Immobilisatie van redoxenzymen op elektrodeoppervlakken...

Immobilisatie van redoxenzymen op elektrodeoppervlakken met als toepassing de

detectie van waterstofperoxide

Hans Buschop Scriptie voorgelegd tot het behalen van de graad van licentiaat in de scheikunde

Academiejaar 2005-2006

Promotor: prof. dr. A. Adriaens Copromotor: dr. K. De Wael

FACULTEIT WETENSCHAPPEN

Vakgroep Analytische Chemie

Aan iedereen die op één of andere manier bijgedragen heeft tot dit werk:

Bedankt!

Inhoudstabel Inleiding 1 Hoofdstuk 1 Biochemie en Eiwitelektrochemie 3 1.1 Eiwitten 3 1.2 Enzymen 5 1.3 Eiwitelektrochemie 13 Hoofdstuk 2 Experimentele technieken 16 2.1 Cyclische voltammetrie 16 2.2 Ramanspectroscopie 25 Hoofdstuk 3 Experimentele opstelling 27 3.1 Drie-elektrodensysteem 27 3.1.1 De elektrochemische cel 27 3.1.2 Elektroden 29 3.2 Reagentia 32 3.2.1 Bufferoplossingen 32 3.2.2 Linkers 34 3.2.3 HCC en CCP 35 3.2.4 Doelmolecule 35 3.3 Meetapparatuur 35 Hoofdstuk 4 Elektrochemisch onderzoek naar een geschikte bufferoplossing 37 4.1 Voltammetrisch gedrag van een Tris bufferoplossing 37 4.1.1 Goud als werkelektrode 38 4.2.1 Glasachtig koolstof als werkelektrode 40 4.2 Voltammetrisch gedrag van een Mes bufferoplossing 42 4.2.1 Goud als werkelektrode 42 4.2.2 Glasachtig koolstof als werkelektrode 43 4.3 Voltammetrisch gedrag van een HEPES bufferoplossing 44 4.3.1 Goud als werkelektrode 45 4.3.2 Glasachtig koolstof als werkelektrode 46

4.4 Welke buffer verder gebruiken? 48 Hoofdstuk 5 Elektrochemisch gedrag van HCC 50 5.1 Elektrochemisch gedrag van HCC aan een glasachtig koolstofelektrode 50 5.2 Elektrochemisch gedrag van HCC aan een goudelektrode 52 5.2.1 4,4’-bipyridyl als linker 52 5.2.2 6-mercaptohexanol als linker 54 5.2.3 5-carboxy-1-pentaanthiol als linker 56 5.2.4 7-carboxy-1-heptaanthiol als linker 58 5.2.5 Overige linkers 59 Hoofdstuk 6 Elektrochemisch gedrag van CCP 61 6.1 Linkers 61 6.2 HCC als mediator voor CCP 63 Hoofdstuk 7 Detectie van waterstofperoxide aan een HCC/CCP gemodificeerde goudelektrode 67 7.1 4,4’-bipyridyl als linker 67 7.2 6-mercaptohexanol als linker 71 Samenvatting en besluit 75 Literatuurlijst 77

1

Inleiding

In 1792 publiceerde Luigi Galvani (1737-1798) zijn beroemde experimenten waarbij hij

stroom zette op de kikkerpoten van dode kikkers (zie figuur 1). Door deze stroom maakten de

kikkerpoten schokbewegingen. Dit experiment kan men beschouwen als het eerste

rudimentair ‘bioelektrochemisch’ experiment.

Figuur 1 Het labo van Luigi Galvani.

Het eerste van de bio-elektrochemische experimenten, zoals ze de dag van vandaag gekend

zijn, was de immobilisatie van paardenhart cytochroom c aan een elektrode. Dit experiment

werd onafhankelijk van elkaar en gelijktijdig uitgevoerd in 1977 door Hill [1] en door

Kuwana [2], respectievelijk aan een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode en een

indiumoxide elektrode. Sindsdien zijn verschillende eiwitten en enzymen geïmmobiliseerd

aan een elektrode om zo de kinetische parameters van deze eiwitten en enzymen te

bestuderen.

Meer recent wordt vooral onderzoek verricht naar de ontwikkeling van biosensoren en wordt

getracht om één enkel eiwit of enzym te immobiliseren om zo een beter beeld te krijgen van

de kinetiek van het eiwit of enzym [3,4].

2

In dit werk is het de bedoeling fundamenteel onderzoek te verrichten naar de immobilisatie

van redoxenzymen aan een elektrodeoppervlak. Als toepassing wordt in dit werk gebruik

gemaakt van een geïmmobiliseerd redoxenzym om waterstofperoxide te detecteren. Het

voordeel om waterstofperoxide te detecteren met behulp van een biosensor is de lage

concentraties waterstofperoxide die gemeten kunnen worden en de snelle detectie. Dit is

vooral van belang voor de klinische diagnose, de chemische en farmaceutische industrie en de

biologische en medische wetenschappen.

Eerst wordt gezocht naar een geschikte bufferoplossing waarin de elektrochemische

experimenten kunnen plaatsvinden. Deze bufferoplossing moet stabiel zijn en moet

elektrochemisch inert zijn in het potentiaalgebied waarin respons van de eiwitten en enzymen

verwacht wordt.

Na dit vooronderzoek wordt de afzetting van het eiwit paardenhart cytochroom c (HCC) en

het enzym Rhodobacter capsulatus cytochroom c peroxidase (CCP) bestudeerd. De gebruikte

elektroden worden al dan niet gemodificeerd met een linker om de immobilisatie van het eiwit

of enzym mogelijk te maken.

Tenslotte wordt waterstofperoxide gedetecteerd door gebruik te maken van het

geïmmobiliseerde CCP.

3

Hoofdstuk 1 Biochemie en eiwitelektrochemie

In dit hoofdstuk worden de biochemische aspecten van het in dit werk gebruikte eiwit

paardenhart cytochroom c (HCC) en het enzym Rhodobacter capsulatus cytochroom c

peroxidase (CCP) toegelicht. Tevens wordt een korte inleiding tot eiwitelektrochemie

gegeven.

1.1 Eiwitten [5,6]

Een eiwit of een proteïne is een biopolymeer dat bestaat uit één of meerdere ketens van

aminozuren verbonden door peptidebindingen. Deze verbindingen zijn essentieel voor

levende organismen. De functies die eiwitten uitvoeren zijn vaak van structurele of metabole

aard. Zo zorgen ze bijvoorbeeld voor de celstructuur (bv. collageen het hoofdbestanddeel van

pezen en ander bindweefsel). Tevens verzorgen ze vele levensfuncties, zoals transport van

voedingsstoffen, aanmaak van lichaamseigen stoffen en vertering. Dergelijke proteïnen die

reacties katalyseren worden enzymen genoemd (zie paragraaf 1.2).

Een eiwit vouwt zich op tot een unieke drie-dimensionale vorm die wordt bepaald door de

onderlinge aantrekking en afstoting van de samenstellende aminozuren. De vorm waarin een

proteïne zich onder normale omstandigheden vouwt noemt men de natieve conformatie van

het eiwit. In de structurele organisatie van eiwitten onderscheidt men 4 niveaus:

- primaire structuur: de aminozuursequentie, de keten wordt bij elkaar gehouden door

covalente bindingen. De lineaire, ééndimensionale structuur komt overeen met de

lineaire informatie in DNA die afgelezen en vertaald wordt door de cellulaire

machinerie voor de eiwitsynthese.

- secundaire structuur: het eiwit stabiliseert en vouwt lokaal op. De eerste structurele

elementen, zoals α-helix en β-plaat ontstaan. Deze structuurelementen worden vooral

gestabiliseerd door middel van waterstofbruggen.

- tertiaire structuur: het eiwit vouwt zich op tot zijn compacte, natuurlijke vorm.

Verdere stabilisatie treedt op door aantrekkingskrachten tussen de verschillende delen

4

van de eiwitketen, zoals hydrofobe interacties, ioneninteracties en disulfidebruggen.

Vooral niet-covalente interacties tussen de zijketens spelen een rol. Voor eiwitten die

uit één keten bestaan is dit de biologisch actieve vorm.

- quaternaire structuur: de vorm die voortkomt uit de associatie van meerdere

eiwitketens, die op zichzelf reeds een tertiaire structuur bezitten, ook het eiwitcomplex

genoemd.

Paardenhart cytochroom c (HCC)

Eén van de eiwitten die in dit onderzoek gebruikt wordt, is paardenhart cytochroom c (HCC).

Cytochromen zijn redox-actieve proteïnen die in alle organismen, behalve in enkele obligaat

anaeroben, voorkomen. Ze bevinden zich in het binnenste membraan of in de

intermembranaire ruimte van de mitochondriën en zijn wateroplosbare, mobiele

elektrondragers. Deze proteïnen binden haemgroepen waarin zich een ijzeratoom bevindt dat

kan variëren tussen de Fe2+ en de Fe3+ valentietoestand tijdens het elektrontransport. Onder de

term ‘haem’ wordt elk ijzerchelaat van een tetrapyrrool verstaan.

Figuur 1.1 Structuur van Paardenhart cytochroom c [7].

5

Paardenhart cytochroom c, waarvan de structuur getoond wordt in figuur 1.1, staat in voor de

elektronenoverdracht naar enzymen die reducties of oxidaties uitvoeren. Deze enzymen

moeten na de elektronenoverdracht terug gereduceerd worden.

1.2 Enzymen [5,6]

Een enzym is een eiwit dat een bepaalde reactie versnelt, ook katalysator genoemd. Het maakt

een biologische reactie in een cel mogelijk of versnelt deze reactie. Het enzym verandert

hierbij niet van samenstelling en wordt niet verbruikt. Het bindt zich tijdens de reactie met het

substraat, met vorming van een enzym-substraat-complex. Dit complex zorgt ervoor dat de

reactie en omzetting van het substraat doorgaan. Na de reactie valt het enzym-substraat-

complex uit elkaar tot product en enzym.

enzym + substraat → enzym-substraat-complex → enzym + product

De binding van het substraat met elk enzym gebeurt op een verschillende manier. Enzymen

worden na de reactie direct omgezet tot hun oorspronkelijke actieve toestand zodat het enzym

opnieuw substraat kan binden en de reactie opnieuw kan katalyseren. Het lichaam maakt

enzymen zelf aan.

De reactiesnelheid van een enzym is afhankelijk van de temperatuur, de zuurtegraad en de

concentratie van enzym en substraat:

- temperatuur: de ruimtelijke structuur van enzymen en eiwitten wijzigt met de

temperatuur. Zo zijn de meeste enzymen inactief bij lage temperatuur en wordt de

werking van het eiwit ook geblokkeerd door denaturatie. Ieder enzym heeft bij een

bepaalde temperatuur een optimale activiteit. Bij zoogdieren is deze temperatuur

meestal de lichaamstemperatuur.

- zuurtegraad: ieder enzym heeft ook een bepaalde pH-waarde waarbij de

enzymactiviteit een maximum bereikt.

6

Veel enzymen zijn efficiënter dan tot nu toe door de mens ontworpen katalysatoren. Daarom

worden enzymen dikwijls gebruikt in industriële processen, bijvoorbeeld in de

voedselbereiding. Zonder enzymen zouden stofwisselingsprocessen in de organismen zeer

traag verlopen.

Enzymen worden benoemd naar het proces dat zij katalyseren, gevolgd door de uitgang –ase:

- oxidoreductasen: katalyseren oxidatie- en reductiereacties. Hieronder vallen de

enzymen hydrogenase, oxidasen, peroxidasen, reductasen, transhydrogenasen en

hydroxylasen.

- transferasen: katalyseren groepsoverdrachtsreacties zoals methyl-, carboxyl-, acyl-,

glycosyl-, amino- of fosfaatgroepoverdracht. Hiertoe behoren onder andere

transfosfatasen (kinasen) en de transaminasen.

- hydrolasen: katalyseren hydrolyses. Enzymen uit deze groep zijn onder andere

peptidasen, esterasen, glycosidasen en fosfatasen.

- lyasen: katalyseren splitsing van C-C, C-O en C-N bindingen door middel van

eliminatiereacties. Enzymen uit deze groep zijn decarboxylasen en dehydratasen.

- isomerasen: katalyseren isomerisatiereacties. Hieronder vallen racemasen en

epimerasen.

- ligasen: katalyseren de koppeling van twee substraten waarbij een binding van een

koolstofatoom met een ander atoom gevormd wordt (meestal zuurstof, stikstof of

zwavel). Tot deze groep behoren onder andere synthetasen en carboxylasen.

Rhodobacter capsulatus cytochroom c peroxidase (CCP)

Cytochroom c peroxidasen komen voor in gist en bacteriën en beschermen het organisme

tegen toxische peroxiden. Het enzym dat in dit werk gebruikt wordt is het Rhodobacter

capsulatus cytochroom c peroxidase (CCP). Cytochroom c peroxidase van Rhodobacter

7

capsulatus is een bacterieel enzym gelegen in het periplasma. Dit enzym behoort tot de

oxidoreductasen en staat in voor de detoxificatie van het organisme door de reductie van

waterstofperoxide te katalyseren. Bacterieel CCP is een enzym dat twee haemgroepen bevat

waarin zich telkens één ijzeratoom bevindt. De reductie van waterstofperoxide gebeurt

volgens volgende reactie [8]:

2 Cyt c (Fe2+) + H2O2 + 2 H+ → 2 cyt c (Fe3+) + 2 H2O

Het cytochroom c (cyt c), aanwezig in de cellen, fungeert als initiële elektrondonor. CCP

komt niet voor in de reactievergelijking aangezien CCP als katalysator voor deze reactie

optreedt.

C

Q107

H74

M118

W97

M278

LP

HP

Ca2+

N

Figuur 1.2 Structuur van Rhodobacter capsulatus cytochroom c peroxidase [8].

Figuur 1.2 toont de driedimensionale structuur van het CCP enzym. Het waterstofperoxide

bindt aan de laagpotentiaal haemgroep (LP) en de elektronen voor de reductie komen binnen

via de hoogpotentiaal haemgroep (HP). De hoogpotentiaal haemgroep heeft een potentiaal

van +29 mV ten opzichte van de verzadigde kalomelelektrode (VKE), de laagpotentiaal

haemgroep varieert tussen -431 tot -500 mV ten opzichte van de VKE. In het midden van het

eiwit bevindt zich een calciumion. Dit calciumion is van belang voor de werking van het

enzym. Dit wordt verduidelijkt in figuur 1.3 [8].

8

Figuur 1.3 Schematische voorstelling van de werking van CCP [8].

Figuur 1.3 toont de ijzerionen van de haemgroepen en hun directe omringing. Het

overgeproduceerde enzym bevindt zich in zijn inactieve, geoxideerde vorm, namelijk 3 3( ) ( )LP HPFe Fe+ +− . Een elektrondonor (cytochroom c in levende organismen, elektrode in

elektrochemische toepassingen) brengt het enzym in zijn gemengde valentie vorm, namelijk 3 2( ) ( )LP HPFe Fe+ +− . Deze vorm is nog steeds inactief. Door tussenkomst van het calciumion, dat

zich in het CCP bevindt, ontstaat de door calcium geactiveerde gemengde valentievorm.

Hierbij wordt de binding tussen histidine 74 en het 3( )LPFe + -ion verbroken. Op deze lege plaats

kan het waterstofperoxide binden. Vervolgens wordt het gereduceerd waarbij elk ijzeratoom

een elektron overdraagt naar het waterstofperoxide. Door deze elektronenoverdracht komt het

enzym in de 4 3( ) ( )( )HP LPFe oxyferryl Fe+ +− toestand. Nu moet het enzym terug gereduceerd

worden naar de calcium geactiveerde gemengde valentievorm. Dit gebeurt in twee stappen

waarbij tijdens elke stap een elektron wordt overgedragen aan een ijzerion uit de haemgroep.

