Hoofdstuk 10 - Audesirk
-
Upload
pascal-van-de-nieuwegiessen -
Category
Education
-
view
567 -
download
0
Transcript of Hoofdstuk 10 - Audesirk
Gene Expression and Regulation
Hoofdstuk 10
2010/2011
GENEXPRESSIEDeel 1
2
Waar coderen genen voor?
• Hoe codeert DNA voor cellen & lichamen?
3
eiwit cel lichaamDNA
Het “Centrale Dogma”
• Stroom van genetische informatie in een cel
– Hoe vervoeren we informatie van DNA naar eiwitten?
4
replicatie
proteinRNADNA eigenschap
Metabolisme geeft het antwoord
• Erfelijkheid van stofwisselingsziekten
– suggereert dat genen coderen voor enzymen
– elke ziekte (fenotype) wordt veroorzaakt door een niet-functioneel genprodukt• gebrek aan een enzym
• Tay-Sachs
• PKU (phenylketonuria)
• albinisme
5
A B C D E
ziekte ziekte ziekte ziekte
enzym 1 enzym 2 enzym 3 enzym 4
metabole pathway
Beadle & Tatum
6
George Beadle
Edward Tatum
"for their discovery that genes act by regulating definite chemical events"
één gen : één enzym hypothese
Wild-typeNeurospora
Minimaalmedium
Selecteer eenspore
Groeien op eencompleet medium
Minimalecontrole
Nucleicacid
CholinePyridoxine RiboflavinArginine
Minimaal medium verrijkt met
ThiamineFolicacid
NiacinInositolp-Aminobenzoic acid
Testen op een minimaalmedium om de mutatieaan te tonen
Groeien op eencompleet medium
Röntgenstraling
asexuelesporen
sporen
Beadle & Tatum
creëer een mutatie
positieve controle
negatieve controle
experimenten
supplementen7
mRNA
Van gen tot eiwit
DNAtranscriptie
kern cytoplasma
aa
aa
aaa
a
aa
aa
a
a
aaa
eiwittranslatie
ribosoom
eigenschap8
Transcriptie
9
RNA
• ribose suiker
• N-basen
– uracil in plaats van thymine
– U : A
– C : G
• enkele streng
• verschillende soorten RNAs
– mRNA, tRNA, rRNA, siRNA…
10RNADNA
transcriptie
Transcriptie
• mRNA maken– gekopieerde DNA streng = template streng
– niet- gekopieerde DNA streng = coderende streng• zelfde basenvolgorde als RNA
– synthese van een complementaire RNA streng
– enzym• RNA polymerase
11template streng
opwinden
mRNA RNA polymerase
ontwinden
coderende streng
DNAC C
C
C
C
C
C
C
C CC
G
GG
G
G G
G G
G
G
GA
A
AA A
A
A
A
A
A A
A
AT
T T
T
T
T
T
T
T T
T
T
U U
5
3
5
3
3
5RNA bouwen 53
Welk gen wordt gelezen?
• Promoter regio
– bindingsplaats vlak voor de start van het gen
– TATA box bindingsplaats
– bindingsplaats voor RNA polymerase
12
Paren van DNA & RNA basen
• Paar RNA basen aan DNA basen op een van de DNA strengen
13
U
A G GGGGGT T A C A C T T T T TC C C CA A
U
UU
U
U
G
G
A
A
A C CRNA
polymerase
C
C
C
C
C
G
G
G
G
A
A
A
AA
5' 3'
Eukaryotische genen hebben junk!
• Eukaryotische genen bestaan uit exonen en intronen
– exon = het echte gen• DNA wat tot expressie komt
– intron = “rotzooi”• ligt tussen exonen in
14
eukaryotische DNA
exon = coderend
intron = niet-coderend
mRNA splicing
• Eukaryotisch mRNA moet nog verder bewerktworden
– primaire transcript = pre-mRNA
– mRNA splicing• intronen verwijderen
15
DNA
exon = coderend
intron = niet-coderend
pre-mRNA
mRNA
~10,000 basen
~1,000 basen
Alternatieve splicing
• Alternatieve mRNA’s geproduceeerd uit hetzelfde gen
– wanneer is een intron een intron…
16
AmRNA
5'
3'
G PPP
Een laatste bewerking…
• mRNA moet beschermd worden tegen het milieu in het cytoplasma– enzymen in cytoplasma vallen mRNA aan
• bescherm de uiteinden van het molecuul
• toevoeging 5 GTP cap
• toevoeging poly-A staart
17
mRNA
Van gen tot eiwit
DNAtranscriptie
kern cytoplasma
aa
aa
aaa
a
aa
aa
a
a
aaa
eiwittranslatie
ribosoom
eigenschap18
Translatie
19
Hoe codeert mRNA voor eiwitten?
20
TACGCACATTTACGTACGCGGDNA
AUGCGUGUAAAUGCAUGCGCCmRNA
MetArgValAsnAlaCysAlaeiwit
?
