869f9efee22c

https://mail.rambler.ru/m/redirect?url=http%3A//pubs.acs.org/action/doSearch%3FContribStored%3DJovin%252C%2BE&hash=623e7871f77bf6c298c737ce35a59fa0

http://www.biomedcentral.com/1472-6882/14/225

163

93. Bhakuni, D. S. Bioactive marine natural products / D.S.Bhakuni, D.S.

Rawat // New Delhi. – 2005. – P. 13-17.

94. Bland, M. An Introduction to Medical Statistics. / M. Bland. – 3 rd edition.

– Oxford. : Oxford Medical Publications, 2000. – 422 р.

95. Bousquet, J. Allergic rhinitis and its impact on asthma / J. Bousquet , P.

Van Cauwenberge, N. Khaltaev // J. Allergy Clin. Immunol. – 2001. – Vol. 108, №5. –

P. S147-S334.

96. Bousquet, J. Allergic rhinitis and its impact on asthma / J. Bousquet, P.

Van Cauwenberge, N. Khaltaev // Allergy. – 2008. – Vol. 63, №s86. – P. 8-160.

97. Canadian clinical practice guidelines for acute and chronic rhinosinusitis /

M. Desrosiers, G.A. Evans, P.K. Keith [et al.] // Allerg. Asthma Clin. Immunol. – 2011.

– Vol. 7, №1. – P. 2.

98. Caroff, M. Structure of bacterial lipopolysaccharides / M. Caroff, D.

Karibian // Carbohydr. Res. – 2003. – Vol. 338. – P. 2431-2447.

99. Carté, B.K. Marine natural products as a source of novel pharmacological

agents / B.K. Carté // Curr. Opin. Biotechnol. – 1993. – Vol.4. – P. 275-279.

100. Cavero, R.Y. Medicinal plants used for dermatological affections in

Navarra and their pharmacological validation / R.Y Cavero, S. Akkereta, M. Calvo // J.

Ethnopharmacol. – 2013. – Vol. 149, №2. – P. 533-542.

101. Celotti, F. Anti-inflammatory drugs: new multitarget compounds to face an

old problem. The dual inhibition concept / F. Celotti, S. Laufer // Pharmacol Res. –

2001. – Vol. 43, №5. – P. 429–436.

102. Ciuman, R. R. Phytotherapeutic and naturopathic adjuvant therapies in

otorhinolaryngology / R.R. Ciuman // Eur. Arch. Otorhinolaryngol. – 2012. – Vol. 269,

№2. – P. 389-397.

103. Comparison of lung accumulation of cationic liposomes in normal rats and

LPS-treated rats / Herber-Jonat S., S., Mittal R., Gsinn S. [et al.] // Inflammation

research. – 2011. – Vol. 60, №3. – P. 245-253.

104. Comparison of trans-1-amino-3-[18F]fluorocyclobutanecarboxylic acid

(anti-[18F]FACBC) accumulation in lymph node prostate cancer metastasis and

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Herber-Jonat%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mittal%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gsinn%20S%22%5BAuthor%5D

164

lymphadenitis in rats / M. Kanagawa, Y. Doi, S. Oka, R. Kobayashi [et al.] // Anatomy.

– 2003. – Vol. 202, №6. – P. 551–561.

105. Cook, C. D. Nociceptive sensitivity and opioid antinociception and

antihyperalgesia in Freund's adjuvant-induced arthritic male and female rats / C.D.

Cook, M.D. Nickerson //J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2005. – Vol. 313, №1. – P. 449-

459.

106. Corning, B. F Group G streptococcal lymphadenitis in rats / B.F. Corning,

J.C. Murphy, J.G. Fox // J. Clin. Microbiol. – 1991. – Vol. 29, №12. – P. 2720-2723.

107. Dicpinigaitis, P.V Sensitivity Effect of Guaifenesin on Cough Reflex / P.V.

Dicpinigaitis, Y.E. Gayle // Chest. – 2003. – Vol. 124. – P. 2178–2181.

108. Dugo, L. Effects of GW274150, a novel and selective inhibitor of iNOS

activity, in acute lung inflammation / Dugo, L., Marzocco, S., Mazzon, E. // Br. J.

Pharmacol. – 2004. – Vol.141, №6. – Р. 979-987.