In dit onderzoek zorgt de elektrode voor de elektronenoverdracht [8].

Om denaturatie van het eiwit tegen te gaan wordt CCP gestockeerd bij -20 °C. Zoals reeds

vermeld is de activeit van een enzym pH afhankelijk. Figuur 1.4 toont de afhankelijkheid van

de activiteit van CCP in functie van de pH van de gebruikte bufferoplossing.

9

Figuur 1.4 De pH afhankelijkheid van de enzymactiviteit van CCP [9].

CCP toont een belvormige afhankelijkheid van de activiteit in functie van de pH en heeft een

pK1 van 6,1 en een pK2 van 7,9 met een maximale activiteit bij pH 7. Het is dus van belang

dat de elektrochemische metingen gebeuren bij pH 7 waarbij CCP een maximale activiteit

vertoont [9].

In tegenstelling tot HCC dat bij de firma Sigma-Aldrich werd aangekocht, werd CCP in het

Laboratorium voor Eiwitbiochemie en Eiwitengineering aan de UGent geproduceerd. Het is

bij de productie van CCP de bedoeling om dit enzym in zo groot mogelijke concentraties in

de groeicellen te krijgen. De cel die hiervoor gebruikt wordt, is Escherichia coli (E. coli). In

deze cel worden vectoren ingebracht die de cel aanzetten tot CCP-productie [10]. Het DNA

dat gekloneerd wordt in de vectoren bekomt men door PCR (polymerase chain reaction), een

techniek die als doel het amplificeren van DNA heeft.

Vaak bevatten monsters te kleine hoeveelheden DNA om direct mee te werken. Dankzij de

PCR-techniek kan het DNA in een monster vermenigvuldigd worden. Het PCR apparaat is

een heel nauwkeurig verwarmings- en koelapparaat met daarin de buisjes met het DNA-

monster en andere componenten die noodzakelijk zijn voor de reactie.

10

Deze componenten zijn:

- deoxynucleotiden (deoxyadeninetrifosfaat (dATP), deoxythyminetrifosfaat

(dTTP), deoxycytosinetrifosfaat (dCTP) en deoxyguaninetrifosfaat (dGTP)).

- korte, enkelstrengige DNA moleculen, de zogenaamde primers.

- het enzym Thermus aquaticus polymerase (Taq polymerase). Taq polymerase is

afkomstig van bacteriën die leven in de nabijheid van hete bronnen en in het bezit

zijn van enzymen die bij zeer hoge temperaturen werkzaam zijn.

- templaat DNA: genomisch DNA of plasmide DNA.

- buffer.

Het proces, voorgesteld in figuur 1.5 begint met het verwarmen van het monster tot een

temperatuur van circa 90-95ºC, waardoor het dubbelstrengig DNA zich splitst in twee enkele

strengen. De oorzaak hiervan is dat de waterstofbruggen die de complementaire strengen "bij

elkaar houden" veel zwakker zijn dan de covalente bindingen tussen de nucleotides binnen

een keten. Het verhitten verbreekt de waterstofbinding waardoor de dubbele streng uit elkaar

gaat terwijl de covalente (keten)bindingen onaangetast blijven. Vervolgens wordt de

temperatuur iets verlaagd, wat de DNA-primers in staat stelt zich aan de gescheiden ketens te

binden. De primers binden zich omdat ze complementair zijn aan bepaalde (specifieke)

sequenties van elke streng die naast het DNA-stuk ligt dat moet worden geamplificeerd.

Zodra de primer zich gehecht heeft, gaat het Taq polymerase het DNA verlengen waarbij de

losse nucleotides gebruikt worden. Het uiteindelijke resultaat is een complementaire keten op

elke oorspronkelijke keten. In deze eerste cyclus is het oorspronkelijk aanwezige DNA

verdubbeld. In de volgende cyclus wordt opnieuw verhit en afgekoeld waardoor de nieuwe

dubbele strengen gescheiden worden en elk afzonderlijk gekopiëerd door het Taq polymerase.

In elke stap, cyclus, wordt het aantal strengen van het gewenste stuk DNA verdubbeld. Na

ongeveer 30 cycli (wat enkele uren duurt), zijn er genoeg DNA kopieën voor verder

onderzoek aanwezig [6].

11

Figuur 1.5 Het principe van PCR [11].

De productie van CCP kan in anaerobe of aerobe condities gebeuren. Voor de productie onder

anaerobe condities wordt gebruik gemaakt van cytochroom c maturatiegenen (ccm) in het

genoom. Deze zorgen voor de aanhechting van de haemgroepen. Het nadeel is een lage

celopbrengst. Een voordeel is dan weer de hoge CCP productie. Men kan CCP ook

produceren onder aerobe condities, maar hier moeten wel de ccm genen gecoëxpresseerd

worden. Hier heeft men een zeer grote celproductie maar de CCP productie ligt lager. In dit

werk wordt gebruik gemaakt van CCP dat geproduceerd werd onder anaerobe condities [10].

12

Vervolgens moet het CCP uit de cel geëxtraheerd worden. Het voordeel van CCP is dat het

een periplasmatisch eiwit is (zie figuur 1.6). Dit wil zeggen dat het enzym zich in het

periplasma van de cel bevindt. Dit is een voordeel omdat het de latere opzuivering

vereenvoudigt aangezien 90% van de eiwitten zich in het cytoplasma bevinden en maar 10%

in het periplasma. Het enzym kan bekomen worden door het buitenste membraan te breken.

Dit kan gebeuren door osmotische shock of door een lysozymebehandeling. Bij osmotische

shock gaat men een hoge concentratie zout toevoegen en nadien water zodanig dat het

buitenste membraan openbreekt. Bij een lysozymebehandeling wordt lysozyme toegevoegd

dat inwerkt op het buitenste membraan zodat het openbreekt [10].

Figuur 1.6 Een schematische voorstelling van de gebruikte cel waarbij CCP zich in het periplasma van de cel

bevindt.

De laatste stap is het opzuiveren van het enzym. Dit gebeurt door standaard

chromatografische technieken en dit onder niet denaturerende omstandigheden (dus geen

HPLC). Dit om ervoor te zorgen dat het enzym zijn opvouwing behoudt. De

chromatografische technieken die vooral gebruikt worden, zijn

ionenuitwisselingschromatografie, gelfiltratie en hydrofobe interactie [10]. Het CCP heeft een

rode kleur. Dit maakt de opzuivering eenvoudiger omdat de andere eiwitten meestal kleurloos

zijn. De fractie met een rode kleur bevat CCP. Indien de kleur van het enzym tijdens de latere

elektrochemische metingen zou veranderen dan weten we dat het CCP gedenatureerd is.

13

1.3 Eiwitelektrochemie

Dankzij het pionierswerk in de jaren 1970-1980 van Bowden E.F., Niki K., Hill H.A.O. en

later ook Armstrong F.A. en Canters G.W. zijn voltammetrische methoden routine geworden

in de bepaling van formele potentialen van redoxcentra in eiwitten [4,12-22]. Het is bekend

dat met behulp van geschikte elektroden bepaalde redoxcomponenten, waaronder

cytochromen, azurines en ferredoxines, een reversibel elektrochemisch gedrag vertonen zelfs

in afwezigheid van een mediator.

Spontane of elektrochemisch opgewekte adsorptie van eiwitten aan elektroden is de meest

recente ontwikkeling binnen de bio-elektrochemie. Het elektrisch contact tussen de

biokatalysator en de elektrode is van fundamenteel belang voor de ontwikkeling van

biosensoren en bio-elektronische koppelingen. Het is vanzelfsprekend dat het behoud van de

oorspronkelijke eigenschappen van de eiwitten centraal staat en dat geen denaturatie mag

optreden. Dit wordt ook wel ‘The art of persuasion’ genoemd.

De interacties tussen het eiwit en de elektrode kunnen zwak of sterk zijn; zwakke interacties

geven in ideale omstandigheden aanleiding tot diffusiegecontroleerde processen van de

eiwitspecies uit oplossing, terwijl bij sterke interacties de eiwitfilm zich gedraagt als een

monolaag. De koppeling tussen het eiwit en de elektrode kan van directe aard zijn of tot stand

komen door tussenkomst van een mediator. Deze mediator kan een eiwit zijn of een linker

waarmee we het elektrodeoppervlak modificeren. Een zeer efficiënte en gemakkelijke

modificatie is het vervaardigen van self-assembled monolayers (SAM) [21,23].

14

Au-oppervlak

S

HO

S

HO

S

HO

S

HO

S

HO

S

HO

S

HO

S

HO

enzyme enzyme

Au-oppervlak

S

HO

S

HO

S

HO

S

HO

S

HO

S

HO

S

HO

S

HO

enzyme enzyme

Figuur 1.7 Een schematische voorstelling van een self-assembled monolayer (SAM) met als linker 1,3-

mercaptopropanol.

Figuur 1.7 toont een SAM. Een SAM kan verkregen worden door het elektrodeoppervlak

gedurende een bepaalde tijd in een oplossing met linker te hangen. Voor een SAM, met als

elektrodemateriaal goud, zijn linkers met een eindstandige thiol groep uitermate geschikt.

Deze linkers kunnen namelijk spontaan een covalente goud-thiol binding vormen met het

elektrodeoppervlak. Door de interacties tussen de koolstofketens van de verschillende linkers

ontstaat een mooie geordende structuur op het elektrodeoppervlak wat er voor zorgt dat een

reproduceerbare monolaag gevormd wordt. De lengte van de koolstofketen kan men variëren

net als de eindgroep zodat men verschillende monolagen met variërende eigenschappen kan

vervaardigen. De lengte van de koolstofketen mag niet kleiner zijn dan drie koolstofatomen

omdat anders de interacties tussen de verschillende koolstofketens niet groot genoeg zijn om

een geordende monolaag te verkrijgen. De elektronenoverdracht tussen het redoxenzym en

het elektrodeoppervlak gebeurt via het tunneling effect [23].

De voltammetrische studie aan een eiwitgemodificeerde elektrode is een uitstekend middel

om oxidatie- en reductiereacties van redoxenzymes te bestuderen. De activiteit van het enzym

kan, bij aanleggen of variëren van een potentiaal, bepaald worden door meting van de met de

doelmolecule geassocieerde stroom. Een elektrochemische studie van het redoxproces kan

gedetailleerde informatie betreffende de reactiekinetiek opleveren.

15

Het toepassingsgebied van eiwitelektrochemie bevindt zich vooral in het ontwikkelen van

biosensoren [3]. Deze sensoren hebben een elektrokatalytische werking. Deze werking wordt

schematisch voorgesteld in figuur 1.8.

e-

Mred

Mox

Dox

Dred

elektrode mediator oplossing

e-

Figuur 1.8 Schematische voorstelling van een heterogeen elektrokatalytisch oxidatieproces (M staat voor

mediator en D voor doelmolecule).

Mox staat voor de geoxideerde vorm van de mediator die in het geval van een biosensor het

enzym is. Deze mediator gaat bij het aanleggen van een gepaste potentiaal naar de

gereduceerde toestand (Mred) door opname van een elektron afkomstig van de elektrode.

Wanneer de mediator in de gereduceerde toestand is kan deze een doelmolecule van de

geoxideerde (Dox) naar de gereduceerde (Dred) toestand brengen waarbij de mediator zelf terug

naar de geoxideerde vorm gaat. Hierna kan het proces opnieuw van voor af aan beginnen. Een

mediator is dus een molecule die de elektronenoverdracht tussen doelmolecule en elektrode

medieert [24].

16

Hoofdstuk 2 Experimentele technieken

2.1 Cyclische voltammetrie [24]

Bij cyclische voltammetrie wordt gebruik gemaakt van lineaire potentiaalvariatie [25-27]. De

overeenkomstige formule wordt getoond in vergelijking 2.1. Bij de eindpotentiaal wordt de

zin van de potentiaalvariatie omgekeerd. Deze potentiaal wordt de omkeerpotentiaal Er

genoemd. Het aangelegde excitatiesignaal wordt voorgesteld in figuur 2.1.

E = Ee + vt (2.1)

met Ee = beginpotentiaal in V, meestal zodanig gekozen dat aanvankelijk geen reactie

optreedt, v = snelheid van potentiaalvariatie of polarisatiesnelheid in Vs-1, t = tijd in s.

Figuur 2.1 Triangulaire potentiaalvariatie kenmerkend voor cyclische voltammetrie [24].

Het cyclisch voltammogram bekomen voor een reversibel systeem aan een stationaire

elektrodeconfiguratie met semi-oneindige lineaire diffusie wordt in figuur 2.2 schematisch

weergegeven. Stel dat een oplossing wordt beschouwd die enkel reductans bevat dan kan de

bekomen piekstroom verklaard worden als het gevolg van de competitie tussen twee effecten.

In eerste instantie zal bij een positievere potentiaal de oxidatiesnelheid van het reductans R

continu gaan toenemen met een stroomstijging tot gevolg. Terzelfdertijd treedt een verarming

op van bestanddeel R in de buurt van het elektrodeoppervlak, wat de stroomstijging afremt en

17

uiteindelijk de bovenhand zal nemen met een daling van de stroom tot gevolg. Na het

bereiken van de omkeerpotentiaal Er zal de oxidatie van R nog doorgaan, totdat een

voldoende negatieve potentiaal bereikt wordt om de reductie van het in de buurt van het

elektrodeoppervlak geaccumuleerde oxidans O te bewerkstelligen. Dit resulteert in een

toename van de kathodische stroom en verandering in polariteit van de totale stroom. De

verarming van bestanddeel O zal uiteindelijk zorgen voor het optreden van een kathodische

piek. Cyclische voltammetrie wordt vaak als eerste techniek in een onderzoek toegepast daar

het meestal een aantal kwalitatieve aspecten van het elektrodeproces onthult, waaronder de

afhankelijkheid van de concentratie, de polarisatiesnelheid,....

Figuur 2.2 Verband tussen de stroom I en de potentiaal E voor een reversibel systeem [24].

2.1.1 Reversibiliteit of irreversibiliteit van een reactie van een deeltje in oplossing

Voor een reversibele elektrochemische reactie geldt dat bij iedere potentiaal in het

voltammogram de potentiaalbetrekking van Nernst, voorgesteld in vergelijking 2.2, geldig is

[28].

0 0lnr

aRTE EnF a

⎛ ⎞= + ⎜ ⎟

⎝ ⎠ (2.2)

waarin E de potentiaal (V), E0 de standaardpotentiaal (V), n het aantal uitgewisselde

elektronen in de reactie, F de constante van Faraday (96485 C mol-1), T de temperatuur (K), R

de universele gasconstante (8,314 J K-1 mol-1), a0 de activiteit van het oxidans en ar de

activiteit van het reductans aan het elektrodeoppervlak is.

18

Dit houdt in dat de elektrontransfer voldoende snel moet verlopen, zodat bij elke aangelegde

potentiaal de concentratie van het oxidans en reductans aan het elektrodeoppervlak

overeenkomen met de verhouding uit de vergelijking van Nernst. Het massatransport, met

andere woorden de aanvoer van elektroactief bestanddeel naar het elektrodeopervlak, is voor

een reversibele reactie snelheidsbepalend bij alle potentialen of in ieder geval trager dan de

snelheid van de elektrontransfer. Het stroompotentiaalgedrag van een reversibel systeem werd

reeds voorgesteld in figuur 2.2.

