Moleculaire karakterisering van methicilline resistente...

0

Moleculaire karakterisering van methicilline resistente

Staphylococcus aureus isolaten afkomstig van

varkensvlees

Kaat LUYCKX

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van

Master in de Biochemie en de Biotechnologie,

Major Microbiële Biotechnologie

Academiejaar 2011-2012

Promotor: Prof. dr. Peter Vandamme

Vakgroep Biochemie en Microbiologie

Laboratorium voor Microbiologie

Promotor: Prof. dr. Marc Heyndrickx

Wetenschappelijk begeleiders: Dr. Geertrui Rasschaert en Lic. Marijke Verhegghe

ILVO – Departement Technologie en Voeding – Voedselveiligheid

Moleculaire karakterisering van methicilline resistente

Staphylococcus aureus isolaten afkomstig van

varkensvlees

Kaat LUYCKX

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van

Master in de Biochemie en de Biotechnologie,

Major Microbiële Biotechnologie

Academiejaar 2011-2012

Promotor: Prof. dr. Peter Vandamme

Vakgroep Biochemie en Microbiologie

Laboratorium voor Microbiologie

Promotor: Prof. dr. Marc Heyndrickx

Wetenschappelijk begeleiders: Dr. Geertrui Rasschaert en Lic. Marijke Verhegghe

ILVO – Departement Technologie en Voeding – Voedselveiligheid

Dankwoord

Graag wil ik alle mensen bedanken die rechtstreeks en onrechtstreeks geholpen hebben aan

het tot stand komen van deze thesis.

Allereerst wil ik Prof. dr. Marc Heyndrickx bedanken die het mogelijk heeft gemaakt mijn

thesis uit te voeren in het microbiologie-labo van het ILVO – Departement Technologie en

Voeding – Voedselveiligheid.

Ik wil Prof. dr. Peter Vandamme zeker niet vergeten bedanken. Dankzij zijn lessen heeft hij

mijn interesse voor microbiologie opgewekt.

Daarnaast zou ik graag Dr. Geertrui Rasschaert bedanken voor haar uitstekende begeleiding

tijdens het schrijven van mijn masterproef.

In het bijzonder wil ik Marijke Verhegghe vermelden. Zij stond mij elke dag bij met raad en

daad. Bedankt voor alle moeite en tijd dat je geïnvesteerd hebt in mijn thesis! Je was een

fantastische begeleidster!

Mijn dank gaat ook uit naar alle collega’s en mede-stagiairs voor de toffe werksfeer!

Ik wil ook graag mijn vrienden alias “vriendschap” en klasgenootjes bedanken: Merci voor

alles!

Gerrit: bedankt voor jouw onuitputtelijke steun en liefde!

Tenslotte ben ik vooral mijn ouders dankbaar: jullie hebben alles mogelijk gemaakt voor mij!

Bedankt!

i

Inhoudsopgave

Dankwoord.................................................................................................................................................................... i

Inhoudstafel ................................................................................................................................................................ ii

Lijst van afkortingen .............................................................................................................................................. iv

Samenvatting ............................................................................................................................................................ vi

Summary .................................................................................................................................................................... vii

I. INLEIDING ............................................................................................................................................ 1

1.1 STAPHYLOCOCCUS .............................................................................................................................. 1

1.2 STAPHYLOCOCCUS AUREUS ................................................................................................................ 2

1.3 DE EVOLUTIE TOT MRSA ..................................................................................................................... 3

1.3.1 Penicilline resistente Staphylococcus aureus ................................................................................... 3 1.3.2 Methicilline resistente Staphylococcus aureus................................................................................. 5

1.4 DE VERSCHILLENDE MRSA TYPES ........................................................................................................ 6

1.4.1 Ziekenhuisgebonden MRSA ...................................................................................................................... 6 1.4.2 Gemeenschapsgebonden MRSA .............................................................................................................. 6 1.4.3 Diergebonden MRSA ................................................................................................................................... 7

1.5 IMPLICATIES OP DE VOLKSGEZONDHEID ............................................................................................ 8

1.6 MOLECULAIRE TECHNIEKEN ............................................................................................................. 10

1.6.1 Multi-Locus Sequentie Typering (MLST) ......................................................................................... 10 1.6.2 Spa typering ................................................................................................................................................ 10 1.6.3 SCCmec typering ....................................................................................................................................... 11 1.6.4 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) .............................................................................................. 12 1.6.5 Multi-Locus Variable numer tandem repeat Analyse (MLVA) ................................................ 12

1.7 ANTIBIOTICA-RESISTENTIEBEPALING ................................................................................................ 13

II. PROBLEEM- EN DOELSTELLING ................................................................................................... 14

III. RESULTATEN .................................................................................................................................. 16

3.1 AFLEZEN VAN DE MRSA EN SA-ID PLATEN ........................................................................................ 16

3.1.1 Rechtstreekse isolaties ............................................................................................................................ 16 3.1.2 Isolaties na aanrijking ............................................................................................................................ 19

3.1.3 Overzicht van de MRSA positieve stalen .......................................................................................... 20

3.2 MRSA ST398 SPECIFIEKE PCR ............................................................................................................ 21

3.3 MOLECULAIRE TYPERING VAN DE STAMMEN .................................................................................. 22

3.3.1 Spa typering ................................................................................................................................................ 22 3.3.2 SCCmec typering ....................................................................................................................................... 22 3.3.3 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) .............................................................................................. 22 3.3.4 Multi-Locus Variable numer tandem repeat Analyse (MLVA) ................................................ 23

3.4 ANTIBIOGRAMMEN .......................................................................................................................... 27

IV. DISCUSSIE EN CONCLUSIE ............................................................................................................ 33

4.1 PREVALENTIE VAN MSSA EN MRSA OP VARKENSVLEES ................................................................... 33

4.2 TYPERINGEN VAN DE MSSA EN MRSA ISOLATEN ............................................................................. 34

4.3 ANTIBIOTICA RESISTENTIEBEPALING ................................................................................................ 36

4.4. CONCLUSIE ....................................................................................................................................... 37

ii

V. MATERIAAL EN METHODEN ......................................................................................................... 38

5.1 VLEESSTALEN .................................................................................................................................... 38

5.2 HET VERWERKEN VAN DE VLEESSTALEN .......................................................................................... 38

5.3 AFLEZEN EN UITZUIVEREN VAN DE SA-ID EN MRSA-ID PLATEN ....................................................... 40

5.3.1 Rechtstreekse uitplaten van de stalen .............................................................................................. 40 5.3.2 Uitplaten van de stalen na aanrijking ............................................................................................. 40 5.3.2 CBA en BP platen....................................................................................................................................... 41

5.4 IDENTIFICATIE VAN DE MRSA ISOLATEN ........................................................................................... 41

5.4.1 DNA extractie ............................................................................................................................................. 41 5.4.2 Triplex PCR .................................................................................................................................................. 41 5.4.3 Agarosegelelektroforese ........................................................................................................................ 42 5.4.4 MRSA ST398 specifieke PCR ................................................................................................................. 42

5.5 HET BESTUDEREN VAN LANGE TERMIJN EVOLUTIES ........................................................................ 43

5.5.1 Spa typering ................................................................................................................................................ 43 5.5.2 SCCmec typering ....................................................................................................................................... 43 5.5.3 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) .............................................................................................. 46

5.6 HET BESTUDEREN VAN KORTE TERMIJN EVOLUTIES: MULTI-LOCUS VARIABLE NUMER TANDEM

REPEAT ANALYSE (MLVA)........................................................................................................................ 47

5.7 ANTIBIOTICA RESISTENTIEBEPALING ................................................................................................ 49

ADDENDUM .......................................................................................................................................... 50

A.1. RESULTATEN .................................................................................................................................... 50

A.2 VERWERKING VLEESSTALEN ............................................................................................................. 61

A.3 DNA EXTRACTIE ................................................................................................................................ 64

A.4 TRIPLEX PCR ...................................................................................................................................... 65

A.5 CC398 PCR ........................................................................................................................................ 67

A.6 SCCMEC TYPERING............................................................................................................................ 68

A.7 PULSED FIELD GEL ELEKTROFORESE (PFGE) VOOR 10 PLUGS ........................................................... 71

A.8 MULTI-LOCUS VARIABLE NUMER TANDEM REPEAT ANALYSE (MLVA) ............................................ 74

A.9 ANTIBIOGRAMMEN .......................................................................................................................... 75

REFERENTIES ....................................................................................................................................... 77

iii

Lijst van afkortingen ArcC Carbamaat kinase

AroE Shikimaat dehydrogenase

BHI Brain/ Heart Infusion

BlaZ Gen coderend voor een β-lactamase

Bp Basenparen

BP Baird parker

BstZI Bacillus stearothermophilus

BURST Based upon related sequence types

CA-MRSA Community-acquired MRSA

CBA Columbia base blood agar

CC Clonaal complex

Ccr Chromosome recombinase-genen

CIP Ciprofloxacine

Clf Clumpingfactor

CLR Chloramphenicol

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

Coa-gen Coagulase gen

DLV Dubbel locus variant

dNTP Deoxyribonucleotide trifosfaat

ERYTR Erythromycin

EUCAST European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing

6-FAM 6-Carboxyfluorescein

FAVV Federaal Agentschap voor de veiligheid van de voedselketen

GC Guanine-cytosine

GEN Gentamicine

Gglp Glycerol kinase

Gmk Guanylaat kinase

GW grootwarenhuis

HA-MRSA Hospital-acquired MRSA

ISS Integration site sequence

J-regio Junkyard-Joining region

KANAM Kanamycine

Kb Kilobasenparen

Kve Kolonievormende eenheden

LA-MRSA Livestock-associated MRSA

LINCO Lincomycine

LINEZ Linezolid

LPS Lipopolysacharide laag

MecA Methicilline resistentiegen

MecI Gen coderend voor mecA repressor eiwit

MecR Gen coderend voor signaaltransductie eiwit dat de aanwezigheid van β-lactam

antibiotica kan detecteren

MHA Mueller hinton agar

MHB Mueller hinton broth

MIC Minimale inhibitorische concentratie

MLST Multi-Locus Sequence Typing

MRSA Methicilline resistente S. aureus

iv

MSSA Methicilline sensitieve S. aureus

MUPIR Mupirocine

NA Niet aanwezig

NB Niet bepaald

NT Niet typeerbaar

NT ST398 Niet ST398

Nuc Nuclease gen

PBP Penicilline bindende proteïne

PBP2a of PBP2’ Gemodificeerd penicilline bindende protein 2a

PCR Polymerase ketting reactie

PFGE Pulsed Field Gel Elektroforese

Pta Fosfaat acetyltransferase

RIFAM Rifampicine

Rpm Revolution per minute

SA Staphylococcus aureus

S. aureus Staphylococcus aureus

SCCmec Staphylococcale-cassettechromosoom mec

Sdr SD repeat

SDS Natriumdodecylsulfaat

SIRU21 Staphylococcal interspersed repeat unit 21

SL Slager

SLV Single locus variant

SmaI Serratia marescens

Spa Staphylococcus proteïne A

ST Sequentie type

SULFA Sulphonamides

SYN Quinupristine/daflopristine

TET Tetracycline

TOBRA Tobramycine

Tpi Triosefosfaat isomerase

TRIME Trimethoprim

TSA Tryptone Soya Agar

TSB Tryptone Soya broth

TSS Toxisch schock syndroom

TYLOS Tylosine

UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean

VNTR Variabel number tandem repeats

XbaI Xanthomonas badrii

YqiL Acetyl coenzym A acetyltransferase

v

Samenvatting

Methicilline resistente Staphylococcus aureus (MRSA) vormt reeds jarenlang een probleem

in ziekenhuizen en in de gemeenschap. In 2004 werd een derde MRSA type geïsoleerd bij

dieren en dan vooral bij varkens. Dit diergebonden MRSA of MRSA type ST398 zorgt voor

heel wat onrust, daar het niet alleen bij varkens en andere dieren teruggevonden wordt

maar ook bij varkenshouders, hun gezinsleden, dierenartsen en occassioneel bij

ziekenhuispatiënten. Aangezien varkens nutsdieren zijn, deed dit allerlei vragen oproepen

omtrent de aanwezigheid van MRSA ST398 op het varkensvlees en de mogelijke verspreiding

ervan onder mensen. Deze thesis kadert in een IWT project waarbij het voorkomen van

