POTENTIEEL VAN FLUORESCERENDE

PSEUDOMONADEN VOOR DE DUUR-

ZAME BEHEERSING VAN FUSARIUM

VERWELKINGSZIEKTE OP BANAAN Aantal woorden: 33.504

Henky van Dort Stamnummer: 01006929

Promotor: Prof. dr. ir. Monica Höfte

Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad Master of Science in de bio-

ingenieurswetenschappen: landbouwkunde

Academiejaar: 2016 – 2017

De auteur en promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen

en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder beperkingen van het

auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden

bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.

Gent, januari 2017

De promotor,

Prof. Dr. ir. Monica Höfte

De auteur,

Henky van Dort

i

Woord vooraf

Hier is dan eindelijk het resultaat van ruim een jaar lang hard werken met ups en downs. Het begon

met een zoektocht met veel getwijfel naar een onderwerp voor de masterproef. Toen ik dit onderwerp

vond waarbij ik met mijn favoriete planten, bananen, kon werken was mijn keuze snel gemaakt. Dit

gaf mij de nodige motivatie om dit toch niet eenvoudige onderwerp tot een succesvol einde te

brengen. Dit was niet mogelijk geweest zonder alle personen die hebben bijgedragen in het tot stand

brengen van deze afsluiter in de opleiding.

Bij dezen wil ik mijn promotor Prof. dr. ir. Monica Höfte bedanken om mij de kans te geven in het labo

van Fytopathologie aan dit onderwerp te werken en voor de planning en sturing van de proeven. En

niet in het minst om met veel geduld mijn Nederlands taalgevoel te prikkelen bij het schrijven.

Ik wil Pauline Deltour en Feyisara Olorunleke bedanken voor de expertise die noodzakelijk was om

goede resultaten te bereiken.

Verder bedank ik Nadia Lemeire en Ilse Delaere voor de praktische begeleiding, en het aanleren van

de procedures en methodologie voor de praktische proeven.

Ik wil iedereen van het labo en mijn mede thesis-studenten bedanken altijd hulp te bieden en te zorgen

voor een aangename werkomgeving. Aan jullie allen, jullie hulp en de fijne pauzes worden zeer

gewaardeerd.

Aan mijn klasgenoten Gregor, Julie, Sanne en Stijn, jullie maakten van de afgelopen jaren in Gent een

leuke tijd.

Ten slotte bedank ik mijn mama en Rudi om mij de kans gegeven te hebben, niet enkel tijdens dit

laatste jaar maar gedurende de volledige opleiding, zorgeloos te kunnen studeren zonder

verplichtingen.

Jullie hebben mij geholpen in het nemen van de laatste stappen tot Bio-ingenieur.

Henky van Dort

Gent, januari 2017

ii

iii

Inhoudsopgave

Woord vooraf ........................................................................................................................................... i

Lijst van afkortingen ............................................................................................................................... vii

Samenvatting ........................................................................................................................................... ix

Inleiding ................................................................................................................................................... 1

A. Literatuur ......................................................................................................................................... 3

1. Banaan ......................................................................................................................................... 3

1.1. Biologie .................................................................................................................................... 3

1.2. Systematiek ............................................................................................................................. 3

1.3. Gebruik .................................................................................................................................... 4

1.4. Domesticatie, cultivars en veredeling ..................................................................................... 5

1.4.1. Domesticatie ........................................................................................................................ 5

1.4.2. Cultivars ............................................................................................................................... 5

1.4.3. Veredelingsdoelstellingen ................................................................................................... 7

1.5. Teelt ......................................................................................................................................... 7

1.6. Productie en export ................................................................................................................. 7

1.7. Plagen en ziekten .................................................................................................................... 8

2. Panama ziekte ............................................................................................................................. 9

2.1. Fusarium verwelkingsziekte .................................................................................................... 9

2.2. Indeling Fusarium oxysporum ................................................................................................. 9

2.2.1. Indeling Fox op basis van formae specialis.......................................................................... 9

2.2.2. Indeling Foc op basis van races, VCG en productie vluchtige organische componenten ... 9

2.3. Geschiedenis ......................................................................................................................... 10

2.4. Geografische distributie ........................................................................................................ 11

2.5. Morfologie ............................................................................................................................. 12

2.6. Ziektecyclus ........................................................................................................................... 12

2.6.1. Levenscyclus Foc ................................................................................................................ 12

2.6.2. Reactie van de waard. ....................................................................................................... 13

2.7. Symptomen ........................................................................................................................... 14

2.8. Verspreiding .......................................................................................................................... 14

2.9. Beheersingsstrategieën ......................................................................................................... 15

2.9.1. Resistente cultivars ........................................................................................................... 15

2.9.2. Vermijden van inoculum ................................................................................................... 16

2.9.3. Vermindering van ziekte.................................................................................................... 16

3. Biologische ziektebeheersing door fluorescerende pseudomonaden ...................................... 19

iv

3.1. Inleiding ................................................................................................................................. 19

3.2. Fluorescerende pseudomonaden ......................................................................................... 19

3.3. Ziektebeheersing ................................................................................................................... 20

3.3.1. Rhizosfeerkolonisatie ........................................................................................................ 20

3.3.2. Mechanismen in ziektebeheersing .................................................................................... 20

B. Doelstelling .................................................................................................................................... 27

C. Materiaal en methoden ................................................................................................................ 29

1. Screening in vitro antagonisme tegen Foc ................................................................................ 29

1.1. Opkweek isolaten Foc en Pseudomonas ............................................................................... 29

1.2. Proefopstelling ...................................................................................................................... 29

1.3. In vitro test 1 ......................................................................................................................... 30

1.4. In vitro test 2 ......................................................................................................................... 30

2. Screening in planta antagonisme tegen Foc ............................................................................. 30

2.1. Opkweek bananenplanten .................................................................................................... 30

2.1.1. In vitro opkweek ................................................................................................................ 30

2.1.2. Ex vitro opkweek ............................................................................................................... 32

2.2. Inoculatie ............................................................................................................................... 32

2.2.1. Inoculatie Foc .................................................................................................................... 32

2.2.2. Inoculatie Pseudomonas isolaten ...................................................................................... 32

2.3. Evaluatie ................................................................................................................................ 33

2.3.1. Externe ziekte evaluatie .................................................................................................... 33

2.3.2. Interne ziekte evaluatie ..................................................................................................... 33

2.3.3. Evaluatie populatiedensiteit fluorescerende pseudomonaden in rhizosfeer ................... 34

2.4. Proefopzet ............................................................................................................................. 35

2.4.1. In planta test 1 .................................................................................................................. 35

2.4.2. In planta test 2 .................................................................................................................. 35

2.4.3. In planta test 3 .................................................................................................................. 36

3. Statistische dataverwerking ...................................................................................................... 36

D. Resultaten ..................................................................................................................................... 37

1. Screening in vitro antagonisme tegen Foc ................................................................................ 37

1.1. In vitro test 1 ......................................................................................................................... 37

1.2. In vitro test 2 ......................................................................................................................... 40

1.3. Besluiten in vitro testen ........................................................................................................ 41

2. Screening in planta antagonisme tegen Foc ............................................................................. 45

2.1. In planta test 1 ...................................................................................................................... 45

2.2. In planta test 2 ...................................................................................................................... 46

v

2.3. In planta test 3 ...................................................................................................................... 48

2.4. Besluiten in planta testen ..................................................................................................... 51

3. Vergelijking in vitro en in planta testen .................................................................................... 52

E. Discussie ........................................................................................................................................ 53

1. Screening in vitro antagonisme tegen Foc ................................................................................ 53

1.1. Verklarende mechanismen in vitro antagonisme ................................................................. 53

1.2. Vorming precipitatielijn in inhibitiezone ............................................................................... 55

2. Screening in planta antagonisme tegen Foc ............................................................................. 55

2.1. Ziektesymptomen in zieke en gezonde controle .................................................................. 55

2.2. Fluorescerende pseudomonaden met biocontrole activiteit ............................................... 56

2.2.1. Populatiedensiteit fluorescerende pseudomonaden op bananenwortels ....................... 57

2.2.2. Rol substraat in ziektebeheersing ..................................................................................... 59

2.2.3. Mechanismen van ziektebeheersing door fluorescerende pseudomonaden ................... 60

2.2.4. Hypothese fytotoxiciteit .................................................................................................... 61

F. Conclusies en ideeën voor verder onderzoek ............................................................................... 63

G. Verwijzingen .................................................................................................................................. 65

H. Bijlage ............................................................................................................................................ 79

vi

vii

Lijst van afkortingen

BAP Benzylaminopurine

BCO Biologische controle organismen

BSI Blad symptoom index

CFU Colony-forming unit

CLP Cyclische lipopeptiden

DAPG 2,4-diacetylphloroglucinol

EDDHA Ethyleendiamine di (o-hydroxyfenylazijnzuur)

EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur

FAL Fenylalanine ammonia lyase

Foc Fusarium oxysporum f. sp. cubense

Fox Fusarium oxysporum

GCY Glucose casamino acid yeast extract agar

HCN Waterstofcyanide

ISR Induced systemic resistance

KB King’s B medium

MEA Malt extract agar

OD Optische densiteit

PCA phenazine-1-carboxylzuur

PCN phenazine-1-carboxamide

PDA Potato dextrose agar

PDI Plant ziekte index

PFO Polyfenol oxidase

PGPR Plant growth-promoting rhizobacteria

PLT Pyoluteorine

PO Peroxidase

PRN Pyrrolnitrine

R Race

rAUDPC relatieve Area under diseased progress curve

RDI Rhizome discoloration index

viii

SAR Systemic acquired resistance

ST4 Subtropische Race 4

TR4 Tropische Race 4

UV Ultraviolet

VCG Vegetatieve compatibiliteitsgroep

WLIP White line inducing principle

ix

Samenvatting

De Fusarium verwelkingsziekte van banaan veroorzaakt door de schimmel Fusarium oxysporum f. sp.

cubense is één van de meest vernietigende ziekten in werelds belangrijkste fruitgewas. Allerlei isolaten

van fluorescerende pseudomonaden zijn in staat ziekte te beheersen in verscheidene gewassen door

de productie van antimicrobiële stoffen, competitie voor nutriënten en niche of inductie van

systemische resistentie. Bepaalde Pseudomonas isolaten geïsoleerd van ziektewerende bodems tegen

o.a. cocoyam root rot disease kunnen in plantentesten ziekte ontwikkeling weren. In deze masterproef

werd onderzocht of deze isolaten van fluorescerende pseudomonaden ziektewerend konden werken

tegen Fusarium verwelkingsziekte in het gewas banaan.

In het eerste deel werd via in vitro screening een selectie uitgevoerd voor de bepaling welke

fluorescerende pseudomonaden de pathogeen isolaten konden inhiberen in hun groei op twee

verschillende media. Het bleek dat alle geteste Pseudomonas isolaten zowel race 1 als race 4 isolaten

van de pathogeen konden inhiberen, waarbij er hoogstens een fungistatisch effect was tegen de

schimmel. Er was geen onderscheid in de inhibitie van de schimmelgroei tussen de verschillende

Fusarium isolaten. De inhibitie was ook afhankelijk van het medium, bepaalde pseudomonaden

konden schimmelgroei sterk inhiberen op verschillende media terwijl andere dit enkel op bepaalde

media konden.

In het tweede deel werden de beste inhiberende isolaten vanuit het eerste deel gebruikt voor in planta

testen en werd naast de ziekte evaluatie ook de populatiedensiteit van de fluorescerende

pseudomonaden in de rhizosfeer van de bananenplanten gemeten onder verschillende

inoculatiemethoden van zowel Pseudomonas als de pathogeen. In een eerste verkennende test

werden de Pseudomonas isolaten opgekweekt op GCY medium waarna de bananenplanten werden

geïnoculeerd met de bacteriën en conidiën inoculum van de pathogeen. Door het uitblijven van hevige

ziektesymptomen in de zieke controle werd in een tweede experiment getest of een puur potgrond

substraat meer ziekte kon geven dan het eerder gebruikte 50 m% potgrond/50 m% zand mengsel.

Hierbij kon ook het effect van het substraat op de ziektewerende capaciteit van de verschillende

Pseudomonas isolaten geëvalueerd worden. Er was een zeer duidelijke invloed van het substraat, in

100 % potgrond verdwenen in alle Pseudomonas behandelingen alle interne ziektesymptomen

vergeleken met het mengsel 50 m% potgrond/50 m% zand. De ziektehevigheid was groter,

waarschijnlijk door het gebruik van plantenbemesting gustig voor Fusarium, maar toch nog te zwak.

Daarom werd in het finale derde experiment de pathogeen geïnoculeerd met de persistente

chlamydosporen. Ditmaal was de ziekte hevig en waren er duidelijkere resultaten naar biocontrole te

danken aan de Pseudomonas isolaten. De isolaat COW5 gaf met een 80 % vermindering (niet

significant) van de interne ziektesymptomen de beste biocontrole. De populatiedensiteit van de

isolaten bij de evaluatie was over het algemeen aan de lage kant. De concentratie Pseudomonas was

telkens het hoogst in de meest zieke plant binnen elke behandeling wat aangeeft dat de afstervende

wortels een gunstige niche vormden. Slechts enkele isolaten konden ziekte sterk beheersen met

variabele resultaten doorheen de verschillende testen. In bepaalde behandelingen was er meer ziekte

dan in de zieke controle mogelijk te wijten aan fytotoxiciteit van metabolieten geproduceerd door de

bacteriën.

x

Inleiding 1

Inleiding

Bananen zijn één van de populairste en oudste voedselgewassen en zijn alomtegenwoordig waar het

klimaat het toelaat. Zowel voor de lokale bevolking die afhangt van dit energierijk en voedzaam gewas

om in hun levenswijze te voorzien als voor de wereldburger zijn deze vruchten niet meer weg te

denken.

Maar bananen zijn slachtoffer van hun eigen succes, door de enorme monoculturen van genetisch

identieke planten en de wereldwijde uitwisseling van plantenmateriaal wordt hun voortbestaan

bedreigd. Er heerst een continue oorlog tussen planten en hun pathogenen. De banaan dreigt nu te

verliezen van een oude vijand die terug is van weggeweest. Deze allesvernietigende vijand is de

panama ziekte en wordt veroorzaakt door een zeer diverse en veelzijdige schimmel. Deze luidt

Fusarium oxysporum forma specialis cubense. Het is een pathogeen die de plant aanvalt vanaf zijn

wortels en dan zijn weg vindt doorheen het binnenste van de plant. De gevoelige plant kan dit niet aan

en verwelkt. De toepasselijke naam Fusarium verwelkingsziekte is hiervan afgeleid. Deze pathogeen

verspreidt zich langzaam door de bodem van plant naar plant of via andere snellere wijzen. Uiteindelijk

kan een volledige plantage ten onder gaan.

Tegen deze ziekte valt niet veel te beginnen; door zijn bodemgebonden aard zijn fungiciden niet

effectief en vruchtwisseling heeft weinig baat door de hoge persistentie van de sporen. Quarantaine

maatregelen en gebruik van resistente cultivars zijn wel succesvol. Wanneer men echter waardevolle

ziektegevoelige cultivars wil inzetten op gecontamineerde velden is er een andere oplossing nodig.

In de bodem leven tal van micro-organismen die vechten voor een plaats. Naast de pathogenen zijn er

ook de commensale organismen die een positieve wisselwerking hebben met de

plantengemeenschap. De plantengroeistimulerende rhizosfeer bacteriën nestelen zich dicht bij een

plant om te kunnen genieten van deze waardevolle plaats. Ze hebben in hun strijd tot verovering van

deze niche veelbelovende mechanismen ontwikkeld tegen plantpathogene schimmels. De meest

uitgebreide en veelzijdige groep zijn de fluorescerende pseudomonaden die door competitie voor een

niche en nutriënten de pathogeen kunnen wegconcurreren. Ze kunnen ook direct antagonistisch

werken door productie van antischimmel metabolieten. Hierbij beschermen ze zichzelf en hun

waardplant. De stimulatie van pathogeeninhiberende processen door inductie van plantresistentie is

een vaak voorkomende interactie. In ziektewerende bodems is er een sterke weerstand tegen

pathogenen door een krachtige microbiële gemeenschap. In allerlei gewassen zijn deze bodems

gekend en zijn in staat ziekte te beheersen op een duurzame wijze.

In deze thesis werd er bestudeerd of bepaalde fluorescerende pseudomonaden met specifieke

eigenschappen, die reeds bewezen ziektebeheersende capaciteit in andere gewas-pathogeen

systemen te hebben, Fusarium verwelkingsziekte in banaan konden beheersen.

2 Inleiding

A. Literatuur 3

A. Literatuur 1. Banaan

1.1. Biologie De monocotyle banaan is een meerjarig gewas, de grootste kruidachtige plant variërend in hoogte van

2 tot 9 meter (Nelson et al. 2006; Pillay en Tenkouano 2011). Het adventieve wortelsysteem spreidt

zich lateraal uit tot 5.5 m en vormt een dichte mat in de 15 cm bovenste bodemlaag (Morton 1987;

OGTR 2008). Vanuit het apicale meristeem in de rhizoom ontwikkelen er zich eerst bladeren waarna

deze verlengt en de bloeistengel vormt. Vanuit de pseudostam, concentrische lagen van bladscheden

gerold in een cilinder, verschijnen dicht opgerolde bladeren (OGTR 2008) aan een frequentie tot 1 per

week in de zomer (Nelson et al. 2006). De bladeren van banaan zijn de grootste ter wereld met een

lengte tot 4 m en breedte tot 1 m. Elk blad heeft een duidelijke middenrib en parallelle nerven. De

grootte van de jonge bladeren blijft toenemen tot net voor de bloei waarna de bladgrootte terug

afneemt met als laatste blad het vlaggenblad (OGTR 2008). Alvorens de grote terminale bloeiwijze

vanuit de pseudostam verschijnt, produceren de meeste bananenplanten 30 tot 40 bladeren

gedurende 10 tot 15 maanden na het planten (OGTR 2008). Een minimum van 8 tot 10 functionele

bladeren zijn noodzakelijk om een goede maturiteit van de tros te verkrijgen (OGTR 2008; Rieger 2016).

De bloeiwijze is een samengestelde aar, de bloemsteel (peduncle) verschijnt na het vlaggenblad. De

onvolgroeide bloeiwijze wordt omgeven door schutbladeren die een bel vormen. Tussen de

schutbladeren zitten aan het proximale uiteinde van de peduncle de vrouwelijke bloemen die zich

ontwikkelen tot bananen en aan het distale uiteinde de mannelijke bloemen (OGTR 2008). Het

maximale aantal vruchten dat potentieel kan gevormd worden in een tros is gecorreleerd met de

klimatologische omstandigheden gedurende de zeer vroege vorming van de bloemen op het tijdstip

dat de laatste 3 tot 4 bladeren zich ontwikkelen. De vruchten zijn bessen en deze zitten aan elkaar

waardoor ze een ‘hand’ vormen waarbij een banaan een ‘vinger’ is, alle handen samen zijn een tros

(OGTR 2008). Banaan komt van het Arabische woord voor vinger ‘banan’ (Ayto 2012). Naarmate de

bloemen en later de vruchten zich ontwikkelen buigt de bloemstengel neerwaarts onder het gewicht

terwijl de bananen opwaarts groeien door negatieve geotropie (OGTR 2008). De schil van de vrucht is

een fusie van het hypanthium en de buitenste laag van het pericarp. Eetbare cultivars hebben zaadloos

vlezig fruit terwijl wilde bananen gevuld zijn met zwarte, harde zaden en weinig vlees hebben (OGTR

2008). Na de bloei worden er geen bladeren meer gevormd en sterft de pseudostam (Pillay en

Tenkouano 2011) waarna axillaire knoppen van de rhizoom uitlopen en ontwikkelen tot scheuten

(‘suckers’) die een volgende oogst (‘ratoon crop’) kunnen geven of gebruikt worden voor vegetatieve

vermenigvuldiging (OGTR 2008). In Figuur 1 staat de bouw van een vruchtdragende bananenplant.

1.2. Systematiek Bananensoorten behoren tot de orde van de Zingiberales, in de groep van de Commenilids in de

Monocotyledons. In de familie van de bananen, de Musaceae, bevinden zich het Afrikaanse en

Aziatische genus Ensete, het Aziatische genus Musella en het Oost-Aziatische genus Musa. Het genus

Musa wordt opgedeeld in secties met 22 (Eumusa, Rhodochlamys) en 20 chromosomen (Australimusa,

Callimusa) waarvan de sectie Eumusa de meeste eetbare bananencultivars bevat (Perrier et al. 2011).

Tot de Australimusa sectie behoort een kleine cultivargroep, inclusief Fe’i bananen die zich beperken

tot de Pacific (Perrier et al. 2011), en de Abaca (M. textilis) (Bakry et al. 2009; Simmonds et al. 1987).

4 A. Literatuur

Figuur 1 Vruchtdragende bananenplant met zijscheut (Bakry et al. 2009).

1.3. Gebruik De banaan plant levert zowel voedsel, materiaal als sierwaarde.

De vruchten zijn rijk aan energie en bevatten relatief veel kalium (OGTR 2008) (zie Tabel 1). Ze kunnen

rauw of gekookt gegeten worden, verwerkt tot bloem en gefermenteerd voor drank zoals bananen

sap, bier, wijn en azijn (OGTR 2008).

Tabel 1 Voedingswaarde per 100 gram rauwe dessertbanaan (USDA 2016).

Nutriënt Hoeveelheid Nutriënt Hoeveelheid Water (g) 74,91 K (mg) 358 Eiwit (g) 1,09 Ca (mg) 5 Vet (g) 0,33 Mg (mg) 27 Koolhydraten (g) 22,84 P (mg) 22 Suiker (g) 12,23 Na (mg) 1 Vezel (g) 2,60 Vit. C (mg) 8,7 Energie (kcal) 89

A. Literatuur 5

De bel van de top van de bloeiwijze wordt rauw of gekookt gegeten in Z.O. Azië, de kern van de

pseudostam wordt gekookt gebruikt en de bladknoppen worden als groente gegeten (OGTR 2008). De

rhizoom is een zetmeelbron die in tijden van hongersnood gegeten wordt in Afrika en Azië (OGTR

2008), in het hoogland van Ethiopië wordt het gefermenteerde zetmeel van de rhizoom en

bladscheden van Ensete ventricosum gebruikt als lokaal basisvoeding (Blomme et al. 2013; Morton

1987; Simmonds et al. 1987) door ongeveer 8 miljoen mensen (Ploetz et al. 2007). Alle plantendelen

worden als dierenvoeder gebruikt (OGTR 2008).

Blad wordt gebruikt voor het inpakken of schotel voor voedsel en als dakbedekking. Sap wordt gebruikt

als verf en inkt. Vezels van de Abaca pseudostam en blad worden gebruikt voor kleren, touw en papier

(van thee- en koffiezakjes tot schrijfpapier) (Morton 1987; OGTR 2008; Ploetz et al. 2007).

1.4. Domesticatie, cultivars en veredeling

1.4.1. Domesticatie Door natuurlijke somatische (vegetatieve) mutatie, hybridisatie en selectie over vele duizenden jaren

is er veel genetische variabiliteit ontstaan binnen de gecultiveerde bananen met meer dan 1000

cultivars wereldwijd (Heslop-Harrison en Schwarzacher 2007; Nelson et al. 2006; OGTR 2008). De

cultivars worden ingedeeld met een lettersysteem waarbij het aantal letters gelijk is aan de ploïdie en

de letter de genomische constitutie weergeeft (Ploetz 2005a). Polyploïdie in banaan kan di-, tri- of

tetraploïd zijn, waarvan de tri-, en tetraploïde cultivars vaak groeikrachtiger zijn en grotere vruchten

geven dan diploïde (Bakry et al. 2009). De meeste huidige zaadloze triploïde variëteiten zijn

geëvolueerd uit de 22 chromosomen tellende diploïde soorten Musa acuminata en Musa balbisiana

met respectievelijk de genoomaanduiding AA en BB (OGTR 2008; Simmonds et al. 1987). M. acuminata

evolueerde in de tropische regenwouden van Z.O. Azië, terwijl de origine van M. balbisiana in de

drogere moesson gebieden in noordelijk Z.O. Azië en zuidelijk Azië gelegen is (Ploetz et al. 2007;

Robinson en Saúco 2010). Belangrijke secondaire centra van diversiteit zijn er in West Afrika (Plataan

subgroep), Polynesië (Pacific Plantains) en Oost-Afrika (Highland East African Bananas) (Ploetz et al.

2007).

De vruchten van wilde soorten bananen zijn gevuld met steenachtige, harde zaden waardoor ze

oneetbaar zijn (Simmonds et al. 1987). De eerste stap in de evolutie naar de huidige eetbare, zaadloze

bananen was de ontwikkeling van de noodzakelijke factoren parthenocarpie en zaadsteriliteit in de M.

acuminata. Parthenocarpie is de capaciteit om vruchten te laten groeien en te vullen met eetbaar

parenchymatisch pulp zonder bevruchting terwijl zaadsteriliteit zaadvorming voorkomt (Simmonds et

al. 1987). Kruisingen binnen de M. acuminata leidden tot de homogenomische triploïde hybriden met

het AAA genotype die voornamelijk de zoete dessertbananen bevat. In de tweede stap gaven

kruisingen tussen diploïde en triploïde types van M. acuminata en M. balbisiana heterogenomische

triploïde hybriden zoals de platanen (AAB) en andere kookbananen (ABB). Het A genoom van M.

acuminata zorgde voor parthenocarpie en zaadsteriliteit terwijl het B genoom van M. balbisiana

bijdroeg aan tolerantie tegen abiotische stress (robuustheid, droogte tolerantie en ziekte resistentie)

en zetmeelinhoud (OGTR 2008; Perrier et al. 2009). Deze beide stappen gebeurden in Z.O. Azië

(Simmonds et al. 1987). Het succes van de triploïde AAA is te danken aan de grote groeikracht,

vruchtgroei en gametische steriliteit. Ongeveer 2000 jaar geleden werden deze bananen verspreid

naar Afrika en later door de Europeanen naar Amerika gebracht (Simmonds et al. 1987).

1.4.2. Cultivars Tabel 2 toont een overzicht van enkele belangrijke subgroepen en cultivars in de bananen.

De groep van de zoete (suiker) dessertbananen (AAA) bevat o.a. bekende variëteiten van de

subgroepen Gros Michel en Cavendish. De Gros Michel werd tot de jaren 1960 het meest gebruikt voor

6 A. Literatuur

export, dit is een ideale exportbanaan want hij produceert grote trossen van grote, smaakvolle zoete

vruchten die goed mechanische schade aankunnen en daardoor intact konden verscheept worden

(Bakry et al. 2009; Ploetz 2005b). Maar toen de race 1 van de panama ziekte de grote plantages van

Gros Michel vernietigde werd de commerciële exportproductie op grote schaal onmogelijk. De Gros

Michel werd vervangen door de resistente maar minder smaakvolle en kwetsbaardere Cavendish. De

naam Cavendish is afkomstig van Lord Cavendish (Duke of Devonshire) die planten verkreeg en ze

verder opkweekte in zijn serres in Engeland (OGTR 2008). De cultivars in de subgroep Cavendish

verschillen van elkaar enkel door mutaties (Bakry et al. 2009; Robinson en Saúco 2010), enkele

belangrijke die onderscheidbaar zijn door o.a. de hoogte zijn volgens afnemende hoogte ‘Lacatan’,

’Robusta’, ‘Valéry’, ‘Giant Cavendish’, ‘Grand Naine’ en ‘Dwarf Cavendish’ (Bakry et al. 2009; Heslop-

Harrison en Schwarzacher 2007). De ‘Dwarf Cavendish’ is de meest verspreide kloon van eetbare

bananen wereldwijd en is de kleinste commerciële cultivar (Ploetz et al. 2007; Robinson en Saúco

2010). Deze vertoont de mutatie dwarfisme (OGTR 2008) en is daardoor makkelijker te oogsten. Deze

cultivar domineerde de banaanindustrie in subtropische landen, maar door zijn gevoeligheid aan de

fysiologische misvorming ‘choke throat’ (waarbij het verschijnen van de tros verhinderd wordt) werd

deze langzaam vervangen door grotere Cavendish cultivars zoals de ‘Grand Naine’ (Robinson en Saúco

2010). De ‘Grand Naine’ (letterlijk vanuit het Frans grote dwerg) is de belangrijkste commerciële kloon

wereldwijd omwille van zijn hoge windresistentie en de productie van grote trossen met grote

bananen ondanks de relatief kleine omvang van de plant (Ploetz et al. 2007). De Cavendish subgroep

is tegenwoordig de belangrijkste subgroep voor zowel productie als export wereldwijd (Robinson en

Saúco 2010) maar door de zeer smalle genetische basis is deze overgeleverd aan de ontwikkeling van

nieuwe pathogenen (Bakry et al. 2009).

Binnen de kookbananen (ABB, AAB) vormen de platanen (AAB) een specifieke subgroep (Valmayor et

al. 2000). Kookbananen zijn zetmeelhoudend en worden vooral lokaal geconsumeerd. Een bekende

variëteit is de ‘Bluggoe’. De algemene term plataan wordt enkel gebruikt voor een specifieke subgroep

van kookbananen, anderzijds is de term banaan niet gelimiteerd tot dessertcultivars maar omvat ook

de kookbananen, inclusief platanen (Valmayor et al. 2000).

Tabel 2 Overzicht van de belangrijke subgroepen/cultivars in de bananen met het gebruik en de genomische groep (Bakry et al. 2009; OGTR 2008; Ploetz et al. 2007).

Genomische groep Subgroep Cultivar Gebruik

AA Sucrier ‘Sucrier’ Dessert

AAA Cavendish Gros Michel Red Highland East African Banana

‘Dwarf Cavendish’, ‘Grand Naine’ ‘Gros Michel’ ‘Red Dacca’

Dessert Dessert Dessert Koken/Bier

AB Ney Poovan ‘Lady’s Finger’ Dessert (zoetzuur)

AAB Silk Pome Mysore Pisang Plantain Maoli-Popoulu

‘Sugar’ ‘Lady’s Finger’ ‘Mysore’ ‘French’ ‘Pacific Plantain’

Dessert (zoetzuur) Dessert (zoetzuur) Dessert (zoetzuur) Dessert (zoetzuur) Koken Dessert/Koken

ABB Pisang Bluggoe Ney Mannan

‘Ducasse’ ‘Bluggoe’ ‘Blue Java’

Dessert Koken Dessert/Koken

AAAB ‘Goldfinger’, ‘Bananza’

Dessert/Koken

A. Literatuur 7

1.4.3. Veredelingsdoelstellingen In veredelingsprogramma’s wordt prioriteit gegeven aan de ontwikkeling van variëteiten met

resistentie tegen ziekten en plagen. De secundaire objectieven zijn gelinkt aan socio-economische

aspecten van productie en natuurlijke gevoeligheid van variëteiten. Voor exportbananen zijn vroege

bloei, hoge opbrengst, perfecte cilindrische vruchttrossen en uniformvormig fruit voor verpakking en

vermarkting belangrijk. Voor binnenlandse handel moeten variëteiten hoge tolerantie tegen biotische

en abiotische stress en een sterk wortelsysteem voor bodemverankering en effectieve opname van

water en mineralen hebben. Ze moeten primitief transport en bewaring verdragen. Kleine variëteiten

zijn minder gevoelig aan windvlagen die kunnen zorgen voor breuk van de pseudostam en zelfs de

planten ontwortelen (Bakry et al. 2009).

1.5. Teelt Bananen worden geteeld in tropische en subtropische gebieden over de hele wereld tussen 30°

noorder- en zuiderbreedte (Morton 1987; OGTR 2008). De ideale temperatuur voor de vegetatieve

groei is 26 tot 28°C en voor vruchtvorming 29 tot 30°C, onder 13 °C kan er koudeschade en

weefselnecrose optreden (Nelson et al. 2006). De minimum neerslaghoeveelheid voor een succesvolle

commerciële plantage is ongeveer 2000 mm per jaar, redelijk gelijk verspreid over het jaar en er is

geen maximale neerslaglimiet indien de bodem goed draineert (Nelson et al. 2006). Een bodem pH

van 5.5 tot 7.5 is geschikt voor de teelt van bananen waarbij 5.5 het optimum is (Nelson et al. 2006;

OGTR 2008). De grote bladeren zijn gevoelig voor hevige wind waarbij de bladeren langs de nerven

worden ingedeeld in kleine delen (OGTR 2008).

Bananen worden vegetatief vermenigvuldigd door scheuten, die zich naast de moederplant uit de

rhizoom ontwikkelen, te verplanten, of via in vitro weefselcultuur (Ploetz 2005a). In vitro

weefselcultuur vermenigvuldigingssystemen werken zeer efficiënt in Musa. Deze geven planten van

uniforme, hoge kwaliteit, vrij van ziekte en nematoden (Heslop-Harrison en Schwarzacher 2007), ze

vertonen een betere groei, kortere groeicyclus en een meeropbrengst van 39 % vergeleken met

scheuten (Bhanusree et al. 2015).

De opbrengst hangt sterk af van de teeltmethode en cultivar. Bijvoorbeeld voor een commerciële

plantage met de cultivar ‘Grand Naine’ met een plantdensiteit van 1750 vruchtdragende planten per

hectare kan de opbrengst tot 40 ton per hectare per jaar zijn. Hogere opbrengsten zijn mogelijk in

productieve commerciële ratoon gewassen (Nelson et al. 2006).

1.6. Productie en export Bananen, het belangrijkste fruit wereldwijd (Bakry et al. 2009; FAOSTAT 2015), worden geteeld in 135

landen en territoriums (FAO 2014b; Kumari en Kumar 2015). Het is het achtste belangrijkste voedsel

gewas in de wereld, het vierde meest belangrijke in de minst ontwikkelde landen (World Banana Forum

2016) en een basis voedsel voor 400 miljoen mensen (BTC 2011). De wereld productie was 107 miljoen

ton bananen in 2013 met als belangrijkste productieregio’s Azië (56 %), America (25 %) en Afrika (17

%) en de belangrijkste productielanden waren in dalende volgorde India, China, de Filipijnen, Brazilië

en Ecuador (FAOSTAT 2015). De regio’s van de banaanproductie staan afgebeeld in Figuur 2. Daarnaast

bedroeg de wereldwijde productie van kookbananen 38 miljoen ton in 2013 waarvan 73 % in Afrika

(FAOSTAT 2015). De belangrijkste groepen van (kook)bananen voor de productie zijn Cavendish (44

%), andere dessertbananen (12 %), kookbananen (26 %) en platanen (18 %) (Lescot 2008).

In 2013 werden 21 Mt bananen geëxporteerd (20 % van de totale productie) en de grootste

exportlanden van eigen gekweekte bananen waren Ecuador (27 %), de Filipijnen (16 %), Guatemala

(10 %), Costa Rica (9 %) en Colombia (8 %) (FAOSTAT 2015). De exportmarkt wordt gedomineerd door

enkele grote multinationals zoals de Amerikaanse bedrijven Chiquita (13%), Del Monte (12%), Dole

8 A. Literatuur

(11%) en het Ierse Fyffes (6%) (FAO 2014a). Noord-Amerika en de EU zijn de grootste

consumentenmarkten voor exportbananen (Robinson en Saúco 2010). 95 % van de export bestaat uit

Cavendish, de rest zijn andere dessertbananen zoals ‘Red bananas’ (AAA), Sucrier of babybanaan (AA),

en Appel of Manzana (AAB) die voor hoge prijs verkocht worden in speciaalzaken (Robinson en Saúco

2010).

Figuur 2 Regio’s van de wereldwijde banaanproductie (Monfreda et al. 2008).

1.7. Plagen en ziekten De tropische en subtropische omgevingen ideaal voor de bananenteelt zijn tegelijkertijd gebieden met

hoge ziekte- en plaagdruk (Pillay en Tenkouano 2011).