109. Effect of Tong Qiao drops on the expression of eotaxin, IL-13 in the nasal

mucosa of rats with allergic rhinitis [Электронный ресурс] / Ying-Ying Xu, Xiang Liu,

Li-Bo Dai [et al.] // J. Chin. Med. Ass. – 2012. – Vol. 75. – P. 524-529. – Режим

доступа: http://dx.doi.org/10.1016/j.jcma.2012.07.003

110. Effects of cryptoporus polysaccharide on rat allergic rhinitis associated

with inhibiting eotaxin mRNA expression / Qiang-Min Xie a, Jun-Fang Deng, Yang-

Mei Deng a [et al.] // J. Ethnopharmacol. – 2006. – Vol. 107. – P. 424–430.

111. Effects of Salvia officinalis and Thymus vulgaris on oxidant-induced DNA

damage and antioxidant status in HepG2 cells / K. Kozics, V. Klusová, A. Srancˇíková,

P. Mucˇaji [et al.] // Food Chem.–2013. – Vol. 141. – P. 2198–2206.

112. Effects of somatostatin analogues and vitamin C on bacterial translocation

in an experimental intestinal obstruction model of rats // M. Akyildiz, S. Ersin, E

Oymaci, M. Dayangaç [et al.] // Invest. Surg. – 2000. – Vol. 13, №3. – P. 169-173.

113. Effects of TAK-427 on acute nasal symptoms and nasal obstruction in

guinea pig model of experimental allergic rhinitis / S. Fukuda, K. Midoro, M. Gyoten,

Y. Kawano [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 2003. – Vol. 476. – P. 239–247.

http://dx.doi.org/10.1016/j.jcma.2012.07.003

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.04.089




165

114. Elias, R. J. Antioxidant activity of proteins and peptides / R.J. Elias, S.S.

Kellerby, E.A. Decker // Crit. Rev. Food Sci. Nut. – 2008. – Vol. 48, №5. – P. 430-441.

115. Endotoxin induces a delayed loss of TH-IR neurons in substantia nigra and

motor behavioral deficits / Y. Liu, B. Wilson, X. Wu [et al.] // Neurotoxicol. – 2008. –

Vol. 29. – P. 864-870.

116. EPOS 2012: European position paper on rhinosinusitis and nasal polyps

2012. A summary for otorhinolaryngologists / W. J. Fokkens, V. J. Lund, J. Mullol [et

al.] // Rhinology. – 2012. – №50. – P. 1-12.

117. Experimental Graft Versus Host Disease in the (BN× LEW) Fl Rat Hybrid

as a Model for Autoimmune Disease. Study of Early Adenitis in Lacrimal and Salivary

Glands / M.J. Peszkowski, K. Fujiwara, G. Warfvinge, A. Larsson [et al.] //

Autoimmunity. – 1996. – Vol. 24, №2. – P. 101-111.

118. Fujita, H., Yoshikawa M. LKPNM: a prodrug-type ACE-inhibitory peptide

derived from fish protein / H. Fujita, M. Yoshikawa // Immunopharmacology. – 1999. –

Vol. 44, №1. – P. 123–127.

119. Garcia Rodriguez, L. Role of dose potency in the prediction of risk of

myocardial infarction associated with nonsteroidal antiinflammatory drugs in the

general population / L. Garcia Rodriguez, S. Tacconelli, P. Patrignani // J. Am. Coll.

Cardiol. – 2008. – Vol. 52. – P. 1628–1636.

120. Glaser, K. Regulation of prostaglandin H synthase 2 expression in human

monocytes by the marine natural products manoalide and scalaradial: novel effects

independent of inhibition of lipid mediator production / Glaser, K., Lock, Y. //

Biochem. Pharmacol. – 1995. – Vol. 50. – P.913-922.

121. G-protein coupled receptor kinase 5 mediates lipopolysaccharide-induced

NFκB activation in primary macrophages and modulates inflammation in vivo in mice /

S. Patial, S. Shahi, Y. Saini [et al.] // J. Cell. Physiol. – 2011. – Vol. 226, №5. – P.

1323-1333.

122. Grzegorczyk, I. Antioxidant activity of extracts from in vitro culturesof

Salvia officinalis / I. Grzegorczyk, A. Matkowski, H. Wysokin´ska // Food Chemistry. –

2007. – Vol. 104. – P. 536–541.

166

123. Guibas, G. V. N‐acetylcysteine exerts therapeutic action in a rat model of

allergic rhinitis / G. V. Guibas, E. Spandou, S. Meditskou et al. // Int. forum of allergy

& rhinology. – 2013. – Vol. 3, №7. – P. 543-549.

124. Helmy, M. Antioxidants as adjuvant therapy in rheumatoid disease / M.

Helmy, M. Shohayeb, M.H. Helmy, E.A. El-Bassiouni [et al.] // Arzneimittelforschung.