MRSA ST398 onderzocht wordt doorheen de varkensproductieketen. Zo werden er stalen

genomen op boerderijen, in slachthuizen, grootwarenhuizen en bij slagers. De focus van

deze thesis ligt bij het bepalen van het percentage methicilline sensitieve Staphylococcus

aureus (MSSA) en MRSA aanwezig op varkensvlees, verkrijgbaar in grootwarenhuizen (A en

B) en bij slagers (C en D). Hiervoor werden er wekelijks vleesstalen aangekocht bij

verschillende slagers en grootwarenhuizen (n=137). Er werd eveneens nagegaan of de

gevonden MRSA isolaten van humane of dierlijke (ST398) afkomst waren. Tevens werden de

mogelijke genetische verwantschappen tussen de verschillende gevonden humane en

diergebonden MRSA isolaten onderzocht door middel van spa-typering, SCCmec typering en

Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE). Korte termijn evoluties werden onderzocht door

middel van Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis (MLVA). Ten slotte

werden er antibioticaprofielen opgesteld om na te gaan tegen welke antibiotica de isolaten

resistent waren.

Bij vijf vleesstalen (4%) werd er rechtstreeks S. aureus teruggevonden. De teruggevonden

aantallen voldeden aan de criteria opgesteld door het Federaal Agentschap voor de veiligheid

van de voedselketen (FAVV). Er werd bij 13 stalen (9%) rechtstreeks MRSA gevonden, waarvan

de stalen voornamelijk poten en oren waren. Aangezien poten en oren weinig

geconsumeerd worden, vormden deze vleesstalen weinig tot geen direct gevaar voor de

volksgezondheid. Tevens werd nagegaan of de MRSA isolaten tot het nieuwe diergebonden

MRSA type, ST398, behoorden. Hieruit bleek dat 97% van de isolaten, MRSA ST398 waren.

Bij deze isolaten werden drie SCCmec types gevonden: SCCmec cassette V (77%), cassette

IVa (18%) en cassette IVc (1%). Daarnaast werd een spa typering uitgevoerd op een selectie

van de MSSA en MRSA (ST398) isolaten. De meeste (71%) isolaten behoorden tot spa type

t011. Daarnaast werden volgende types teruggevonden: t008, t034, t2370, t091 en t127.

Vervolgens werd een typering uitgevoerd door middel van PFGE op een selectie van de

isolaten en MLVA op alle MSSA en MRSA isolaten. Bij beide typeringsmethodes werden veel

profielen teruggevonden. Ten slotte werd de antibiotica resistentie onderzocht bij de MSSA

en MRSA (ST398) isolaten. Enkele isolaten waren resistent tegen geneesmiddelen (fucidine,

chloramfenicol en quino/dalfopristine) die uitsluitend gebruikt worden in de humane

geneeskunde. De MRSA ST398 isolaten waren grotendeels resistent aan tetracycline (97%)

en trimethoprim (78%), beide vaak gebruikt in de veeteelt. Binnen de vier slagerijen werden

veel verschillende genotypes en antibiotypes gevonden, wat deed vermoeden dat de MRSA

op de vleeswaren afkomstig zijn van meerdere contaminatiebronnen.

vi

Summary During the last 50 years methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) has caused major

problems in hospitals and in the community. In 2004, a third type has been isolated in

pigfarmers and pigs. To date, this livestock-associated MRSA or MRSA type ST398 was also

found in other livestock animals, people working with these animals and hospital patients.

Questions arose about the possible spread of this type from livestock animals to the general

human population. The present study was a part of an IWT-project, during which the

presence of MRSA ST398 was examined throughout the pig-food chain by sampling pig

farms, slaughterhouses, supermarkets and butchers. The main goal of this study was to

examine the potential carryover from live animals to meat and to estimate the methicilline

sensitive Staphylococcus aureus and MRSA percentage, present on pig meat. To determine

the origin of the retrieved isolates, a molecular typing occurred on the obtained isolates.

During six weeks, six pig meat samples (roast meat, chopped meat, bacon, ribs, feet and

ears) were purchased weekly in two supermarkets (A en B) and the butcher shops (C en D),

with a total of 137 samples. The obtained isolates were screened for the presence of ST398

and subsequently spa-typing, SCCmec typing, Pulsed Field Gel Electrophorese (PFGE) and

Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis (MLVA) were used. Finally, the

isolates’ susceptibility to 16 antibiotics was determined.

Five (4%) and 13 (9%) meat samples tested positive for S. aureus and MRSA, respectively.

The number of colony forming units were beneath the indicated limit of the Federal Agency

for food safety (FAVV). The contamination rates were highest on feet and ears, but due to the

the fact that these amples are not bought a lot, the risk of colonization is considered very

low. The majority (97%) of the MRSA isolates belonged to MRSA ST398. These isolates

carries three types of SCCmec types: SCCmec cassette V (77%), cassette IVa (18%) and

cassette IVc (1%). The remaining SCCmec types were non-typeable. Spa typing revealed the

presence of six spa types (t001, t008, t034, t2370, t091 and t127) of which too1

predominated (77%). When using both PFGE and MLVA, a variety in profiles was observed.

Most of the MRSA ST398 isolates were resistant against tetracyclin (97%) and trimethoprim

(78%), both commonly used in animal husbandry. Few isolates were resistant to drugs

(fucidin, chloramphenicol and Quino/dalfopristin) which are exclusively used in human

medicine. In conclusion, the variation of genotypes and antibiotypes within the four

butcheries and over time suggests that the MRSA isolates on the meat orginated from

multiple contamination sources. But the contamination risk to the general human

population appears low.

I. INLEIDING

1

I. Inleiding 1.1 Staphylococcus Staphylococcus is één van de genera van de familie Staphylococcaceae, bestaande uit gram-

positieve cocci. De naam Staphylococcus is afgeleid van het Griekse woord staphyle dat

“trosje” betekent en verwijst naar de clusters die deze ronde bacteriën of “kokken” vormen

(Fig 1.1).

Figuur 1.1: Clustervorming bij Staphylococcus aureus. Deze foto is genomen door middel van een

elektronenmicroscoop scanning (http://phil.cdc.gov/phil/home.asp).

Staphylococci zijn facultatief aerobe, chemo-organotrofe, asporogene, niet-mobiele,

catalase-positieve en vaak halo-tolerante bacteriën met een GC-waarde van ongeveer

30-40% (Brock, 2007). Bovendien zijn ze resistent aan dehydratatie waardoor ze

maandenlang in lucht, grond en water kunnen overleven (Kluytmans, 2010). Naast de

omgeving komen ze ook voor op de huid, de huidklieren, de slijmvliezen, de pharynx, de

mond, het bloed, de faeces enzovoort van hun gastheren (mensen en warmbloedige dieren).

Traditioneel werd het genus onderverdeeld in twee groepen, afhankelijk van de aan- of

afwezigheid van het coagulase-gen (coa-gen): coagulase positieve Staphylococci

(bijvoorbeeld S. aureus, een geel gepigmenteerde species) en coagulase negatieve

Staphylococci (bijvoorbeeld S. epidermidis, een niet gepigmenteerd species).

Het coa-gen draagt bij tot de pathogeniciteit van de bacterie en codeert voor een

extracellulair eiwit, het coagulase. Coagulase bindt en activeert protrombine, een

enzymprecursor van de gastheer, en vormt het staphylotrombine complex. De protease

activiteit van trombine leidt tot de conversie van fibrinogeen naar fibrine, het

basisbestanddeel van bloedstolsel (Friedrich et al, 2003). De accumulatie van fibrine rond de

bacteriële cellen geeft bescherming tegen een mogelijke immuunrespons van de gastheer.

De meest geïsoleerde pathogenen van het genus zijn Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis en Staphylococcus saprophyticus (Brock, 2007).

I. INLEIDING

2

1.2 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus is een belangrijke opportunistische pathogeen van zowel mens als

dier en werd voor het eerst beschreven rond 1880 door Alexander Ogston (Deurenberg &

Stobberingh, 2008). Ongeveer één derde van de bevolking is asymptomatische drager van

deze bacterie op de huid, in de neus en/of in de mond. Staphylococcus aureus zal pas

infecties veroorzaken wanneer de bacterie open wonden of zweren gaat koloniseren. Dit kan

dan leiden tot milde huidinfecties en abcessen maar ook tot levensgevaarlijke ziektes zoals

pneumonie, septicemie en osteomyelitis (Haesebrouck et al, 2006; Nunan & Young, 2007).

Dit levensgevaar doet zich vooral voor wanneer de bacterie wonden gaat koloniseren van

immunogecompromitteerde mensen (Nunan & Young, 2007).

De virulentie van S. aureus is een complex proces dat gecoördineerd wordt door

verschillende genproducten zoals oppervlakte-eiwitten, toxines en gesecreteerde

exoproteïnen (zoals het eerder vernoemde coagulase).

Een groep van oppervlakte-eiwitten zijn adhesines, die interageren met weefsels,

serumeiwitten en/of polypeptiden (bijvoorbeeld laminine en fibronectine) van de

extracellulaire matrix van de gastheer. Zo zijn er de clumpingfactoren (Clf) A en B die

fibrinogeen, de bloedplaatjes en beschadigd epithelium kunnen binden. Naast adhesines

codeert het genoom van S. aureus ook voor andere oppervlakte-eiwitten, zoals bijvoorbeeld

Staphylococcus proteïne A (Spa), die kunnen interfereren met het defensiemechanisme van

de gastheer. Spa biedt bescherming aan S. aureus tegen antilichamen door te binden aan het

Fc-fragment van immunoglobulines, wat opsonisatie en fagocytose inhibeert. Na het binden

van de gastheercellen en het onderdrukken van het immuunsysteem kan de bacterie zich

vermenigvuldigen en de infectieplaats koloniseren.