Het verband tussen de piekstroom en de polarisatiesnelheid voor een reversibel systeem bij

298 K wordt weergegeven in vergelijking 2.3, volgens Sevcik-Randles [29,30]. Een lineair

verband tussen de piekstroom en de wortel van de polarisatiesnelheid is eigen aan de reactie

van een deeltje in oplossing. Voor de afleiding van deze vergelijking wordt verwezen naar de

literatuur [25,31]. 3 1 1

5 2 2 22,69.10 vp i iI n AD c= (2.3)

waarin Ip de piekstroom (A), n het aantal uitgewisselde elektronen in de reactie, A de

elektrodeoppervlakte (cm2), Di de diffusiecoëfficient van het elektroactief bestanddeel O of R

(cm2 s-1), ci de concentratie van het elektroactief bestanddeel O of R (mol cm-3) en v de

polarisatiesnelheid (V s-1) is.

Wanneer de snelheid van de elektrontransfer snelheidsbepalend wordt, zal de vergelijking van

Nernst niet meer geldig zijn en spreekt men van een irreversibele reactie. Voor een volledige

theoretische behandeling wordt verwezen naar meer gespecialiseerde literatuur [25,31]. Het

karakteristieke verloop van een volledig irreversibele oxidatiereactie (A → B) wordt

voorgesteld in figuur 2.3. De terugkerende piek, die bij een reversibele reactie zichtbaar is

(B → A), wordt niet meer geobserveerd. Enkel het oxidatieproces zal bijgevolg zichtbaar zijn

in de stroompotentiaalcurve.

19

Figuur 2.3 Verband tussen de stroom I en de potentiaal E voor een volledig irreversibel systeem [24].

Voor een irreversibele reactie bij 298 K wordt het verband tussen de piekstroom en de

polarisatiesnelheid weergegeven door vergelijking 2.4 [32].

1 1 1

5 2 2 22,99.10 ( ') vp i iI n n AD cα= (2.4)

waarin Ip de piekstroom (A), n het aantal uitgewisselde elektronen in de reactie, α de

transfercoëfficiënt, n’ het aantal elektronen uitgewisseld tot en met de snelheidsbepalende

stap, A de elektrodeoppervlakte (cm2), Di de diffusiecoëfficiënt van het elektroactief

bestanddeel O of R (cm2 s-1), ci de concentratie van het elektroactief bestanddeel O of R (mol

cm-3) en v de polarisatiesnelheid (V s-1) is.

Een quasi-reversibel systeem situeert zich tussen het reversibele en irreversibele en kan

slechts optreden in een bepaald polarisatiesnelheidsgebied. De stroom wordt zowel bepaald

door de reactiesnelheid van de elektrontransfer als door het massatransport. Voor een quasi-

reversibel systeem zijn de vergelijkingen ingewikkeld. Daar deze vergelijkingen niet relevant

zijn voor dit onderzoek wordt hiervoor verwezen naar de literatuur [25,27,31]. Het algemene

verband tussen piekstroom en polarisatiesnelheid voor de reacties van deeltjes uit oplossing

wordt schematisch voorgesteld in figuur 2.4.

20

Figuur 2.4 Schematische voorstelling van de overgang van een reversibel naar een irreversibel systeem bij

vergroten van de polarisatiesnelheid [24].

Hierin is duidelijk dat de polarisatiesnelheid een invloed kan hebben op het al dan niet

reversibel gedrag van een elektrochemische reactie. Het is bijgevolg mogelijk dat een

bepaalde elektrochemische reactie zich reversibel gedraagt bij een lagere polarisatiesnelheid,

terwijl bij hogere polarisatiesnelheden de reactie een quasi-reversibel of irreversibel gedrag

vertoont.

2.1.2 Reversibiliteit of irreversibiliteit van een reactie van een deeltje geadsorbeerd aan

de elektrode

Wanneer het reagens en/of het product van de elektrodereactie geadsorbeerd wordt aan het

elektrodeoppervlak, kan dit het voltammetrisch signaal beïnvloeden. Drie situaties kunnen

zich voordoen:

- de reactiesnelheid van de geadsorbeerde deeltjes is veel groter dan de

reactiesnelheid van de deeltjes in oplossing.

- zowel de reactie van de geadsorbeerde deeltjes als de reactie van de deeltjes in

oplossing moeten in rekening gebracht worden.

- de reactiesnelheid van de geadsorbeerde deeltjes is het kleinst en bijgevolg

snelheidsbepalend.

21

De interpretatie van de voltammogrammen is niet evident wanneer adsorptieprocessen

aanwezig zijn. Adsorptie is dan ook een fenomeen dat in het doorsnee elektrochemisch

onderzoek eerder dient vermeden te worden door bijvoorbeeld het solvent of de concentraties

te wijzigen. Toch is de adsorptie van een component aan het elektrodeoppervlak in sommige

situaties net wel gewenst om bijvoorbeeld, zoals in dit werk, tot een biosensor te komen.

Daarom wordt de theorie van deze adsorptieprocessen hier kort toegelicht. Er dient echter

opgemerkt dat de werkelijk opgenomen stroompotentiaalcurven afwijken van de theoretisch

beschreven situatie. Tevens wordt de theoretische behandeling complex wanneer het gaat om

de vorming van een multilaag in plaats van een monolaag: in het geval van een dunne film

zijn de eigenschappen analoog aan die van een monolaag. Factoren zoals inhomogeniteit van

de film, beperkte ladingstransfer door de film, structurele veranderingen in de multilaag

gedurende de oxidatie en/of reductie,... kunnen een rol spelen in het elektrochemisch gedrag

en zich uiten in een verandering van de opgenomen stroompotentiaalcurven.

Omwille van de hierboven beschreven complexiteit van adsorptieprocessen wordt voor een

volledige theoretische behandeling verwezen naar de literatuur [33-35]. Enkel het meest

eenvoudige en ideale geval wordt hier besproken, namelijk datgene waarbij enkel

geadsorbeerd oxidans O elektroactief is (O in oplossing is niet elektroactief) en reversibel

reageert. Er wordt in dit geval tevens aangenomen dat gevormd reductans R geadsorbeerd is

aan het oppervlak en dat geen laterale interacties optreden (Langmuir isotherm). Een

voorbeeld is de situatie waarbij, eens het adsorptie-evenwicht is ingesteld, de adsorptie zo

sterk is dat de geadsorbeerde laag O gevormd wordt zelfs waneer de concentratie in oplossing

zo klein is dat de stroombijdrage van opgelost O te verwaarlozen is. De stroompotentiaalcurve

horende bij deze situatie wordt in figuur 2.5 voorgesteld.

22

Figuur 2.5 Voorstelling van een cyclisch voltammogram voor een reversibel adsorptieproces met oxidatie en

reductie [25].

Een belangrijke karakteristiek van de vergelijkingen die het verband tussen de stroom en de

potentiaal beschrijven is de afwezigheid van transportparameters vermits de reagerende

bestanddelen O en R geïmmobiliseerd zijn op het elektrodeoppervlak. Vergelijking 2.5 geeft

het verband weer tussen de piekstroom en de polarisatiesnelheid.

2 2 *

0 v4p

n F AIRT

Γ= (2.5)

waarin Ip de piekstroom (A), n het aantal uitgewisselde elektronen in de reactie, F de

constante van Faraday (96485 C mol-1), R de universele gasconstante (8,314 J K-1 mol-1), T de

temperatuur (K), v de polarisatiesnelheid (V s-1), A de elektrodeoppervlakte (cm2) en *0Γ de

totale oppervlakconcentratie van de geadsorbeerde deeltjes (mol cm-2) is.

2 2 *0( / )

pin F RT vAΓ

2 2 *0( / )

in F RT vAΓ

23

Uit vergelijking 2.5 kan worden afgeleid dat de piekstroom in functie van de

polarisatiesnelheid een lineair verband vertoont, in tegenstelling tot de situatie voor een

deeltje in oplossing waarbij een lineair verband tussen de piekstroom en de wortel van de

polarisatiesnelheid waargenomen wordt (zie vergelijking 2.3).

Bij adsorptie-evenwicht is een welbepaalde hoeveelheid van reagens aanwezig op het

elektrodeoppervlak. Vandaar dat de stroom eerst zal toenemen, vervolgens een maximum

bereiken om uiteindelijk opnieuw de reststroomwaarde te bereiken. De lading die hierbij

verbruikt wordt is constant, vandaar dat bij verhogen van de polarisatiesnelheid de stroom op

een analoge manier moet toenemen om de lading constant te houden.

Het oppervlak onder de reductiegolf, na correctie voor een eventuele reststroom, komt

overeen met de lading Q nodig om de laag volledig te reduceren (Q = nF *0Γ ). De anodische

golf is het spiegelbeeld van de kathodische ten opzichte van de potentiaalas. Afwijkingen op

deze theoretische situatie komen frequent voor, wanneer bijvoorbeeld de ene component

sterker geadsorbeerd wordt dan de andere of wanneer laterale interacties tussen O en R in de

film opduiken. Een perfect symmetrische stroompotentiaalcurve, zoals voorgesteld in figuur

2.5, is dan ook een theoretisch gegeven en zal in de praktijk zelden voorkomen. Ondanks het

afwijkend gedrag van de stoompotentiaalcurve in de reële situaties, blijft het verband tussen

de piekstroom en de polarisatiesnelheid lineair.

Ook voor adsorptieprocessen kan een irreversibele situatie beschouwd worden, namelijk

diegene waarbij enkel geadsorbeerd O elektroactief is en gereduceerd wordt in een

irreversibele, éénstaps- en éénelektronreactie. De schematische voorstelling van de

stroompotentiaalcurve is weergegeven in figuur 2.6.

24

Figuur 2.6 Voorstelling van een irreversibel adsorptieproces [25].

Zoals figuur 2.6 aantoont treedt geen terugkeerpiek op en is de stroompotentiaalcurve

asymmetrisch. Een volledige theoretische behandeling is terug te vinden in gespecialiseerde

literatuur [25].

Het verband tussen de piekstroom en de polarisatiesnelheid voor een irreversibele situatie is,

analoog aan het reversibele gedrag, lineair en wordt in vergelijking 2.6 weergegeven.

2 *

0 v2,718.p

F AIRT

α Γ= (2.6)

waarin Ip de piekstroom (A), α de transfercoëfficiënt, F de constante van Faraday (96485 C

mol-1), A de elektrodeopervlakte (cm2), v de polarisatiesnelheid (V s-1), *0Γ de totale

oppervlakconcentratie van de geadsorbeerde deeltjes (mol cm-2), R de universele gasconstante

(8,314 J K-1 mol-1) en T de temperatuur (K) is.

2 *0( / )

iF RT Avα Γ

25

Voor de quasi-reversibele situatie is er wel een terugkeerpiek, maar beide pieken zijn sterk

asymmetrisch. Een meer gedetailleerde beschrijving is terug te vinden in de literatuur daar de

vergelijkingen horende bij deze situatie niet relevant zijn voor deze studie [36-38].

Nogmaals wordt benadrukt dat de hierboven beschreven situaties de meest ideale zijn. De

Langmuir isotherm die de basis vormt voor de afgeleide formules houdt echter geen rekening

met enerzijds laterale interacties en anderzijds het feit dat de verschillende sites van het

elektrodeoppervlak gekenmerkt worden door een verschillende vrije energie. Indien men één

van deze aspecten in rekening brengt, zullen andere vergelijkingen het

stroompotentiaalgedrag beschrijven. De basis voor de afgeleide formules zijn dan Frumkin en

Temkin isothermen. Hiervoor wordt verwezen naar de literatuur [25,35,39].

2.2 Ramanspectroscopie [24]

Het Ramaneffect kan opgevat worden als een inelastische verstrooiing van licht door materie

[40]. Een foton met een energie die onvoldoende is om een elektronische transitie te

bewerkstelligen, kan interageren met een molecule en verstrooid worden. De molecule gaat

hierbij over van een stationaire naar een virtuele toestand, die een distortie van de

elektronendistributie van een covalente binding inhoudt. Deze toestand is echter niet stabiel

en de molecule relaxeert naar een stationaire energietoestand. Deze relaxatie kan op drie

verschillende manieren gebeuren en wordt voorgesteld in figuur 2.7.

Figuur 2.7 Energieniveaus en voorstelling van ontstaan van Rayleigh (a), Stokes (b) en anti-Stokes (c)

verstrooiing [24].

26

Wanneer de molecule relaxeert en terugkeert naar de vibrationele grondtoestand, dan heeft het

verstrooide foton eenzelfde energie en golflengte als het initiërende foton. Dit is beter gekend

als Rayleigh verstrooiing (figuur 2.7a). Als de molecule relaxeert en terugvalt naar de eerste

geëxciteerde toestand (figuur 2.7b) zal het verstrooide foton minder energie bezitten en

bijgevolg een langere golflengte hebben dan het initiële foton. De vibratie-energie van de

molecule is toegenomen. Dit proces wordt Stokes (Raman) verstrooiing genoemd. Wanneer

de molecule zich bevindt in de eerste geëxciteerde toestand en een foton met energie E

absorbeert, dan wordt de molecule geëxciteerd naar een virtueel energieniveau met een iets

hogere energie dan in het geval van Rayleigh en Stokes verstrooiing. De molecule relaxeert en

kan terugkeren naar de vibrationele grondtoestand. Het verstrooide foton zal meer energie

bezitten dan het initiële foton en bijgevolg een kortere golflengte hebben. Dit fenomeen wordt

anti-Stokes Raman verstrooiing genoemd (figuur 2.7c).

De energie wordt in Ramanspectroscopie uitgedrukt als het Ramangolfgetal of Ramanshift, de

verschuiving ten opzichte van de Rayleigh verstrooiing (cm-1). Voor analytische doeleinden

wordt hoofdzakelijk Stokes verstrooiing gebruikt daar de Stokes Ramanintensiteit groter is

dan de anti-Stokes Ramanintensiteit. Het is namelijk zo dat de intentsiteit van het Stokes

Ramanverstrooid licht proportioneel is met het aantal moleculen in de initiële grondtoestand,

terwijl de intensiteit van het anti-Stokes Ramanverstrooid licht proportioneel is met het aantal

moleculen in de eerste aangeslagen vibratietoestand. Volgens Boltzmann is het zo dat het

aantal moleculen in een hogere vibratietoestand steeds kleiner is dan het aantal bij een lagere

vibratietoestand, vandaar dat het Stokes Ramanverstrooid licht gekenmerkt wordt door een

grotere intensiteit.

In realiteit is een Ramanspectrum meestal gesuperponeerd op een continuüm aan

fluorescentie. Wanneer fotonen met voldoende energie invallen op een molecule, kan deze

molecule overgaan naar geëxciteerde elektronische toestanden. De toestand heeft een beperkte

levensduur met een terugval naaar lager gelegen toestanden en uitzenden van licht (E = hv)

als gevolg. Dit proces wordt fluorescentie genoemd. Als de energie van het geëmitteerde

foton dezelfde waarde heeft als de energie van het geabsorbeerde foton, dan is er sprake van

resonantiefluorescentie.

Met Ramanspectroscopie kan informatie bekomen worden of het eiwit of enzym

geïmmobiliseerd is aan het elektrodeoppervlak of niet.

27

Hoofdstuk 3 Experimentele opstelling

In dit werk worden de elektrochemische reacties van eiwitten en enzymen bestudeerd. Door

de hoge kostprijs van deze bestanddelen is het ongepast gebruik te maken van een standaard

elektrochemische cel die 10 of 100 mL van een oplossing vereist. Om deze reden werd een cel

ontwikkeld die toelaat aan elektrochemie te doen in één druppel (20 µL). De configuratie van

de cel, het drie-elektrodensysteem, de gebruikte reagentia en de meetapparatuur komen in dit

hoofdstuk aan bod.

3.1 Drie-elektrodensysteem

Voor sommige elektrochemische metingen, zoals evenwichtspotentiaalbepaling en

potentiometrische experimenten, volstaan twee elektroden. Wanneer men de potentiaal doet

veranderen van zijn openklemwaarde dan zal, in het geval van een twee-elektrodensysteem,

de overpotentiaal zich verdelen over de twee elektroden. Het is echter voor elektrochemische

metingen belangrijk om de overpotentiaal aan de werkelektrode te kennen. Daarom wordt bij

metingen onder stroomdoorgang een drie-elektrodensysteem gehanteerd [41].