– 2001. – Vol. 51, №04. – P. 293-298.

125. How to randomize / D.G. Altman, J.M. Bland [et al.] // BMJ. – 1999. –

Vol. 11. – P. 319.

126. HPLC preparation of fish waste hydrolysate fractions. Effect on guinea pig

ileum and ACE activity / S. Bordenave, I. Fruitier, I. Ballander [et al.] // Prep. Biochem.

Biotech. – 2002. – Vol. 31, №1. – P. 65-77.

127. Hypotensive effect of fish-protein hydrolysate / K. Sugiyama, K. Takada,

M. Egawa [et al.] // J. Agric. Chem. Soc. Japan. – 1991. – Vol. 65, N. 1. – P. 35-43.

128. Identification of anti-inflammatory constituents in Hypericum

perforatumand Hypericum gentianoides extracts using RAW 264.7 mouse macrophages

/ N. Huang, L. Rizshsky, C. Hauck, B.J. Nikolau [et al.] // Phytochemistry. – 2011. –

Vol. 72. – P. 2015–2023.

129. IDSA clinical practice guideline for acute bacterial rhinosinusitis in

children and adults / A.W. Chow, M.S. Benninger, I. Brook [et al.] // Clin. Infect. Dis.

– 2012. – P. 1043-1046.

130. Immune stimulated regional inflammatory responses mediating lung

reactivity in rats / S. Ahlstedt, B. Björkstén, B. Hesselmar, H. Nygren [et al]. // Allergy.

– 1985. – Vol. 40, №4. – P. 282-288.

131. Inhibition of angiotensin I-converting enzyme by Bacillus-Licheniformis

alkaline protease hydrolzates derived from sardine muscle / T. Matsui, H. Matshufuji, E.

Seki [et al.] // Biosci. Biotech. Biochem. – 1993. – Vol. 57, №6. – P. 922-925.

132. Investigations into inhibitor type and mode, simulated gastrointestinal

digestion, and cell transport of the angiotensin I-converting enzyme-inhibitory peptides

in Pacific hake (Merluccius productus) fillet hydrolysate / C.D. Cinq-Mars, C. Hu, D.D.

Kitts // J. Agric. Food. Chem. 2008. – Vol. 56, №2. – P. 410-419.

http://dx.doi.org/10.1016/j.phytochem.2011.07.016




167

133. Isolation of acid peptide fractions from a fish protein hydrolysate with

strong stimulatory effect on Atlantic salmon (Salmo salar) head kidney Leucocytes / A.

Gildberg, J. Bogwald, A. Johansen [et al.] // Comp. Biochem. Physiol. –1996. – Vol. 11.

– P. 97–101.

134. Je, J. Y. A novel angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide from

Alaska pollack (Theragra chalcogramma) frame protein hydrolysate / J.Y. Je, P-J Park,

J. Kwon, S-K. Kim // J. Agric. Food Chem. – 2004. – Vol. 52, №26. – P. 7842-7845.

135. Jeon, Y.J. Improvement of functional properties of cod frame protein

hydrolysates using ultrafiltration membranes / Y.J. Jeon, H.G. Byun, S.K. Kim //

Process Biochem. – 1999. – Vol. 35, №5. – P. 471-478.

136. Johansson, P. Blood flow in the rabbit maximally sinus [Текст] / P.

Johansson, J. Kunlien // Acta Otolaringol. – 1988. – Vol. 106. – P. 299-305.

137. Juneja, L. Ovalbumin induced allergic rhinitis and development of

prediabetes to rats: possible role of th2 cytokines / L. Juneja, H. S. Parmar //

Inflammation & Allergy-Drug Targets (Formerly Current Drug Targets-Inflammation &

Allergy). – 2013. – Vol. 12, №3. – P. 199-205.

138. Jung, H.W. Comparison of the efficacy of KOB03, ketotifen, and

montelukast in an experimental mouse model of allergic rhinitis [Электронный ресурс]

/ H. Jung, J. Jung, Y. Park // Int. Immunopharmacol. – 2013 – Vol. 16 – P. 254–260. –

Режим доступа: www.elsevier.com/locate/ejphar, свободный.

139. Khora, S. S. Marine fish-derived bioactive peptides and proteins for human

therapeutics / S.S. Khora // Int. J. Pharm. Pharm. Sci. – 2013. – Vol. 5, №3. – P. 31-37.