Na adhesie en kolonisatie gaat de pathogeen de weefsels binnendringen, beschadigen en zo

de infectie verspreiden. Verscheidene toxines zijn in dit proces betrokken zoals hemolysines

(die de membraan van erythrocyten beschadigen en zo hemolyse veroorzaken) en

leukocidines (die de membraan van leukocyten beschadigen). Deze toxines zorgen

hoogstwaarschijnlijk voor de symptomen die gepaard gaan met de infectie.

Verder codeert het genoom van S. aureus voor exoproteïnen zoals coagulase en

staphylokinase. Staphylokinase is een plasminogeen activator dat zorgt voor de vorming van

plasmine. Deze heeft een proteolytische activiteit en breekt fibrineklonters af. Fibrinolyse

zou helpen bij de verspreiding van de bacterie (Daum & Spellberg, 2012; Foster, 1996).

Tevens kan S. aureus voedselvergiftigingen veroorzaken door de productie van

enterotoxines (Nunan & Young, 2007). Enterotoxines zijn kleine gesecreteerde eiwitten die

vaak hitte stabiel zijn en resistent zijn tegen proteolytische enzymen. Hierdoor behouden

deze toxines hun activiteit na ingestie (Foster, 1996). Naast voedselvergiftiging kunnen

enterotoxines ook het toxisch shock syndroom (TSS) veroorzaken. TSS komt voor wanneer

het toxine systemisch wordt uitgedrukt en leidt tot een polyclonale T cel activatie. Dit zorgt

vervolgens tot een storm van cytokine-aanmaak en bijgevolg systemische infecties.

I. INLEIDING

3

1.3 De evolutie tot MRSA 1.3.1 Penicilline resistente Staphylococcus aureus

In 1929 heeft Alexander Fleming penicilline per toeval ontdekt. Cultuurplaten geïnoculeerd

met Staphylococcus varianten waren accidenteel gecontamineerd met een fungus, die de

groei van deze Staphylococcus kolonies inhibeerde. Uit verder onderzoek door Fleming bleek

dat deze schimmel een Penicillum species was en een bacteriolytische component, namelijk

penicilline, produceerde (Fleming, 1929) (Fig. 1.2). In 1939 vonden Ernst Chain en Howard

Florey een manier om penicilline te isoleren en gebruikten ze dit antibioticum om bacteriële

infecties te behandelen (Sulek, 1968).

Figuur 1.2: Structuurformule van Penicilline (Solomon & Donnenfeld, 1986).

Penicilline behoort tot de β-lactam antibiotica, die de celwandproductie van voornamelijk

gram-positieve bacteriën verhinderen. Gram-negatieve bacteriën zijn impermeabel voor het

antibioticum. Dit komt omdat de celwandstructuur van gram-positieve en gram-negatieve

bacteriën verschillend is. De celwanden van gram-positieve bacteriën bevatten een dikke

peptidoglycaanlaag. Bij de gram-negatieve bacteriën hebben de celwanden een complexere

structuur door de aanwezigheid van een buitenste membraan bestaande uit fosfolipiden,

eiwitten en polysachariden. Deze buitenste hydrofobe laag wordt ook de lipopolysachariden

laag (LPS) genoemd (Brock, 2007).

β-lactam antibiotica bevatten een typische β-lactam ring (Fig. 1.3). Deze antibiotica binden

transpeptidasen die instaan voor de aanmaak van de bacteriële celwand [zoals bijvoorbeeld

penicilline bindende proteïnen (PBP)]. Hierdoor kan de transpeptidase reactie niet doorgaan

en gebeurt er geen cross-linking van peptidoglycaan ketens. Dit zorgt ervoor dat de nieuw

gesynthetiseerde celwand zijn sterkte verliest. Bovendien kan het antibiotica-transpeptidase

complex de productie van autolysines stimuleren die de reeds verzwakte celwand verder

afbreken. Tot slot zal het osmotische verschil tussen het milieu binnen en buiten de cel

leiden tot celdood (Brock, 2007).

Figuur 1.3: β-lactam ring structuur. (http://flashcarddb.com/cardset/140084-antibacs-i-anaerobes-oppor-

infections-flashcards)

I. INLEIDING

4

In 1942 werd de eerste penicilline resistente S. aureus stam beschreven door Rammelkamp

en Maxon (Rammelkamp & Maxon, 1942). Resistente stammen hebben het resistentiegen

BlaZ, dat codeert voor een β-lactamase. Dit enzym verhindert de werking van penicilline

door de β-lactam ring open te breken (Nunan & Young, 2007). Door het veelvoudig gebruik

van β-lactam antibiotica in de ziekenhuizen, stierven gevoelige bacteriën af en werd de

overleving van resistente bacteriën in de hand gewerkt. In 1950 kwamen penicilline

resistente stammen overal ter wereld voor in ziekenhuizen. Tot dan toe waren de S. aureus

isolaten, afkomstig van de gemeenschap, nog gevoelig aan penicilline. Hierdoor bleef men

penicilline als antibioticum gebruiken tegen S. aureus infecties. In 1969 werd in

Denenmarken een grootschalige studie uitgevoerd door Jessen et al waarbij de

epidemiologie van penicilline resistente S. aureus stammen onderzocht werd in de

gemeenschap en in ziekenhuizen (Jessen et al, 1969). Daaruit bleek dat het niveau van

penicilline resistente S. aureus stammen bijna hetzelfde was in de gemeenschap als in de

ziekenhuizen (Fig. 1.4). Daar dit niet alleen het geval was in Denenmarken maar ook in de

Verenigde Staten en Europese landen, werd vanaf 1970 penicilline niet meer gebruikt om

S. aureus infecties te behandelen.

Figuur 1.4: De stijging van het aantal penicilline resistente S. aureus stammen in de ziekenhuizen en

gemeenschap vanaf 1942 tot midden jaren ‘70. Het aantal penicilline resistente S. aureus stammen uit het

ziekenhuis (gesloten symbolen) en de gemeenschap (open symbolen) wordt uitgedrukt in percent (Chambers,

2001).

I. INLEIDING

5

1.3.2 Methicilline resistente Staphylococcus aureus

Door de snelle toename van penicillineresistentie in de jaren 50 was er nood aan nieuwe

antibiotica om S. aureus infecties te behandelen. In 1959 leidde dit tot de ontwikkeling van

een semi-synthetisch antibioticum: methicilline (Fig. 1.5). Methicilline is een penicilline-

derivaat dat resistentie vertoonde tegen β-lactamasen en zo pencilline resistente stammen

kon doden (Nunan & Young, 2007). Slechts twee jaar na het eerste gebruik van methicilline

werden de eerste methicilline resistente S. aureus (MRSA) stammen beschreven in het

Verenigde Koninkrijk (Jevons, 1961). Sindsdien werden er ook MRSA stammen

gerapporteerd in andere Europese landen, Japan, Australië en de Verenigde Staten (Enright

et al, 2002).

Figuur 1.5: Structuurformule van Methicilline (Solomon & Donnenfeld, 1986).

De methicillineresistentie is gelinkt aan het mecA gen (methicilline resistentie gen), dat

chromosomaal gelegen is op een mobiel genetisch element, het Staphylococcale-

cassettechromosoom mec (SCCmec) (Vanderhaeghen et al, 2010). Er heerst een sterk

vermoeden dat het mecA gen afkomstig is van het genoom van een ander bacterieel species

en in het verleden geïntegreerd is in het chromosoom van S. aureus (Ito et al, 1999). Het

mecA gen codeert voor een gemodificeerd penicilline bindend eiwit (PBP2a of PBP2’) met

een lagere bindingsaffiniteit voor β-lactam antibiotica. PBP2a blijft functioneel actief terwijl

andere PBP’s geïnactiveerd worden door penicilline/methicilline (Leonard & Markey, 2008;

Vanderhaeghen et al, 2010).

De expressie van het mecA gen wordt gereguleerd door mecI en mecR1. Het mecI gen

codeert voor het mecA repressor eiwit dat de transcriptie van mecA onderdrukt wanneer

β-lactam antibiotica afwezig zijn. Het mecR1 gen codeert voor een signaaltransductie eiwit

dat de aanwezigheid van β-lactam antibiotica kan detecteren. Hierbij wordt mecRI

autokatalytisch gekliefd en wordt het metalloprotease domein actief. Dit metalloprotease

zal op zijn beurt mecI, gebonden aan de mecA operator regio, splitsen waardoor de

transcriptie van mecA kan starten met als gevolg de vorming van PBP2a (Deurenberg &

Stobberingh, 2008).

I. INLEIDING

6

1.4 De verschillende MRSA types 1.4.1 Ziekenhuisgebonden MRSA

Sinds 1960 vormt MRSA een groot probleem in ziekenhuizen waar ze endemisch kunnen

voorkomen. Dit komt doordat in ziekenhuizen patiënten vaak een verzwakt immuunsysteem

hebben, waardoor ze gevoeliger zijn voor MRSA infecties. MRSA kan verspreid worden via

direct contact met een MRSA-drager. Doordat er soms meerdere patiënten op één kamer

verblijven en/of verzorgend personeel asymptomatisch drager van MRSA kunnen zijn,

bestaat de mogelijkheid dat patiënten geïnfecteerd geraken. Daarenboven kan een patiënt

via contact met gecontamineerde stofdeeltjes, huidschilfers, voorwerpen en oppervlakten

besmet geraken met MRSA. In ziekenhuizen veroorzaakt MRSA vaak huidinfecties.

De ziekenhuisgebonden MRSA (“hospital-acquired” of HA-MRSA) is vaak niet alleen resistent

tegen β-lactam antibiotica maar ook tegen andere antimicrobiële middelen, waardoor MRSA

ook wel multiresistente S. aureus genoemd wordt. MRSA is hierdoor moeilijk te behandelen

en zorgt zo voor ernstige morbiditeit en mortaliteit in ziekenhuizen (Weese, 2010).

De meeste MRSA-stammen zijn nog gevoelig aan vancomycine, maar door veelvoudig

gebruik van dit antibioticum, werden intussen ook vancomycine resistente S. aureus (VRSA)

stammen gerapporteerd(Haesebrouck et al, 2006).

1.4.2 Gemeenschapsgebonden MRSA

In 1990 kwam er een tweede grote epidemiologische schift waarbij MRSA voorkwam in de

gemeenschap. Bij dit MRSA type spreekt men van “community-acquired” MRSA (CA-

MRSA)(Haesebrouck et al, 2006; Weese, 2010). CA-MRSA is meestal gerelateerd met

infecties van de huid en zachte weefsels wat bij HA-MRSA minder het geval is (Aarestrup &

Schwarz, 2006).

De eerste gevallen van CA-MRSA infecties kwamen voor in inheemse populaties in het

westen van Australië. Na uitvoeren van “Pulsed Field” Gel Elektroforese (PFGE) op deze

MRSA stammen werden andere klonen onderscheiden dan degene die circuleerden in de

Australische ziekenhuizen. De CA-MRSA stammen bleken gevoelig voor andere

antimicrobiële middelen dan β-lactam antibiotica. Mogelijk waren deze stammen verre

afstammelingen van HA-MRSA ofwel S. aureus stammen die op een ander moment het mecA

gen verworven hadden via horizontale gentransfer.