Ziekten zijn één van de meest beperkende factoren in de productie (Ploetz 2005b). De schimmelziekten

panama ziekte (Fusarium oxysporum f. sp. cubense), yellow sigatoka (Mycosphaerella musicola) en

black sigatoka (Mycosphaerella fijienis), en de bacteriële ziekten Moko disease (Ralstonia

solanacearum race 2) en banana Xanthomonas wilt (Xanthomonas vasicola pv. musacearum) zijn met

voorsprong de belangrijkste ziekten in Musa wereldwijd (Pérez-Vicente et al. 2014; Pillay en

Tenkouano 2011). De bladziekte black sigatoka geeft grote opbrengstverliezen tussen 20 en 70 % en

bestrijding gebeurt met milieuonvriendelijke en dure fungiciden waarbij de kost tot een kwart van de

productiekost kan bedragen (Heslop-Harrison en Schwarzacher 2007; Marin et al. 2003). Banana

bunchy top disease en banana streak disease met als vector respectievelijk de bananen bladluis en

wolluizen zijn de belangrijkste virusziekten (Nelson et al. 2006; Pillay en Tenkouano 2011).

De nematoden Radopholus similis en Helicotylenchus multicinctus veroorzaken wortellesies gevolgd

door toppling disease. De belangrijkste insecten zijn de bananen bladluis (Pentalonia nigronervosa),

de banana scab moth (Nacoleia octasema) die zich voedt op de ontwikkelende vruchten en de kever

banana weevil (Cosmopolites sordidus) (Nelson et al. 2006). Deze kever wordt gevonden overal waar

banaan groeit en beweegt zich doorheen de bodem, voedend op de wortels en de rhizoom van de

planten (Gold et al. 2001).

A. Literatuur 9

2. Panama ziekte Panama ziekte, de Fusarium verwelkingsziekte die banaan treft, is één van de meest vernietigende

plantenziekten in de geschiedenis (Moore et al. 2009; Pillay en Tenkouano 2011). Panama ziekte wordt

beschouwd als één van de meest vernietigende ziektes in banaan in de geschiedenis van de landbouw

en het is nog steeds de meest belangrijke bananenziekte (Kumari en Kumar 2015).

2.1. Fusarium verwelkingsziekte De verwekker van Fusarium verwelkingsziekte is Fusarium oxysporum (Fox). De taxonomische positie

van deze schimmel is als volgt: Domein: Eukaryoot; Koninkrijk: Schimmel; Fylum: Ascomycota; Klasse:

Ascomycetes; Subklasse: Sordariomycetidae; Orde: Hypocreales (Pérez-Vicente et al. 2014). Deze soort

bestaat uit vnl. saprofytische isolaten maar bevat vele plantpathogenen die vasculaire verwelking en

rot veroorzaken (Ploetz 2006). Fox is wereldwijd verspreid en is een vaak voorkomende

bodemgebonden plantpathogeen, deze soort is de meest beschadigende soort van het geslacht vanuit

het perspectief van de plantenziekten (Smith 2007) en zorgt waarschijnlijk voor de meeste

economische schade aan landbouwgewassen van alle plantpathogenen (Correll 1991; Ploetz 2005a).

Fox wordt gezien als een pionier schimmel omdat deze niet in staat is door andere bodemorganismen

eerder gekoloniseerd organisch materiaal te koloniseren (Park 1959). Het heeft enkel een

ongeslachtelijke vorm (anamorf) (Fourie et al. 2011) die drie typen sporen produceert: ovale

microconidiën, banaanvormige macroconidiën en dikwandige chlamydosporen. De macroconidiën zijn

puntig aan het uiteinde, de soortnaam ‘oxysporum’ vertaalt ruwweg naar gepunte sporen (Smith

2007).

2.2. Indeling Fusarium oxysporum

2.2.1. Indeling Fox op basis van formae specialis Fox bestaat uit pathogene en niet-pathogene isolaten (Gordon en Martyn 1997), niet-pathogene

isolaten zijn degene waarvoor geen gevoelige waardplant gekend is (Lemanceau en Alabouvette 1993).

De plantpathogene isolaten worden ingedeeld in speciale vormen of ‘formae speciales’ (f. sp.)

naargelang de plantensoort waarop ze ziekte veroorzaken (Correll 1991; Fourie et al. 2011). Dit is niet

op genetische of taxonomische basis maar op basis van een pathogeniteitstest (Correll 1991). Meer

dan 150 formae speciales van Fox veroorzaken vasculaire verwelking bij bloeiende planten en ze

kunnen onderling niet morfologisch onderscheiden worden (Baayen et al. 2000). Zo groepeert

Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) alle Fox isolaten die pathogeen zijn op banaan. Andere

gewassen gevoelig voor Fox zijn o.a. tomaat (Fox f. sp. lycopersici) en erwt (Fox f. sp. pisi). Ook kan een

Fox meerdere gewassen aantasten zoals bij komkommer en meloen (Fox f. sp. cucumerinum) (Cafri et

al. 2005).

2.2.2. Indeling Foc op basis van races, VCG en productie vluchtige organische

componenten Foc is een genetisch diverse pathogeen, ontstaan door mutaties en horizontale genoverdracht, en

vertoont een klonale populatiestructuur (Ploetz 2006). Na indeling in formae specialis binnen Fox kan

een verdere indeling van isolaten in Foc gebeuren op basis van races (R), vegetatieve

compatibiliteitsgroepen (VCG) (Correll 1991; Fourie et al. 2011), productie van vluchtige organische

componenten en moleculaire karakterisatietechnieken (PaDIL 2016).

De opdeling van Foc in vier races gebeurt op basis van de pathogeniteit van een isolaat voor een

specifieke cultivar. Cultivars uit de subgroepen Gros Michel (AAA), Silk (AAB), Pome (AAB) en Latundan

zijn vatbaar voor Foc R1. R2 tast de subgroep Bluggoe (ABB) (Ploetz en Churchill 2011), andere platanen

en ‘Blue Java’ (ABB) aan. R3 infecteert Heliconia spp. (een sierplant) maar doordat deze geen ziekte op

banaan veroorzaakt, wordt deze niet meer in de Foc race structuur opgenomen (Fourie et al. 2011).

10 A. Literatuur

Als laatste zijn Cavendish (AAA) en alle R1 en R2 gevoelige cultivars vatbaar aan de nieuwe variant R4

(Fourie et al. 2011). R4 wordt onderverdeeld in subtropische R4 (ST4) en de zeer agressieve tropische

R4 (TR4). TR4 veroorzaakt ziekte in tropische omstandigheden en ST4 pas na een periode van

koudestress in de subtropen (Fourie et al. 2011; Ploetz 2006). Naast Heliconia spp. zijn ook nog andere

verwanten aan banaan gevoelig, zoals Abaca (M. textilis) die gevoelig is aan R1, Ensete ventricosum is

gevoelig aan R2 en M. schizocarpa (Pillay en Tenkouano 2011; Ploetz 2005a, 2006; Purwati et al. 2008).

Isolaten van Fox worden ook gegroepeerd op basis van vegetatieve compatibiliteit, dit laat een indeling

toe gebaseerd op de genetica van de schimmel i.p.v. de gastheer-pathogeen interactie, ook laat dit de

karakterisatie van niet-pathogene Fox toe in tegenstelling tot het races systeem (Correll 1991).

Vegetatieve compatibiliteit in Fusarium spp. wordt gecontroleerd door verschillende vegetatieve of

heterokaryon incompatibele loci (Correll 1991; Fourie et al. 2011). Twee individuen zijn vegetatief

compatibel en kunnen een stabiel heterokaryon vormen indien ze beide eenzelfde allel

gemeenschappelijk hebben voor elk vegetatieve incompatibele locus (Correll 1991). Het Puhalla

numeriek systeem voor classificatie (Puhalla 1985) beschrijft de opdeling, vegetatieve compatible

isolaten krijgen een VCG code bestaande uit een vier- of vijf-cijferig nummer waarbij de eerste drie

cijfers overeenkomen met de gastheerspecialisatie (dus formae specialis) en het (de) laatste cijfer(s)

met de individuele VCG binnen de formae specialis waarbij de eerste beschreven VCG “0” krijgt en de

volgende VCG opeenvolgend genummerd worden (Kistler et al. 1998). De formae specialis cubense

krijgt de code 012- (Kistler et al. 1998). Er zijn reeds 24 VCG voor Foc beschreven (Fourie et al. 2011; Li

et al. 2013a). Isolaten in VCG 0120, 0129, 01211 en 01215 omvatten de ST4 die geen ziekte geven op

Cavendish in de tropen (Fourie et al. 2011). Daarentegen geeft VCG 01213-01216 wel ziekte op

Cavendish in de tropen zonder koudestress en is gekend als TR4 (Bentley et al. 1998).

Voor Foc is de relatie tussen race en VCG zeer complex, meerdere races kunnen toebehoren aan een

VCG en meerdere VCG kunnen toebehoren aan een race (Correll 1991). Foc heeft een polyfyletische

oorsprong (Bentley et al. 1998), sommige VCG zijn taxonomisch dichter bij andere Fox f. sp. dan bij

andere Foc VCG (Baayen et al. 2000; Fourie et al. 2009; O'Donnell et al. 1998). Isolaten behorend aan

diverse VCG kunnen gegroepeerd zijn in hetzelfde race, dit suggereert dat pathogeniteit voor een

specifieke cultivar zich ontwikkelde door convergentie (Fourie et al. 2009; O'Donnell et al. 1998) of

door horizontale genoverdracht tussen leden van het Fox complex (Ma et al. 2010). Er zijn twee

hypotheses voor de origine van Foc. Volgens de eerste hypothese zou Foc samen geëvolueerd zijn met

zijn waard in Z.O. Azië vanwaar het werd geïntroduceerd naar nieuwe bananenproducerende landen

door verspreiding van geïnfecteerd plantenmateriaal. De tweede hypothese is dat de pathogeen

onafhankelijk evolueerde vanuit lokale populaties van Fox in verschillende landen waar ze een

geïntroduceerde waardplant aanvielen (Bentley et al. 1998). Resultaten van Bentley et al. (1998)

suggereren dat terwijl de meeste lijnen van Foc waarschijnlijk samen geëvolueerd waren met banaan

in Azië, andere lijnen zich waarschijnlijk onafhankelijk hadden ontwikkeld zowel binnen als buiten het

centrum van origine van de waardplant. De genetisch afstand tussen races suggereert dat R1 en R2

samen zouden ontwikkeld zijn, in tegenstelling tot R3 en R4 die beiden van een aparte origine zouden

zijn.

Moore et al. (1991) toonden aan dat Australische R1, R2 en niet-pathogene isolaten van Foc gekweekt

op een zetmeel medium geen detecteerbare vluchtige geur produceerden en gaschromatografieën

zonder pieken gaven, terwijl Australische R4 isolaten wel vluchtige geuren produceerden met

karakteristieke gaschromatogram profielen.

2.3. Geschiedenis Panama ziekte werd voor het eerst gerapporteerd in Australië in 1876 (Ordonez et al. 2015; Ploetz

2000; Ploetz en Pegg 1997). In 1890 werd de ziekte geobserveerd in de Gros Michel plantages van

A. Literatuur 11

Panama, het meest gevoelige gebied waarnaar de ziekte werd vernoemd, en Costa Rica waar het

ontwikkelde tot grote epidemieën in de 1900s die één van de ergste waren in de geschiedenis van de

landbouw (Ordonez et al. 2015). Pas in 1910 werd de schimmel F. oxysporum f. sp. cubense

geïdentificeerd als de oorzaak in Cuba, waarnaar de naam van de formae specialis werd vernoemd

door E. F. Smith (Ploetz 2005a). Voor 1960 was de exporthandel bijna volledig gebaseerd op Gros

Michel. Een oplossing was het opzetten van nieuwe plantages waar nog geen ziekte was vastgesteld,

maar door gebruik van besmet plantmateriaal bij het aanplanten geraakte de ziekte wijdverspreid en

veroorzaakte grote verliezen. De grond werd schaars. Door het uitroeien van de Gros Michel op deze

monoculturen werd de exporthandel verplicht over te schakelen op de resistente Cavendish subgroep

(Ploetz 2000). Door de verliezen in handel en de overgang op Cavendish bedragen de geschatte kosten

tot 1960 400 miljoen dollar, omgerekend naar 2000 zou dit een waarde betekenen van 2,3 miljard

dollar (Ploetz 2005b). Door de transitie van Gros Michel naar Cavendish daalde de belangstelling voor

onderzoek naar deze ziekte (Ploetz 2005b).

De geschiedenis dreigt zich echter te herhalen, net als de Gros Michel subgroep bestaat de Cavendish

subgroep uit mutanten afkomstig van een unieke kloon waardoor de commerciële plantages

vertrouwen op een gevaarlijk smalle genetische basis (Raboin et al. 2005). Dit komt tot uiting

aangezien in Azië de Cavendish sinds de jaren 1990 aangetast wordt door het nieuwe R4 en deze is

zich aan het verspreiden (Heslop-Harrison en Schwarzacher 2007). TR4 tast cultivars aan die instaan

voor 80 % van de wereldproductie (Ploetz 2005a). Als TR4 de belangrijke plantages in Latijns Amerika,

de Caraïben en West-Afrika binnengeraakt, dreigt de multi-miljard dollar productie en exportindustrie

een ramp te kennen, ook de voedselzekerheid voor miljoenen mensen afhankelijk van kleinschalige

productie is in gevaar (Dita et al. 2010; Ploetz en Churchill 2011). Er is echter nog geen gepaste

resistente cultivar tegen R4 (Ploetz 2000).

2.4. Geografische distributie

Figuur 3 De huidige geografische distributie van Foc TR4. De banaanproducerende landen zijn in donkergrijs gekleurd en de landen waar Foc TR4 is vastgesteld zijn met een rode driehoek aangeduid (ProMusa 2015).

Races 1 en 2 zijn wereldwijd verspreid in alle teeltgebieden van banaan (Pérez-Vicente et al. 2014).

Figuur 3 toont dat TR4 oprukt in Azië, Australië en Afrika maar nog niet is vastgesteld in Amerika. Deze

12 A. Literatuur

verspreiding is te wijten aan de antropogene verspreiding van geïnfecteerd plantenmateriaal dat vaak

nog geen symptomen vertoont (Radhajeyalakshmi et al. 2014).

2.5. Morfologie De schimmel produceert chlamydosporen, macro- en microconidiën voor vermenigvuldiging,

verspreiding en overleving (Pérez-Vicente et al. 2014; Pillay en Tenkouano 2011). Macroconidiën zijn

licht gekromd, tot bijna recht, met dunne wanden, met 3 tot 5 septa (meestal 3) (Figuur 4).

Microconidiën, meestal zonder septa, kunnen ovaal, elliptisch tot niervormig zijn en worden

ontwikkeld in valse hoofden. Chlamydosporen worden gevormd in hyfen of in conidiën, alleen of in

ketens, vaak in paren (Pérez-Vicente et al. 2014). Op potato dextrose agar (PDA) produceren

schimmelkolonies wit mycelium dat paars kan verkleuren in het centrum (Pillay en Tenkouano 2011).

Figuur 4 De reproductieve structuren van Fusarium oxysporum f. sp. cubense. (A) Macroconidiën (27-55 x 3.3-5.5 μm). (B) Microconidiën (5-16 x 2.4-3.5 μm). (C) Microconidiën gegroepeerd in valse hoofden. (D) Chlamydosporen (7-11 μm diameter). (E) Foc TR4 in PDA medium. (F) Oranje gekleurde sporodochia ontwikkeld in een PDA cultuur medium. (Pérez-Vicente et al. 2014).

2.6. Ziektecyclus

2.6.1. Levenscyclus Foc De levenscyclus van Foc (Figuur 5) bestaat uit een saprofytische en parasitaire fase (Lemanceau en

Alabouvette 1993). In de afwezigheid van de waardplant kan Foc overleven door als saprofyt te groeien

op organisch materiaal van plantenresten en door de vorming van chlamydosporen (Lemanceau en

Alabouvette 1993; Stover 1958) die zijn voornaamste overlevingsstructuur vormen en overleven in de

bodem tot 30 jaar (Ploetz 2000).

Het proces van infectie kan ingedeeld worden in verschillende stappen: (i) wortelherkenning,

vasthechting aan het worteloppervlak en kolonisatie, (ii) penetratie en kolonisatie van de cortex, en

(iii) hyfale proliferatie binnenin de xyleem vaten (Dong et al. 2012).

(i) Kieming van chlamydosporen wordt gestimuleerd door wortelexudaten van bananenwortels, dit

wordt versterkt door mechanische verwonding van de wortels. Chlamydosporen vormen kiembuizen

waaruit hyfen worden gevormd die in de intercellulaire ruimten langs verbindingspunten van

wortelepidermiscellen groeien en het worteloppervlak koloniseren (Yip et al. 2011).

(ii) Mogelijke invasiesites van Foc R4 zijn natuurlijke wonden aan de basis van laterale wortels of door

directe penetratie van wortelkapjes en de elongatiezone van epidermale cellen van bananenwortels

A. Literatuur 13

(Yip et al. 2011). Geprefereerde infectiesites op het worteloppervlak zijn de groeven langs

verbindingspunten van de epidermale cellen (Yin et al. 2011). Voordat epidermiscellen worden

gepenetreerd, zwellen hyfen op bij de penetratiesites. De gezwollen hyfen treden de epidermiscel

binnen door een smalle penetratieporie. Er worden geen appressoriën aangemaakt (Yip et al. 2011).

Gedurende de kolonisatie van de cortex is er productie van een netwerk van vertakte hyfen In de

cellen. Van in de cellen infecteert R4 naastliggende cellen door poriën in cel eindplaten. De schimmel

groeit dan inter- en intracellulair binnen cellen van de wortelepidermis en cortex. Bijna direct na

penetratie van de wortelcellen produceert R4 verdikte hyfen en microconidiën in de cellen. De verdikte

hyfen ontwikkelen in chlamydosporen die zowel intra- en intercellulair worden gevormd (Yip et al.

2011).

(iii) In de xyleemvaten verspreidt de schimmel zich in de plant door hyfale proliferatie en productie van

microconidiën (Dong et al. 2012). Hyfen groeien door het wortelsysteem naar de rhizoom waarbij

sporen worden geproduceerd (Yip et al. 2011). De vasculaire schimmel Fox kan zich zeer snel over

grote afstanden verplaatsen in de plant door de vorming van microconidiën die meegenomen worden

door de transpiratiestroom in het xyleem.

Deze pathogene fase eindigt met de dood van de zieke plant en de saprofytische fase start opnieuw

met de verspreiding van de schimmel (Lemanceau en Alabouvette 1993). Macroconidiën en

chlamydosporen worden meestal enkel op dode of stervende planten gevormd (Ploetz 2000).

Figuur 5 Levenscyclus en ziektesymptomen van Foc TR4. (A) Een bananenplant met initiële vergeling van de randen van oudere bladeren. (B-C) Secties van de pseudostam en (D) de rhizoom vertonen een roodbruine verkleuring (Muah en Kema 2013).

2.6.2. Reactie van de waard. Tegen Foc zijn er geen immune cultivars (Pegg en Langdon 1986). Ongeacht het pathotype of cultivar

kan de schimmel het vasculaire systeem van de wortel penetreren en er zich in vestigen (Pegg en

Langdon 1986), dit veronderstelt dus dat resistentie van de waard afhangt van de mogelijkheid de

14 A. Literatuur

invasie na infectie te beperken (Baayen en Elgersma 1985; Nasira et al. 2003). Infectie induceert een

resistentiereactie in cultivars met resistentiegenen, en dit voorkomt proliferatie van de pathogeen

door vorming van fysische barrières door de productie van gel, gom, callose, tylosen en door vasculaire

inzakking (Dong et al. 2012; Pegg en Langdon 1986). Gel en gom lokaliseren de pathogeen door de

conidiën te vangen in de vaten. De pathogeen wordt succesvol beheerst Indien de gel lang genoeg

aanwezig blijft opdat tylosen kunnen gevormd worden (Pegg en Langdon 1986).

Het mechanisme van verwelken en chlorose kan verklaard worden door verstopping van de vaten of

systemische toxiciteit. De verstoppingstheorie suggereert dat de xyleemvaten van zieke planten

verstopt raken met callose, tylose, gel, mycelium, micro- en macroconidiën waardoor watertransport

wordt verhinderd met watertekort en verwelking van de plant als gevolg. Geïnfecteerde planten

vertonen een hogere bladtemperatuur, verminderde stomatale geleiding en verdampingssnelheid

resulterend in minder waterverlies. De waterpotentiaal in zwaar zieke planten is significant lager en

het ongecontroleerde waterverlies wordt niet geregeld door de stomata. Gedurende de kolonisatie in

de plant kan de schimmel fytotoxische stoffen secreteren die de vitale activiteit van plantencellen

verminderen. De systemische toxiciteitstheorie suggereert dat een fytotoxische stof zoals fusaar zuur

het metabolisme van de geïnfecteerde plant verstoord (Dong et al. 2012). Meer productie van toxines

zoals fusaar en beauvericinezuur in het weefsel, waardoor de incidentie van ziektesymptomen

toeneemt en de verwelking versnelt, verhogen de pathogeniteit van Foc (Dong et al. 2012; Li et al.

2013b). Fusaar en beauvericinezuur werden teruggevonden in zowel de wortels, de pseudostam, het

blad en de vruchten (Dong et al. 2012; Li et al. 2013b) waarbij de hoeveelheden in de vruchten niet

schadelijk zijn voor menselijke en dierlijke consumptie, echter in de pseudostam zijn de hoeveelheden

duizendmaal hoger welk potentieel een gevaar kan opleveren voor dieren (Li et al. 2013b).

2.7. Symptomen Na infectie door Foc kan de ziekte zich variabel ontwikkelen, variërend van geen symptomen tot zware

rotting en verwelking (Yin et al. 2011). Figuur 5 toont de symptomen van panama ziekte. De interne

symptomen die deze ziekte veroorzaakt zijn een bruine verkleuring van de wortels, vervolgens van de

rhizoom en de bladscheden van de pseudostam. Externe symptomen zijn de vergeling van de oudste

bladeren en later overgaand op de jonge bladeren gevolgd door afsterven van de bladeren, doorbuigen

aan de petiool en neerwaarts afhangen waarbij een rok van dode bladeren rond de pseudostam

achterblijft (Pérez-Vicente et al. 2014; Ploetz 2000). De jonge bladeren vertonen als laatste

symptomen, de groei stopt niet in een geïnfecteerde plant maar nieuwe bladeren kunnen kleinere

bladlamina hebben en verschrompeld of misvormd zijn (Pérez-Vicente et al. 2014). De basis van de

pseudostam kan splitten en uiteindelijk sterft de plant (Pérez-Vicente et al. 2014; Ploetz 2000). Het

fruit (Pérez-Vicente et al. 2014) noch planten jonger dan vier maanden vertonen symptomen (Ploetz

2000). Er zijn geen verschillen in symptomen tussen verschillende races van Foc in Musa (Pérez-Vicente

et al. 2014).

Doordat Moko ziekte vergelijkbare symptomen heeft kan deze verward worden met de panama ziekte.

Moko ziekte geeft echter ook verkleuring en rotten van het fruit, geeft ook op jonge planten

symptomen, symptomen gaan eerder over van jong naar ouder blad en bacterieel uitsijpelend vocht

kan worden waargenomen op gesneden oppervlakken (Pérez-Vicente 2004; Pérez-Vicente et al. 2014;

Ploetz 2000).

2.8. Verspreiding De studie van Meldrum et al. (2013) toont aan dat nieuwe met TR4 geïnfecteerde planten uitstralen

vanuit een initieel geïnfecteerde plant in het veld (plant tot plant verspreiding), maar doordat er in het

A. Literatuur 15

veld ook geïsoleerde zieke planten kunnen voorkomen, zijn er wellicht ook nog andere mechanismen

van verspreiding.

Lokale (op de plantage) of verspreiding over lange afstand (andere plantages tot in andere landen) van

Foc gebeurt voornamelijk door geïnfecteerd, maar nog symptoomloos, plantenmateriaal (Pérez-

Vicente et al. 2014). Verplaatsen van potentiële gastheren, zoals bepaalde onkruiden (Hennessy et al.

2005), wilde bananen en hun verwanten (Waman et al. 2013), en plantenresten kunnen bijdragen tot

de verspreiding. Foc kan via gecontamineerde grond op natuurlijke weg door stof via wind of erosie

door regenval verbreid worden. Orkanen, sterke wind en zware neerslag met als gevolg

overstromingen kunnen ook belangrijke verspreiders zijn. Ook door de menselijke invloed tijdens

landbouwwerkzaamheden waarbij grond aan gereedschappen, schoeisel en kleren kan blijven hangen

of gebruik van grond in substraten voor kwekerijen kunnen hiervoor verantwoordelijk zijn. Foc kan

snel verspreid worden door irrigatiewater, regenval of oppervlakkig drainagewater na regenval alsook

in rivieren tussen ziekte-geïnfecteerde en ziektevrije gebieden (Pérez-Vicente et al. 2014). Als laatste

kunnen dieren potentieel vector zijn van Foc. Zo kunnen de insecten banana weevil (Meldrum et al.

2013) en volwassen rouwmuggen extern sporen dragen en rouwmuglarven intern (Heyman en Höfte

2015).

2.9. Beheersingsstrategieën Beheersingsstrategieën kunnen onderverdeeld worden in drie categorieën, nl. voorkomen van

gevoeligheid aan de pathogeen door gebruik van resistente cultivars, vermijden van de aanwezigheid

van inoculum van de pathogeen en vermindering van ziekte indien de pathogeen wel aanwezig is.

2.9.1. Resistente cultivars Het beste middel tegen panama ziekte is het gebruik van resistente cultivars die weinig tot geen ziekte

vertonen tegen de pathogeen (Moore et al. 2009). Deze strategie was al eerder succesvol toen de R1

gevoelige Gros Michel vervangen werd door de R1 ongevoelige Cavendish. De commerciële waarde

van de Cavendish was echter lager dan die van de Gros Michel waardoor de transitie zolang mogelijk

werd uitgesteld (Ploetz 2000). Ook nu verloopt de transitie naar resistente cultivars om deze reden

traag bij de verspreiding van R4. Het vinden van de resistentiegenen verloopt moeilijk, o.a. doordat

verschillende races van Foc verschillende cultivars aanvallen en de onderliggende genen voor

resistentie in banaan en virulentie in Foc elke keer kunnen verschillen (Ploetz 2006). Een aantal wilde

soorten banaan hebben potentieel om als genetische bron gebruikt te worden voor resistentie tegen

TR4 (Li et al. 2015) en daarnaast worden cultivars en synthetische diploïden gebruikt in

veredelingsprogramma’s (Bakry et al. 2009).

De hoofdreden dat het moeilijk is de eigenschappen van ziekte resistentie en commerciële waarde te

verenigen in variëteiten is dat de meeste eetbare gecultiveerde bananen triploïd zijn, daardoor vaak

steriliteit vertonen en dus zelden zaden aanmaken. Dus is het moeilijk bananenplanten met resistentie

tegen Fusarium verwelking te ontwikkelen door gebruik te maken van conventionele

veredelingstechnieken (Chen et al. 2013) die afhangen van kruis-bevruchting tussen planten (Sun et

al. 2009). De veredelingsinstelling FHIA heeft een aantal resistente tot licht gevoelige cultivars

bekomen: ‘FHIA-01’ (‘Goldfinger’, AAAB), ‘FHIA-03’, ‘FHIA-17’, ‘FHIA-18’ (‘Bananza’, AAAB) en ‘FHIA-

25’ (Crane et al. 2005; Daly et al. 2006; OGTR 2008; Rowe 1994). Daarnaast is ‘Dong Guan Da Jiao’

(ABB) een voorbeeld van een lokale Chinese TR4 resistente cultivar (Chen et al. 2011).

Ook niet-conventionele technieken zoals biotechnologie, mutatieveredeling en somaklonale variatie

worden gebruikt in de ontwikkeling van resistente genotypen in veredelingsprogramma’s (Bakry et al.

2009; Hwang en Ko 2004). Zolang genetische transformatie van Cavendish geen routine is en effectieve

genen voor resistentie niet gevonden worden en getest in veldtesten hangt de toekomstige

16 A. Literatuur

verbetering voornamelijk af van op mutatie gebaseerde veredeling (Smith et al. 2006; Sun et al. 2009).

Gedurende in vitro weefselcultuur van bananen komen vaak somaklonale (vegetatieve kloon)

varianten voor (Sahijram et al. 2003) door het ontstaan van willekeurige mutaties en dit fenomeen is

geschikt voor de uitbreiding van de genetische variatie in de bananenveredeling (Chen et al. 2013). De

R4 resistente tot licht gevoelige somaklonale lijnen van ‘Giant Cavendish tissue-culture variants’

‘GCTCV-119’ en ‘GCTCV-218’ (‘Formosana’) werden ontwikkeld in Taiwan (Daly et al. 2006; Hwang en

Ko 2004). De tolerantie van ‘GCTCV-218’ aan ST4 kan verklaard worden door een verhoogde expressie

van genen die instaan voor celwand-geassocieerde fenolische componenten in de wortels (Van den

Berg et al. 2007). In vitro mutagenese geïnduceerd door chemische stoffen (zoals

ethylmethaansulfonaat, natriumazide en di-ethylsulfaat) leverde Foc tolerante planten van de Gros

Michel cultivar ‘Highgate’ op (Bhagwat en Duncan 1998; Chen et al. 2013). Ook kan in vitro mutagenese

geïnduceerd worden door fysische mutagenen zoals gammastraling waarbij de agronomische waarde

van de ST4 resistente Cavendish cultivar ‘Dwarf Parfitt’ verbeterd werd (Smith et al. 2006).

Fraser-Smith et al. (2016) hebben aangetoond dat resistentie in M. acuminata subsp. malaccensis

tegen zowel ST4 als TR4 gebaseerd is op één enkel dominant gen. De Cavendish gevoeligheid aan TR4

kan te wijten zijn aan de onderdrukking van de expressie van genen die invloed hebben op de

salicylzuur biosynthese. Geïnduceerde resistentie waargenomen in banaan tegen TR4 kan te wijten

zijn aan een salicylzuur-afhankelijk systemisch verkregen resistentie (Wang et al. 2015b). In

Arabidopsis thaliana beïnvloeden de salicylzuur, jasmijnzuur en ethyleen wegen positief de resistentie

tegen Foc (Radhajeyalakshmi et al. 2014). Exogeen toegediend methyl jasmonaat vermindert ziekte

incidentie door activatie van belangrijke enzymen in secundaire metaboliet biosynthetische wegen in

geïnduceerde systemische resistentie (ISR). Dit suggereert dat methyl jasmonaat betrokken is in de

activatie van een ziekte-gerelateerd verdedigingssysteem (Sun et al. 2013). Volgens Yip et al. (2011)

inhiberen wortelexudaten van zeer resistente cultivars kieming en groei van de pathogeen, die van

matig resistente cultivars verminderen sporenkieming en myceliumgroei terwijl gevoelige cultivars

geen effect hebben op kieming en groei van de schimmel.

2.9.2. Vermijden van inoculum Inoculum kan vermeden worden door gebruik van niet-geïnfecteerd land samen met gebruik van niet-

geïnfecteerd plantenmateriaal. Quarantaine maatregelen zijn belangrijk om verspreiding van de

pathogeen te vermijden. Volgens Waman et al. (2013) wordt de kweek, vermenigvuldiging en export

van sierplanten verwant aan banaan zoals Heliconia spp., Canna indica, Aglaonema pictum en

Hedychium coronarium het best vermeden in teeltgebieden van bananen aangezien deze soorten als

alternatieve gastheer kunnen dienen. Gebruik van suckers als plantenmateriaal geeft een risico

aangezien jonge planten nog geen symptomen vertonen. Om zeker te zijn van niet-geïnfecteerd

plantenmateriaal maakt men het best gebruik van in vitro weefselcultuur planten. Planten van in vitro

weefselcultuur hebben echter een verhoogde gevoeligheid aan Foc gedurende een aantal jaar na

uitplanten, wellicht door de afwezigheid van antagonistische micro-organismen (Smith et al. 1998). In

en tussen velden kan men de verspreiding van de pathogeen tijdens plantage bewerkingen beperken

via oppervlaktesterilisatie van machines en schoeisel, een geschikt middel is het quaternair ammonium

component bevattende ‘Sporekill’ (Meldrum et al. 2013).

2.9.3. Vermindering van ziekte Er zijn geen structurele verschillen tussen de xyleemelementen van resistente en gevoelige cultivars,

het cruciale verschil is de snelheid waarmee de gastheer reageert op de invasie (Pegg en Langdon

1986). De tijd tussen initiële infectie of invasie van de pathogeen en de resistentiereactie van de waard

bepalen het succes of falen van de pathogeen. De reactietijd wordt bepaald door de mogelijkheid van

de waard om direct opgeslagen energiereserves te mobiliseren voor de resistentiereactie. Planten die

A. Literatuur 17

in staat zijn om de energiereserves bovenop de primaire metabolische noden voor groei en

reproductie op pijl te houden, zijn in staat om snel de nodige resistentiecomponenten of secundaire

metabolieten te produceren in de verdediging tegen de pathogeen (Daniells 2010).

Verdedigingsmechanismen van de waard (o.a. vorming van gel, tylosen, fenolische componenten) die

de invasie van de pathogeen beperken zijn vooral gedreven door fotoassimilaten, enerzijds uit

voorraad of door huidige fotosynthese (Smith et al. 1998). In het algemeen zijn snel groeiende planten

met een diep wortelsysteem, groeiend in een gepast klimaat, goede luchtige vruchtbare bodem met

de gepaste vochtigheid, minder vatbaar voor pathogene vormen van Fox dan traag groeiende planten

in ondiepe, zure bodems onder te warme of te koude omstandigheden, en vooral planten vertraagd

door nematodeninfecties of andere problemen. Sterke planten zijn in betere conditie om de nodige

componenten te produceren om zich te verdedigen tegen de pathogeen (Smith 2007). Het

minimaliseren van abiotische stress (koude, slechte drainage) is belangrijk in de gevoeligheid van een

plant (Pegg en Langdon 1986).

Vermindering van ziekte indien de pathogeen wel aanwezig is kan o.a. door gebruik van rotaties met

niet-waardplant gewassen zoals ananas (Wang et al. 2015a) en Chinese bieslook (Allium tuberosum)

(Huang et al. 2012). Wortelexudaten van Chinese bieslook inhiberen de kieming en groei van TR4,

initiëren de accumulatie van reactieve zuurstofspecies, en brengen een vermindering in de

mitochondriale transmembraanpotentiaal te weeg (Zuo et al. 2015). De vraag naar Chinese bieslook is

echter veel beperkter dan van banaan. Gewasrotatie is dus niet effectief in management van Fusarium

verwelkingsziekte in grote plantages (Moore et al. 2009). Toevoegen van verscheidene organische

materialen zoals groenbemesters en compost hebben hoogstens beperkt succes of zijn ineffectief om

de plant te bevoordeligen tegenover de pathogeen (Moore et al. 2009; Rishbeth en Naylor 1957; Smith

2007). Toediening van silicium aan bananenplanten heeft potentieel in vermindering van ziekte

(Fortunato et al. 2012). Toevoegen van bepaalde ijzerchelaten, calciumcarbonaat, calciumhydroxide

of calciumsulfaat aan bodem vermindert kieming van chlamydosporen en de hevigheid van ziekte door

Foc (Peng et al. 1999). Een hoge temperatuur en weinig verstoring (anaëroob) zorgen voor een

vermindering in de populatie van Foc. Bij braak leggen door onder water zetten is de maximale

overleving in verzadigde grond 6 weken en in 50 % verzadigde grond 7 weken (Stover 1954) maar dit

heeft slechts een tijdelijk effect (Moore et al. 2009; Smith 2007). Fungiciden hebben beperkt succes

en zijn ecologisch gezien onverantwoord (Thangavelu et al. 2004). Benomyl en de demethylering-

remmende fungiciden verminderen significant ziekte wanneer toegepast als worteldip en bepaalde

quaternair ammonium componenten zijn effectief als sterilisatiemiddel en zouden best de ineffectieve

sterilisatiemiddelen vervangen die momenteel gebruikt worden (Nel et al. 2007). De mate van ziekte

is afhankelijk van de bodem, zo zijn er ziektewerende bodems waar ondanks aanwezigheid van de

pathogeen weinig tot geen ziekte ontstaat.

