P L A T F O R M

Fosfaatstatus van Loosdrechtse Plassen als monitorings-instrumcnt voor herstel

DR. M. DIGNUM, NEDERLANDS INSTITUUT VOOR ECOLOGIE - CENTRUM VOOR LIMNOLOGIE

DRS. J. HOFSTRA, DIENST WATERBEHEER EN RIOLERING

DRS. B. VAN DER WAL, STICHTING TOEGEPAST ONDERZOEK WATERBEHEER

De Universiteit van Amsterdam en liet Centrum voor Limnologie in Nieuwerslms ontwikkelen een

nieuwe methode voor het bepalen van de beschikbaarheid van fosfaat voor jytoplankton m meren

waar de concentratie fosfaat al zeer laag is. De techniek is 1112001 met succes toegepast in de Loos­

drechtse Plassen, waar een verdere reductie van de (os/aatbelustuig noodzakelijk is voor ecologisch

herstel. De toepassing werpt ecu nieuw licht op de voedingstoestand 111 het meer. Kennis over de mate

van fos/aatgebrek 111 her water maakt het mogelijk om de ejjccieu van herstclmaatregelcn op de ont­

wikkeling van individuele (vtoplaiiktonsoorten te kunnen volgen. In 2003 is de methode opnieuw

toegepast 111 liet Loosdrechtse Plasseugebicd, 111 samenwerking met de Dienst Waterbeheer en

Riolering eu de Stichting Toegepast Onderzoek Waterbeheer.

Uitbundige fytoplanktongroei in het

oppervlaktewater zorgt voor verstoring van

ecosystemen, de drinkwatervoorziening en het

zwemplezier. De veelgebruikte methoden om

de waterkwaliteit te bepalen, zoals chemische

bepalingen van opgeloste en gesuspendeerde

stoffen en biologische tellingen van indicator­

organismen, geven wel informatie over de hui­

dige toestand van een meer, maar geven onvol­

doende inzicht in hoe de situatie verbeterd kan

worden. Ondanks jarenlange inspanningen

om de eutrofiëring van Nederlandse meren

terug te dringen, hebben de maatregelen in

veel gevallen nog niet het gewenste effect

gehad; veel meren worden nog steeds gedomi­

neerd door fytoplankton. Daarom is aanvul­

lend onderzoek nodig, dat de wisselwerking

tussen licht, nutriënten en fytoplankton in

beschouwing neemt. Fosfaat speelt daarbij een

sleutelrol. De vraag is wat nodig is om water te

laten omslaan van troebel naar helder en hoe

we zichtbaar kunnen maken hoe ver we nog

van het omslagpunt verwijderd zijn.

In vergelijking met de geëutrofiëerde toe­

stand worden de fytoplanktoncellen nabij het

omslagpunt naar een helder systeem geken­

merkt door fosfaatgelimiteerde groei en ver­

laagde vitaliteit. De mate waarin afzonderlijke

fytoplanktonpopulaties in hun groei gelimi­

teerd zijn door fosfaat, vormt dus een belang­

rijk kenmerk voor de voedingstoestand van een

meer. Dit kan het beste worden gemeten aan

de hand van de fysiologische kenmerken van

de fytoplanktoncellen zelf

Kennis over de mate waarin fosfaat

beschikbaar ofjuist beperkend voor het fyto­

plankton is, is voor waterbeheerders noodzake­

lijk om te bepalen welk pakket van maat­

regelen zij moeten nemen om algenbloei te

voorkomen. De in dit artikel beschreven

methode voor de bepaling van de fosfaatstatus

van fytoplankton kan dan een belangrijk in­

strument blijken te zijn.

Loosdrechtse Plassen De Loosdrechtse Plassen zijn representatief

voor veel Nederlandse laagveenwateren. Eutro­

fiëring van deze meren is het gevolg van lang­

durig verhoogde externe toevoer van fosfaat in

de twintigste eeuw. Door de grote hoeveelheid

kennis die is verzameld over dit gebied, dient

het als een modelsysteem voor de beoordeling

van het effect van reductie van fosfaattoevoer

in Nederlandse meren1'. Vanaf 1984 heeft de

provincie Utrecht maatregelen genomen om

de externe fosfaattoevoer te beperken. Deze

maatregelen zijn vanaf t997 voortgezet door

het hoogheemraadschap Amstel, Gooi en Vecht

(AGV), de huidige waterbeheerder.

