UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2011-2012

GERICHTE AFGIFTE VAN CHEMOTHERAPEUTICA DOOR MIDDEL VAN

MICROBUBBELS EN ECHOGRAFIE

door

Sandra DEBEVERE

Promotor: Prof. Dr. Niek Sanders Literatuurstudie in het kader

van de Masterproef

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2011-2012

GERICHTE AFGIFTE VAN CHEMOTHERAPEUTICA DOOR MIDDEL VAN

MICROBUBBELS EN ECHOGRAFIE

door

Sandra DEBEVERE

Promotor: Prof. Dr. Niek Sanders Literatuurstudie in het kader

van de Masterproef

De auteur en de promotor(en) geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen

voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met

betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie.

Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotor(en). Het auteursrecht

beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en

neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde

studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren.

De auteur en de promotor(en) zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in

deze studie geciteerd en beschreven zijn.

VOORWOORD

Deze literatuurstudie zou niet tot stand gekomen zijn zonder de hulp en steun van een aantal

mensen. Daarom wil ik hen dan ook in dit voorwoord bedanken.

In eerste instantie bedank ik mijn promotor, Prof. Sanders, voor de kans die ik gekregen heb om

een literatuurstudie te maken over het onderwerp dat ik zo graag wou en voor het nalezen van mijn

werk.

Ook wil ik Steven Cool bedanken voor de vele tijd die hij genomen heeft om mijn verschillende

versies te lezen en te verbeteren. Bovendien kon ik met al mijn vragen bij hem terecht. Zijn

opmerkingen en tips hebben me enorm geholpen!

Daarnaast wil ik ook mijn ouders bedanken omdat ik altijd bij hen terecht kon om wat stoom af

te laten wanneer het schrijven eens wat minder goed vooruit ging.

Natuurlijk mogen mijn broers ook niet vergeten worden! Zij waren altijd bereid om me te helpen

bij de praktische zaken. Zonder hen zou ik nog altijd blijven knoeien met de opmaak in Word en met

het automatisch invoegen van referenties. Ook dankzij hen kan ik nu zelf mijn figuren maken.

Bovendien wil ik hen nog bedanken voor het nalezen van mijn werk.

Tot slot mag ik Maria zeker niet vergeten! Ze was mijn grootste motivatie om deze

literatuurstudie te maken.

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING ...................................... .................................................................................... 1

INLEIDING .................................................................................................................................... 2

LITERATUURSTUDIE .................................. ................................................................................ 3

1. KANKER .......................................................................................................................... 3

2. CHEMOTHERAPEUTICA ............................................................................................... 4

3. ULTRASOUND ................................................................................................................ 6

3.1. Wat is ultrasound? ................................................................................................... 6

3.2. Medische toepassingen ........................................................................................... 8

4. MICROBUBBELS .......................................................................................................... 11

4.1. Wat zijn microbubbels?.......................................................................................... 11

4.2. Microbubbels en ultrasound................................................................................... 12

4.3. Bio-effecten van caviterende en imploderende microbubbels............................... 12

4.4. Medische toepassingen ......................................................................................... 13

5. MICROBUBBELS EN ULTRASOUND VOOR GENEESMIDDELENTOEDIENING ..... 15

5.1. Werkingsmechanisme ........................................................................................... 15

5.2. Farmacabeladen microbubbels: waarom? ............................................................ 15

5.3. Samenstelling van farmacabeladen microbubbels ................................................ 16

6. DOXORUBICINE ........................................................................................................... 19

6.1. Algemeen ............................................................................................................... 19

6.2. DOX-liposoom beladen microbubbels ................................................................... 19

BESPREKING ........................................ ..................................................................................... 22

REFERENTIELIJST ................................... ................................................................................. 23

SAMENVATTING

Kanker is een aandoening waarbij normale cellen getransformeerd zijn in kwaadaardige cellen.

Ze groeien zodanig snel en agressief dat ze door invasie in normale weefsels de dood van het individu

tot gevolg hebben. Om deze tumoren af te doden zijn er allerhande chemotherapeutica ontwikkeld

met verschillende werkingsmechanismen. Een belangrijk nadeel van de klassieke chemotherapie is

echter hun weinig specifieke werking. Hierdoor worden niet alleen de tumorcellen aangetast, maar ook

de gezonde weefsels.

Een nieuwe benadering in de kankertherapie is de systemische co-administratie van

microbubbels en medicatie gevolgd door lokale toepassing van ultrasound. Dit maakt het mogelijk om

geneesmiddelen beter in de cellen te brengen. Wanneer microbubbels blootgesteld worden aan

ultrasone geluidsgolven (ultrasound), ondergaan ze volumetrische oscillaties en bij hogere

intensiteiten kunnen ze imploderen. De hiermee gepaard gaande microstreams, shockwaves en

microjets zijn in staat om tijdelijke poriën te vormen ter hoogte van het celmembraan waardoor

geneesmiddelen gemakkelijker opgenomen kunnen worden. Aangezien deze fenomenen zich enkel

voordoen in de met ultrasound bestraalde zones, kan de toediening van geneesmiddelen selectief

gestuurd worden door enkel de zieke weefsels aan ultrasound bloot te stellen.

Een formulatie waarbij chemotherapeutica gebonden is aan microbubbels kan de neveneffecten

nog meer beperken. Enkel ter hoogte van de bestraalde zones wordt de medicatie vrijgesteld uit de

geneesmiddelbeladen microbubbels. Deze methode maakt het mogelijk om gelijktijdig een verhoogde

membraanpermeabiliteit en een hoge concentratie van het farmacon te bekomen ter hoogte van de te

behandelen weefsels. Dit maakt een dosisreductie van het geneesmiddel mogelijk. Een

veelbelovende formulatie die momenteel nog in zijn kinderschoenen staat is de “DOX-liposoom

beladen microbubbels”.

Summary

Cancer is a disease in which normal cells are transformed in malignant cells. They grow so fast

and aggressive that they result in death of the patient by invading normal tissues. There exist many

types of chemotherapeutics with different mechanisms to kill these tumors. An important disadvantage

of the traditional chemotherapy, however, is their low specific activity.

A new approach in cancer therapy is the systemic co-administration of medication and

microbubbles followed by local application of ultrasound. When microbubbles are exposed to

ultrasound, microstreams, shockwaves and microjets are formed. These forces can temporarily

permeabilize cell membranes and stimulate drug transport in the cell.

A formulation where chemotherapeutics are bound to microbubbles can further reduce the side

effects. These microbubbles can locally release its content and simultaneously increase drug uptake in

the ultrasound treated area. A promising formulation which is still in its infancy is "DOX-liposome

loaded microbubbles".

Key words: Chemotherapy – Drug delivery – Microbub bles – Targeted delivery – Ultrasound

2

INLEIDING

Kanker is één van de meest gevreesde ziektes in de moderne samenleving. Na

hartaandoeningen en infectieuze en parasitaire ziekten is het wereldwijd de derde belangrijkste

doodsoorzaak. Volgens de World Health Organization (WHO) is 13% van alle sterfgevallen in 2008 te

wijten aan kanker. Ook voor onze gezelschapsdieren is kanker een belangrijke ziekte die meer en

meer aan belang wint. Pfizer animal health schat dat één op de vier honden en één op de zes katten

in de loop van hun leven een tumor ontwikkelen (Pfizer animal health, 2012). Daarnaast overlijdt bijna

50% van alle honden ouder dan tien jaar ten gevolge van een kankergerelateerd probleem. Daarom

wordt zowel in de humane geneeskunde als in de diergeneeskundige zeer veel onderzoek verricht

naar de mechanismen van kanker en effectieve therapieën.

Een veelgebruikte behandeling van kanker, naast chirurgie en bestraling, is chemotherapie. Er

zijn reeds veel verschillende chemotherapeutica ontwikkeld, maar het belangrijkste nadeel van

klassieke chemotherapie is het feit dat het product systemisch toegediend wordt en zich zo over het

ganse lichaam verspreidt. Hierdoor worden niet alleen de tumorcellen aangetast, maar ook de

gezonde weefsels. Om dit ongewenst effect te vermijden, tracht men chemotherapeutica aan te

passen of te verpakken zodat ze pas op de gewenste plaats actief worden. Microbubbels en

liposomen zijn mogelijke opties om medicatie te incorporeren. Het cytotoxisch product kan op die

manier door middel van ultrasound gericht vrijgesteld worden ter hoogte van de tumor. Zodoende

kunnen lagere dosissen gegeven worden waardoor eventuele neveneffecten sterk verminderen. Veel

methodes om gericht chemotherapeutica af te geven zijn nog volop in ontwikkeling, maar kunnen een

grote doorbraak betekenen in de strijd tegen kanker.

3

LITERATUURSTUDIE

1. KANKER

Genetische fouten liggen aan de basis van het ontstaan van kanker. Hierbij zijn normale cellen

getransformeerd in kwaadaardige cellen welke ongecontroleerd groeien en bijgevolg kwaadaardige

gezwellen vormen. Deze “maligne tumoren” groeien, in tegenstelling tot goedaardige (“benigne”)

tumoren, zodanig snel en agressief dat ze door invasie in normale weefsels de dood van het individu

tot gevolg hebben (Chiers, 2010; G. I. Evan & Vousden, 2001).