2.9.3.1. Ziektewerende bodem Bepaalde bodems met fysische, chemische en microbiologische eigenschappen zijn in staat tot

beheersing van ziekteontwikkeling en andere zijn ziektebevorderend (Pérez-Vicente et al. 2014).

Ziektewerende bodems worden gedefinieerd als: “bodems waar de pathogeen zich niet kan vestigen

of overleven, vestigt maar weinig of geen schade veroorzaakt, of vestigt en kortstondig ziekte

veroorzaakt waarna de ziekte minder belangrijk is, hoewel de pathogeen kan overleven in de bodem.”

Daarentegen, ziektebevorderende bodems zijn bodems waar ziekte veelvuldig voorkomt (Baker en

Cook 1974; Weller et al. 2002). Ziektewerende bodems tegen Fusarium verwelking beperken ziekte

incidentie in vele economisch belangrijke gewassen zoals banaan, palm, katoen, vlas, tomaat en

meloen (Alabouvette et al. 1993). In banaan kan voor een gevoelige cultivar de productieve tijd in een

plantage geclassificeerd worden in kort- (3-10 jaar), intermediair- (10-20 jaar) en langlevend (>20 jaar),

dit komt overeen met de snelheid waarmee de ziekte zich verspreidt in een plantage en kan

18 A. Literatuur

gedefinieerd worden als de benodigde tijd tot wanneer meer dan de helft van de planten ziekte

vertonen (Stotzky en Torrence Martin 1963).

Bepaalde eigenschappen van de bodem bepalen het ziektewerend vermogen. Een toename van de

temperatuur verhoogt de kieming door chlamydosporen en infectie door Foc (Peng et al. 1999; Smith

2007) waardoor de wereldwijde klimaatopwarming de incidentie kan vergroten (Radhajeyalakshmi et

al. 2014). Organische en zware klei-textuur bodems vertonen minder ziekte incidentie (Geense et al.

2015; Pérez-Vicente et al. 2014; Rishbeth 1957). De klei verbetert de waterhoudende capaciteit, het

vasthouden van nutriënten en calciumionen voor de pH buffering en kan ook als matrix fungeren voor

het huisvesten van microflora antagonistisch tegen de pathogeen (Smith 2007). Vooral bodems die klei

van het type montmorilloniet bevatten zijn meer ziektewerend (Höper et al. 1995; Stotzky en Torrence

Martin 1963). Incidentie van panama ziekte stijgt met toenemende bodemzuurtegraad (Domínguez et

al. 2001; 1995; Morton 1987; Peng et al. 1999; Pérez-Vicente et al. 2014; Rishbeth 1957) terwijl de

kieming door chlamydosporen het grootst is bij een pH van 8 (Peng et al. 1999). Enkel op zeer

vruchtbare bodems kunnen planten na infectie van Foc herstellen (Rishbeth 1957). Stikstofbemesting

vergroot de gevoeligheid van bananen voor panama ziekte (Rishbeth 1957) en resulteert in een

vroegere verwelking (Rishbeth en Naylor 1957). Ammonium-stikstof, bv. in de vorm van ureum,

bevoordeligt Fusarium terwijl nitraat-stikstof de ontwikkeling van ziekte vermindert (Pérez-Vicente et

al. 2014; Smith 2007). De status van kalium in de bodem kan een indirecte invloed hebben op de

biologische mechanismen van ziekte uitdrukking (Domínguez-Hernández et al. 2010; Pérez-Vicente et

al. 2014), een bodem rijk in beschikbaar kalium is ziektewerend (Rishbeth 1957). Ziekte incidentie van

panama ziekte en de kieming door chlamydosporen daalt met afnemende ijzerbeschikbaarheid in de

bodem (Domínguez et al. 1995; Peng et al. 1999; Pérez-Vicente et al. 2014). In deze bodems kunnen

biologische controle organismen (BCO) aanwezig zijn.

2.9.3.2. Biologische controle organismen voor beheersing Fusarium Ziektewerende bodems hebben een hogere populatie van actinomyceten en bacteriën dan de

ziektebevorderende bodems die een hogere populatie van filamenteuze schimmels en gisten bevatten

(Peng et al. 1999). De toepassing van BCO, zoals niet-pathogene Fusarium en fluorescerende

pseudomonaden, verminderen de ernst van ziekte in gewassen (Alabouvette et al. 1993; Lemanceau

en Alabouvette 1993). Het combineren van antagonisten kan de consistentie van biologische

beheersing verbeteren, zoals de combinatie van niet-pathogene Fusarium sp. en P. fluorescens tegen

pathogene Fusarium sp. (Amir en Alabouvette 1993). Specifiek voor inhibitie van Foc in banaan zijn de

volgende organismen beschreven:

de arbusculaire mycorrhizae Glomus spp. (Jaizme-Vega et al. 1998)

de goedaardige endofyt, wortel en andere plantenweefsels koloniserende organismen (Fourie

et al. 2011), Trichoderma sp. (Nel et al. 2006) waaronder isolaten van T. harzianum

(Thangavelu et al. 2004) en T. viride (Batasa en Baliad 2005; Thangavelu et al. 2010)

niet-pathogene Fox isolaten (Nel et al. 2006)

de rhizosfeer bacteriën Streptomyces sp. (Cao et al. 2005), waaronder isolaten van

Streptomyces violaceus niger (Getha en Vikineswary 2002), en Pseudomonas sp. (Belgrove et

al. 2011; Fishal et al. 2010; Mohandas et al. 2004; Nel et al. 2006; Selvaraj et al. 2014; Sivamani

en Gnanamanickam 1988; Thangavelu et al. 2003)

A. Literatuur 19

3. Biologische ziektebeheersing door fluorescerende pseudomonaden

3.1. Inleiding Pseudomonaden (Pseudomonas-achtige bacteriën) zijn chemo-organotroof staafvormige bacteriën

met polaire flagellen die allen behoren tot de proteobacteriën (Brock en Madigan 2012; Haas en

Défago 2005). Het zijn typische gram-negatieve bacteriën waarvan de celwand een unieke enveloppe

architectuur vormt bestaande uit een buitenste en binnenste membraan gescheiden door een

gelachtige periplasmatische ruimte welk een dunne laag peptidoglycaan bevat. De meerlagige cel

enveloppe beperkt de celgrootte en beschermt tegen omgevingsstress en voert belangrijke functies

uit zoals nutriënt opname, adhesie, secretie, signalering, pathogeniteit en bevat effluxpompen voor de

exclusie van antibiotica (Kahlon 2016).

Pseudomonas spp. worden gezien als de meest effectieve wortelkoloniserende groep van

bodemmicro-organismen dankzij hun vermogen nutriënten efficiënt op te nemen, dat snelle

wortelkolonisatie toelaat, en hun gastheer-bacterie terugkoppeling, die indirect en/of direct,

strategische verdedigingsmechanismen initiëren die de invasieve plantpathogeen beroven en

afbreken (Haas en Défago 2005; Kahlon 2016). Pseudomonaden hebben verschillende eigenschappen

dat ze geschikt maken als biocontrole en groeibevorderende agenten (Saharan 2011). Deze omvatten

de mogelijkheid tot (i) snelle in vitro groei en massaproductie; (ii) snel gebruik van zaad en

wortelexudaten; (iii) koloniseren en vermenigvuldigen in de rhizosfeer en in het binnenste van de

plant; (iv) productie van een breed spectrum aan bioactieve metabolieten (zoals antibiotica,

sideroforen, vluchtige stoffen en groeibevorderende stoffen); (v) agressieve competitie met andere

micro-organismen; en (vi) aanpassen aan omgevingsstress. Daarnaast zijn pseudomonaden

verantwoordelijk voor de natuurlijke ziektewerendheid van enkele bodems tegen bodempathogenen

(Weller et al. 2002). Het voornaamste nadeel van pseudomonaden als biocontrole agenten is hun

onbekwaamheid tot de productie van rustsporen, waardoor de formulering van de bacteriën voor

commercieel gebruik ingewikkeld wordt (Saharan 2011). Ook zijn er plantpathogene

pseudomonassoorten zoals P. syringae en P. marginalis (Brock en Madigan 2012).

3.2. Fluorescerende pseudomonaden De fluorescerende pseudomonaden behoren tot de fylogenetische γ-groep van de proteobacteriën

(Brock en Madigan 2012; Kahlon 2016). Deze bevat soorten zoals Pseudomonas aeruginosa, P.

fluorescens, P. putida, P. syringae en P. stutzeri en de meesten hiervan produceren geelgroene

fluorescerende pigmenten (Brock en Madigan 2012). P. aeruginosa is opportunistisch pathogeen voor

de mens in tegenstelling tot P. fluorescens die dit zelden is omdat het niet goed groeit bij 37°C (Brock

en Madigan 2012). Volgens Garrido-Sanz et al. (2016) is het P. fluorescens complex samengesteld uit

de vijf groepen P. putida, P. syringae, P. lutea, P. asplenii en P. fluorescens waarbij de P. fluorescens

groep een enorme diversiteit in zowel het aantal soorten als de afstand erbinnen vertoont en wordt

opgedeeld in de negen subgroepen P. protegens, P. chlororaphis, P. corrugata, P. koreensis, P. jesseni,

P. mandelii, P. fragi, P.gessardi en P. fluorescens. De fluorescerende pseudomonaden worden

gekarakteriseerd door de groene ultraviolette (UV) fluorescentie typerend voor de groep veroorzaakt

door een diverse klasse van chromofoor bevattende sideroforen (Kahlon 2016) en het zijn

alomtegenwoordige bodemorganismen en inwoners van de rhizosfeer. Ze zijn de grootste en

potentieel de meest veelbelovende groep van plantengroeistimulerende rhizobacteriën (Plant growth-

promoting rhizobacteria, PGPR) betrokken in de biocontrole van plantenziekten (Kahlon 2016;

Tambong en Höfte 2001). PGPR bevatten de fractie van de bacteriële populatie die zaadkieming,

plantengroei en ontwikkeling bevoordeligen door verhoging van de nutriënt beschikbaarheid of zelf

specifieke nutriënten te produceren (Kahlon 2016). In het bijzonder plant-begunstigende soorten zoals

20 A. Literatuur

P. fluorescens, P. protegens en P. chlororaphis beschermen de plant tegen belangrijke schimmelziekten

veroorzaakt door Gaeumannomyces sp., Thielaviopsis, Rhizoctonia, Pythium sp. en Fox (Kahlon 2016).

3.3. Ziektebeheersing

3.3.1. Rhizosfeerkolonisatie De rhizosfeer, gedefinieerd als de ruimte beïnvloed door het wortelsysteem, is de plaats waar

exudatie, nutriënt- en wateropname plaatsvinden en de activiteit van de microbiële populatie hoger is

dan in de omliggende bulkbodem (Kahlon 2016).

Voordat geïntroduceerde pseudomonaden bekwaam zijn de plantenwortels te beschermen tegen

pathogene aanvallen wordt het vermogen om de wortel te koloniseren aan hoge populatieniveaus in

competitie met gevestigde bodemmicro-organismen gezien als een belangrijke voorwaarde voor

effectieve biocontrole (Bull et al. 1991; Haas en Défago 2005; Kahlon 2016; Raaijmakers et al. 1999;

1995; Troxler et al. 1997) zoals aangetoond door Chin-A-Woeng et al. (2000) waar mutanten van P.

chlororaphis PCL1391 aangetast in hun capaciteit tot wortelkolonisatie hun biocontrole activiteit

verloren tegen tomaten voet- en wortelrot. De succesvolle rhizosfeer kolonisatie is een gevolg van een

delicaat evenwicht tussen biotische (de waardplant, het geïntroduceerde BCO, gevestigde rhizosfeer

en endofytische microbiota) en abiotische (bodemtype en structuur, water en nutriënten

beschikbaarheid, pH, temperatuur, samenstelling van wortelexudaten, etc.) factoren (Mercado-Blanco

en Bakker 2007). Effectiviteit van veel biologische controle eigenschappen zijn afhankelijk van de

bereikte populatieniveaus door de BCO op of in het specifieke doel niche, en sommige van deze

eigenschappen (bv. antibiotica productie, siderofoor-gemedieerde ijzercompetitie en ISR) zijn

onderhevig aan een cel-densiteit afhankelijke regulering (Haas en Défago 2005; Kahlon 2016; Leeman

et al. 1995; Raaijmakers et al. 1999; 1995; van Loon et al. 1998).

In de rhizosfeer worden Pseudomonas spp. vaak aangetroffen vlakbij het worteloppervlak, waar ze

microkolonies vormen, of als discontinue biofilms in de groeven tussen epidermiscellen, waar ze

endofytische kolonies vormen (Duijff et al. 1997; Kahlon 2016). P. fluorescens kunnen het

wortelsysteem binnendringen en koloniseren de intercellulaire ruimten van de buitenste corticale

cellen (M'piga et al. 1997; Mohandas et al. 2004). De populatie in de richting van de cortex regio van

de wortel is relatief groter vergeleken met de stele regio in banaan (Mohandas et al. 2004). Competitie

voor infectieplaatsen kan verantwoordelijk zijn voor zowel een lager aantal Foc als P. fluorescens

kolonies (Mohandas et al. 2004).

Indien biocontrole Pseudomonas isolaten bekwaam zijn weefsels in de waardplant extern of intern te

koloniseren en te overleven op of in die weefsels, dan kunnen ze diverse mechanismen inzetten die

bijdragen aan plantfitheid. Het uiteindelijke gevolg is verbetering van plantengroei door promotie van

groei of bescherming tegen plantpathogenen (Kahlon 2016).

3.3.2. Mechanismen in ziektebeheersing Ziektebeheersing door pseudomonaden kan gebaseerd zijn op direct antagonisme van de

plantpathogeen (productie van antibiotica) of indirecte mechanismen (competitie voor nutriënten en

niches of inductie van systemische resistentie) (Kahlon 2016; Lugtenberg en Kamilova 2009). Directe

en indirecte mechanismen sluiten elkaar niet uit en kunnen tegelijk opereren of geactiveerd worden

tijdens verschillende stadia (ruimtelijk en temporeel) in de plant-BCO-pathogeen interactie (Kahlon

2016).

3.3.2.1. Directe mechanismen in ziektebeheersing: Antibiose Antibiose is de productie van antimicrobiële componenten door BCO. In vele gewas-pathogeen

systemen zijn de primaire mechanismen van biocontrole door fluorescerende pseudomonaden de

A. Literatuur 21

productie van antibiotica, volgens Haas en Keel (2003) stoffen geproduceerd door bepaalde micro-

organismen die andere micro-organismen inhiberen of zelfs doden aan lage concentraties. De

belangrijkste zijn fenazinen, biosurfactanten, pyrrolnitrine, pyoluteorine, 2,4-di-acetylphloroglucinol,

waterstofcyanide en lytische enzymen (Haas en Défago 2005; Haas en Keel 2003; Kahlon 2016;

Tambong en Höfte 2001), een aantal staan afgebeeld in Figuur 6.

Figuur 6 Antimicrobiële componenten geproduceerd door fluorescerende pseudomonaden relevant voor biocontrole. Fenazinen (phenazine-1-carboxylzuur, phenazine-1-carboxamide, pyocyanine), 2,4-di-acetylphloroglucinol, pyoluteorine, pyrrolnitrine en cyclische lipopeptiden (vb. viscosinamide) zijn allen diffuseerbaar, daarentegen is waterstofcyanide vluchtig (Haas en Défago 2005; Haas en Keel 2003).

3.3.2.1.1. Fenazinen Sommige fluorescerende pseudomonaden produceren en excreteren fenazinen, dit zijn

gepigmenteerde, stikstofbevattende heterocyclische componenten met breedspectrum

antimicrobiële eigenschappen gekend voor hun antischimmel werking die myceliumgroei van

verschillende plantpathogene schimmels inhiberen (Anjaiah et al. 1998; D'Aes et al. 2011; Kahlon 2016;

Pierson en Pierson 1996; Tambong en Höfte 2001). De vaakst geïdentificeerde fenazine pigmenten

geproduceerd door Pseudomonas spp. zijn pyocyanine, phenazine-1-carboxylzuur (PCA), phenazine-1-

carboxamide (PCN), en een aantal hydroxy-phenazinen (D'Aes et al. 2011; Olorunleke et al. 2015b). De

productie van fenazinen kan essentieel zijn voor de biocontrole capaciteit van P. fluorescens (Tambong

en Höfte 2001). PCN geproduceerd door P. chlororaphis PCL1391 kan tomaten voet- en wortelrot,

veroorzaakt door Fox f. sp. radicis-lycopersici, controleren zowel in vitro als in planta en het fenazine

biosynthetisch operon komt tot expressie in de tomaten rhizosfeer (Chin-A-Woeng et al. 1998).

Fenazine productie draagt bij tot de biocontrole van Fusarium verwelking in kikkererwt (Fox f. sp.

ciceris) door P. aeruginosa PNA1 (Anjaiah et al. 1998). De betrokkenheid van fenazinen in de

ziektewerende capaciteit van Pseudomonas sp. CMR12a tegen Rhizoctonia solani op boon werd

22 A. Literatuur

aangetoond door D'Aes et al. (2011). PCA geproduceerd door P. fluorescens 2-79 is belangrijk in de

biocontrole van Gaeumannomyces-graminis var. tritici (Bull et al. 1991). Verschillende hypothesen

voor de actiemechanismen zijn inhibitie van DNA vermenigvuldiging, het loskoppelen van

elektronentransport en energieproductie, en verstoring van de normale functies van de membraan

(Pierson en Pierson 1996). Daarnaast kan gereduceerd PCN oplosbare Fe2+ ionen vrijgeven vanuit

onoplosbaar Fe3+(OH–)3 bij neutrale pH, dit geeft de mogelijkheid dat fenazinen bijdragen aan de

ijzermobilisatie in bodems (Haas en Défago 2005).

3.3.2.1.2. Biosurfactanten Biosurfactanten zijn microbieel geproduceerde amfifiele componenten met zowel hydrofiele als

lipofiele eigenschappen die de oppervlaktespanning verkleinen (D'Aes et al. 2011; Kahlon 2016). Deze

metabolieten kunnen geproduceerd worden door verscheidene Pseudomonas spp. (D'Aes et al. 2011).

De voorgestelde primaire werking van biosurfactanten is poriënvorming in membranen, resulterend

in een onevenwicht in transmembraan ionstromen en vernietiging van microbiële membranen met als

gevolg de dood van bacteriën, schimmels, oömyceten en virussen (Baltz 2009; Haas en Défago 2005;

Olorunleke et al. 2015b; Raaijmakers et al. 2010).

Pseudomonas biocontrole isolaten produceren vooral twee typen van biosurfactanten, rhamnolipiden

en cyclische lipopeptiden (CLP) (Olorunleke et al. 2015b) die beide antischimmel eigenschappen

kunnen hebben (D'Aes et al. 2011; Raaijmakers et al. 2006; Ron en Rosenberg 2001; Stanghellini en

Miller 1997). Rhamnolipiden zijn rhamnose-gebaseerde glycolipiden (Kahlon 2016) en zijn betrokken

in de biocontrole tegen de plantpathogenen Pythium myriotylum, Pythium splendens (Perneel et al.

2008), Botrytis cinerea (Varnier et al. 2009) en Phytophthora cryptogea (De Jonghe et al. 2005). CLPs

bestaan uit een cyclisch oligopeptide met een lipide staart en tonen surfactant, antimicrobiële,

antipredatie en cytotoxische eigenschappen (Kahlon 2016). CLPs worden volgens hun structuur

ingedeeld in verschillende groepen zoals de amphisine, viscosine, putisolvine, orfamide, tolaasine,

syringomycine, syringopeptine en entolysine groep (Gross en Loper 2009; Li et al. 2013c; Olorunleke

et al. 2015b; Raaijmakers et al. 2006; Roongsawang et al. 2011). CLPs zijn betrokken in de

ziektewerende capaciteit van Pseudomonas sp. CMR12a tegen Rhizoctonia solani op boon (D'Aes et al.

2011). Orfamiden hebben potentieel in de biologische controle van een breed spectrum aan schimmel

plantpathogenen zoals Magnaporthe oryzae, Rhizoctonia solani, Phytophthora en Pythium (Ma et al.

2016a). De drie voornaamste natuurlijke functies van lipopeptiden omvatten antagonisme tegen

(micro)organismen, motiliteit en vasthechting aan oppervlakken (Raaijmakers et al. 2010).

3.3.2.1.3. Pyrrolnitrine Pyrrolnitrine (PRN) is actief tegen Rhizoctonia spp., Fusarium spp. en andere plantpathogene

schimmels (Howell en Stipanovic 1979; Ligon et al. 2000) en remt schimmelgroei door inhibitie van het

ademhaling elektrontransportsysteem (Tripathi en Gottlieb 1969). PRN kan in de bodem tot 30 dagen

in vochtige, niet-steriele bodem overblijven zonder meetbaar verlies in activiteit (Howell en Stipanovic

1979). Synthetische analogen zoals fludioxonil en fenpiclonil worden gebruikt als fungicide in de

landbouw (Ligon et al. 2000).

3.3.2.1.4. Pyoluteorine Pyoluteorine (PLT) werkt inhiberend tegen bepaalde bacteriën en schimmels (Garrido-Sanz et al. 2016)

zoals Pythium ultimum (Howell en Stipanovic 1980) maar de werkingswijze is nog niet gekend (Haas

en Défago 2005).

3.3.2.1.5. DAPG 2,4-di-acetylphloroglucinol (DAPG) is actief tegen een breed spectrum aan micro-organismen en is

betrokken in de beheersing van vele plantenziekten (Keel et al. 1992; Weller en Thomashow 1993).

A. Literatuur 23

Het veroorzaakt schade aan de membraan van Pythium spp. en heeft vooral een sterke inhibitie op de

zoösporen (de Souza et al. 2003). De DAPG productie van de P. fluorescens isolaat Pfm beïnvloedt de

antischimmel activiteit tegen Foc, het toont een significante inhibitie op sporenkieming en groei van

Foc, en onderdrukt de vasculaire verkleuring in bananenplanten (Saravanan en Muthusamy 2006).

DAPG activiteit situeert zich in de mitochondriën waarbij het respiratie en ATP-synthese ontkoppelt

(Olorunleke et al. 2015b).

3.3.2.1.6. Waterstofcyanide Waterstofcyanide (HCN) is een vluchtig toxine met nematicide activiteit (Nandi et al. 2015) en de

productie draagt bij tot de biocontrole capaciteit van P. protegens isolaat CHA0 tegen zwart wortelrot

veroorzaakt door Thielaviopsis basicola in tabak (Laville et al. 1998; Voisard et al. 1989). Het cyanide-

ion afkomstig van HCN inhibeert sterk cytochroom-c-oxidasen, de terminale component van de

ademhalingsketen in vele organismen, en vele andere metallo-enzymen (Blumer en Haas 2000;

Olorunleke et al. 2015b).

3.3.2.1.7. Lytische enzymen Volgens Haas en Keel (2003) leiden de Pseudomonas antibiotica tot dusver behandeld aan een

gemeenschappelijke tekortkoming, ze werken niet specifiek tegen pathogene schimmels en ze zijn te

breedwerkend. Zo doden hoge dosissen van DAPG, PLT, fenazinen of viscosinamide de pathogenen,

maar zijn ook schadelijk voor vele planten. Een betere strategie kan zijn om te zoeken naar

Pseudomonas biocontrole isolaten die metabolieten produceren die specifiek schimmels inhiberen,

bijvoorbeeld door inhibitie van de synthese van glucaan of chitine. Op vergelijkbare wijze zouden

antischimmel enzymen zoals chitinasen, die worden geproduceerd door sommige biocontrole isolaten

van Pseudomonas spp., misschien meer voordelig benuttigd kunnen worden, in combinatie met

antischimmel antibiotica.

Een aantal micro-organismen produceren hydrolasen die een werking hebben op de celwand van

schimmels en dus de sporenkieming en groei van pathogene schimmels in de rhizosfeer beïnvloeden

(Kahlon 2016). Chitine, de voornaamste component van de celwand van schimmels bestaande uit een

onoplosbaar lineair polymeer van β-1,4-N-acetylglucoseamine, wordt afgebroken door chitinase en β-

1,3-glucanase (Labuschagne et al. 2011). Bepaalde isolaten van P. fluorescens hebben chitinolytische

activiteit (Nielsen en Sorensen 1999). P. stutzeri produceert extracellulair chitinase en laminarinase en

verteert en lyseert mycelium van Fusarium solani (Kahlon 2016; Mauch et al. 1988). Burkholderia

cepacia (voormalig P. cepacia) synthetiseert β-1,3-glucanase en beschadigt de integriteit van de

celwanden van Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii en Pythium ultimum (Fridlender et al. 1993; Kahlon

2016).

3.3.2.2. Indirecte mechanismen in ziektebeheersing

3.3.2.2.1. Competitie voor nutriënten en niche: Siderofoor-gemedieerde

ijzercompetitie Van de verschillende mechanismen van microbiële antagonisme speelt competitie voor nutriënten een

belangrijke rol in ziektebeheersing. Het belangrijkste nutriënt waarvoor fluorescerende

pseudomonaden in competitie gaan tegen andere micro-organismen is ijzer.

IJzer is een cofactor voor vele redox-afhankelijke enzymen en dus essentieel voor de meeste levende

organismen inclusief bacteriën (Youard et al. 2007). Het is noodzakelijk voor een aantal eiwitten in

aërobe respiratie en Pseudomonas behoort tot deze categorie van bacteriën (Kahlon 2016). Echter

ondanks de overvloedige aanwezigheid van ijzer, het vierde meest voorkomende element in de

aardkorst (Scavino et al. 2013), is het meestal limiterend in de omgeving door zijn lage oplosbaarheid

en hoge competitie door andere organismen (Kahlon 2016). Onder aërobe omstandigheden wordt vrij

24 A. Literatuur

ferro-ijzer (Fe2+) geoxideerd tot het zeer onoplosbare ferri-ijzer (Fe3+) en wordt daardoor

onbeschikbaar voor metabolisch gebruik door levende organismen (Neilands 1995; Scavino et al. 2013;

Youard et al. 2007). Verhoogde beschikbaarheid van koolstof of ijzer zorgt voor een toename van de

groei van de pathogeen en uiteindelijk ziekte hevigheid. Een lage concentratie van Fe3+ in oplossing

kan limiterend werken voor de kieming van Fusarium chlamydosporen en verhoogt daarmee de

natuurlijke ziektewerendheid van de bodem (Lemanceau en Alabouvette 1993).

IJzercompetitie is geassocieerd met de fysico-chemische en microbiologische karakteristieken van de

ziektewerende bodem (Baker et al. 1986). IJzerbeschikbaarheid kan verlaagd worden door de bodem

pH te verhogen waarbij de concentratie van Fe3+ in oplossing afneemt, door de gepaste

pseudomonaden te introduceren geselecteerd voor het efficiënt binden van ijzer of door gebruik van

een stabiel ijzerchelaat in de nutriëntenoplossing (Lemanceau en Alabouvette 1993). Toediening van

P. putida (geïsoleerd van een Fusarium werende bodem) of ijzerchelaten aan een ziektebevorderende

bodem maakte de bodem ziektewerend tegen Fusarium verwelkers op vlas, komkommer en radijs. Het

blijkt dus dat ijzercompetitie beheersing tegen Fusarium pathogenen kan induceren (Scher en Baker

1982).

Om Fe3+ te verkrijgen, hebben aërobe micro-organismen een opname strategie ontwikkeld die meestal

gebaseerd is op de synthese van de ijzer-chelaterende moleculen genaamd sideroforen (Lemanceau

en Alabouvette 1993; Youard et al. 2007). Sideroforen worden beschreven als water oplosbare, laag

moleculair gewicht, ijzerdragers of ijzer-bindende componenten en organische liganden met affiniteit

en specifieke ijzer-bindende capaciteit (Kahlon 2016; Kraemer 2004; Lemanceau en Alabouvette 1993).

Onder ijzerlimiterende groeiomstandigheden worden deze moleculen gesecreteerd naar de omgeving

waar ze Fe3+ chelateren en leveren het aan het bacteriële cytoplasma via specifieke membraan-

geassocieerde receptoreiwitten (Lemanceau en Alabouvette 1993; Youard et al. 2007). De efficiëntie

van de actieve opname van Fe3+ varieert naargelang de microbiële soort. Verschillende sideroforen

vertonen een verschillende affiniteit voor ijzer (Lemanceau en Alabouvette 1993). De meeste

sideroforen worden geproduceerd door de gram-negatieve Pseudomonas en Enterobacter genera

(Kahlon 2016; Tian et al. 2009).

Er is veel heterogeniteit en specificiteit in sideroforen geproduceerd door Pseudomonas spp. (Kahlon

2016). Fluorescerende pseudomonaden produceren verschillende sideroforen zoals een grote

verscheidenheid aan pyoverdine derivaten (soms ook pseudobactine genoemd), pyocheline,

azotobactin, salicylzuur en pseudomonine (Dave en Dube 2000; Hohlneicher et al. 1995; Kahlon 2016;

Leeman et al. 1996; Lemanceau et al. 1993; Mercado-Blanco et al. 2001; Scavino et al. 2013). Al deze

sideroforen dragen bij aan ziektewerendheid door ijzercompetitie (Scavino et al. 2013). Deze

sideroforen hebben een zeer hoge affiniteit voor ijzer en ontnemen andere micro-organismen (o.a.

pathogene schimmels) met een lagere affiniteit ervoor van dit essentiële nutriënt, vooral onder

ijzerlimiterende omstandigheden, en binden het aan specifieke oppervlakte opnamereceptoren

(Kahlon 2016). De afgifte van specifieke sideroforen begunstigt het wortelkoloniserend vermogen van

het biocontrole isolaat (Aeron et al. 2011). Sideroforen geproduceerd door P. putida bleken een hogere

ijzer stabiliteit te hebben dan sideroforen geproduceerd door verscheidene pathogene Fusarium

(Scher en Baker 1982). Ferripyoverdine, het complex van pyoverdine met Fe3+, heeft een hogere

stabiliteitsconstante (K = 1032) (Lemanceau en Alabouvette 1993) dan het complex van fusarinines, de

sideroforen van Fusarium spp. (Lemanceau et al. 1986), met Fe3+ (K = 1029) (Scher en Baker 1982)

waardoor fluorescerende pseudomonaden ijzer efficiënter mobiliseren dan Fusarium ssp. (Lemanceau

en Alabouvette 1993). Naast hun eigen sideroforen, kunnen Pseudomonas bacteriën ook sideroforen

geproduceerd door verschillende isolaten en soorten van Pseudomonas, andere bacteriën en

schimmels in de rhizosfeer zelf gebruiken (Loper en Henkels 1997, 1999). Elk van de op te nemen

A. Literatuur 25

sideroforen induceert een specifieke receptor en zorgt voor competitief voordeel voor Pseudomonas

in de omgeving (Kahlon 2016).

IJzerbeschikbaarheid kan verlaagd worden door gebruik van een stabiel ijzerchelaat in de

nutriëntenoplossing, eerder ijzer gebonden aan ethyleendiamine di (o-hydroxyfenylazijnzuur)

(EDDHA) (K = 1033,9) dan ijzer gebonden aan ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (K = 1027,3) (Scher

en Baker 1982). Fe-EDDHA kan worden opgenomen door de plant en het vrije EDDHA kan vervolgens

chelateren met ijzer in de bodem en de beschikbaarheid van ijzer in de rhizosfeer verminderen

(Lemanceau en Alabouvette 1993). Fe-EDDHA blijkt een hogere ijzer stabiliteit te hebben (K = 1033.9)

dan de sideroforen geproduceerd door verscheidene pathogene Fusarium (K = 1029) (Scher en Baker

1982).

3.3.2.2.2. Geïnduceerde systemische resistentie Niet-pathogene rhizobacteriën kunnen het rhizobacteriën-gemedieerde geïnduceerde systemische

resistentie (induced systemic resistance, ISR) induceren in planten dat fenotypisch vergelijkbaar is met

het pathogeen-geïnduceerde systemisch verkregen resistentie (systemic acquired resistance, SAR)

(van Loon et al. 1998). ISR is een belangrijk mechanisme in de biocontrole van plantpathogenen door

pseudomonaden (Duijff et al. 1993; van Peer et al. 1991) en zorgt voor biologische resistentie tegen

plantpathogenen door systemische inductie van onderliggende signaalwegen die leiden tot resistentie

tegen schimmels, bacteriën en virussen (Heil en Bostock 2002). ISR reflecteert fysiologische en

biochemische reacties van de waardplant, resulterend in de synthese en secretie van

verdedigingsmetabolieten (van Loon et al. 1998).

Formulering van bepaalde Pseudomonas isolaten aan de wortels van bananenplanten induceert

systemische resistentie door een verhoogde inductie van de verdedigingsenzymen peroxidase (PO),

fenylalanine ammonia lyase (FAL), polyfenol oxidase (PFO), chitinase en β-1,3-glucanase en een

toename van de concentratie aan fenolische componenten tegen o.a. banana bunchy top disease

(Kavino et al. 2008) en Foc (Fishal et al. 2010; Saravanan et al. 2004; Thangavelu et al. 2003). De

productie van PO en FAL is geassocieerd met een toename van lignificatie in de celwanden van de

wortels (Fishal et al. 2010). De mate van inductie verhoogt respectievelijk naarmate er enkel met Foc,

enkel met Pseudomonas en wanneer beide geïnoculeerd worden. Dus verhoogde activiteit van

verdedigingsenzymen en verhoogde concentratie van fenolische componenten kunnen helpen bij de

biocontrole tegen Foc (Saravanan et al. 2004; Thangavelu et al. 2003). Fenolische componenten, PO

en FAL enzymen (Kahlon 2016) zijn betrokken in het proces van versteviging van de celwand en gaan

daardoor penetratie van schimmels tegen (Peng en Kuc 1992; Saravanan et al. 2004). Fenolische

componenten zijn toxisch voor pathogenen (Niranjan Raj et al. 2006). FAL is één van de sleutelenzymen

in het metabolisme van fenylpropanoïde dat een belangrijke rol speelt in de biosynthese van fenolische

componenten (Daayf et al. 1997; Fishal et al. 2010; He et al. 2002; Kahlon 2016; Pereira et al. 2000;

Saravanan et al. 2004). Accumulatie van FAL kan mogelijk ook de hoeveelheid van het voor

schimmelgroei en ontwikkeling noodzakelijke fenylalanine verminderen (He et al. 2002). PO is

vastgesteld als één van de eerste enzymen die reageren en snelle verdediging geven tegen

plantpathogenen, het is een sleutelenzym dat de biosynthese van lignine uit fenolische componenten

katalyseert door de waterstofperoxide productie te verhogen (Bruce en West 1989; Fishal et al. 2010;

Graham en Graham 1991; Kahlon 2016; Kavino et al. 2008; Pereira et al. 2000; Saravanan et al. 2004).

Dit lignine zorgt voor het verdikken van de celwand waardoor schimmelpathogenen moeilijker kunnen

penetreren (Daayf et al. 1997; He et al. 2002; Saravanan et al. 2004). De rol van PFO in ziekte resistentie

is fenolische componenten te oxideren tot de vaak toxischer voor micro-organismen zijnde quinines

(Kavino et al. 2008; Saravanan et al. 2004), en is betrokken in de terminale oxidatie van ziek

plantenweefsel (Saravanan et al. 2004). ISR zorgt voor de accumulatie van pathogenese-gerelateerde

26 A. Literatuur

eiwitten zoals chitinase en β-1,3-glucanase die chitine en β-1,3-glucaan, belangrijke componenten van

celwanden van schimmels, kunnen hydrolyseren (Fishal et al. 2010; Heil en Bostock 2002; Kasprzewska

2003).

