Kom verder. Saxion.

Medische Microbiologie

Studietaak 1: De prokaryote cel: H4 (Bacteria; archaebacteria niet)

Kom verder. Saxion.

Wat is medische microbiologie?KLASSIEK: • Patiënt arts lichamelijk onderzoek klinische diagnose• Monster-afname

– Juiste monster (bloed, urine, pus, faeces, liquor)– Juiste afname, labeling, transport/opslag

• Microscopisch onderzoek– gekleurd/ongekleurd (bijv. Gram-preparaat)

• Kweek en reinkweek– op voedingsbodems– in voedingsmedia– identificatie m.b.v. biochemische en/of serologische testen

• Gevoeligheid voor antibiotica– Diffusiemethoden, breekpunten/MIC

MOLECULAIR:• Serologische diagnostiek: meting specifieke

antistoffen• DNA-technologie

Kom verder. Saxion.

Prokaryoten

• Klein, < 2 µm• 1 circulair

chromosoom• Geen

kernmembraan• Geen histonen • Geen organellen• Ribosomen 70S • Peptidoglycaan-

celwand • Binaire deling

Eukaryoten

• Groter, 2-20 µm• Gepaarde

chromosomen• Kernmembraan • Histonen• Organellen• Ribosomen 80S (muv

mito: 70S)• Evt. polysacharide

celwand• Mitose

Kom verder. Saxion.

• Gemiddelde grootte: 0,2 –1,0 µm 2 - 8 µm

• Basisvormen: zie boek!

Kom verder. Saxion.

• Bijzondere vormen– Stervormige Stella– Rechthoekige Haloarcula

• Meeste bacteriesoorten zijn monomorf (één vorm)• Sommigen zijn pleomorf (meerdere vormen)

Figure 4.5

Geen leerstofGeen leerstof

Kom verder. Saxion.

• Paren: diplococci, diplobacilli

• Clusters: staphylococci

• Ketens: streptococci, streptobacilli

Rangschikkingen

Kom verder. Saxion.

• Celmembraan• Celwand• Flagellen/fimbriae/pili• Kernmateriaal• Endporen• Een of twee membranen• Slijmlaag/kapsel

Bouw van bacteriën

Figure 4.6a, b

Kom verder. Saxion.

• Voorkomt osmotische lysis• Is bij bacteriën gemaakt van peptidoglycaan

Celwand

Figure 4.6a, b

Kom verder. Saxion.

• Polymeer van een disacharide dat is opgebouwd uitN-acetylglucosamine (NAG) en N-acetylmuraminezuur (NAM)

• Verbonden door polypeptiden

Peptidoglycaan

Figure 4.13a

Kom verder. Saxion.

• Dikke peptidoglycaanlaag

• Teichoïnezuren• Mycolinezuur*)

• Geen LPS

G+ celwand G- celwand • Dunne

peptidoglycaanlaag• Geen

teichoïnezuren

• Buitenmembraan• LPS (endotoxine)

*): Bij zuurvaste cellen

Kom verder. Saxion.

• Teichoïnezuren:– Lipoteichoïnezuur verbindt met plasmamembraan– Wand-teichoïnezuur verbindt met peptidoglycaan

• Teichoïnezuren reguleren mogelijk de beweging van kationen

• Polysachariden zorgen voor antigene variatie

Gram-positieve celwanden

Figure 4.13b

Kom verder. Saxion.

• Lipopolysachariden (LPS), lipoproteïnen, fosfolipiden• Omsluit het periplasma• Beschermt tegen fagocyten, complement,

antibiotica• LPS:

– Polysacharide-deel: antigeen; bv. onderscheiding van E. coli O157:H7

– Lipo-deel: lipide A, is een endotoxine

• Porines (eiwitten) vormen kanalen door de membraan

Gram-negatieve buitenmembraan

Kom verder. Saxion.

Differentiatiekleuringen

• Onderscheid in bacteriën maken op basis van kleuring (microscoop)

• Gram-kleuring en Ziehl-Neelsen-kleuring (zuurvaste kleuring)

Deze komen uit HOOFDSTUK 3!! (laatste paar pagina’s)

Deze komen uit HOOFDSTUK 3!! (laatste paar pagina’s)

Kom verder. Saxion.

