Periode 9 deel 2DNA TECHNIEKEN

Lesstof toets 9.2

Biologie voor het MLO zesde druk

Hfdst 15.5 DNA technieken

Het oude boek (vijfde druk) heeft dit hoofdstuk niet

Technieken BiotechnologieOnder biotechnologie vallen verschillende technieken die erfelijk materiaal van planten en dieren veranderen.

Traditionele en moderne biotechnologie

Een voorbeeld van traditionele biotechnologie is het maken van kaas. Dit gebeurt met de hulp van bacteriën en schimmels.

Onder moderne biotechnologietechnieken vallen bijvoorbeeld: genetische modificatie, stamceltechnieken, klonen en synthetische biologie.

Biotechnologie in de industrie

bijvoorbeeld productie van chemicaliën of plastics.

Productie van brandstoffen op basis van hernieuwbare grondstoffen, zoals bioethanol (Milieuvriendelijk). Bio-ethanol wordt gemaakt van

voedingsgewassen zoals suikerriet, graan, maïs- en suikerbieten en reststromen zoals stro en maïsloof. Het ontstaat door de vergisting van suikers of

zetmeel.

H15 Biotechnologie tot H15.5 behandeld in periode 4

Industriële

biotechnologie

Moderne biotechnologieGenetische modificatie

Onderzoekers kunnen erfelijk materiaal in planten en dieren (organismen) veranderen. Zo voorzien zij die organismen

van gewenste eigenschappen. Als ze dat doen op een manier die van nature niet mogelijk is, heet dat genetische

modificatie. Het resultaat is een genetisch gemodificeerd organisme(ggo).

Genetische modificatie van dieren gebeurt vooral voor biomedisch onderzoek. Onder meer op het gebied van kanker,

hersenfalen, ouderdomsziekten en ontwikkelingsproblemen.

Door toepassing van biotechnologie kunnen planten en dieren wezenlijk veranderen. Daarom stelt de overheid hier

wettelijke grenzen aan.

Klonen

Bij klonen van dieren of planten is de nakomeling genetisch hetzelfde als de oouder. Dit is te vergelijken met stekken of

enten bij planten.

In Nederland worden dieren alleen gekloond voor de wetenschap. In landen buiten de Europese Unie worden ook dieren

gekloond voor bijvoorbeeld onderzoek of fokprogramma’s.

Jan 2018- Gekloonde apen

Moderne BiotechnologieSynthetische biologie

Een nieuwe vorm van biotechnologie is synthetische biologie. Hierbij maken onderzoekers kunstmatig (delen van) cellen die beter werken dan biologische onderdelen. Dit kan

leiden tot veel toepassingen. Bijvoorbeeld productie van goedkope medicijnen of biobrandstoffen.

De Commissie Genetische Modificatie (Cogem) monitort de ontwikkelingen van synthetische biologie. Ook adviseert Cogem de Rijksoverheid over de risico’s ervan. Tot nu toe

volstaat de bestaande wetgeving.

Genetische kettingreactie: gene drive

Bij een genetische kettingreactie wordt een eigenschap van een organisme blijvend veranderd. Dit heet ook wel ‘gene drive’. A lle nakomelingen van het organisme nemen de

verandering over. Daardoor kan de eigenschap binnen enkele generaties aan bijna alle nakomelingen worden doorgegeven. Bij andere vormen van genetische modificatie

gebeurt dit niet. Met gene drive zou bijvoorbeeld de (infectie)ziekte malaria teruggedrongen kunnen worden door muggen permanent ongevoelig te maken voor de

malariaparasiet. Het onderzoek hiernaar gebeurt nu nog alleen in het laboratorium.

Bij gene drive wordt een nieuwe eigenschap doorgegeven aan de gehele nieuwe generatie van het organisme. Daardoor is de verspreiding van de nieuwe eigenschap niet

eenvoudig terug te draaien. Ook zijn de gevolgen van gene drive voor de natuur nog niet bekend. Daarom gaat de overheid hier onderzoek naar laten doen.

Wetenschappers die willen werken met gene drive, moeten een vergunning aanvragen. Aan de vergunning worden strenge voorwaarden verbonden. Bijvoorbeeld de eis te

voorkomen dat het organisme dat zij veranderen, in de natuur terecht komt. De Inspectie Leefomgeving en Transport (ILT) houdt hier toezicht op.

