HET GEBRUIK VAN DICENTRISCHE ......Voorwoord Het heeft mij bloed, zweet en tranen (én veel...

HET GEBRUIK VAN DICENTRISCHE CHROMOSOOMABERRATIES

VOOR HET BEPALEN VAN DE OPGELOPEN STRALINGSDOSIS BIJ

EEN GEDEELTELIJKE LICHAAMSBESTRALING TIJDENS EEN

STRALINGSACCIDENT

Aantal woorden: 18789

Celine Schipman Stamnummer: 01200238

Promotor: Prof. dr. Anne Vral

Copromotor: Dr. Julie Depuydt

Vakgroep: Medische Basiswetenschappen

Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de richting Master of Science in de

Biomedische Wetenschappen

Academiejaar: 2016 - 2017

Voorwoord

Het heeft mij bloed, zweet en tranen (én veel ‘telwerk’) gekost om deze thesis tot stand te

brengen.

Allereerst hartelijk dank aan Prof. Dr. Vral, dank u wel voor het delen van uw expertise, dank u

wel voor het nalezen van mijn thesis en uw feedback.

Julie, dank u wel voor uw hulp en feedback, het beantwoorden van mijn vele vragen en het

meehelpen twijfelen over het antwoord op de vraag ‘is dat een dicentrisch chromosoom of niet?’.

Annelot en Leen, bedankt omdat ik ook bij jullie terecht kon met mijn vragen.

Medestudenten op het labo, bedankt voor de aangename en plezante pauzes.

Astrid, de beste en liefste kotvriendin, een dikke merci om steeds voor mij klaar te staan.

Last, but definitely not least, mijn ouders en vriend, een speciaal woordje van dank voor jullie

motivatie, luisterend oor, engelengeduld en liefde van de voorbije jaren.

Bedankt allemaal voor jullie steun!

Celine

Inhoudstafel

Samenvatting ......................................................................................................................................... 1

Abstract .................................................................................................................................................. 2

1 Inleiding ......................................................................................................................................... 3

1.1 Stralingsaccidenten ..................................................................................................... 3

1.2 Ioniserende straling ..................................................................................................... 5

1.2.1 DNA schade en chromosoomaberraties .............................................................. 5

1.2.2 Gezondheidseffecten wegens stralingsblootstelling ............................................ 8

1.3 Dosimetrie .................................................................................................................... 9

1.3.1 Klinische dosimetrie ............................................................................................. 9

1.3.2 Fysische dosimetrie .............................................................................................. 9

1.3.3 Biologische dosimetrie ....................................................................................... 10

1.3.4 Europese netwerken voor dosimetrie ................................................................ 11

1.4 De dicentrische test als biologische dosimeter in stralingsaccidenten ..................... 12

1.4.1 Dicentrische analyse .......................................................................................... 12

1.4.2 Automatisatie van de dicentrische test .............................................................. 15

1.4.3 De dicentrische test met telomeer- en centromeerprobes ................................. 16

1.4.4 De dicentrische test voor partiële lichaamsbestraling........................................ 17

1.5 Doelstelling ................................................................................................................ 19

2 Materiaal en methoden ............................................................................................................... 20

2.1 In vitro simulatie van volledige en partiële lichaamsbestralingen ............................. 20

2.2 Cultuur en fixatie procedure ...................................................................................... 20

2.3 Giemsa-kleuring ......................................................................................................... 21

2.4 Fluorescentie in situ hybridisatie met telomeer- en centromeerprobes .................... 21

2.5 Inscannen van de slides en acquisitie van metafase cellen ..................................... 23

2.5.1 MSearch Classifier ............................................................................................. 23

2.5.2 Autocapt Classifier ............................................................................................. 23

2.6 Scoren van dicentrische chromosoomaberraties ...................................................... 24

2.7 Statistische analyse ................................................................................................... 24

3 Resultaten .................................................................................................................................... 27

3.1 MSearch Classifier ..................................................................................................... 27

3.2 Dosis-respons curves ................................................................................................ 27

3.2.1 FISH-TC dosis-respons curve ............................................................................ 27

3.2.2 Vergelijking FISH-TC en Giemsa dosis-respons curve ..................................... 30

3.2.3 Validatie dosis-respons curves .......................................................................... 30

3.3 Partiële lichaamsbestraling ........................................................................................ 34