In 1995-1999 werden in de Verenigde Staten de eerste CA-MRSA stammen afkomstig van

gezonde kinderen goed gedocumenteerd. Deze kinderen konden niet gelinkt worden aan

gekende risicofactoren voor MRSA en stierven allemaal aan ernstige infecties. Door de

productie van toxines, zoals bijvoorbeeld Panton-Valentine leukocidine-toxine en phenol

soluble moduline-toxine, kon CA-MRSA ernstige infecties veroorzaken over het hele lichaam

met soms de dood tot gevolg. Ook deze CA-MRSA stammen bleken niet gerelateerd aan HA-

MRSA stammen en waren gevoelig voor de meeste antibiotica (Chambers & Deleo, 2009).

Tegenwoordig is CA-MRSA een groot probleem. Zeer typisch is dat veelal jonge mensen

zonder gezondheidsproblemen geïnfecteerd worden. Bovendien verspreidt het zich

gemakkelijk in de bevolking. Een voorbeeld hierbij is de verspreiding van CA-MRSA in

sportclubs door het delen van handdoeken (http://www.phila.gov/health/pdfs/CA-

MRSA_guidelines.pdf).

I. INLEIDING

7

1.4.3 Diergebonden MRSA

Een volgende stap in de evolutie van MRSA is bij dieren te vinden. Zo werd in 1972 MRSA

voor het eerst geïsoleerd uit (melk van) runderen met mastitis (Devriese et al, 1972).

Sindsdien werd ook MRSA geïsoleerd uit huisdieren. Deze dieren bleken meestal

geïnfecteerd met humane MRSA stammen afkomstig van de eigenaar(s). Door dekolonisatie

van dieren, stopte meestal de MRSA kolonisatie van de eigenaars en omgekeerd.

Vanaf 2004 werd er echter MRSA gevonden bij mensen die een link hadden met

veehouderij. Zo werd bij een zes maanden oud meisje MRSA gevonden. Ondanks

verscheidene pogingen om de bacterie te elimineren bleef het meisje maandenlang door

MRSA gekoloniseerd. Bij de ouders, die varkenshouders waren, werd eveneens MRSA

gevonden (Voss et al, 2005). In hetzelfde jaar werd er een jonge moeder in het ziekenhuis

opgenomen met mastitis veroorzaakt door MRSA, waarvan de partner een varkenshouder

bleek te zijn. Ook hier waren de gezinsleden besmet met MRSA. De medewerkers (n=3) en

varkens (n=10) aanwezig op het bedrijf werden getest op MRSA. Bij alle drie de

medewerkers en acht van de geteste varkens werd MRSA gevonden (Nunan & Young, 2007).

Begin 2005 werd er opnieuw MRSA gevonden bij een varkensboer en een zoon van een

varkensdierenarts. Dit zorgde voor het vermoeden dat varkens een mogelijke bron van

MRSA konden zijn.

Vervolgens werden 30 varkens, afkomstig van de boerderij van het baby-meisje en van

andere boerderijen uit de buurt, getest op MRSA aanwezigheid. Bij één varken, afkomstig

van de boerderij van het baby-meisje, kon MRSA geïsoleerd worden. Ook werden andere

varkensboeren uit de regio getest, waarvan er meerdere MRSA drager bleken te zijn.

Wetenschappers probeerden de verkregen stammen te typeren door middel van PFGE met

SmaI (Serratia marescens) restrictie, maar deze stammen bleken niet-typeerbaar (NT). Na

spa-typering van de stammen bleek dat het babymeisje, haar familie en het varken

afkomstig van hun boerderij besmet waren met éénzelfde type, namelijk spa-type t108.

Deze resultaten vormden het eerste bewijs van transmissie van MRSA tussen varken en

varkenshouder en tussen varkenshouder en zijn familie (Nunan & Young, 2007; Voss et al,

2005). Door nog een andere typeringsmethode te gebruiken, namelijk Multi-Locus Sequence

Typing (MLST), werden alle isolaten geïdentificeerd als sequentie type ST398. MRSA ST398

wordt ook wel “pig-associated” MRSA genoemd.

Bij verdere studies omtrent de verspreiding van MRSA in varkens in verschillende landen

zoals Nederland, Duitsland, Canada, België, Singapore en de Verenigde Staten werden

telkens door SmaI PFGE niet typeerbare isolaten, behorende tot sequentie type 398

gevonden. Door deze studies werd het duidelijk dat dit MRSA type wijd verspreid was bij

varkens. De isolaten behoorden tot verschillende spa-types (vooral t011, t108 en t1254)

(Weese & van Duijkeren, 2010). Tevens zag men dat MRSA ST398 stammen bijna altijd

tetracycline resistent waren (de Neeling et al, 2007). Van Duijkeren et al. (2008) testten tien

varkens op MRSA aanwezigheid voor en na toediening van tetracycline. Na gebruik van

tetracycline werd een stijging gezien in MRSA kolonisatie. Dit kleinschalige onderzoek was

echter niet statistisch significant maar heeft geleid tot de suggestie dat het veelvoudig

gebruik van tetracycline als antibioticum en groeipromotor in de varkensteelt geleid heeft

tot het voorkomen en verspreiden van MRSA ST398 (van Duijkeren et al, 2008).

I. INLEIDING

8

Tegenwoordig wordt dit type ook teruggevonden in andere nutsdieren, zoals runderen en in

mindere mate bij kippen en kalkoenen. Tevens werd MRSA ST398 beschreven bij

gezelschapsdieren zoals honden, katten en paarden. Het veelvuldig beschrijven van MRSA

ST398 bij deze verschillende diersoorten heeft geleid tot een verandering van naam:

“pig-associated” MRSA werd “livestock-associated” of diergebonden MRSA (LA-MRSA)

genoemd (Smith & Pearson, 2011; Vanderhaeghen et al, 2010; Weese, 2010; Weese & van

Duijkeren, 2010).

1.5 Implicaties op de volksgezondheid De impact van MRSA ST398 op de volksgezondheid wordt nog steeds onderzocht. Tot op

heden veroorzaakt MRSA ST398 weinig infecties bij mensen, maar doorheen de jaren

werden er toch een aantal gevallen beschreven, met soms ernstige infecties tot gevolg

(Graveland et al, 2011; van Cleef et al, 2011).

Eén van de risicofactoren voor dragerschap van MRSA ST398 bij mensen is het rechtstreeks

en langdurig contact met varkens. Dit zijn bijvoorbeeld mensen die op boerderijen leven en

werken, slachthuismedewerkers en dierenartsen (van Duijkeren et al, 2008). De vraag rees

of deze stam zich kan verspreiden van personen met direct varkenscontact naar de

maatschappij. Indien deze verspreiding kan optreden, kan dit leiden tot grote problemen

(Nunan & Young, 2007).

Tot op heden zijn er een aantal studies geweest om deze vraag te beantwoorden. Zo

onderzochten Cuny et al. (2009) de prevalentie van MRSA ST398 in individuen met contact

met varkens, personen die leven op boerderijen zonder contact met varkens en

schoolkinderen in de buurt van de MRSA positieve boerderijen. Tijdens deze studie werd

gezien dat de verspreiding van MRSA ST398 van gekoloniseerde varkensboeren naar de

gemeenschap voorkomt, maar niet frequent(Cuny et al, 2009). Toch neemt het aantal

rapporten betreffende MRSA ST398 besmettingen van patiënten in ziekenhuizen en

individuen die geen contact hebben met levende varkens geleidelijk aan toe (Smith et al,

2010). Zo was er in juni 2007 een ST398 uitbraak in een ziekenhuis in Nederland. Wulf en

collega’s (2008) vonden MRSA bij vijf patiënten en vijf verzorgenden. Geen van de patiënten

kwam in contact met varkens. Eén van de verzorgenden woonde op een varkensboerderij

maar kwam zelf niet in contact met de varkens. De onderzoekers vermoedden dat deze

verpleegster hoogstwaarschijnlijk de bron was van MRSA ST398. Dit werd echter niet

bewezen omdat de varkens op de boerderij niet onderzocht mochten worden (Wulf et al,

2008).

In een studie van Rijen et al. (2008) werd de transmissie van MRSA ST398 in vergelijking met

HA-MRSA onderzocht. Hieruit bleek dat personen gekoloniseerd met MRSA ST398 minder

snel anderen infecteerden ten opzichte van HA-MRSA patiënten (van Rijen et al, 2008). Dit

werd tevens bevestigd door andere studies. Vancleef et al. (2011) onderzochten hoe lang

een persoon die kort in de varkensstallen verblijft, MRSA ST398 draagt. Na 24 uur bleken de

personen terug negatief voor MRSA (van Cleef et al, 2011).

Bovendien heeft MRSA ST398 weinig tot geen humane virulentiegenen, waardoor deze

moeilijker in staat is om mensen te contamineren (Price et al, 2012). Price et al.

suggereerden dat MRSA ST398 ontstaan is in mensen als MSSA (methicilline sensitieve

S. aureus). Vervolgens verspreidde de bacterie zich snel en infecteerde vee via zoönose.

I. INLEIDING

9

Deze “sprong” van mens naar vee ging samen met het verlies van humane virulentiegenen

en acquisitie van tetracycline en methicilline resistentiegenen. Verder is ook bevestigd dat

transfer van deze bacterie in twee richtingen voorkomt (Price et al, 2012).

Naast rechtstreeks contact met varkenshouders en dergelijke, kan er ook secundaire

transmissie van MRSA ST398 optreden. Zo kunnen mensen gekoloniseerd geraken door

bijvoorbeeld luchtcontaminatie. Uit onderzoek blijkt dat bacteriën afkomstig van een

varkensbedrijf tot 150 meter verder terug te vinden zijn (Gibbs et al, 2006; Smith et al,

2010). Daar MRSA ST398 veelvuldig voorkomt bij voedselproductiedieren is het vlees van

deze dieren een andere mogelijke contaminatiebron. Kan via vlees en vervolgens

kruiscontaminatie MRSA ST398 verspreid worden onder mensen (Vanderhaeghen et al,

2010)?

In een Nederlands onderzoek van juni 2007 tot mei 2008 onderzocht men de prevalentie van

MRSA ST398 op 2217 rauwe vleesstalen, zoals aangeboden door grootwarenhuizen en

slagers. MRSA werd geïsoleerd uit 264 (11,9%) vleesmonsters, waarvan 28 (10,7%)

varkensvleesstalen. MRSA isolaten uit de verschillende vleessoorten behoorden grotendeels

(87%) tot het type ST398. Het aantal bacteriën teruggevonden op vlees, was zeer laag wat

doet vermoeden dat MRSA ST398 op deze producten tot op heden geen groot risico vormt

voor de volksgezondheid (de Boer, 2008). Beneke et al. (2011) hebben in 2011 het

voorkomen van MRSA in de varkensvleesproductieketen onderzocht. Op deze manier wilden

ze het overdragen van MRSA van levende dieren doorheen het slachtproces bepalen met als

eindproduct het vlees in de winkels. Uit de resultaten bleek dat MRSA over de gehele

productieketen voorkwam (Beneke et al, 2011). Meer onderzoek is nodig om dit de

bevestigen en mogelijke transmissieroutes van MRSA in de vleesproductieketen te

onderzoeken om zo potentiële contaminatie te verminderen.