Biotechnologie

Opdracht:

- Ga naar start.me periode 9

- Bekijk de uitleg klassieke moderne biotechnologie

- Maak de oefening klassieke moderne biotechnologie

Genetische modificatieBij kruisingen ontstaan regelmatig recombinanten, maar gewone kruisingen zijn alleen mogelijk binnen de soort.

Recombinant DNA techniek= De techniek om erfelijk materiaal van het ene soort organisme in te brengen in dat

van een andere soort. Je noemt het DNA dat hierdoor ontstaat recombinant-DNA.

Transgeen / transgenese= inbrengen van DNA afkomstig van een organisme van een andere soort

Cisgeen / cisgenese= inbrengen van DNA dat afkomstig van een organisme van hetzelfde soort

Recombinante DNA technologie

De techniek maakt gebruik van plasmiden en restrictie-enzymen (knipenzymen) en ligases (plakenzymen).

Plasmiden zijn kleine ringvormige stukjes DNA die naast het grote ringvormige DNA-molecuul in bacteriën voorkomen.

Plasmiden kunnen zich onafhankelijk van het chromosomale DNA van de bacterie vermeerderen Met hulp van plasmiden

kunnen bacteriën genen met soortgenoten of zelfs met andere soorten bacteriën uitwisselen.

Restrictie-enzymen spelen een rol in de natuurlijke afweer van bacteriën tegen virussen. Ze kunnen DNA 'openknippen';

daarom noem je ze knipenzymen. De restrictie-enzymen schakelen een binnengedrongen virus uit door zijn DNA stuk te

knippen. Waar de knip gebeurt, ontstaan twee uiteinden, die sticky ends (kleverige eindjes) worden genoemd.

Ligases zijn enzymen die in staat zijn gebroken DNA-strengen te repareren, aan elkaar te 'plakken'. Vandaar dat ze plak-

enzymen worden genoemd. Vooral de sticky ends worden gemakkelijk aan elkaar geplakt.

Recombinante DNA technologieDe recombinant-DNA-techniek verloopt als volgt (uitgebeeld bij het

menselijke gen dat voor insuline codeert):

1. Een plasmide wordt met behulp van restrictie-enzymen opengeknipt.

2. Een stuk DNA met het insuline gen wordt uit het menselijke DNA geknipt en

met behulp van ligase in de plasmide geplakt.

3. De plasmiden worden opgenomen door bacteriën die in cultuur gebracht

worden en zich vele malen delen. Zo ontstaan er miljoenen bacteriën met het

gerecombineerde plasmide.

4. De bacterie is transgeen geworden door genetische modificatie.

Zie de animatie op Bioplek (klik hier voor de tablet).

Recombinant DNA techniek

Campylobacter jejuni besmetting

Wat is Guillain barré syndroom?

DNA Technieken

Polymerase Chain Reaction (PCR)

De polymerase-kettingreactie, vaak afgekort tot PCR (van Polymerase Chain Reaction), is een methode om in het

laboratorium kleine stukjes DNA heel vaak te kopiëren tot er genoeg van is om het DNA te bouwen en te analyseren.

DNA Sequencen

Door het DNA vervolgens te sequencen kan men de volgorde van de nucleotiden in het DNA bepalen

Kloneren van genen

DNA Finger Printing

Introduction PCR

De PCR-methode, in 1983 uitgevonden door Kary Mullis

Vele doeleinden een aantal voorbeelden:

Het kloneren van een gewenst stuk DNA van een organisme om het bijvoorbeeld in een ander organisme te brengen (bij genetische modificatie).

Bij het analyseren van DNA-monsters bij forensisch onderzoek.

Om verwantschap na te gaan; je kunt bijvoorbeeld aantonen dat iemand de vader is van een bepaald kind.

Om bij infectieziekten de ziekteverwekker aan te tonen; het DNA van de ziekteverwekker moet dan natuurlijk wel bekend zijn.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Thermocycler

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Voor deze methode is nodig:

het stukje DNA dat gekopieerd (geamplificeerd) moet worden;

Mastermix

• Het enzym Taq polymerase = DNA-polymerase; (afkomstig van bacteriën die in hete bronnen leven. Het heeft een

optimum van ongeveer 72°C.)