Omdat de maatregelen nog niet het

gewenste resultaat hebben gehad, heeft AGV

samen met de Stuurgroep Loosdrechtse Plassen

een herstelplan ontwikkeld. Dit heeft als doel

om de oorspronkelijke helderheid van de plas-

Afo. 1: Flowcytometrische scheiding vanjytoplanktotiijroepen uit de Loosdrechtse Plassen (West-End, 02-09-2003).

A: Eukaryote algen (zowel groenalgen als diatomeeën); B: draadvormige cyanobactenen zonderjycoc/anine

(Prochlorothnx hollandica); C: Cyanobacteriën metjyeocyanine (voornamelijk de draadvormige Limnothnx

sp.); D: Detritus (dode cellen).

O 05 S O 3

è o S-H

O

U

640 log

Phycocyanine-fluorescentie

26 H 2 0 1.6-2004

P L A T F O R M

£ 200 E

<Z 150

;<Ë 100 0) o

ra •Q 50 o n I I DJH

13 14 15 19 20 24 26 30 31 34 36 38 40 42 45 47 48 50 51

Week

c 60 -

- 4 0 IS

ra 20 n o e ra >. O

B

aan n 13 14 15 19 20 24 26 30 31 34 36 38 40 42 45 47 48 50 51

Week

Afo. 2 : ELF-syjnaal in natuurlijke populaties van de voornaamste soorten cyanobacteriën in de Loosdrechtse Plassen, Limnothrix sp. (A) en Prochlorothrix hollandica (B). Deeltje,

met ELF-sujnaal zijn aangeven in blauw, deeltjes zonder ELF-s(gnaai indeel.

sen, te herstellen en de ophoping van bagger in

jachthavens en watergangen te beperken. De

gekozen aanpak is verminderen van de reste­

rende fosfaatbelasting en aanleg van plaatse­

lijke verdiepingen2'.

De Loosdrechtse Plassen zijn in een case­

study voor de implementatie van de Europese

Kaderrichtlijn Water getypeerd als sterk veran­

derde wateren. Maar er gaan ook stemmen op

om de ondiepe veenmeren als kunstmatige

wateren aan te wijzen. Ongeacht deze keuze

zullen voor ondiepe veenmeren normen

worden gedefinieerd die afgeleid zijn van ver­

gelijkbare natuurlijke watertypen. De ecologi­

sche ambitie die daarbij gekozen wordt, is

momenteel onderwerp van politieke discus­

sies. Hoe hoger deze ambitie, des te zwaarder

de opgave voor het waterbeheer. Vast staat dat

voor (veen)meren ook voor het fytoplankton

een norm moet worden opgesteld, die bereikt

moet zijn in 2015.

De belangrijkste indicatoren voor de actu­

ele conditie van een meer zijn chlorofylconcen-

tratie, doorzicht, totaal-fosfaatconcentratie en

fytoplanktonsamcnstelling. De huidige norm­

waarden voor deze indicatoren bestrijden ech­

ter de eutrofiëring niet3'. De concentratie chlo-

rofyl a in de Loosdrechtse Plassen is gedaald

van meer dan 100 ug/1 (de normwaarde voor

ondiepe meren in Nederland) in de periode

1982-1990 tot ongeveer 60-80 ug/1 in het afgelo­

pen decennium. Het doorzicht is rond 1995

toegenomen tot boven de normwaarde van

ongeveer 40 cm, maar ligt nog ver onder de

zwemwaternorm (één meter) en de ecologische

normdoelstelling (twee meter, wat overeen­

komt met doorzicht tot op de bodem). De

zomergemiddelde concentratie van totaal-fos­

faat in de Loosdrechtse Plassen is gedaald van

meer dan 100 (jg/1 in de periode 1982 -1990 tot

ongeveer 60 ug/1 in het afgelopen decennium.