I. INLEIDING

10

1.6 Moleculaire technieken Tegenwoordig zijn er een aantal technieken beschikbaar om lange-termijnevoluties binnen

MRSA stammen na te gaan, zoals Multi-Locus Sequentie Typering, spa-typering, SCCmec

typering en Pulsed Field Gel Elektroforese. Voor korte-termijnevoluties wordt er onder

andere Multi-Locus Variable number tandem repeat Analyse gebruikt.

1.6.1 Multi-Locus Sequentie Typering (MLST)

Multi-locus sequentietypering (MLST) kan gebruikt worden om lange termijn evoluties te

analyseren tussen MRSA isolaten. Deze methode meet de genetische diversiteit in zeven

huishoudgenen: carbamaat kinase (arcC), shikimaat dehydrogenase (aroE), glycerol kinase

(glp), guanylaat kinase (gmk), fosfaat acetyltransferase (pta), triosefosfaat isomerase (tpi) en

acetyl coenzym A acetyltransferase (yqiL). Dit zijn essentiële genen coderend voor eiwitten

die constitutief worden aangemaakt. Bij MLST worden deze genen geamplificeerd en

vervolgens gesequeneerd. Elke locus krijgt een specifiek nummer of allel type toegekend.

Zo heeft één isolaat zeven nummers, wat een allelisch profiel wordt genoemd. Het allelisch

profiel krijgt vervolgens een nummer of sequentie type (ST) toegewezen. Stammen die maar

één of twee loci verschillen worden respectievelijk “single” locus varianten (SLV) of dubbel

locus varianten (DLV) genoemd. In onder andere Bionumerics® worden de bekomen STs,

SLVs en DLVs geanalyseerd met BURST (“based upon related sequence types”) en

gegroepeerd in clonale complexen (CC) om tenslotte fylogenische bomen te maken. In een

clonaal complex wordt de ST met het grootste aantal verschillende SLVs en DLVs de

“voorouderlijke ST” genoemd en het CC wordt genummerd naar zijn voorouderlijke ST

(Vanderhaeghen et al, 2010). Er bestaat een website (http://mlst.ox.ac.uk) waarop een allelisch

profiel toegevoegd vergeleken kan worden met andere MRSA en MSSA profielen (Enright et

al, 2000). Een nadeel zijn de hoge kosten die gepaard gaan met deze methode. Daarenboven

is MLST labo-intensief en dus niet geschikt voor honderden isolaten.

1.6.2 Spa typering

Spa-typering is een “single locus” typeringsmethode ontwikkeld door Frenay et al. (1996)

waarbij de repeat regio of polymorfische regio X geanalyseerd wordt van de S. aureus

proteïne A (spa) locus (Deurenberg & Stobberingh, 2008).

Deze repeat-regio in het spa-gen is gevoelig aan het verliezen en/of winnen van repeats en

aan spontane mutaties. De polymorfische regio bevat een “variabel number tandem repeat”

(VNTR) van 24 bp en ligt stroomopwaarts van het gen coderend voor de C-terminale celwand

“attachment”-sequentie (Fig. 1.6). De repeat-regio wordt geamplificeerd en vervolgens

gesequeneerd. De volgorde van de specifieke repeats bepaalt het spa-type.

Het is een snelle, reproduceerbare en in vergelijking met MLST een goedkope methode om

MRSA te typeren (Shopsin et al, 1999). Een ander voordeel is de beschikbaarheid van een

softwarepakket, StaphType®, om de bekomen sequentiechromatogrammen te analyseren.

StaphType® maakt gebruik van een algoritme gebaseerd op het repeat-patroon (“based

upon repeat pattern”, BURP) om clusteranalyse van de spa-typeringsdata uit te voeren.

I. INLEIDING

11

Er bestaat tevens een centrale spa server (http://spaserver.ridom.de) waar de spa typeringsdata

te vinden zijn (Deurenberg & Stobberingh, 2008). Deze databank is één van de grootste

typeringsdatabanken van S. aureus en bestaat momenteel uit meer dan 10000 spa-types.

Figuur 1.6: Een schematisch overzicht van het spa-gen. Het spa-gen codeert voor proteïne A en is in het

overzicht opgedeeld in verschillende blokken. Blok S is een signaalsequentie (S), blokken A tot E zijn

immunoglobuline G bindende regio’s. De regio X stelt het COOH-terminale gedeelte van proteïne A voor en

bestaat uit een XF-blok (de short sequence repeats of SSR) en een XC-blok (een celwand “attachment”

sequentie)(Shopsin et al, 1999; Uhlen et al, 1984).

1.6.3 SCCmec typering

Staphylococcale-cassettechromosoom mec (SCCmec) is een mobiel genetisch element dat

het resistentiegen mecA tegen β-lactam antibiotica draagt. Naast het mecA gen, gelegen in

het mec-gencomplex, draagt de cassette ook cassette chromosome recombinase-genen (ccr-

genen). De ccr-genen staan in voor een plaats specifieke recombinatie waardoor het

genetisch element op specifieke plaatsen in het chromosoom van gevoelige stammen

geïnsereerd kan worden. Deze specifieke plaatsen worden de integratie site sequentie (ISS)

genoemd. De ccr-genen zijn gelegen in het ccr-gencomplex. Naast de twee vernoemde

complexen bevat het SCCmec element ook een J-regio of “joining/junkyard region”. Deze

bevat de niet-essentiële componenten van de cassette (bijvoorbeeld extra antibiotica-

resistentiegenen).

SCCmec elementen zijn zeer divers qua structuur en sequentie, waardoor ze onderverdeeld

kunnen worden in types en subtypes. Zo zijn er drie fylogenetisch verschillende ccr-genen:

ccrA, ccrB en ccrC en zijn er vijf verschillende allotypes geïdentificeerd op basis van allelische

variaties. Bij het mec-gencomplex zijn er vijf klassen: A, B, C1, C2 en D. Er zijn tot nu toe 11

(I-XI) verschillende types en subtypes beschreven in MRSA. De subtypes worden bepaald op

basis van de polymorfismen aanwezig in de J-regio (Ito, 2009; Vanderhaeghen et al, 2010).

Uit onderzoek blijkt dat SCCmec types I, II en III vaak teruggevonden worden in HA-MRSA en

types IV en V in CA-MRSA. Verder blijkt ook dat in LA-MRSA de types IVa en V het meeste

voorkomen. De SCCmec types IV en V dragen minder extra antibiotica resistentiegenen naast

het methicillineresistentiegen in vergelijking met de types I, II en III. De cassette is hierdoor

kleiner en wordt dus makkelijker doorgegeven via horizontale gentransfer en verspreidt CA-

MRSA zich sneller dan HA-MRSA (Grundmann et al, 2006; Nunan & Young, 2007).

Voor de typering wordt de cassette geamplificeerd met primers die op de geconserveerde

sequenties in de ccr en mec regio kunnen binden. Vervolgens worden de amplicons

gescheiden op gel waardoor men een “fingerprint” bekomt. Aan de hand van deze

fingerprint kan het SCCmec type van het isolaat bepaald worden.

I. INLEIDING

12

1.6.4 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) is de gouden standaard om S. aureus te typeren en

wordt onder andere gebruikt om epidemieën te onderzoeken. Hiervoor wordt een

restrictiereactie uitgevoerd op het in agarose ingebed DNA. De resulterende DNA

fragmenten worden gescheiden door middel van agarosegel elektroforese in een elektrisch

veld met een wisselende voltage gradiënt. Doordat het voltage periodiek van richting

verandert, kunnen grote DNA fragmenten tot 1000 Kb gescheiden worden. De DNA

fragmenten moeten namelijk bij elke stroomwisseling heroriënteren om verder door te gel

te bewegen. De tijd nodig om het heroriëntatieproces te vervolledigen is afhankelijk van de

grootte van het DNA fragment: hoe groter, hoe langzamer en moeizamer. Op deze manier

verkrijgt men een “fingerprint” van het bacterieel genoom, dat verder geanalyseerd kan

worden met onder andere Bionumerics®. Met behulp van deze software kunnen onder meer

fylogenetische bomen gemaakt worden.

De nadelen van deze zeer discriminerende methode zijn de hoge kosten en de tijdsrovende

protocols (Deurenberg & Stobberingh, 2008; Herschleb et al, 2007). Door het bestaan van

een gestandaardiseerde methode (HARMONY) kunnen resultaten van verschillende labo’s

vergeleken worden aan de hand van internationale databanken.

Om (methicilline resistente) S. aureus te typeren wordt PFGE met SmaI-restrictie gebruikt.

Doordat MRSA ST398 een methylatie bevat op de SmaI restrictieplaats, kan het enzym niet

knippen en wordt er gesproken van niet-typeerbare MRSA (Bosch et al, 2010). Bij deze

isolaten zullen er andere restrictie-enzymen gebruikt worden zoals BstZI, SacII, ApaI, Cfr9 en

XmaI (Rasschaert et al, 2009).

1.6.5 Multi-Locus Variable numer tandem repeat Analyse (MLVA)

Om de korte termijn evoluties tussen isolaten te bestuderen kan men Multi-Locus Variable

number tandem repeat Analyse (MLVA) gebruiken. Het is een polymerase ketting reactie

(PCR) gebaseerde methode, waarbij variable number tandem repeats (VNTRs)-regio’s van

verschillende individuele genen worden geanalyseerd. De tandem herhalingen kunnen

gebruikt worden om de genetische diversiteit van MRSA te onderzoeken.

De polymorfisme-index kan van elke locus berekend worden en er kunnen zeer specifieke

primers ontwikkeld worden. Door middel van een MLVA, specifiek ontwikkeld voor MRSA

ST398, worden via multiplex PCR de repeat regio’s van vijf genen geamplificeerd. De

amplicons worden samen met een standaardmerker gescheiden op gel of door middel van

capillaire elektroforese. Allelen die één repeat in grootte verschillen kunnen hierdoor

gescheiden worden.

Deze methode blijkt goed te zijn voor het typeren van S. aureus, klinische en dierlijke MRSA

isolaten. MLVA is zeer reproduceerbaar en heeft een hoog discriminerend vermogen. Verder

is het een goedkope en makkelijk interpreteerbare methode (Lindstedt, 2005; Rasschaert et

al, 2009).