• heel veel nucleotiden (A, C, G en T);

• kleine beginnetjes, primers genoemd, van waaruit de polymerisatie kan starten. Er zijn voor het proces twee primers

nodig. Een primer is een stukje enkelstrengs DNA dat op de 5’ of 3’ nucleotide van het te kopiëren stuk DNA past.

• Buffer voor de optimale pH

• MgCl2 cofactor voor DNA Polymerase

PCR procedure bestaat uit drie stappen cyclus. Tijdens de cyclus wordt het stukje DNA één keer gekopieerd. De PCR-cyclus bestaat uit

drie stappen:

Stap 1 Denaturatie :• het DNA wordt verhit tot ongeveer 95°C; hierdoor denatureert het en gaan de twee DNA-strengen uit elkaar.

Stap 2 Annealing: • de temperatuur wordt verlaagd en de primers worden toegevoegd.

Stap 3 Elongatie: • de temperatuur wordt weer verhoogd tot 72°C en DNA-polymerase en de nucleotiden worden toegevoegd.

• Vanuit de primers worden langs de enkelstrengen DNA nieuwe strengen DNA gevormd. Dit wordt de verlenging genoemd.

• Het enkelstrengs DNA dient als matrijs voor de vorming van de nieuwe strengen.

• De temperatuur mag hierbij niet te laag zijn, omdat het DNA anders meteen weer dubbelstrengs wordt en ook niet te hoog, omdat het DNA-

polymerase anders denatureert.

De PCR-cyclus duurt ongeveer 4 seconden. Daarna start de cyclus opnieuw en wordt nog 30-40 keer herhaald. Na 30 cycli zijn er al meer dan 1

miljard kopieën van het stuk DNA. En dat is genoeg om te gebruiken bij gelelektroforese.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Principe PCR

PCR

Een animatie van de PCR kun je op Bioplek bekijken (klik hier voor de tablet)

Opdracht:

- Ga naar start.me periode 9

- Bekijk de animatie PCR

- Maak vervolgens de vragen uit het boek 21 t/m

31

Je kunt zelf op je computer ook een PCR uitvoeren:

zie http://www.hhmi.org/biointeractive/bacterial-identification-virtual-lab

DNA Sequencen

Toepassing DNA sequencen

Voor deze methode is nodig

DNA fragmenten (in veelvoud door PCR of door kloneren in bacteriën)

Mastermix

DNA sequencen

Wat is sequencen?

Een speciale PCR reactie met gelabelde (gebonden met een specifieke stof) nucleotiden. Wanneer de nucleotiden gebonden worden fluoreseren ze en dat wordt gemeten door een detector.

Gelelektroforese

Gelelektroforese 2Gelelektroforese 1

Opdracht:

- Maak vervolgens de vragen uit het boek 32 t/m 39

is een scheidingstechniek die DNA fragmenten onder invloed van een elektrisch

veld laat bewegen in een gel. Negatief geladen moleculen bewegen naar

beneden waar de positieve pool (anode) zich bevindt. DNA fragmenten worden zo

gescheiden op basis van grootte.

Kloneren van genen- recombinant DNA technologie

Bij kloneren worden bepaalde genen in een bacterie gebracht. Als de bacteriën zich

vermenigvuldigen, wordt ook het gen vermenigvuldigd. (uitgebeeld bij het

menselijke gen dat voor insuline codeert):

1. Een plasmide wordt met behulp van restrictie-enzymen opengeknipt.

2. Een stuk DNA met het insuline gen wordt uit het menselijke DNA geknipt en met

behulp van ligase in de plasmide geplakt.

3. De plasmiden worden opgenomen door bacteriën die in cultuur gebracht

worden en zich vele malen delen. Zo ontstaan er miljoenen bacteriën met het

gerecombineerde plasmide.

4. De bacterie is transgeen geworden door genetische modificatie.

Zie de animatie op Bioplek (klik hier voor de tablet).