Voor zwaar geëurrofiëcrde ondiepe meren met

cyanobacteriën-dominantie zal de ecologische

doelstelling, helder water, waarschijnlijk pas

gehaald worden bij een streefwaarde voor

totaal-fosfaat lager dan 50 ug/P'. Meringen van

concentraties opgelosr reactief fosfaar (DRP)

zouden meer inzicht moeten geven in de voe­

dingsstatus van een meer. Doordat bacteriën

en algen deze vorm van fosfaat echter snel

opnemen, is de concentratie zelfs in geëutro-

fiëerde meren vaak zeer laag. DRP-metingen in

de Loosdrechtse Plassen liggen sinds 1998 gro­

tendeels onder de detectiegrens van de

gebruikte fotometrische analyses (10 pg/1;

NEN-standaard 6663:1983). Deze metingen zijn

daarom niet bruikbaar als maat voor de voe­

dingsstatus met betrekking tot fosfaat.

De waargenomen lichte verbeteringen

hebben niet geleid tot een omslag naar de

gewenste ecologische toestand. Integendeel,

fytoplanktontellingen laten zien dat, naast een

sterke seizoensvariatie, het aantal draadvormi-

ge cyanobacteriën in de Loosdrechtse Plassen

(meer dan 90 procent van het fytoplankton in

dit meer) in de periode 1984-1993 licht is toe­

genomen en in de periode 1997-2003 stabiel is

gebleven4'. Dit wordt waarschijnlijk veroor­

zaakt door het vermogen dat cyanobacteriën

hebben om zich aan te passen aan zeer lage

fosfaatconcentraties en lage lichtintensiteit.

Fosfatase-activiteit indicator voor voedingsstatus

In een nutriëntenarm ecosysteem kan een

groot aantal soorten naast elkaar bestaan,

doordat er een lage maar constante stroom is

van stoffen en energie door het systeem. Sub­

tiele verschillen in omzetting- en opname­

capaciteiten zorgen ervoor dat sterk gelijkende

organismen hun eigen niche vinden. Fyto-

planktoncellen die te maken krijgen met een

(tijdelijk) verminderde beschikbaarheid van

nutriënten, zullen zich aanpassen om hun

groei te handhaven. Groenalgen en diato-

meeën zijn meestal dominant tijdens het

begin van het eutrofiëringsproces. Wanneer

een meer erg troebel geworden is, zijn cyano­

bacteriën in het voordeel, omdat ze door hun

pigmentsamenstelling beter met weinig licht

kunnen groeien. Bovendien kunnen cyanobac­

teriën efficiënt groeien bij zeer lage fosfaatcon­

centraties. Fosfatase-activiteit is een veelge­

bruikte indicator voor de mate van fosfaatlimi-

tatie in fytoplankton.

Het probleem met traditionele meetme­

thoden is dat onbekend is welke cellen de

activiteit veroorzaken; dit kunnen zelfs hetero-

trofe bacteriën zijn. Het nieuwe ELF-97-fosfa-

tasesubstraat (ELFP) vormt microkristallen op

de plek van de enzymatische activiteit. Hier­

mee kan de activiteit aan individuele cellen

worden toegewezen5'. Deze methode is breed

inzetbaar en is specifiek voor fosfaat.

In de toekomst willen het NIOO en de

Universiteit van Amsterdam meer fluorescente

kleuringen gaan gebruiken, bijvoorbeeld om

de opslag van fosfaat en de hoeveelheid DNA in

de cellen te bepalen. Verder wordt gebruik

gemaakt van de natuurlijke variabiliteit in het

voorkomen van de stabiele koolstofisotoop I3C

in de vetzuren van het fytoplankton. De ver­

houding waarin de meest voorkomende iso­

toop 12C en de zeldzame isotoop '3C worden

ingebouwd in de cel, is afhankelijk van cellu­

laire omzettingssnelheden. Omdat elke soort

een karakteristiek vetzuurprofiel heeft, kan de I2C/13C ratio van vetzuren worden gerelateerd

aan de groeisnelheid van specifieke fytoplank­

ton populaties6'. De combinatie van flowcyto-

metrie, fluorescente kleuring en isotopen-ratio

massaspectrometrie geeft een uniek inzicht in

de actuele voedingsstatus van afzonderlijke

fytoplanktonpopulaties.