3.4 Realizing the European Network of Biodosimetry ..................................................... 39

4 Bespreking ................................................................................................................................... 40

4.1 MSearch Classifier ..................................................................................................... 40

4.2 Dosis-respons curves ................................................................................................ 40

4.2.1 FISH-TC dosis-respons curve ............................................................................ 40

4.2.2 Validatie dosis-respons curves .......................................................................... 43

4.3 Partiële lichaamsbestraling ........................................................................................ 44

4.4 Realizing the European Network of Biodosimetry ..................................................... 47

5 Algemeen besluit ......................................................................................................................... 48

6 Referentielijst .............................................................................................................................. 49

Bijlagen .................................................................................................................................................... I

Bijlage A................................................................................................................................... I

Bijlage B.................................................................................................................................. II

Bijlage C ................................................................................................................................ IV

1

Samenvatting

Achtergrond: De dicentrische chromosoomaberratie (DCA) test is de meest gebruikte techniek

in de biologische dosimetrie. Bovendien is de DCA test meestal in staat om een partiële

lichaamsbestraling te detecteren. Voor elke scoringsmethode, automatische scoring (AS G),

semi-automatische scoring I (SAS I G) en semi-automatische scoring II (SAS II G) na Giemsa-

kleuring en semi-automatische scoring II (SAS II TC) in combinatie met FISH telomeer en

centromeer (TC) kleuring, werd in de onderzoeksgroep reeds een in vitro dosis-respons curve

opgesteld. De doelstellingen van deze studie waren om de verschillende dosis-respons curves te

valideren en de bruikbaarheid van de DCA test in combinatie met de FISH-TC-kleuring (SAS II

TC) voor partiële lichaamsblootstellingen te evalueren.

Methoden: Om de dosis-respons curves te valideren, werden bloedstalen van twee gezonde

donoren bestraald met een 60Co-bron bij verschillende dosissen (0, 1, 2 en 4 Gy). Voor de

evaluatie van de DCA test in combinatie met de FISH-TC-kleuring in het geval van partiële

lichaamsbestralingen, werden negen partiële lichaamsbestralingen per donor gesimuleerd door

bestraald (2 en 4 Gy) bloed te mengen met niet bestraald bloed in verschillende verhoudingen.

Resultaten: De SAS II TC methode was de enige scoringsmethode die voor beide donoren en

voor alle gesimuleerde volledige lichaamsbestralingen leidde tot een goede inschatting van de

dosis. In het geval van de gesimuleerde partiële lichaamsbestralingen, de SAS II TC methode

was in staat om deze als een PBE te detecteren. De ingeschatte volledige en partiële

lichaamsdosissen en bestraalde fracties bekomen aan de hand van de SAS II TC methode in

deze studie waren in de meeste gevallen accurater dan de inschattingen verkregen via de SAS II

G methode in een vorige studie van de onderzoeksgroep.

Besluiten: Deze eerste resultaten tonen aan dat de SAS II TC methode een bruikbare methode

is voor het bepalen van het type blootstelling in het geval van een stralingsaccident en eventueel

een goed alternatief zou kunnen zijn voor de SAS II G methode. Vooraleer deze methode te

implementeren in de biologische dosimetrie is optimalisatie en bijkomend onderzoek nodig.

2

Abstract

Background: The dicentric chromosome aberration (DCA) assay is the “gold standard” of

biological dosimetry and has the capability to detect partial-body exposures (PBE). Dose effect

curves were already established in the research group for different scoring methods: automatic

scoring (AS G), semi-automatic scoring I (SAS I G) and semi-automatic scoring II (SAS II G) in

case of Giemsa staining and semi-automatic scoring II (SAS II TC) in combination with FISH

telomere and centromere (TC) staining. The purposes of this study were to validate the different

dose-response curves and to evaluate the usefulness of the dicentric assay in combination with

the FISH-TC-staining in case of a partial-body exposure.

Methods: To validate the dose effect curves, blood samples from two healthy donors were

irradiated with 60Co gamma rays, simulating whole-body exposures (WBE) (0,1, 2 and 4 Gy). To

investigate the application of DCA for partial-body exposure, nine partial-body irradiations were

simulated for each donor by mixing non-irradiated and irradiated (2 and 4 Gy) blood in various

proportions.