Kloneren van genen

Bij Kloneren wordt gebruikt gemaakt van bacteriën, plasmiden, restrictie

enzymen en DNA ligases

Plasmiden

Zijn kleine cirkelvormige stukjes DNA die zich onafhankelijk van het bacteriële

chromosoom vermenigvuldigen

Met dit stukje DNA kan genetische informatie tussen bacteriën uitgewisseld

Plasmiden worden ook wel vectoren genoemd. Om het gen in een bacterie te

brengen, is een 'vector' nodig: iets dat het gen bevat en door de bacterie

makkelijk wordt opgenomen. Plasmiden zijn zulke vectoren

Plasmiden komen voor bij bacteriën, maar ook bij sommige eukaryoten zoals

gist.

Kloneren van genen Restrictie enzymen (knip enzymen)

knippen een dubbelstrengs DNA-streng op een specifieke plaats.

Ze komen uit bacteriën, en heten daarnaar: zo komt EcoR I uit E(scherichia) coli.

Sommige restrictie-enzymen geven rechte uiteinden ('blunt ends'). Andere geven ongelijke einden ('sticky ends') die ook weer

makkelijk aan elkaar binden.

Restrictie-enzymen werken op vaste sequenties, dus zijn de 'sticky' uiteinden voor één restrictie-enzym altijd gelijk. Hierdoor is

het mogelijk vreemd DNA aan elkaar te 'plakken', dus ook om vreemde genen in het DNA van een bepaald organisme te brengen.

Deze organismen worden dan transgeen.

Animatie van Eco-R1

Kloneren van genen

De plasmiden die gebruikt worden bevatten twee speciale genen:

- één voor resistentie tegen een antibioticum, en

- één voor een blauwe kleur van de kolonie.

Ze worden geknipt met hetzelfde restrictie-enzym als gebruikt is voor het DNA met het in te bouwen gen.

Dit moet 1× knippen, namelijk precies in het gen voor de blauwe kleur. Nu voeg je de oplossing van DNA toe. Dit bevat meestal ook nog stukjes DNA zonder het gewenste gen. Sommige plasmiden bouwen het goede DNA in.

Er zijn er ook die niets inbouwen (zelfsluiters), of een verkeerd stukje DNA. De stukken zijn nog niet definitief aan elkaar verbonden. Om dit te doen voeg je DNA ligasen ( plak enzymen) toe.

Kloneren van genen De plasmiden worden opgenomen door de bacteriën. Sommige bacteriën nemen niets op, en sommige bacteriën

nemen een verkeerd plasmide op.

Het opnemen en tot expressie komen van vreemd DNA heet genetische transformatie

Het inbrengen van plasmiden is bacteriën is vaak door middel van een hitteschok die de doorlaatbaarheid (permeabiliteit) van het celmembraan vergroot.

Waarom kloneren?

Grote productie van eiwitten of stofwisselingsproducten

Opdracht:

- Maak vervolgens de vragen uit het boek 41 t/m 48

DNA Finger printing Forensisch onderzoek

DNA-Fingerprint: ieder persoon heeft een unieke DNA sequentie. Het unieke DNA profiel noemen we DNA fingerprint

Methode:

DNA van de verdachte is gevonden. Het DNA wordt op specifieke plaatsen in het genoom onderzocht. Op het DNA wat niet codeerd voor genen. Een hypervariabel gebied wat de unieke DNA profiel van een persoon geeft.

Short tandem repeats STR’s (genetische markers)=niet coderend DNA die uit korte stukjes repeterend DNA (de korte stukjes DNA herhalen zichbinnen een stukje sequentie)

PCR vermenivuldigt de STR’s met gelabelde primers

Via capilaire gelelectroforese worden de aantal repeats bepaald op meerdere plaatsen op het DNA

De DNA fingerprint wordt weergegeven als een piekenpatroon met een nummer. Het cijfer staat voor het aantal keer dat de repeat voor komt

De combintie van cijfers en pieken worden vergeleken met andere DNA profielen in een DNA Databank

Als DNA profielen precies overeenkomen is er sprake van een match

DNA Fingerprinting

DNA Finger Printing

Opdracht:

- Maak de vragen uit het boek 49 t/m 56

DNA Fingerprinting wordt ook gebruikt om verwantschappen

aan te tonen