Fosfaatstatus Loosdrechtse Plassen Meerdere soorten fytoplankton leven naast

elkaar in de Loosdrechtse Plassen. De groepen

kunnen, moeizaam, worden onderscheiden

met behulp van microscopie, en veel gemakke­

lijker en sneller met flowcytometrie. Door de

oranje fluorescentie van het voor cyanobacte­

riën karakterisrieke pigment fycocyanine uit te

zetten tegen de rode chlorofyl fluorescentie,

kan onderscheid gemaakt worden tussen

cyanobacteriën enerzijds en diatomeeën en

groenalgen anderzijds (afbeelding 1). De domi-

H 2 O ns-2004 27

P L A T F O R M

Groeisnelheid: 0.02

_ 200

150 -

0.36 0.40

:2 100

50

1 Week

Afo. j : ELF-signaal eiijjroeisuelheden in LimnotK-

rix-populaties uit de Loosdrechtse Plassen,

tijdens cjroci m een laboratorium enclosure.

Aan 130 LLoosdrecht water werd continue

medium met een overmaat fosfaat toecje-

voerjd. Deeltjes met ELF-sicjnaal zijn aange­

geven in blauw, deeltjes zouder ELF-sicjnaal

indeel. Groeisnelheden zijn bepaald uit de

relatieve incorporatie van de ' 'C isotoop in

vetzuren van de cellen.

nante draadvormige cyanobacteriën (meer dan

90 procent van het totale fytoplankton) lijken

sterk op elkaar. De in dit meer ontdekte soort

Prochlorothrix hollandico heeft een voor cyano­

bacteriën unieke pigmentsamenstelling en kan

daardoor worden onderscheiden van de meest

voorkomende soort Limnothrix sp. De ELF-97

kleuringstechniek is eerst getest op isolaten

van beide soorten. In sterk fosfaatgelimiteerde

batchculturen van Limnothrix sp.-isolaat MRi

was ongeveer de helft ELF-gckleurd, terwijl dit

in een fosfaatrijke cultuur maar bij enkele pro­

centen het geval was. Uit deze metingen blijkt

dat Limnothrix-cellen fosfatase-enzymen aan­

maken wanneer ze een gebrek hebben aan fos­

faat, in tegenstelling tot P. hollcmdica5'.

In 2001 is de ELF-methode voor het eerst

toegepast op veldmonsters uit de Loosdrechtse

Plassen (afbeelding 2). Hieruit blijkt dat in voor­

jaar en najaar ongeveer de helft van de Limno-

thrix-populatie het ELF-signaal had, vergelijk­

baar met een fosfaatgelimiteerde batchcultuur.

In de lente werd toen 130 liter water uit de

Loosdrechtse Plassen geïncubeerd onder conti­

nue toevoeging van medium met fosfaat in een

'Laboratory Scale Enclosure' (LSE). De verdun­

ningssnelheid (0,05 per dag) kwam overeen met

typische groeisnelheden van cyanobacteriën in

natuurlijke omstandigheden (0,02-0,10 per dag).

De groeisnelheid van de Limnotfirix-groep, die

aan het begin van het experiment met de kool-

stof-isotopenmethode gevonden is, bedroeg 0,02

per dag. Op de eerste dag van het experiment

had ongeveer 45 procent van de Limnothrix-dra-

den het ELF-signaal (afbeelding 3). Het aantal

nam sterk toe, terwijl het aantal met ELF-sig­

naal afnam tot 15 procent na één week en tot 5,5

procent na twee weken.

De meeste nieuw gevormde cellen hadden

dus geen ELF-signaal. De groeisnelheid

bedroeg respectievelijk 0,36 en 0,40 per dag,

veel hoger dan in veldmonsters gevonden was.