Results: The SAS II TC method was the best method for individual dose estimation in case of

the simulated WBE. For simulated PBE, it was possible to detect these as partial-body

irradiations with the SAS II TC method. The estimated whole and partial body doses and

irradiated fractions obtained in this study with the SAS II TC method were more accurate

compared to the SAS II G results obtained in a previous study of the research group.

Conclusions: This study demonstrates that the SAS II TC method can be an alternative for the

SAS II G in case of accidental exposures. However, additional optimization is needed to fully

evaluate the application of the FISH-TC scoring method in biological dosimetry.

3

1 Inleiding

1.1 Stralingsaccidenten

De populatie wordt voortdurend blootgesteld aan ioniserende straling (IR), zowel aan natuurlijke

achtergrondstraling, zoals kosmische straling en straling afkomstig van radioactieve elementen in

de bodem, als aan artificiële stralingsbronnen [1]. Door het toenemend gebruik van IR in de

industrie, de medische wereld (therapeutisch en diagnostisch), de landbouw en het onderzoek

neemt de waarschijnlijkheid dat een stralingsongeval zal plaatsvinden toe. Daarnaast is er een

toenemende dreiging voor terroristische nucleaire aanslagen [1, 2]. In het geval van een

stralingsaccident is het inschatten van de dosis aan dewelke het (de) slachtoffer(s) is (zijn)

blootgesteld (=dosimetrie) onontbeerlijk om een aangepaste medische begeleiding/behandeling

te verzekeren [3].

In het geval van een stralingsaccident kunnen verschillende scenario’s zich voordoen (Tabel 1).

Stralingsongevallen waarbij een grote populatie betrokken is, zoals een kernramp of een

nucleaire terroristische aanslag, vereisen een andere aanpak dan kleinschalige

stralingsaccidenten.

Tabel 1: Mogelijke situaties van stralingsaccidenten [3].

4

Wanneer een grootschalig stralingsaccident zich voordoet, is er een breed spectrum aan

slachtoffers en kan medisch management problematisch zijn. Effectieve planning en triage zullen

de klinische zorg bespoedigen en het gebruik van de beschikbare klinische faciliteiten

maximaliseren. Triage verwijst naar het beoordelen en sorteren van de slachtoffers in

verschillende categorieën volgens de ernst van blootstelling: <1 Gy, 1-2 Gy en >2 Gy. Het doel is

om prioriteiten te stellen en te bepalen welke individuen het meest dringend medische hulp

vereisen (> 2 Gy) en welke individuen geen onmiddellijke zorg nodig hebben (< 1Gy). Hierbij is

een snelle dosisbepaling (high-throughput dosimetry) essentieel. Triage zal verwezenlijkt worden

aan de hand van een multiparamater aanpak, waarbij gebruik zal gemaakt worden van én

klinische én fysische én biologische dosimetrie. Pas nadat dat initiële urgentie van triage

dosimetrie voorbij is, zal overgaan worden tot een accuratere individuele inschatting van de

ontvangen dosis [3, 4].

Een voorbeeld van een grootschalig stralingsaccident is de kernramp van Tsjernobyl (Oekraïne)

dat plaatsvond op 26 april 1986, waarbij reactoreenheid 4 ontplofte. Door deze explosie kwamen

grote hoeveelheden radioactieve stof vrij in de omgeving. Het gebied met een straal van 30

kilometer rond de geëxplodeerde reactor werd volledig geëvacueerd. Van de 600 werknemers

aanwezig op het moment van het accident en de daaropvolgende uren stierven 28 mensen

binnen de eerste vier maanden ten gevolge van de stralingsblootstelling en werd bij 106

werknemers de diagnose van acute stralingsziekte gesteld [5]. De meest recente kernramp vond

plaats op 11 maart 2011 in Japan. De aardbeving en de daaropvolgende tsunami leidden tot de

fusie van de splijtstof van verschillende eenheden van de kerncentrale van Fukushima Daiichi en

tot een significante besmetting van verschillende honderden vierkante kilometer op het

grondgebied van Japan. Meer dan 80000 personen werden geëvacueerd in een straal van 20 tot

30 kilometer rond de site [6].