Bij een drie-elektrodensysteem wordt er tussen de werkelektrode en de tegenelektrode een

variabel potentiaalverschil aangelegd en de stroom die tussen deze twee elektroden vloeit,

wordt gemeten. Tussen de referentie- en de werkelektrode bevindt zich een hoogohmige

voltmeter waardoor de potentiaal van de werkelektrode ten opzichte van de referentie-

elektrode gemeten wordt in een circuit waardoor nagenoeg geen stroom vloeit. Hierdoor is de

gemeten potentiaal, op een constante na, deze van de werkelektrode. In dit werk wordt

gebruik gemaakt van een platinadraadje als tegenelektrode, een goudelektrode of glasachtig

koolstofelektrode als werkelektrode en een verzadigde kalomelelektrode als referentie-

elektrode.

3.1.1 De elektrochemische cel

Zoals reeds vermeld werd, wordt wegens de hoge kostprijs van het enzym gebruik gemaakt

van een celconfiguratie waarvoor maar één druppel van 20 µL als celoplossing vereist is.

Deze configuratie wordt getoond in figuur 3.1.

28

Figuur 3.1 Elektrochemische cel met aanduiding van de werkelektrode (1), referentie-elektrode (2),

tegenelektrode (3) en invoer (4).

De in dit werk gebruikte meetcel bestaat uit glas en is goed afsluibaar. Dit laatste is belangrijk

om in een zuurstofvrije omgeving te kunnen werken (zie later). In de bovenste opening

bevindt zich de referentie-elektrode (2), onderaan in een teflonbuis de werkelektrode (1), links

bevindt zich de tegenelektrode (3) en rechts bevindt zich het septum (4) langswaar met behulp

van een microliterspuit de eiwitten kunnen toegevoegd worden aan de druppel. Achteraan,

niet zichtbaar op figuur 3.1, bevindt zich nog een ingang voor de stikstoftoevoer. Met een

kraantje kan de stikstoftoevoer geregeld worden. Via het septum langswaar de reagentia

1

2

3 4

29

worden toegevoegd wordt de stikstofflow nagegaan via een druppelteller. Aangezien de

stikstof uit de fles zeer droog is wordt deze eerst door twee wasflessen (5) gestuurd. De

volledige opstelling wordt getoond in figuur 3.2. Om interferentiestromen van buitenaf te

weren staat de volledige opstelling in een Faraday-kooi. Alle metingen worden uitgevoerd bij

kamertemperatuur.

Figuur 3.2 De volledige proefopstelling.

3.1.2 Elektroden

-De referentie-elektrode

Een goede referentie-elektrode is van cruciaal belang voor elektrochemische metingen. De

referentie-elektrode wordt gekenmerkt door een vaste potentiaal die niet verandert gedurende

het experiment en zorgt voor het vervolledigen van het circuit voor de potentiaalmeting.

In dit werk wordt gebruik gemaakt van een verzadigde kalomelelektrode (Hg/Hg2Cl2,

verzadigd KCl). Deze elektrode heeft een referentiepotentiaal van 0,241 V versus de

standaard waterstofelektrode [41]. De elektrode bestaat uit een kwikmetaalfase, waarop een

55

30

pasta van het weinig oplosbare zout Hg2Cl2 (kalomel) gemengd met kwik zit, in contact met

een chloridebevattende oplossing (doorgaans waterig KCl). Deze elektrode is commercieel

verkrijgbaar bij verschillende firma’s. De in dit onderzoek gebruikte referentie-elektrode heeft

als referentie REF 401 en werd aangekocht bij het bedrijf Radiometer (Frankrijk).

Iedere gemeten en aangelegde potentiaal wordt weergegeven ten opzichte van deze

verzadigde kalomelelektrode. De elektrode wordt verder aangeduid als VKE

Figuur 3.3 De gehanteerde referentie-elektrode [42].

-De tegenelektrode

Tussen de tegenelektrode en de werkelektrode wordt de stroom gemeten. De stroom die in de

oplossing komt via de werkelektrode verlaat de oplossing via de tegenelektrode. De

tegenelektrode is een geleider. In dit werk werd gebruik gemaakt van een platinadraadje

ingesmolten in een plastiek tip.

31

-De werkelektrode

Als werkelektrode werd gebruik gemaakt van een goudelektrode en van een glasachtig

koolstofelektrode beide van BasInstruments (USA).

Figuur 3.4 Werkelektrode met CTFE omhulsel (1), metaal voor elektrische geleiding (2) en goud of glasachtig

koolstof (3) [43].

Figuur 3.4 toont de schematische voorstelling van de gebruikte werkelektroden. Deze

werkelektroden zijn opgebouwd uit een chloro-trifluorethyleen (CTFE) polymeer omhulsel

waarvan de lengte 7,5 cm is en de dikte 6 mm. In dit omhulsel is het elektrodemateriaal

(polykristallijn goud of glasachtig koolstof) ingebed. De diameter van de schijfelektrode is 1,6

mm voor de goudelektrode en 3,0 mm voor de glasachtig koolstofelektrode. Een metalen pin

is in het omhulsel geïncorporeerd om voor het elektrisch contact tussen de kabels van de

potentiostaat en het elektrodemateriaal te zorgen.

Om resten van vorige metingen te verwijderen en om een reproduceerbaar elektrodeoppervlak

te bekomen wordt de werkelektrode eerst voorbehandeld. De voorbehandeling bestond uit een

vijftal minuten polijsten op 1 en 0,05 µm Al2O3, dat werd aangebracht op verschillende

polijstdoeken. De resten Al2O3 werden verwijderd door spoelen met gedeïoniseerd water en

via ultrasone trillingen in een ultrasoonbad (Branson 3210) gedurende één minuut.

1

2

3

32

3.2 Reagentia

3.2.1 Bufferoplossingen

Hoe werkt een buffer? Een bufferoplossing omvat doorgaans een mengsel van een zwak zuur

HA en zijn geconjugeerde base A-. Wanneer hydroxide ionen worden toegevoegd treedt de

volgende reactie op met het zwakke zuur.

OH- + HA → A- + H2O (3.1)

Het netto resultaat is dat de hydroxide ionen worden vervangen door de geconjugeerde base

van het zwakke zuur. De stabiliteit van de pH onder deze omstandigheiden kan verklaard

worden door het evenwicht van de dissociatiereactie te onderzoeken.

[ ][ ][ ]a

H AKHA

+ −

= of na herschikken, [ ][ ][ ]aHAH KA

+−= (3.2)

Hieruit volgt dat de evenwichtsconcentratie van H+ en dus de pH bepaald wordt door de

verhouding [HA]/[A-]. Wanneer hydroxide ionen worden toegevoegd dan wordt het zwakke

zuur omgezet in zijn geconjugeerde base en daalt de verhouding [HA]/[A-]. Wanneer nu de

initieel aanwezige hoeveelheid zwak zuur en geconjugeerde base veel groter is dan de

hoeveelheid toegevoegde hydroxide ionen dan is de wijziging in de verhouding [HA]/[A-]

zeer klein. Dezelfde redenering kan nu ook gemaakt worden wanneer protonen toegevoegd

worden. Een andere nuttige en veel gebruikte formule in verband met buffers wordt bekomen

door het negatieve logaritme van vergelijking 3.2 te nemen:

[ ]log[ ] log( ) log[ ]aHAH KA

+−

⎛ ⎞− = − − ⎜ ⎟⎝ ⎠

of herschreven naar pH en rekening houdend met de tekens:

[ ] [ ]log log[ ] [ ]a a

A basepH pK pKHA zuur

−⎛ ⎞ ⎛ ⎞= + = +⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠⎝ ⎠

(3.3)

33

Deze formule wordt de Henderson-Hasselbalch vergelijking genoemd en is zeer nuttig om de

pH te berekenen van oplossingen waarvoor de verhouding [A-]/[HA] gekend is. Om een

goede buffer te bekomen bij een welbepaalde pH is het zeer belangrijk dat de pKa van de

gekozen bufferoplossing zo dicht mogelijk bij de gewenste pH ligt. Omdat hoe verder de

verhouding [A-]/[HA] van 1 ligt hoe slechter de buffercapaciteit en dus hoe slechter de

resistentie van de oplossing tegen wijzigingen van de pH wanneer protonen of hydroxide

ionen worden toegevoegd [44].

Tijdens het onderzoek naar een geschikte bufferoplossing voor de elektrochemische metingen

van dit werk werden drie buffers getest, namelijk tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris), 2-

morfolinoethaansulfonzuur (Mes) en N-cyclohexyl-2-aminoethaansulfonzuur (HEPES).

NH2

OH

HO OH

O N

S

O

O

O-

. H2O

N

N OH

S

OO

-O

Tris Mes

HEPES

NH2

OH

HO OH

O N

S

O

O

O-

. H2O

N

N OH

S

OO

-O

Tris Mes

HEPES Figuur 3.5 Structuur van Tris, Mes en HEPES.

De eerste buffer is tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris). Deze biochemische buffer heeft

een pKa waarde van 8,1 en een bruikbaar gebied van 7,0 tot 9,01. Tris is een buffer met zeer

hoge stabiliteit. Daarom is tris één van de meest gebruikte biochemische buffers bij pH 7. De

structuur van Tris wordt weergegeven in figuur 3.5.

De tweede buffer is 2-morfolinoethaansulfonzuur (Mes). Deze biochemische buffer vertoont

een veel mindere stabiliteit. Na enkele weken treedt schimmelvorming op in de

34

bufferoplossing en is de oplossing niet meer bruikbaar. De pKa van Mes bedraag 6,2. Mes

heeft een bruikbaar gebied van 5,5 tot 6,7. Het bruikbare gebied van Mes is lager dan 7 wat de

Mes bufferoplossing minder geschikt maakt om te bufferen voor CCP. De structuur van Mes

wordt getoond in figuur 3.5.

De derde en laatste buffer die in dit onderzoek gebruikt werd is een HEPES bufferoplossing.

Een HEPES bufferoplossing bevindt zich qua stabiliteit tussen de Tris bufferoplossing en de

Mes bufferoplossing en is ongeveer een maand stabiel. HEPES heeft een pKa van 7,5 en een

bruikbaar gebied van 6,8 tot 8,2. De structuur van HEPES wordt voorgesteld in figuur 3.5.

Alle bufferoplossingen werden aangekocht bij Sigma-Aldrich (USA) net als NaOH (99,998%

zuiver) dat gebruikt werd om de bufferoplossingen op pH 7 te brengen.

3.2.2 Linkers

Een linker wordt in dit werk gebruikt om het elektrodeoppervlak te modificeren zodat het

eiwit of enzym ten eerste gemakkelijker bindt en ten tweede omdat het eiwit of enzym minder

makkelijk zou denatureren (cf. the art of persuasion). De verschillende linkers en de firma

waar ze werden aangekocht worden getoond in tabel 3.1.

Tabel 3.1 De gebruikte linkers met de firma van aankoop.

Linker Firma 4,4'-bipyridyl Sigma-Aldrich polymixine Sigma-Aldrich 6-mercapto-1-hexanol Fluka Cysteamine hydrochloride Fluka Neomycine Riedel-DeHaën Spermidine Sigma-Aldrich CuTSPc Sigma-Aldrich poly-L-lysine Sigma-Aldrich 5-carboxy-1-pentaanthiol Dojindo 7-carboxy-1-heptaanthiol Dojindo 5-carboxypenthyl disulfide Dojindo 6-amino-1-hexaanthiol Dojindo 6-ferrocenyl-1-hexaanthiol Dojindo mercaptopropionzuur Sigma-Aldrich

35

3.2.3 Paardenhart cytochroom c (HCC) en Rhodobacter capsulatus cytochroom c

peroxidase (CCP)

Paardenhart cytochroom c (HCC) werd aangekocht bij Sigma-Aldrich en heeft een zuiverheid

van 97 %. Rhodobacter capsulatus cytochroom c peroxidase (CCP) werd aangemaakt door

het Laboratorium voor Eiwitbiochemie en Eiwitengineering aan de UGent. HCC en CCP

werden bewaard bij -20°C.

3.2.4 Doelmolecule

Als doelmolecule werd waterstofperoxide gebruikt omdat CCP de reductie van

waterstofperoxide katalyseert. Waterstofperoxide heeft een molaire massa van 40 g mol-1. Het

waterstofperoxide, dat in dit onderzoek gebruikt werd, werd aangekocht bij de firma Sigma-

Aldrich en was een 35 gewichtsprocent oplossing in water. De oplossing werd bewaard bij

+4°C.

3.3 Meetapparatuur

Een volledig geautomatiseerde potentiostaat met softwarebediening werd aangewend voor het

aanleggen van een gecontroleerd, al dan niet variërend, potentiaalverschil en het meten van de

stroom tussen werken tegenelektrode. In dit werk werd een Autolab potentiostaat van Eco

Chemie B.V. (Nederland) gehanteerd, meer bepaald het type PGSTAT 10. Voor dit systeem

verloopt de besturing via het softwarepakket GPES (General Purpose Electrochemical

System), versie 4.9.005 [45].

Meting van de pH van de bufferoplossing gebeurde met een Orion (USA) Benchtop pH-

meter, model 420A.

Het in dit werk gebruikte Ramantoestel is het Renishaw System 1000 (Renishaw, Wotton

Under Edge, UK) met als monochromatische lichtbron een diode laser met een vermogen van

50 mW en een golflengte van 785 nm. Het laserlicht werd rechtstreeks gefocusseerd op het

elektrodeoppervlak door middel van een Olympus 50X objectief, waardoor deeltjes met een

36

diameter van ongeveer 2 µm diameter bestudeerd konden worden. De detector was een Peltier

CCD (charge coupled device), bestaande uit lichtgevoelige cellen.

37

Hoofdstuk 4 Elektrochemisch onderzoek naar een

geschikte bufferoplossing In dit hoofdstuk wordt het elektrochemisch gedrag van drie biochemische buffers beschreven,

zowel aan een goud- als een glasachtig koolstofelektrode. De geselecteerde buffers zijn:

- tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris) zie figuur 3.5

- 2-morfolinoethaansulfonzuur (Mes) zie figuur 3.5

- N-cyclohexyl-2-aminoethaansulfonzuur (HEPES) zie figuur 3.5

Zoals reeds eerder vermeld, worden deze bufferoplossingen gekozen omdat ze een pKa

waarde hebben die zeer dicht bij 7 ligt (zie paragraaf 3.2.1). Dit maakt ze uitermate geschikt

om te bufferen bij pH 7. Bij deze pH vertoont het gebruikte enzym zijn maximale activiteit.

Alle stroompotentiaalcurven worden verkregen door een druppel van de bufferoplossing (18

µL) in contact te brengen met de drie elektroden (werkelektrode, referentie-elektrode en

tegenelektrode). Als werkelektrode wordt gebruik gemaakt van ofwel een goudelektrode

ofwel een glasachtig koolstofelektrode. Eerst wordt een stroompotentiaalcurve opgenomen

waarbij het systeem vrij aan de lucht is waardoor er reactie met zuurstof kan optreden.

Vervolgens wordt een stroompotentiaalcurve opgenomen waarbij de cel met stikstof

verzadigd is. Daarna wordt telkens het, voor dit werk, bruikbare potentiaalgebied van elke

bufferoplossing bepaald.

Een geschikte bufferoplossing mag geen elektrochemische reacties vertonen in het

potentiaalgebied van -0,2 V tot 0,2 V omdat in dit gebied de oxidatie en reductiepieken van

het eiwit en het enzym worden verwacht.