Het proces van carcinogenese kan ingedeeld worden in 3 stappen: tumorinitiatie, tumorpromotie

en tumorprogressie (Chiers, 2010; Pitot, 1993). Tijdens de tumorinitiatie vindt er in een cel een

niet-lethale beschadiging plaats aan genen die de celproliferatie of apoptose controleren. Deze

schade wordt meestal veroorzaakt door inwerking van “noxen” (zoals U.V. stralen, gamma straling,

intercalerende reagentia, radicalen,…), maar kan soms ook erfelijk bepaald zijn. De belangrijkste

genen die aangetast worden omvatten de proto-oncogenen en tumorsuppressorgenen (Bertram,

2000; Chiers, 2010). Proto-oncogenen (zoals ras en yes) coderen voor proteïnes die de celgroei en

celdifferentiatie stimuleren. De expressie van deze genen staat echter onder strenge controle.

Wanneer deze controle wegvalt, leidt dit tot ongecontroleerde celproliferatie. Vanaf dan wordt er niet

meer van proto-oncogenen gesproken, maar van oncogenen. Tumorsuppressorgenen (zoals Rb en

TGF-β) coderen voor proteïnen die een remmende werking uitoefenen op de celproliferatie. Bij

genetische beschadiging kan hun normale werking onderdrukt worden. Tijdens de tumorpromotie

wordt de gewijzigde genetische code van de geïnitieerde cel tot expressie gebracht zodat de cel

autonoom en ongecontroleerd kan delen. Deze clonale expansie kan aanleiding geven tot het

ontstaan van nieuwe mutaties waarbij de subpopulaties nieuwe eigenschappen verwerven zoals

productie van angiogene groeifactoren, resistentie tegen anti-tumorale therapeutica, invasievermogen

en metastaseringsvermogen (Chiers, 2010). Deze maligne transformatie is de laatste stap en wordt

tumorprogressie genoemd.

Een tumoraal proces wordt als kwaadaardig beschouwd indien er zich zeven fundamentele

wijzigingen voordoen in de cellen (Chiers, 2010):

1) zelfvoorziening van groeisignalen

2) ongevoeligheid voor groei-inhiberende signalen

3) resistentie aan apoptose

4) ontsnappen aan de celsenescentie

5) defect in DNA herstel zodat door genetische instabiliteit nieuwe eigenschappen kunnen

verworven worden

6) ondersteunende vasculogenese/angiogenese voor aanbrengen van voedingsstoffen naar

de snelgroeiende tumor

7) invaserings- en metastaseringsvermogen wat kan leiden tot de dood van het individu

4

2. CHEMOTHERAPEUTICA

Chemotherapeutica kunnen volgens hun werkingsmechanisme in verschillende categorieën

worden onderverdeeld: alkylerende middelen, antimetabolieten, antitumorale antibiotica,

topo-isomerase inhibitoren, microtubulaire inhibitoren, monoklonale antilichamen en biologicals,

tyrosine kinase-ihibitoren en andere (BCFI, 2012). Vaak worden twee of meer geneesmiddelen met

een verschillende werking samen toegediend, waardoor de kans verhoogt dat kankercellen afgedood

worden. Bovendien kunnen de neveneffecten van de chemotherapie een stuk verminderd worden

aangezien een gecombineerde therapie lagere dosissen vereist dan wanneer slechts één product

gebruikt wordt. Een kort overzicht van de verschillende klassen chemotherapeutica wordt hieronder

gegeven (BCFI, 2012).

Alkylerende middelen. Alkylerende stoffen verstoren de celfunctie door het vormen van

covalente bindingen met amino-, carboxyl-, thiol- en fosfaatgroepen ter hoogte van verschillende

cellulaire componenten zoals DNA, RNA en proteïnes (Takimoto & Calvo, 2008). Alkylatie van DNA

leidt tot het stoppen van de celcyclus en apoptose (Siddik, 2002). Alkylerende stoffen zijn werkzaam

tijdens alle fasen van de celcyclus. Deze groep omvat onder andere de stikstofmosterd verbindingen

en platinumderivaten (Takimoto & Calvo, 2008).

Antimetabolieten. Antimetabolieten zijn structureel analoog met de bouwstenen die gebruikt

worden voor synthese van DNA en RNA. Op die manier kunnen ze als substituut geïncorporeerd

worden in DNA of RNA. De antimetabolieten zijn echter zo aangepast dat ze geen werking uitoefenen

waardoor celdeling en verdere DNA en RNA synthese tegengegaan wordt. Omwille van hun typisch

werkingsmechanisme zijn antimetabolieten het meest werkzaam tegen sneldelende cellen. Tot deze

groep behoren onder andere de foliumzuur-, purine- en pyrimidineanalogen (Takimoto & Calvo, 2008).

Antitumorale antibiotica. Sommige antibiotica zijn te toxisch om als antibacteriële

geneesmiddelen te worden gebruikt, maar hebben wel antitumorale eigenschappen. Een zeer gekend

antibioticum in de chemotherapie is bleomycine. Bleomycine is een glycopeptide die aanvankelijk

geïsoleerd werd uit Streptomyces species (J. Chen & Stubbe, 2005; Galm et al., 2005). Zijn werking

berust op de metaalion-afhankelijke oxidatieve verbreking van DNA en RNA in de aanwezigheid van

zuurstof (Galm et al., 2005). Andere belangrijke antibiotica in de kankerbestrijding zijn de

anthracyclines. Dit zijn producten van de schimmel Streptomyces percetus var caesius (Takimoto &

Calvo, 2008). Ze hebben verschillende werkingsmechanismen waaronder intercallatie tussen DNA

baseparen en inhibitie van topoisomerase type I of II (Takimoto & Calvo, 2008). Een belangrijk

voorbeeld van een anthracycline is doxorubicine (DOX) dat in hoofdstuk 6 verder besproken wordt.

Topo-isomerase inhibitoren. Topoisomerases zijn zeer belangrijke enzymen die zorgen voor

de relaxatie van supercoiled DNA waardoor transcriptie en translatie kan doorgaan (Pommier, 2009).

Inhibitie van deze enzymen voorkomt bijgevolg verdere celdeling. Voorbeelden van topo-isomerase

inhibitoren zijn doxorubicine, topotecan en etoposide.

5

Microtubulaire inhibitoren. Microtubuli vormen een belangrijk onderdeel van het cytoskelet.

Naast de celvorm zijn ze ook verantwoordelijk voor het intracellulair transport van vesikels,

mitochondria en andere componenten in de cel. Bovendien spelen ze een grote rol in de mitose wat

ze een belangrijk doelwit maakt voor chemotherapeutica. Microtubulaire inhibitoren kunnen op die

manier de celdeling blokkeren en apoptotische celdood induceren (Jordan & L. Wilson, 2004). Deze

groep van chemotherapeutica bevat de Vinca rosea-alkaloïden (waaronder vinblastine en vincristine)

en de taxanen, geïsoleerd uit Taxus-soorten (waaronder docetaxel en paclitaxel).

Chemotherapeutica gebaseerd op natuurlijke producte n. Talrijke stoffen met een

antitumorale activiteit kunnen geïsoleerd worden uit natuurlijke substanties zoals planten, fungi en

bacteriën (Takimoto & Calvo, 2008). Deze stoffen vormen de basis voor vele chemotherapeutica zoals

de antitumorale antibiotica waaronder de anthracyclines.

Monoklonale antilichamen en biologicals. Biologicals zijn geneesmiddelen bestaande uit

natuurlijke eiwitten. Een belangrijke groep zijn de monoklonale antilichamen. Deze antilichamen

herkennen bepaalde antigenen van tumorcellen waardoor het immuunsysteem geactiveerd wordt met

celdood als gevolg (Harris, 2004). Daarnaast binden ze ook aan receptoren van groeifactoren

waardoor groei van tumorcellen tegengegaan wordt (Harris, 2004). Verschillende agentia kunnen

gekoppeld worden aan de monoklonale antilichamen zoals radio-isotopen, toxines, enzymen of

cytotoxische farmaca (Harris, 2004). Hierdoor worden hoge concentraties aan cytotoxische agentia

bereikt ter hoogte van de tumor met minimale neveneffecten ter hoogte van gezonde weefsels.

Tyrosine kinase-inhibitoren. Tyrosine kinase speelt een belangrijke rol in de transductie van

extracellulaire signalen. Hierbij worden intracellulaire cascadereacties in gang gezet die de activiteit

van de cel, waaronder celdeling, reguleren. Continue activatie van tyrosine kinase leidt tot

ongecontroleerde celgroei (Arora & Scholar, 2005). Tyrosine kinase-inhibitoren (TKI) worden gebruikt

om deze overactivatie te onderdrukken. Voorbeelden van dergelijke chemotherapeutica zijn dasatinib,

imatinib, nilotinib en masitinib. Masitinib, de eerste TKI voor veterinair gebruik, is commercieel

beschikbaar onder de merknaam Masivet® voor de behandeling van mastceltumoren bij honden.

Diverse anti-tumorale middelen. Deze restgroep omvat onder andere L-asparaginase en

Bacillus Calmette-Guérin (BCG).

6

3. ULTRASOUND

3.1. WAT IS ULTRASOUND?

Ultrasound is geluid met een frequentie hoger dan 20 000 cycli per seconde (20 kHz) (Boon,

2011). Deze zijn voor het menselijk oor niet waarneembaar. Net als gewone geluidsgolven bestaat

ultrasound uit opeenvolgende golven van hoge en lage druk. Wanneer de geluidsgolf doorheen een

medium gestuurd wordt, zullen de moleculen in dit medium bijgevolg afwisselend compressie en

rarefactie ondergaan. Hierdoor ontstaan er zones met hogere en lagere densiteit (Leighton, 2007)

(Fig. 1).