Daarnaast, hebben ISR-uitdrukkende planten de capaciteit om aminocyclopropaan-1-carboxylaat, een

essentiële precursor molecule voor de biosynthese van ethyleen, om te zetten, welk zijn werking heeft

als onderdrukker tegen plantpathogenen tijdens de initiële stadia van pathogene aanval (Niranjan Raj

et al. 2006; Pieterse et al. 2000). Pseudomonaden geassocieerd met planten beïnvloeden plantengroei

door modulering van plantregelingsmechanismen. Indool-3-azijn zuur geproduceerd door plant-

geassocieerde bacteriën heeft een diepgaand effect op groei en ontwikkeling van planten door de

fysiologische processen te controleren (Kahlon 2016; Lugtenberg en Kamilova 2009). Signaalmoleculen

zoals salicylzuur, jasmijnzuur en ethyleen spelen een rol in de regulering en inductie van basale

resistentie. Salicylzuur is een sleutelregulator van SAR, terwijl jasmijnzuur en ethyleen worden

geïnitieerd door ISR (Niranjan Raj et al. 2006).

De bacteriële determinanten die ISR kunnen teweegbrengen zijn o.a. lipopolysacchariden, sideroforen,

salicylzuur, flagellen (van Loon 2007; van Loon en Bakker 2003; van Loon et al. 1998), bepaalde CLPs

(Ongena et al. 2007) en DAPG (Iavicoli et al. 2003). Het duurt meestal enkele dagen tot een week

voordat SAR of ISR zich kan ontwikkelen (van Loon et al. 1998), zo was in de ontlokking van ISR

gemedieerd door P. fluorescens WCS374 tegen Fusarium verwelking van radijs, ten minste een dag

nodig voor de toepassing van de bacteriën voordat resistentie significant kon worden geïnduceerd

(Leeman et al. 1995). De initiële triggering van de plant geeft aanleiding tot een geïnduceerde staat en

zodra dit bereikt wordt is verdere bescherming onafhankelijk van de resterende populatie van de

inducerende bacteriën in de rhizosfeer (van Loon et al. 1998).

3.3.2.2.3. Fusaar zuur detoxificatie Detoxificatie en afbraak van virulentie factoren van pathogenen zijn belangrijke aspecten van

verschillende BCO. Burkholderia cepacia en Ralstonia solanacearum (beide werden eerder

geclassificeerd als Pseudomonas) hydrolyseren fusaar zuur, een fytotoxische stof geproduceerd door

Fusarium spp. (Kahlon 2016; Lemanceau en Alabouvette 1993). P. fluorescens Pf10 is in staat in

medium met fusaar zuur te groeien en te detoxificeren, de genen die dit mogelijk maken zijn

noodzakelijk om ziekte te verminderen want een isolaat met dit plasmide verminderde ziekte door Foc

in banaan met 50 % vergeleken met de zieke controle terwijl deze vermindering verloren ging indien

dit plasmide afwezig was (Thangavelu et al. 2001).

B. Doelstelling 27

B. Doelstelling Vanuit eerder onderzoek werden isolaten van fluorescerende pseudomonaden geïsoleerd uit

ziektewerende bodems. Het Zwitserse P. protegens isolaat CHA0 werd voor het eerst geïsoleerd van

de wortels van de tabaksplant (Nicotiana tabacum) in een ziektewerende bodem tegen zwart

wortelrot veroorzaakt door Thielaviopsis basicola (Iavicoli et al. 2003; Maurhofer et al. 1995; Stutz et

al. 1986). De Pseudomonas sp. CMR12a en CMR5c werden geïsoleerd van de rhizosfeer van de rode

cocoyam variëteit (Xanthosoma sagittifolium) van Kameroen op ziektewerende bodems tegen

cocoyam root rot disease veroorzaakt door Pythium myriotylum (Perneel et al. 2007). In plantentesten

geven zowel CMR5c als CMR12a een goede biocontrole activiteit tegen cocoyam root rot disease in

cocoyam (Perneel et al. 2007). CMR12a heeft voldoende antagonistische activiteit tegen Rhizoctonia

solani op boon (D'Aes et al. 2011) en Chinese kool (Olorunleke et al. 2015a). Ook Pseudomonas sp.

COW5 en COR35 werden geïsoleerd van Kameroense ziektewerende bodems van de cocoyam

rhizosfeer en konden in plantentesten met cocoyam root rot disease in cocoyam ziekte ontwikkeling

weren. Pseudomonas sp. NSE1 en NNC7 zijn afkomstig van de rhizosfeer van cocoyam vanuit

Nigeriaanse bodems (Olorunleke et al. niet gepubliceerde data). Al deze isolaten produceren

antimicrobiële componenten die betrokken kunnen zijn in de ziektewerende capaciteit, zo zijn de

fenazinen en CLPs geproduceerd door CMR12a belangrijk tegen Rhizoctonia solani op boon (D'Aes et

al. 2011).

De doelstelling van deze thesis was na te gaan of deze Pseudomonas isolaten ziektewerend konden

werken tegen Fusarium verwelkingsziekte in het gewas banaan. Volgende onderzoeksvragen werden

gesteld:

1. Welke biocontrole fluorescerende pseudomonaden kunnen de Fusarium verwelkingsziekte

van banaan beheersen?

a. Welke biocontrole fluorescerende pseudomonaden kunnen schimmelgroei door

verschillende races van Fusarium oxysporum f. sp. cubense inhiberen in vitro en is deze

inhibitie afhankelijk van het medium?

b. Welke biocontrole fluorescerende pseudomonaden kunnen ziektesymptomen van

Fusarium verwelkingsziekte in planta in het gewas banaan verminderen en is dit

afhankelijk van het substraat?

2. Komen de biocontrole fluorescerende pseudomonaden in een voldoende hoge

populatiedensiteit voor in de rhizosfeer van bananenwortels voor biocontrole capaciteit en is

dit afhankelijk van het substraat?

28 B. Doelstelling

C. Materiaal en methoden 29

C. Materiaal en methoden 1. Screening in vitro antagonisme tegen Foc In dit deel werd nagegaan of de gebruikte fluorescerende pseudomonaden in staat zijn de groei van

Foc in vitro te remmen. In de eerste in vitro test werd getest of bepaalde Pseudomonas isolaten Foc

konden inhiberen, de beste isolaten hiervan werden in de tweede in vitro test getest of het resultaat

afhankelijk was van het gebruikte medium.

1.1. Opkweek isolaten Foc en Pseudomonas Foc isolaten werden opgekweekt op petriplaten met Potato Dextrose Agar (PDA) (aanmaak in Tabel

B1) en geïncubeerd bij 28 °C. Pseudomonas isolaten werden bewaard bij -80 °C en werden opgekweekt

op petriplaten met vast Glucose Casamino acid Yeast extract agar (GCY) (aanmaak in Tabel B1) en

geïncubeerd gedurende 48 uur bij 28 °C en vervolgens werd met een steriele entnaald vloeibaar GCY

in proefbuizen met deze isolaten geïnoculeerd. Deze werden gedurende 24 uur op een schudder bij 28

°C opgekweekt.

1.2. Proefopstelling Op 90 mm petriplaten met PDA werd in het centrum een 3 mm mycelium plug van Foc aangebracht

met het mycelium aan de onderkant. Vervolgens werden de Pseudomonas isolaten in een streep

analyse in twee lijnen langs weerskanten van de plug aangebracht door met een pipet 5 µL

geïnoculeerd vloeibaar GCY op drie punten aan te brengen en te verbinden met een entnaald. Er werd

een assenkruis op de petriplaat getekend met als centrum de mycelium plug en als verticale as de

evenwijdige aan de streep analyse lijnen en horizontale as de loodrechte hierop (zie Figuur 7). Voor de

controle zonder Pseudomonas isolaat werd vloeibaar GCY gebruikt. Per behandeling waren er drie

herhalingen. De petriplaten werden geïncubeerd bij 28 °C. Op de tweede dag van incubatie werd op

de horizontale en verticale as aangeduid tot waar het mycelium gegroeid was en werd de horizontale

en verticale diameter van het mycelium gemeten met een digitale schuifmaat. Dit werd dagelijks

herhaald t.e.m. 6 dagen na incubatie.

Figuur 7 Proefopzet van de in vitro screening voor antagonisme door fluorescerende pseudomonaden tegen Foc. In het centrum van een petriplaat werd een 3 mm mycelium plug aangebracht met langs weerzijden de bacteriële oplossing in streep analyse (aangeduid met blauwe lijnen). Er werd een assenkruis getekend met als centrum de mycelium plug, de verticale as evenwijdig met de streep analyse en de horizontale as loodrecht op de verticale (zwarte lijnen). Dagelijks werd vanaf twee t.e.m. zes dagen na incubatie de horizontale en verticale afstand tot waar het mycelium gegroeid was aangeduid en werd de diameter van het mycelium gemeten langs de assen.

30 C. Materiaal en methoden

Om na te gaan of de bacteriën een fungistatisch (remmen schimmelgroei) of fungicide (schimmel

dodend) effect hadden werden op de petriplaten waar de schimmel stopte met groeien en waar na 9

dagen incubatie nog geen hergroei te zien was (want PDA is niet ideaal voor de bacteriën waardoor ze

verzwakten en de schimmel kon hergroeien) 3 mm mycelium pluggen genomen van de rand van het

mycelium langs beide kanten van de horizontale as en langs 1 kant van de verticale as en op PDA

geplaatst zonder de bacteriën. Er werd een assenkruis getekend en de lengte van beide diameters

werd gemeten na 1 en 2 dagen incubatie.

1.3. In vitro test 1 In de eerste in vitro test werd een screening op PDA medium uitgevoerd voor de Foc isolaten E, P7D, J3S en M27 (Tabel 4) met als behandelingen een controle zonder bacteriën en de gebruikte Pseudomonas isolaten CHA0, CMR5c, CMR12a, COR35, COW5, NSE1 en NNC7 (Tabel 3) in drie herhalingen.

1.4. In vitro test 2 De in vitro test 1 werd herhaald voor de vier Foc isolaten maar enkel voor de behandelingen met de

Pseudomonas isolaten CHA0, CMR5c, COR35 en COW5 omdat deze de beste inhibitie toonden in de

eerste in vitro test. Naast PDA werd dit ook uitgevoerd op malt extract agar (MEA) (aanmaak in Tabel

B1) omdat antagonisme medium afhankelijk kan zijn. De inoculatie van de bacteriën werd deze keer

sneller toegepast door met een entnaald direct van de vloeibare GCY bacteriëncultuur een streep

analyse uit te voeren i.p.v. eerst met de pipet op de petriplaat aan te brengen zoals in de eerste in vitro

test. Net als in het eerste experiment werd deze uitgevoerd in drie herhalingen.

2. Screening in planta antagonisme tegen Foc In deze testen werd nagegaan of er bepaalde fluorescerende pseudomonaden in staat waren de

symptomen van Fusarium verwelkingsziekte in planta te verminderen en of de populatie bacteriën in

de rhizosfeer voldoende groot was voor biocontrole activiteit. Het eerste experiment was verkennend,

in het tweede werd ook het effect van substraat getest en in het derde werd een betere wijze voor de

pathogeen inoculatie toegepast.

2.1. Opkweek bananenplanten

2.1.1. In vitro opkweek De bananenplanten werden in vitro vermenigvuldigd en opgekweekt. Het vermenigvuldigingsmedium

bevat per liter: 4.3 g Murashige and Skoog medium met vitaminen, 10 mg ascorbinezuur, 30 g sucrose,

2.25 mg cytokinine (benzylaminopurine, BAP), 0.175 mg auxine (indool-3-azijnzuur) en 2 g gelrite

gellan gom. Het proliferatiemedium was analoog behalve 0.225 mg BAP en 1.75 g actieve kool. Van

beide media werd de pH van het medium tot 5.7 gebracht met NaOH en HCl en vervolgens verhit in

een microgolfoven (1 minuut per 100 mL medium). Vervolgens werd het medium in glazen bokalen

gegoten (13 bokalen per liter medium), afgedekt met een deksel en geautoclaveerd.

Voor het behandelen van de scheuten werd in een laminaire flow gewerkt. Op, gedurende 1 uur aan

180 °C in een oven gesteriliseerd, papier werd met een gesteriliseerde pincet en scalpel de scheuten

van elkaar gescheiden en het necrotisch weefsel samen met blad en wortels verwijderd. De

overblijvende calli werden per 4 tot 6 in het medium in de bokalen geplaatst. Het deksel werd dicht

geschroefd en de bokaal bedekt met plastic folie. Deze werden in een groeikamer bij 25 °C en een

dag/nacht regime van 16/8 uur gehouden. Elke zes weken werd dit proces herhaald. Scheuten die

dienden gebruikt te worden voor de ex vitro opkweek werden eerst van het

vermenigvuldigingsmedium overgeplaatst op het proliferatiemedium.

C. Materiaal en methoden 31

Tabel 3 De Pseudomonas isolaten gebruikt in deze thesis met de taxonomie, de oorspronkelijke waardplant, de locatie van afkomst en de geproduceerde metabolieten relevant voor biocontrole. + = aanwezig; - = afwezig; CLP, cyclische lipopeptiden; WLIP, White line inducing principle; PCN, phenazine-1-carboxamide; PCA, phenazine-1-carboxylzuur; PLT, pyoluteorine; PRN, pyrrolnitrine; DAPG, 2,4-diacetylphloroglucinol; HCN, waterstofcyanide

Taxonomie Isolaat Waardplant Locatie Geproduceerde metabolieten Verwijzing

Groep Subgroep CLP fenazine PLT PRN DAPG HCN

P. fluorescens P. protegens CHA0 Tabak (Nicotiana tabacum)

Zwitserland orfamide A, B, C en G

+ + + + Ma et al. (2016a), Stutz et al. (1986)

P. fluorescens Pseudomonas sp. CMR5c Rode cocoyam (Xanthosoma sagittifolium)

Bokwai, Kameroen

orfamide B, D, E, F en G

PCN, PCA

+ + - + Ma et al. (2016a), Perneel et al. (2007)

P. fluorescens Pseudomonas sp. CMR12a Rode cocoyam Bokwai, Kameroen

orfamide B, D, E en G, sessiline

PCN - - - + D'Aes et al. (2011), Ma et al. (2016a), Perneel et al. (2007)

P. putida C COR35 Rode cocoyam Boteva, Kameroen

N3 Olorunleke et al. (niet gepubliceerde data)

P. fluorescens P. koreensis COW5 Witte cocoyam (Xanthosoma sagittifolium)

Boteva, Kameroen

N1 Olorunleke et al. (niet gepubliceerde data)

NSE1 Witte cocoyam Unudike, Nigeria

WLIP Olorunleke et al. (niet gepubliceerde data)

NNC7 Witte cocoyam Benue, Nigeria

Putisolvine Olorunleke et al. (niet gepubliceerde data)

Tabel 4 De Foc isolaten gebruikt in deze thesis met de oorspronkelijke waardplant of oorsprong, de locatie van afkomst en het race.

Foc isolaat Waardplant Oorsprong Locatie Race Verwijzing

E Embrapa Brazilië R1 Velkeneers et al. (2013) P7D Endofyt van Maçã Brazilië R1 Velkeneers et al. (2013) J3S Endofyt van Maçã R1 Heyman en Höfte (2015) M27 Cirad Taiwan TR4 Velkeneers et al. (2013)

32 C. Materiaal en methoden

2.1.2. Ex vitro opkweek Goed gewortelde planten van het proliferatiemedium werden vanuit de bokalen gehaald en het

medium werd van de wortels gewassen ter voorkoming van schimmelgroei. Potten en potgrond (twee

maal geautoclaveerd met een dag tussen) werden geautoclaveerd en hierin werden de planten

opgepot. De planten werden in een kleine serre, gemaakt met plastic folie, gebracht en deze werd in

de groeikamers geplaatst (temperatuur 24 tot 27 °C; dag/nacht regime 12/12 of 16/8 uur). Voor

geleidelijke acclimatisatie werden gaatjes in het plastic gemaakt naarmate de planten groeiden.

Wekelijks werd er bemest met Hoagland nutriëntenoplossing die als volgt gemaakt werd: zes

stockoplossingen werden apart aangemaakt en bewaard in een koude kamer (4°C):

1. KH2PO4 oplossing (136 g L-1),

2. MgSO4.7H2O oplossing (248,48 g L-1),

3. Ca(NO3)2.4H2O oplossing (236,15 g L-1),

4. KNO3 oplossing (101,1 g L-1),

5. Geautoclaveerde Fe-EDTA oplossing bestaande uit FeSO4 (7,2045 g L-1) en EDTA (9,306 g L-1),

6. Geautoclaveerde micro elementen oplossing bestaande uit boorzuur (2,68 g L-1), MnCl.4H2O

(1,81 g L-1), ZnSO4.7H2O (0,22 g L-1), CuSO4.5H2O (0,08 g L-1) en molybdeen zuur (0,02 g L-1).

De Hoagland oplossing werd gemaakt uit respectievelijk 1, 2, 5, 5, 4 en 1 mL van de 6 stockoplossingen

per liter. Pas wanneer de pseudostam minstens 10 tot 15 cm hoog was konden de planten gebruikt

worden voor de pathogeniteitstesten omdat kleinere planten nog een onderontwikkeld vasculair

systeem hebben. Deze hoogte werd bereikt vanaf 8 weken ex vitro opkweek.

2.2. Inoculatie

2.2.1. Inoculatie Foc

2.2.1.1. Methode 1: Conidiën inoculum Op een 9-14 dagen oude cultuur van Foc op PDA platen werd er 10 mL geautoclaveerd gedestilleerd

water gepipetteerd op het mycelium en met een drigalski spatel werden het mycelium en de sporen

losgemaakt. Vervolgens werd dit mengsel gefilterd doorheen een steriel filterpapiertje om de sporen

af te scheiden. De concentratie van de sporen werd bepaald met een Bürker-Türk telkamer en

vervolgens werd de concentratie aangepast tot 106 sporen mL-1, het substraat werd geïnoculeerd met

een concentratie van 5.104 sporen g-1 substraat.

2.2.1.2. Methode 2: Chlamydosporen inoculum Voor het maken van het chlamydosporen inoculum werd gedroogde tuingrond op drie opeenvolgende

dagen geautoclaveerd en vervolgens werd 200 g grond per bokaal geïnoculeerd met 10 mL van een

sporenoplossing gemaakt zoals in methode 1 en werd gedurende 4 weken geïncubeerd bij 22°C met

losgeschroefd deksel om de bodem te laten drogen. Na de incubatieperiode werd een

verdunningsreeks gemaakt door een gram grond te verdunnen tot 10-5 en uit te platen op PDA medium

met streptomycine (aanmaak in Tabel B1). Streptomycine is een aminoglycoside antibiotica,

geproduceerd door Streptomyces griseus en heeft een werking tegen gram-negatieve bacteriën (Brock

en Madigan 2012). Na 2 tot 3 dagen werden de kolonievormende eenheden (Colony-forming units,

CFU) geteld. De concentratie werd aangepast naar 1,5.104 CFU g-1 substraat.

2.2.2. Inoculatie Pseudomonas isolaten De planten werden geïnoculeerd door een dubbele inoculatie, Pseudomonas bacteriën werden aan

het substraat toegevoegd en de planten ondergingen een worteldip.

C. Materiaal en methoden 33

2.2.2.1. Methode 1: GCY De bacteriën opkweek was analoog als in de in vitro testen op het GCY medium, maar nu gevolgd door

bepaling van de concentratie bacteriën. Hiervoor werd de optische densiteit (OD) bij 620 nm gemeten

van de niet-geïnoculeerde oplossing en drie maal de bacteriën oplossing. Voor de bacteriën oplossing

werd het gemiddelde berekend. De concentratie werd bepaald met volgende regressievergelijking:

𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛 𝑚𝐿−1 = (𝐺𝑒𝑚𝑖𝑑_𝑂𝐷620_𝑏𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑒𝑜𝑝𝑙 − 𝑂𝐷620_𝑜𝑝𝑙) . 8,2293 . 108𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛 𝑚𝐿−1𝑂𝐷−1

De concentratie werd aangepast tot 1,81.106 CFU g-1 substraat en tot 2,35.107 CFU mL-1 voor de

worteldip.

2.2.2.2. Methode 2: KB De isolaat werd via een kriskras inoculatie op een petriplaat met King’s B (KB) medium aangebracht

(aanmaak in Tabel B1). Na 22 tot 24 h incubatie bij 28 °C werd er een zoutoplossing (0,85 % NaCl) over

de plaat gegoten en met een drigalski spatel de bacteriën losgemaakt van het medium waarna analoog

als in methode 1 de OD bepaald werd van de oplossing en de concentratie berekend. Dezelfde

concentratie werd gebruikt als in methode 1 (1,81.106 CFU g-1 substraat en 2,35.107 CFU mL-1 voor de

worteldip).

2.3. Evaluatie

2.3.1. Externe ziekte evaluatie Voor de externe ziekte evaluatie werden wekelijks de lengte van de pseudostam opgemeten en de

externe symptomen van Fusarium verwelkingsziekte (de vergeling van de bladeren) opgevolgd. De

blad symptoom index (BSI) werd berekend door respectievelijk het aantal dode, gele en groene

bladeren per plant te vermenigvuldigen met de scores ‘2’, ‘1’ en ‘0’ en deze waarden werden

gesommeerd voor alle bladeren en gedeeld door de maximale score per plant.

𝐵𝑆𝐼 =∑ 𝑠𝑐𝑜𝑟𝑒 𝑝𝑒𝑟 𝑏𝑙𝑎𝑑

aantal bladeren ∗ maximale score

De wekelijkse BSI werden gebruikt om voor elke plant de relatieve Area under diseased progress curve

(rAUDPC) op te stellen. Deze wordt gebruikt om uit meerdere observaties op verschillende tijdstippen

een gemiddelde ziektescore te berekenen. In onderstaande vergelijkingen staat yi voor het resultaat

na opmeten van de ziekte (BSI) op observatie i, n staat voor het aantal observaties, ti is het tijdstip van

observatie i en ymax is de maximale waarde voor y (hier 1) (Simko en Piepho 2012).

𝐴𝑈𝐷𝑃𝐶 = ∑𝑦𝑖 + 𝑦𝑖+1

2

𝑛−1

𝑖=1

∗ (𝑡𝑖+1 + 𝑡𝑖)

𝑟𝐴𝑈𝐷𝑃𝐶 = 𝐴𝑈𝐷𝑃𝐶

(𝑡𝑛 − 𝑡1) ∗ 𝑦𝑚𝑎𝑥

2.3.2. Interne ziekte evaluatie Voor de interne ziekte evaluatie werd de rhizoom overlangs doorgesneden en werd er een score

volgens de rhizoom verkleuringsindex (Rhizome Discoloration Index, RDI) gegeven (zie Figuur 8).

Hiervan werd de incidentie (het relatief aandeel planten) per score berekend. Vervolgens werd

hiermee de plant ziekte index (PDI) berekend.

𝑃𝐷𝐼 =∑(𝑅𝐷𝐼 ∗ 𝑖𝑛𝑐𝑖𝑑𝑒𝑛𝑡𝑖𝑒)

maximale RDI

34 C. Materiaal en methoden

Daarnaast werd er getest of de schimmel terug te vinden was in de rhizoom om na te gaan of er aan

Koch ’s postulaten voldaan werd en of de schimmel ook symptoomloos aanwezig kon zijn. Hiertoe

werd een stukje rhizoom van 0,5 cm² oppervlakte extern gesteriliseerd door achtereenvolgens 1 min

in 70 % ethanol, 3 min in bleekwater (1 % NaOCl), te wassen in gesteriliseerd gedistilleerd water en

gedroogd op een gesteriliseerd filterpapiertje. Vervolgens werd dit stukje op een petriplaat met PDA

medium en streptomycine geplaatst en geïncubeerd bij 28 °C. De platen werden opgevolgd tot er

schimmelgroei te zien was, indien dit morfologisch op Fusarium leek werd een 3 mm plug genomen en

opnieuw op een petriplaat met PDA medium in de incubator geplaatst. Na 5 dagen werd vergeleken

met de geïnoculeerde Foc.

Figuur 8 De rhizoom verkleuringsindex (Rhizoom Discoloration Index, RDI) gebruikt voor de interne ziekte scoring van de bananenplanten voor Fusarium verwelkingsziekte. Score ‘0’ voor geen verkleuring, ‘1’ voor een spoor tot 25 % verkleuring, ‘2’ voor 26-50 % verkleuring, ‘3’ voor 51-100 % verkleuring en ‘4’ voor een dode plant.

2.3.3. Evaluatie populatiedensiteit fluorescerende pseudomonaden in rhizosfeer De populatiedensiteit van de fluorescerende pseudomonaden in de rhizosfeer van de wortels werd bij

de interne ziekte evaluatie getest om na te gaan of de populatie voldoende hoog was voor biocontrole

activiteit. De wortels werden met kraantjes water gewassen om de meeste grond te verwijderen.

Figuur 9 Een foto van de telling van de kolonievormende eenheden van fluorescerende pseudomonaden op een petriplaat met behulp van UV licht. De fluorescerende pseudomonaden waren te onderscheiden van de andere bacteriën door hun fluorescentie onder UV licht (aangeduid met zwarte stip).

C. Materiaal en methoden 35

Wortels werden in een petriplaat afgedekt met parafilm en hoogstens 1 dag bewaard in een koude

kamer. De wortels werden op gesteriliseerd papier in stukjes versneden en vermengd. Hiervan werd

ongeveer 2 g wortels samen met een beetje gesteriliseerd zand en 5 mL gesteriliseerde zoutoplossing

(0,85 % NaCl) met een steriele porseleinen mortier en stamper vermaald. Vervolgens werd 1 mL van

het mengsel gebruikt voor een tiendelige verdunningsreeks tot 10-5. De verdunningen 10-1 t.e.m. 10-5

werden in duplicaat uitgeplaat door 100 µL van de verdunning te pipeteren op petriplaten met KB

medium en uit te spreiden met een drigalski spatel. De CFU die morfologisch gelijk waren aan de

origineel geïnoculeerde fluorescerende Pseudomonas bacterie werden geteld met behulp van UV licht

na 24 h incubatie (zie Figuur 9). De data werden logaritmisch getransformeerd.

2.4. Proefopzet

2.4.1. In planta test 1 ‘Grand Naine’ (Cavendish subgroep) bananenplanten werden geïnoculeerd met Foc TR4 isolaat M27

en Pseudomonas bacteriën. De planten werden uit de pot gehaald en de wortels werden gewassen om

zoveel mogelijk grond te verwijderen. Het substraat bestond uit 50 massa % potgrond/50 m% zand

(50P/50Z) (potgrond: Structural Type 1; zand: Cobo Gardenis gewassen zand 0/2). Er werd een dubbele

inoculatie met de bacteriën uitgevoerd volgens de eerste methode met GCY (2.2.2.1). Eerst werd in

geautoclaveerd substraat de bacteriën oplossing vermengd en nadien de plant hierin opgepot. Er werd

een schaal onder de pot geplakt om contaminatie te voorkomen. Na 2 dagen in de groeikamer werden

de planten terug uit het substraat gehaald en zonder de wortels te wassen kregen ze een worteldip in

de bacteriën oplossing gedurende 20 min. De conidiën sporenoplossing gemaakt volgens methode 1

(2.2.1.1) werd gebruikt voor de inoculatie van Foc. Deze werd vermengd met het substraat waar de

planten waren uitgehaald. De planten werden hierin terug opgepot en terug in de groeikamer

geplaatst. De tijdlijn was dus op dag 0 inoculatie substraat met bacteriën en planten bananen en na 2

dagen worteldip bananenplanten en inoculatie substraat met Foc en herplanten banaan. In deze test

werd er nog niet bemest met de Hoagland oplossing. De proefopstelling was een compleet willekeurig

ontwerp met vier planten per behandeling, inclusief een positieve gezonde en negatieve zieke

controle. Tabel 5 toont een overzicht van de verschillende behandelingen. Na 120 dagen was er interne

ziekte evaluatie.

2.4.2. In planta test 2 Een vergelijkbaar experiment als in planta test 1 werd opgezet maar nu werd de Pseudomonas isolaat

CMR5c vervangen door CMR12a omdat CMR5c de minste vermindering in ziekte had in de in planta

test 1 en er werd gekozen voor CMR12a omdat deze bacterie veel secundaire metabolieten

produceert. In de in vitro test 1 had CMR12a een beperkt inhiberend effect maar de correlatie tussen

de inhibitie in de in vitro test en de biocontrole in de in planta test 1 was klein waardoor dit geen

aanwijzing is dat deze niet goed in planta kon werken. In deze test werden de bacteriën opgekweekt

op KB medium (2.2.2.2) omdat metabolieten geproduceerd op dit medium effect kunnen hebben op

de wortelkolonisatie en de inhibitie tegen de pathogeen. Doordat er weinig ziekte was in de eerste in

planta test werd nu de helft van de planten in potgrond gezet omdat er hierbij duidelijker symptomen

te zien zouden zijn (Deltour, persoonlijke communicatie). Ook zou het interessant zijn te testen of er

een substraat afhankelijk effect is van de bacteriën. Het substraat was ook een behandeling met

onderscheid tussen potgrond en 50P/50Z. De bacteriën werden vermengd met het substraat en

gedurende 2 dagen geïncubeerd bij 28 °C. De grond werd van de wortels van de bananenplanten

gewassen waarna ze een worteldip kregen gedurende 20 minuten. Het inoculum van Foc werd volgens

methode 1 aangemaakt. De pathogeen werd toegevoegd aan het substraat met de bacteriën en de

bananenplanten werden hierin opgepot. De tijdlijn was dus op dag 0 inoculatie substraat met bacteriën

en na 2 dagen worteldip bananenplanten en inoculatie substraat met Foc en planten banaan. In deze

36 C. Materiaal en methoden

test werd er bemest met de Hoagland oplossing. De proefopstelling was een compleet willekeurig

ontwerp met vijf planten per behandeling, inclusief een positieve gezonde en negatieve zieke controle.

Tabel 5 toont een overzicht van de verschillende behandelingen. Na 60 dagen was er interne evaluatie.

2.4.3. In planta test 3 De derde in planta test was analoog als het tweede met de volgende verschilpunten: substraat enkel

50P/50Z, Foc werd geïnoculeerd volgens methode 2 met chlamydosporen (2.2.1.2) en er waren zes

herhalingen. Tabel 5 toont een overzicht van de verschillende behandelingen.

Tabel 5 Overzicht van de drie in planta testen met het aantal herhalingen voor antagonisme van fluorescerende pseudomonaden tegen Foc. Er wordt onderscheid gemaakt tussen het substraat (potgrond (P) of 50 m% Potgrond/50 m% Zand (50P/50Z)), de Pseudomonas isolaat, de inoculatie methode van de pathogeen Foc M27 (conidiën of chlamydosporen), het gebruikte medium voor de opkweek van de Pseudomonas bacteriën (GCY of KB), de verschillende tijdlijn en al dan niet bemesting met Hoagland oplossing van de bananenplanten.

Substraat Foc isolaat Pseudomonas isolaat

Aantal herhalingen

Test 1 Test 2 Test 3

50P/50Z

Positieve controle 4 5 6

Negatieve controle, M27

4 5 6

M27 CHA0 4 5 6

M27 CMR5c 4

M27 CMR12a 5 6

M27 COR35 4 5 6

M27 COW5 4 5 6

P

Positieve controle 5

Negatieve controle, M27

5

M27 CHA0 5

M27 CMR12a 5

M27 COR35 5

M27 COW5 5

Inoculatie methode Foc Conidiën Conidiën Chlamydosporen

Medium opkweek Pseudomonas GCY KB KB

Contact banaan met bacteriën (dag in tijdlijn) 0 2 2

Bemesting Hoagland oplossing Nee Ja Ja

3. Statistische dataverwerking Statistische dataverwerking werd uitgevoerd met het programma SPSS. De niet-parametrische Krukal-

Wallis toets werd gebruikt voor de test voor de nulhypothese of er significante verschillen waren in de

distributie. Indien er significante verschillen waren werden paarsgewijze Mann-Whitney toetsen

uitgevoerd. Telkens werd het significantieniveau van 5 % gebruikt, indien de p-waarde groter was dan

0,05 werd de nulhypothese behouden en anders verworpen. In de in vitro testen werd de horizontale

diameter van het mycelium voor alle behandelingen horend bij dezelfde Foc isolaat apart getest (bij

de in vitro testen werd de p-waarde van de paarsgewijze toetsen met een asymptotische toets bepaald

aangezien de exacte toets geen significante verschillen gaf). In de in planta testen werden de interne

en externe ziektesymptomen, de pseudostamlengte en de logaritmisch getransformeerde data van de

concentratie fluorescerende pseudomonaden op de wortels getest. Correlaties en hun significantie

werden berekend met de Pearson correlatie toets.

D. Resultaten 37

D. Resultaten 1. Screening in vitro antagonisme tegen Foc

1.1. In vitro test 1 In de eerste in vitro test werd de inhiberende capaciteit van zeven verschillende Pseudomonas isolaten

tegen vier Foc isolaten getest op PDA medium. In Figuur 10 en 11 staan de foto’s van deze test. Alle

bacteriën konden de groei van alle vier de schimmels inhiberen. Het mycelium aan de rand van de

schimmel in de bacteriën behandelingen had een grotere densiteit dan in de controle. De schimmel

was in staat in de behandelingen met CHA0, CMR12a, CMR5c, COW5, NNC7 en NSE1 de bacterie te

overgroeien, enkel bij COR35 niet. In de petriplaten waar de schimmel stopte met groeien (in de

behandelingen met COR35 en CMR5c) werd een plug van de rand van het mycelium genomen, doordat

deze telkens hergroeide was er dus hoogstens een fungistatisch effect van de bacterie in de

behandelingen met COR35 op alle vier de schimmels en bij CMR5c op de schimmel J3S. Er waren in

bepaalde platen contaminaties (vooral van CHA0 en CMR5c) waardoor deze test deels herhaald werd

in test 2 waaruit blijkt dat de resultaten van CMR5c in deze eerste test daardoor niet betrouwbaar zijn.

De schimmel Foc R4 M27 produceert weinig gekleurde metabolieten zowel in de controle als in de

behandelingen. De drie schimmels van Foc R1 produceren daarentegen veel meer gekleurde

metabolieten, P7D en E reeds in de controle, en tonen een verschil in de hoeveelheid gekleurde (rood-

paarse) metabolieten naargelang de behandeling.

Figuur 12 toont de horizontale diameter van het mycelium van Foc na zes dagen incubatie op PDA

medium. Alle Pseudomonas behandelingen geven inhibitie van de schimmelgroei. Doordat er vooral

voor CHA0 en CMR5c gecontamineerde platen waren werden deze niet meegeteld en zijn er niet

significant waarden. In alle Foc isolaten geven, in afnemende volgorde van antagonisme, COR35,

CMR5c en CHA0 het meeste antagonisme. De inhibitie van de groei van Foc isolaten E, P7D, J3S en

M27 door COR35 is respectievelijk 49 %, 57 %, 62 % en 59 % (Tabel B2). De kleinste waarde voor

antagonisme werd gevonden in de Foc isolaat E waar COW5 slechts voor een inhibitie van de groei van

16 % zorgde.

38 D. Resultaten

Figuur 10 Overzicht van de in vitro test 1 voor antagonisme van fluorescerende pseudomonaden tegen Foc uitgevoerd op PDA medium na zes dagen incubatie. In de kolommen de Foc isolaten en in de rijen de Pseudomonas isolaat . In het centrum van het assenkruis de plug met mycelium die werd aangebracht en de lijnen links en rechts de streep analyse van de Pseudomonas bacterie. Vanaf dag 2 t.e.m. 6 werd de dagelijkse toename van de myceliumgroei van de schimmel aangeduid op het assenkruis zowel horizontaal als verticaal. Het vervolg staat in de volgende figuur.