4.1 Voltammetrisch gedrag van een Tris bufferoplossing

Een Tris bufferoplossing wordt gekenmerkt door een hoge stabiliteit, ze blijft ongeveer een

jaar stabiel bij kamertemperatuur. Tris heeft een pKa van 8,1 en heeft een bruikbaar pH

gebied van 7,0 tot 9,01. In dit pH-gebied zijn de geselecteerde eiwitten en enzymen stabiel.

38

4.1.1 Goud als werkelektrode

Figuur 4.1 toont het elektrochemisch gedrag van een 10 mmol L-1 Tris bufferoplossing aan

een goudelektrode. De parameterinstellingen voor deze meting worden getoond in tabel 4.1.

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5

E (V vs VKE)

I (µA)

1

2

Figuur 4.1 Cyclische voltammogrammen van een goudelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1 Tris

bufferoplossing. Curve 1 is opgenomen in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in aanwezigheid van zuurstof,

telkens aan een andere Tris buffer druppel. Parameterinstellingen: zie tabel 4.1.

Curve 1 uit figuur 4.1 toont het stroompotentiaalgedrag in afwezigheid van zuurstof; curve 2

in aanwezigheid van zuurstof. De zuurstofreductiepiek treedt duidelijk op bij een potentiaal

van -0,16 V. Omdat deze zuurstofreductiepiek verschijnt in het potentiaalgebied waar een

respons van het enzym verwacht wordt, wordt verkozen te werken in afwezigheid van

zuurstof. Een zuurstofvrije atmosfeer werd bereikt door continu stikstof door de opstelling te

sturen. Het oxidatieproces bij 0,35 V is zowel zichtbaar in curve 1 als in curve 2 en kan

verklaard worden als de oxidatie van goud met vorming van goudoxiden en –hydroxiden [46-

48]. In aanwezigheid van zuurstof treedt bij 0,16 V en 0,1 V respectievelijk een oxidatie- en

reductieproces op. Deze elektrochemische reacties treden vermoedelijk op door reactie met

zuurstofradicalen.

39

Tabel 4.1 Parameterinstellingen bij figuur 4.1, figuur 4.2, figuur 4.3, figuur 4.5, figuur 4.6, figuur 4.7 en

figuur 4.9.

startpotentiaal 0 V eerste omkeerpotentiaal 0,5 V tweede omkeerpotentiaal -0,5 V polarisatiesnelheid 10 mV s-1

De twee stroompotentiaalcurven, getoond in figuur 4.1, werden telkens opgenomen aan een

andere Tris buffer druppel. Wanneer deze meting op een zelfde druppel werd uitgevoerd,

werd een ander elektrochemisch gedrag waargenomen. Dit elektrochemisch gedrag wordt

voorgesteld in figuur 4.2.

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5

E (V vs VKE)

I (µA)

1

2

Figuur 4.2 Cyclische voltammogrammen van een goudelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1 Tris

bufferoplossing. Curve 1 is opgenomen in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in afwezigheid van zuurstof na

cyclische voltammogrammen te hebben opgenomen in aanwezigheid van zuurstof. Parameterinstellingen: zie

tabel 4.1.

Curve 1 uit figuur 4.2 is identiek aan curve 1 van figuur 4.1, namelijk de

stroompotentiaalcurve waarbij rechtstreeks in afwezigheid van zuurstof het elektrochemisch

gedrag werd nagegaan. Curve 2 stelt het elektrochemisch gedrag van een Tris bufferdruppel

voor, eveneens in afwezigheid van zuurstof, maar waarbij eerst op dezelfde druppel het

elektrochemisch gedrag in aanwezigheid van zuurstof getest werd. In vergelijking met curve 1

wordt er een extra oxidatie- en reductiepiek waargenomen. De extra oxidatiepiek is gelegen

bij 0,16 V. De reductiepiek bevindt zich bij 0,095 V. Het zijn precies deze processen die reeds

40

gedetecteerd werden in curve 2 van figuur 4.1 (in aanwezigheid van zuurstof). Ook hier is een

mogelijke verklaring voor deze extra pieken dat er tijdens de meting in aanwezigheid met

zuurstof een reactie optreedt tussen de buffermoleculen en de aanwezige zuurstofradicalen.

Zelfs na zuurstofvrij maken van de oplossing blijven deze vermoedelijk geadsorbeerde

bestanddelen elektrochemisch zichtbaar. Dit fenomeen wordt verder in dit werk het

zuurstofeffect genoemd. Omdat deze pieken voor interferentie kunnen zorgen met de respons

van het enzym wordt steeds van bij de aanvang van het experiment gemeten in afwezigheid

van zuurstof. Het bruikbaar potentiaalgebied voor een Tris bufferoplossing aan een

goudelektrode gaat van -0,5 V tot 0,25 V.

4.1.2 Glasachtig koolstof als werkelektrode

Bij een glasachtig koolstofelektrode wordt het eerder beschreven zuurstofeffect, vastgesteld

bij een goudelektrode (zie figuur 4.2), niet waargenomen. Toch zijn er ook hier interfererende

processen in aanwezigheid van zuurstof. Figuur 4.3 toont de stroompotentiaalcurven van een

10 mmol L-1 Tris bufferoplossing aan een glasachtig koolstofelektrode.

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

-0.50 -0.30 -0.10 0.10 0.30 0.50

E (V vs VKE)

I (µA)2

2

1 1

Figuur 4.3 Cyclische voltammogrammen van een glasachtig koolstofelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1

Tris bufferoplossing. Curve 1 is opgenomen in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in aanwezigheid van zuurstof.

Parameterinstellingen: zie tabel 4.1.

41

Curve 1 uit figuur 4.3 stelt het elektrochemische gedrag voor in afwezigheid van zuurstof,

curve 2 in aanwezigheid van zuurstof. De piek gelegen bij een potentiaal van 0,14 V is de

koolstofoxidatiepiek [49]. Deze piek heeft een verschillende respons voor beide curven. Een

mogelijke verklaring hiervoor is dat door het polijsten het kristallijne oppervlak van de

elektrode telkens verschilt [50]. Iedere voorbehandeling is anders en geeft aanleiding tot licht

verschillende oppervlakken.

Op basis van figuur 4.3 kan vervolgens het bruikbare potentiaalgebied van een glasachtig

koolstofelektrode in een 10 mmol L-1 Tris bufferoplossing bepaald worden. Figuur 4.4 is de

voorstelling van dit bruikbare potentiaalgebied. Het zuurstofreductie proces wordt niet

waargenomen. De aanzet van de koolstofoxidatiepiek, bij een potentiaal van 0,025 V, vormt

de oxidatieve begrenzing. Er worden nog twee kleine oxidatieprocessen waargenomen bij

-0,31 V en -0,55 V. Deze processen zijn toe te kennen aan quinone dat zich op het

elektrodeoppervlak van een glasachtig koolstofelektrode bevindt. Voor meer informatie wordt

verwezen naar de literatuur [49,51]. Tabel 4.2 toont de parameterinstellingen voor deze

meting.

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

-1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0

E (V vs VKE)

I (µA)

Figuur 4.4 Cyclisch voltammogram van een glasachtig koolstofelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1 Tris

bufferoplossing in afwezigheid van zuurstof. Parameterinstellingen: zie tabel 4.2.

42

Tabel 4.2 Parameterinstellingen bij de figuur 4.4.


4.2 Voltammetrisch gedrag van een Mes bufferoplossing

Door mogelijke schimmelvorming in de oplossing blijft een Mes bufferoplossing maar een

paar weken stabiel. Qua stabiliteit heeft het bijgevolg niet de voordelen van een Tris

bufferoplossing. Mes heeft een pKa van 6,2 en is stabiel in een pH gebied van 5,5 tot 6,7. In

dit hoofdstukonderdeel wordt het elektrochemisch gedrag van een Mes bufferoplossing aan

een goud- en glasachtig koolstofelektrode onderzocht.


Analoog aan de experimenten beschreven in 4.1.1 wordt het elektrochemisch gedrag van de

Mes bufferoplossing vooreerst aan een goudelektrode bestudeerd. De cyclische

voltammogrammen van een gepolijste, niet roterende goudelektrode opgenomen in een 10

mmol L-1 Mes bufferoplosing worden voorgesteld in figuur 4.5. De parameterinstellingen van

deze meting worden weergegeven in tabel 4.1.

43

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5

E (V vs VKE)

I (µA)

2

1

12

12

Figuur 4.5 Cyclische voltammogrammen van een goudelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1 Mes


telkens aan een andere Mes buffer druppel. Parameterinstellingen: zie tabel 4.1.

Curve 1 in figuur 4.5 stelt de stroompotentiaalcurve voor in afwezigheid van zuurstof, curve 2

in aanwezigheid van zuurstof. Beide scans zijn opgenomen in een andere druppel Mes buffer

om het eventuele zuurstofeffect te vermijden. De zuurstofreductiepiek heeft een

piekpotentiaal van -0,13 V. Deze piek verdwijnt volledig wanneer gemeten wordt in

afwezigheid van zuurstof. Zowel in curve 1 als 2 worden twee oxidatieprocessen

waargenomen bij een potentiaal van ongeveer 0,24 V en 0,38 V en een reductieproces bij

ongeveer 0,24 V. Deze processen kunnen wellicht verklaard worden als de oxidatie van het

goud met vorming van goudoxiden en –hydroxiden en de reductie van deze componenten [46-

48]. Het bruikbare potentiaalgebied voor een Mes bufferoplossing aan een goudelektrode gaat

van -0,5 V tot 0,1 V.


Figuur 4.6 toont twee stroompotentiaalcurven, opgenomen aan een glasachtig

koolstofelektode in een Mes bufferoplossing.De parameterinstellingen bij de opname van

deze cyclische voltammogrammen worden weergegeven in tabel 4.1.

44

-4.0

-3.0

-2.0

-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5

E (V vs VKE)

I (µA)

2

1

2

1


Mes bufferoplossing. Curve 1 is opgenomen in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in aanwezigheid van zuurstof.


Curve 1 toont een stroompotentiaalcurve in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in

aanwezigheid van zuurstof. Er wordt een verschuiving van de koolstofoxidatiepiek

opgemerkt. Bij curve 1 bevindt de koolstofoxidatiepiek zich bij een potentiaal van 0,13 V en

bij curve 2 bij 0,16 V. Bij ongeveer -0,3 V wordt in aanwezigheid van zuurstof een

reductieproces waargenomen. Dit proces kan verklaard worden als de reductie van de

aanwezige hoeveelheid zuurstof in de oplossing. Daar dit proces kan interfereren met andere

wordt verkozen om te werken in een stikstofatmosfeer. Het bruikbare potentiaalgebied ligt

tussen -0,8 V en 0,1 V.

4.3 Voltammetrisch gedrag van een HEPES bufferoplossing

HEPES is een buffer die qua stabiliteit tussen de twee voorgaande ligt. Een HEPES

bufferoplossing blijft gedurende enkele maanden stabiel. HEPES heeft een pKa van 7,5 en

zijn bruikbaar pH-gebied ligt tussen 6,8 en 8,2. In dit pH gebied zijn de bestudeerde eiwitten

en enzymen stabiel en vertonen ze een hoge activiteit.

45


De cyclische voltammogrammen van een gepolijste, niet roterende goudelektrode opgenomen

in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing worden voorgesteld in figuur 4.7. De

parameterinstellingen van deze meting worden weergegeven in tabel 4.1.

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5

E (V vs VKE)

I (µA)

2

1

2

1

Figuur 4.7 Cyclische voltammogrammen van een goudelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1 HEPES


telkens aan een andere HEPES buffer druppel. Parameterinstellingen: zie tabel 4.1.

Curve 2 uit figuur 4.7 werd opgenomen in aanwezigheid van zuurstof, curve 1 in afwezigheid

van zuurstof. De zuurstofreductiepiek heeft een potentiaal van -0,16 V. Deze piek is niet

aanwezig in curve 1. In curve 2 worden twee oxidatieprocessen bij 0,20 V en bij 0,38 V

waargenomen. Het oxidatieproces bij 0,38 V is eveneens zichtbaar in curve 1 en kan

verklaard worden als de oxidatie van het goudoppervlak met vorming van goudoxiden en

goudhydroxiden [46-48]. Het proces bij 0,20 V is echter enkel waarneembaar in aanwezigheid

van zuurstof. Er treedt ook een reductieproces op bij 0,13 V. Een mogelijke verklaring voor

deze oxidatie- en reductiepiek is, zoals bij Tris, dat er tijdens de meting in aanwezigheid van

zuurstof mogelijk een reactie optreedt met de aanwezige zuurstofradicalen. Figuur 4.8 toont

het bruikbare potentiaalgebied van een goudelektrode in een 10 mmol L-1 HEPES

bufferoplossing in afwezigheid van zuurstof. Het bruikbare potentiaalgebied voor een

46

goudelektrode in een HEPES bufferoplossing gaat van -0,65 V tot 0,20 V. Tabel 4.3 toont de

parameterinstellingen die voor deze meting gebruikt werden.

-20

-10

0

10

20

-0.41 -0.31 -0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19

E (V vs VKE)

I (nA)

Figuur 4.8 Cyclisch voltammogram van een goudelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1 HEPES

bufferoplossing. Parameterinstellingen: zie tabel 4.3.

Tabel 4.3 Parameterinstellingen bij figuur 4.8.

startpotentiaal 0 V eerste omkeerpotentiaal 0,20 V tweede omkeerpotentiaal -0,65 V polarisatiesnelheid 10 mVs-1


Figuur 4.9 toont het elektrochemisch gedrag van een glasachtig koolstofelektrode in

aanwezigheid van zuurstof (curve 2) en in afwezigheid van zuurstof (curve 1). De

parameterinstellingen bij de opname van deze cyclische voltammogrammen worden

weergegeven in tabel 4.1.

47

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

-0.5 -0.3 -0.1 0.1 0.3 0.5

E (V vs VKE)

I (µA)

1

2

2


HEPES bufferoplossing. Curve 1 is opgenomen in afwezigheid van zuurstof, curve 2 in aanwezigheid van

zuurstof. Parameterinstellingen: zie tabel 4.1.

Het zuurstofreductieproces begint bij een potentiaal van ongeveer -0,13 V. De

koolstofoxidatiepiek wordt waargenomen bij een potentiaal van 0,17 V in afwezigheid van

zuurstof en bij 0,16 V in aanwezigheid van zuurstof. Ook bij HEPES is er dus een

verschuiving van de koolstofreductiepiek.

Figuur 4.10 toont het voor dit werk geselecteerde potentiaalgebied voor een glasachtig

koolstofelektrode in contact met een HEPES bufferoplossing onder stikstofatmosfeer. Het

bruikbare potentiaalgebied voor een glasachtig koolstofelektrode in een HEPES

bufferoplossing gaat van -0,8 V tot 0,1 V. Tabel 4.4 toont de parameterinstellingen die voor

deze meting gebruikt werden.

48

-80

-40

0

40

80

-0.8 -0.7 -0.6 -0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1

E (V vs VKE)

I (nA)

Figuur 4.10 Cyclisch voltammogram van een glasachtig koolstofelektrode opgenomen in een 10 mmol L-1

HEPES bufferoplossing. Parameterinstellingen: zie tabel 4.4.



4.4 Welke buffer verder gebruiken?

Op basis van de beschreven experimenten en resultaten wordt één van de bufferoplossingen

geselecteerd. In volgende hoofdstukken zal het eiwit en enzym elektrochemisch bestudeerd

worden in deze bufferoplossing.