Fig. 1: Schematische voorstelling van een geluidsgolf met een constante frequentie en zijn effect op

het medium. 1) Weergave van een geluidsgolf in functie van de tijd met amplitude (A) en golflengte

(λ). 2) Verschuiving van de moleculen van het medium waardoor de geluidsgolf gestuurd wordt. 3)

Afwisselende rarefactie en compressie van het medium. (naar Leighton, 2007)

Net zoals een gewone geluidsgolf wordt ultrasound gekarakteriseerd door een frequentie (f in

Hz), een golflengte (λ in m), een periode (T in s), een amplitude (A in Pa) en een geluidssnelheid (v in

m/s). De geluidssnelheid hangt af van de compressiemodulus en de dichtheid van het medium waarin

het geluid zich verplaatst. Dit verband wordt weergegeven in de volgende vergelijking (Formule 1).

v = �κ

ρ Formule 1

waarin v: snelheid (m/s)

κ: compressiemodulus (Pa)

ρ: dichtheid (kg/m³)

7

Hoe groter de compressiemodulus of stijfheid van het medium, hoe sneller het geluid zich zal

voortbewegen. De snelheid blijft constant in een homogene materie en is bovendien onafhankelijk van

de frequentie van de geluidsgolf. Onderstaande tabel (Tabel 1) geeft geluidssnelheden weer in

verschillende weefsels van het lichaam. De gemiddelde geluidssnelheid in weke weefsels bedraagt

1.540 meter per seconde (Boon, 2011).

Weefsel Snelheid (m/s)

Lucht 330

Vet 1.440

Hersenen 1.510

Lever 1.560

Nier 1.560

Spier 1.570

Bloed 1.570

Bot 4.080

Tabel 1. Geluidssnelheid in lucht en verschillende weefsels van het lichaam (Boon, 2011)

Wanneer ultrasound zich doorheen een medium voortbeweegt, wordt de intensiteit afgezwakt

door reflectie, refractie en absorptie. Dit energieverlies wordt attenuatie genoemd. Reflectie en

refractie treden op ter hoogte van de overgang tussen weefsels met verschillende akoestische

impedantie (Fig. 2). Akoestische impedantie is de weerstand die een geluidsgolf ondervindt bij

doorgang door een bepaald medium (Boon, 2011). Hoe groter het verschil in akoestische impedantie,

hoe meer reflectie. De relatie tussen de akoestische impedantie, de densiteit van het medium en de

geluidssnelheid wordt weergegeven in volgende vergelijking (Formule 2) (Hong et al., 2011).

Z = ρ.v Formule 2

waarin Z: akoestische impedantie

ρ: densiteit van het medium

v: geluidssnelheid

Het niet gereflecteerde gedeelte wordt ter hoogte van de grens tussen beide media een andere

richting uitgestuurd (refractie). De relatie tussen de brekingsindex van beide media, de intredehoek en

uittredehoek wordt bepaald door de wet van Snellius (Formule 3) (Shelby, Smith, & Schultz, 2001):

n1.sinθ1 = n2.sinθ2 Formule 3

waarin n: brekingsindex van medium 1 respectievelijk medium 2

θ1: intredehoek

θ2: uittredehoek

8

Hier geldt echter: hoe groter het verschil in akoestische impedantie, hoe minder refractie.

Geabsorbeerde energie van ultrasound laat de moleculen in het medium sneller bewegen wat

resulteert in warmte (Boon, 2011).

Fig. 2: Reflectie en refractie van geluid ter hoogte van grensvlakken van verschillende media (naar

Boon, 2011).

3.2. MEDISCHE TOEPASSINGEN

Ultrasound wordt zowel voor diagnostische als therapeutische doeleinden gebruikt. Bij lage

frequentie en intensiteit kan ultrasound gunstige en reversibele cellulaire effecten teweegbrengen. Bij

hoge intensiteit daarentegen kan onmiddellijke celdood verkregen worden. Therapeutische ultrasound

kan bijgevolg ingedeeld worden in “laag energetisch ultrasound” en “hoog energetisch ultrasound” (ter

Haar, 2007). Laag energetisch ultrasound wordt o.a. gebruikt in echografie, fysiotherapie,

fractuurheling, sonoforese en sonodynamische therapie. Hoog energetisch ultrasound wordt vaak

gefocusseerd en dan spreekt men van High Intensity Focused Ultrasound (HIFU). HIFU wordt

momenteel klinisch gebruikt voor de behandeling van uterusmyomen.

Echografie. Bij deze beeldvormingstechniek wordt gebruikgemaakt van een transducer die

ultrasone geluiden uitstuurt met een constante golflengte. Er wordt gebruikgemaakt van een gel

tussen de probe en het weefsel zodat er geen lucht tussen zit die de ultrasoundgolven kan

weerkaatsen (Boon, 2011). De ultrasone geluiden die doorheen de weefsels gestuurd worden, worden

deels gereflecteerd ter hoogte van de overgangen van weefseltype naar weefseltype. Hoe groter het

verschil in akoestische impedantie tussen twee weefsels, hoe groter de intensiteit van de

gereflecteerde golf. De terugkerende echo’s worden vervolgens opnieuw opgevangen door de

transducer en omgezet in een elektrisch signaal. Zowel de intensiteit van de teruggekeerde

geluidsgolf als de tijd tussen het uitsturen van de ultrasone golf en het opvangen van de echo worden

geregistreerd en daarna omgevormd tot een beeld.

Fysiotherapie. Ultrasound in de fysiotherapie wordt voornamelijk aangewend voor de

behandeling van beschadigde weefsels, voor snellere wondheling, vermindering van oedeemvorming

9

en verbeteren van de stevigheid en elasticiteit van littekenweefsel (ter Haar, 2007). Hoewel in vitro en

in vivo studies erop wijzen dat ultrasound milde inflammatie, weefselherstel en wondheling stimuleert,

zijn er nog geen afdoende bewijzen dat ultrasound een belangrijke bijdrage zou kunnen leveren in de

fysiotherapie. (Speed, 2001)

Fractuurheling. Botheling is een complex proces die volgende stadia omvat: inflammatie,

proliferatie (met angiogenese, zachte en harde callusvorming) en remodellering van het bot.

Ultrasound zou dit helingsproces versnellen door stimulatie van de inflammatie, angiogenese,

chondrogenese, kraakbeenhypertrofie en osteogenese (Rubin, Bolander, Ryaby, & Hadjiargyrou,

2001). Over de resultaten van deze theorie wordt echter nog steeds hevig gedebatteerd. Ondanks het

gebrek aan effectieve bewijzen dat ultrasound botheling stimuleert, wordt het reeds in de praktijk

toegepast voor fractuurheling.

Sonoforese. Ultrasound met lage frequentie kan gebruikt worden om een betere penetratie

doorheen de huid te verkrijgen van een topicaal aangebracht geneesmiddel. De permeabiliteit van de

huid wordt gelimiteerd door het stratum corneum die bestaat uit gekeratiniseerde epitheelcellen die

ingebed liggen in een extracellulaire lipidenmatrix (Alvarez-Román, Merino, Kalia, Naik, & Guy, 2003).

Door gebruik van ultrasound kan deze barrière doorbroken worden. Er wordt naar voor geschoven dat

cavitatie hierin een hoofdrol zou spelen (Alvarez-Román et al., 2003). Onder cavitatie verstaat men de

vorming en oscillatie van gasbelletjes in een vloeibaar medium met eventuele implosie van deze

gasbelletjes onder invloed van ultrasound. Dit fenomeen leidt tot verstoring van de lipidenmatrix en

vorming van waterkanaaltjes in de huid zodat medicatie de huid beter kan binnendringen (Pahade,

Jadhav, & Kadam, 2010). Het is echter niet bewezen dat cavitatie het hoofdmechanisme is bij

sonoforese. Ook zeer lokale temperatuursverhogingen zouden een belangrijke rol kunnen spelen

(Sarheed & Abdul Rasool, 2011).

Sonodynamische therapie (SDT). Sensu stricto staat sonodynamische therapie voor de lokale

activatie van geluidsgevoelige stoffen (sonosensitizers) door middel van ultrasound aangewend bij

kankertherapie (Kuroki, Hachimine, Abe, & Shibaguchi, 2007; Yumita, Okuyama, Sasaki, & Umemura,

2004). De sonosensitizers zelf hebben minder antitumorale activiteit en zijn slechts zeer licht toxisch.

Hun cytotoxiciteit kan dus lokaal ter hoogte van de tumor door ultrasound opgewekt worden zodat

neveneffecten op de rest van het lichaam minimaal blijven. Voor de precieze werking bestaan er

echter verschillende theorieën. Sommige wetenschappers beweren dat sonosensitizers het

celmembraan verstoren waardoor de ultrasoundeffecten de cel gemakkelijker kunnen afdoden

(Hiraoka, Honda, Feril, Kudo, & Kondo, 2006). Anderen stellen dat de geluidsgevoelige stoffen onder

invloed van ultrasound vrije zuurstofradicalen vormen die het kankerweefsel vernietigen (Tachibana,

Feril, & Ikeda-Dantsuji, 2008). Er wordt vooropgesteld dat hierin verschillende reactieve

zuurstofverbindingen (reactive oxygen species of ROS) betrokken zijn (J.-hua Li, Song, Xu, Huang, &

Yue, 2008). Andere wetenschappers zijn echter van mening dat vooral de vorming van singlet oxygen

belangrijk is (Kuroki et al., 2007) of dat sonosensitizers eerst worden omgezet tot koolstofradicalen

10

welke reageren met zuurstof om vervolgens ROS te vormen (Misík & Riesz, 2006). Ook over de

activering van de sonosensitizers bestaat discussie. Zo zijn bepaalde wetenschappers ervan overtuigd

dat sonoluminescentie (de vorming van licht bij cavitatie) ook sonodynamische reacties op gang kan

brengen (Kuroki et al., 2007; Tachibana et al., 2008). Waarschijnlijk is het werkelijke mechanisme een

combinatie van de verschillende theorieën. In brede zin wordt sonodynamische therapie vaak gebruikt

om alle niet-thermische toepassingen van therapeutische ultrasound te beschrijven (Tachibana et al.,

2008). Hierbij hoort onder andere gerichte afgifte van farmaca.