Bij stralingsongevallen met een beperkt aantal slachtoffers staat een nauwkeurige dosisbepaling

op de voorgrond. In januari 2003 kwam het stralingsongeval van een 41-jarige man aan het licht

toen hij naar de kliniek ging wegens huidletsels ter hoogte van het abdomen en de rug. De man

was verantwoordelijk voor het elektronisch onderhoud van de x-stralen apparatuur in een

ziekenhuis. De huidletsels waren waarschijnlijk het gevolg van een beroepshalve blootstelling

aan straling tijdens het herstellen van het waterkoelsysteem van de x-stralenbuis op 4 oktober

2002. Op het moment van de blootstelling droeg hij zijn schort met zijn persoonlijke dosimeter

niet. Een bloedstaal werd opgestuurd naar het biodosimetrie laboratorium van de Universiteit

Gent. De dicentrische chromosoomaberratie test werd toegepast voor het bevestigen van de

stralingsblootstelling en het bepalen van de ontvangen dosis. De ingeschatte volledige

lichaamsdosis was 0,75 Gy. De dicentrische test detecteerde een partiële lichaamsbestraling, er

werd bekomen dat 49% van het lichaam werd blootgesteld aan een dosis van 1,1 Gy [7].

5

Tijdens een stralingsaccident wordt in de meeste gevallen, zoals in het vorige voorbeeld, niet het

volledige lichaam van het slachtoffer blootgesteld aan straling maar slechts een gedeelte ervan

[8, 9]. De prognose en de medische behandeling van het blootgestelde individu zal afhangen van

het feit of dat het volledige lichaam of slechts een gedeelte van het lichaam werd blootgesteld

aan straling. Bij eenzelfde dosis is de impact op de gezondheid van het individu groter bij een

volledige lichaamsbestraling dan bij een partiële lichaamsbestraling. Een volledige

lichaamsbestraling van ongeveer 3,5 Gy zal bij 50% van de gevallen resulteren in de dood

binnen de twee maanden bij afwezigheid van een medische behandeling [3, 10]. Wanneer de

accidentele situatie onduidelijk is, is een methode dat volledige lichaamsbestraling kan

onderscheiden van partiële lichaamsbestraling onmisbaar en is het essentieel dat aan de hand

van deze methode de blootgestelde fractie en de dosis van het blootgestelde gebied kan

ingeschat worden. De dicentrische test is hiertoe meestal in staat [9, 11].

1.2 Ioniserende straling

Ioniserende straling (IR) is straling die voldoende energie bezit om fysische veranderingen,

namelijk excitaties en ionisaties, in het blootgestelde medium te veroorzaken en wordt

onderverdeeld in corpusculaire straling en elektromagnetische straling (EMS). Voorbeelden van

corpusculaire stralingen zijn neutronen, alfa-deeltjes en bèta-deeltjes. X- en γ-stralen behoren tot

de EMS [2].

Ioniserende straling wordt ook onderverdeeld op basis van de Lineaire Energie Transfer (LET)

van de straling. De fysische grootheid LET wordt gedefinieerd als de hoeveelheid energie

afgezet langs het pad van het ioniserende deeltje per eenheid van weglengte (keV/µm). Lage

LET stralen, zoals β-deeltjes, X- en γ-stralen, worden gekarakteriseerd door geïsoleerde of

verspreide ionisaties. Hoge LET stralen, zoals α-straling en neutronen, worden gekenmerkt door

een lokale afzetting van energie wat resulteert in een zeer dens ionisatiepatroon. Bij hoge LET

straling is de DNA schade veel complexer en moeilijker herstelbaar [12].

1.2.1 DNA schade en chromosoomaberraties

Het DNA in de celkern wordt beschouwd als een stralingsgevoelig doelwit. IR kan verschillende

vormen van DNA schade veroorzaken, zoals enkel- en dubbelstrengige DNA breuken (ssb en

dsb), verlies of beschadiging van basen, DNA-proteïne cross-links, DNA dimeren en

suikerschade. Foutief of geen herstel van DNA schade kan leiden tot mutaties,

chromosoomaberraties, genetische instabiliteit en celdood. Van alle DNA schade veroorzaakt

door IR zijn DNA dsb het meest schadelijk voor de cel, doordat de integriteit van beide strengen

is aangetast [12].