I. INLEIDING

13

1.7 Antibiotica-resistentiebepaling

Om na te gaan tegen welke antibiotica de isolaten resistent zijn, wordt onder andere gebruik

gemaakt van Neo-Sensitabs (Rosco diagnostica®). Neo-Sensitabs zijn tabletten die een

variëteit aan anti-microbiële stoffen bevat. De isolaten worden op Mueller Hinton II Agar

uitgeplaat en de tabletten worden vervolgens via een dispenser aangebracht op de

agarplaten. Na incubatie (24 uur bij 37 °C) wordt de zonediameter van de groei-inhibitiezone

rondom de tabletten gemeten. De resultaten worden vergeleken met een interpretatietabel

voor de individuele antibiotica. De isolaten worden op resistentie tegen 16 antibiotica

getest, waarvan enkele uitsluitend in de humane geneeskunde gebruikt worden zoals

chloramfenicol, fucidine, linezolid, mupirocine, quino/dalfopristine en rifampicine. De overig

geteste antibiotica worden onder andere gebruikt in de diergeneeskunde. De meest

gebruikte antibiotica bij veeteelt zijn sulfonamides en trimethoprim (behoort tot de

antibioticumklasse van sulfonamides), penicilline en tetracycline. Tevens worden ook

combinaties van drie antibiotica gebruikt, om kruisresistentie aan te tonen (erythromycine,

lincomycine en tylosine/kanamycine, gentamicine en tobramycine). Deze methode is

gebaseerd op het standaardprotocol van Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).

Men kan ook de minimale inhibitorische concentratie (MIC) bepalen van een antibioticum.

De minimale inhibitorische concentratie is de laagste concentratie van een antibioticum

waarbij de groei van de bacterie wordt geïnhibeerd na één nacht incubatie. Hoe lager de

MIC, hoe beter het antibioticum werkt tegen die bacterie. De MIC kan bepaald worden door

middel van een verdunningsreeks volgens een standaardprotocol van CLSI of van European

Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST).

Tevens kunnen de antibioticaresistentie genen gedetecteerd worden door middel van PCR

met primers tegen geconserveerde regio’s in het gen of door middel van hybridisatie van het

bacterieel DNA met micro-arrays waarop zich sequenties bevinden van resistentiegenen.

II. PROBLEEM- EN DOELSTELLING

14

II. Probleem- en doelstelling

Reeds jarenlang vormt MRSA een probleem in de ziekenhuizen en gemeenschap. De

ziekenhuis en gemeenschapsgebonden MRSA veroorzaken vaak infecties wat “livestock –

associated” MRSA of MRSA ST398 minder doet. Stilaan neemt echter het aantal rapporten

over MRSA ST398 infecties toe, waardoor men de verspreiding naar de maatschappij wilt

vermijden. Een belangrijke bron van MRSA ST398 zijn varkens en mensen die vaak in contact

komen met varkens. In een studie van Cuny et al. (2009) blijkt dat de transmissie van MRSA

ST398 van gekoloniseerde varkensboeren naar de gemeenschap niet frequent voorkomt. Om

toch te vermijden dat MRSA ST398 terecht komt in de gemeenschap via een andere manier,

werd de aanwezigheid van MRSA ST398 doorheen de varkensproductieketen onderzocht.

Deze thesis kadert in een IWT project waarbij het voorkomen van MRSA ST398 onderzocht

wordt doorheen de varkensproductieketen. Zo zullen er stalen genomen worden op

boerderijen, in slachthuizen, supermarkten en bij slagers. Verder zal ook onderzocht worden

hoe in de primaire sector MRSA positieve bedrijven geremedieerd kunnen worden.

Gedurende deze thesis zal het percentage MRSA bepaald worden op varkensvlees

verkrijgbaar in supermarkten en bij slagers. Hiervoor zullen er wekelijks

varkensvleesproducten aangekocht worden bij verschillende slagers en supermarkten.

Volgende vleesstalen zullen geanalyseerd worden: varkensribben, die zich bevinden aan de

binnenkant van het karkas en spek (met zwoerd), dat zich bevindt aan de buitenkant van het

karkas (de huid). Ook varkenspoten of varkensschenkels worden aangekocht, aangezien uit

een voorstudie bleek dat de poten het meeste MRSA gecontamineerde deel waren van het

karkas. Tot slot zullen ook varkensmignonettes (vaak geconsumeerd), varkensoren en

varkensgehakt (omdat dit vlees sterk gemanipuleerd wordt tijdens de verwerking)

onderzocht worden. Er zal eveneens nagegaan worden of de gevonden MRSA isolaten van

humane of dierlijke/ST398 afkomst zijn.

Indien de consument in gevaar is bij consumptie van het varkensvlees, moeten de resultaten

gemeld worden aan het FAVV (Federaal Agentschap voor de veiligheid van de voedselketen).

Echter, in de voedselveiligheidscriteria van het FAVV staat nergens het toegelaten aantal van

MRSA of MSSA op (varkens)vleeswaren vermeld. Er kan tevens naar de

proceshygiënecriteria gekeken worden: wanneer volgens deze criteria de aangegeven

aantallen overschreden worden, komt niet zodanig de volksgezondheid in gevaar, maar

moet de hygiëne aangepast worden in het productieproces. Volgens deze criteria moet het

kve/g van coagulase positieve Staphylococci (zoals S. aureus) op rauw gehakt lager zijn dan

100 kve/g, maar mag bij twee van de minstens vijf onderzochte stalen het aantal maximum

1000 kve/g zijn. Daar er niets vermeld staat in de criteria over de ander onderzochte

vleesstalen, werden de resultaten van alle vleessoorten met bovenstaande criterium

vergeleken. Tevens werden alle resultaten gemeld aan het FAVV.

Vervolgens worden de verwantschappen tussen de verschillende verkregen humane en

diergebonden MRSA isolaten onderzocht door middel van methodes die lange termijn

evoluties detecteren zoals spa-typering, PFGE en SCCmec typering. Korte termijn evoluties

kunnen onderzocht worden door middel van Multiple-Locus Variable number tandem repeat

Analysis (MLVA). Door het uitvoeren van deze typeringsmethoden, kan nagegaan worden of

de stammen van éénzelfde of verschillende contaminatiebron(nen) afkomstig zijn.

II. PROBLEEM- EN DOELSTELLING

15

Ten slotte zullen er antibioticaprofielen opgesteld worden om na te gaan tegen welke

antibiotica de isolaten resistent zijn.

III. RESULTATEN

16

III. Resultaten

3.1 Aflezen van de MRSA en SA-ID platen

Het aantal methicilline resistente/sensitieve Staphylococcus aureus kolonies werd per gram

(voor de mignonettes, het spek en gehakt) of vierkante centimeter (voor de ribben, poten en

oren) geschat.

3.1.1 Rechtstreekse isolaties

Er werden minstens vijf groene kolonies per verdunningsreeks van elk vleesstaal opgepikt

van de SA-ID platen. Daarnaast werd (indien aanwezig) één blauwgroene kolonie van de nul

verdunning op de MRSA-ID platen geselecteerd. Om na te gaan of de stammen MSSA of

MRSA waren, werd een triplex PCR uitgevoerd op de bekomen lysaten. Bij deze PCR werd er

gekeken naar de aanwezigheid van drie genen door specifieke primers te gebruiken tegen

het mecA gen (533 bp), het nuc gen (279 bp) en het 16S rRNA gen (750 bp). Bij MRSA

stammen worden alle genen geamplificeerd. Bij MSSA stammen zijn slechts twee van de drie

genen aanwezig: het nuc en 16S rRNA gen (Fig 3.1). Van de 912 DNA-stalen waren in totaal

6 stalen (0,7%) MSSA-positief en 147 (16,1%) MRSA-positief.

Figuur 3.1: Triplex PCR van de geselecteerde kolonies van de SA en MRSA-ID platen. In laan twee, drie en vier

zijn de verkegen amplicons te zien na triplex van PCR respectievelijk een MRSA stam, een MSSA stam en een

niet S. aureus stam. (L: 100 bp DNA ladder)

Aan de hand van het aflezen van de SA en MRSA-ID platen en de resultaten van de triplex

PCR, werd het aantal MSSA en MRSA kolonie vormende eenheden (kve) per gram of

vierkante centimeter vlees bepaald. In tabel 3.1 wordt het aantal vleesstalen weergegeven

die MSSA-positief (aantal per gram of vierkante centimeter) waren. In totaal was 4% van de

vleesstalen MSSA-positief. Van de 24 mignonettestalen, 24 ribbetjes en 18 gehaktstalen was

telkens één staal MSSA-positief. Er werden naar schatting respectievelijk 100 kve/g,

606 kve/cm² en 142 kve/g teruggevonden. Deze stalen waren allen aangekocht bij slagerij C.

III. RESULTATEN

17

Ten slotte bevatten twee oren, gekocht bij grootwarenhuis A, naar schatting 557 en 34

MSSA kve/cm².

Tabel 3.1: Aantal MSSA kolonie vormende eenheden per gram (mignonette spek en gehakt) of vierkante

centimeter (ribbetjes, poten en oren) rechtstreeks teruggevonden op de verschillende vleesstalen.

(SA +: positief voor S. aureus)

MSSA + MSSA/g

MSSA/cm²

Mignonette [1/24] 100

Spek [0/24] -

Gehakt [1/18] 142

Ribbetjes [1/24] 606

Poten [0/24] -

Oren [2/23] 557

34

In tabel 3.2 wordt het aantal MRSA-positieve vleesstalen weergegeven per grootwarenhuis/

slagerij na rechtstreeks uitplaten van de stalen. Daarnaast wordt de schatting van het aantal

MRSA kolonies per gram of vierkante centimeter getoond. Er werd bij 13 stalen (9%)

rechtstreeks MRSA gevonden. De aantallen waren maximum 1000 kve/g en 8002 kve/cm².

III. RESULTATEN

18

Tabel 3.2. Aantal MRSA per gram (mignonette, spek en gehakt) of vierkante centimeter (ribbetjes, poten en oren) teruggevonden op de verschillende vleesstalen van elk

grootwarenhuis/slagerij. Zes keer werden verschillende vleessoorten aangekocht bij vier verschillende zaken. (NA: niet aanwezig in slagerij, NB: kon niet bepaald worden,

MRSA +: aantal positieve stalen voor MRSA.)

Grootwarenhuis A Grootwarenhuis B Slager C Slager D

MRSA + MRSA/g MRSA + MRSA/g MRSA + MRSA/g MRSA + MRSA/g

MRSA/cm² MRSA/cm² MRSA/cm² MRSA/cm²

Mignonette [0/6] -

[0/6] -

[1/6] 100

[2/6] 110

1000

Spek [0/6] - [0/6] - [0/6] - [1/6] 20

Gehakt NA - [0/6] - [1/6] 140 [0/6] -

Ribbetjes [0/6] - [0/6] - [1/6] 93 [0/6] -

Poten [0/6] - [1/6] 6 [1/6] 7374 [1/6] 8002

Oren 0/6] -

[2/6]

NB [1/5] 136 [1/6] 541

59

III. RESULTATEN

19

3.1.2 Isolaties na aanrijking

Na aflezen van de MRSA-ID platen van de aangerijkte verdunningsreeksen werd bij

90 vleesstalen (65,7%) MRSA teruggevonden. Van elke vleessoort werd een tabel gemaakt,

waarin per grootwarenhuis/slagerij en per week het minimum aantal MRSA kolonies na

aanrijking wordt weergegeven (tabel 3.3 tot 3.8).