High Intensity Focused Ultrasound (HIFU). High intensity focused ultrasound is een nieuwe

niet-invasieve techniek die coagulatienecrose kan veroorzaken in een welomschreven gebied in het

lichaam (ter Haar, 2007). De hoofdmechanismen van weefselbeschadiging door HIFU-ablatie

omvatten hitte en cavitatie. Ultrasound met hoge intensiteit wordt gefocust op een klein gebied

waardoor de temperatuur, via de geïnduceerde cavitatie, stijgt tot boven 56°C (de minimale

temperatuur voor irreversibele celschade) in één seconde (Chen-xi, Rong-hui, & Chang-sheng, 2010).

Desondanks worden de bovenliggende en aangrenzende weefsels niet aangetast.

Lithotripsie. Lithotripsie is de enige niet-invasieve methode om nier- en galstenen uit het

lichaam te verwijderen (Lingeman, Mcateer, Gnessin, & A. P. Evan, 2009). Extracorporale shockwave

lithotripsie (ESWL) maakt gebruik van hoog energetische geluidsgolven die gefocust worden op de

stenen. Wanneer de shockwave de steen bereikt, wordt door het verschil in akoestische impedantie

schuif- en trekkrachten gegenereerd wat resulteert in erosie van het oppervlak (Auge & Preminger,

2002; Pemberton, 1987). Finaal leidt dit tot reductie van de steen in kleine fragmentjes die spontaan

door het lichaam kunnen verwijderd worden.

Gerichte afgifte van farmaca. Medicatie geïncorporeerd in carriers zoals liposomen, micellen

of microbubbels kan door middel van ultrasound gericht afgegeven worden in het lichaam (Geers et

al., 2011; Husseini & Pitt, 2009; Lentacker, 2009). Naast de vrijstelling van het farmacon uit de carrier

zorgt ultrasound ook voor de verstoring van celmembranen door vorming van tijdelijke microporiën

zodat er een hogere opname kan plaatsvinden (Husseini & Pitt, 2009). Er is een synergetisch effect

waargenomen tussen de farmacologische activiteit van bepaalde farmaca en ultrasound zodat er

minder hoge dosissen moeten aangewend worden (Husseini & Pitt, 2009).

11

4. MICROBUBBELS

4.1. WAT ZIJN MICROBUBBELS?

Microbubbels zijn microscopisch kleine gasbelletjes gestabiliseerd door een dun omhulsel. De

diameter is variabel, maar bedraagt meestal 3 à 5 µm wat net iets kleiner is dan de diameter van een

rode bloedcel (Fig. 3) (S. R. Wilson & Burns, 2010). Toch zijn deze bubbels groot genoeg zodat ze na

intraveneuze injectie niet extravaseren. Eliminatie gebeurt door opsonisatie van het omhulsel en de

daarop volgende klaring in de lever waarna het gasvormig gedeelte via de long uitgeademd wordt

(Hernot & Klibanov, 2009; Ohlerth & R. T. O’Brien, 2007; Quaia, 2007).

Fig. 3 Microscopisch beeld en 3D-voorstelling van microbubbels. Het microscopisch beeld (A) toont de

verhouding van de iets kleinere microbubbel (pijl) ten opzichte van de rode bloedcel (pijlpunt). De

microbubbel bestaat uit een gasvormige kern omgeven door een omhulsel (B). (Naar Wilson & Burns,

2010 en Lentacker, 2009)

Kern. Eerste generatie contraststoffen waren gevuld met lucht. Lucht is echter sterk

wateroplosbaar zodat de microbubbels snel uit de bloedbaan verdwenen. Daarom werden tweede

generatie contraststoffen ontwikkeld die inerte gassen bevatten met een hoog moleculair gewicht

zoals perfluorocarbonen (CnFn+2) of zwavelhexafluoride (SF6) (Hernot & Klibanov, 2009; Kiessling,

Gaetjens, & Palmowski, 2011; Skyba & Kaul, 2000). Deze gassen zijn weinig wateroplosbaar en hun

chemische halfwaardetijd wordt bepaald door de lengte van hun koolstofketen (Skyba & Kaul, 2000).

Dit resulteert in een aanzienlijke verlenging van de circulatietijd: de eerste generatie contraststoffen

verblijven slechts enkele seconden in de circulatie, terwijl perfluorocarbon gevulde microbubbels een

halfwaardetijd van meer dan 15 minuten hebben (Tinkov, Bekeredjian, Winter, & Coester, 2009).

Omhulsel. Ultrasound contraststoffen kunnen ingedeeld worden volgens hun omhulselrigiditeit.

“Soft-shelled” microbubbels hebben ofwel geen coating ofwel hebben ze een dunne monolaag van

surfactant moleculen zoals palmitinezuur of fosfolipiden. Deze microbubbels zijn gevoelig aan

drukveranderingen (Kiessling et al., 2011). “Hard-shelled” microbubbels hebben daarentegen een

rigidere coating die gevormd wordt door polymeren of gedenaturiseerde albumine (Kiessling et al.,

2011). Hun verhoogde stabiliteit gaat echter gepaard met een verminderd cavitatievermogen. Het

omhulsel verhindert coalescentie en oplossing van het gas in het bloed (Hernot & Klibanov, 2009).

Een goede coating zorgt bijgevolg voor een betere stabiliteit en langere levensduur. PEGylatie van het

oppervlak van de microbubbels kan de halfwaardetijd nog extra verlengen (Immordino, Dosio, &

12

Cattel, 2006). PEG zorgt namelijk voor een sterk verminderde opname van de bubbels door het

mononucleair fagocyterend systeem. Bovendien gaat het aggregatie tegen.

4.2. MICROBUBBELS EN ULTRASOUND

Omdat gassen goed samendrukbaar zijn, worden microbubbels sterk beïnvloed door de

drukverschillen die gepaard gaan met ultrasound. Hun gedrag zal afhangen van de druk waaraan ze

blootgesteld worden.

Bij lage akoestische druk ondergaat de microbubbel volumetrische oscillaties in functie van de

lokale drukverandering (ter Haar, 2009; Hernot & Klibanov, 2009). Tijdens de compressiefase heerst

er een positieve akoestische druk zodat de bubbel verkleint. De rarefactiefase daarentegen is

gekenmerkt door een negatieve akoestische druk waarbij de microbubbel uitzet. Het opeenvolgend

verkleinen en uitzetten van microbubbels wordt stabiele cavitatie genoemd (Fig. 4 A).

Wanneer de ultrasound intensiteit verhoogd wordt, worden de oscillaties sterk asymmetrisch

(ter Haar, 2009). Dit is te wijten aan het feit dat de bubbel meer resistent is tegen compressie dan

tegen expansie (Hernot & Klibanov, 2009). De bubbel wordt op een gegeven moment zodanig groot

dat hij de opeenvolgende drukverschillen niet meer kan volgen. Dit leidt tot een situatie waarin de

bubbel nog wil uitzetten terwijl de omgevende vloeistof deze reeds in elkaar perst. Hierdoor klapt de

microbubbel in elkaar met fragmentatie in vele kleine bubbels tot gevolg (Fig. 4 B). Dit verschijnsel

wordt aangeduid als inertiële cavitatie.

str

aa

l va

n d

e

mic

rob

ub

be

la

ko

estisch

e

dru

k

Fig. 4 Schematische voorstelling van microbubbels blootgesteld aan ultrasound. Matige akoestische

druk veroorzaakt een stabiele cavitatie (A). Hoge ultrasound intensiteit veroorzaakt inertiële cavitatie

met implosie tot gevolg (B). (naar Quaia, 2007)

4.3. BIO-EFFECTEN VAN CAVITERENDE EN IMPLODERENDE MICROBUBBELS

Stabiele oscillaties veroorzaken snel bewegende vloeistofstromen rond het oppervlak van de

microbubbels. Deze “microstreams” kunnen tijdelijke mechanische schade veroorzaken ter hoogte van

nabijliggende celmembranen wat kan resulteren in de vorming van microporiën (Fig. 5) (Kelley, 2008;

Richardson, Pitt, & Woodbury, 2007).

13

Wanneer bij de inertiële cavitatie microbubbels imploderen, worden shockwaves gevormd in de

omringende vloeistof. De implosie van de microbubbel begint meestal ter hoogte van het zwakste punt

van de shell. Hierdoor is de implosie asymmetrisch en wordt aan deze zijde een krachtige

vloeistofstraal (microjet) gecreëerd. Wanneer de implosie nabij een grensoppervlak plaatsvindt,

gebeurt deze eveneens asymmetrisch zodat een microjet naar dit oppervlak gestuurd wordt (Stride,

2009; Tezel & Mitragotri, 2003). Shockwaves en microjets zijn zeer krachtig waardoor celmembranen

en zelfs bloedvaten tijdelijk geperforeerd kunnen worden (Hynynen, 2008; Qin, 2009) (Fig. 5).