6

Herstel van DNA dsb gebeurt hoofdzakelijk via twee pathways: homologe recombinatie (HR) en

non-homologous end-joining (NHEJ). HR zal de DNA dsb correct herstellen (error free) met

behulp van het aanwezige niet beschadigde zusterchromatide, waardoor HR enkel actief is

tijdens de late S-fase en G2-fase van de celcyclus. NHEJ (Figuur 1) is actief gedurende alle fasen

van de celcyclus. NHEJ zal de vrije DNA uiteinden van de dsb met elkaar verbinden zonder

template, waardoor de breuk vaak foutief hersteld wordt (error prone) met verandering van de

DNA sequentie. Wanneer de vrije DNA uiteinden van twee verschillende dubbelstrengbreuken

gelieerd worden, ontstaan structurele chromosoomafwijkingen. Ondanks dat NHEJ de

dubbelstrengbreuken vaak incorrect hersteld, is deze pathway het belangrijkste

herstelmechanisme dat optreedt in de cellen van hogere eukaryoten voor het herstellen van IR-

geïnduceerde dsb [12, 13].

Figuur 1: Schematische voorstelling van de verschillende stappen tijdens het non-homologous end-joining herstelmechanisme [14].

Structurele chromosoomafwijkingen vormen één van de belangrijkste effecten van ioniserende

straling. Een onderscheid kan gemaakt worden tussen chromosoomaberraties en chromatide-

aberraties. Het type aberratie dat zal ontstaan, is afhankelijk van de celcyclus fase waarin de cel

zich bevindt op moment van bestraling. Chromosoomaberraties ontstaan wanneer de cel

bestraald wordt in de G0- of G1-fase. Na DNA duplicatie (S-fase) zullen beide zusterchromatiden

beschadigd zijn. Als de cel bestraald wordt in de G2-fase of M-fase, zal slechts één

zusterchromatide beschadigd zijn. Dit type van aberratie wordt een chromatide-aberratie

genoemd [12].

7

In Figuur 2 wordt een classificatie van de verschillende chromosoomaberraties weergegeven.

Wanneer geen herstel optreedt van de DNA dsb, ontstaat een acentrisch fragment (terminale

deletie) en een onvolledig chromosoom. Wanneer een foutieve interactie en ‘re-joining’ optreedt

tussen twee dubbelstrengbreuken ontstaat een chromosomale herschikking. De twee dsb

kunnen gelegen zijn: 1) in twee verschillende chromosomen resulterend in een

'inter'chromosomale uitwisseling; 2) in de twee verschillende armen van eenzelfde chromosoom

resulterend in een ‘inter’-arm ‘intra’chromosomale uitwisseling; 3) in dezelfde arm van een

chromosoom resulterend in een ‘intra’-arm ‘intra’chromosomale uitwisseling. Asymmetrische

herschikkingen leiden tot onstabiele chromosoomaberraties (bv. dicentrische chromosomen),

aangezien er steeds een acentrisch fragment ontstaat dat bij de celdeling niet kan doorgegeven

worden aan de dochterkernen. Dit heeft verlies van genetische informatie voor de dochtercellen

tot gevolg. Bovendien zal meestal een mechanisch scheidingsprobleem optreden tijdens de

anafase. Onstabiele aberraties zijn daarom bijna altijd lethaal voor de cel. Stabiele

chromosoomaberraties, zoals translocaties, impliceren geen verlies van genetische informatie en

zijn het gevolg van symmetrische chromosomale herschikkingen. Stabiele aberraties kunnen

over een lange periode succesvol worden doorgegeven bij opeenvolgende celdelingen [15].

Figuur 2: Classificatie van de verschillende types chromosoomaberraties [15]. A. Asymmetrische chromosomale herschikking. S. Symmetrische chromosomale herschikking Opmerking: net zoals de translocatie zijn het dicentrisch chromosoom en het bijhorend acentrisch fragment samengesteld uit twee chromosomen (zwart en wit). Net zoals bij de pericentrische inversie, bevatten zowel de centrische ring als het acentrisch fragment een deeltje van de korte arm en een deeltje van de lange arm van het chromosoom (zwart en wit).