P7D J3S E M27 C

on

tro

le

CH

A0

C

MR

5c

CM

R1

2a

CO

R3

5

D. Resultaten 39

Figuur 11 Vervolg van het overzicht van de in vitro test 1 voor antagonisme van fluorescerende pseudomonaden tegen Foc uitgevoerd op PDA medium na zes dagen incubatie. In de kolommen de Foc isolaten en in de rijen de Pseudomonas isolaat. In het centrum van het assenkruis de plug met mycelium die werd aangebracht en de lijnen links en rechts de streep analyse van de Pseudomonas bacterie. Vanaf dag 2 t.e.m. 6 werd de dagelijkse toename van de myceliumgroei van de schimmel aangeduid op het assenkruis zowel horizontaal als verticaal.

P7D J3S E M27 C

OW

5

NN

C7

N

SE1

40 D. Resultaten

Figuur 12 De horizontale diameter van het mycelium van de Foc isolaat van de in vitro test 1 voor antagonisme van fluorescerende pseudomonaden tegen Foc uitgevoerd op PDA medium na zes dagen incubatie met 3 herhalingen. De vier deelfiguren betreffen de verschillende Foc isolaten E, P7D, J3S en M27. De behandelingen zijn gerangschikt van grootste naar kleinste diameter beginnend links. De foutenbalken stellen de standaarddeviatie voor. Het niveau van significantie is berekend per deelfiguur. Behandelingen met dezelfde letter zijn niet significant verschillend op het 5% significantieniveau en werden berekend met paarsgewijze Mann-Whitney toetsen (asymptotisch).

1.2. In vitro test 2 In de tweede in vitro test werd de inhiberende capaciteit van de vier meest antagonistische

Pseudomonas isolaten uit de eerste in vitro test opnieuw tegen de vier Foc isolaten getest. Ditmaal op

PDA en MEA medium om de invloed van het medium te weten te komen. In Figuur 13 staan de foto’s

van deze test op PDA. De gekleurde metabolieten productie van de schimmel op PDA is analoog als in

de eerste test. Opnieuw zijn alle bacteriën in staat de groei van alle vier de schimmels te inhiberen. De

schimmel was in staat in de behandelingen met CHA0 en COW5 de bacterie te overgroeien, bij COR35

en CMR5c niet. Het anatagonisme van CMR5c is ook groter in de tweede test vergeleken met het eerste

waar er contaminaties waren en daardoor zijn de resultaten van CMR5c in de eerste test niet

betrouwbaar. Opnieuw stopte de schimmel met groeien in de behandelingen met COR35 en CMR5c

en kan er dus besloten worden dat enkel deze twee een fungistatisch effect hebben, COR35 op alle

vier de schimmels en CMR5c enkel op J3S, P7D en M27.

a

ab b ab babc

abc c

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Ho

rizo

nta

le d

iam

eter

myc

eliu

m (

mm

)

Pseudomonas isolaat

Foc isolaat E

a

b bc bcc

abcdd d

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Ho

rizo

nta

le d

iam

eter

myc

eliu

m (

mm

)

Pseudomonas isolaat

Foc isolaat P7D

a

b b babcd

c

abcd d

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Ho

rizo

nta

le d

iam

eter

myc

eliu

m (

mm

)

Pseudomonas isolaat

Foc isolaat J3S

a

b b bcc

abcdabcd

d

0

10

20

30

40

50

60

70

80H

ori

zon

tale

dia

met

er m

ycel

ium

(m

m)

Pseudomonas isolaat

Foc isolaat M27

D. Resultaten 41

In Figuur 14 staan de foto’s van deze test op MEA. De gekleurde metabolieten van de schimmel op

MEA komt nu enkel sterk tot uiting in de schimmel E. Opnieuw vertonen alle bacteriën antagonisme

op alle vier de schimmels. COW5 had een fungistatisch effect op alle schimmels, CMR5c en CHA0 op

de schimmels J3S, P7D en M27. Op het MEA medium waren er in de behandelingen met COW5, CMR5c

en CHA0 vanaf zes dagen incubatie precipitaties in de vorm van een lijn te zien in de inhibitiezone

gelegen tussen de schimmel en de bacteriën in. Wellicht zijn de precipitaties afkomstig van een reactie

tussen metabolieten van Foc en de bacteriën die door diffusie doorheen het medium migreren.

Vanuit figuur 15 is er te zien dat op MEA medium de behandelingen van de verschillende Pseudomonas

isolaten de groei van alle schimmels significant inhiberen (behalve voor Foc isolaat E waar er in een

plaat van de controle minder schimmelgroei was). In alle Foc isolaten geven, in afnemende volgorde

van antagonisme, CMR5c en CHA0 significant het meeste antagonisme gevolgd door COR35 of COW5.

De inhibitie van de groei van Foc isolaten E, J3S, P7D en M27 door CMR5c is respectievelijk 57 %, 61 %,

59 % en 72 % (Tabel B3).

Ook op PDA medium is de groei van alle schimmels door de behandelingen van de verschillende

Pseudomonas isolaten significant geïnhibeerd. Isolaat CMR5c geeft driemaal het meeste antagonisme

(significant in E en J3S) gevolgd door COR35, enkel in Foc isolaat P7D is deze volgorde omgekeerd (niet

significant). CHA0 is de derde meest antagonistische in isolaten E (niet significant) en P7D (significant)

en COW5 in isolaten J3S en M27 (niet significant). De inhibitie van de groei van E, J3S en M27 door

CMR5c is respectievelijk 61 %, 65 % en 67 % en van P7D door COR35 60 % (Tabel B3). In de eerste in

vitro test was telkens COR35 de meest antagonistische, in de tweede test is echter CMR5c driemaal de

meest antagonistische en COR35 eenmaal. Dit verschil is te wijten aan de contaminaties die aanwezig

waren in de eerste test vooral in de behandelingen CHA0 en CMR5c en daardoor is voor CMR5c enkel

het resultaat in de tweede test betrouwbaar.

Het sterkste antagonisme in een Foc isolaat werd teruggevonden in de isolaat M27, en dit door CMR5c

op zowel MEA (72 %) als PDA (67 %).

Dus de volgorde van de meest antagonistische behandeling varieert weinig tussen elke Foc isolaat op

een bepaald medium. Tussen de twee media is de volgorde van de meest antagonistische behandeling

wel duidelijk verschillend en Foc isolaat M27 is het gevoeligst.

1.3. Besluiten in vitro testen Vanuit de in vitro testen kan er besloten worden dat COR35 en CMR5c sterk antagonisme geven op

PDA medium en dat CHA0 en CMR5c sterk antagonisme geven op MEA medium. Het medium heeft

dus een effect op de interactie tussen Foc en de Pseudomonas. Op MEA medium vertonen de

behandelingen CMR5c, CHA0 en COW5 een neerslag in de inhibitiezone en het is net in deze

behandelingen dat de inhibitie van de groei in dit medium het sterkst is.

42 D. Resultaten

Figuur 13 Overzicht van de in vitro test 2 voor antagonisme van fluorescerende pseudomonaden tegen Foc uitgevoerd op PDA medium na zes dagen incubatie. In de kolommen de Foc isolaten en in de rijen de Pseudomonas isolaat. In het centrum van het assenkruis de plug met mycelium die werd aangebracht en de lijnen links en rechts de streep analyse van de Pseudomonas bacterie. Vanaf dag 2 t.e.m. 6 werd de dagelijkse toename van de myceliumgroei van de schimmel aangeduid op het assenkruis zowel horizontaal als verticaal.

P7D J3S E M27 C

on

tro

le

CH

A0

C

MR

5c

CO

W5

C

OR

35

D. Resultaten 43

Figuur 14 Overzicht van de in vitro test 2 voor antagonisme van fluorescerende pseudomonaden tegen Foc uitgevoerd op MEA medium na zes dagen incubatie. In de kolommen de Foc isolaten en in de rijen de Pseudomonas isolaat. In het centrum van het assenkruis de plug met mycelium die werd aangebracht en de lijnen links en rechts de streep analyse van de Pseudomonas bacterie. Vanaf dag 2 t.e.m. 6 werd de dagelijkse toename van de myceliumgroei van de schimmel aangeduid op het assenkruis zowel horizontaal als verticaal. Enkele precipitaties in de vorm van een lijn worden aangeduid met een witte pijl.

P7D J3S E M27 C

on

tro

le

CH

A0

C

MR

5c

CO

W5

C

OR

35

44 D. Resultaten

Figuur 15 De horizontale diameter van het mycelium van de Foc isolaat van de in vitro test 2 voor antagonisme van fluorescerende pseudomonaden tegen Foc uitgevoerd op MEA (links) en PDA medium (rechts) na zes dagen incubatie met 3 herhalingen. De acht deelfiguren betreffen de verschillende Foc isolaten E, P7D, J3S en M27 in elk medium. De behandelingen zijn gerangschikt van grootste naar kleinste diameter beginnend links. De foutenbalken stellen de standaarddeviatie voor. Het niveau van significantie is berekend per deelfiguur. Behandelingen met dezelfde letter zijn niet significant verschillend op het 5% significantieniveau en werden berekend met paarsgewijze Mann-Whitney toetsen (asymptotisch).

MEA PDA

a

a ab

c

0

20

40

60

80

Controle COR35 COW5 CHA0 CMR5cHo

rizo

nta

le d

iam

eter

m

ycel

ium

(m

m)

Pseudomonas isolaat

Foc isolaat E

a

b bc d

0

20

40

60

80

Controle COW5 CHA0 COR35 CMR5c

Ho

rizo

nta

le d

iam

eter

m

ycel

ium

(m

m)

Pseudomonas isolaat

Foc isolaat E

a

bc

d d

0

20

40

60

80

Controle COR35 COW5 CHA0 CMR5cHo

rizo

nta

le d

iam

eter

m

ycel

ium

(m

m)

Pseudomonas isolaat

Foc isolaat P7D

a

b c

d d

0

20

40

60

80

Controle COW5 CHA0 CMR5c COR35

Ho

rizo

nta

le d

iam

eter

m

ycel

ium

(m

m)

Pseudomonas isolaat

Foc isolaat P7D

a

b bc

d

0

20

40

60

80

Controle COW5 COR35 CHA0 CMR5c

Ho

rizo

nta

le d

iam

eter

m

ycel

ium

(m

m)

Pseudomonas isolaat

Foc isolaat J3Sa

b b

c d

0

20

40

60

80

Controle CHA0 COW5 COR35 CMR5c

Ho

rizo

nta

le d

iam

eter

m

ycel

ium

(m

m)

Pseudomonas isolaat

Foc isolaat J3S

a

b

cd d

0

20

40

60

80

Controle COR35 COW5 CHA0 CMR5c

Ho

rizo

nta

le d

iam

eter

m

ycel

ium

(m

m)

Pseudomonas isolaat

Foc isolaat M27

a

b b

c c

0

20

40

60

80

Controle CHA0 COW5 COR35 CMR5c

Ho

rizo

nta

le d

iam

eter

m

ycel

ium

(m

m)

Pseudomonas isolaat

Foc isolaat M27

D. Resultaten 45

2. Screening in planta antagonisme tegen Foc

2.1. In planta test 1 De externe en interne ziekte werd opgevolgd in bananenplanten geïnoculeerd met Foc isolaat M27

alleen of in combinatie met één van de vier Pseudomonas behandelingen die de sterkste inhibitie van

de schimmelgroei gaven vanuit de in vitro testen. Daarnaast werd de populatiedensiteit van de

bacteriën op de wortels bepaald.

Figuur 16 De incidentie van de rhizoom verkleuringsindex, de plant ziekte index (PDI) en de afname in ziekte ([Negatieve controle – Behandeling]/[Negatieve controle - Positieve controle]) van in planta test 1. Er werd een score van ‘0’ toegekend aan geen verkleuring, ‘1’ aan een spoor tot 25 %, ‘2’ aan 26 tot 50 %, ‘3’ aan 51 tot 100 % en ‘4’ aan een dode plant. In deze test werd het antagonisme van vier Pseudomonas isolaten op Foc TR4 M27 in ‘Grand Naine’ bananenplanten nagegaan in een substraat van 50 m% potgrond/50 m% zand. Elke behandeling, op de positieve controle na, werd geïnoculeerd met een sporenoplossing van conidiën van Foc TR4 isolaat M27. De negatieve controle enkel met M27 en de Pseudomonas behandelingen met de M27 en de Pseudomonas isolaat. Pseudomonas isolaten werden opgekweekt op GCY. Het aantal herhalingen was 4. Behandelingen met dezelfde letter zijn niet significant verschillend op het 5 % significantieniveau (p-waarde Krukal-Wallis toets: 0.495).

Er was zeer weinig ziekte waardoor uit dit eerste experiment geen sterke conclusies kunnen worden

getrokken (zie Figuur 16). Enkel de logaritme van de concentratie van de bacteriën op de wortels was

significant verschillend tussen de behandelingen (Tabel B4). De pseudostamlengte bij de start was niet

significant verschillend tussen de behandelingen en dus heeft de begintoestand van de plant geen

invloed op de ziektesymptomen. De hoogste correlatie tussen de externe en interne symptomen werd

teruggevonden na 40 dagen inoculatie en bedroeg 0,61 (p-waarde = 0,002), vervolgens herstelden de

planten extern. Doordat er weinig externe en interne ziektesymptomen te zien zijn in de negatieve

controle (hoogstens score 1) en er ook een grote variatie is tussen de herhalingen in de behandelingen

zijn er geen significante verschillen tussen de behandelingen. Voor de externe symptomen is de

behandeling COW5 gelijk aan de positieve controle en de andere bacteriën behandelingen bevinden

zich tussen de positieve en negatieve controle in (data wordt niet getoond). Figuur 16 toont dat de

behandeling COW5 geen interne symptomen gaf (net als de positieve controle), daarentegen gaven

de behandelingen CHA0 en COR35 evenveel en CMR5c zelfs meer interne ziektesymptomen

vergeleken met de negatieve controle. De Fusarium schimmel werd teruggevonden in de rhizoom van

alle behandelingen met M27 behalve bij COW5. Door de beperkte ziekte en grote variatie kan er voor

PDI (%) 0 6 6 13 6 0

Afname ziekte (%)

0 -100 0 100

a a a a a a

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Positievecontrole

Negatievecontrole

CHA0 CMR5c COR35 COW5

Aan

dee

l pla

nte

n in

elk

e kl

asse

(%

)

Behandeling

4

3

2

1

0

46 D. Resultaten

de isolaten dus geen conclusie getrokken worden tot beheersing van ziekte. De isolaat COW5 heeft

wel het meeste potentieel voor de biocontrole van Foc M27 in de eerste in planta test, toch door de

beperkte ziekte in de negatieve controle dient dit experiment herhaald te worden.

De volgorde van de behandelingen met de hoogste concentratie fluorescerende pseudomonaden op

de wortels in de verschillende Pseudomonas isolaten was, in afnemende volgorde, CMR5c, CHA0,

COW5 en COR35 (zie Tabel 6). De behandeling CMR5c kwam dus in het grootste aantal voor maar had

ook de meeste interne ziektesymptomen. De behandeling COW5 toonde de beste interne ziekte

inhibitie maar had een intermediaire populatiedichtheid.

Tabel 6 De concentratie van de fluorescerende pseudomonaden in de bananenwortels van de eerste in planta test in een substraat van 50 m% potgrond/50 m% zand met 3 herhalingen. Pseudomonas isolaten werden opgekweekt op GCY. De detectielimiet was 2.27 log10 CFU g-1 verse wortel. Het gemiddelde (Gemid) met standaarddeviatie en significantie worden getoond. Behandelingen met dezelfde letter zijn niet significant verschillend op het 5 % significantieniveau, bepaald met paarsgewijze Mann-Whitney toetsen.

Pseudomonas isolaat Gemid. (log10 CFU g-1 verse wortel)

CHA0 6,00 ± 0,25 ab

CMR5c 6,17 ± 0,29 a

COR35 3,81 ± 0,88 c

COW5 5,38 ± 0,45 bc

2.2. In planta test 2 Net als in het vorig experiment worden de externe, interne ziekte en populatiedichtheid gemeten,

maar nu in de twee substraten 50P/50Z en 100 % potgrond. Pseudomonas isolaat CMR5c gaf in de

eerste in planta test het minste potentieel tot ziektebeheersing en werd daarom vervangen door

CMR12a.

Figuur 17 toont de incidentie van RDI en deze zijn niet significant verschillend (Tabel B5). Er is geen

verschil in RDI incidentie naargelang het substraat in de negatieve controle. De bacteriën

behandelingen vertonen in het mengsel van 50P/50Z minder (CMR12a; 67 %), evenveel (CHA0) of

meer (COR35 en COW5; 33 %) interne ziekte dan de negatieve controle (echter niet significant). Dit

komt in het geval van COW5 niet overeen met de eerste in planta test waar deze nog de beste

ziektebeheersing gaf. Het is echter opvallend dat geen enkele plant ziektesymptomen vertoont in de

bacteriën behandelingen in potgrond. Het substraat heeft dus duidelijk geen effect wanneer enkel Foc

aanwezig is, maar indien ook de bacterie aanwezig is dan is deze in staat tot volledige ziektebeheersing

in potgrond in tegenstelling tot 50P/50Z waar de ziekte minder, evenveel of meer kan zijn. De correlatie

tussen interne en externe symptomen was vanaf 36 dagen na inoculatie t.e.m. de finale evaluatie na

60 dagen significant en schommelde in deze periode rond 0,67. Alle planten van de positieve controle

vertoonden een lichte verkleuring van de rhizoom (score ‘1’) en ook geen enkele plant van de

behandelingen vertoont score ‘0’. In de rhizoom kon Fusarium sp. teruggevonden worden in de

positieve controle en was er dus waarschijnlijk contaminatie. Op het oppervlak van het substraat

waren er gedurende de proef kleine vliegjes aanwezig die potentieel als vector dienden.

De populatiedichtheid van de Pseudomonas in de wortels was hoger in het mengsel 50P/50Z dan in

potgrond (voor COR35 en COW5 significant), enkel voor CMR12a (de beste ziekte inhiberende bacterie

in deze test in P/Z) was dit niet significant lager (Tabel 7).

D. Resultaten 47

Figuur 17 De incidentie van de rhizoom verkleuringsindex, de plant ziekte index (PDI) en de afname in ziekte ([Negatieve controle – Behandeling]/[Negatieve controle - Positieve controle]) van in planta test 2. Er werd een score van ‘0’ toegekend aan geen verkleuring, ‘1’ aan een spoor tot 25 %, ‘2’ aan 26 tot 50 %, ‘3’ aan 51 tot 100 % en ‘4’ aan een dode plant. In deze test werd het antagonisme van vier Pseudomonas isolaten op Foc TR4 M27 in ‘Grand Naine’ bananenplanten en de invloed van het substraat hierop nagegaan. Elke behandeling, op de positieve controles na, werd geïnoculeerd met een sporenoplossing van conidiën van Foc TR4 isolaat M27. De negatieve controle enkel met M27 en de Pseudomonas behandelingen met de M27 en de Pseudomonas isolaat. Pseudomonas isolaten werden opgekweekt op KB. Er zijn twee substraatbehandelingen, nl. Potgrond en 50 m% Potgrond/50 m% Zand. Het aantal herhalingen was 5. Behandelingen met dezelfde letter zijn niet significant verschillend op het 5 % significantieniveau (p-waarde Krukal-Wallis toets: 0,055).

Tabel 7 De concentratie van de fluorescerende pseudomonaden in de bananenwortels van de tweede in planta test in de substraten van Potgrond (P) en 50 m% potgrond/50 m% zand (50P/50Z) met 5 herhalingen. Pseudomonas isolaten werden opgekweekt op KB. De detectielimiet was 2.77 log10 CFU g-1 verse wortel. Het gemiddelde (Gemid) met standaarddeviatie en significantie worden getoond. Behandelingen met dezelfde letter zijn niet significant verschillend op het 5 % significantieniveau, bepaald met paarsgewijze Mann-Whitney toetsen.

Behandeling Gemid. (log10 CFU g-1 verse wortel) Substraat Pseudomonas isolaat

P

CHA0 4,83 ± 0,37 abc

CMR12a 4,83 ± 0,53 bc

COR35 4,63 ± 0,22 c

COW5 5,11 ± 0,05 b

50P/50Z

CHA0 5,20 ± 0,52 abc

CMR12a 4,71 ± 0,26 c

COR35 5,32 ± 0,17 b

COW5 6,00 ± 0,33 a

PDI (%) 25 40 25 25 25 25 25 40 40 30 45 45

Afname ziekte (%)

100 100 100 100 0 67 -33 -33

a a a a a a a a a a a a

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Po

siti

eve

co

ntr

ole

Ne

gati

eve

co

ntr

ole

CH

A0

CM

R1

2a

CO

R3

5

CO

W5

Po

siti

eve

co

ntr

ole

Ne

gati

eve

co

ntr

ole

CH

A0

CM

R1

2a

CO

R3

5

CO

W5

Potgrond 50 % Potgrond /50 % Zand

Aan

dee

l pla

nte

n in

elk

e kl

asse

(%

)

Behandeling

4

3

2

1

0

48 D. Resultaten

2.3. In planta test 3 Om hevigere ziektesymptomen te verkrijgen in de planten werd chlamydosporen inoculum van de

pathogeen gebruikt.

Figuur 18 toont de gemiddelde blad symptoom index van de derde in planta test. Er zijn duidelijk

hevigere ziektesymptomen dan in de vorige experimenten doordat de pathogeen nu geïnoculeerd

werd met chlamydosporen. Vanaf 15 dagen na inoculatie met Foc vertoonden zich de eerste externe

ziektesymptomen. Voor zowel de BSI als rAUDPC (afgeleid van BSI; Figuur 19) zijn de negatieve controle

en de behandeling met COR35 niet verschillend van elkaar. De andere behandelingen zitten halfweg

tussen de positieve en negatieve controle in. Na 55 dagen inoculatie geven in afnemende volgorde de

behandelingen COW5, CMR12a en CHA0 de beste biocontrole. Geen enkele behandeling is significant

verschillend van de negatieve controle en enkel de behandelingen met CMR12a en COR35 vertonen

significant ziekte vergeleken met de positieve controle.

De pseudostamlengte bij de start was niet significant verschillend tussen de behandelingen en dus

heeft dit geen invloed op de ziektesymptomen (Tabel B6). Vanaf 40 dagen na inoculatie tot het einde

van de externe ziekte evaluatie en bij de interne ziekte evaluatie waren er behandelingen significant

verschillend. Ditmaal zijn er geen significante verschillen tussen de behandelingen in de

populatiedensiteit op de wortels.

Figuur 20 toont de incidentie van RDI. Net als de externe zijn de interne symptomen veel duidelijker

dan in de voorgaande testen en de correlatie tussen beide piekt na 48 dagen inoculatie op 0,92 (p-

waarde is 0). Ook was er een grote variatie in ziekte tussen planten van dezelfde behandeling over

zowel de zieke controle als de Pseudomonas behandelingen heen. Zo waren er in de zieke controle

planten die stierven en planten die amper symptomen vertoonden. Planten met RDI scores ‘2’ en ‘3’

vertoonden herstel na initiële verwelking. Alle planten vertoonden ziektesymptomen in de

behandelingen COR35 en CMR12a in tegenstelling tot de zieke controle. In deze twee behandelingen

hadden bijna alle planten een RDI score ‘2’ of ‘3’ (herstellende planten) waarbij de externe symptomen

afnamen tussen 48 en 55 dagen na inoculatie (Figuur 18). Behandeling COW5 gaf de beste

vermindering van interne ziektesymptomen (80 %, maar niet significant) gevolgd door CHA0 en

CMR12a, terwijl COR35 meer ziekte gaf dan de negatieve controle (Figuur 20). Net als in de tweede

test vertoonde de positieve controle steeds score ‘1’ en ook hier kon Fusarium sp. teruggevonden

worden (testen 2 en 3 overlapten elkaar in de tijd en stonden in dezelfde groeikamer).

De concentratie van de bacteriën in de wortels, in afnemende volgorde COW5, CHA0, COR35 en

CMR12a, was niet significant verschillend tussen de behandelingen (Tabel 8). Behandeling COW5

gevolgd door CHA0 gaven ook het minst frequent interne ziektesymptomen, daarentegen gaf COR35

meer frequenter lichte symptomen dan de negatieve controle terwijl deze ongeveer dezelfde

populatiedensiteit had in de wortels als de andere behandelingen.

Ook was het opvallend dat voor alle Pseudomonas behandelingen de plant met de hevigste

ziektesymptomen binnen een behandeling ook de hoogste populatiedichtheid vertoonde in de

wortels, ongeveer tienmaal hoger dan de minder zieke planten (zie Figuur 21). De correlatie was echter

geen enkele keer significant.

D. Resultaten 49

Figuur 18 De gemiddelde blad symptoom index (scoring: som van de scores voor elk blad (0 = groen, 1 = geel en 2 = dood) gedeeld door de maximale score) doorheen de tijd van de derde in planta test. In deze test werd het antagonisme van vier Pseudomonas isolaten op Foc TR4 M27 in ‘Grand Naine’ bananenplanten nagegaan in het substraat 50 m% potgrond/50 m% zand. Elke behandeling, op de positieve controle na, werd geïnoculeerd met chlamydosporen van Foc TR4 isolaat M27. De negatieve controle enkel met M27 en de Pseudomonas behandelingen met de M27 en de Pseudomonas isolaat. Pseudomonas isolaten werden opgekweekt op KB. Het aantal herhalingen was 6. Behandelingen met dezelfde letter per tijdstap zijn niet significant verschillend op het 5 % significantieniveau (tijdstappen zonder letters zijn niet significant verschillend), bepaald met paarsgewijze Mann-Whitney toetsen.

Figuur 19 Relatieve Area under diseased progress curve (rAUDPC) gemaakt uit de opvolging van de externe ziektesymptomen van de derde in planta test. In deze test werd het antagonisme van vier Pseudomonas isolaten op Foc TR4 M27 in ‘Grand Naine’ bananenplanten nagegaan in het substraat 50 m% potgrond/50 m% zand. Elke behandeling, op de positieve controle na, werd geïnoculeerd met chlamydosporen van Foc TR4 isolaat M27. De negatieve controle enkel met M27 en de Pseudomonas behandelingen met de M27 en de Pseudomonas isolaat. Pseudomonas isolaten werden opgekweekt op KB. Het aantal herhalingen was 6. Behandelingen met dezelfde letter zijn niet significant verschillend op het 5 % significantieniveau, bepaald met paarsgewijze Mann-Whitney toetsen.

aa a

abcab

abc

abc

ab

abccd b

cbd

b

b

ac

abac

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 8 15 23 30 40 48 55

Bla

d s

ymp

too

m in

dex

Tijd na inoculatie (dagen)

Positieve controle

Negatieve controle

CHA0

CMR12a

COR35

COW5

a

abc

abccd

bd

ac

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

Positievecontrole

Negatievecontrole

CHA0 CMR12a COR35 COW5

rAU

DP

C (

%)

Behandeling

50 D. Resultaten

Figuur 20 De incidentie van de rhizoom verkleuringsindex, de plant ziekte index (PDI) en de afname in ziekte ([Negatieve controle – Behandeling]/[Negatieve controle - Positieve controle]) van in planta test 3. Er werd een score van ‘0’ toegekend aan geen verkleuring, ‘1’ aan een spoor tot 25 %, ‘2’ aan 26 tot 50 %, ‘3’ aan 51 tot 100 % en ‘4’ aan een dode plant. In deze test werd het antagonisme van vier Pseudomonas isolaten op Foc TR4 M27 in ‘Grand Naine’ bananenplanten nagegaan in het substraat 50 m% potgrond/50 m% zand. Elke behandeling, op de positieve controle na, werd geïnoculeerd met chlamydosporen van Foc TR4 isolaat M27. De negatieve controle enkel met M27 en de Pseudomonas behandelingen met de M27 en de Pseudomonas isolaat. Pseudomonas isolaten werden opgekweekt op KB. Het aantal herhalingen was 6. Behandelingen met dezelfde letter zijn niet significant verschillend op het 5 % significantieniveau, bepaald met paarsgewijze Mann-Whitney toetsen.

Tabel 8 De concentratie van de fluorescerende pseudomonaden in de bananenwortels van de derde in planta test in een substraat van 50 m% potgrond/50 m% zand met 6 herhalingen. Pseudomonas isolaten werden opgekweekt op KB. De detectielimiet was 2.54 log10 CFU g-1 verse wortel. Het gemiddelde (Gemid) met standaarddeviatie en significantie worden getoond. Behandelingen met dezelfde letter zijn niet significant verschillend op het 5 % significantieniveau (p-waarde Krukal-Wallis toets: 0,08)

Pseudomonas isolaat Gemid. (log10 CFU g-1 verse wortel)

CHA0 5,80 ± 0,46 a

CMR12a 4,91 ± 0,57 a

COR35 5,43 ± 0,39 a

COW5 5,90 ± 0,80 a

PDI (%) 25 67 46 54 71 33

Afname ziekte (%)

50 30 -10 80

a ab ab b b a

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Positievecontrole

Negatievecontrole

CHA0 CMR12a COR35 COW5

Aan

dee

l pla

nte

n in

elk

e kl

asse

(%

)

Behandeling

4

3

2

1

0

D. Resultaten 51

Figuur 21 De correlatie tussen de concentratie fluorescerende pseudomonaden in de wortels en de rhizoom verkleuringsindex (RDI) in bananenplanten in de derde in planta test in een substraat van 50 m% potgrond/50 m% zand met 6 herhalingen. De vier deelfiguren bevatten telkens een Pseudomonas behandeling met regressierechte en de p-waarde van de Pearson correlatie toets in het zwarte kader. Foc TR4 isolaat M27 geïnoculeerd met chlamydosporen. Pseudomonas isolaten werden opgekweekt op KB.

2.4. Besluiten in planta testen De methode van inoculatie van de pathogeen met chlamydosporen gaf duidelijk meer ziekte dan de

methode met conidiën. De methode van opkweek van de fluorescerende pseudomonaden geeft geen

aanwijsbare verschillen.

Het substraat had geen invloed op ziekteontwikkeling indien enkel de pathogeen aanwezig was, maar

ziekte verdween volledig in alle bacteriën behandelingen in potgrond. In 50P/50Z gaf de bacteriën

behandeling meer, evenveel of minder ziekte dan de zieke controle (niet significant). In dit substraat

gaf COW5 het vaakst de beste biocontrole (maar niet in de tweede test) en CMR12a en CHA0 gaven

hoogstens een beperkt effect, CMR5c gaf in de enige test dat het werd meegenomen geen effect en

COR35 was in geen enkele test beter dan de zieke controle.

0

1

2

3

4

0 2 4 6 8

RD

I sco

re

Concentratie (log10 CFU g-1 verse wortel)

CHA0p = 0,21

0

1

2

3

4

0 2 4 6 8

RD

I sco

re

Concentratie (log10 CFU g-1 verse wortel)

CMR12ap = 0,12

0

1

2

3

4

0 2 4 6 8

RD

I sco

re

Concentratie (log10 CFU g-1 verse wortel)

COR35p = 0,24

0

1

2

3

4

0 2 4 6 8

RD

I sco

re

Concentratie (log10 CFU g-1 verse wortel)

COW5p = 0,42

52 D. Resultaten

In de derde test had de plant met de hevigste ziektesymptomen binnen een behandeling ook de

hoogste populatiedichtheid (niet significant). Een overzicht van de concentraties van de bacteriën

teruggevonden in de wortels staat in Tabel 9. In volgorde van dalende gemiddelde populatiedichtheid

over de 3 testen in 50P/50Z zijn CMR5c, COW5, CHA0, COR35 en CMR12a.

Tabel 9 Overzicht van de gemiddelde concentratie fluorescerende pseudomonaden (log10 CFU g-1 verse wortel) in de drie in planta testen. Voor het substraat 50 m% potgrond/50 m% zand (P/Z) werd ook het gemiddelde van de drie testen berekend.

Test 1 2 3 Gemiddelde 1, 2 en 3 2

Substraat P/Z P/Z P/Z P/Z P

Medium bacteriën opkweek

GCY KB KB KB

Pseudomonas isolaat

CHA0 6,00 5,20 5,80 5,67 4,83

CMR5c 6,17 6,17

COR35 3,81 5,32 5,43 4,85 4,63

COW5 5,38 6,00 5,90 5,76 5,11

CMR12a 4,71 4,91 4,81 4,83

3. Vergelijking in vitro en in planta testen De volgorde van inhibitie van de groei in vitro op MEA medium van de Foc isolaat M27 door

fluorescerende pseudomonaden was in afnemende volgorde de behandeling CMR5c, CHA0, COW5 en

COR35 (enkel CMR5c en CHA0 niet significant verschillend van elkaar) en op PDA medium was dit in

afnemende volgorde CMR5c, COR35, COW5, CHA0 en CMR12a (CMR5c en COR35 zijn net als COW5 en

CHA0 onderling niet significant verschillend van elkaar).

De volgorde van ziektebeheersing in de eerste in planta test op de Foc isolaat M27 was in afnemende

volgorde de behandeling COW5, COR35, CHA0 en CMR5c (COR35 en CHA0 zijn onderling niet

significant verschillend van elkaar). In de tweede in planta test in potgrond was er volledige inhibitie

door alle isolaten (CMR5c werd hier niet getest) en in 50P/50Z gaven de behandelingen CMR12a,

CHA0, COW5 en COR35 (COW5 en COR35 zijn onderling niet significant verschillend van elkaar) in

afnemende volgorde ziektebeheersing. In de derde in planta test gaven de behandelingen COW5,

CMR12a, CHA0 en COR35 (CMR12a en CHA0 zijn onderling niet significant verschillend van elkaar) in

afnemende volgorde de beste ziektebeheersing.

De resultaten van de in vitro en in planta testen kwamen dus niet overeen.

E. Discussie 53

E. Discussie 1. Screening in vitro antagonisme tegen Foc Onder in vitro omstandigheden zijn bepaalde fluorescerende pseudomonaden zoals PF10 (Thangavelu

et al. 2001) antagonistisch tegen Foc R1 en R4 (Mohandas et al. 2004; Sivamani en Gnanamanickam

1988). In deze thesis werd dit bevestigd, alle Pseudomonas isolaten zorgden voor inhibitie van de groei

in alle Foc isolaten variërend tussen 16 en 72 %. De hogere waarden van antagonisme komen overeen

met de studie van Saravanan et al. (2004) waar de Indiaanse isolaten Pf1 Pf2, Pf3, Pf4 en Pfm een

antagonisme gaven van respectievelijk 73, 71, 75, 76 en 79 % tegen een Foc R1 isolaat. Hier dient wel

vermeld te worden dat men de schimmel langer liet doorgroeien (tot 90 mm koloniediameter in de

controle) vergeleken met deze thesis (grootste gemiddelde diameter in de controle was 76 mm)

waardoor het verschil in groei tussen de controle en de behandelingen groter kon worden en er dus

meer inhibitie van de groei was.

1.1. Verklarende mechanismen in vitro antagonisme Een eerste mechanisme waardoor fluorescerende pseudomonaden in vitro schimmelgroei kunnen

remmen is ijzercompetitie. Naarmate de ijzerinhoud van agar platen steeg nam de inhibitie door P.

putida isolaat WCS358r op myceliumgroei van Fox f. sp. dianthi af (Duijff et al. 1993). Daar de

ijzerinhoud waarschijnlijk niet limiterend was speelde dit waarschijnlijk geen belangrijke rol in deze

thesis.

De Pseudomonas isolaten kunnen ook antimicrobiële metabolieten produceren die doorheen het

medium diffunderen en voor inhibitie zorgen. De geproduceerde metabolieten gekend betrokken te

zijn in biocontrole activiteit door de gebruikte isolaten CHA0, CMR5c, CMR12a, COR35, COW5, NSE1

en NNC7 zijn opgelijst in Tabel 10.