B

A

C

E

D

endotheel

ultrasound

Fig. 5 Bio-effecten ter hoogte van endotheel veroorzaakt door caviterende en imploderende

microbubbels. Een stabiel caviterende microbubbel (A) genereert microstreams (B). Een imploderende

microbubbel vormt shockwaves (C) of vloeistofstralen (D). Deze effecten zorgen voor een verhoogde

permeabiliteit en beschadiging van het endotheel (E). (naar Kelley, 2008)

Hoogstwaarschijnlijk zorgen zowel mechanische, chemische als thermische effecten voor de

vorming van poriën in membranen. Naargelang de intensiteit van de ultrasound en het type

microbubbel zal het ene bio-effect een grotere rol spelen dan het andere (Juffermans, Dijkmans,

Musters, Visser, & Kamp, 2006).

4.4. MEDISCHE TOEPASSINGEN

Microbubbels werden oorspronkelijk ontwikkeld als contraststof voor echografie. Naast hun

diagnostische waarde hebben microbubbels meer en meer aan belang gewonnen als een veelzijdig

middel voor therapeutische doeleinden. Sonothrombolyse is hierbij een belangrijke toepassing.

Reversibele doorbreking van de bloed-hersenbarrière door middel van ultrasound is ook een

veelbesproken therapie, maar er zijn nog geen afdoende bewijzen voor zijn werking. Deze

behandeling is echter nog in zijn experimentele fase. Gerichte afgifte van geneesmiddelen door

middel van microbubbels wordt besproken in het volgende hoofdstuk.

Contrastversterkende echografie. Ultrasound contraststoffen worden intraveneus

geïnjecteerd. Dankzij het grote verschil in akoestische impedantie tussen het gas van de microbubbels

14

en het omringende bloed treedt er een sterke reflectie op van de ultrasoundgolven. Zo verkrijgt men

beelden met een beter contrast. Aangezien de meeste contraststoffen niet doorheen het endotheel

diffunderen, blijft hun gebruik beperkt tot het in beeld brengen van het cardiovasculair systeem

(Ohlerth & R. T. O’Brien, 2007; Schutt, Klein, Mattrey, & Riess, 2003). In de diergeneeskunde wordt

contrastversterkende echografie niet routinematig gebruikt zoals in de humane geneeskunde omwille

van de kostprijs. Toch zijn er interessante gevallen waar dit evenwel aan te raden is. Voorbeelden

hiervan zijn onder andere: detectie en prognose van oppervlakkige tumoren, detectie van metastasen

ter hoogte van de lever (vaak bij oudere honden), bepaling van avasculaire gebieden in massa’s als

hulp bij biopsiename en het in beeld brengen van infarcten of ischemie ter hoogte van een orgaan

(Ohlerth & R. T. O’Brien, 2007).

Sonothrombolyse. Ultrasound kan gebruikt worden voor het oplossen van intra-arteriële

thrombi. Intraveneuze toediening van microbubbels (met of zonder fibrinolytische agentia) versterkt

het thrombolytisch effect van ultrasound (Hernot & Klibanov, 2009). Dit is te verklaren door het feit dat

microbubbels de energiedrempel voor cavitatie verlagen. Cavitatie veroorzaakt microstreams en

microjets die op hun beurt de bloedklonter kunnen afbreken. Het fibrinenetwerk wordt aangetast zodat

fibrinolytische agentia gemakkelijker in de klonter kunnen geraken en thrombolytische enzymen beter

hun werk kunnen verrichten. Bovendien gaat de vlottere afbraak van de thrombus niet gepaard met

vrijstelling van grote hoeveelheden potentieel gevaarlijke klonterfragmenten wat eventueel wel kan

gebeuren bij andere therapieën.

Doorbreking van de bloed-hersenbarrière. De bloed-hersenbarrière limiteert de doorgang

van de meeste moleculen vanuit de bloedbaan naar het hersenparenchym. Meer dan 95% van de

potentieel therapeutische moleculen worden hierdoor tegengehouden wat hun gebruik in de

behandeling of diagnose ter hoogte van het centraal zenuwstelsel uitsluit (Hynynen, 2008).

Transcraniale aanwending van ultrasound in combinatie met intraveneuze toediening van

microbubbels zou tot op heden de enige methode zijn om reversibele doorbreking van de bloed-

hersenbarrière te veroorzaken zonder schade aan te brengen aan het hersenparenchym (Hynynen,

2008). Het exacte mechanisme is nog niet helemaal opgehelderd, maar cavitatie van de microbubbels

met de hiermee gepaarde microstreams, shockwaves en microjets zouden een grote rol spelen in de

vorming van tijdelijke openingen. Drie hoofdmechanismen van geneesmiddelentransport doorheen de

bloed-hersenbarrière werden hierbij geïdentificeerd. Als eerste werd microruptuur van

hersencapillairen geassocieerd met extravasatie van rode bloedcellen. Daarnaast werd lekkage

doorheen schijnbaar intact endotheel waargenomen veroorzaakt door het openen van de tight

junctions. Als laatste werd transport via vacuoles doorheen de endotheliale cellen vastgesteld

(Hynynen, 2008; Mayer, Geis, Katus, & Bekeredjian, 2008).

15

5. MICROBUBBELS EN ULTRASOUND VOOR GENEESMIDDELENTOEDI ENING

5.1. WERKINGSMECHANISME

Zoals eerder vermeld, kunnen microbubbels onder invloed van ultrasound stabiele of inertiële

cavitatie ondergaan. Terwijl stabiele oscillaties weinig agressieve microstreams vormen, kan inertiële

cavitatie aanleiding geven tot veel krachtigere shockwaves en microjets. Deze fenomenen zijn in staat

om poriën te vormen ter hoogte van celmembranen. Dit wordt sonoporatie genoemd. Deze perforaties

zijn tijdelijk en hebben een diameter van 30 tot 100 nm tot zelfs enkele micrometers (Tinkov et al.,

2009). Binnen enkele seconden tot minuten worden de poriën actief hersteld door middel van

intracellulaire vesikels met behulp van Ca2+ en ATP (Schlicher et al., 2006; Tinkov et al., 2009).

Doorheen het defect in het celmembraan vindt er namelijk een calcium-influx plaats wat lysosomen in

de buurt van het defect aanzet om samen te smelten en te fusioneren met het beschadigd

celmembraan (Yang et al., 2008).

De tijdelijke beschadiging van het celmembraan zorgt voor een verhoogde

membraanpermeabiliteit zodat er gemakkelijker transport van extracellulaire componenten zoals

proteïnes, plasmiden, siRNA, DNA en celimpermeabele geneesmiddelen naar het cytosol plaatsvindt.

Daarnaast kunnen microjets en shockwaves het endotheel beschadigen waardoor de extravasatie

gepromoot wordt (Tinkov et al., 2009). Bijgevolg kunnen microbubbels en ultrasound de intracellulaire

opname en extravasatie van geneesmiddelen stimuleren.

5.2. FARMACABELADEN MICROBUBBELS: WAAROM?

Systemische co-administratie van microbubbels en medicatie gevolgd door lokale toepassing

van ultrasound geeft goede resultaten, maar de effecten blijven gelimiteerd tot de onmiddellijke

nabijheid van de microbubbels (Hernot & Klibanov, 2009). Bovendien is er ook een tijdsgebonden

beperking: beschadiging aan het celmembraan ten gevolge van caviterende en imploderende

microbubbels is slechts van korte duur. Om deze redenen is het veel voordeliger om het

geneesmiddel te binden aan microbubbels.

Farmacabeladen microbubbels is in vele opzichten interessant. Vooreerst wordt de medicatie

onder invloed van de ultrasone golven lokaal vrijgesteld zodat de concentratie ter hoogte van de te

behandelen weefsels hoog is en de systemische neveneffecten tot het minimum beperkt blijven. Zoals

in sectie 5.1 besproken, zorgt de implosie van de microbubbels ook voor een verhoogde opname ter

hoogte van de behandelde weefsels. Bovendien kan cavitatie met de daarmee gepaard gaande

microstreams en shockwaves een ballistisch effect teweegbrengen zodat het farmacon gemakkelijker

doorheen beschadigde celmembranen geloodst wordt (Laing & McPherson, 2009; Unger et al., 2002).

Overigens kan binding aan microbubbels de medicatie beschermen tegen degradatie en metabolisatie

(Laing & McPherson, 2009). Een laatste belangrijk voordeel is dat de afgifte van het geneesmiddel

gevisualiseerd kan worden met ultrasound aangezien de drugcarrier zelf een contraststof is. Het is

duidelijk dat farmacabeladen microbubbels kunnen zorgen voor een dosisreductie van het farmacon

zodat ook de toxische neveneffecten beperkt blijven wat zeker belangrijk is voor medicatie met een

nauwe therapeutisch-toxische marge.

16

5.3. SAMENSTELLING VAN FARMACABELADEN MICROBUBBELS

Er zijn verschillende manieren om medicatie te binden aan microbubbels. Zoals weergegeven in

onderstaande figuur (Fig. 6) kan het farmacon geïncorporeerd worden in de kern (a), of het omhulsel

van de microbubbel (b), of het kan aangebracht worden aan het oppervlak van de microbubbel (c en

d) (Dijkmans et al., 2004; Unger et al., 2004).