Tabel 3.3: Het aantal MRSA na aanrijking van één gram mignonette, weergegeven per slagerij/week van

staalname.

MRSA/g per tijdstip

Mignonette (n=24) week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week 6

Grootwarenhuis A - >10 >10 - - -

Grootwarenhuis B >10000 >10 >10 - - -

Slagerij C - - >10 - >10 >10

Slagerij D >100000 - - - >10 -

Tabel 3.4: Het aantal MRSA na aanrijking van één gram spek, weergegeven per slagerij/week van staalname.

MRSA/g per tijdstip

Spek (n=24) week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week 6

Grootwarenhuis A - >10 >10 >10 - >10

Grootwarenhuis B - - >10 - - -

Slagerij C - - >1000 >10 - -

Slagerij D >100 - - - >1000000 -

Tabel 3.5: Het aantal MRSA na aanrijking van één gram gehakt, weergegeven per slagerij/week van

staalname. (In grootwarenhuis A was er geen varkensgehakt verkrijgbaar).

MRSA/g per tijdstip

Gehakt (n=18) week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week 6

Grootwarenhuis B >10 >10 - >10 >10 -

Slagerij C - - >10 >10 >10 >10

Slagerij D >1000000 - - - >10 -

Tabel 3.6: Het aantal MRSA na aanrijking aanwezig per vierkante centimeter op ribbetjes, weergegeven per

slagerij/week van staalname.

MRSA/cm² per tijdstip

Ribbetjes (n=24) week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week 6

Grootwarenhuis A >11 >11 - >167960 >10 >8

Grootwarenhuis B - - >86 >20 - -

Slagerij C >107 >12 >13 >90 >10 >9

Slagerij D >1000 >14 >16 >13 >8 >7

III. RESULTATEN

20

Tabel 3.7: Het aantal MRSA na aanrijking aanwezig per vierkante centimeter op poten, weergegeven per

slagerij/week van staalname.

MRSA/cm² per tijdstip

Poten (n=22) week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week 6

Grootwarenhuis A >7 >7438 >7 >783 - >8

Grootwarenhuis B >9 >7 >7 >6 >8 >6

Slagerij C >8 >83 >838 >8 >8 >8

Slagerij D >889200 >87 >10 >9 - >9

Tabel 3.8: Het aantal MRSA na aanrijking aanwezig per vierkante centimeter op oren, weergegeven per

slagerij/week van staalname. NA: niet aanwezig.

MRSA/g per tijdstip

Oren (n=21) week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week 6

Grootwarenhuis A >5 >5 - >631400 >4 >6

Grootwarenhuis B >6 >6 >567 >592600 >811 >8

Slagerij C >435 >4 >540 >4 >48 NA

Slagerij D >587800 >36 >37560 >5 >4 >46

3.1.3 Overzicht van de MRSA positieve stalen

In totaal werd er rechtstreeks en na aanrijking bij 104 vleesstalen (76%) MRSA gevonden

(tabel 3.9). Alle stalen van oren waren MRSA positief. Daarnaast werd er bij 83%, 86% en

72% van de stalen van ribbetjes, poten en gehakt MRSA geïsoleerd. In mindere mate werd er

MRSA gevonden bij mignonette- en spekstalen (54% en 58%).

Tabel 3.9: Aantal en percentage van de MRSA-positieve (rechtsreeks en/of na aanrijking) vleesstalen.

(n= totaal aantal stalen).

n

Aantal rechtstreeks

MRSA positief (%)

Aantal MRSA positief

na aanrijking (%)

Aantal MRSA-positief

(%)

Mignonette 24 3 (12) 10 (42) 13 (54)

Spek 24 10(4) 13 (54) 14 (58)

Gehakt 18 1 (6) 12 (67) 13 (72)

Ribbetjes 24 1 (4) 19 (79) 20 (83)

Poten 24 3 (12) 18 (75) 21(86)

Oren 23 4 (17) 19 83) 23 (100)

Totaal 137 13 (9) 91 (66) 104 (76)

III. RESULTATEN

21

3.2 MRSA ST398 specifieke PCR Alle MRSA en MSSA stammen (n=153) werden onderworpen aan een MRSA ST398 specifieke

PCR. Hierbij werden er primers gebruikt die een 500 bp lang fragment van het mecA gen en

een 296 bp lang fragment van de sau1hsd1 sequentie amplificeren. Na gelelektroforese

vertonen MRSA ST398 stammen twee bandjes op de agarosegel: beide fragmenten werden

geamplificeerd. Bij MSSA ST398 stammen werd slechts de sau1hsd1 sequentie

geamplificeerd en deze stammen vertoonden bijgevolg het 296 bp op gel. Bij MRSA

(niet ST398) stammen amplificeerde uitsluitend het mecA gen en bij MSSA (niet ST398)

gebeurde geen amplificatie (Fig. 3.2). Van de 147 MRSA isolaten behoorden 143 (97,2%) tot

ST398. De MSSA-isolaten waren ST398-negatief.

Figuur 3.2: MRSA ST398 specifieke PCR. Bij een MRSA ST398 positieve stam werden twee fragmenten

geamplificeerd: mecup (500 bp) en CC398 (296 bp). Bij een MRSA (niet ST398) uitsluitend het mecup gen.

Alleen het CC398 gen werd geamplificeerd bij een MSSA ST398 stam en er gebeurde geen amplificatie bij een

MSSA (niet ST398) stam. (L: 100 bp DNA ladder)

III. RESULTATEN

22

3.3 Moleculaire typering van de stammen

3.3.1 Spa typering

Na selectie werd er van 28 stalen [4 MSSA, 23 MRSA ST398 en 1 MRSA (niet ST398) isolaten]

het spa type bepaald. Er werden zes verschillende spa types teruggevonden: t011, t008,

t034, t2370, t091 en t127 (tabel 3.10). Het type t011 was het meest voorkomende (71%),

met daaropvolgend t008 (11%) en t034 (7%). Spa type t011 kwam voor bij isolaten afkomstig

van alle vleessoorten, aangekocht bij de beide grootwarenhuizen en beide slagers. Type t008

werd bij MSSA-isolaten gevonden, afkomstig van gehakt en oren (beide grootwarenhuizen

en slager C) en type t034 bij isolaten van gehakt en ribbetjes van beide slagers. Types t2370,

t091 en t127 kwamen slechts bij één isolaat voor (4%), geïsoleerd van poten (slager D),

ribbetjes (slager C) en gehakt (slager D).

Tabel 3.10: Aantal en percentage van de zes teruggevonden Spa types.

3.3.2 SCCmec typering

Om te bepalen welke SCCmec cassette de MRSA isolaten hebben, werd een SCCmec typering

uitgevoerd op de MSSA en MRSA isolaten. Deze typering hield drie PCR reacties in.

Vervolgens werden per isolaat de drie bekomen bandpatronen op agarosegel geanalyseerd

en vergeleken met acht controles. Deze controles waren stammen waarvan de SCCmec

cassettes gekend zijn. De meerderheid van de MRSA isolaten (76,2%) waren drager van

SCCmec cassette type V. Deze isolaten behoorden tot alle soorten vleesstalen, afkomstig van

de vier slagerijen. SCCmec type IVa werd teruggevonden bij 26 MRSA-isolaten (17,7%). Deze

isolaten werden geïsoleerd van alle vleessoorten van beide slagers en enkel van de poten en

oren van de twee grootwarenhuizen. Ten slotte werd SCCmec type IVc teruggevonden bij

één MRSA ST398 isolaat, afkomstig van ribbetjes van slagerij C.

3.3.3 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE)

Een selectie van stalen (n=44) onderging PFGE. Deze selectie bevatte onder andere de vijf

verkregen MSSA stammen. Tevens werd van elke slagerij een vleestype gekozen en werden

alle isolaten verkregen op dit vleestype op de verschillende tijdstippen aan de selectie

toegevoegd. Bij 40 van de 44 stalen werd een “fingerprint” bekomen. De verkregen

“fingerprints” werden in Bionumerics® verwerkt en vergeleken via de Dice coëfficiënt, op

Spa type n(%)

t011 20 (71%)

t008 3 (11%)

t034 2 (7%)

t2370 1 (4%)

t091 1 (4%)

t127 1 (4%)

III. RESULTATEN

23

basis van de aan of afwezigheid van een bandje. Vervolgens werd een clustering door middel

van UPGMA (“Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean”) uitgevoerd, waarbij

een dendrogram bekomen werd (Fig. 3.3). In totaal werden er 18 verschillende pulsotypes

teruggevonden. Tevens werden er verschillende dendrogrammen per

grootwarenhuis/slagerij gemaakt. Bij grootwarenhuis A werden er twee pulsotypes

gevonden en bij grootwarenhuis B zeven types. Op de vleesstalen van de slagers werden

9 en 6 types gevonden (Fig 3.4).

3.3.4 Multi-Locus Variable numer tandem repeat Analyse (MLVA)

Na MLVA typering, werd de gegeneerde data in Bionumerics® verwerkt. De verkregen

bandenpatronen werden omgezet in numerieke codes op basis van de VNTR loci: ClfA

(clumpingfactor A, zie 1.2), ClfB (clumpingfactor B, zie 1.2), SIRU21 (“staphylococcal

interspersed repeat unit” 21) en sdr (SD repeat). Vervolgens werden dendrogrammen

gegenereerd door categorische analyse. Het eerste dendrogram bevat de data van alle

isolaten (zie addendum A.1). Deze clustering vertoonde 153 profielen. In totaal waren er 26

isolaten niet typeerbaar door middel van MLVA. Vervolgens werd een dendrogram gemaakt

van alle MRSA ST398 isolaten (zie addendum A.1). Hierbij werden er 65 profielen gevonden,

waaronder 24 isolaten niet typeerbaar waren. Het dendrogram, verkregen na analyse van de

selectie van isolaten werd onderverdeeld in 21 clusters/profielen (Fig 3.5), waarbij twee

isolaten niet typeerbaar waren door middel van MLVA. Er waren 13 MRSA ST398 profielen,

5 MSSA profielen en 2 MRSA (niet ST398) profielen. Bij één MSSA isolaat kon het aantal

repeats van het sdrCDE gen niet bepaald worden.

III. RESULTATEN

24

Figuur 3.3: Dendrogram van de verkregen fingerprints na PFGE van een selectie van de stalen. Links bovenaan

staat een schaal waarop de similariteit in percentage terug te vinden is. Naast de “fingerprints” staat telkens

het stamnummer, de afkomst [grootwarenhuis(GW)/slager(SL)], vleessoort (M: mignonette, S: spek, G: gehakt,

R: ribbetjes, P: poten, O: oren), week van staalname (T1 tot en met T6), de gecombineerde resultaten van de

triplex en MRSA ST398 PCR, het SCCmec type en indien bepaald het spa type. (GW 1: GW A, GW 2: GW B, SL 1:

SL C, SL 2: SL D, SA: MSSA, NT ST398: niet ST398).