• Er vormen zich kristalviolet-jodium (KV-I) kristallen in het cytoplasma

• Gram-positieve cel:– Alcohol dehydrateert het peptidoglycaan– KV-I kristallen blijven in de cel

• Gram-negatieve cel:– Alcohol lost buitenmembraan op en maakt gaten

in peptidoglycaan– KV-I wordt weggespoeld

Mechanisme Gramkleuring

Kom verder. Saxion.

Gram Stain

Color of Gram +

cells

Color ofGram –

cells

Primary stain:Crystal violet

Purple Purple

Mordant:Iodine

Purple Purple

Decolorizing agent:Alcohol-acetone

Purple Colorless

Counterstain:Safranin

Purple Red

Kom verder. Saxion.

• Cellen met mycolinezuur in hun celwand houden kleuring vast bij behandeling met zure alcohol: zuurvaste cellen– Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Nocardia, sommige

Corynebacteriën

• Niet-zuurvaste cellen verliezen de kleuring als ze gespoeld worden met zure alcohol en worden meestal tegengekleurd– Geassocieerde flora, ont-

stekingscellen

Zuurvaste kleuring (Ziehl-Neelsen)

Figure 3.11

Kom verder. Saxion.

• Negatieve kleuring bruikbaar voor kapsels

• Verhitting nodig om endosporen te kunnen kleuren

• Voor het kleuren van flagellen is een fixatief (mordant) nodig dat ze dik genoeg maakt om ze te kunnen zien

Speciale kleuringen

Figure 3.12a-c

Kom verder. Saxion.

Medische Microbiologie

Studietaak 1: De groei en het kweken van micro-organismen

H6

Kom verder. Saxion.

Microbiële groei

• Groei: toename aantal cellen (niet celgrootte!)• Benodigdheden/belangrijk:

– Minimum, optimum, maximum kweektemperatuur– pH tussen 6,5 en 7,5 (m.u.v. alkalofiel, acidofiel)– Water (in lab: demiwater / milliQ)– Osmotische druk (m.n. bij halofiel, facultatief halofiel)– Koolstof, stikstof, zwavel, fosfor, spoorelementen,

groeifactoren

Kom verder. Saxion.

THE REQUIREMENTS FOR GROWTH

PHYSICAL REQUIREMENTS

Kom verder. Saxion.

TEMPERATURE

Kom verder. Saxion.

• Psychrotrofen:– Groeien tussen 0°C en 20-30°C– Veroorzaken voedselbederf

• Mesofielen:– Optimum groeitemperatuur 25-40°C– Meest voorkomende type, waaronder de meeste

pathogene - en voedselbedervende m.o.– Micro-organismen die zich hebben aangepast aan

het leven in een dierlijke gastheer: optimum temperatuur dichtbij die van gastheer

– Veel pathogene bacteriën: optimum temperatuur 37°C

Kom verder. Saxion.

• Hyperthermofielen:– Optimum temperatuur boven de 80°C– Archaea– Hete bronnen rond vulkanische activiteit– Meestal zwavel nodig voor metabolisme– Interessant voor de biotechnologie, als bron van

hittebestendige enzymen

Pyrococcus furiosus

Geen leerstofGeen leerstof

Kom verder. Saxion.

pH

Kom verder. Saxion.

• De meeste bacteriën groeien bij neutrale pH (6,5-7,5)• Fungi groeien bij zure pH (5-6)• Acidofiele bacteriën groeien in zure milieus• Kweken van bacteriën in het lab: uitscheiding van

zuren (anaeroob katabolisme!) die de groei uiteindelijk gaan remmen medium bufferen; mogelijke buffers:– In veel media zit pepton of aminozuren (als N-bron en als az-

bron); deze bufferen– In veel media zitten fosfaat-zouten (als P-bron); deze bufferen,

met name in het neutrale pH-gebied

Kom verder. Saxion.

OSMOTIC PRESSURE

Kom verder. Saxion.