Een Tris bufferoplossing wordt verder niet gebruikt vanwege het zuurstofeffect. Een Mes

bufferoplossing vertoont dit zuurstofeffect niet maar heeft een geringe stabiliteit. Een HEPES

bufferoplossing vertoont geen zuurstofeffect en is zeer stabiel. Tevens is er een relatief groot

potentiaalgebied waarin geen oxidatie- of reductieproces van de HEPES bufferoplossing of

van de elektrode optreedt. Dit zowel voor de goudelektrode als voor de glasachtig

koolstofelektrode. Hieruit kan besloten worden dat de HEPES bufferoplossing de voor dit

werk meest geschikte bufferoplossing is. Alle experimenten beschreven in volgende

hoofdstukken worden bijgevolg uitgevoerd in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing bij pH

49

7 en bij kamertemperatuur gebruik makende van ofwel een goudelektrode of een glasachtig

koolstofelektrode.

50

Hoofdstuk 5 Elektrochemisch gedrag van HCC Dit hoofdstuk omvat de studie van het elektrochemisch gedrag van HCC aan een glasachtig

koolstof- en een goudelektrode, al dan niet gemodificeerd met een linker, in een 10 mmol L-1

HEPES buffer oplossing van pH 7. Vóór iedere elektrochemische meting wordt 18 µL van

een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing aan de referentie-elektrode gehangen en wordt, om

alle zuurstof uit de cel te verwijderen, stikstof door de cel gestuurd. Na vijftien tot twintig

minuten wordt contact gemaakt tussen de drie elektroden. Vervolgens worden een drietal

cyclische voltammogrammen opgenomen waarna een linker wordt toegevoegd, opnieuw

gevolgd door opname van een drietal scans. In een volgende stap wordt het eiwit toegevoegd

en wordt het elektrochemisch gedrag ervan bestudeerd. In sommige gevallen wordt de stap

van het toevoegen van de linker overgeslaan omdat het elektrodeoppervlak reeds op voorhand

gemodificeerd werd. Dit wordt gedaan door het elektrodeoppervlak een twintigtal minuten in

contact te brengen met een oplossing van de linker waarmee men het oppervlak wil

modificeren. Het eiwit dat in dit hoofdstuk gebruikt wordt is HCC en bevat één haemgroep.

Het is de oxidatie en reductie van het ijzerion in deze haemgroep dat elektrochemisch

gedetecteerd kan worden.

5.1 Elektrochemisch gedrag van HCC aan een glasachtig koolstofelektrode

Omdat HCC aan de buitenkant een globale positieve lading heeft en het glasachtig

koolstofoppervlak negatieve groepen bevat, wordt verwacht dat door de aantrekking van

tegengestelde ladingen HCC elektrochemisch detecteerbaar is aan een glasachtig

koolstofelektrode. Om dit na te gaan werden achtereenvolgende cyclische voltammogrammen

continu opgenomen onder een stikstofatmosfeer aan een glasachtig koolstofelektrode in een

26,3 µmol L-1 HCC bevattende 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing. Figuur 5.1 stelt de

eerste vier scans van dit experiment voor alsook de stroompotentiaalcurve opgenomen aan

een blanco glasachtig koolstofelektrode in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing zonder

HCC (curve 1). In dit experiment werd HCC gedetecteerd zonder gebruik te maken van een

linker. De parameterinstellingen voor dit experiment worden voorgesteld in tabel 5.1.

51

-0.5

-0.3

0.0

0.3

0.5

-0.33 -0.28 -0.23 -0.18 -0.13 -0.08 -0.03 0.02 0.07

E (V vs VKE)

I (µA)

1

2

5

2

5


HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van 26,3 µmol L-1 HCC (2-5). Parameterinstellingen: zie tabel 5.1.

Wat opvalt in figuur 5.1 is dat in het potentiaalgebied van 0 V tot -0,33 V na toevoegen van

HCC de reductiestromen afnemen met het scannummer. De pijlen verduidelijken de zin van

de optredende stroomvariaties met toenemend scannummer. Dit is te verklaren door het

volgende effect. Wanneer HCC wordt toegevoegd, wordt een kleine hoeveelheid zuurstof in

de cel gebracht dat gereduceerd kan worden in het getoonde potentiaalgebied. Deze kleine

hoeveelheid zuurstof en de daarbij horende reductiestroom verdwijnen wanneer continu

stikstofgas door de cel wordt gestuurd. Een ander redoxproces dat optreedt, is dat van HCC.

De piekpotentiaal van het oxidatieproces van HCC bedraagt 0,07 V. Er wordt slechts tot 0,07

V gescand omdat bij een hogere potentiaal de koolstofoxidatiepiek van de glasachtig

koolstofelektrode zichtbaar wordt en deze zou interfereren met de oxidatiepiek van HCC. Er

is reeds een kleine interferentie zichtbaar in figuur 5.1 waardoor het oxidatieproces en de

bijhorende potentiaal moeilijk te bepalen is. De piekpotentiaal van het reductieproces van

HCC bedraagt -0,024 V. Verder ziet men ook dat bij toenemend aantal scans de oxidatiepiek

van het eiwit afneemt. Dit is te verklaren door het optreden van denaturatie van het eiwit aan

het koolstofoppervlak. Deze twee effecten, zuurstofreductie bij toevoegen en denaturatie van

het eiwit bij herhaaldelijk cycliseren, treden bij ieder experiment op en worden daarom niet

meer expliciet vermeld. De besproken reacties zijn afkomstig van de oxidatie en reductie van

het ijzerion dat zich in de haemgroep van HCC bevindt en dit volgens de volgende reacties:

52

Oxidatie: Fe2+ → Fe3+ + 1 e- Reductie: Fe3+ + 1 e- → Fe2+


startpotentiaal -0,31 V eerste omkeerpotentiaal 0,07 V tweede omkeerpotentiaal -0,31 V polarisatiesnelheid 10 mV s-1

5.2 Elektrochemisch gedrag van HCC aan een goudelektrode

Daar goud een hydrofoob karakter heeft, wordt verwacht dat een hydrofiel enzym, zoals

HCC, denatureert in contact met een goudoppervlak. Elektrochemisch wordt dan ook vaak

geen signaal waargenomen omdat de elektronenoverdracht in het eiwit niet meer optimaal

verloopt. Om HCC elektrochemisch wel te kunnen detecteren aan een goudelektrode moet

gebruik gemaakt worden van een linker. De linker kan door spontane adsorptie tijdens de

voorbehandeling of elektrochemisch aangebracht worden. Omdat HCC globaal positief

geladen is, maakt men het best gebruik van linkers die een negatieve eindgroep bevatten zoals

6-mercaptohexanol, 5-carboxy-1-pentaanthiol,… In de literatuur werd tevens beschreven dat

4,4’-bipyridyl vaak als een geschikte linker kan fungeren [1,46].

5.2.1 4,4’-bipyridyl als linker

De eerste linker die getest werd, is 4,4’-bipyridyl (figuur 5.2). De modificatie van het

goudoppervlak werd bereikt door drie achtereenvolgende cyclische voltammogrammen op te

nemen van een goudelektrode in contact met 20 µL 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing die

5 mmol L-1 4,4’-bipyridyl bevat. De laatste van deze drie scans worden in figuur 5.3

voorgesteld (curve 1).

HN NH

Figuur 5.2 Structuur van 4,4’-bipyridyl.

In figuur 5.3 wordt tevens het elektrochemisch gedrag van HCC aan een met 4,4’-bipyridyl

gemodificeerde goudelektrode in 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing voorgesteld. Curve 1

53

stelt een cyclisch voltammogram voor van de met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde

goudelektrode. Na stabilisatie van het signaal werd 1 µL 500 µmol L-1 HCC toegevoegd (23,8

µmol L-1 HCC in druppel) (curve 2).

-0.20

-0.15

-0.10

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

-0.42 -0.32 -0.22 -0.12 -0.02 0.08 0.18

E (V vs VKE)

I (µA)

1

2

Figuur 5.3 Cyclisch voltammogram van een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode opgenomen in een

10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van 23,8 µmol L-1 HCC (2). Parameterinstellingen zie

tabel 5.2.

Figuur 5.3 geeft duidelijk weer dat in aanwezigheid van 23,8 µmol L-1 HCC een oxidatie- en

reductieproces optreedt. Op basis van literatuurgegevens [1] kunnen deze processen worden

toegeschreven aan de oxidatie en reductie van de haemgroep in het eiwit. De piekpotentiaal

van het oxidatieproces bedraagt 0,087 V en van het reductieproces 0,002 V. Het

oxidatieproces stelt de oxidatie van Fe2+ voor met vorming van Fe3+. Bij 0,002 V treedt het

daarbijhorende reductieproces op. In de literatuur werden analoge piekpotentialen gevonden

[1]. De parameterinstellingen voor deze meting worden getoond in tabel 5.2.

54

Tabel 5.2 Parameterinstellingen bij figuur 5.3, figuur 5.5 en figuur 5.10.


Nu blijft natuurlijk de vraag of het eiwit geadsorbeerd is aan het goudoppervlak of niet. Dit

werd onderzocht door de polarisatiesnelheid te variëren. Wanneer de stroom wordt uitgezet in

functie van de polarisatiesnelheid zou men een lineair verband moeten vinden als het deeltje

geadsorbeerd wordt (vergelijking 2.5). Indien het eiwit vanuit de oplossing reageert dan vindt

men een lineair verband als de stroom wordt uitgezet in functie van de vierkantswortel van de

polarisatiesnelheid (vergelijking 2.4). Wanneer dit voor HCC aan een met 4,4’-bipyridyl

gemodificeerde goudelektrode werd uitgevoerd, werd noch voor adsorptie, noch voor reactie

vanuit de oplossing een lineair verband gevonden. Dit kan verklaard worden door denaturatie

van het eiwit. Gedenatureerd eiwit kan aan het elektrodeoppervlak binden waardoor het

oppervlak gedeeltelijk geblokkeerd wordt.

Vervolgens werden Raman metingen uitgevoerd om een passend antwoord op deze vraag te

vinden. Maar door de lage concentratie op de elektrode werden geen duidelijke Raman

banden waargenomen.

Gebaseerd op literatuurgegevens [1,46] wordt aangenomen dat HCC geadsorbeerd wordt aan

het gemodificeerde oppervlak. De piekseparatie die optreedt, duidt op een lichte afwijking

van het ideale reversibele systeem.

5.2.2 6-mercaptohexanol als linker

De volgende linker die getest werd om HCC elektrochemisch te detecteren aan een

goudelektrode is 6-mercaptohexanol (figuur 5.4).

HS

OH Figuur 5.4 Structuur van 6-mercaptohexanol.

55

Om het goudoppervlak te modificeren werd de goudelektrode twintig minuten in een

1 mmol L-1 6-mercaptohexanol oplossing gedompeld. Dit om de covalente goud-thiol

bindingen te vormen. De gemodificeerde goudelektrode werd vervolgens in de cel gebracht en

18 µL 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing werd aan de referentie-elektrode gehangen. De

volledige opstelling werd vijftien minuten doorborreld met stikstof om alle zuurstof uit de cel

te verwijderen. Na contact gemaakt te hebben tussen de druppel en de elektroden werden een

aantal voltammetrische curven opgenomen. Na stabilisatie van dit blanco signaal werd

vervolgens HCC toegevoegd aan de druppel. De cyclische voltammogrammen van de

gemodificeerde elektrode in af- en aanwezigheid van HCC worden voorgesteld in figuur 5.5.

-0.28

-0.23

-0.18

-0.13

-0.08

-0.03

0.02

0.07

0.12

0.17

-0.41 -0.31 -0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19

E (V vs VKE)

I (µA)

1

2

Figuur 5.5 Cyclisch voltammogram van een met 6-mercaptohexanol gemodificeerde goudelektrode opgenomen

in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van 100 µmol L-1 HCC (2).

Parameterinstellingen zie tabel 5.2.

Curve 1 in figuur 5.5 toont het elektrochemisch gedrag van een met 6-mercaptohexanol

gemodificeerde goudoppervlak. Curve 2 toont het elektrochemisch gedrag na toevoegen van 2

µL van een 1 mmol L-1 HCC oplossing. Dit resulteert in een 100 µmol L-1 HCC oplossing in

de druppel.

Analoog aan figuur 5.3 worden een oxidatie- en reductieproces van HCC vastgesteld. De

piekpotentialen liggen wat verder uit elkaar wat duidt op een meer irreversibel proces en dus

op een minder goede linker. De piekpotentiaal van de oxidatie bevindt zich bij 0,116 V, die

56

van de reductie bij -0,059 V. Ook hier kunnen beide processen worden toegeschreven aan de

oxidatie en reductie van de haemgroep van het eiwit HCC.

5.2.3 5-carboxy-1-pentaanthiol als linker

Indien 5-carboxy-1-pentaanthiol (zie figuur 5.6) als linker wordt gebruikt dan ontstaan

covalente goud-thiol bindingen waarbij een negatief geladen oppervlak (carboxylgroepen)

gecreëerd wordt.

HS COOH

Figuur 5.6 De structuur van 5-carboxy-1-pentaanthiol.

Om een met 5-carboxy-1-pentaanthiol gemodificeerd goudoppervlak te bekomen, werd de

goudelektrode gedurende twintig minuten in een 5-carboxy-1-pentaanthiol oplossing

gehangen. Deze oplossing werd bereid door 1 µL 5-carboxy-1-pentaanthiol op te lossen in 1

mL ethanol. Deze modificatie gebeurde onder stikstofatmosfeer omdat 5-carboxy-1-

pentaanthiol reageert met zuurstof.

-40

-20

0

20

40

60

80

-0.47 -0.37 -0.27 -0.17 -0.07 0.03 0.13

E (V vs VKE)

I (nA)

1

2

Figuur 5.7 Cyclisch voltammogram van een met 5-carboxy-1-pentaanthiol gemodificeerde goudelektrode

opgenomen in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van 50 µmol L-1 HCC (2).


57

Curve 1 in figuur 5.7 toont het cyclisch voltammogram van een met 5-carboxy-1-pentaanthiol

gemodificeerde goudoppervlak in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing. Er zijn

verschillende redoxprocessen van de linker zichtbaar. Curve 2 is de scan opgenomen in

aanwezigheid van 50 µmol L-1 HCC oplossing. De parameterinstellingen van deze meting

worden getoond in tabel 5.3.



Om het netto elektrochemisch signaal van HCC waar te nemen, wordt curve 1 van curve 2

afgetrokken. De resulterende curve wordt voorgesteld in figuur 5.8.

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

-0.17 -0.12 -0.07 -0.02 0.03 0.08 0.13

E (V vs VKE)

I (nA)

AC

B

D

Figuur 5.8 Curve 2 – curve 1 van figuur 5.7.

De piekpotentialen liggen ook hier ver uit elkaar. De piekpotentiaal van de oxidatie van HCC

bevindt zich bij 0,124 V (A), deze van de reductie bij -0,031 V (B). De grote spreiding tussen

de piekpotentialen duidt er wederom op dat 5-carboxy-1-pentaanthiol een minder goede linker

is dan 4,4’-bipyridyl. Bij C en D treedt een tweede redoxkoppel op. Dit proces en een

mogelijke verklaring ervan werden niet bestudeerd.

58

5.2.4 7-carboxy-1-heptaanthiol als linker

Ook met 7-carboxy-1-heptaanthiol (figuur 5.9) worden covalente goud-thiol bindingen en een

negatief geladen goudoppervlak gevormd.

HS COOH

Figuur 5.9 Structuur van 7-carboxy-1-heptaanthiol.

Het gemodificeerde goudoppervlak werd bereid door de goudelektrode in een 7-carboxy-1-

heptaanthiol oplossing te hangen. Deze oplossing werd bekomen door 1 µL 7-carboxy-1-

heptaanthiol op te lossen in 1 mL water.

-50

-25

0

25

50

-0.41 -0.31 -0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19

E (V vs VKE)

I (nA)

1

2

Figuur 5.10 Cyclisch voltammogram van een met 7-carboxy-1-heptaanthiol gemodificeerde goudelektrode

opgenomen in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van 13,5 µmol L-1 HCC (2).