4
4
20
ATCG
AUCG
AUGCGUGUAAAUGCAUGCGCCmRNA
mRNA codeert in tripletten
21
TACGCACATTTACGTACGCGGDNA
AUGCGUGUAAAUGCAUGCGCCmRNA
Met Arg Val Asn Ala Cys Alaeiwit
?
codon
Kraken van de code
• Crick
– beschreef het 3-letter (triplet) codon systeem
• Nirenberg & Khorana
– beschreven de RNA–aminozuur koppeling
– voegden kunstmatig mRNA toe aan een reageerbuis met ribosomen, tRNA & aminozuren
• er werd UUUUUUU… mRNA gevormd
• dit leidde tot de vorming van phenylalanine
22
WHYDIDTHEREDBATEATTHEFATRATWHYDIDTHEREDBATEATTHEFATRAT
De code
• Code voor al het leven!
23
Start codon
• AUG
• methionine
Stop codons
• UGA, UAA, UAG
Koppeling codon - aminozuur?
24
TACGCACATTTACGTACGCGGDNA
AUGCGUGUAAAUGCAUGCGCCmRNA
aminozuur
tRNA anti-codon
codon
5 3
3 5
3 5
UAC
MetGCA
Arg
CAU
Val
mRNA
Van gen tot eiwit
DNAtranscriptie
kern cytoplasma
aa
aa
aaa
a
aa
aa
a
a
aaa
eiwittranslatie
ribosoom
eigenschap25
Structuur Transfer RNA
• “Klaverblad” structuur
– anticodon op het uiteinde van het “klaverblad”
– aminozuur op 3
26
Ribosomen
• Maken koppeling tussentRNA anticodon en het mRNA codon mogelijk
– organel of enzym?
• Structuur
– ribosomaal RNA (rRNA) & eiwitten
– 2 subunits• groot
• klein
E P A
27
• A site (aminoacyl-tRNA site)
– tRNA met nieuwe aminozuur
• P site (peptidyl-tRNA site)
– tRNA met groeiende polypeptide (eiwit) keten
• E site (exit site)
– lege tRNA verlaat het ribosoomvanaf de exit site
Ribosomen
Met
5'
3'
UUA C
A G
APE28
Een eiwit bouwen• Initiatie
– samenbrengen van mRNA, rRNA en tRNA
• Elongatie– aminozuren toevoegen, gebaseerd
op de codon volgorde
• Terminatie– stop codon 123
Leu
Leu Leu Leu
tRNA
Met MetMet Met
PE A
mRNA5' 5' 5' 5'
3' 3' 3'3'
U UA AAAC
CC
AU UG GGU
UA
AAAC
CC
AU UG GGU
UA
AAAC
CC
AU UG GGU U
AAAC
CA U UG G
ValSer
AlaTrp
releasefactor
AA A
CCU UGG 3'
29
DNA
pre-mRNA
ribosoom
tRNA
aminozuren
polypeptide
mRNA
5' GTP cap
poly-A tail
grote subunit
kleine subunitE P A
5'
3'
RNA polymerase
exon introntRNA
30
Eiwitsynthesein
prokaryoten
Bacterial chromosome
mRNA
Cell wall
Cellmembrane
Transcription
Prokaryoten vs. Eukaryoten• Prokaryoten
– DNA in cytoplasma
– circulair chromosoom
– “naakt” DNA
– geen intron
• Eukaryoten
– DNA in kern
– lineair chromosoom
– DNA gewonden omhistonen
– intron vs. exon
eukaryotischDNA
exon = coderend
intron = niet-coderend
32
• Transcriptie & translatie gelijktijdig in bacteriën
– DNA in cytoplasma
– geen mRNA bewerking
– ribosomenlezen mRNA terwijl transcriptienog bezig is
Translatie in Prokaryoten
33
Translatie: prokaryoten vs. eukaryoten
34
MUTATIESDeel 2
35
Mutaties
• Puntmutaties– 1 base verandert
– substitutie• silent mutatie
– hetzelfde aminozuur
• missense mutatie– ander aminozuur
• nonsense mutatie– verandering in stop codon
36
Sikkelcelanemie
37
Sikkelcelanemie
38
Mutaties
• Frameshift– insertie
• toevoeging base(n)
– deletie• verlies base(n)
39
Cystic fibrosis
• Meest voorkomende autosomaalrecessieve aandoening in W-Europa
– 1 op 2500
– normale allel codeert voor een membraaneiwit dat Cl-
over het membraan transporteert• defect of afwezig kanaal beperkt het transport van Cl- (& H2O)
over het membraan
• dik en plakkerig slijm rondom cellen
– met name in alvleesklier, longen, maag-darmstelsel
– leidt tot bacteriële infecties
– zonder behandeling <5 jaarmet behandeling >20 jaar
40
Deletie leidt tot CF
delta F508
41
GENREGULATIE PROKARYOTENDeel 3
42
Bacterieel metabolisme
• Bacteriën moeten snel reageren op veranderingen in hun omgeving
– als ze genoeg van een bepaald product hebben moeten ze de productie stoppen• waarom? zonde van de energie om meer te maken
• hoe? productie stoppen van het product
– als ze een nieuwe voedselbron vinden moeten ze die snel benutten• waarom? metabolisme, groei, reproductie
• hoe? productie starten van de benodigde enzymen
UIT
AAN
43
Reguleren metabolisme?