• Hypertone omgeving: plasmolyse– Conservering voeding via extra suiker of zout– Max. % agar in vaste media (anders te grote osmotische

druk)

• Hypotone omgeving (bv. demiwater): water de cel in, maar celwand behoedt cel meestal tegen lysis

Figure 6.4

Kom verder. Saxion.

Extremofielen• Bij de extremofielen die we tot nu toe gezien hebben

(temperatuur, zout, zuur) gaat het vaak om Archaebacteriën (Archaea)

Geen leerstofGeen leerstof

Kom verder. Saxion.

THE REQUIREMENTS FOR GROWTH

CHEMICAL

REQUIREMENTS

Kom verder. Saxion.

• Als basis voor alle biomoleculen en als energiebron (covalente bindingen tussen C-atomen)

• Chemoheterotrofen gebruiken organische stoffen (biomoleculen) als C- en energiebron

• Autotrofen gebruiken CO2 als C-bron

CARBON (Koolstof)

Kom verder. Saxion.

• Stikstof: Nodig voor alle aminozuren, eiwitten– N-bron:

• Meeste bacteriën breken eiwitten af• Sommige bacteriën gebruiken NH4

+ of NO3

• Enkele bacteriën gebruiken N2 (stikstoffixatie)

• Zwavel: nodig voor bepaalde aminozuren, thiamine, biotine– S-bron:

• Meeste bacteriën breken eiwitten af• Sommige bacteriën gebruiken SO4

2 of H2S

• Fosfor: Nodig voor DNA, RNA, ATP en membranen– P-bron: fosfaat

• Spore-elementen: kleine hoeveelheden anorganische elementen, meestal enzym-cofactoren

NITROGEN, SULFUR, PHOSPHORUS, TRACE

ELEMENTS

Kom verder. Saxion.

OXYGEN

Kom verder. Saxion.

• Zuurstof is essentieel voor het leven op aarde, maar het is in feite een giftig gas

• Op de oer-aarde was er zeer weinig zuurstof en waarschijnlijk was er zelfs geen leven ontstaan als er (veel) zuurstof aanwezig was geweest

• Levensvormen met aerobe respiratie hebben zuurstof nodig voor hun katabolisme, waarbij zuurstof wordt omgezet in ……:– Reultaat: veel ATP en neutralisatie van een potentieel giftig

gas (win-win situatie! )

Kom verder. Saxion.

Naamgeving zuurstofbehoefte• Obligaat aeroben:

– Hebben zuurstof nodig om te leven (aerobe respiratie)– Zonder zuurstof gaan ze dood

• Facultatief anaeroben: – Gebruiken zuurstof, maar kunnen ook zonder (switchen tussen

aerobe respiratie (veel ATP) en fermentatie (weinig ATP))

• Obligaat anaeroben:– Gebruiken geen zuurstof en kunnen er meestal ook niet tegen– Meesten: alleen fermentatie (incl. glycolyse) ; bep. soorten in

staat tot anaerobe respiratie = respiratie met alternatieve elektronenacceptor

Kom verder. Saxion.

• Obligaat (strikt) aeroob:– Vrijwel alle dieren (op organisme-niveau!), de meeste

schimmels, verschillende bacteriën (bv. Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis)

• Strikt aerobe micro-organismen kennen geen fermentatie• Dieren zijn strikt aeroob omdat ze het op organisme-niveau niet

lang uithouden zonder zuurstof (te weinig ATP)

– Veel ‘oxidatieve stress’ = giftige effect zuurstof, dus goed verdedigingsmechamisme tegen zuurstof nodig (zie later)

Kom verder. Saxion.

• Facultatief anaeroben:– Hebben verdedigingsmechanisme tegen toxisch effect zuurstof– Groeien uiteraard beter met zuurstof dan zonder– Veel bacteriën (bv. Escherichia coli, Bacillus anthracis,

Salmonella, bep. Lactobacilli) en veel gisten en bv. ook dierlijke cellen

• Obligaat (strikt) anaeroben:– Zijn geen zuurstof gewend– Hebben daarom geen verdedigingsmechanisme tegen het

toxische effect van zuurstof– Voorbeelden obligaat anaeroben met fermentatie: bep.