Figuur 5.10 toont het elektrochemisch gedrag van een met 7-carboxy-1-heptaanthiol

gemodificeerd goudoppervlak in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing. Curve 1 toont het

stroompotentiaalgedrag van het gemodificeerde goudoppervlak. Curve 2 stelt het

stroompotentiaalgedrag voor van HCC aan dit gemodificeerde oppervlak. Aan de

bufferoplossing werd 0,5 µL 500 µmol L-1 HCC oplossing toegevoegd, resulterend in een

13,5 µmol L-1 concentratie HCC in de druppel. De reductiepiek van het eiwit bevindt zich bij

59

een potentiaal van 0,0 V, de oxidatiepiek bij een potentiaal van 0,12 V. Deze piek zijn

afkomstig van de oxidatie en de reductie van HCC. Deze linker blijkt dus geschikt te zijn voor

detectie van HCC. 7-carboxy-1-heptaanthiol als linker geeft wel een minder reversibel

systeem voor HCC dan 4,4’-bipyridyl.

5.2.5 Overige linkers

Bij het gebruik van sommige linkers verschijnen er in het gehanteerde potentiaalgebied geen

extra oxidatie- of reductieprocessen na toevoegen van het eiwit. Het eiwit HCC kan aldus met

deze linkers geïmmobiliseerd op de elektrode niet gedetecteerd worden.

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

-0.33 -0.28 -0.23 -0.18 -0.13 -0.08 -0.03 0.02 0.07

E (V vs VKE)

I (nA)

1

2

Figuur 5.11 Cyclisch voltammogram van een met een linker gemodificeerde goudelektrode opgenomen in een 10

mmol L-1 HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van HCC(2).

Figuur 5.11 toont het elektrochemisch gedrag van een dergelijke linker. Curve 1 toont het

elektrochemisch gedrag van het gemodificeerde goudoppervlak. Curve 2, die de

stroompotentiaalcurve na toevoeging van het eiwit voorstelt, verschilt enkel in het

potentiaalgebied van -0,15 V tot -0,33 V van curve 1. Dit valt te verklaren door het

zuurstofeffect dat reeds besproken werd bij figuur 5.1. Een linker die een gelijkaardig

elektrochemisch gedrag heeft, zoals getoond wordt in figuur 5.11 is

koper(II)tetrasulfoftalocyanine tetrasodium zout (CuTSPc). Deze afzetting van CuTSPc werd

60

bekomen door eerst tien blanco scans op te nemen in een bufferoplossing met pH 12.

Vervolgens werd de elektrode in een 8 mmol L-1 CuTSPc oplossing gebracht en werden 50

scans opgenomen. Bij deze meting was de beginpotentiaal 0 V, de eerste omkeerpotentiaal

bedroeg 0,6 V en de tweede omkeerpotentiaal was -1,2 V. De polarisatiesnelheid was steeds

50 mV s-1. De blanco goudelektrode geeft zoals vermeld ook een gelijkaardige respons als

figuur 5.7.

Aangezien er reeds een aantal linkers (4,4’-bipyridyl, 6-mercaptohexanol, ...) een zeer goede

respons voor HCC vertonen en omdat het doelenzym CCP is, werden geen extra linkers

getest.

Het mag duidelijk zijn dat het dikwijls trial and error is om het eiwit HCC elektrochemisch te

kunnen detecteren. Zowel de hydrofobiciteit als de lading van zowel het oppervlak als het

eiwit spelen vaak een beperkende factor.

61

Hoofdstuk 6 Elektrochemisch gedrag van CCP

Zoals in hoofdstuk 1 reeds werd beschreven, wordt het enzym CCP gekenmerkt door een

negatieve lading langs de buitenzijde van de haemgroepen. Om CCP te kunnen detecteren aan

een door een linker gemodificeerde elektrode, is het een vereiste dat deze linker een positief

uiteinde bevat. Linkers die hiervoor in aanmerking komen zijn diegene met als eindstandige

groep bijvoorbeeld een amine (bv. cysteamine).

6.1 Linkers

De eerste linker die getest werd, was cysteamine (zie figuur 6.1). Het goudoppervlak werd

gemodificeerd door de elektrode in een 60 µmol L-1 cysteamine oplossing, met als solvent

water, te hangen gedurende een twintigtal minuten.

HSNH2

Figuur 6.1 Structuur van Cysteamine.

Curve 1 van figuur 6.2 toont de stroompotentiaalcurve voor een met cysteamine

gemodificeerde goudelektrode in een 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing. Curve 2 toont het

elektrochemisch gedrag van 50 µ mol L-1 CCP aan deze gemodificeerde elektrode. De

parameterinstellingen van dit experiment worden getoond in tabel 6.1.

Parameterinstellingen bij figuur 6.1.


62

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

-0.41 -0.31 -0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19

E (V vs VKE)

I (µA)

12

Figuur 6.2 Cyclisch voltammogram van een met cysteamine gemodificeerde goudelektrode opgenomen in een 10

mmol L-1 HEPES bufferoplossing (1) in aanwezigheid van 50 µmol L-1 CCP (2). Parameterinstellingen zie tabel

6.1.

In curve 1 van figuur 6.2 wordt een oxidatieproces waargenomen in het potentiaalgebied van

-0,04 V tot 0,2 V. Dit oxidatieproces heeft als mogelijke verklaring de oxidatie van de linker

cysteamine. Deze oxidatie wordt ook waargenomen in curve 2. In aanwezigheid van CCP is

de respons duidelijk verschillend van curve 1. Dit doet vermoeden dat er een ander proces

optreedt. Om het signaal van dit extra proces te bekomen wordt curve 2 van curve 1

afgetrokken. Dit nettosignaal geeft de bijdrage van CCP weer.

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

-0.11 -0.06 -0.01 0.04 0.09 0.14E (V vs VKE)

I (µA)

Figuur 6.3 Curve 2 – curve 1 van figuur 6.2.

63

Figuur 6.3 vertoont een duidelijke oxidatiepiek waarvan de piekpotentiaal zich bij 0,08 V

bevindt. Deze oxidatiepiek is afkomstig van het ijzerion uit de hoogpotentiaal haemgroep. Het

reductieproces is afwezig wat duidt op een irreversibel proces waarbij het ijzerion uit de

hoogpotentiaal haemgroep geoxideerd wordt.

2 3 -1HP HPFe Fe e+ +→ +

Vervolgens werden heel wat linkers getest waarbij het elektrochemisch gedrag gelijkaardig is

aan figuur 5.7. Deze linkers zijn niet geschikt voor de elektrochemische detectie van CCP.

Deze zijn voor de goudelektrode: neomycine, spermidine, 4,4’-bipyridyl, CuTSPc, poly-L-

lysine, 6-mercaptohexanol, 6-ferrocenyl-1-hexaanthiol, 5-carboxy-1-pentaanthiol, 5-

carboxypenthyl disulfide, mercaptopropionzuur en de blanco goudelektrode. Voor de

glasachtig koolstofelektrode werden poly-L-lysine, poly-L-lysine (10X verdund), neomycine,

6-amino-1-hexaanthiol en de blanco koolstofelektrode getest.

6.2 HCC als mediator voor CCP

Omdat de geteste linkers geen goede resultaten gaven, wordt getracht CCP elektrochemisch te

detecteren met HCC als mediator (zie paragraaf 1.3). Hiervoor wordt eerst HCC

geïmmobiliseerd aan de goudelektrode met behulp van 4,4’-bipyridyl volgens de procedure

die werd uitgelegd in paragraaf 5.2.1. Nadien wordt HCC toegevoegd zodat het

gemodificeerde goudoppervlak in contact staat met 11,9 µmol L-1 HCC. Daarna worden vijf

cyclische voltammogrammen opgenomen om HCC te laten stabiliseren. Vervolgens wordt

CCP toegevoegd en elektrochemisch gedetecteerd.

64

I (nA)

-30

-20

-10

0

10

20

-0.21 -0.16 -0.11 -0.06 -0.01 0.04 0.09 0.14 0.19

E (V vs VKE)

Au/bipyAu/bipy/HCCAu/bipy/HCC/CCP

Figuur 6.4 Cyclisch voltammogram van een met 4,4’-bipyridyl (bipy) gemodificeerde goudelektrode opgenomen

in 10 mmol L-1 HEPES bufferoplossing (blauw) in aanwezigheid van HCC (rood) en in aanwezigheid van HCC

en CCP (groen). Parameterinstellingen zie tabel 6.2.

Figuur 6.4 toont het elektrochemisch gedrag van door HCC gemedieerd CCP. De

parameterinstellingen van deze meting worden getoond in tabel 6.1. De blauwe curve toont

het elektrochemisch gedrag van een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode. De

rode curve toont het elektrochemisch gedrag na toevoegen van HCC aan de druppel en de

groene curve toont het elektrochemisch gedrag na toevoegen van CCP aan diezelfde druppel.

Bij de rode curve worden opnieuw het oxidatie- en reductieproces van HCC waargenomen.

De piekpotentiaal van de oxidatie van HCC bevindt zich bij 0,08 V, deze van de reductie bij

0,02 V. Bij de groene curve, dit is de curve na toevoegen van 1 µL 500 µmol L-1 CCP

(resulterend in 26,3 µmol L-1 in de druppel), verschuift de piekpotentiaal van de oxidatie naar

0,06 V, deze van de reductie naar 0,0 V. Een mogelijke verklaring voor deze verschuiving is

de vorming van een complex tussen HCC en CCP. CCP is elektrochemisch niet actief maar

bindt zich aan HCC via complexvorming. Deze binding van CCP aan HCC zorgt voor de

verschuiving van de piekpotentiaal van HCC.

Een gelijkaardig systeem werd door het Laboratorium voor Eiwitbiochemie en

Eiwitengineering aan de UGent getest met het twee hybride systeem. De complexvorming

werd onderzocht met cytochroom c2 en CCP. Cytochroom c2 is net als HCC een monohaem

65

eiwit en een elektronendonor. Cytochroom c2 werd in frame gekloneerd met ∆α truncaties

van galactosidase en cytochroom c peroxidase met ∆ω truncaties van galactosidase. Deze

twee β galactosidase mutanten, ∆α (N-terminale deletie) en ∆ω (C-terminale truncatie)

hebben een lage bindingsaffiniteit en zijn niet in staat om een stabiel complex te vormen. Een

actief complex wordt gevormd wanneer de twee mutanten geëxpresseerd worden als fusies

waarvan de ‘target’ eiwitparen met elkaar interageren (in dit geval cytochroom c2 en CCP)

(zie figuur 6.5). Als gastheer voor dit systeem werd gebruik gemaakt van een E. Coli stam

waarvan het endogeen galactosidase geïnactiveerd is. Deze benadering heeft als voordeel dat

eiwitcomplexen kunnen bestudeerd worden in het periplasma en dat er geen interactie met het

DNA noodzakelijk is om een reporter gen aan te slaan. De activiteit wordt

spectrofotometrisch gevolgd bij 450 nm dat de vrijstelling van ortho-nitrofenol uit 2-

nitrofenyl-β D-galactopyranoside volgt indien een actief complex gevormd wordt [52].



Figuur 6.5 Principe van het bacterieel twee hybride systeem.

In de literatuur vinden we ook nog andere systemen waarbij complexvorming optreedt tussen

HCC en een peroxidase [53,54]. Op basis van de bekomen resultaten, de vastgestelde

66

piekverschuiving en gelijkaardige systemen beschreven in de literatuur, stellen we dat HCC

en CCP een complex vormen.

67

Hoofdstuk 7 Detectie van waterstofperoxide aan een

HCC/CCP gemodificeerde goudelektrode

Als toepassing wordt getracht waterstofperoxide te detecteren met behulp van een

goudelektrode gemodificeerd met het HCC/CCP complex. De reductie van waterstofperoxide

gebeurt door het enzym CCP volgens de reactie:

H2O2 + 2 e- + 2 H+ → 2 H2O

In dit hoofdstuk wordt nagegaan of de detectie van waterstofperoxide aan deze

gemodificeerde goudelektrode mogelijk is. Het complex wordt geïmmobiliseerd met enerzijds

4,4’-bipyridyl als linker en anderzijds met 6-mercaptohexanol als linker.

7.1 4,4’-bipyridyl als linker

Om waterstofperoxide te detecteren wordt aan het in hoofdstukdeel 6.2 beschreven systeem

(met 4,4’bipyridyl gemodificeerde goudelektrode in contact met HCC/CCP complex)

waterstofperoxide toegevoegd. Figuur 7.1 toont de katalyse in een 10 mmol L-1 HEPES

bufferoplossing. Curve 1 uit figuur 7.1 toont het elektrochemisch gedrag van CCP gemedieerd

door HCC aan een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerd goudoppervlak. Na toevoegen van het

waterstofperoxide (454 µmol L-1 in de druppel) wordt curve 2 bekomen. HCC en CCP

worden in de verhouding 1/1 (telkens 23,8 µmol L-1 in de druppel) aan de druppel

toegevoegd, zodat de complexvorming goed kan doorgaan. De elektrontransfer, van het

complex naar het waterstofperoxide, wordt gekatalyseerd via een redoxreactie met de

geadsorbeerde ijzerionen uit de haemgroepen. De elektrontransfer (reductie van

waterstofperoxide) is elektrochemisch detecteerbaar. Dit wordt duidelijk waargenomen in

curve 2 waar de elektrokatalyse zichtbaar is in de vorm van een sigmoïde.

68

-165

-115

-65

-15-0.21 -0.16 -0.11 -0.06 -0.01 0.04 0.09 0.14 0.19

E (V vs VKE)

I (nA)

2

1

Figuur 7.1 Cyclisch voltammogrammen van een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode in contact met

23,8 µmol L-1 HCC en 23,8 µmol L-1 CCP (1) in contact met 454 µmol L-1 H2O2 (2). Parameterinstellingen zie

tabel 7.1.

Tabel 7.1 Parameterinstellingen bij figuur 7.1, figuur 7.3 en figuur 7.4.


Om te weten of de katalyse reversibel verloopt wordt de eerste afgeleide van de stroom naar

de tijd genomen en uitgezet in functie van de potentiaal. Dit wordt getoond in figuur 7.2.

69

-15

-10

-5

0

5

10

15

-0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19

E (V vs VKE)

di/dt (nA/s)

Figuur 7.2 De afgeleide van de stroom naar de tijd van curve 2 uit figuur 7.1 uitgezet in functie van de

potentiaal.

Op figuur 7.2 worden duidelijk pieken waargenomen op de plaats van de sigmoïden. De

oxidatie- en de reductiepiek bevinden zich bij dezelfde potentiaal wat duidt op een reversibele

katalytische reactie.

Om aan te tonen dat alle componenten die aanwezig zijn aan de goudelektrode nodig zijn om

katalyse elektrochemisch waar te nemen, werden een aantal experimenten uitgevoerd waarbij

telkens een component werd weggelaten.

In een eerste experiment werd CCP weggelaten. Het goudoppervlak werd gemodificeerd met

4,4’-bipyridyl. Vervolgens werd HCC aan de druppel toegevoegd. Dan werd de

gemodificeerde goudelektrode in contact gebracht met waterstofperoxide. Dit experiment test

in feite of HCC de reductie van waterstofperoxide kan katalyseren. Figuur 7.3 toont dit

experiment.

70

-30

-20

-10

0

10

20

30

-0.21 -0.16 -0.11 -0.06 -0.01 0.04 0.09 0.14 0.19

E (V vs VKE)

I (µA)

1

2

Figuur 7.3 Cyclische voltammogrammen van een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode in contact

met 23,8 µmol L-1 HCC en 454 µmol L-1 H2O2. Parameterinstellingen zie tabel 6.1.