140. Kim, S. K. Development and biological activities of marine-derived

bioactive peptides: A review / S.K. Kim, I. Wijesekara // J. Funct. Foods. – 2010. – Vol.

2, №1. – P. 1-9.

141. Kumar, K. High-through screening assays for cyclooxygenase-2 and 5-

lipoxygenase, the targets for inflammatory disorders / K. Kumar // Indian J. Biochem.

Biophys. – 2011. – Vol. 48. – P.256–261.

142. Lariviere, W. R. Inflammation-susceptible Lewis rats show less sensitivity

than resistant Fischer rats in the formalin inflammatory pain test and with repeated

http://dx.doi.org/10.1016/j.intimp.2013.04.011






http://www.elsevier.com/locate/ejphar

168

thermal testing / W.R. Lariviere, M.A. Sattar, R. Melzack //J. Neurophysiol. – 2006. –

Vol. 95, №5. – P. 2889-2897.

143. Li, D. Macronutrient innovations: the role of fats and sterols in human

health / D. Li, A. Sinclair // Asia Pac. J. Clin. Nutr. – 2002. – Vol. 11. – P.155-162.

144. Li, Y. Effects of tripterine on NF-kappaB and eotaxin in nasal mucosa of

allergic rhinitis rat / Y. Li, X. Chen // J. Clin. Otorhinolaryngol. Head. Neck Sur. –

2012. – Vol. 26, №20. – P. 943-945.

145. Local and landscape factors affecting communities of plants and diurnal

Lepidoptera in black coal spoil heaps: Implications for restoration management / R.

Tropek, M. Hejda, T. Kadlec, L. Spitzer // Ecolog. Engineer. – 2013. – Vol. 57. – P.

252-260.

146. Mattacks, C. A. The cellular structure and lipid/protein composition of

adipose tissue surrounding chronically stimulated lymph nodes in rats / C.A. Mattacks,

D. Sadler, C.V. Pond // J. Anat. – 2003. – Vol. 202, №6. – P. 551-561.

147. No involvement of interleukin-5 or eosinophils in experimental allergic

rhinitis in guinea pigs / M. Yamasaki, N. Mizutani, K. Sasaki, T. Nabe [et al.] // Eur. J.

Pharmacol. – 2002. – Vol. 439. – P. 159–169.

148. Okadaic acid stimulates phospholipase A2, cyclooxygenase and

lipoxygenase / Huynh, C., Pinelli, E., Puiseux-Dao, S. Pfohl-Leszkowicz, A. // Mutat.

Res. Fundam. Mol. Mech. Mutagenesis. – 1997. – Vol. 379. – P.53.

149. Pereira, E.J. The effect of inhaled on upper airway resistance in humans. A

randomized controlled crossover study / E.J. Pereira, I. Sim, H.S. Driver // Can. Respir.

J. – 2013. – Vol. 20, №1.

150. Pomponi, S. A. The bioprocess-technological potential of the sea / S. A.

Pomponi // J. Biotechnol. – 1999. – Vol. 70. – P. 5–13.

151. Posadas, I. Carrageenan‐induced mouse paw oedema is biphasic,

age‐weight dependent and displays differential nitric oxide cyclooxygenase‐2

expression / Posadas, I. // Br. J. Pharmacol. – 2004. – Vol. 142, № 2. – P. 331-338.

152. Purification and characterization of an antioxidative peptide from

enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein / S.Y. Jun, P-J.

169

Park, W-K. Jung, S-K. Kim // Eur. Food Res. Technol. – 2004. – Vol. 219, №1. – P. 20-

26.

153. Quigley, R. L. Application of the popliteal lymph node assay to evaluate an

immunosuppression protocol / R.L. Quigley // J. Surg. Res. – 1994. – Vol. 56, №1. – P.

28-31.

154. Resolvin E1: a novel lipid mediator in the resolution of allergic airway

inflammation / T. Ishizuka, T. Hisada, H. Aoki, M. Mori // Expert. Rev. Clin. Immunol.

– 2008. – Vol. 4. – P.669-672.

155. Rhinitis in guinea pigs / N. Vishnu, M.M. Thakare, Osama [et al.] // Int.

Immunopharmacol. –2013. – Vol. 17. – P. 18–25.

156. Role of 15-deoxy delta(12,14) prostaglandin J2 and Nrf2 pathways in

protection against acute lung injury / M. Mochizuki, Ishii Y. [et al.] // Am. J. Respir.

Crit. Care. Med. – 2005. – Vol. 171, №11. – Р.1260-1266.