• Feedback inhibitie
– product werkt als eenrem op 1e enzym in de tryptofaan productie
– maar waarom überhauptenzymen produceren?
44
= inhibitie-
-
Andere manier van regulatie
• Genregulatie
– in plaats van het enzymblokkeren kan ook de transcriptie van de enzymen geblokkeerdworden• kost minder energie
45
= inhibitie-
-
-
Genregulatie in bacteriën
• Cellen variëren de hoeveelheid enzymen door gentranscriptie te reguleren
– schakel genen aan of schakel genen uit• Voorbeeld 1
als bacteriën genoeg tryptofaan hebben stoppen ze met het maken van enzymen die tryptofaan maken
• Voorbeeld 2als een bacterie een nieuwe suiker tegenkomt (bv. lactose), dan zal het enzymen moeten maken om lactose te verteren
46
STOP
GO
Bacteriën groeperen genen
• Operon– genen met vergelijkbare functie gegroepeerd
• bijvoorbeeld: all enzymen in een metabolic pathway
– promoter = RNA polymerase bindingsplaats• één promoter bepaalt de transcriptie van allen genen in het
operon
– operator = DNA bindingsplaats voor een repressoreiwit
47
Uitschakelen van genen?
• Repressoreiwit
– bindt aan de operator
– blokkeert RNA polymerase
– blokkeert transcriptie
48
operatorpromoter
Operon model
Operon: operator, promoter & genen die zij reguleren
een model voor genregulatie
49
DNATATA
RNApolymerase
repressor
repressor = repressoreiwit
gen1 gen2 gen3 gen4RNA
polymerase
1 2 3 4mRNA
enzym1 enzym2 enzym3 enzym4
Wanneer er een overmaat van tryptofaan is bindt dit aan het tryprepressor eiwit : repressor bindt aan DNA
– blokkeert transcriptie
mRNA
enzym1 enzym2 enzym3 enzym4
operatorpromoter
Repressible operon: tryptofaan
50
DNATATA
RNApolymerase
tryptofaan
repressor repressoreiwit
repressortryptofaan – repressoreiwitcomplex
gen1 gen2 gen3 gen4
vormverandering in het repressoreiwit!
1 2 3 4
repressortrpRNApolymerase
trp
trp
trp trp
trp trp
trptrp
trp
trp
trp
Tryptofaan operon
51Tryptofaan is een allosterische regulator van het repressoreiwit
Als lactose aanwezig is bindt et aan het lac repressoreiwit & zorgt ervoordat de respressor loskoppelt van het DNA
– start transcriptie
mRNA
enzym1 enzym2 enzym3 enzym4
operatorpromoter
Inducible operon: lactose
52
DNATATARNApolymerase
repressor repressoreiwit
repressor lactose – repressoreiwit complex
lactose
lac repressor gen1 gen2 gen3 gen4
RNApolymerase
1 2 3 4
lac lac
laclac
lac
lac
lac
lac
lacvormverandering in het
repressoreiwit!
Lactose operon
53
Lactose is een allosterische regulator van het repressoreiwit
Samenvatting operon
• Repressible operon
– doorgaans betrokken bij anabolisme
• maken van producten
– als het product voldoende aanwezig is gebruikt de cel
zijn energie voor andere processen
• Inducible operon
– doorgaans betrokken bij katabolisme
• afbreken van voedingsstoffen tot kleinere moleculen
– enzymen worden alleen geproduceerd als de
voedingsstof aanwezig is
• voorkomt dat enzymen gemaakt worden die niets te doen
hebben 54
Einde
Opdracht
A. Verzin zelf een nucleotidenvolgorde van een stuk dubbelstrengs DNA waarin een start- en stopcodon
zit. Neem in je DNA sequentie ook een promoter en een terminator op. De term ‘sequentie’ betekent
nucleotidenvolgorde.
i Op de coderende streng vind je het startcodon terug als ATG
ii Gebruik TAA als stopcodon op de coderende streng
iii Zorg dat het stuk tussen start- en stopcodon voor zes aminozuren codeert.
iv Gebruik als promotorsequentie op de coderende streng: TAATAT. De transcriptie start 10
nucleotiden na deze sequentie.
v Gebruik als terminatorsequentie op de coderende streng: CTGGCGGC. De transcriptie stopt 2
nucleotiden na deze sequentie.
vi Let op: vanaf de plek waar transcriptie start volgen eerst een aantal willekeurige nucleotiden
voordat je het startcodon tegenkomt. Hetzelfde geldt voor aan het einde van het gen. Na het
stopcodon volgen een aantal willekeurige nucleotiden, voordat de terminator het einde van
transcriptie aangeeft.
B. Schrijf onder de DNA sequentie de mRNA volgorde.
C. Geef met pijltjes aan waar de translatie begint en eindigt.
56