Tabel 10 De Pseudomonas isolaten gebruikt in deze thesis met de geproduceerde metabolieten relevant voor biocontrole. + = aanwezig; - = afwezig; CLP, cyclische lipopeptiden; WLIP, White line inducing principle; PCN, phenazine-1-carboxamide; PCA, phenazine-1-carboxylzuur; PLT, pyoluteorine; PRN, pyrrolnitrine; DAPG, 2,4-diacetylphloroglucinol; HCN, waterstofcyanide

Isolaat Geproduceerde metabolieten Verwijzing

CLP fenazine PLT PRN DAPG HCN

CHA0 orfamide A, B, C en G

+ + + + Ma et al. (2016a), Stutz et al. (1986)

CMR5c orfamide B, D, E, F en G

PCN, PCA + + - + Ma et al. (2016a), Perneel et al. (2007)

CMR12a orfamide B, D, E en G, sessiline

PCN - - - + D'Aes et al. (2011), Ma et al. (2016a), Perneel et al. (2007)

COR35 N3 Olorunleke et al. (niet gepubliceerde data)

COW5 N1 Olorunleke et al. (niet gepubliceerde data)

NSE1 WLIP Olorunleke et al. (niet gepubliceerde data)

NNC7 Putisolvine Olorunleke et al. (niet gepubliceerde data)

54 E. Discussie

De resultaten tussen de twee geteste media PDA en MEA verschilden, dit komt o.a. doordat

mineraalinhoud, zuurstofspanning, osmotische omstandigheden, fosfaat, koolstof en stikstof bronnen,

net als schimmelmetabolieten de productie van secundaire metabolieten door Pseudomonas spp. in

vitro kunnen beïnvloeden (Haas en Keel 2003). Doordat er niet geweten is welke metabolieten er

specifiek op de gebruikte media geproduceerd worden door de isolaten zijn de volgende potentiële

verklaringen speculatief. Hiertoe zou er voor bepaling welke metabolieten belangrijk zijn de pure

metaboliet of mutanten die bepaalde metabolieten niet meer kunnen aanmaken gebruikt dienen te

worden. Zo zijn er mutanten van CMR12a beschikbaar waarin de productie van fenazine en/of sessiline

is uitgeschakeld (D'Aes et al. 2011; Hua en Höfte 2015).

In de eerste in vitro test op PDA medium gaven CMR5c en COR35 (beide fungistatisch) het meeste

antagonisme gevolgd door CHA0 die gevolgd werd door COW5, CMR12a, NSE1 en NNC7. Dus zou het

door COR35 geproduceerde N3 een sterk effect kunnen hebben en de door COW5 (N1), NSE1 (WLIP)

en NNC7 (Putisolvine) geproduceerde metabolieten zouden een zwakker effect kunnen hebben.

Blijkbaar zouden ook PCA, PLT of PRN belangrijk kunnen zijn en sessiline niet want CMR5c gaf meer

antagonisme dan CMR12a. Volgens D'Aes et al. (2014) interfereert de aanwezigheid van sessiline

geproduceerd door CMR12a in het medium met het vrijgeven van orfamide door deze isolaat, dit zou

kunnen verklaren dat CMR5c (produceert geen sessiline) meer antagonisme gaf dan CMR12a. Dit kan

nagegaan worden door het vergelijken van het wild type met de sessiline mutant van CMR12a. In de

tweede in vitro test op PDA medium gaven isolaten CMR5c en COR35 (beide fungistatisch) het meeste

antagonisme gevolgd door CHA0 en COW5. In elk van deze twee groepen zit er één die veel en één die

slechts één antimicrobiële metaboliet kunnen aanmaken en dus zou die grote hoeveelheid van

metabolieten geproduceerd door CHA0 nu niet bevoordeligend kunnen zijn. CMR5c geeft betere

inhibitie van de groei dan CHA0, mogelijk door de productie van fenazinen. Het door COR35

geproduceerde N3 zou een sterk effect kunnen hebben en de door COW5 geproduceerde N1

metaboliet zou een zwakker effect kunnen hebben. Indien het enkel zou liggen aan de CLPs (want 2

aparte groepen) dan zou kunnen blijken dat orfamide en N3 een vergelijkbaar sterk effect zouden

hebben en orfamide en N1 een vergelijkbaar minder sterk effect zouden hebben.

Op MEA medium gaf isolaat CMR5c het meest antagonisme gevolgd door CHA0, COW5 (deze drie

fungistatisch) en COR35. Dit zou kunnen verklaard worden doordat CMR5c en CHA0 beide veel

verschillende metabolieten produceren terwijl COW5 en COR35 slechts één. CMR5c zou meer

antagonisme kunnen geven dan CHA0 doordat CMR5c wel fenazinen maakt en CHA0 niet. Op malt

agar inhibeert een mutant van CHA0, die PLT en DAPG overproduceert, Fox f. sp. cucumerinum meer

dan het wilde type (Maurhofer et al. 1995). DAPG inhibeert groei van Foc in vitro (Saravanan en

Muthusamy 2006).

Volgens Chin-A-Woeng et al. (1998) is de antifungale activiteit in vitro tegen Fox f. sp. radicis-lycopersici

van PCN is tienmaal hoger dan van PCA bij een pH van 5,7 in malt extract medium. PCN vertoont

antifungale activiteit in het volledige pH bereik van 3,1 tot 7 terwijl PCA een hoge activiteit heeft bij

lage pH, afneemt bij stijgende pH waarna de activiteit verdwijnt bij pH 5,9. In de controle werd de

schimmel niet beïnvloed door de zuurtegraad in het pH bereik van 3,1 tot 7 en het effect was dus enkel

te wijten aan de aanwezige metaboliet. De pH van PDA en MEA in deze thesis zijn respectievelijk 5,6

en 5,4 dus is het PCA geproduceerd door CMR5c in vooral het PDA wellicht weinig actief, maar doordat

de inhibitie in zowel PDA als MEA zeer goed was is PCA wellicht onbelangrijk. De Fusarium metaboliet

fusaar zuur inhibeert daarentegen PCN synthese door P. chlororaphis PCL1391 (van Rij et al. 2005;

2004), CMR12 kan PCN produceren maar CMR5c kan zowel PCA als PCN produceren waardoor CMR5c

toch nog de activiteit van de PCA heeft wat het verschil tussen deze twee fenazine producerende

isolaten zou kunnen verklaren. PCN synthese is afhankelijk van de omstandigheden, daling van de pH,

E. Discussie 55

zoutstress, lage concentratie van ferri-ijzer, fosfaat-, sulfaat-, en ammoniumionen verminderen

synthese en verschillende stikstof bronnen beïnvloeden deze synthese (van Rij et al. 2004).

HCN geproduceerd door culturen van fluorescerende pseudomonaden op vast medium inhiberen de

groei van verschillende plantpathogene schimmels zoals T. basicola en Gaeumannomyces graminis via

de gas fase (Blumer en Haas 2000).

De Pseudomonas isolaten COW5 (een lid van de P. koreensis subgroep in de P. fluorescens groep),

COR35 (een lid van de C subgroep in de P. putida groep) en NSE1 produceren respectievelijk de CLPs

N1, N3 en ‘White line inducing principle’ (WLIP). Deze metabolieten hebben in vitro een inhiberend

effect op Pythium myriotylum, N1 en N3 zorgen voor lyse van de hyfen terwijl WLIP een toename van

de vertakking in het mycelium geeft (Olorunleke et al. niet gepubliceerde data). Van deze drie gaf in

deze thesis COR35 op PDA een sterk antagonisme. Op MEA vertoonden deze isolaten minder

antagonisme (NSE1 werd niet getest). Dit is een aanwijzing dat N3 een belangrijke rol zou kunnen

spelen op PDA. WLIP is een CLP van de viscosine groep en geeft inhibitie tegen verbruining van

champignons door P. tolaasii (Soler-Rivas et al. 1999) en werkt inhiberend tegen Erwinia carotovora

subsp. carotovora en champignon (Agaricus bisporus) (Lo Cantore et al. 2006). Isolaat NNC7

produceert het CLP putisolvine (Olorunleke et al. niet gepubliceerde data) dat vooral door

fluorescerende pseudomonaden binnen de P. putida groep wordt geproduceerd (Olorunleke et al.

2015b). P. putida isolaat 267 was effectief in de biocontrole tegen Phytophthora capsici in komkommer

waarbij in vitro testen met putisolvine resulteerden in de lyse van de zoösporen van deze pathogeen

(Kruijt et al. 2009). Echter blijkt de biocontrole capaciteit onafhankelijk te zijn van de CLP productie

(Olorunleke et al. 2015b). Sessiline, behorend tot de tolaasine groep in de CLP (D'Aes et al. 2014;

Olorunleke et al. 2015b), inhibeert in vitro groei van de pathogenen Pythium myriotylum, Pythium

splendens en Fox f. sp. lycopersici (D'Aes et al. 2014). Vanuit in vitro testen waren de orfamiden A, B

en G even actief tegen Magnaporthe oryzae en tegen Rhizoctonia solani AG 4-HGI en veroorzaakten

ze zoöspore lyse van Phytophthora en Pythium (Ma et al. 2016a).

1.2. Vorming precipitatielijn in inhibitiezone De productie van een neerslag in de vorm van een lijntje tussen twee verschillende micro-organismen

in vitro zoals in deze thesis gebeurde tussen Foc en de Pseudomonas isolaten CMR5c, CHA0 en COW5

op MEA medium is niet ongewoon. Zo werd een precipitatielijn gevormd tussen Bacillus subtilis en

Aspergillus niger (Machado et al. 2010) en tussen Bacillus spp. en Sclerotinia sclerotiorum (Cornea et

al. 2002). Ook tussen verschillende Pseudomonas isolaten kunnen er precipitaties worden gevormd. In

de ‘white line test’ geeft de specifieke interactie tussen de diffuseerbare componenten WLIP,

geproduceerd door verschillende P. fluorescens en P. putida isolaten, en tolaasine, een toxine

geproduceerd door Pseudomonas tolaasii, een witte neerslag (Rokni-Zadeh et al. 2012; Rokni-Zadeh

et al. 2013; Soler-Rivas et al. 1999). Resultaten van D'Aes et al. (2014) suggereren dat tolaasine en

sessiline (gerelateerd aan tolaasine) kunnen co-precipiteren in een witte lijn met zowel WLIP als

orfamide (allen CLPs) in KB agar medium rond kolonies van Pseudomonas isolaten.

2. Screening in planta antagonisme tegen Foc

2.1. Ziektesymptomen in zieke en gezonde controle In respectievelijk de eerste, tweede en derde in planta test waren er weinig, matig en veel externe en

interne ziektesymptomen van de bananenplanten enkel geïnoculeerd met Foc. In de eerste en tweede

test werd de pathogeen geïnoculeerd met conidiën, in het derde met chlamydosporen. De

chlamydosporen zorgden voor een sterke toename in ziekte. Het verschil tussen de twee conidiën-

geïnoculeerde testen kan verklaard worden door de bemesting. De bananenplanten werden in de

tweede en derde in planta test bemest met o.a. Fe-EDTA. Fe-EDTA heeft een lagere

56 E. Discussie

stabiliteitsconstante (K=1027,3) dan de ijzerbindende complexen die Fusarium spp. (K=1029) (Scher en

Baker 1982) aanmaken waardoor de schimmel makkelijker dit noodzakelijke element kan opnemen.

Fe-EDTA behandeling kan de incidentie van Fusarium verwelkingsziekte door Fox verhogen (Scher en

Baker 1982) en ook de ziekte incidentie van panama ziekte stijgt met toenemende ijzerbeschikbaarheid

in de bodem (Domínguez et al. 1995). Daarentegen zou toediening van Fe-EDDHA, een chelaat met

een hogere stabiliteitsconstante (K=1033,9) dan de ijzerbindende complexen van Fusarium spp., een

vermindering in ziekte geven door Fox (Domínguez et al. 1995; Scher en Baker 1982) en vermindert de

kieming door chlamydosporen en de ziekte hevigheid van Foc (Peng et al. 1999).

Ook was er een groot verschil in ziekte tussen planten van dezelfde behandeling over zowel de zieke

controle als de Pseudomonas behandelingen heen vooral in de derde in planta test. Zo waren er in de

zieke controle zowel planten die stierven als planten die amper symptomen vertoonden. De planten

gebruikt in de in planta testen van deze thesis zijn afstammelingen van planten die reeds verscheidene

jaren in vitro vermenigvuldigd werden. Er werd vanuit gegaan dat door de vegetatieve

vermenigvuldiging de planten genetisch identiek aan elkaar zijn. In een grote verscheidenheid van

bananen en platanen komt echter somaklonale variatie voor met een incidentie variërend tussen 0 en

69 % (Sahijram et al. 2003). De cultivars van de Cavendish subgroep vormen hierop geen uitzondering,

het voorkomen van off-types van in weefselcultuur planten in Cavendish cultivars varieerde van 3 tot

38% (Hwang en Ko 1987; Sahijram et al. 2003; Stover 1987) en meer specifiek voor de cultivar gebruikt

in deze thesis, ‘Grand Naine’, 1 tot 19 % (Arias en Valverde 1987; Hwang en Ko 1987). Een schatting

van de frequentie van off-typen in conventioneel vermenigvuldigde planten van ‘Dwarf Cavendish’ is

twee per miljoen, ruwweg duizendmaal lager dan in vitro vermenigvuldigde planten (Israeli et al.

1991). In veredelingsprogramma’s van banaan wordt de techniek van somaklonale variatie veelvuldig

toegepast, o.a. in de zoektocht naar resistente cultivars tegen Foc (Hwang en Ko 1987, 2004). Het is

dus niet ondenkbaar dat in de gebruikte planten in deze thesis een deel van de planten betere

resistentie heeft en aan de basis ligt van de gezonde planten in de zieke controles. ‘Grand Naine’

vertoont tot de 8ste subcultuur generatie weinig variatie en er wordt aangeraden het aantal

subculturen tot dit aantal te beperken (Borse et al. 2011).

In de tweede en derde in planta test vertoonden alle planten, ook de positieve controles tenminste

een spoor van verkleuring in de rhizoom bij de interne ziekte evaluatie. Ook kon vanuit de rhizoom

morfologisch Fusarium sp. teruggevonden worden. Dus is de kans reëel dat er contaminatie gebeurd

was. Bij het begin van deze twee proeven vlogen er kleine vliegjes tussen de planten en zaten op het

substraat. Eerder werd door Heyman en Höfte (2015) al reeds aangetoond dat in dezelfde groeikamers

volwassen rouwmuggen extern sporen van Foc konden dragen en de larven, die zich voeden met

schimmels in de bodem en daarbij wortels beschadigen, intern. Dit ging gepaard met veel ziekte in

planten die niet met de pathogeen waren geïnoculeerd. Doordat in deze thesis de ziekte zeer beperkt

bleef in de positieve controle (hoogstens score ‘1’ in de RDI) konden er toch nog besluiten uit de

resultaten getrokken worden.

2.2. Fluorescerende pseudomonaden met biocontrole activiteit In deze thesis hadden de bacteriën een wisselende en soms geen invloed of konden zelfs

ziektesymptomen verergeren. Zo gaf behandeling COW5 het meeste antagonisme in de eerste en

derde in planta test (niet significante 80 % vermindering in interne ziektesymptomen) maar waren er

in de tweede in planta test in het substraat 50P/50Z twee behandelingen beter en gaf COW5 zelfs

meer ziekte (niet significant) dan de zieke controle.

P. fluorescens isolaat Pf10 verminderde ziekte door Foc in banaan met 50 % vergeleken met de zieke

controle (Thangavelu et al. 2001). Toediening van een vloeibare formulering van P. fluorescens Pfl met

druppelirrigatie bij 4 l ha-1 in een veldtest verminderde incidentie van verwelking met 60 % (Selvaraj et

E. Discussie 57

al. 2014). Pseudomonas sp. UPMP3 verminderde ziekte met 51 % (Fishal et al. 2010). De DAPG

producerende isolaten Pfm en Pf1 verminderden interne ziekte respectievelijk met 66 en 64 %

(Saravanan en Muthusamy 2006). Pf1, Pf2, Pf3, Pf4 en Pfm verminderden interne ziekte respectievelijk

met 38, 32, 43, 45 en 48 % (Saravanan et al. 2004). De P. fluorescens isolaten WCS 417 en Psf

verminderden interne ziekte met respectievelijk 87 en 83 % (Nel et al. 2006). In een veldtest waren

zowel niet-pathogene Fox en P. fluorescens alleen en als combinaties van beide niet significant in staat

de ziekte te verminderen (Belgrove et al. 2011). Dus vergeleken met de literatuur komen de waarden

voor ziekte vermindering met deze thesis redelijk overeen, enkel de hevigere ziekte in bepaalde

behandelingen dan in de negatieve controle werd niet teruggevonden.

De verkregen biocontrole voor Fusarium verwelking is vaak inconsistent. Het is een grote uitdaging om

reproduceerbare resultaten te verkrijgen in biocontrole testen. De redenen voor inconsistentie zijn

fluctuaties van omgevingscondities die de uitdrukking van de bacteriële activiteit kan beïnvloeden en

een suboptimale wortelkolonisatie van de geïntroduceerde bacteriën. Effectiviteit van

ziektebeheersing varieert naargelang de soort en zelfs naar de cultivar van de waardplant. Slechts

enkele isolaten van fluorescerende pseudomonaden zijn capabel de hevigheid van Fusarium

verwelking te verminderen (Lemanceau en Alabouvette 1993).

In de literatuur zijn isolaten vaak geïsoleerd vanuit de rhizosfeer van banaan (Saravanan et al. 2004;

Saravanan en Muthusamy 2006; Thangavelu et al. 2003; 2001) en dus waarschijnlijk beter aangepast

aan de waard dan de isolaten getest in deze thesis, maar dit blijkt toch niet noodzakelijk want een

isolaat geïsoleerd van oliepalm gaf ook in banaan verminderde ziekte door ISR (Fishal et al. 2010) of

de gebruikte isolaat in deze thesis CHA0 (geïsoleerd van tabak) verminderde banana bunchy top

disease in banaan door ISR (Kavino et al. 2008). Opdat de pseudomonaden effectief zijn in hun

biologische controle dient deze zijn mechanisme van inhibitie optimaal te kunnen uitoefenen. Zo is de

productie van DAPG afhankelijk van de populatiedensiteit in de rhizosfeer (Raaijmakers et al. 1999).

Doordat een goede kolonisatie van de rhizosfeer noodzakelijk is voor goede biologische ziektecontrole

werd in deze thesis de concentratie van de fluorescerende pseudomonaden op de wortels van de

planten bepaald.

2.2.1. Populatiedensiteit fluorescerende pseudomonaden op bananenwortels In de testen in deze thesis varieerde de bacteriële populatie in de wortels. Een concentratie van 5 tot

6 log CFU g–1 wordt gezien als een cruciaal kolonisatieniveau nodig voor optimale biologische controle

door Pseudomonas spp. (Haas en Défago 2005; Raaijmakers et al. 1995) voor zowel antibiotica

productie (Raaijmakers et al. 1999), siderofoor-gemedieerde ijzercompetitie (van Loon et al. 1998) als

ISR (Leeman et al. 1995). In 50P/50Z substraat haalden in deze thesis CMR12a en COR35 (enkel de

eerste test) dit niveau niet. In potgrond haalde enkel COW5 dit niveau. Desondanks gaven alle isolaten

getest in potgrond volledige inhibitie van ziekte. Ter vergelijking van de populatiedensiteiten uit deze

thesis wordt er vergeleken met waarden uit de literatuur (Tabel 11). Voor CMR12a (deze isolaat werd

van cocoyam oorspronkelijk geïsoleerd) zijn de waarden voor de bacteriële populatie op de wortels,

op cocoyam na, veel hoger dan in deze thesis op bananenwortels (gemiddeld tussen 4,71 en 4,91 log

CFU g–1). Voor Pseudomonas sp. CMR5c (ook deze isolaat werd van cocoyam oorspronkelijk geïsoleerd)

is de concentratie ook veel hoger dan in deze thesis (6,17 log CFU g–1). De concentratie van P. protegens

isolaat CHA0 in maïs, net als banaan een monocotyl met dikkere wortels, komt de waarde gevonden

in deze thesis (4,83 tot 6,00 log CFU g–1) redelijk goed overeen, echter is de concentratie in cocoyam

heel wat hoger. In deze thesis had COW5 een concentratie van 5,11 tot 6 log CFU g–1 en COR35 een

concentratie van 3,81 tot 5,43 log CFU g–1 en ook deze zijn veel lager dan in cocoyam. De concentratie

in banaan kan wel degelijk hoog zijn, P. fluorescens isolaat Pf1 varieert tussen 9,6 tot 9,7 log CFU g–1

na 70 dagen inoculatie en zakt vervolgens naar 6,7 tot 7,7 log CFU g–1 na 250 dagen (inoculatie met 4 l

58 E. Discussie

ha-1) (Selvaraj et al. 2014). Hieruit volgt dus dat de populatiedensiteit van alle isolaten in deze thesis

laag was. Bij fluorescerende pseudomonaden is de combinatie gewas-bacterie belangrijk. De structuur

van de bacteriële rhizosfeer populatie wordt bepaald door de plantensoort (De La Fuente et al. 2006;

Lemanceau et al. 1995) en verschillen in de samenstelling en hoeveelheden van wortelexudaten zijn

waarschijnlijk verantwoordelijk voor de verschillen in microbiële populaties (Haas en Défago 2005).

Tabel 11 De populatiedensiteit van Pseudomonas isolaten op de wortels van gewassen.

Pseudomonas isolaat

Gewas Populatiedensiteit (log CFU g–1 verse wortel)

Verwijzing

CMR12a

Boon 5,6 tot 6,1 (zonder R. solani) en 5,3 tot 6,5 (met R. solani)

D'Aes et al. (2011)

Boon 6,1 tot 6,5 (met R. solani) Olorunleke et al. (2015a)

Chinese kool 6,8 tot 8,3 Olorunleke et al. (2015a)

Cocoyam 3,2 (50 m% potgrond/50 m% zand) D'Aes en Höfte (2012)

Rijst 6,1 tot 7,7 Ma et al. (2016b)

CMR5c Cocoyam 10 De Bruyn en Höfte (2016)

CHA0 Cocoyam 9,8 De Bruyn en Höfte (2016)

Maïs (tijdens bloeifase)

4,9 (rhizosfeer) en 1,5 (intern in de wortel)

Troxler et al. (1997)

COW5 Cocoyam 8,2 Olorunleke et al. (niet

gepubliceerde data)

COR35 Cocoyam 7,8 Olorunleke et al. (niet

gepubliceerde data)

Ter voorkoming van een daling in de bacteriële populatie vaak waargenomen na een applicatie kunnen

metabolieten geproduceerd op KB gedurende de groei van de bacteriën belangrijk zijn voor de

biocontrole capaciteit waarbij ze een voordeel opleveren voor de bacteriële cellen in de vroege stadia

van introductie in de bodem (D'Aes et al. 2011). Echter zijn er in deze thesis geen duidelijke verschillen

waargenomen in de populatiedensiteit tussen opkweek op GCY en KB medium, waarschijnlijk doordat

er pas na ten vroegste 60 dagen intern geëvalueerd werd (in de eerste test met GCY zelfs pas na 110

dagen) en de populatie doorheen de tijd al geconvergeerd was naar zijn evenwichtsniveau.

Het was opvallend dat binnen de Pseudomonas behandelingen de plant met de hevigste

ziektesymptomen ook de hoogste populatiedichtheid had in de wortels (in de derde test). Dit kan

verklaard worden doordat oudere en of rottende wortels een gunstige niche vormen voor de bacteriën

door het vrijkomen van nutriënten uit afstervende wortels. Dit werd reeds aangetoond door Troxler

et al. (1997) met CHA0 in maïs waarbij planten waarvan respectievelijk de scheut was afgeknipt, en

daardoor de wortels in levenskracht afnamen, en ongeknipt een populatiedichtheid van ongeveer 4,8

en 3,5 log CFU g–1 vertoonden. Dus ruwweg tienmaal meer net als in deze thesis. Doordat dus ook de

zieke planten een hoge populatiedichtheid hadden zijn de populatiedichtheden uit deze thesis niet

bruikbaar om na te gaan of deze factor voldoende groot was voor biocontrole. Om te weten te komen

of de populatiedichtheid voldoende groot is voor biocontrole zouden er ten eerste controles zonder

pathogeen van deze bacteriën behandelingen kunnen uitgevoerd worden of ten tweede reeds voordat

de planten grote ziekte vertonen. In het tweede geval kan ook het effect van competitie tussen de

pseudomonaden en Foc tonen want de studie van Mohandas et al. (2004) toont aan dat het aantal

kolonies van zowel Foc als de fluorescerende pseudomonaden lager is wanneer de ander ook aanwezig

is.

E. Discussie 59

2.2.2. Rol substraat in ziektebeheersing De tweede in planta test toonde aan dat er geen onderscheid was in ziektesymptomen tussen

potgrond (P) of het mengsel 50P/50Z in de zieke controle. Vanuit eerder onderzoek door Hua en Höfte

(2015) met dezelfde substraten bedraagde het geschatte aandeel organisch materiaal van de

substraten P en 50P/50Z respectievelijk 46 en 18 % (Tabel B7). Echter vertonen organische bodems

minder uitdrukking van ziektesymptomen vergeleken met conventionele bodems (Geense et al. 2015)

en zijn bodems met een lichte textuur gunstiger voor Fusarium verwelkingsziekte dan bodems met een

zware klei-textuur (Pérez-Vicente et al. 2014). Het verschil kan verklaard worden doordat in de testen

van deze thesis de grond voordien geautoclaveerd werd en er dus geen invloed was van andere micro-

organismen dan de geïnoculeerde terwijl andere micro-organismen in de bovenstaande natuurlijke

bodems wel een invloed kunnen hebben. Dit wordt bevestigd doordat in de testen in deze thesis er

geen ziekte was in de behandelingen met Pseudomonas isolaten in potgrond. Een tweede belangrijke

factor is de zuurtegraad van de bodem, ziekte incidentie van panama ziekte stijgt met afnemende

bodem pH (Domínguez et al. 2001; 1995; Peng et al. 1999; Pérez-Vicente et al. 2014). Echter is de

geschatte pHKCl van de gebruikte substraten in deze thesis voor P en 50P/50Z respectievelijk 5,08 en

5,21 (Tabel B7). Ten derde kan een lage concentratie van Fe3+ in oplossing limiterend werken voor de

kieming van Fusarium chlamydosporen (Lemanceau en Alabouvette 1993), maar het ijzergehalte van

beide substraten is onbekend. Het verschil in zuurtegraad was veel kleiner dan bij het organisch

materiaal gehalte tussen deze twee substraten en dus woog het organisch materiaal blijkbaar als

belangrijkste factor door.

In deze thesis werd aangetoond dat de biocontrole activiteit van alle Pseudomonas isolaten gebruikt

in de tweede in planta test zeer sterk was in 100 % potgrond, de Pseudomonas isolaten gaven totale

inhibitie (niet significant), terwijl in 50P/50Z er (beperkt) minder tot zelfs meer ziekte optrad

afhankelijk van de Pseudomonas isolaat. De kolonisatie en de activiteit van de Pseudomonas kan

afhankelijk zijn van het substraat. Volgens Mascher et al. (2014) vertoonde isolaat CHA0 in zeer zure

bodems (pH < 5) een sterk, in zure (pH tussen 5 en 6,5) minder sterk en in neutrale en alkalische

bodems een verwaarloosbaar verlies in celcultuurbaarheid, terwijl de bodemsamenstelling geen

correlatie vertoonde met verlies in deze parameter. CHA0 (niet significant), COR35 en COW5 (beide

significant) kwamen in een grotere populatiedichtheid voor in 50P/50Z, het minst zure substraat, en

bevestigen dit dus in deze thesis. Daarentegen was CMR12a (niet significant) lager in 50P/50Z in deze

thesis terwijl de concentratie van CMR12a in de rhizosfeer van boon hoger is naarmate er een groter

aandeel zand in het substraat was (Hua en Höfte 2015). Maar doordat CMR12a ook de beste ziekte

inhibitie gaf in 50P/50Z in deze thesis zou de verklaring eerder liggen bij de mogelijkheid dat de zieke

planten (in 50P/50Z) een gunstigere niche vormden zoals eerder vermeld. De metaboliet DAPG,

geproduceerd door CHA0 (Jamali et al. 2009), heeft een hogere activiteit bij lagere pH (de Souza et al.

2003) en dit zou misschien de betere inhibitie in de zuurdere bodem (potgrond) kunnen verklaren. Hua

en Höfte (2015) toonden aan dat voor ziektebeheersing door CMR12a tegen Rhizoctonia solani in boon

de verhouding tussen potgrond en zand belangrijk is. In het mengsel 50P/50Z en 75P/25Z was de

aanwezigheid van fenazinen of sessiline geproduceerd door mutante CMR12a voldoende terwijl in

25P/75Z beide metabolieten noodzakelijk waren voor ziektebeheersing. Het mengsel met 75P/25Z was

het meest onderdrukkend tegen invasie van R. solani. Sessiline heeft een belangrijke rol in de

wortelkolonisatie van CMR12a in mengsels met minstens 50 % zand (Olorunleke et al. niet

gepubliceerde data). Ook de ziektewerendheid van P. myriotylum in cocoyam is substraat afhankelijk

(D'Aes en Höfte 2012). In een mengsel van 75 m% vulkanische grond/25Z kon de productie van

fenazinen de pathogeen beheersen, terwijl in 50 m% vulkanische grond/50Z sessiline belangrijk was

voor de biocontrole activiteit. En in 75P/25Z konden zowel fenazinen als sessiline apart de ziekte

60 E. Discussie

controleren. Echter in 50P/50Z kon de productie van zowel fenazinen als sessiline de ziekte niet

beheersen. Deze resultaten komen overeen met deze thesis.

2.2.3. Mechanismen van ziektebeheersing door fluorescerende pseudomonaden Isolaat CHA0 produceert DAPG (Jamali et al. 2009) en deze metaboliet is effectief tegen Foc (Saravanan

en Muthusamy 2006). De DAPG productie van de P. fluorescens isolaat Pfm beïnvloedde de

antischimmel activiteit tegen Foc, het toonde een significante inhibitie op spoorkieming en groei van

Foc, en onderdrukt de vasculaire verkleuring in bananenplanten. De DAPG productie kan echter

onderdrukt worden door Foc in de rhizosfeer van bananenplanten (Saravanan en Muthusamy 2006).

Notz et al. (2002) observeerden dat fusaar zuur geproduceerd door Fox de productie van DAPG door

P. protegens isolaat CHA0 in tarwe onderdrukte. Duffy en Défago (1997) namen waar dat fusaar zuur

geproduceerd door Fox f. sp. radicis-lycopersici DAPG productie onderdrukte in CHA0 in

tomatenwortels maar dat met zink toediening de Fox minder fusaar zuur produceerde in vitro en in

planta en daardoor CHA0 meer DAPG produceerde in de tomatenwortels. HCN productie draagt bij tot

de biocontrole capaciteit van CHA0 tegen zwart wortelrot veroorzaakt door Thielaviopsis basicola in

tabak (Laville et al. 1998; Voisard et al. 1989). Fluorescerende pseudomonaden kunnen via ISR ziekte

door Foc verminderen in bananenplanten (Saravanan et al. 2004; Thangavelu et al. 2003), toch niet

altijd duurzaam (Fishal et al. 2010), ook CHA0 kan ISR in banaan tegen banana bunchy top disease

(Kavino et al. 2008) en tegen Fox f. sp. lycopersici in tomaat tot stand brengen (Ardebili et al. 2011).

Het sessiline geproduceerd door CMR12a is zeer gelijkend op tolaasine, een belangrijke

virulentiefactor geproduceerd door de paddenstoel pathogeen P. tolaasii en P. fluorescens NZI7

(Olorunleke et al. 2015b). CMR12a kan ISR induceren tegen Magnaporthe oryzae op rijst, waarbij

fenazinen zeer belangrijk zijn voor de inductie, en tegen Rhizoctonia solani AG2-2 op boon, waarbij

fenazinen en de CLPs sessiline en orfamide belangrijk zijn (Ma et al. 2016b). Fenazine productie was

belangrijk in de biocontrole van Fox f. sp. ciceris op kikkererwt door Pseudomonas aeruginosa PNA1

(Anjaiah et al. 1998). PCA geproduceerd door P. fluorescens isolaat 2-79 is belangrijk in de biocontrole

van Gaeumannomyces-graminis var. tritici (Bull et al. 1991). Volgens Chin-A-Woeng et al. (1998) is er

een verschil in activiteit tussen verschillende fenazinen, een PCN-producerende Pseudomonas isolaat

kon ziekte door Fox f. sp. radicis-lycopersici in tomaat beheersen en de PCA-producerende isolaten

konden dit niet. Fenazinen maar niet DAPG geproduceerd door fluorescerende pseudomonaden in

combinatie met niet-pathogene Fox dragen bij tot de natuurlijke Fusarium verwelking werende

bodems van het Franse Châteaurenard (Mazurier et al. 2009).

De Pseudomonas isolaten COW5 en COR35 produceren respectievelijk de CLPs N1 en N3. Deze zorgden

voor een evenwaardige ziektebeheersing van P. myriotylum op cocoyam (Olorunleke et al. niet

gepubliceerde data). COW5 toonde in de eerste en derde in planta test in deze thesis de beste

biocontrole activiteit (maar was in het 50P/50Z mengsel in de tweede in planta test slechter dan de

zieke controle). COR35 gaf in de eerste en derde in planta test evenveel ziekte als de zieke controle, in

het tweede evenveel ziekte als COW5.

Doordat er grote verschillen waren in de resultaten van antagonisme voor de isolaten tussen de in

vitro en in planta testen zou er kunnen op wijzen dat het mechanisme van antibiose (in vitro test toetst

dit aspect) slechts gedeeltelijk tot niet verantwoordelijk is, maar dat het wel afhangt van de siderofoor-

gemedieerde ijzercompetitie of ISR mechanismen die niet in vitro konden waargenomen worden.

Overproductie van sideroforen door P. putida isolaat NRRL-B-12537 zorgt in de rhizosfeer van tomaat

voor een hogere resistentie tegen Fox (Vandenbergh en Gonzalez 1984). Pseudomonas sp. WCS417r

inhibeert in anjer de verwekker van Fusarium verwelking (Fox f. sp. dianthi) door ijzercompetitie zowel

voor de conidiën kieming als de myceliumgroei van de pathogeen in vitro (Duijff et al. 1993). Verrijking

van het substraat met Fe-EDTA vermindert de inhiberende werking van P. putida op Fox f. sp. lini,

E. Discussie 61

daarentegen geeft toediening van Fe-EDDHA op zich reeds een sterke inhiberende werking.

Combinatie van Fe-EDDHA en P. putida geeft echter geen toename van de inhibering vergeleken met

enkel P. putida (Scher en Baker 1982). Tenslotte kan detoxificatie van fusaar zuur door fluorescerende

pseudomonaden bepalend zijn voor biocontrole van panama ziekte in banaan (Thangavelu et al. 2001).