Lactobacilli en andere darmflora-bacteriën, Clostridium botulinum, Clostridium tetani

– Voorbeelden obligaat anaeroben met alternatieve elektronenacceptor (= anaerobe respiratie): methaanproduceerders (‘methanogenen’) in moerassen, spijsverteringsstelsel van herkauwers, anaerobe rioolwaterzuivering

Kom verder. Saxion.

Giftige vormen van zuurstof• Superoxide vrije radicalen: O2

– In kleine hoeveelheden gevormd tijdens aerobe respiratie, maar ook bij obligaat anaeroben

– Zeer toxisch

– Alle organismen die groeien in aanwezigheid O2 maken deze vorm van zuurstof onschadelijk via:

Deze formule klopt niet, maar hij zit op deze manier in de ppt (gemaakt door de auteur) en ik kan deze niet aanpassen: zie boek voor correcte formule

Kom verder. Saxion.

•Peroxide anion: O22

• Bevindt zich in de H2O2 uit de SOD-reactie

• Giftig, dus: verder verwerkt via een van deze reacties (meestal katalase) :

De onderste formule klopt niet, maar hij zit op deze manier in de ppt (gemaakt door de auteur) en ik kan deze niet aanpassen: zie boek voor correcte formule

Kom verder. Saxion.

• Obligaat aeroben en facultatief anaeroben:

• SOD en katalase/peroxidase ontgiften

• Obligaat anaeroben:

• Geen ontgiftende enzymen

• Aerotolerante anaeroben:

• Wel SOD, geen katalase/peroxidase

• Gedeeltelijke ontgifting

• Microaerofielen:

• Waarschijnlijk geen ontgiftende enzymen, maar wel zuurstof nodig

• Zuurstof niet giftig bij lage concentraties

Kom verder. Saxion.

• Kies uit: Aerotolerante anaeroben, facultatief anaeroben, microaerofielen, obligaat aeroben, obligaat anaeroben

Kom verder. Saxion.

• Essentiële verbindingen– Biomoleculen die het organisme zelf niet kan

maken– Om welke biomoleculen het precies gaat, is

afhankelijk van de betreffende bacteriesoort: veel bacteriën kunnen alle of de meeste biomoleculen zelf maken

– Vitamines, aminozuren, purines, pyrimidines

ORGANIC GROWTH FACTORS

Kom verder. Saxion.

THE REQUIREMENTS FOR GROWTH

CULTURE

MEDIA

Kom verder. Saxion.

• Definities:– (Kweek)medium: Mengsel van voedingsstoffen voor groei

van micro-organisme(n)– Steriel: Geen levende m.o. aanwezig– Inoculum: Aan (kweek)medium toegevoegde m.o.– Enten: het toevoegen van het inoculum– Kweek of culture: M.o. in of op een (kweek)medium

• Meestal van te voren samengesteld door commerciële leveranciers: ‘just add water’ en steriliseren

Definities

Kom verder. Saxion.

• Complex polysacharide uit zeewier

• Gebruikt voor de bereiding van vaste media: voedingsbodems, schuine agars e.d.

• De meeste m.o. kunnen agar niet verteren

• Wordt vloeibaar bij 100°C• Wordt weer hard bij ~40°C

Agar

Kom verder. Saxion.

• Chemisch gedefinieerde media: – Exacte chemische samenstelling is bekend– Lastig te maken en langzame groei: alleen speciale toep.

• Complexe media

Soorten media

Kom verder. Saxion.

Complexe media

• Extracten, bv. van gist of vlees (vandaar dat nog vaak de term ‘bouillon’ wordt gebruikt; dateert uit de tijd van Pasteur) en

• Peptonen– Korte, wateroplosbare peptiden, onstaan uit zure hydrolyse

of enzymatische digestie van een eiwitbron (bv. soja, melk, ….)

– Meest gebruikt voor het kweken in het lab– Voornaamste ingrediënt zijn eiwitten: energiebron, C-bron,

N-bron, S-bron • Vitaminen en andere organische groeifactoren

meestal via vlees- of gist-extract (= daarnaast ook extra C- en N-bron)– Bij anaeroob kweken MOET ook een suiker (meestal

glucose) worden toegevoegd voor de energie!

Kom verder. Saxion.