Fig. 6 Schematische weergave van de verschillende mogelijke manieren om microbubbels met

farmaca te beladen. (a1): incorporatie van hydrofobe farmaca in de gasvormige kern; (a2): incorporatie

van hydrofobe moleculen in een inwendige olielaag; (b): incorporatie in het omhulsel van de bubbel;

(c): binding aan het omhulsel; (d): farmacabeladen nanopartikels gekoppeld aan de microbubbel.

Farmaca geïncorporeerd in de kern van de microbubbe l. Deze methode heeft als voordeel

dat de medicatie volledig beschermd wordt door het omhulsel van de microbubbel. Bovendien is de

kans op voortijdige vrijstelling van het farmacon, d.w.z. vooraleer ultrasound aangewend wordt, kleiner

(Lentacker, 2009).

Een voorbeeld hiervan zijn akoestisch actieve liposferen (AALs). Dit zijn microbubbels die een

olielaag bevatten tussen hun omhulsel en gasvormige kern. Dankzij deze laag kunnen sterk hydrofobe

moleculen zoals paclitaxel aan hoge concentraties door de microbubbels vervoerd worden (Kooiman

et al., 2009; Shortencarier et al., 2004; Tinkov et al., 2009). AALs vereisen echter ultrasound met hoge

intensiteit aangezien de inwendige olielaag de wandsnelheid tijdens de oscillaties aanzienlijk verlaagt

(Shortencarier et al., 2004).

Farmaca geïncorporeerd in het omhulsel van de micro bubbel. Een zeer interessante

toepassing is het gebruik van perfluorocarbon (C5F12) nanodruppels welke gestabiliseerd zijn door een

omhulsel van biodegradeerbare blokcopolymeren (Gao, A. M. Kennedy, Christensen, & N. Y.

Rapoport, 2008; N. Rapoport, Gao, & A. Kennedy, 2007). In dit omhulsel kan medicatie zoals

17

doxorubicine geïncorporeerd worden. Het bijzondere aan deze nanodruppels is dat ze converteren tot

microbubbels door opwarming bij de fysiologische lichaamstemperatuur. Na intraveneuze toediening

accumuleren de bubbels ter hoogte van tumoraal weefsel als gevolg van de verhoogde permeabiliteit

van de microvasculatuur van tumoren. Bij aanwending van ultrasound kan er bijgevolg een sterk en

langdurig contrast waargenomen worden ter hoogte van de tumor. Bij hogere ultrasound intensiteit

kan men vrijstelling van de medicatie en selectieve opname door de tumorcellen bewerkstelligen.

Binding van farmaca aan het omhulsel van de microbu bbel. De koppeling van medicatie

aan het omhulsel van de microbubbel kan gebeuren door middel van elektrostatische en hydrofobe

interacties (Sirsi & Borden, 2009; Tinkov et al., 2009). In tegenstelling tot nucleïnezuren wordt

medicatie zelden elektrostatisch gebonden aan microbubbels (Sirsi & Borden, 2009).

Recent werd een nieuwe doxorubicine beladen microbubbel ontwikkeld (Tinkov, Coester, et al.,

2010; Tinkov, Winter, Coester, & Bekeredjian, 2010). Door de positieve lading en het amfifiele karakter

van doxorubicine kan dit chemotherapeuticum niet-covalente complexen vormen met anionische

fosfolipiden. Deze binding wordt dus voornamelijk gestabiliseerd door elektrostatische en hydrofobe

krachten (Tinkov, Winter, et al., 2010). In vitro werd een synergetisch effect waargenomen tussen

doxorubicine, de microbubbels en ultrasound met een driemaal hoger anti-proliferatief effect dan vrij

doxorubicine (Tinkov, Winter, et al., 2010). Ook in vivo experimenten geven veelbelovende resultaten.

Een pancreas carcinoma rattenmodel gaf met deze methode een twaalfvoudige verhoging in

weefselconcentratie ter hoogte van doelwittumoren met bijgevolg een significante remming van

tumorgroei (Tinkov, Coester, et al., 2010).

Farmacabeladen nanopartikels gekoppeld aan het omhu lsel van de microbubbel.

Microbubbels kunnen ook met farmaca beladen worden door er farmaca bevattende nanopartikels

aan te koppelen. Een eenvoudige manier om farmacabeladen nanopartikels te koppelen aan het

oppervlak van microbubbels is via een biotine-avidine koppelsysteem (Fig. 7) (Geers et al., 2011).

Hierbij worden in de lipidencoating van zowel de microbubbels als van de liposomen gebiotinyleerde

lipiden aangebracht (Kheirolomoom et al., 2007). Daarna worden de bubbels en liposomen na

incubatie met avidine met elkaar gekoppeld. Het hoge aantal liposomen die gebonden kan worden

aan een microbubbel (>1000) zorgt ervoor dat de ladingscapaciteit van microbubbels aanzienlijk wordt

verhoogd (Kheirolomoom et al., 2007).

18

Microbubbel

DOX

DOX

DOX

DOX

DOXDOX

DOX

Avidine

Biotine

Biotine

DOX

Fig. 7 Schematische weergave van doxorubicine beladen liposomen gebonden aan een microbubbel

via een biotine-avidine koppelsysteem (naar Lentacker, 2009)

19

6. DOXORUBICINE

6.1. ALGEMEEN

Doxorubicine is een anthracycline antibioticum en wordt aangemaakt door de schimmel

Streptomyces percetus var caesius. Door zijn grote toxiciteit wordt dit geneesmiddel niet als

antibioticum aangewend, maar wel als antitumoraal middel. Alhoewel doxorubicine in de

diergeneeskunde nog niet geregistreerd is, wordt het vaak off-label gebruikt bij honden en katten met

weke delen sarcoma’s, lymfoma’s, osteosarcoma’s en carcinoma’s (Ahaus, Couto, & Valerius, 2000).

Doxorubicine oefent zijn cytostatische en cytotoxische activiteit uit via verschillende

werkingsmechanismen (Milic et al., 2009; Stepankova et al., 2011). Het cytostaticum intercaleert

tussen baseparen in het DNA. Hierdoor wordt de biosynthese van macromoleculen geïnhibeerd.

Daarnaast induceert doxorubicine de vorming van vrije radicalen met beschadiging van het DNA of

lipidenperoxidatie tot gevolg. Inhibitie van het topoisomerase II en cross-linking met DNA zijn andere

manieren waarop het farmacon de celdeling verhindert.

Het gebruik van vrij doxorubicine is echter beperkt omwille van de niet te onderschatten

bijwerkingen. De voornaamste die bij de kat vastgesteld zijn, omvatten anorexie, myelosuppressie en

cumulatieve nefrotoxiciteit (Poirier et al., 2002). Bij de hond en de mens wordt doxorubicine

geassocieerd met cardiotoxiciteit (Poirier et al., 2002). Bovendien kampt doxorubicine ook met

multidrug-resistentie. De belangrijkste oorzaak hiervan is de overexpressie van een transmembranaire

effluxpomp, het P-glycoproteïne (Ma et al., 2009; Sonneveld & te Boekhorst, 1994). Hierdoor is er een

verhoogde efflux van doxorubicine uit het cytoplasma en een verminderde accumulatie van het

cytostaticum in de cel.

Omwille van voorvermelde problemen die met vrij doxorubicine gepaard gaan, is er een nieuwe

formulatie ontwikkeld waarbij doxorubicine verpakt wordt in stealth liposomen. Deze formulatie is

ondertussen commercieel beschikbaar als Doxil® (in de Verenigde Staten) en Caelyx® (in de EU,

Japan en Israël) en wordt gebruikt voor de behandeling van verschillende kankertypes (Kaposi

Sarcoma, ovariumkanker, borstkanker en multipele myeloma) (Gabizon, Shmeeda, & Grenader,

2012). Ondanks de sterk verminderde cardiotoxiciteit van Doxil® doken er andere neveneffecten op.

Verschillende patiënten kregen te kampen met mucositis en palmoplantaire erythrodysestesie (PPE;

hand-voet syndroom) (Gabizon et al., 2012; Lentacker, Geers, Demeester, De Smedt, & Sanders,

2010; von Moos et al., 2008). Daarom wordt er zeer veel onderzoek verricht om doxorubicine veel

gerichter vrij te stellen ter hoogte van de tumoren. Een veelbelovende formulatie die momenteel nog in

zijn kinderschoenen staat is “DOX-liposoom beladen microbubbels” waarbij de combinatie van

microbubbels en ultrasound zorgt voor een gerichte afgifte van de DOX-liposomen ter hoogte van de

tumor.

6.2. DOX-LIPOSOOM BELADEN MICROBUBBELS

Lentacker et al. zijn erin geslaagd om een doxorubicine formulatie te ontwerpen die met behulp

van microbubbels en echografie het doxorubicine lokaal ter hoogte van bijvoorbeeld een tumor kan

afgeven. Hierbij werden doxorubicine beladen liposomen gebonden aan het lipidenomhulsel van

microbubbels (DOX-liposoom beladen microbubbels) door middel van het biotine-avidine

20

koppelsysteem (Lentacker et al., 2010). Het gebruik van deze formulatie in combinatie met ultrasound

biedt enkele belangrijke voordelen. Enerzijds maakt ultrasound een gerichte afgifte van het

geneesmiddel mogelijk. Enkel ter hoogte van de bestraalde zone wordt immers doxorubicine

vrijgesteld uit de DOX-liposomen. Anderzijds vormen de imploderende microbubbels tijdelijke

openingen in de celmembranen zodat een verhoogde opname van het vrijgesteld doxorubicine door

de cellen kan plaatsvinden. Een ander voordeel van doxorubicine beladen microbubbels is hun hoge

ladingscapaciteit. Naar schatting zou per microbubbel ongeveer 3,25 x 10-8 µg doxorubicine kunnen

gebonden worden (Lentacker et al., 2010). Deze formulatie is echter onpraktisch voor klinisch gebruik

omwille van de complexe methode om dergelijke microbubbels te vormen en de immunogene natuur

van het biotine-avidine koppelsysteem.