157. Saddiqe, Z. A review of the antibacterial activity of Hypericum perforatum

/ Z. Saddiqe, I. Naeem, A. Maimoona // J. Ethnopharmacol. – 2010. – Vol. 131. – P.

511–521.

158. Samotrueva, M.A. The phenibut Influence on the phagocytosis indices

under the immune stress conditions [Электронный ресурс] / M.A. Samotrueva, E.N.

Tyurenkov, N.R. Kuleshevskaya, T.K. Serezhnikova [et al.] // Int. J. Appl. Fundam.

Res. – 2011. – № 1 – Режим доступа: www.science-sd.com/387-23476

159. Sepčić, K. 3-alkylpyridinium compounds as potential non–toxic antifouling

agents. / K. Sepčić, T. Turk // Antifouling Compounds. – 2006. – P. 105–124.

160. Serhan, C. Novel anti-inflammatory pro-resolving mediators and their

receptors / C. Serhan, S. Krishnamoorthy, A. Recchiuti , N. Chiang // Curr. Top. Med.

Chem. – 2011. – Vol. 11. – P. 629-647.

161. Serhan, C. Resolving inflammation: dual anti-inflammatory and pro-

resolution lipid mediators / C. Serhan, N. Chiang, T.Dyke, Van // Nat. Rev. Immunol. -

2008. – Vol. 8. – P.349-361.

162. Spatial and temporal expression of CCR3 and the common beta chain of

the IL-3, IL-5 and GM-CSF receptor in the nasal epithelium and lymphoid tissues in a

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mochizuki%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ishii%20Y%22%5BAuthor%5D

170

rat model of allergic rhinitis / M. Fortin, J. G. Wagner, J. Brault [et al.] //Cytokine. –

2010. – Vol. 52, №3. – P. 194-202.

163. Stables, M. Old and new generation lipid mediators in acute inflammation

and resolution / M. Stables, D. Gilroy // Prog. Lipid Res. – 2011. – Vol. 50. – P. 35–51.

164. The 5-lipoxygenase inhibitor, zileuton, suppresses prostaglandin

biosynthesis by inhibition of arachidonic acid release in macrophages / A. Rossi, C.

Pergola, A. Koeberle [et al.] // Br. J. Pharmacol. – 2010. – Vol. 161, №3. – Р. 555-570.

165. The antiallergic mechanisms of Citrus sunki and bamboo salt (K-ALL) in

an allergic rhinitis model / H. A. Oh, M. J. Kim, T. Y. Shin [et al.] // Exp. Biol. Med. –

2014. – Vol. 239, №1. – P. 83-93.

166. Topical anti-inflammatory activity of Sal6ia officinalis L. leaves: the

relevance of ursolic acid / D. Baricevic, S. Sosa, R. Della Loggia, A. Tubaro [et al.] // J.

Ethnopharmacol. – 2001. – Vol. 75. – P. 125–132.

167. Topical levamisole hydrochloride therapy attenuates experimental murine

allergic rhinitis / H. Wang, J. Zhang, C. Gao b, Y. Zhu [et al.] // European Journal of

Pharmacology. – 2007. – Vol. 507. – P. 162–169.

168. Use of antibiotics for adult upper respiratory infections in outpatient

settings: a national ambulatory network study / J.M. Gill, P. Fleischut, S. Haas [et al.] //

Fam. Med. – 2006. – Vol. 38, №5. – P. 349.

169. Vagal nerve stimulation modulates the dendritic cell profile in

posthemorrhagic shock mesenteric lymph / K. Morishita, T.W. Costantini, B. Eliceiri,

V. Bansal [et al.] // J. Trauma Acute Care Sur. – 2014. – Vol. 76, №3. – P. 610-618.

170. Wang, D.Y. A survey on the management of acute rhinosinusitis among

Asian physicians / D.Y. Wang, R.S. Wardani, K. Singh // Rhinology. – 2011. – №49

(3). – P. 264–271.

171. Weiss, D. J., Schalm's veterinary hematology. / D. J. Weiss, K. J. Wardrop

// Wiley-Blackwell. 6-th edition. – 2010. – p. 1232.

172. Winter, C. Carrageenin-induced in hind paw of the rats as an assay for anti-

inflammatory drugs / C. Winter, E. Risley, G. Nuss // Exp. Biol. Med. – 1962. – Vol.

111. – P. 537-544.

«ВОЕННО МИНИСТЕРСТВА ОБОРОНЫ РОССИЙСКОЙ...

Documents

Transcript of «ВОЕННО МИНИСТЕРСТВА ОБОРОНЫ РОССИЙСКОЙ...