Chromosoomaberraties, zoals dicentrische chromosomen, ringen en translocaties, vormen een

belangrijke biologische parameter voor het bestuderen van stralingsschade in perifere

bloedlymfocyten (zie 1.3.3 Biologische dosimetrie)[16].

INTERCHANGE INTER-ARM

INTRACHANGE

INTRA-ARM

INTRACHANGE

“BREAK”

DISCONTINUITY

centric ring +

acentric fragment

A

S

dicentric +

acentric fragment

terminal deletion

interstitial

deletion

reciprocal

translocation

pericentric

inversion

paracentric

inversion

8

1.2.2 Gezondheidseffecten wegens stralingsblootstelling

De meeste gegevens met betrekking tot de effecten van straling zijn afkomstig van

epidemiologische studies omtrent medisch en beroepshalve blootgestelde personen, populaties

levend nabij nucleaire installaties en overlevenden van atoombommen (bv. Nagasaki en

Hiroshima) en kernrampen (bv. Tsjernobyl). Stralingsgeassocieerde gezondheidseffecten worden

ingedeeld in twee hoofdgroepen, namelijk de deterministische en de stochastische effecten [17].

Deterministische effecten

Deterministische effecten (of ‘weefselreacties’) zijn effecten van hoge stralingsdosissen (>1 Gy)

en hebben een drempeldosis waaronder het effect niet optreedt en waarboven de probabiliteit en

de ernst van het effect toeneemt met stijgende dosis. Een deterministisch effect treedt op

wanneer een zeer groot aantal cellen van een orgaan wordt vernietigd. Welke

ziekteverschijnselen er zullen optreden, is afhankelijk van welke organen werden bestraald en

met welke dosis, dosistempo en stralingskwaliteit. In het algemeen ontstaan deterministische

effecten binnen een tijdsperiode van enkele uren tot enkele maanden (acute effecten).

Voorbeelden van deterministische effecten zijn transiënte huiderytheem, haarverlies, verminderd

voortplantingsvermogen etc., elk met een eigen drempeldosis [17].

Het acuut stralingssyndroom (ARS: acute radiation syndrome) treedt op wanneer het hele

lichaam of een significant deel van het lichaam in korte tijd werd blootgesteld aan een dosis van

meer dan 1 Gy. De klassieke syndromen van het ARS zijn het cutane syndroom, het

hematopoëtisch syndroom, het gastro-intestinaal syndroom en het neurovasculair syndroom. Het

ARS verloopt in verschillende fases: de prodromale fase (initiële reactie: nausea, emesis,

hoofdpijn etc.), de latentieperiode (asymptomatisch), de manifestatie van de ziekte en de

uitkomst (herstel of dood). De ernst en de tijd van optreden van deze fases is afhankelijk van de

dosis en het dosistempo. Een aangepaste medische behandeling is essentieel en leidt tot een

significante stijging van de overleving [10].

Stochastische effecten

Blootstelling aan een lage stralingsdosis (<1 Gy) heeft op lange termijn als belangrijkste

gezondheidsrisico het ontstaan van kanker. Erfelijke aandoeningen, die het gevolg zijn van

stralingsblootstelling, zijn nog niet aangetoond bij de mens en het risico zou laag zijn in

vergelijking met het risico op kankerinductie. Deze stralingseffecten komen pas lange tijd na

blootstelling tot uiting (late effecten) en behoren tot de stochastische (kansgebonden) effecten

[17]. Kenmerkend hiervoor is dat de waarschijnlijkheid van optreden, maar niet de ernst,

afhankelijk is van de stralingsdosis. Eveneens wordt er aangenomen dat er geen drempelwaarde

is waaronder het effect niet voorkomt [10] (linear no-threshold model (LNT) [17]).

9

Stralingsgeïnduceerde tumoren worden gekenmerkt door een latentieperiode, de tijd tussen de

blootstelling en het manifesteren van de tumor, van 7 tot 10 jaar voor leukemieën en 20 tot 30

jaar voor solide tumoren. Diverse weefsels en organen verschillen in stralingsgevoeligheid

waardoor het risico op een solide tumor afhankelijk is van welke organen werden bestraald,

echter is het risico op fatale stralingsgeïnduceerde kanker in de populatie (Excess relative risk

cancer) 5% per Sievert bij een chronische blootstelling [17].