III. RESULTATEN

25

Figuur 3.4: Dendrogram per grootwarenhuis/slager van de verkregen fingerprints na PFGE van een selectie

van de stalen. Links bovenaan staat een schaal waarop de similariteit in percentage terug te vinden is. Naast de

“fingerprints” staat telkens de numerieke codes die overeenkomen met het aantal repeats van gen clfA, clfB,

sdrC, sdrE, SIRU, stamnummer, afkomst [grootwarenhuis(GW)/slager(SL)], vleessoort (M: mignonette, S: spek,

G: gehakt, R: ribbetjes, P: poten, O: oren), week van staalname (T1 tot en met T6), de gecombineerde

resultaten van de triplex en MRSA ST398 PCR, het SCCmec type en indien bepaald het spa type.

(A: grootwarenhuis A, B: grootwarenhuis B, C: slager C, D: slager D, SA:MSSA, NT: niet ST398).

III. RESULTATEN

26

Figuur 3.5: Dendrogram gebaseerd op MLVA typering. Links bovenaan staat een schaal waarop de similariteit

in percentage terug te vinden is. Daarnaast staat telkens de numerieke codes die overeenkomen met aantal

repeats van gen clfA, clfB, sdrC, sdrE, SIRU, stamnummer, herkomst [grootwarenhuis (GW)/slager (SL)],

vleessoort (M: mignonette, S: spek, G: gehakt, R: ribbetjes, P: poten, O: oren), week van staalname (T1 tot en

met T6), de gecombineerde resultaten van de triplex en MRSA ST398 PCR, het SCCmec type en indien bepaald

het spa type. (GW 1: GW A, GW 2: GW B, SL 1: SL C, SL 2: SL D, SA: MSSA, NT: niet ST398).

III. RESULTATEN

27

3.4 Antibiogrammen De geselecteerde isolaten (n=44) werden getest op resistentie tegen 16 verschillende

anitbiotica. Een aantal van deze antibiotica worden uitsluitend in de humane geneeskunde

gebruikt zoals chloramfenicol, fucidine, linezolid, mupirocine, quino/dalfopristine en

rifampicine. De overige antibiotica worden onder andere gebruikt in de diergeneeskunde,

waarvan het meeste sulfonamides/ trimethoprim (behoort tot de antibioticumklasse van

sulfonamides) en tetracyline. Tevens werden combinaties van drie antibiotica gebruikt, om

kruisresistentie aan te tonen (erythromycine, lincomycine en tylosine/ kanamycine,

gentamicine en tobramycine).

Alle isolaten waren gevoelig aan rifampicine, mupirocine, linezolid en sulfonamides.

De meerderheid (≥74%) van de isolaten waren gevoelig aan quinupristine/dalfopristine,

gentamicine, tobramycine, kanamycine, chloramfenicol, erythromycine, fucidine en tylosine.

Ongeveer de helft van de isolaten waren gevoelig aan ciprofloxacine en lincomycine (tabel

3.11). MRSA-isolaten 6845, 6948, 6984, 6989, 7059, 7166, 7492, 7553 en 7554 vertoonden

kruisresistentie aan erythromycine, lincomycine en tylosine. MRSA-isolaten 6848, 6849,

6854, 6990, 7322 en 7661 waren kruisresistent aan kanamycine, gentamicine en

tobramycine.

Tot slot was 68% van de MRSA isolaten resistent aan trimethoprim en 84% aan tetracycline

(tabel 3.11). Vier MSSA isolaten waren gevoelig voor alle antibiotica en één was resistent aan

tetracycline (tabel 3.12). De resistentiepercentages van MSSA, MRSA en MRSA ST398 tegen

de verschillende antibiotica werd uitgezet in staafdiagrammen (figuur 3.6 en 3.7).

Tabel 3.11: Percentages van de resistente, intermediair resistente en sensitieve isolaten weergegeven per

antibioticum.

Antibiotica Resistent Intermediair Sensitief

Quinupristine/dalfopristine 9% 2% 89%

Trimethoprim 68% 2% 30%

Gentamicine 16% - 84%

Tobramycine 16% - 74%

Kanamycine 16% 5% 79%

Erythromycine 23% - 77%

Ciprofloxacine 48% - 52%

Tetracycline 84% - 16%

Rifampicine - - 100%

Mupirocine - - 100%

Chloramfenicol 2% - 98%

Linezolid - - 100%

Fucidine 2% - 98%

Sulfonamides - - 100%

Lincomycine 41% 2% 57%

Tylosine 18% 2% 80%

III. RESULTATEN

28

Tenslotte werden de verschillende antibiotypes bepaald (tabel 3.12). Er werden 23

antibiotica resistentieprofielen gevonden: 2 bij MSSA, 18 bij MRSA ST398 en 3 antibiotypes

bij MRSA (niet ST398) isolaten. Eén antibiotype bij de MSSA isolaten vertoonde resistentie

aan tetracycline en één van de antibiotypes bij de MRSA (niet ST398) isolaten vertoonde

resistentie aan fucidine, een humaan geneesmiddel. Ten slotte wordt in tabel 3.13 de

aanwezigheid van elk antibiotype geanalyseerd per grootwarenhuis/slagerij. De selectie van

isolaten afkomstig van grootwarenhuis A behoorden tot slechts zes antibiotypes in

vergelijking met de isolaten afkomstig van grootwarenhuis B die tot 12 antibiotypes

behoorden. De isolaten van slagerij C en D behoorden respectievelijk tot 9 en 10

antibiotypes. Antibiotypes vier en vijf kwamen voor bij alle geselecteerde isolaten van beide

grootwarenhuizen en beide slagers en antibiotype drie kwam voor bij grootwarenhuis B en

beide slagers (tabel 3.13).

III. RESULTATEN

29

Figuur 3.6: Staafdiagram met de resultaten van de antibiogrammen van de isolaten. Het percentage van de resistente MSSA en/of MRSA isolaten per antibioticum

wordt weergegeven. (CLR: chloramfenicol, CIP: ciprofloxacine, ERYTR: erythromycine, FUCID: fucidine, GEN: gentamicine, KANAM: kanamycine, LINCO: lincomycine, LINEZ:

linezolid, MUPIR: mupirocine, SYN: quinupristine/daflopristine, RIFAM: rifampicine, SULFA: sulfonamides, TET: tetracyline, TOBRA: tobramycine, TRIME: trimethoprim,

TYLOS: tylosine).

III. RESULTATEN

30

Figuur 3.7: Staafdiagram met de resultaten van de antibiogrammen van de MRSA isolaten. Het percentage van de resistente MRSA en MRSA ST398 isolaten per

antibioticum wordt weergegeven. Daarnaast werd ook de resistentie weergegeven van alle MRSA isolaten. (CLR: chloramfenicol, CIP: ciprofloxacine, ERYTR:

erythromycine, FUCID: fucidine, GEN: gentamicine, KANAM: kanamycine, LINCO: lincomycine, LINEZ: linezolid, MUPIR: mupirocine, SYN: quinupristine/daflopristine, RIFAM:

rifampicine, SULFA: sulfonamides, TET: tetracyline, TOBRA: tobramycine, TRIME: trimethoprim, TYLOS: tylosine).

III. RESULTATEN

31

Tabel 3.12: Overzicht van de verkregen antibiotypes voor MSSA en MRSA (ST398/ niet ST398) isolaten. (R: resistent, S: sensitief, %: aantal positieve isolaten in percentage per antibiotype, CLR: chloramfenicol, CIP: ciprofloxacine, ERYTR: erythromycine, FUCID: fucidine, GEN: gentamicine, KANAM: kanamycine, LINCO: lincomycine, LINEZ: linezolid, MUPIR: mupirocine, SYN: quinupristine/daflopristine, RIFAM: rifampicine, SULFA: sulfonamides, TET: tetracyline, TOBRA: tobramycine, TRIME:

trimethoprim, TYLOS: tylosine).

CLR CIP ERYTR FUCID GEN KANAM LINCO LINEZ MUPIR SYN RIFAM SULFA TET TOBRA TRIME TYLOS % Antibiotype

MSSA (n=5) S S S S S S S S S S S S S S S S 80 1

S S S S S S S S S S S S R S S S 20 2

MRSA ST398 (n=36)

S S S S R R S S S S S S R R R S 17 3

S S S S S S S S S S S S R S R S 14 4

S R S S S S S S S S S S R S R S 11 5

S R R S S S R S S S S S R S R R 8 6

S R S S S S R S S S S S R S R S 8 7

S R S S S S S S S S S S R S S S 6 8

S S S S S S S S S S S S S S S S 6 9

S S R S S S R S S R S S R S R R 3 10

S S R S S S R S S S S S R S S S 3 11

S S S S S S R S S S S S R S R S 3 12

S R S S S S R S S R S S R S R S 3 13

S S S S S S S S S S S S R S S S 3 14

S S R S R S R S S S S S R R R R 3 15

S S R S S S R S S S S S R S R R 3 16

R R S S S S R S S R S S R S R S 3 17

S S S S S S R S S R S S R S S S 3 18

S S R S S S R S S S S S R S S R 3 19

S S S S S S R S S S S S R S S S 3 20

MRSA (niet ST398,

n=3)

S S R R S S R S S S S S S R R S 33 21

S S R S S R R S S S S S R R R R 33 22

S S S S S S S S S S S S S S S S 33 23

III. RESULTATEN

32

Tabel 3.13: Weergave van de aan- of afwezigheid van de verschillende antibiotypes per grootwarenhuis (GW) en slagerij (SL). (NA: geen MSSA of niet ST398 MRSA isolaten gedetecteerd op de vleeswaren afkomstig van het grootwarenhuis of slagerij, +: aanwezig, -: afwezig, %: percentage van de isolaten behorende tot dit type).

Antibiotype GW A GW B SL C SL D %

MSSA (n=5) 1 + NA - NA 80,00

2 + NA + NA 20,00

3 - + + + 16,22

4 + + + + 13,51

5 + + + + 10,81

6 + + - + 8,11

7 - + + - 8,11

8 + + - - 5,41

9 - + - + 5,41

MRSA ST398 (n=36) 10 - + - - 2,70

11 - + - - 2,70

12 - + - - 2,70

13 - + - - 2,70

14 - - + - 2,70

15 - - + - 2,70

16 - - - + 2,70

17 - - - + 2,70

18 - + - - 2,70

19 - - - + 2,70

20 - - + - 2,70

MRSA

(niet ST398, n=3)

21 NA NA - + 33,33

22 NA NA - + 33,33

23 NA NA + - 33,33

IV. DISCUSSIE EN CONCLUSIE

33

IV. Discussie en conclusie

Sinds 2004 is een nieuw type MRSA, namelijk MRSA ST398 gerapporteerd dat bij varkens en

andere voedselproducerende dieren (zoals kippen en koeien) voorkomt. Indien MRSA ST398

ook aanwezig zou zijn op het vlees van deze dieren, kan het via deze weg

Moleculaire karakterisering van methicilline resistente...

Documents

Transcript of Moleculaire karakterisering van methicilline resistente...