2.2.4. Hypothese fytotoxiciteit In een aantal behandelingen met Pseudomonas isolaten was er meer ziekte dan in de negatieve

controle. In het substraat 50P/50Z konden CMR5c, COR35 en COW5 hevigere ziektesymptomen geven

en COR35 en CMR12a gaven in het derde experiment in alle planten symptomen. Dit zou kunnen

verklaard worden door het feit dat antimicrobiële stoffen geproduceerd door de isolaat fytotoxisch

kunnen zijn. CMR5c, CMR12a (Ma et al. 2016a), COR35 en COW5 kunnen CLPs produceren (Olorunleke

et al. niet gepubliceerde data). Het CLP viscosine kan hoofdrot veroorzaken in broccoli (Hildebrand et

al. 1998). CMR5c kan o.a. PLT en PCA produceren maar geen DAPG (Perneel et al. 2007). Bij hoge

concentraties zijn DAPG, PLT (Keel et al. 1992; Maurhofer et al. 1995; 1992) en PCA fytotoxisch (Gealy

et al. 1996; van Loon et al. 1998). De gevoeligheid is echter wel plantensoortafhankelijk. Zo waren

tabak, suikermaïs en tuinkers gevoeliger aan PLT en DAPG dan komkommer en tarwe (Maurhofer et

al. 1995; 1992). CMR5c en CMR12a kunnen HCN produceren (Perneel et al. 2007) en HCN heeft een

negatief effect op wortel metabolisme en groei (Schippers et al. 1990) en kan onkruidengroei hinderen

(Heydari et al. 2008). De volgende potentiële verklaringen zijn speculatief aangezien er niet geweten

is welke metabolieten een rol speelden in deze thesis. Doordat behandeling CMR5c (kan o.a. PLT, HCN,

CLP en fenazinen maar geen DAPG produceren) meer ziekte gaf dan de negatieve controle in

tegenstelling tot CHA0 (kan o.a. PLT, HCN, CLP en DAPG maar geen fenazinen produceren) zou kunnen

aangeven dat PLT, HCN, CLP en DAPG voor banaan in deze thesis niet aan een fytotoxische concentratie

voorkwamen in tegenstelling tot de fenazinen. Dus volgens bovenstaande hypothese zouden de CLPs

aangemaakt door CMR5c en CMR12a (orfamiden en sessiline) niet fytotoxisch zijn in tegenstelling tot

de CLPs geproduceerd door COR35 en COW5 (N3 en N1). Dus misschien is banaan gevoeliger voor

fenazinen, N3 en N1 wat dan ook de wisselende uitkomsten van ziektebeheersing door CMR12a en

COW5 zou kunnen verklaren. Zo kan er misschien een optimum zijn in de hoeveelheid productie van

antimicrobiële componenten door de pseudomonas isolaat, indien er niet te veel productie dan is er

een goede biocontrole maar indien er te veel productie is van deze metabolieten dan is er meer schade

aan de wortels en dus meer verwelking. Indien fytotoxiciteit een rol speelt kan dit (naast een ander

mechanisme dan antibiose) het niet overeenkomen tussen de in vitro en in planta resultaten verklaren.

62 E. Discussie

F. Conclusies en ideeën voor verder onderzoek 63

F. Conclusies en ideeën voor verder onderzoek

In de in vitro testen ondervonden alle Foc isolaten antagonisme door alle Pseudomonas isolaten. Er

was hoogstens een fungistatisch effect door COW5, COR35 en CMR5c. Dit antagonisme door

Pseudomonas isolaten was medium afhankelijk. Isolaat CMR5c gaf op zowel PDA als MEA uitstekend

antagonisme terwijl COR35 meer antagonisme gaf op PDA vergeleken met MEA en CHA0 net

omgekeerd. De verschillende Foc isolaten werden op hetzelfde medium en in dezelfde Pseudomonas

behandeling vergelijkbaar geïnhibeerd in hun groei.

Chlamydosporen inoculum van Foc gaf duidelijk meer ziekte in de bananenplanten dan conidiën

inoculum. Er werd aangetoond dat een hoger aandeel potgrond en lager aandeel zand

ziektebeheersing van panama ziekte op banaan door fluorescerende pseudomonaden sterk

begunstigde (maar niet significant), terwijl het substraat geen invloed had indien enkel de pathogeen

aanwezig was. Er was geen merkbaar effect van het opkweekmedium gebruikt voor de

pseudomonaden op de ziektesymptomen in de planten. Isolaat COW5 vertoonde het vaakst de beste

inhibitie van panama ziekte in planta maar de isolaten vertoonden grote verschillen in inhibitie van

ziekte tussen de verschillende testen. In bepaalde behandelingen van COR35, COW5, CMR12a en

CMR5c was er meer ziekte (of frequenter) dan in de zieke controle, mogelijk te wijten aan fytotoxiciteit

van metabolieten geproduceerd door de bacteriën. De populatiedichtheid van de fluorescerende

pseudomonaden in de rhizosfeer van de bananenwortels was redelijk laag. Behandelingen met de

isolaten COR35 en COW5 hadden een significant hogere populatiedichtheid in de rhizosfeer in het

substraat 50P/50Z vergeleken met potgrond maar vertoonden ook meer ziektesymptomen. De planten

met de hevigste ziektesymptomen vertoonden een tienmaal hogere populatiedichtheid dan de

gezondere planten (echter niet significant), dit is wellicht te verklaren door de gunstige niche die de

afstervende wortels vormen voor de bacteriën waardoor dit geen goede indicatie is voor de

biocontrole activiteit. Door de grote variatie in ziektesymptomen vastgesteld voor zowel de negatieve

controle als de Pseudomonas behandelingen konden er geen harde conclusies getrokken worden, om

dit te verhelpen zou er in toekomstig onderzoek met meer herhalingen gewerkt kunnen worden opdat

er sterkere statistische besluiten kunnen worden gevormd.

De Pseudomonas isolaten die voor goede inhibitie van schimmelgroei zorgden in vitro gaven minder

goede biocontrole in planta en omgekeerd waardoor een in vitro test voor het testen van de

biocontrole activiteit in dit geval geen sterke indicatie gaf voor in planta activiteit van de Pseudomonas

isolaat.

Het zou nuttig zijn te testen of het mechanisme via siderofoor-gemedieerde ijzercompetitie of ISR

verantwoordelijk was voor de ziektebeheersing gezien de verschillen tussen de in vitro en in planta

testen waarbij de in vitro test in de eerste plaats de invloed van de productie van antimicrobiële stoffen

nagaat. Ook zijn er van bepaalde Pseudomonas isolaten mutanten beschikbaar die een bepaalde

metaboliet niet meer kunnen produceren en kan het effect daarvan in de biocontrole activiteit van die

isolaat bepaald worden. Het effect van de Pseudomonas bacteriën op de bananenplant zonder

pathogeen kan nagegaan worden voor het bevestigen of het vermoeden van fytotoxiciteit terecht was

waarbij dan ook de populatiedichtheid kan bepaald worden. Ook zou de evolutie van de

populatiedichtheid in de loop van de tijd kunnen gemeten worden om te weten te komen of er een

effect is van de opkweekmethode van de fluorescerende pseudomonaden op de initiële vestiging in

de rhizosfeer. Er kan een in planta test met bv. 75P/25Z opgezet worden omdat er in 50P/50Z veel

ziekte voorkwam en terwijl er geen ziekte was in de behandelingen met Pseudomonas in potgrond en

dus ligt het optimum voor bepaling van de beste ziektebeheersende isolaat misschien tussen deze

64 F. Conclusies en ideeën voor verder onderzoek

twee substraten. Er kan onderzocht worden of combinaties van verschillende biocontrole organismen

zoals niet-pathogene Fox samen met fluorescerende speudomonaden een betere en/of stabielere

biocontrole van ziekte geven.

G. Verwijzingen 65

G. Verwijzingen

Aeron A, Kumar S, Pandey P en Maheshwari DK 2011. Emerging Role of Plant Growth Promoting Rhizobacteria in Agrobiology. In: Maheshwari, KD (Ed.) Bacteria in Agrobiology: Crop Ecosystems, Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, p. 1-36.

Alabouvette C, Lemanceau P en Steinberg C. 1993. Recent Advances in the Biological Control of Fusarium Wilts. Pesticide Science 37: 365-373.

Amir H en Alabouvette C. 1993. Involvement of Soil Abiotic Factors in the Mechanisms of Soil Suppressiveness to Fusarium Wilts. Soil Biology & Biochemistry 25: 157-164.

Anjaiah V, Koedam N, Nowak-Thompson B et al. 1998. Involvement of Phenazines and Anthranilate in the Antagonism of Pseudomonas aeruginosa PNA1 and Tn5 Derivatives Toward Fusarium spp. and Pythium spp. Molecular Plant-Microbe Interactions 11: 847-854.

Ardebili ZO, Ardebili NO en Hamdi SMM. 2011. Physiological effects of Pseudomonas fluorescens CHA0 on tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) plants and its possible impact on Fusarium oxysporum f. sp Lycopersici. Australian Journal of Crop Science 5: 1631-1638.

Arias O en Valverde M. 1987. Produccion y variacion somaclonal de plantas de banano variedad Grande Naine producidas por cultivo de tejidos. ASBANA (CRI) 6: 11.

Ayto J 2012. The Diner's Dictionary: Word Origins of Food and Drink. OUP Oxford, 405 p.

Baayen RP en Elgersma DM. 1985. Colonization and histopathology of susceptible and resistant carnation cultivars infected with Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Netherlands Journal of Plant Pathology 91: 119-135.

Baayen RP, O'Donnell K, Bonants PJM et al. 2000. Gene Genealogies and AFLP Analyses in the Fusarium oxysporum Complex Identify Monophyletic and Nonmonophyletic Formae Speciales Causing Wilt and Rot Disease. Phytopathology 90: 891-900.

Baker K en Cook RJ 1974. Biological control of plant pathogens. WH Freeman and Company.

Baker R, Elad Y en Sneh B 1986. Physical, Biological and Host Factors in Iron Competition in Soils. In: Swinburne, TR (Ed.) Iron, Siderophores, and Plant Diseases, Boston, MA: Springer US, p. 77-84.

Bakry F, Carreel F, Jenny C en Horry J-P 2009. Genetic Improvement of Banana. In: Jain, SM en Priyadarshan, PM (Eds.) Breeding Plantation Tree Crops: Tropical Species, New York, NY: Springer New York, p. 3-50.

Baltz RH. 2009. Daptomycin: mechanisms of action and resistance, and biosynthetic engineering. Current Opinion in Chemical Biology 13: 144-151.

Batasa G en Baliad A. 2005. Biological control of Fusarium wilt of abaca (Fusarium oxysporum) with Trichoderma and yeast. Philippine Journal of Crop Science 30: 29-37.

Belgrove A, Steinberg C en Viljoen A. 2011. Evaluation of Nonpathogenic Fusarium oxysporum and Pseudomonas fluorescens for Panama Disease Control. Plant Disease 95: 951-959.

Bentley S, Pegg KG, Moore NY, Davis RD en Buddenhagen IW. 1998. Genetic Variation Among Vegetative Compatibility Groups of Fusarium oxysporum f. sp. cubense Analyzed by DNA Fingerprinting. Phytopathology 88: 1283-1293.

Bhagwat B en Duncan EJ. 1998. Mutation breeding of banana cv. Highgate (Musa spp., AAA Group) for tolerance to Fusarium oxysporum f. sp. cubense using chemical mutagens. Scientia Horticulturae 73: 11-22.

Bhanusree M, Kumar KR, Suresh C, Shukla G en Chakravarty S. 2015. Comparative studies on tissue culture plantlet versus conventional sucker var. Grand Naine banana. Plant Archives 15: 785-788.

66 G. Verwijzingen

Blomme G, Ploetz RC, Jones D et al. 2013. A historical overview of the appearance and spread of Musa pests and pathogens on the African continent: highlighting the importance of clean Musa planting materials and quarantine measures. Annals of Applied Biology 162: 4-26.

Blumer C en Haas D. 2000. Mechanism, regulation, and ecological role of bacterial cyanide biosynthesis. Archives of Microbiology 173: 170-177.

Borse N, Chimote VP en Jadhav AS. 2011. Stability of micropropagated Musa acuminata cv. Grand Naine over clonal generations: A molecular assessment. Scientia Horticulturae 129: 390-395.

Brock TD en Madigan MT 2012. Brock biology of microorganisms. 13th ed., Global ed. ed: Boston, [Mass.]: Pearson.

Bruce RJ en West CA. 1989. Elicitation of Lignin Biosynthesis and Isoperoxidase Activity by Pectic Fragments in Suspension Cultures of Castor Bean. Plant Physiology 91: 889-897.

BTC 2011. The banana, a Fruit Living on Borrowed Time België, Brussel, 48 p.

Bull CT, Weller DM en Thomashow LS. 1991. Relationship Between Root Colonization and Suppression of Gaeumannomyces graminis var. tritici by Pseudomonas fluorescens Strain 2-79. Phytopathology 81: 954-959.

Cafri D, Katan J en Katan T. 2005. Cross-pathogenicity between Formae Speciales of Fusarium oxysporum, the Pathogens of Cucumber and Melon. Journal of Phytopathology 153: 615-622.

Cao LX, Qiu ZQ, You JL, Tan HM en Zhou SN. 2005. Isolation and characterization of endophytic streptomycete antagonists of fusarium wilt pathogen from surface-sterilized banana roots. Fems Microbiology Letters 247: 147-152.

Chen YF, Chen W, Huang X et al. 2013. Fusarium wilt-resistant lines of Brazil banana (Musa spp., AAA) obtained by EMS-induced mutation in a micro-cross-section cultural system. Plant Pathology 62: 112-119.

Chen YF, Dai XM, Gong Q et al. 2011. Non-Conventional Breeding of Banana (Musa spp.). In: VanDenBergh, I, Smith, M, Swennen, R en Hermanto, C (Eds.) International Ishs-Promusa Symposium on Global Perspectives on Asian Challenges, p. 39-46.

Chin-A-Woeng TFC, Bloemberg GV, Mulders IHM, Dekkers LC en Lugtenberg BJJ. 2000. Root Colonization by Phenazine-1-Carboxamide-Producing Bacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1391 is Essential for Biocontrol of Tomato Foot and Root Rot. Molecular Plant-Microbe Interactions 13: 1340-1345.

Chin-A-Woeng TFC, Bloemberg GV, van der Bij AJ et al. 1998. Biocontrol by Phenazine-1-carboxamide-Producing Pseudomonas chlororaphis PCL1391 of Tomato Root Rot Caused by Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici. Molecular Plant-Microbe Interactions 11: 1069-1077.

Cornea CP, Grebenisan I, Mateescu R, Vamanu E en Campeanu G. 2002. Isolation and Characterization of New Bacillus Spp. Strains-Useful as Biocontrol Agents of Plant Pathogens. Romanian Biotechnological Letters 8: 1115-1122.

Correll JC. 1991. The Relationship Between Formae Speciales, Races, and Vegetative Compatibility Groups in Fusarium oxysporum. Phytopathology 81: 1061-1064.

Crane JH, Balerdi CF en Maguire I. 2005. Banana growing in the Florida home landscape. Institute of Food and Agricultural Sciences (IFAS), University of Florida, Florida.

D'Aes J, Gia KHH, De Maeyer K et al. 2011. Biological Control of Rhizoctonia Root Rot on Bean by Phenazine- and Cyclic Lipopeptide-Producing Pseudomonas CMR12a. Phytopathology 101: 996-1004.

D'Aes J en Höfte M. 2012. Biological activity and regulation of cyclic lipopeptides and phenazines produced by biocontrol strain Pseudomonas CMR12a. Doctoraat, UGent.

D'Aes J, Kieu NP, Leclere V et al. 2014. To settle or to move? The interplay between two classes of cyclic lipopeptides in the biocontrol strain Pseudomonas CMR12a. Environmental Microbiology 16: 2282-2300.

Daayf F, BelRhlid R en Belanger RR. 1997. Methyl ester of p-coumaric acid: A phytoalexin-like compound from long English cucumber leaves. Journal of Chemical Ecology 23: 1517-1526.

G. Verwijzingen 67

Daly A, Walduck G, Chidwick L en Meldrum R. 2006. Management of the Tropical Race 4 Strain of Banana Fusarium Wilt. Northern Territory Department of Primary Industry, Fisheries & Mines Primary Industries Tech Annu Rep: 12-15.

Daniells J. 2010. Fusarium wilt of banana - An integrated approach to disease management. In: Tripathi L (Ed) Bananas, plantains and enset II Tree and Forestry Science and Biotechnology 4: 50-55.

Dave B en Dube H. 2000. Detection and chemical characterisation of siderophores of rhizobacterial fluorescent Pseudomonas. Indian Phytopathology 53: 97-98.

De Bruyn C en Höfte M. 2016. De biosynthese, regulatie en secretie van cyclische lipopeptiden in fluorescente Pseudomonas populaties. Masterproef, UGent.

De Jonghe K, De Dobbelaere I, Sarrazyn R en Höfte M. 2005. Control of Phytophthora cryptogea in the hydroponic forcing of witloof chicory with the rhamnolipid-based biosurfactant formulation PRO1. Plant Pathology 54: 219-226.

De La Fuente L, Landa BB en Weller DM. 2006. Host Crop Affects Rhizosphere Colonization and Competitiveness of 2,4-Diacetylphloroglucinol-Producing Pseudomonas fluorescens. Phytopathology 96: 751-762.

de Souza JT, Arnould C, Deulvot C et al. 2003. Effect of 2,4-Diacetylphloroglucinol on Pythium: Cellular Responses and Variation in Sensitivity Among Propagules and Species. Phytopathology 93: 966-975.

Dita MA, Waalwijk C, Buddenhagen IW, Souza MT en Kema GHJ. 2010. A molecular diagnostic for tropical race 4 of the banana fusarium wilt pathogen. Plant Pathology 59: 348-357.

Domínguez-Hernández JD, Negrín-Medina MA en Rodríguez-Hernández CM. 2010. Potassium Selectivity in Transported Volcanic Soils (Sorribas) under Banana Cultivation in Relation to Banana-Wilt Expression Caused by Fusarium oxysporum f. sp Cubense. Communications in Soil Science and Plant Analysis 41: 1674-1692.

Domínguez J, Negrín MA en Rodríguez CM. 2001. Aggregate water-stability, particle-size and soil solution properties in conducive and suppressive soils to Fusarium wilt of banana from Canary Islands (Spain). Soil Biology & Biochemistry 33: 449-455.

Domínguez J, Rodríguez CM en Hernández-Moreno JM 1995. Iron and Fusarium wilts in banana crops on Andic soils. In: Abadía, J (Ed.) Iron Nutrition in Soils and Plants: Proceedings of the Seventh International Symposium on Iron Nutrition and Interactions in Plants, June 27–July 2, 1993, Zaragoza, Spain, Dordrecht: Springer Netherlands, p. 255-258.

Dong X, Ling N, Wang M, Shen QR en Guo SW. 2012. Fusaric acid is a crucial factor in the disturbance of leaf water imbalance in Fusarium-infected banana plants. Plant Physiology and Biochemistry 60: 171-179.

Duffy BK en Défago G. 1997. Zinc Improves Biocontrol of Fusarium Crown and Root Rot of Tomato by Pseudomonas fluorescens and Represses the Production of Pathogen Metabolites Inhibitory to Bacterial Antibiotic Biosynthesis. Phytopathology 87: 1250-1257.

Duijff BJ, Gianinazzi-Pearson V en Lemanceau P. 1997. Involvement of the outer membrane lipopolysaccharides in the endophytic colonization of tomato roots by biocontrol Pseudomonas fluorescens strain WCS417r. New Phytologist 135: 325-334.

Duijff BJ, Meijer JW, Bakker PAHM en Schippers B. 1993. Siderophore-mediated competition for iron and induced resistance in the suppression of fusarium-wilt of carnation by fluorescent Pseudomonas spp. Netherlands Journal of Plant Pathology 99: 277-289.

FAO 2014a. The changing role of multinational companies in the global banana trade. Rome, p. 7.

FAO 2014b. Working together for sustainable banana production and trade Call for action to all partners of the World Banana Forum / Public announcement Fusarium wilt TR4 Task Force founded in December 2013.

FAOSTAT. 2015. Available: http://faostat3.fao.org/ [Accessed 20 november 2015].

Fishal EMM, Meon S en Yun WM. 2010. Induction of Tolerance to Fusarium Wilt and Defense-Related Mechanisms in the Plantlets of Susceptible Berangan Banana Pre-Inoculated with Pseudomonas sp (UPMP3) and Burkholderia sp (UPMB3). Agricultural Sciences in China 9: 1140-1149.

68 G. Verwijzingen

Fortunato AA, Rodrigues FA, Baroni JCP et al. 2012. Silicon Suppresses Fusarium Wilt Development in Banana Plants. Journal of Phytopathology 160: 674-679.

Fourie G, Steenkamp ET, Gordon TR en Viljoen A. 2009. Evolutionary Relationships among the Fusarium oxysporum f. sp cubense Vegetative Compatibility Groups. Applied and Environmental Microbiology 75: 4770-4781.

Fourie G, Steenkamp ET, Ploetz RC, Gordon TR en Viljoen A. 2011. Current status of the taxonomic position of Fusarium oxysporum formae specialis cubense within the Fusarium oxysporum complex. Infection Genetics and Evolution 11: 533-542.

Fraser-Smith S, Czislowski E, Daly A et al. 2016. Single gene resistance to Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race 4 in the wild banana Musa acuminata subsp. malaccensis. International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium, p. 95-100.

Fridlender M, Inbar J en Chet I. 1993. Biological control of soilborne plant pathogens by a β-1,3 glucanase-producing Pseudomonas cepacia. Soil Biology and Biochemistry 25: 1211-1221.

Garrido-Sanz D, Meier-Kolthoff JP, Goker M et al. 2016. Genomic and Genetic Diversity within the Pseudomonas fluorescens Complex. PLoS One 11: 30.

Gealy DR, Gurusiddaiah S en Ogg AG. 1996. Isolation and characterization of metabolites from Pseudomonas syringae-strain 3366 and their phytotoxicity against certain weed and crop species. Weed Science 44: 383-392.

Geense P, Pattison A, Kukulies T, Scholberg J en Molina A. 2015. Can Changes in Soil Properties in Organic Banana Production Suppress Fusarium Wilt? Natural Resources 6: 181-195.

Getha K en Vikineswary S. 2002. Antagonistic effects of Streptomyces violaceusniger strain G10 on Fusarium oxysporum f.sp cubense race 4: Indirect evidence for the role of antibiosis in the antagonistic process. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 28: 303-310.

Gold CS, Pena JE en Karamura EB. 2001. Biology and integrated pest management for the banana weevil Cosmopolites sordidus (Germar) (Coleoptera: Curculionidae). Integrated Pest Management Reviews 6: 79-155.

Gordon TR en Martyn RD. 1997. The evolutionary biology of Fusarium oxysporum. Annual Review of Phytopathology 35: 111-128.

Graham MY en Graham TL. 1991. Rapid Accumulation of Anionic Peroxidases and Phenolic Polymers in Soybean Cotyledon Tissues following Treatment with Phytophthora megasperma f. so. Glycinea Wall Glucan. Plant Physiology 97: 1445-1455.

Gross H en Loper JE. 2009. Genomics of secondary metabolite production by Pseudomonas spp. Natural Product Reports 26: 1408-1446.

Haas D en Défago G. 2005. Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonads. Nature Reviews Microbiology 3: 307-319.

Haas D en Keel C. 2003. Regulation of Antibiotic Production in Root-Colonizing Pseudomonas spp. and Relevance for Biological Control of Plant Disease. Annual Review of Phytopathology 41: 117-153.

He CY, Hsiang T en Wolyn DJ. 2002. Induction of systemic disease resistance and pathogen defence responses in Asparagus officinalis inoculated with nonpathogenic strains of Fusarium oxysporum. Plant Pathology 51: 225-230.

Heil M en Bostock RM. 2002. Induced systemic resistance (ISR) against pathogens in the context of induced plant defences. Annals of Botany 89: 503-512.

Hennessy C, Walduck G, Daly A en Padovan A. 2005. Weed hosts of Fusarium oxysporum f. sp cubense tropical race 4 in northern Australia. Australasian Plant Pathology 34: 115-117.

Heslop-Harrison JS en Schwarzacher T. 2007. Domestication, genomics and the future for banana. Annals of Botany 100: 1073-1084.

G. Verwijzingen 69

Heydari S, Rezvani-Moghadam P en Arab SM. 2008. Hydrogen Cyanide Production Ability by Pseudomonas fluorescence Bacteria and their Inhibition Potential on Weed Germination. In Proceedings “Competition for Resources in a Changing World: New Drive for Rural Development”, Tropentag, Hohenheim http://wwwtropentagde/2008/abstracts/full/676pdf.

Heyman L en Höfte M. 2015. Non-pathogenic Fusarium oxysporum populations as drivers of soil suppressiveness to Fusarium wilt in banana. Masterproef, UGent.

Hildebrand PD, Braun PG, McRae KB en Lu X. 1998. Role of the biosurfactant viscosin in broccoli head rot caused by a pectolytic strain of Pseudomonas fluorescens. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie 20: 296-303.

Hohlneicher U, Hartmann R, Taraz K en Budzikiewicz H. 1995. Pyoverdin, Ferribactin, Azotobactin - A New Triad of Siderophores from Pseudomonas chlororaphis ATCC 9446 and Its Relation to Pseudomonas fluorescens ATCC 13525. Zeitschrift Fur Naturforschung C-a Journal of Biosciences 50: 337-344.

Höper H, Steinberg C en Alabouvette C. 1995. Involvement of clay type and pH in the mechanisms of soil suppressiveness to fusarium wilt of flax. Soil Biology and Biochemistry 27: 955-967.

Howell CR en Stipanovic RD. 1979. Control of Rhizoctonia solani on Cotton Seedlings with Pseudomonas fluorescens and With an Antibiotic Produced by the Bacterium. Phytopathology 69: 480-482.

Howell CR en Stipanovic RD. 1980. Suppression of Pythium ultimum-Induced Damping-Off of Cotton Seedlings by Pseudomonas fluorescens and its Antibiotic, Pyoluteorin. Phytopathology 70: 712-715.

Hua GKH en Höfte M. 2015. The involvement of phenazines and cyclic lipopeptide sessilin in biocontrol of Rhizoctonia root rot on bean (Phaseolus vulgaris) by Pseudomonas sp CMR12a is influenced by substrate composition. Plant and Soil 388: 243-253.

Huang YH, Wang RC, Li CH et al. 2012. Control of Fusarium wilt in banana with Chinese leek. European Journal of Plant Pathology 134: 87-95.

Hwang SC en Ko WH 1987. Somaclonal variation of bananas and screening for resistance to Fusarium wilt. In: Banana and plantain breeding strategies. Proceedings of an International Workshop Held at Cairns Australia State Mutual Book & Periodical Service, Ltd: ACIAR Proceedings No. 21, p. 151-156.

Hwang SC en Ko WH. 2004. Cavendish banana cultivars resistant to fusarium wilt acquired through somaclonal variation in Taiwan. Plant Disease 88: 580-588.

Iavicoli A, Boutet E, Buchala A en Métraux JP. 2003. Induced Systemic Resistance in Arabidopsis thaliana in Response to Root Inoculation with Pseudomonas fluorescens CHA0. Molecular Plant-Microbe Interactions 16: 851-858.

Israeli Y, Reuveni O en Lahav E. 1991. Qualitative aspects of somaclonal variations in banana propagated by in vitro techniques. Scientia Horticulturae 48: 71-88.

Jaizme-Vega MC, Hernandez BS en Hernandez JMH 1998. Interaction of arbuscular mycorrhizal fungi and the soil pathogen Fusarium oxysporum f. sp. cubense on the first stages of micropropagated Grande Naine banana. In: Sauco, VG (Ed.) First International Symposium on Banana in the Subtropics, Proceedings, p. 285-295.

Jamali F, Sharifi-Tehrani A, Lutz MP en Maurhofer M. 2009. Influence of Host Plant Genotype, Presence of a Pathogen, and Coinoculation with Pseudomonas fluorescens Strains on the Rhizosphere Expression of Hydrogen Cyanide- and 2,4-Diacetylphloroglucinol Biosynthetic Genes in P. fluorescens Biocontrol Strain CHA0. Microbial Ecology 57: 267-275.

Kahlon RS 2016. Pseudomonas: Molecular and Applied Biology. Springer International Publishing.

Kasprzewska A. 2003. Plant chitinases - Regulation and function. Cellular & Molecular Biology Letters 8: 809-824.

Kavino M, Harish S, Kumar N, Saravanakumar D en Samiyappan R. 2008. Induction of systemic resistance in banana (Musa spp.) against Banana bunchy top virus (BBTV) by combining chitin with root-colonizing Pseudomonas fluorescens strain CHA0. European Journal of Plant Pathology 120: 353-362.

70 G. Verwijzingen

Keel C, Schnider U, Maurhofer M et al. 1992. Suppression of Root Diseases by Pseudomonas fluorescens CHA0 - Importance of the Bacterial Secondary Metabolite 2,4-Diacetylphloroglucinol. Molecular Plant-Microbe Interactions 5: 4-13.

Kistler HC, Alabouvette C, Baayen RP et al. 1998. Systematic numbering of vegetative compatibility groups in the plant pathogenic fungus Fusarium oxysporum. Phytopathology 88: 30-32.

Kraemer SM. 2004. Iron oxide dissolution and solubility in the presence of siderophores. Aquatic Sciences 66: 3-18.

Kruijt M, Tran H en Raaijmakers JM. 2009. Functional, genetic and chemical characterization of biosurfactants produced by plant growth-promoting Pseudomonas putida 267. Journal of Applied Microbiology 107: 546-556.

Kumari A en Kumar H. 2015. Association of nonpathogenic Fusarium oxysporum species with cultured shoot apices of banana (Musa acuminata) cultivars. The Bioscan 10: 629-633.

Labuschagne N, Pretorius T en Idris AH 2011. Plant Growth Promoting Rhizobacteria as Biocontrol Agents Against Soil-Borne Plant Diseases. In: Maheshwari, KD (Ed.) Plant Growth and Health Promoting Bacteria, Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, p. 211-230.

Laville J, Blumer C, Von Schroetter C et al. 1998. Characterization of the hcnABC Gene Cluster Encoding Hydrogen Cyanide Synthase and Anaerobic Regulation by ANR in the Strictly Aerobic Biocontrol Agent Pseudomonas fluorescens CHAO. Journal of bacteriology 180: 3187-3196.

Leeman M, den Ouden FM, van Pelt JA et al. 1996. Iron Availability Affects Induction of Systemic Resistance to Fusarium wilt of Radish by Pseudomonas fluorescens. Phytopathology 86: 149-155.

Leeman M, van Pelt JA, den Ouden FM et al. 1995. Induction of systemic resistance by Pseudomonas fluorescens in radish cultivars differing in susceptibility to fusarium wilt, using a novel bioassay. European Journal of Plant Pathology 101: 655-664.

Lemanceau P en Alabouvette C. 1993. Suppression of Fusarium Wilt by Fluorescent Pseudomonads: Mechanisms and Applications. Biocontrol Science and Technology 3: 219-234.

Lemanceau P, Alabouvette C en Meyer JM 1986. Production of Fusarinine and Iron Assimilation by Pathogenic and Non-Pathogenic Fusarium. In: Swinburne, TR (Ed.) Iron, Siderophores, and Plant Diseases, Boston, MA: Springer US, p. 251-259.

Lemanceau P, Bakker PAHM, De Kogel WJ, Alabouvette C en Schippers B. 1993. Antagonistic Effect of Nonpathogenic Fusarium oxysporum Fo47 and Pseudobactin 358 upon Pathogenic Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Applied and Environmental Microbiology 59: 74-82.

Lemanceau P, Corberand T, Gardan L et al. 1995. Effect of Two Plant Species, Flax (Linum usitatissinum L.) and Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.), on the Diversity of Soilborne Populations of Fluorescent Pseudomonads. Applied and Environmental Microbiology 61: 1004-1012.

Lescot T. 2008. Present state of the production of Musaceae in Africa, Asia Pacific and the Caribbean. In: International Meeting ACORBAT 2008, 2008-11-10 / 2008-11-14 2008 Guayaquil, Équateur, public: s.n., p. 12 p.

Li C, Mostert G, Zuo C et al. 2013a. Diversity and Distribution of the Banana Wilt Pathogen Fusarium oxysporum F. Sp. cubense in China. Fungal Genomics & Biology 3.

Li C, Zuo C, Deng G et al. 2013b. Contamination of Bananas with Beauvericin and Fusaric Acid Produced by Fusarium oxysporum f. sp cubense. Plos One 8.

Li W, Ge X, Wu W et al. 2015. Identification of defense-related genes in banana roots infected by Fusarium oxysporum f. sp cubense tropical race 4. Euphytica 205: 837-849.

Li W, Rokni-Zadeh H, De Vleeschouwer M et al. 2013c. The Antimicrobial Compound Xantholysin Defines a New Group of Pseudomonas Cyclic Lipopeptides. Plos One 8.

Ligon JM, Hill DS, Hammer PE et al. 2000. Natural products with antifungal activity from Pseudomonas biocontrol bacteria. Pest Management Science 56: 688-695.

G. Verwijzingen 71

Lo Cantore P, Lazzaroni S, Coraiola M et al. 2006. Biological Characterization of White Line-Inducing Principle (WLIP) Produced by Pseudomonas reactans NCPPB1311. Molecular Plant-Microbe Interactions 19: 1113-1120.

Loper JE en Henkels MD. 1997. Availability of Iron to Pseudomonas fluorescens in Rhizosphere and Bulk Soil Evaluated with an Ice Nucleation Reporter Gene. Applied and Environmental Microbiology 63: 99-105.

Loper JE en Henkels MD. 1999. Utilization of Heterologous Siderophores Enhances Levels of Iron Available to Pseudomonas putida in the Rhizosphere. Applied and Environmental Microbiology 65: 5357-5363.

Lugtenberg B en Kamilova F. 2009. Plant-Growth-Promoting Rhizobacteria. Annual Review of Microbiology 63: 541-556.

M'piga P, Bélanger RR, Paulitz TC en Benhamou N. 1997. Increased resistance to Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici in tomato plants treated with the endophytic bacterium Pseudomonas fluorescens strain 63-28. Physiological and Molecular Plant Pathology 50: 301-320.

Ma LJ, van der Does HC, Borkovich KA et al. 2010. Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium. Nature 464: 367-373.

Ma Z, Geudens N, Kieu NP et al. 2016a. Biosynthesis, Chemical Structure, and Structure-Activity Relationship of Orfamide Lipopeptides Produced by Pseudomonas protegens and Related Species. Frontiers in Microbiology 7.

Ma Z, Hua GKH, Ongena M en Höfte M. 2016b. Role of phenazines and cyclic lipopeptides produced by Pseudomonas sp. CMR12a in induced systemic resistance on rice and bean. Environmental Microbiology Reports.

Machado AP, Vivi VK, Tavares JR, Gueiros FJ en Fischman O. 2010. Antibiosis and Dark-Pigments Secretion by the Phytopathogenic and Environmental Fungal Species after Interaction in vitro with a Bacillus subtilis Isolate. Brazilian Archives of Biology and Technology 53: 997-1004.

Marin DH, Romero RA, Guzman M en Sutton TB. 2003. Black sigatoka: An increasing threat to banana cultivation. Plant Disease 87: 208-222.

Mascher F, Hase C, Bouffaud ML, Défago G en Moënne-Loccoz Y. 2014. Cell culturability of Pseudomonas protegens CHA0 depends on soil pH. Fems Microbiology Ecology 87: 441-450.

Mauch F, Mauch-Mani B en Boller T. 1988. Antifungal Hydrolases In Pea Tissue. II. INHIBITION OF FUNGAL GROWTH BY COMBINATIONS OF CHITINASE AND β-1,3-GLUCANASE. Plant Physiology 88: 936-942.

Maurhofer M, Keel C, Haas D en Défago G. 1995. influence of plant species on disease suppression by Pseudomonas fluorescens strain CHAO with enhanced antibiotic production. Plant Pathology 44: 40-50.

Maurhofer M, Keel C, Schnider U et al. 1992. Influence of Enhanced Antibiotic Production in Pseudomonas fluorescens Strain-CHA0 on its Disease Suppressive Capacity. Phytopathology 82: 190-195.

Mazurier S, Corberand T, Lemanceau P en Raaijmakers JM. 2009. Phenazine antibiotics produced by fluorescent pseudomonads contribute to natural soil suppressiveness to Fusarium wilt. Isme Journal 3: 977-991.