Gedefinieerd vs. complex medium

Table 6.2 & 6.4

Kom verder. Saxion.

• Vloeibaar: – Reducerende media

• Bevatten stoffen (thioglycolaat of oxyrase) die een verbinding aangaan met O2

• Vlak van te voren verhitten om gebonden O2

te verdrijven

• Voedingsbodems: – Anaerobe vaten: zie volgende dia– Oxyrase/OxyPlate

• Enzym oxyrase zet O2 om in H2O

• Enzym in voedingsbodem: hele plaat wordt een anaerobe ‘kamer’: de OxyPlate

• Geen speciale apparatuur nodig

Anaeroob kweken

Kom verder. Saxion.

• Anaeroob vat– Zakje met

natriumbicarbonaat en natriumborohydride bevochtigen

– Er onstaat H2 en CO2

– Palladium combineert H2 met O2 ( H2O)

Figure 6.5

Kom verder. Saxion.

• Bij m.o.’s die niet op of in media groeien: speciale kweektechnieken nodig, zoals– Proefdieren– Celkweek

• Veel m.o.’s groeien slechts bij 5-15% CO2

Speciale kweekmethoden

Figure 6.6

Kom verder. Saxion.

• Selectieve media:– Gewenste bacteriën groeien wel, ongewenste niet; bv:

• Bismuthsulfietagar bij S. typhi• Briljantgroenagar bij Salmonella spp.• Eosinemethyleenblauwagar (EMB) bij E. coli

• Differentiële media:– Om kolonies van het aan te tonen m.o. te kunnen

onderscheiden van kolonies van andere m.o.; bv:• Bloedagar: hemolyse door S. pyogenes• EMB medium Enterobacter aerogenes en Escherichia coli

Selectieve en differentiële media

Figure 6.9b, c

De voorbeelden zijn nu nog geen leerstof (komt vanzelf later in module)

De voorbeelden zijn nu nog geen leerstof (komt vanzelf later in module)

Kom verder. Saxion.

Differentiële media

Figure 6.9a

Staphylococcus aureus op telluriet-glycine medium

Om onderscheid te kunnen maken tussen verschillende bacteriën in een mengsel, om zodoende specifieke bacteriën aan te kunnen tonen en te onderscheiden van andere

Kom verder. Saxion.

Verrijkingskweken

• In feite selectief medium, maar dan zodanig dat de groei van een bepaald m.o. zodanig wordt bevorderd dat detecteerbare hoeveelheden cellen ontstaan– Voorbeeld (toepassing): verrijking van fenol-

afbrekende m.o. in de bodem door te weken met fenol als enige C- en energiebron

Kom verder. Saxion.

Reinkweken• Een reinkweek bevat maar één soort of stam• Een kolonie is een populatie van cellen op een

voedingsbodem die afkomstig is van één cel of spore of van een groep van aan elkaar vastzittende cellen

• Een kolonie wordt vaak een kolonievormende eenheid (KVE) of colony-forming unit (CFU) genoemd

Kom verder. Saxion.

Methode om losliggende kolonies krijgen

Figure 6.10a, b

Kom verder. Saxion.

Meest gebruikte manieren:• Diepvries: -50°tot -95°C (meestal in aanwezigheid van

glycero als antivries!)• Lyofilisering (vriesdrogen): Bevroren (-54° tot -72°C) en

gedehydrateerd in een vacuüm

Het bewaren van bacteriekweken

Kom verder. Saxion.

THE GROWTH OF BACTERIAL CULTURES

Kom verder. Saxion.

• Bij bacteriën bijna altijd binaire deling– Synthese celmateriaal– Instulping celmembraan– Splitsing in twee cellen

• Groei: aantal bacteriën/bacteriemassa– Per volume-eenheid: #cellen/ml, droge stof/ml– Verdubbelingstijd: delingssnelheid (bijv. per uur),

toename massa– Generatietijd of verdubbelingstijd

Vermeerdering/groei van bacteriën

Kom verder. Saxion. Generatietijd

Figure 6.12b

Berekening aantal cellenPer generatie verdubbeling van het aantal cellen

Dus: Aantal cellen = N0 x 2aantal generaties

http://www.cellsalive.com/ecoli.htm

Website Tortora: Intetractive Tutorials H6: alle drie!