Deze resultaten bewijzen dat de groei van Lim­

nothrix sp. in de Loosdrechtse Plassen in de len­

te van 2001 sterk fosfaatgelimiteerd was en dat

de ELF-methode geschikt is om fosfaatlimita-

tie in deze soort aan te tonen. In de zomer, de

periode dat de Limuothrix-populatie een maxi­

mum bereikte, hadden echter veel minder cel­

len het ELF-signaal. Dit wijst op een verhoogde

beschikbaarheid van fosfaat, waardoor de

Prochlorothnx-populatie kon gaan groeien.

Deze resultaten laten duidelijk zien dat

men met de ELF-methode een genuanceerd

beeld kan krijgen van de fosfaatstatus van fyto-

planktonpopulaties in een meer, terwijl de

concentratie opgelost fosfaat nauwelijks meer

meetbaar is. De ELF-methode levert ook aan­

wijzingen op dat verschillen in aanpassing aan

fosfaat- en lichtbeperking een rol spelen de

competitie tussen Limnothrix en Prochlorothrix

in het meer. Dit is een interessant onderwerp

voor verdere studie.

Ondanks goede ervaringen in 2001 zijn in

2003 problemen bij de toepassing van de ELF-

kleuringsmethode ontstaan. Ten eerste bleek

uit tijdreeksen dat vertraging kan optreden in

het zichtbaar worden van het ELF-signaal. Ten

tweede veroorzaakte de excitatie met UV-licht,

zoals nodig voor de kleuringsmethode, een

heel hoog achtergrondsignaal bij gebruik van

het fixeermiddel glutaaraldehyde. Dit achter­

grondsignaal overlapte met het minder sterke

ELF-signaal, waardoor dit slecht meetbaar was.

Kleuring van ongefrxeerde monsters veroor­

zaakte samenklontering en breken van de fila­

menten. Dir probleem kan worden opgelost

door gebruik te maken van een speciale flowcy-

Om routinematig toegepast te kunnen

worden, moer de ELF-methode nog verder

getest, gekalibreerd en gevalideerd worden.

Hiertoe is een onderzoeksvoorstel ingediend

bij de Stichting Technische Wetenschappen. In

dit toekomstige project zal aandacht worden

besteed aan uitbreiding van de kennis over fos-

fatase-activiteit van fytoplanktonsoorten die

voorkomen in andere meren, ontwikkeling van

aanvullende fluorescente kleuringstechnieken

én experimenteel en theoretisch onderzoek

naar de competitie om organisch fosfaat. '

LITERATUUR

ij Gulati R. en E. van Donk (2002). Lakes m the Nether­

lands, their origins, eutrophication and restoration: state-

of-the-art review. Hydrobiol. nr. 478, pag. 71-106.

2) VoortJ., R. Koomans en). Hofstra f2003]. Slibbalans

Loosdrechtse Plassen. H : 0 nr. 21, pag. 13-15.

3) Van Liere L. en D. Jonkers (2002J. Watertypegerichre norm­

stelling voor nutriënten in oppervlaktewater. RIVM-rap-

port 703715005.

4) Digntmt M. (looj). Phosphate uptake proteins as markers

for the nuttient status of freshwater cyanobactetia. Acade­

misch proe/schri/r Universiteit van Amsterdam.

5] Dignum M.T H. Hoogveld, H. Matthijs, H. Laanbroek en

R. Pel f2004]. Detecting the phosphate status of phyto-

plankton by enzyme labelled fluorescence and flow cyto­

metry. FEMS Microbiol. Ecol. nr. 48, pag. 29-1&.

6) Pel R-, H. Hoogveld en V. Fions f2003]. Using the hidden

isotopic hetetogeneity in phyto- and zoöplankton to

unmask disparity in trophic carbon transfer. Limnol. Oee-

anogr. nr. 48, pag. 2200-2207.

7] Dubelaar G., P. Gerntzen, A. Beeker, R. Jonker en K. Tan-

gen [1999). Design andjirsr results of the CytoBuoy: A

witeless flow cytometer/or in situ analysis of marine and

fresh waters. Cytometry nr. 37, pag. 247-254.

» H 2 0 - id .2004