Curve 1 uit figuur 7.3 toont het elektrochemisch gedrag van 23,8 µmol L-1 HCC aan een met

4,4’-bipyridyl gemodificeerd goudoppervlak. De oxidatie- en reductiepieken die besproken

werden in hoofdstuk 5.2.1 komen ook hier tevoorschijn. Na toevoegen van 1 µl 10 mmol L-1

waterstofperoxide (454 µmol L-1 in de druppel) werd curve 2 bekomen. De respons van deze

curve is lager omdat HCC vrij gemakkelijk denatureert in contact met waterstofperoxide. Dit

proces wordt bleking genoemd. Er treedt geen katalyse op wat er op wijst dat CCP een

noodzakelijke component is voor het detecteren van waterstofperoxide aan de gemodificeerde

goudelektrode.

In een volgend experiment werd HCC weggelaten. Dat CCP niet elektrochemisch

detecteerbaar is aan 4,4’-bipyridyl werd reeds aangetoond in hoofdstuk 6.2. Maar dat de

katalyse elektrochemisch niet detecteerbaar is zonder HCC, werd nog niet aangetoond. Om dit

te onderzoeken werd de goudelektrode gemodificeerd met 4,4’-bipyridyl. Vervolgens werd

CCP aan de druppel toegevoegd. Daarna werd het gemodificeerde goudoppervlak in contact

gebracht met waterstofperoxide. Figuur 7.4 toont de resultaten van dit experiment.

71

-40

-30

-20

-10

0

10

20

-0.21 -0.16 -0.11 -0.06 -0.01 0.04 0.09 0.14 0.19

E (V vs VKE)

I (nA)

1

2

Figuur 7.4 Cyclische voltammogrammen van een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode in contact

met 23,8 µmol L-1 CCP (1) en met 455 µmol L-1 H2O2 (2). Parameterinstellingen zie tabel 6.1.

Curve 1 uit figuur 7.4 toont het elektrochemisch gedrag van 23,8 µmol L-1 CCP aan een met

4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode. Na toevoegen van 1 µl 10 mmol L-1

waterstofperoxide (455 µmol L-1 in de druppel) werd curve 2 bekomen. Ook hier wordt geen

katalyse waargenomen. Dus HCC is wel degelijk nodig om katalyse elektrochemisch te

detecteren aan een goudelektrode. De complexvorming tussen HCC en CCP is nodig om de

reductie van waterstofperoxide elektrochemisch te detecteren.

7.2 6-mercaptohexanol als linker

Het bovenstaande systeem werd ook getest met een andere linker dan 4,4’-bipyridyl, namelijk

6-mercaptohexanol. Deze linker gaf ook een reversibele respons met HCC (zie paragraaf

5.2.2).

72

-150

-100

-50

0

50

-0.31 -0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19E (V vs VKE)

I (nA)

1

2

Figuur 7.5 Cyclische voltamogrammen van een met 6-mercaptohexanol gemodificeerde goudelektrode in contact

met 23,8 µmol L-1 HCC en 23,8 µmol L-1 CCP (1) en in contact met 454 µmol L-1 H2O2 (2).


Figuur 7.5 maakt duidelijk dat de katalyse die we met 4,4’-bipyridyl elektrochemisch konden

detecteren ook mogelijk is met 6-mercaptohexanol. De parameterinstellingen van deze meting

worden getoond in tabel 7.1. Curve 1 toont hier CCP gemedieerd door HCC aan een met 6-

mercaptohexanol gemodificeerde goudelektrode. HCC en CCP worden telkens toegevoegd tot

een concentratie van 23,8 µmol L-1 in de druppel. Curve 2 toont het cyclisch voltammogram

na toevoegen van 1 µL 10 mmol L-1 waterstofperoxide (454 µmol L-1 in de druppel). De

sigmoïde vorm verschijnt duidelijk maar om iets te kunnen vertellen over de reversibiliteit

wordt de eerste afgeleide van de stroom naar de tijd uitgezet in functie van de potentiaal.



73

-15

-10

-5

0

5

10

15

-0.31 -0.21 -0.11 -0.01 0.09 0.19

E (V vs VKE)

di/dt (nA/s)

Figuur 7.6 De afgeleide van de stroom naar de tijd van curve 2 uit figuur 7.5 uitgezet in functie van de

potentiaal.

Figuur 7.6 toont duidelijk pieken op de plaats waar in figuur 7.5 de sigmoïden zich bevinden.

Hieruit kan besloten worden dat ook hier de katalyse elektrochemisch detecteerbaar is. Dit

doet vermoeden dat voor elke linker die een goede reversibiliteit vertoont met HCC het

systeem in staat is om katalyse elektrochemisch te detecteren. Verder onderzoek zal dit echter

moeten uitwijzen.

Wat is er nu allemaal nodig om waterstofperoxide te kunnen detecteren? Dit wordt getoond in

figuur 7.7.

-linker

-HCC

-CCP

-H2O2

Indien één van deze componenten ontbreekt:

geen katalyse waarneembaar!!!!

Deze 4 componenten zijn nodig aan het Au-oppervlak

om katalyse waar te nemen

-linker

-HCC

-CCP

-H2O2





-linker

-HCC

-CCP

-H2O2





Figuur 7.7 schematische voorstelling van de componenten noodzakelijk om katalyse waar te nemen.

74

Eerst en vooral het elektrodeoppervlak. Dit elektrodeoppervlak wordt gemodificeerd met een

linker die een goede reversibiliteit vertoonde met HCC. Vervolgens HCC dat

geïmmobiliseerd wordt op deze linker. Dan CCP dat op HCC geïmmobiliseerd wordt waarbij

een complex tussen HCC en CCP wordt gevormd en tot slot moet dit systeem in contact

gebracht worden met waterstofperoxide.

Voor de eventuele toepassing in de klinische diagnose, de chemische en farmaceutische

industrie en de biologische en medische wetenschappen is het zoals vermeld in de inleiding

van belang dat zeer lage concentraties aan waterstofperoxide gedetecteerd kunnen worden. In

dit onderzoek werd nagegaan of waterstofperoxide gedetecteerd kan worden. Daarom werd

steeds gebruik gemaakt van ongeveer 454 µmol L-1 waterstofperoxide in de druppel. Wat de

laagste concentratie waterstofperoxide is die gemeten kan worden moet nog verder

onderzocht worden.

75

Samenvatting en besluit

In dit werk werd onderzoek verricht naar de immobilisatie van eiwitten en redoxenzymen aan

al dan niet gemodificeerde elektroden.

Eerst werd nagegaan welke bufferoplossing het meest geschikt is om elektrochemische

metingen in uit te voeren bij pH 7. Door middel van cyclische voltammetrie werd vastgesteld

dat een HEPES bufferoplossing bij pH 7 de meest stabiele bufferoplossing is en het minste

interferentiepieken heeft in een potentiaalgebied van -0,2 V tot 0,2 V. Dit is het

potentiaalgebied waarin respons van de eiwitten of enzymen verwacht wordt.

Na dit vooronderzoek werd onderzoek verricht naar de immobilisatie van paardenhart

cytochroom c (HCC) aan een al dan niet gemodificeerde goudelektrode en een glasachtig

koolstofelektrode. Dit werd onderzocht met behulp van cyclische voltammetrie. Hierbij werd

gevonden dat een goudelektrode gemodificeerd met 4,4’-bipyridyl een zeer goede respons

geeft die het meest de reversibiliteit benadert. Ook een goudelektrode gemodificeerd met 6-

mercaptohexanol geeft een goede respons. De voltammetrische respons die wordt bekomen is

afkomstig van de oxidatie en reductie van het ijzerion in de haemgroep van HCC.

Vervolgens werd gepoogd Rhodobacter capsulatus cytochroom c peroxidase (CCP) te

immobiliseren aan een al dan niet gemodificeerde goudelektrode of glasachtig

koolstofelektrode. Aanvankelijk kon CCP elektrochemisch niet gedetecteerd worden. Dus

werd CCP geïmmobiliseerd met HCC als mediator. Hierbij werd HCC eerst geïmmobiliseerd

aan een met 4,4’-bipyridyl gemodificeerde goudelektrode. Deze gemodificeerde

goudelektrode werd vervolgens in contact gebracht met CCP. Hierbij was CCP zelf niet

elektrochemisch actief maar kon de immobilisatie gevolgd worden door de verschuiving van

de piekpotentiaal van HCC. Deze verschuiving bracht aan het licht dat HCC en CCP een

complex vormen.

Tot slot werd getracht waterstofperoxide te detecteren met het gevormde complex. Dit is

mogelijk omdat CCP in staat is om de reductie van waterstofperoxide te katalyseren. Deze

detectie lukte zeer goed waarbij de katalyse werd waargenomen als een sigmoïde vorm in het

cyclisch voltammogram. Er werd bekomen dat waterstofperoxide kan gedetecteerd worden

76

aan een goudelektrode gemodificeerd met een linker die een goede reversibiliteit vertoond

met HCC. Op dit gemodificeerde oppervlak wordt HCC geïmmobiliseerd. Daarna wordt CCP

toegevoegd zodat er een complex wordt gevormd tussen HCC en CCP. Dit systeem is in staat

om waterstofperoxide elektrochemisch te detecteren als waterstofperoxide aan het systeem

wordt toegevoegd.

77

Literatuurlijst

[1] Eddowes M.J., Hill H.A.O., J.C.S. Chem. Comm. 21 (1977) 771.

[2] Yeh P., Kuwana T., Chemistry Letters 10 (1977) 1145.

[3] Kafi A.K.M., Yin F., Shin H., Kwon Y., Thin Solid Films 499 (2006) 420.

[4] Heering H.A., Wiertz F.G.M., Dekker C., de Vries S., J. AM. Chem. Soc. 126

(2004) 11103.

[5] http://nl.wikipedia.org (mei 2006).

[6] Voet D., Voet J.G., Biochemistry, Second Edition, Wiley-VCH, New York,

1995.

[7] http://www.aecom.yu.edu/home/biophysics/rousseau/ctc/ctcw.gif (mei 2006).

[8] De Smet L., Savvides S.N., Van Horen E., Pettigraw G., Van Beeumen J.J.,

Journal of Biological Chemistry 281 (2006) 4371.

[9] Koh M., Meyer T.E., De Smet L., Van Beeumen J.J., Cusanovich M.A.,

Archives of Biochemistry and Biophysics 410 (2003) 230.

[10] De Smet L., Pettigraw G.W., Van Beeumen J.J., Eur. J. Biochem. 268 (2001)

6559.

[11] http://dwp.fcroc.nl/microbiologie/images/Image13.gif (november 2005).

[12] Bowden E.F., Hawkridge F.M., Chlebowski J.F., Bancroft E.E., Thorp C.,

Blount H.N., J. Am. Chem. Soc. 104 (1982) 7641.

[13] Niki K., Yagi T., Inokuchi H., Kimura K., J. Am. Chem. Soc. 101 (1979) 3335.

[14] Eddowes M.J., Hill H.A.O., J. Am. Chem. Soc. 101 (1979) 4461.

[15] Guilbault G.G., Kauffmann J.-M., Patriarche G.J., Protein immobilization,

Taylor R.F. (Ed.), Marcel Dekker, New York, 1991.

[16] Bowden, E.F., Hawkridge, F.M., Blount H.N., J. Electroanal. Chem. 161

(1984) 355.

[17] Davis J.J., Hill H.A.O., Bond A.M., Coordination Chem. Reviews 200-202

(2000) 411-442.

[18] Hill H.A.O., Davis J.J., Biochem. Soc. Trans. 27 (1999) 331.

[19] Gilardi G., den Blaauwen T., Canters G. W., J. Controlled Release 29 (1994)

231.

[20] Armstrong F.A., Wilson G.S., Electrochim. Acta 45 (2000) 2623.

[21] Jeuken L.J.C., Biochimica et Biophysica Acta 1604 (2003) 67.

78

[22] Page C.C., Moser C.C., Chen X., Dutton P.L., Nature 402 (1999) 47.

[23] Bard A.J., Stratmann M., Encyclopedia of Electrochemistry volume 9:

Bioelectrochemistry, (Ed.) Wilson G.S., Wiley, Weinheim, 2002.

[24] De Wael K., Elektrochemische studie van een goudelektrodeoppervlak

gemodificeerd door het immobiliseren van transitiemetaalionftalocyanines en

–porfyrines, Scriptie, UGent, 2005.

[25] Bard J., Faulkner L.R., Electrochemical Methods Fundamentals and

Applications, Wiley, New York, 2001.

[26] Kissinger P.T., Heineman W.R., Laboratory Techniques in Electroanalytical

Chemistry, Marcel Dekker, New York, 1994.

[27] Oldham K.B., Myland J.C., Fundamentals of Electrochemical Science,

Academic Press, New York, 1994.

[28] Maloy J.T., J. Chem. Educ. 60 (1983) 285.

[29] Sevcik A., Collect. Czech. Chem. Commun. 13 (1948) 349.

[30] Randles J.E.B., Trans. Faraday Soc. 44 (1948) 327.

[31] Brett C.M.A., Brett A.M.O., Electrochemistry: Principles, Methods and

Applications, Oxford University Press, Oxford, 1993.

[32] Nicholson R.S., Shain I., Anal. Chem. 36 (1964) 706.

[33] Nicholson R.S., Anal. Chem. 37 (1965) 1351

[34] Perone S.P., Anal. Chem. 38 (1966) 1158.

[35] Noel M., Vasu K.I., Cyclic Voltammetry and the Frontiers of Electrochemistry,

Aspect Publications, London, 1990.

[36] Laviron E. J. Electroanal. Chem. 52 (1974) 355.

[37] Laviron E. J. Electroanal. Chem. 52 (1974) 395.

[38] Srinivasan S., Gileadi E., Electrochim. Acta 13 (1968) 721.

[39] Bockris J.O’M., Khan S.U.M., Surface Electrochemistry: A Molecular Level

Approach, Plenum Press, New York, 1993.

[40] Pelletier M.J., Arbor A., Analytical Applications of Raman Spectroscopy,

Blackwell Science, Oxford, 1999.

[41] Southampton Electrochemistry Group, Instrumental Methods in

Electrochemistry, 229, Horwood Publishing Ltd, 2001.

[42] http://www.radiometer-analytical.com (mei 2006)

[43] http://www.bioanalytical.com (mei 2006)

79

[44] Zumdahl S.S., Chemical Principles Second Edition, D.C. Heath and Company,

Lexington, 1995.

[45] Eco Chemie B.V., User Manual for General Purpose Electrochemical System

for Windows, Utrecht, 1996.

[46] Uosaki K., Hill H.A.O., J. Electroanal. Chem. 122 (1981) 321.

[47] Eddowes M.J., Hill H.A.O., J. Am. Chem. Soc. 101 (1979) 7113.

[48] Bard A.J., Encyclopedia of Electrochemistry of the Elements Volume IV,

Marcel Dekker, New York, 1975.

[49] Bard A.J., Encyclopedia of Electrochemistry of the Elements Volume VII,

Marcel Dekker, New York, 1976.

[50] Chen P., McCreery R.L., Anal. Chem. 68 (1996) 3958.

[51] Yang Y., Lin Z., J. Elektroanal. Chem. 364 (1994) 23.

[52] Unpublished results, Borloo et al. 2006.

[53] Vitello L.B., Erman J.E., Archives of Biochemistry and Biophysics, 258 (1987)

621.

[54] Erman J.E., Kim, K.L., Vitello L.B., Moench S.J., Satterlee J.D., Biochimica

et Biophysica Acta 911 (1987) 1.

Immobilisatie van redoxenzymen op elektrodeoppervlakken...

Documents

Transcript of Immobilisatie van redoxenzymen op elektrodeoppervlakken...