Kom verder. Saxion. Generatietijd

Zie appendix DG (generatietijd) = t(tijd, in minuten)/n(aantal generaties)

G = generatietijd = tijd die 1 celdeling duurt = t/nt = een bepaald tijdsinterval: aan het begin en aan het eind hiervan wordt het aantal cellen bepaaldAo = aantal cellen bij het begin van het tijdsintervalAt = aantal cellen aan het eind van het tijdsinterval

Celdeling: At = Ao x 2n

Oplossen voor n: logAt = logAo + log 2n = logAo + nlog2 nlog2 = logAt – logAo n = logAt - logAo            log2 n = logAt - logAo

           0,301

Kom verder. Saxion.

• Stel: 100 cellen groeien in 5 uur naar een totaal van 1.720.320 cellen:

Berekening aantal generaties en generatietijd

Aantal generaties n = log(1.720.320) – log(100) = 14,3 log2

Generatietijd G: 5 x 60 min. / n = 21 minuten/generatie

Kom verder. Saxion.

Figure 6.13

Groeicurve exponentiële groei

Kom verder. Saxion. Groeifasen

Figure 6.14http://wps.aw.com/bc_tfc_microplace_8/0,7590,665416-,00.html

Kom verder. Saxion.

• Directe methoden– Plate Count methode

seriële verdunningen van een sample, uitplaten, incuberen en tellen (platen met 25-250 KVE’s)

– Filtratiemethode (bij lage hoeveelheden bacteriën)

hoeveelheid filtreren door membraanfilter, filter op plaat incuberen

– Directe tellingbacteriemonster in telkamer beoordelen

– Meting optische dichtheidturbiditeit (vlg extinctie) evenredig met

bacterieconcentratie

• Indirect methoden– Metabole activiteit– Drooggewicht

Meting van bacteriegroei

Figure 6.15, top portion

Kom verder. Saxion.

• Kolonies tellen: Monster eerst ‘doorverdunnen’

Directe meting: Plate Counts

Figure 6.15, top portion

Kom verder. Saxion.

• Een aantal verdunningen uitplaten

• Waarom?

Plate Counts

Figure 6.16

Kom verder. Saxion.

• Na incubatie: tel aantal kolonies op platen met 25-250 kolonies (CFU/KVE)

Plate Counts

Figure 6.15

Kom verder. Saxion.

• Bij zeer kleine aantallen, m.n. in watermonsters

Filtration

Figure 6.17a, b

Kom verder. Saxion.

Direct Microscopic count

Figure 6.19

Kom verder. Saxion.

Direct Microscopic Count

Kom verder. Saxion.

Direct Microscopic Count

• Nadelen:– Beweeglijke bacteriën moeilijk te tellen– Dode cellen niet of nauwelijks te onderscheiden

van levende– Vrij hoge celdichtheden nodig om betrouwbaar te

kunnen tellen

• Voordeel:– Snel (geen incubatietijd)

Kom verder. Saxion.

• Troebeling/turbiditeit (= ‘Turbidity’)

Indirecte Methoden

Figure 620

Kom verder. Saxion.

Turbiditeit• Spectrofotometer• Absorptie (A) / extinctie (E) / optische

dichtheid (OD)– A / E / OD = -logT; T= transmissie

• Hoe hoger de OD, hoe meer cellen aanwezig• In logaritmische groeifase loopt OD tegen tijd

in ongeveer een rechte lijn• Wanneer bekend is hoeveel cellen/ml met een

bepaalde OD overeenkomen (1 keer uitzoeken en standaardcurve maken), kan men vanuit een gemeten OD het aantal cellen uitrekenen

• Gevoeligheid: werkt vanaf 107 cellen/ml; bij lagere aantallen geen troebeling; bij te hoge OD: verdunnen

Kom verder. Saxion.

Voorbeeld standaardcurve

• Bij Escherichia coli loopt deze curve over een groot gebied lineair als je de OD meet bij 600 nm;

• vuistregel: • 1 OD-eenheid bij 600

nm komt overeen met 8 x 108 cellen

Kom verder. Saxion.

THE END