Meldrum RA, Daly AM, Tran-Nguyen LTT en Aitken EAB. 2013. Are banana weevil borers a vector in spreading Fusarium oxysporum f. sp cubense tropical race 4 in banana plantations? Australasian Plant Pathology 42: 543-549.

Mercado-Blanco J en Bakker PAHM. 2007. Interactions between plants and beneficial Pseudomonas spp.: exploiting bacterial traits for crop protection. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 92: 367-389.

Mercado-Blanco J, van der Drift KMGM, Olsson PE et al. 2001. Analysis of the pmsCEAB gene cluster involved in biosynthesis of salicylic acid and the siderophore pseudomonine in the biocontrol strain Pseudomonas fluorescens WCS374. Journal of bacteriology 183: 1909-1920.

Mohandas S, Manamohan M, Rawal RD et al. 2004. Interaction of Fusarium oxysporum f.sp cubense with Pseudomonas fluorescens precolonized to banana roots. World Journal of Microbiology & Biotechnology 20: 651-655.

72 G. Verwijzingen

Monfreda C, Ramankutty N en Foley JA. 2008. Farming the planet: 2. Geographic distribution of crop areas, yields, physiological types, and net primary production in the year 2000. Global Biogeochemical Cycles 22: 19.

Moore NY, Bentley S, Pegg KG et al. 2009. Fusarium wilt. In: Genetic Improvement of Banana. In: Jain, SM en Priyadarshan, PM (Eds.) Breeding Plantation Tree Crops: Tropical Species, New York, NY: Springer New York, p. 3-50.

Moore NY, Hargreaves PA, Pegg KG en Irwin JAG. 1991. Characterization of Strains of Fusarium oxysporum f. sp. cubense by Production of Volatiles. Australian Journal of Botany 39: 161-166.

Morton JF 1987. Fruits of Warm Climates. In: Dowling, CF (Ed.), Miami, Florida: Creative Resource Systems, Inc., p. 505.

Muah SK en Kema G. 2013. Novel Molecular Tools for the Detection and Quantification of Fusarium oxysporum formae speciale cubense Tropical Race 4 and Radopholus similis in Bananas. Masterproef, UGent.

Nandi M, Selin C, Brassinga AKC et al. 2015. Pyrrolnitrin and Hydrogen Cyanide Production by Pseudomonas chlororaphis Strain PA23 Exhibits Nematicidal and Repellent Activity against Caenorhabditis elegans. Plos One 10.

Nasira N, Pittaway PA en Pegg KG. 2003. Effect of organic amendments and solarisation on Fusarium wilt in susceptible banana plantlets, transplanted into naturally infested soil. Australian Journal of Agricultural Research 54: 251-257.

Neilands JB. 1995. Siderophores: Structure and Function of Microbial Iron Transport Compounds. Journal of Biological Chemistry 270: 26723-26726.

Nel B, Steinberg C, Labuschagne N en Viljoen A. 2006. The potential of nonpathogenic Fusarium oxysporum and other biological control organisms for suppressing fusarium wilt of banana. Plant Pathology 55: 217-223.

Nel B, Steinberg C, Labuschagne N en Viljoen A. 2007. Evaluation of fungicides and sterilants for potential application in the management of Fusarium wilt of banana. Crop Protection 26: 697-705.

Nelson SC, Ploetz RC en Kepler AK 2006. Musa species (banana and plantain). Species profiles for Pacific island agroforestry, Hōlualoa, Hawai‘i: Permanent Agriculture Resources (PAR), 33 p.

Nielsen MN en Sorensen J. 1999. Chitinolytic activity of Pseudomonas fluorescens isolates from barley and sugar beet rhizosphere. Fems Microbiology Ecology 30: 217-227.

Niranjan Raj S, Shetty HS en Reddy MS 2006. Plant Growth Promoting Rhizobacteria: Potential Green Alternative for Plant Productivity. In: Siddiqui, ZA (Ed.) PGPR: Biocontrol and Biofertilization, Dordrecht: Springer Netherlands, p. 197-216.

Notz R, Maurhofer M, Dubach H, Haas D en Défago G. 2002. Fusaric acid-producing strains of Fusarium oxysporum alter 2,4-diacetylphloroglucinol biosynthetic gene expression in Pseudomonas fluorescens CHA0 in vitro and in the rhizosphere of wheat. Applied and Environmental Microbiology 68: 2229-2235.

O'Donnell K, Kistler HC, Cigelnik E en Ploetz RC. 1998. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 2044-2049.

OGTR 2008. The Biology of Musa L. (banana). Ver. 1. Office of the Gene Technology Regulator, Australian Government Department of Health and Ageing, Canberra 77 p.

Olorunleke FE, Hua GKH, Kieu NP, Ma Z en Höfte M. 2015a. Interplay between orfamides, sessilins and phenazines in the control of Rhizoctonia diseases by Pseudomonas sp CMR12a. Environmental Microbiology Reports 7: 774-781.

Olorunleke FE, Kieu NP, Höfte M et al. 2015b. Recent advances in Pseudomonas biocontrol. Bacteria-plant Interactions : Advanced Research and Future Trends: Poole.

Ongena M, Jourdan E, Adam A et al. 2007. Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants. Environmental Microbiology 9: 1084-1090.

Ordonez N, Seidl M, Waalwijk C et al. 2015. Worse Comes to Worst: Bananas and Panama Disease-When Plant and Pathogen Clones Meet. Plos Pathogens 11.

G. Verwijzingen 73

PaDIL. 2016. Plant Biosecurity Toolbox: Fusarium Wilt (Fusarium oxysporum f. sp. cubense): Taxonomic Description [Online]. Available: http://pbt.padil.gov.au/index.php?q=node/122&pbtID=137 [Accessed 15 mei 2016].

Park D. 1959. Some Aspects of the Biology of Fusarium oxysporum Schl. in Soil. Annals of Botany 23: 35-49.

Pegg K en Langdon P 1986. Fusarium wilt (Panama disease): a review. Banana and Plantain Breeding Strategies: Proceedings of an International Workshop, Cairns, Australia, p. 119-123.

Peng HX, Sivasithamparam K en Turner DW. 1999. Chlamydospore germination and Fusarium wilt of banana plantlets in suppressive and conducive soils are affected by physical and chemical factors. Soil Biology & Biochemistry 31: 1363-1374.

Peng M en Kuc J. 1992. Peroxidase-Generated Hydrogen Peroxide as a Source of Antifungal Activity In Vitro and on Tobacco Leaf Disks. Phytopathology 82: 696-699.

Pereira LF, Goodwin PH en Erickson L. 2000. Peroxidase activity during susceptible and resistant interactions between cassava (Manihot esculenta) and Xanthomonas axonopodis pv. manihotis and Xanthomonas cassavae. Journal of Phytopathology-Phytopathologische Zeitschrift 148: 575-577.

Pérez-Vicente L. 2004. Fusarium wilt (Panama disease) of bananas: an updating review of the current knowledge on the disease and its causal agent. Publication Especial XV1 Reunion International Acrobat 2004 Dexaca, Mexico 1-15.

Pérez-Vicente L, Dita M en Martínez E. 2014. Technical Manual Prevention and diagnostic of Fusarium Wilt (Panama disease) of banana caused by Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4 (TR4). In: Regional Workshop on the Diagnosis of Fusarium Wilt (Panama disease) caused by Fusarium oxysporum f sp cubense Tropical Race 4: Mitigating the Threat and Preventing its Spread in the Caribbean, St Augustine, Trinidad and Tobago, 05-09/05/2014 2014, Rome, Italy FAO, p. 74.

Perneel M, D'hondt L, De Maeyer K et al. 2008. Phenazines and biosurfactants interact in the biological control of soil-borne diseases caused by Pythium spp. Environmental Microbiology 10: 778-788.

Perneel M, Heyrman J, Adiobo A et al. 2007. Characterization of CMR5c and CMR12a, novel fluorescent Pseudomonas strains from the cocoyam rhizosphere with biocontrol activity. Journal of Applied Microbiology 103: 1007-1020.

Perrier X, Bakry F, Carreel F et al. 2009. Combining Biological Approaches to Shed Light on the Evolution of Edible Bananas. Ethnobotany Research and Applications 7: 199-216.

Perrier X, De Langhe E, Donohue M et al. 2011. Multidisciplinary perspectives on banana (Musa spp.) domestication. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 11311-11318.

Pierson LS en Pierson EA. 1996. Phenazine antibiotic production in Pseudomonas aureofaciens: Role in rhizosphere ecology and pathogen suppression. Fems Microbiology Letters 136: 101-108.

Pieterse CMJ, Van Pelt JA, Ton J et al. 2000. Rhizobacteria-mediated induced systemic resistance (ISR) in Arabidopsis requires sensitivity to jasmonate and ethylene but is not accompanied by an increase in their production. Physiological and Molecular Plant Pathology 57: 123-134.

Pillay M en Tenkouano A 2011. Banana breeding: progress and challenges. CRC Press, 383 p.

Ploetz RC 2000. Panama Disease: A Classic and Destructive Disease of Banana. Florida, USA: Plant Health Progress.

Ploetz RC. 2005a. Panama Disease: An Old Nemesis Rears its Ugly Head. Part 2. The Cavendish Era and Beyond [Online]. Florida, USA: Plant Health Progress. [Accessed 15 oktober 2015].

Ploetz RC. 2005b. Panama Disease: An Old Nemesis Rears its Ugly Head: Part 1: The beginnings of the banana export trades [Online]. Florida, USA: Plant Health Progress. [Accessed 15 oktober 2015].

Ploetz RC. 2006. Fusarium wilt of banana is caused by several pathogens referred to as Fusarium oxysporum f. sp cubense. Phytopathology 96: 653-656.

74 G. Verwijzingen

Ploetz RC en Churchill ACL 2011. Fusarium Wilt: the Banana Disease that Refuses to Go Away. In: VanDenBergh, I, Smith, M, Swennen, R en Hermanto, C (Eds.) International Ishs-Promusa Symposium on Global Perspectives on Asian Challenges, p. 519-526.

Ploetz RC, Kepler AK, Daniells J en Nelson SC 2007. Banana and plantain—an overview with emphasis on Pacific island cultivars. Species profiles for Pacific island agroforestry, Hōlualoa, Hawai‘i: Permanent Agriculture Resources (PAR), 21-32 p.

Ploetz RC en Pegg K. 1997. Fusarium wilt of banana and Wallace's line: Was the disease originally restricted to his Indo-Malayan region? Australasian Plant Pathology 26: 239-249.

ProMusa. 2015. Distribution of tropical race 4 (TR4) [Online]. Available: http://www.promusa.org/Tropical+race+4+-+TR4 [Accessed 20 april 2016].

Puhalla JE. 1985. Classification of strains of Fusarium oxysporum on the basis of vegetative compatibility. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique 63: 179-183.

Purwati RD, Hidayah N, Sudjindro en Sudarsono. 2008. Inoculation Methods and Conidial Densities of Fusarium oxysporum f.sp. cubense in Abaca. HAYATI Journal of Biosciences: 1.

Raaijmakers JM, Bonsall RE en Weller DM. 1999. Effect of population density of Pseudomonas fluorescens on production of 2,4-diacetylphloroglucinol in the rhizosphere of wheat. Phytopathology 89: 470-475.

Raaijmakers JM, de Bruijn I en de Kock MJD. 2006. Cyclic lipopeptide production by plant-associated Pseudomonas spp.: Diversity, activity, biosynthesis, and regulation. Molecular Plant-Microbe Interactions 19: 699-710.

Raaijmakers JM, de Bruijn I, Nybroe O en Ongena M. 2010. Natural functions of lipopeptides from Bacillus and Pseudomonas: more than surfactants and antibiotics. Fems Microbiology Reviews 34: 1037-1062.

Raaijmakers JM, Leeman M, van Oorschot MMP et al. 1995. Dose-Response Relationships in Biological Control of Fusarium Wilt of Radish by Pseudomonas spp. Phytopathology 85: 1075-1081.

Raboin LM, Carreel F, Noyer JL et al. 2005. Diploid ancestors of triploid export banana cultivars: Molecular identification of 2n restitution gamete donors and n gamete donors. Molecular Breeding 16: 333-341.

Radhajeyalakshmi R, Xia Y en Shah D. 2014. Evidence of salicylic acid regulatory mechanisms of disease resistance against banana vascular wilt Fusarium oxysporium f.sp. cubense in Arabidopsis thaliana. African Journal of Biotechnology 13: 3030-3035.

Rieger M. 2016. Banana Tree – Musa spp. [Online]. Available: http://www.fruit-crops.com/banana-musa-spp/ [Accessed 12 mei 2016].

Rishbeth J. 1957. Fusarium Wilt of Bananas in Jamaica: II. Some Aspects of Host-parasite Relationships. Annals of Botany 21: 215-245.

Rishbeth J en Naylor AG. 1957. Fusarium Wilt of Bananas in Jamaica: III. Attempted Control. Annals of Botany 21: 599-609.

Robinson JC en Saúco VG 2010. Bananas and plantains. Crop production science in horticulture, n. 19: Cabi, 311 p.

Rokni-Zadeh H, Li W, Sanchez-Rodriguez A et al. 2012. Genetic and Functional Characterization of Cyclic Lipopeptide White-Line-Inducing Principle (WLIP) Production by Rice Rhizosphere Isolate Pseudomonas putida RW10S2. Applied and Environmental Microbiology 78: 4826-4834.

Rokni-Zadeh H, Li W, Yilma E, Sanchez-Rodriguez A en De Mot R. 2013. Distinct lipopeptide production systems for WLIP (white line-inducing principle) in Pseudomonas fluorescens and Pseudomonas putida. Environmental Microbiology Reports 5: 160-169.

Ron EZ en Rosenberg E. 2001. Natural roles of biosurfactants. Environmental Microbiology 3: 229-236.

Roongsawang N, Washio K en Morikawa M. 2011. Diversity of Nonribosomal Peptide Synthetases Involved in the Biosynthesis of Lipopeptide Biosurfactants. International Journal of Molecular Sciences 12: 141-172.

G. Verwijzingen 75

Rowe PR 1994. Banana plant "FHIA-01". US: Fundacion, Hondurena De Investigacion Agricola (San Pedro Sula, HN).

Saharan B. 2011. Plant growth promoting rhizobacteria: a critical review. Life Sciences and Medicine Research.

Sahijram L, Soneji JR en Bollamma KT. 2003. Analyzing somaclonal variation in micropropagated bananas (Musa spp.). In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 39: 551-556.

Saravanan T, Bhaskaran R en Muthusamy M. 2004. Pseudomonas fluorescens Induced Enzymological Changes in Banana Roots (Cv. Rasthali) against Fusarium Wilt Disease. Plant Pathology Journal 3: 72-80.

Saravanan T en Muthusamy M. 2006. Influence of Fusarium oxysporum f. sp. cubense [E. F.Smith] Snyder and Hansen on 2,4-diacetylphloroglucinol production by Pseudomonas fluorescens migula in banana rhizosphere. Journal of Plant Protection Research 46: 241-254.

Scavino F, Pedraza RO, Maheshwari DK, Saraf M en Aeron A 2013. The Role of Siderophores in Plant Growrh-Promoting Bacteria. Bacteria in Agrobiology: Crop Productivity: Springer-Verlag Berlin Heidelberg, p. 237-263.

Scher FM en Baker R. 1982. Effect of Pseudomonas putida and a Synthetic Iron Chelator on Induction of Soil Suppressiveness to Fusarium Wilt Pathogens. Phytopathology 72: 1567-1573.

Schippers B, Bakker AW, Bakker PAHM en Van Peer R. 1990. Beneficial and deleterious effects of HCN-producing pseudomonads on rhizosphere interactions. Plant and Soil 129: 75-83.

Selvaraj S, Ganeshamoorthi P, Anand T et al. 2014. Evaluation of a liquid formulation of Pseudomonas fluorescens against Fusarium oxysporum f. sp cubense and Helicotylenchus multicinctus in banana plantation. Biocontrol 59: 345-355.

Simko I en Piepho HP. 2012. The Area Under the Disease Progress Stairs: Calculation, Advantage, and Application. Phytopathology 102: 381-389.

Simmonds NW, Persley G en De Langhe E 1987. Classification and Breeding of Bananas. In: Banana and plantain breeding strategies. Proceedings of an International Workshop Held at Cairns Australia State Mutual Book & Periodical Service, Ltd: ACIAR Proceedings No. 21, p. 69-73.

Sivamani E en Gnanamanickam SS. 1988. Biological Control of Fusarium oxysporum f. sp. cubense in Banana by Inoculation with Pseudomonas fluorescens. Plant and Soil 107: 3-9.

Smith MK, Hamill SD, Langdon PW et al. 2006. Towards the development of a Cavendish banana resistant to race 4 of fusarium wilt: gamma irradiation of micropropagated Dwarf Parfitt (Musa spp., AAA group, Cavendish subgroup). Australian Journal of Experimental Agriculture 46: 107-113.

Smith MK, Whiley AW, Searle C et al. 1998. Micropropagated bananas are more susceptible to fusarium wilt than plants grown from conventional material. Australian Journal of Agricultural Research 49: 1133-1139.

Smith SN. 2007. An overview of ecological and habitat aspects in the genus Fusarium with special emphasis on the soil-borne pathogenic forms. Plant Pathology Bulletin 16: 97-120.

Soler-Rivas C, Arpin N, Olivier JM en Wichers HJ. 1999. WLIP, a lipodepsipeptide of Pseudomonas 'reactans', as inhibitor of the symptoms of the brown blotch disease of Agaricus bisporus. Journal of Applied Microbiology 86: 635-641.

Stanghellini ME en Miller RM. 1997. Biosurfactants: their identity and potential efficacy in the biological control of zoosporic plant pathogens. Plant disease 81: 4-12.

Stotzky G en Torrence Martin R. 1963. Soil mineralogy in relation to the spread of fusarium wilt of banana in central America. Plant and Soil 18: 317-337.

Stover RH. 1954. Flood-fallowing for eradication of Fusarium oxysporum f. cubense: II. Some factors involved in fungus survival. Soil Science 77: 401-414.

Stover RH. 1958. Studies on fusarium wilt of bananas: II. Some factors influencing survival and saprophytic multiplication of F. oxysporum f. cubense in soil. Canadian Journal of Botany 36: 311-324.

76 G. Verwijzingen

Stover RH 1987. Somaclonal variation in Grand Naine and Saba bananas in the nursery and field. In: Banana and plantain breeding strategies. Proceedings of an International Workshop Held at Cairns Australia State Mutual Book & Periodical Service, Ltd: ACIAR Proceedings No. 21, p. 136-139.

Stutz EW, Défago G en Kern H. 1986. Naturally Occurring Fluorescent Pseudomonads Involved in Suppression of Black Root Rot of Tobacco. Phytopathology 76: 181-185.

Sun D, Hu Y, Zhang L, Mo Y en Xie J. 2009. Cloning and analysis of Fusarium wilt resistance gene analogues in Goldfinger banana. Molecular Plant Breeding 7: 1215-1222.

Sun D, Lu X, Hu Y et al. 2013. Methyl jasmonate induced defense responses increase resistance to Fusarium oxysporum f. sp cubense race 4 in banana. Scientia Horticulturae 164: 484-491.

Tambong JT en Höfte M. 2001. Phenazines are involved in biocontrol of Pythium myriotylum on cocoyam by Pseudomonas aeruginosa PNA1. European Journal of Plant Pathology 107: 511-521.

Thangavelu R, Mustaffa M en Tripathi L. 2010. A potential isolate of Trichoderma viride NRCB1 and its mass production for the effective management of Fusarium wilt disease in banana. Tree and Forestry Science and Biotechnology 4: 76-84.

Thangavelu R, Palaniswami A, Doraiswamy S en Velazhahan R. 2003. The effect of Pseudomonas fluorescens and Fusarium oxysporum f. sp cubense on induction of defense enzymes and phenolics in banana. Biologia Plantarum 46: 107-112.

Thangavelu R, Palaniswami A, Ramakrishnan G et al. 2001. Involvement of fusaric acid detoxification by Pseudomonas fluorescens strain Pf10 in the biological control of Fusarium wilt of banana caused by Fusarium oxysporum f. sp cubense. Zeitschrift Fur Pflanzenkrankheiten Und Pflanzenschutz-Journal of Plant Diseases and Protection 108: 433-445.

Thangavelu R, Palaniswami A en Velazhahan R. 2004. Mass production of Trichoderma harzianum for managing fusarium wilt of banana. Agriculture Ecosystems & Environment 103: 259-263.

Tian F, Ding YQ, Zhu H, Yao LT en Du BH. 2009. Genetic Diversity of Siderophore-Producing Bacteria of Tobacco Rhizosphere. Brazilian Journal of Microbiology 40: 276-284.

Tripathi RK en Gottlieb D. 1969. Mechanism of action of the antifungal antibiotic pyrrolnitrin. Journal of bacteriology 100: 310-318.

Troxler J, Zala M, Natsch A, Moënne-Loccoz Y en Défago G. 1997. Autecology of the biocontrol strain Pseudomonas fluorescens CHA0 in the rhizosphere and inside roots at later stages of plant development. FEMS Microbiology Ecology 23: 119-130.

USDA. 2016. National Nutrient Database for Standard Reference Release 28 [Online]. USA. Available: https://ndb.nal.usda.gov/ndb/foods/show/2159?fgcd=&manu=&lfacet=&format=&count=&max=35&offset=&sort=&qlookup=banana [Accessed 27 Juni 2016].

Valmayor R, Jamaluddin S, Silayoi B et al. 2000. Banana cultivar names and synonyms in Southeast Asia. Advancing Banana and Plantain R & D in Asia and the Pacific, 28 p.

Van den Berg N, Berger DK, Hein I et al. 2007. Tolerance in banana to Fusarium wilt is associated with early up-regulation of cell wall-strengthening genes in the roots. Molecular Plant Pathology 8: 333-341.

van Loon LC. 2007. Plant responses to plant growth-promoting rhizobacteria. European Journal of Plant Pathology 119: 243-254.

van Loon LC en Bakker PAHM 2003. Signalling in Rhizobacteria-Plant Interactions. Root ecology, Berlin, Heidelberg: Springer, p. 297-330.

van Loon LC, Bakker PAHM en Pieterse CMJ. 1998. Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria. Annual Review of Phytopathology 36: 453-483.

van Peer R, Niemann GJ en Schippers B. 1991. Induced Resistance and Phytoalexin Accumulation in Biological Control of Fusarium Wilt of Carnation by Pseudomonas sp. Strain WCS417r. Phytopathology 81: 728-734.

G. Verwijzingen 77

van Rij ET, Girard G, Lugtenberg BJJ en Bloemberg GV. 2005. Influence of fusaric acid on phenazine-1-carboxamide synthesis and gene expression of Pseudomonas chlororaphis strain PCL1391. Microbiology-Sgm 151: 2805-2814.

van Rij ET, Wesselink M, Chin-A-Woeng TFC, Bloemberg GV en Lugtenberg BJJ. 2004. Influence of environmental conditions on the production of phenazine-1-carboxamide by Pseudomonas chlororaphis PCL1391. Molecular Plant-Microbe Interactions 17: 557-566.

Vandenbergh PA en Gonzalez CF 1984. Method for protecting the growth of plants employing mutant siderophore producing strains of Pseudomonas putida. Microlife Technics, Inc., Sarasota, Fla., p. 6.

Varnier AL, Sanchez L, Vatsa P et al. 2009. Bacterial rhamnolipids are novel MAMPs conferring resistance to Botrytis cinerea in grapevine. Plant Cell and Environment 32: 178-193.

Velkeneers E, Höfte M en de Carvalho França S. 2013. Suppression of Fusarium oxysporum f. sp. cubense on banana in an agroforestry system in Brazil. Masterproef, UGent.

Voisard C, Keel C, Haas D en Défago G. 1989. Cyanide production by Pseudomonas fluorescens helps suppress black root rot of tobacco under gnotobiotic conditions. Embo Journal 8: 351-358.

Waman AA, Bohra P, Sathyanarayana BN, Chandrashekar SC en Rani RT. 2013. Are bananas (Musa spp.) really safe from their aesthetic relatives? Screening potential alternative hosts of Fusarium oxysporum f. sp cubense. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 88: 559-562.

Wang B, Li R, Ruan Y et al. 2015a. Pineapple-banana rotation reduced the amount of Fusarium oxysporum more than maize-banana rotation mainly through modulating fungal communities. Soil Biology & Biochemistry 86: 77-86.

Wang Z, Jia CH, Li JY et al. 2015b. Activation of salicylic acid metabolism and signal transduction can enhance resistance to Fusarium wilt in banana (Musa acuminata L. AAA group, cv. Cavendish). Functional & Integrative Genomics 15: 47-62.

Weller DM, Raaijmakers JM, Gardener BBM en Thomashow LS. 2002. Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens. Annual Review of Phytopathology 40: 309-348.

Weller DM en Thomashow LS. 1993. Use of rhizobacteria for biocontrol. Current Opinion in Biotechnology 4: 306-311.

World Banana Forum. 2016. Fusarium Wilt TR4 [Online]. Available: http://www.fao.org/economic/worldbananaforum/fusarium-tr4/disease/en/ [Accessed 5 juni 2016].

Yin XM, Xu BY, Zheng W et al. 2011. Characterisation of Early Events in Banana Roots Infected with Green Fluorescent Protein-Tagged Fusarium oxysporum f. sp cubense. In: VanDenBergh, I, Smith, M, Swennen, R en Hermanto, C (Eds.) International Ishs-Promusa Symposium on Global Perspectives on Asian Challenges, p. 371-376.

Yip MK, Lee SW, Su KC et al. 2011. An easy and efficient protocol in the production of pflp transgenic banana against Fusarium wilt. Plant Biotechnology Reports 5: 245-254.

Youard ZA, Mislin GLA, Majcherczyk PA, Schalk IJ en Reimmann C. 2007. Pseudomonas fluorescens CHA0 produces enantio-pyochelin, the optical antipode of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. Journal of Biological Chemistry 282: 35546-35553.

Zuo C, Li C, Li B et al. 2015. The toxic mechanism and bioactive components of Chinese leek root exudates acting against Fusarium oxysporum f. sp cubense tropical race 4. European Journal of Plant Pathology 143: 447-460.

78 G. Verwijzingen

H. Bijlage 79

H. Bijlage

Tabel B1 De aangemaakte media gebruikt voor de testen. Na aanmaak 21 min. geautoclaveerd aan 121 °C.

Medium Hoeveelheid Component

PDA medium 39 g 1 L

Potato Dextrose Agar (Difco)1 Bidest water

PDA + streptomycine medium2 39 g 400 µL (2,5 g 10 mL-1) 1 L

Potato Dextrose Agar (Difco) Streptomycine Bidest water

MEA medium 50 g 1 L

Malt Extract Agar3 Bidest water

GCY medium 20 g 10 g 5 g 15 g 1 L

Glucose Casein pancreatic peptone Gist extract Bacto agar Bidest water

Vloeibaar GCY 20 g 10 g 5 g 1 L

Glucose Casein pancreatic peptone Gist extract Bidest water

KB medium 20 g 1,5 g 1,5 g 10 mL 1 L

Proteose pepton nr.3 (Difco) K2HPO4 MgSO4 Glycerol Bidest water

Vloeibaar KB 20 g 1,5 g 1,5 g 10 mL 15 g 1 L

Proteose pepton nr.3 (Difco) K2HPO4 MgSO4 Glycerol Agar Bidest water

Zoutoplossing 8,5 g 1 L

NaCl Bidest water

1 Benaderde formule voor PDA: 4 g aardappel zetmeel; 20 g Dextrose; 15 g agar; pH = 5,6 ± 0,2 2 PDA laten afkoelen tot 50 °C, vervolgens streptomycine bijvoegen 3 Benaderde formule voor MEA: 30 g malt extract; 5 g mycological peptone; 15 g agar; pH = 5,4 ± 0,2

80 H. Bijlage

Tabel B2 De horizontale diameter van het mycelium van de Foc isolaat van de in vitro test 1 voor antagonisme van fluorescerende pseudomonaden tegen Foc uitgevoerd op PDA medium na zes dagen incubatie met 3 herhalingen. Gemiddelde (Gemid), standaarddeviatie en inhibitie (verschil tussen controle en behandeling gedeeld door controle) zijn weergegeven.

Behandeling Gemid. (mm) Inhibitie (%)

Foc isolaat Pseudomonas isolaat

E

Controle 58,06 ± 6,52

CHA0 35,51 ± 2,22

39

CMR12a 45,92 ± 0,26

21

CMR5c 30,61 ± 1,29

47

COR35 29,62 ± 1,16

49

COW5 48,58 ± 6,20

16

NNC7 43,91 ± 3,57

24

NSE1 44,82 ± 5,66

23

J3S

Controle 75,89 ± 1,76

CHA0 44,33 ± 1,18

42

CMR12a 48,92 ± 0,15

36

CMR5c 32,68 ± 2,83

57

COR35 28,97 ± 0,93

62

COW5 57,28 ± 1,66

25

NNC7 56,66 ± 1,20

25

NSE1 58,59 ± 1,21

58,6

23

P7D

Controle 62,95 ± 1,75

CHA0 35,09 ± 6,29

44

CMR12a 48,29 ± 2,28

23

CMR5c 28,54 ± 2,68

55

COR35 27,20 ± 2,31

57

COW5 40,95 ± 4,02

35

NNC7 48,98 ± 0,55

22

NSE1 47,39 ± 3,70

25

M27

Controle 65,63 ± 0,46

CHA0 39,91 ± 0,00

39

CMR12a 49,92 ± 0,91

24

CMR5c 35,18 ± 0,00

46

COR35 26,89 ± 1,51

59

COW5 44,69 ± 2,44

32

NNC7 48,92 ± 4,33

25

NSE1 53,10 ± 2,85

19

H. Bijlage 81

Tabel B3 De horizontale diameter van het mycelium van de Foc isolaat van de in vitro test 2 voor antagonisme van fluorescerende pseudomonaden tegen Foc uitgevoerd op MEA en PDA medium na zes dagen incubatie met 3 herhalingen. Gemiddelde (Gemid), standaarddeviatie en inhibitie (verschil tussen controle en behandeling gedeeld door controle) zijn weergegeven.

Behandeling Gemid. (mm) Inhibitie (%)

Medium Foc isolaat Pseudomonas isolaat

MEA

E

Controle 65,95 ± 14,96

CHA0 40,84 ± 0,90

38

CMR5c 28,51 ± 0,98

57

COR35 52,74 ± 1,73

20

COW5 50,37 ± 3,64

24

J3S

Controle 74,08 ± 1,49

CHA0 35,24 ± 3,07

52

CMR5c 28,81 ± 0,90

61

COR35 42,60 ± 0,86

42

COW5 44,69 ± 4,40

40

P7D

Controle 69,12 ± 1,25

CHA0 30,73 ± 1,40

56

CMR5c 28,02 ± 0,88

59

COR35 45,34 ± 1,59

34

COW5 38,22 ± 0,40

45

M27

Controle 71,47 ± 0,39

CHA0 20,97 ± 0,34

71

CMR5c 19,76 ± 0,76

72

COR35 48,42 ± 1,70

32

COW5 33,52 ± 0,63

53

PDA

E

Controle 67,03 ± 5,57

CHA0 43,18 ± 0,70

36

CMR5c 26,08 ± 2,46

61

COR35 30,85 ± 1,88

54

COW5 44,27 ± 0,88

34

J3S

Controle 75,52 ± 2,63

CHA0 51,00 ± 2,56

32

CMR5c 26,13 ± 2,13

65

COR35 30,43 ± 0,65

60

COW5 47,00 ± 2,67

38

P7D

Controle 63,57 ± 0,41

CHA0 42,78 ± 0,75

33

CMR5c 27,91 ± 3,83

56

COR35 25,62 ± 0,76

60

COW5 45,40 ± 0,50

29

M27

Controle 70,53 ± 0,82

CHA0 47,77 ± 0,81

32

CMR5c 23,46 ± 3,94

67

COR35 27,80 ± 0,77

61

COW5 47,25 ± 2,43

33

82 H. Bijlage

Tabel B4 De p-waarden van de eerste in planta test verkregen van de niet-parametrische Kruskal-Wallis rank sum toets voor testen van de nulhypothese dat alle behandelingen gelijk zijn. De parameters zijn de pseudostam lengte, het aantal gele bladeren na x dagen, de blad symptoom index (BSI) na x dagen, de rhizoom verkleuringsindex (RDI) en de logaritme van de kolonievormende eenheden (CFU) van fluorescerende pseudomonaden in de wortels. Significante p-waarden op het 5 % significantieniveau zijn aangeduid in vet.

Parameter p-waarde

Pseudostam lengte 0 d 0,743

Pseudostam lengte 110 d 0,679

geel blad 40 d 0,964

geel blad 44 d 0,691

geel blad 51d 0,413

geel blad 58 d 0,606

BSI 65 d 0,701

BSI 71 d 0,559

BSI 78 d 0,605

BSI 86 d 0,858

BSI 92 d 0,494

BSI 100 d 0,379

BSI 110 d 0,408

RDI 0,495

log10 CFU g-1 verse wortel 0,007

Tabel B5 De p-waarden van de tweede in planta test verkregen van de niet-parametrische Kruskal-Wallis rank sum toets voor testen van de nulhypothese dat alle behandelingen gelijk zijn. De parameters zijn de pseudostam lengte, blad symptoom index (BSI) na x dagen, rhizoom verkleuringsindex (RDI) en de logaritme van de kolonievormende eenheden (CFU) van fluorescerende pseudomonaden in de wortels. De CFU meting werd enkel voor de behandelingen met Pseudomonas uitgevoerd. Significante p-waarden op het 5 % significantieniveau zijn aangeduid in vet.

Parameter p-waarde

Pseudostam lengte 0 d 0,151

BSI 0 d 0,000

BSI 6 d 0,015

BSI 14 d 0,189

BSI 22 d 0,029

BSI 30 d 0,051

BSI 36 d 0,546

BSI 45 d 0,982

BSI 52 d 0,406

BSI 62 d 0,012

RDI 0,055

log10 CFU g-1 verse wortel 0,003

H. Bijlage 83

Tabel B6 De p-waarden van de derde in planta test verkregen van de niet-parametrische Kruskal-Wallis rank sum toets voor testen van de nulhypothese dat alle behandelingen gelijk zijn. De parameters zijn de pseudostam lengte, blad symptoom index (BSI) na x dagen, rhizoom verkleuringsindex (RDI) en de logaritme van de kolonievormende eenheden (CFU) van fluorescerende pseudomonaden in de wortels. De CFU meting werd enkel voor de behandelingen met Pseudomonas uitgevoerd. Significante p-waarden op het 5 % significantieniveau zijn aangeduid in vet.

Parameter p-waarde

Pseudostam lengte 0 d 0,470

BSI 0 d 0,087

BSI 8 d 0,313

BSI 15 d 0,664

BSI 23 d 0,153

BSI 30 d 0,227

BSI 40 d 0,040

BSI 48 d 0,041

BSI 55 d 0,050

RDI 0,007

log10 CFU g-1 verse wortel 0,080

Tabel B7 Fysische en chemische eigenschappen van de substraten gemaakt uit potgrond (Structural Type 1) en zand (Cobo Gardenis gewassen zand 0/2) (Hua en Höfte 2015).

Eigenschap Potgrond 50 m% Potgrond/50 m% Zand

Vocht inhoud (%) 75 46 pHH2O 5,47 5,62 pHKCl 5,08 5,21 Organisch materiaal (%) 46,42 17,64 Koolstof (%) 26,99 10,26 Stikstof (%) 0,795 0,174 C:N ratio 34:1 59:1 Fosfor (mg/kg) 279,6 115,5 Calcium (mg/kg) 6270 3238 Magnesium (mg/kg) 1056 485 Kalium (mg/kg) 931 407 Natrium (mg/kg) 109,2 41,5