In een recente studie werd een nieuwe vorm van DOX-liposoom beladen microbubbels

ontworpen door middel van zelfassemblage van fosfolipiden, farmacabeladen liposomen en

perfluorobutaan gas (C4F10) (Fig. 8) (Geers et al., 2011). In plaats van het biotine-avidine

koppelsysteem welke zeer immunogeen is, werden de liposomen via een covalente binding gekoppeld

aan de microbubbel. Deze formulatie is een belangrijke vooruitgang daar het beantwoordt aan alle

criteria voor klinisch gebruik: (a) er worden geen immunogene componenten gebruikt, (b) sterilisatie is

mogelijk op een eenvoudige manier en (c) voldoende liposomen kunnen op een stabiele wijze

gebonden worden op het oppervlak van de microbubbels (Geers et al., 2011). De maximale

ladingscapaciteit van dergelijke microbubbels werd geschat op 600 tot 1.300 liposomen per bubbel

(Geers et al., 2011). Ook in vitro resultaten zijn veelbelovend. In vergelijking met vrij doxorubicine en

DOX-liposomen geeft deze nieuwe formulatie een significant hogere afdoding van kankercellen. Dit

maakt dosisreductie van het farmacon mogelijk zodat ook de toxische neveneffecten beperkt blijven.

21

Fig. 8 Schematische voorstelling van DOX-liposoom beladen microbubbels ontworpen door middel

van zelfassemblage van fosfolipiden, farmacabeladen liposomen en perfluorobutaan gas.

22

BESPREKING

Het is duidelijk dat de ideale chemotherapie nog niet bestaat. Toch is er al een lange weg

afgelegd in de ontwikkeling van betere therapieën waarbij de patiënt een betere levenskwaliteit en

positievere prognose krijgt. Niet alleen in de humane geneeskunde is dit een belangrijke evolutie. Ook

op diergeneeskundig vlak is dit zeer interessant aangezien het dier een steeds belangrijkere plaats

krijgt binnen het gezin. Meer en meer mensen zijn bereid om verder te gaan bij het behandelen van

hun zieke huisdier. Het is dan ook niet verwonderlijk dat chemotherapie tegenwoordig eveneens tot

een belangrijke behandelingsoptie behoort wanneer het dier te maken heeft met kanker.

Gerichte afgifte van chemotherapeutica door middel van microbubbels en echografie is een

veelbelovende strategie om kanker te bestrijden. Het is een aantrekkelijke behandeling voor de

kankerpatiënt omwille van zijn niet invasieve aard, de mogelijkheid tot gerichte afgifte en

dosisreductie. De sterke vermindering van neveneffecten ten opzichte van de klassieke

chemotherapie is zeker en vast een grote vooruitgang.

Een vermeldenswaardige formulatie is DOX-liposoom beladen microbubbels. Niettegenstaande

hierop momenteel nog onderzoek verricht wordt, geven in vitro en in vivo studies alvast hoopgevende

resultaten.

23

REFERENTIELIJST

Ahaus E. a, Couto C.G., Valerius K.D. (2000). Hematological toxicity of doxorubicin-containing protocols in dogs with spontaneously occurring malignant tumors. Journal of the American Animal Hospital Association, 36(5), 422–426.

Alvarez-Román R., Merino G., Kalia Y.N., Naik a, Guy R.H. (2003). Skin permeability enhancement by low frequency sonophoresis: lipid extraction and transport pathways. Journal of pharmaceutical sciences, 92(6), 1138–1146.

Arora A., Scholar E.M. (2005). Role of Tyrosine Kinase Inhibitors in Cancer Therapy. Pharmacology, 315(3), 971–979.

Auge B.K., Preminger G.M. (2002). Update on shock wave lithotripsy technology. Current opinion in urology, 12(4), 287–290.

BCFI. (2012). Gecommentarieerd Geneesmiddelenrepertorium. Internetreferentie: http://www.bcfi.be/GGR/Index.cfm?ggrWelk=/GGR/MPG/MPG_M.cfm (geconsulteerd op 14 mei 2012).

Bertram J.S. (2000). The molecular biology of cancer. Molecular aspects of medicine, 21(6), 167–223.

Boon J.A. (2011). Veterinary Echocardiography. 2nd edition, Wiley-Blackwell, p. 5–9.

Chen J., Stubbe J. (2005). Bleomycins: towards better therapeutics. Nature reviews. Cancer, 5(2), 102–112.

Chen-xi J., Rong-hui Y., Chang-sheng M. (2010). Cardiac ablation by transesophageal high intensity focused, 123(17), 2451–2453.

Chiers K. (2010). Algemene pathologie: deel 7: oncologie, p. 1–71.

Dijkmans P. a, Juffermans L.J.M., Musters R.J.P., van Wamel A., ten Cate F.J., van Gilst W., Visser C. a, et al. (2004). Microbubbles and ultrasound: from diagnosis to therapy. European journal of echocardiography : the journal of the Working Group on Echocardiography of the European Society of Cardiology, 5(4), 245–256.

Evan G.I., Vousden K.H. (2001). Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer. Nature, 411(6835), 342–348.

Gabizon A., Shmeeda H., Grenader T. (2012). Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences, 45(4), 388–398.

Galm U., Hager M.H., Van Lanen S.G., Ju J., Thorson J.S., Shen B. (2005). Antitumor antibiotics: bleomycin, enediynes, and mitomycin. Chemical reviews, 105(2), 739–758.

Gao Z., Kennedy A.M., Christensen D.A., Rapoport N.Y. (2008). Drug-Loaded Nano/Microbubbles for Combining Ultrasonography and Targeted Chemotherapy. Ultrasonics, 48(4), 260–270.

Geers B., Lentacker I., Sanders N.N., Demeester J., Meairs S., De Smedt S.C. (2011). Self-assembled liposome-loaded microbubbles: The missing link for safe and efficient ultrasound triggered drug-delivery. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 152(2), 249–256.

ter Haar G. (2007). Therapeutic applications of ultrasound. Progress in biophysics and molecular biology, 93(1-3), 111–129.

24

ter Haar G. (2009). Safety and bio-effects of ultrasound contrast agents. Medical & biological engineering & computing, 47(8), 893–900.

Harris M. (2004). Monoclonal antibodies in cancer therapy Monoclonal antibodies as therapeutic agents for. The Lancet Oncology, 5(5), 292–302.

Hernot S., Klibanov A. (2009). Microbubbles in Ultrasound-Triggered Drug and Gene Delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 60(10), 1153–1166.

Hiraoka W., Honda H., Feril L.B., Kudo N., Kondo T. (2006). Comparison between sonodynamic effect and photodynamic effect with photosensitizers on free radical formation and cell killing. Ultrasonics sonochemistry, 13(6), 535–542.

Hong S.S., Khan W., Shin Y.H., Cho S.H., Ahn B.Y., Chung J.W., Woo S.Y. (2011). The study of new vacuum pressure measurement technique using ultrasonic acoustic impedance transducers. The Review of scientific instruments, 82(7), 1–4.

Husseini G.A., Pitt W.G. (2009). Ultrasonic-Activated Micellar Drug Delivery for Cancer Treatment. Ultrasound, 98(3), 795–811.

Hynynen K. (2008). Ultrasound for drug and gene delivery to the brain. Advanced drug delivery reviews, 60(10), 1209–1217.

Immordino M.L., Dosio F., Cattel L. (2006). Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International journal of nanomedicine, 1(3), 297–315.

Jordan M.A., Wilson L. (2004). Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer, 4(April), 253–265.

Juffermans L.J.M., Dijkmans P. a, Musters R.J.P., Visser C. a, Kamp O. (2006). Transient permeabilization of cell membranes by ultrasound-exposed microbubbles is related to formation of hydrogen peroxide. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology, 291(4), H1595–H1601.

Kelley K.W. (2008). Ultrasonic Drug Delivery – A General Review. Brain, Behavior, and Immunity, 22(5), 629.

Kheirolomoom A., Dayton P.A., Lum A.F.H., Little E., Paoli E.E., Ferrara K.W. (2007). Acoustically-Active Microbubbles Conjugated to Liposomes: Characterization of a Proposed Drug Delivery Vehicle. J Control Release, 118(3), 275–284.

Kiessling F., Gaetjens J., Palmowski M. (2011). Application of Molecular Ultrasound for Imaging Integrin Expression. Theranostics, 1, 127–134.

Kooiman K., Böhmer M.R., Emmer M., Vos H.J., Chlon C., Shi W.T., Hall C.S., et al. (2009). Oil-filled polymer microcapsules for ultrasound-mediated delivery of lipophilic drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 133(2), 109–118.

Kuroki M., Hachimine K.E.N., Abe H., Shibaguchi H. (2007). Sonodynamic Therapy of Cancer Using Novel Sonosensitizers. Anticancer Research, 27(6A), 3673–3677.

Laing S.T., McPherson D.D. (2009). Cardiovascular therapeutic uses of targeted ultrasound contrast agents. Cardiovascular research, 83(4), 626–635.

Leighton T.G. (2007). What is ultrasound? Progress in biophysics and molecular biology, 93(1-3), 3–83.

25

Lentacker I. (2009). Design and evaluation of drug loaded microbubbles for ultrasound guided cancer therapy, Ghent University. Faculty of Pharmaceutical Sciences, Ghent, Belgium, p. 1–216.

Lentacker I., Geers B., Demeester J., De Smedt S.C., Sanders N.N. (2010). Design and evaluation of doxorubicin-containing microbubbles for ultrasound-triggered doxorubicin delivery: cytotoxicity and mechanisms involved. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy, 18(1), 101–108.

Li J.-hua, Song D.-yong, Xu Y.-gang, Huang Z., Yue W. (2008). In vitro study of haematoporphyrin monomethyl ether-mediated sonodynamic effects on C6 glioma cells. Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology, 29(4), 229–235.

Lingeman J.E., Mcateer J.A., Gnessin E., Evan A.P. (2009). Shock wave lithotripsy: advances in technology and technique. Nat Rev Urol., 6(12), 660–670.

Ma P., Dong X., Swadley C.L., Gupte A., Leggas M., Ledebur H.C., Mumper R.J. (2009). Development of Idarubicin and Doxorubicin Solid Lipid Nanoparticles to Overcome Pgp–mediated Multiple Drug Resistance in Leukemia. Journal of Biomedical Nanotechnology, 5(2), 151–161.

Mayer C.R., Geis N. a, Katus H. a, Bekeredjian R. (2008). Ultrasound targeted microbubble destruction for drug and gene delivery. Expert opinion on drug delivery, 5(10), 1121–1138.

Milic V.D., Stankov K., Injac R., Djordjevic A., Srdjenovic B., Govedarica B., Radic N., et al. (2009). Activity of antioxidative enzymes in erythrocytes after a single dose administration of doxorubicin in rats pretreated with fullerenol C(60)(OH)(24). Toxicology mechanisms and methods, 19(1), 24–28.

Misík V., Riesz P. (2006). Free Radical Intermediates in Sonodynamic Therapy. Annals of the New York Academy of Sciences, 899(1), 335–348.

von Moos R., Thuerlimann B.J.K., Aapro M., Rayson D., Harrold K., Sehouli J., Scotte F., et al. (2008). Pegylated liposomal doxorubicin-associated hand–foot syndrome: Recommendations of an international panel of experts. European Journal of Cancer, 44(6), 781–790.

Ohlerth S., O’Brien R.T. (2007). Contrast ultrasound: general principles and veterinary clinical applications. The Veterinary journal, 174(3), 501–512.

Pahade A., Jadhav V.M., Kadam V.J. (2010). Sonophoresis: an overview. Quality Assurance, 3(2), 24–32.

Pemberton J. (1987). Extra-corporeal shock wave lithotripsy. Postgraduate medical journal, 63(746), 1025–1031.

Pfizer animal health. (2012). Kanker bij honden en katten. Internetreferentie: https://animalhealth.pfizer.com (geconsulteerd op 14 mei 2012).

Pitot H.C. (1993). The molecular biology of carcinogenesis. Cancer, 72(S3), 962–970.

Poirier V.J., Thamm D.H., Kurzman I.D., Jeglum K.A., Chun R., Obradovich J.E., O’Brien M., et al. (2002). Liposome-encapsulated doxorubicin (Doxil) and doxorubicin in the treatment of vaccine-associated sarcoma in cats. Journal of veterinary internal medicine / American College of Veterinary Internal Medicine, 16(6), 726–731.

Pommier Y. (2009). DNA Topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, Biology and Interfacial Inhibition. Chemical Reviews, 109(7), 2894–2902.

26

Qin S. (2009). Ultrasound contrast microbubbles in imaging and therapy: physical principles and engineering. Phys. Med. Biol., 54(6), 1–42.

Quaia E. (2007). Microbubble ultrasound contrast agents: an update. European radiology, 17(8), 1995–2008.

Rapoport N., Gao Z., Kennedy A. (2007). Multifunctional nanoparticles for combining ultrasonic tumor imaging and targeted chemotherapy. Journal of the National Cancer Institute, 99(14), 1095–1106.

Richardson E.S., Pitt W.G., Woodbury D.J. (2007). The role of cavitation in liposome formation. Biophysical journal, 93(12), 4100–4107.

Rubin C., Bolander M., Ryaby J.P., Hadjiargyrou M. (2001). The use of low-intensity ultrasound to accelerate the healing of fractures. The Journal of bone and joint surgery. American volume, 83-A(2), 259–270.

Sarheed O., Abdul Rasool B.K. (2011). Development of an optimised application protocol for sonophoretic transdermal delivery of a model hydrophilic drug. The open biomedical engineering journal, 5, 14–24.

Schlicher R.K., Radhakrishna H., Tolentino T.P., Apkarian R.P., Zarnitsyn V., Prausnitz M.R. (2006). Mechanism of intracellular delivery by acoustic cavitation. Ultrasound in medicine & biology, 32(6), 915–924.

Schutt E.G., Klein D.H., Mattrey R.M., Riess J.G. (2003). Injectable microbubbles as contrast agents for diagnostic ultrasound imaging: the key role of perfluorochemicals. Angewandte Chemie (International ed. in English), 42(28), 3218–3235.

Shelby R. a, Smith D.R., Schultz S. (2001). Experimental verification of a negative index of refraction. Science (New York, N.Y.), 292(5514), 77–79.

Shortencarier M.J., Dayton P. a, Bloch S.H., Schumann P. a, Matsunaga Terry O, Ferrara K.W. (2004). A method for radiation-force localized drug delivery using gas-filled lipospheres. IEEE transactions on ultrasonics, ferroelectrics, and frequency control, 51(7), 822–831.

Siddik Z.H. (2002). Mechanisms of Action of Cancer Chemotherapeutic Agents : DNA-Interactive Alkylating Agents and Antitumour Platinum-Based Drugs. The cancer handbook, John Wiley & Sons, New York, p. 1295–1313.

Sirsi S., Borden M. (2009). Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications. Bubble Science, Engineering & Technology, 1(1-2), 3–17.

Skyba D.M., Kaul S. (2000). Advances in microbubble technology. Coronary artery disease, 11(3), 211–219.

Sonneveld P., te Boekhorst P.A.W. (1994). Multidrug-resistentie in hematologische maligniteiten: prognostische betekenis en het effect van resistentie-modulerende farmaca. Nederlands Tijdschrift voor Geneeskunde, 138(508-512).

Speed C. a. (2001). Therapeutic ultrasound in soft tissue lesions. Rheumatology (Oxford, England), 40(12), 1331–1336.

Stepankova J., Studenovsky M., Malina J., Kasparkova J., Liskova B., Novakova O., Ulbrich K., et al. (2011). DNA interactions of 2-pyrrolinodoxorubicin, a distinctively more potent daunosamine-modified analogue of doxorubicin. Biochemical pharmacology, 82(3), 227–235.

27

Stride E. (2009). Physical principles of microbubbles for ultrasound imaging and therapy. Cerebrovascular diseases, 27(2), 1–13.

Tachibana K., Feril L.B., Ikeda-Dantsuji Y. (2008). Sonodynamic therapy. Ultrasonics, 48(4), 253–259.

Takimoto B.C.H., Calvo E. (2008). Chapter 3: Principles of Oncologic Pharmacotherapy. Cancer Management: A Multidisciplinary Approach. 11th edition, CMP Healthcare Media, p. 1–9.

Tezel A., Mitragotri S. (2003). Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis. Biophysical journal, 85(6), 3502–3512.

Tinkov S., Bekeredjian R., Winter G., Coester C. (2009). Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of pharmaceutical sciences, 98(6), 1935–1961.

Tinkov S., Coester C., Serba S., Geis N. a, Katus H. a, Winter G., Bekeredjian R. (2010). New doxorubicin-loaded phospholipid microbubbles for targeted tumor therapy: in-vivo characterization. Journal of controlled release, 148(3), 368–372.

Tinkov S., Winter G., Coester C., Bekeredjian R. (2010). New doxorubicin-loaded phospholipid microbubbles for targeted tumor therapy: Part I--Formulation development and in-vitro characterization. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 143(1), 143–150.

Unger E.C., Matsunaga Terry Onichi, McCreery T., Schumann P., Sweitzer R., Quigley R. (2002). Therapeutic applications of microbubbles. European journal of radiology, 42(2), 160–168.

Unger E.C., Porter T., Culp W., Labell R., Matsunaga T., Zutshi R. (2004). Therapeutic applications of lipid-coated microbubbles. Advanced drug delivery reviews, 56(9), 1291–1314.

Wilson S.R., Burns P.N. (2010). Microbubble-enhanced US in Body Imaging : What Role ? Radiology, 257(1), 24–39.

Yang F., Gu N., Chen D., Xi X., Zhang D., Li Y., Wu J. (2008). Experimental study on cell self-sealing during sonoporation. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 131(3), 205–210.

Yumita N., Okuyama N., Sasaki K., Umemura S.-ichiro. (2004). Sonodynamic therapy on chemically induced mammary tumor: pharmacokinetics, tissue distribution and sonodynamically induced antitumor effect of porfimer sodium. Cancer science, 95(9), 765–769.