1.3 Dosimetrie

1.3.1 Klinische dosimetrie

Klinische symptomen, zoals nausea, emesis, diarree, haaruitval en erytheem, zijn belangrijke

indicatoren van stralingsblootstelling en treden op vanaf een bepaalde dosis (> 1Gy) en dit

binnen enkele minuten tot enkele uren of dagen na de blootstelling (Tabel 2) [3].

Tabel 2: De drempeldosis en tijd van aanvang van verschillende klinische tekens [Samengesteld uit [3]].

De snelheid van optreden, de ernst en de duur van de symptomen worden gebruikt bij triage om

een ruwe inschatting van de ontvangen dosis te verkrijgen [3, 10]. Een belangrijk nadeel is dat

klinische verschijnselen onvoldoende stralingsspecifiek zijn en ook kunnen veroorzaakt worden

door stress/angst ten gevolge van het stralingsaccident. Dit kan leiden tot vals positieve

diagnoses (‘worried well individuals’) [4]. De beperkingen van de klinische dosimetrie impliceren

de nood aan methoden die stralingsgeïnduceerde veranderingen in het lichaam op een

objectieve en precieze manier kunnen evalueren en kwantificeren, zoals de fysische en

biologische dosimetrie, om de ontvangen dosis te bepalen.

1.3.2 Fysische dosimetrie

De conventionele fysische dosimetrie houdt in dat de beroepsmatig blootgestelde werknemers

een persoonlijke dosimeter dragen waarmee de ontvangen dosis kan bepaald worden. In het

geval van een stralingsaccident waarbij de gewone bevolking, die geen persoonlijke dosimeter

Symptoom Drempeldosis (Gy) Tijd van aanvang

Nausea 1,4 Binnen 48 uur

Emesis 1,8 Binnen 48 uur

Diarree 2,3 Binnen 48 uur

Erytheem 3 – 10 (±6) Binnen enkele uren (primair

erytheem), na 14 tot 21 dagen (secundair erytheem)

Epilatie (haaruitval) > 2-3 Na 14 tot 18 dagen

10

draagt, is betrokken, wordt de ontvangen dosis ingeschat aan de hand van een alternatieve

techniek [2]. Fysische dosimetrie, zoals de optisch gestimuleerde luminescentie (OSL) en

elektron paramagnetische resonantie (EPR) dosimetrie, analyseert stralingsgeïnduceerde

fysische veranderingen in biologisch materiaal (bv. bot, tanden en vingernagels) [2] of

stralingsgevoelige materialen (portable/personal electronic devices), zoals een gsm/smartphone,

die het slachtoffer bij zich had op het moment van blootstelling [4, 18]. OSL dosimetrie heeft een

hogere gevoeligheid in het lage dosisgebied dan EPR dosimetrie, maar bij OSL dosimetrie zal

50% van het signaal verdwijnen in de eerste 10 dagen na bestraling (Tabel 3) [4].

Methode Signaalstabiliteit

Type

blootstelling Specifiek

voor IR

Dosisbereik

(Gy) Dagen Weken Maanden Jaren

Acute

WBEa

Acute

PBEb

EPR (ped)c x x x x x x 1 - >10

OSL (ped)d x x x x 0,01 - >10

aWhole body exposure;

bPartial body exposure;

cPersonal electronic device (bv. glazen scherm van een

smartphone); dPersonal electronic device (bv. elektronische elementen van een smartphone)

1.3.3 Biologische dosimetrie

Om de ontvangen dosis in te schatten, 1) na een stralingsaccident, waarbij de gewone bevolking

is betrokken, 2) om de uitgelezen dosis van de persoonlijke dosimeter van de blootgestelde

werknemer te bevestigen of 3) wanneer de persoonlijke dosimeter of de personal electronic

device zich buiten het bestralingsveld bevond bij een partiële lichaamsbestraling, kan men zich

wenden tot de biologische dosimetrie (biodosimetrie).

Biodosimetrie is een methode gebaseerd op de analyse van stralingsgeïnduceerde biomerkers in

biologisch materiaal van het blootgestelde individu om de ontvangen dosis van het slachtoffer in

te schatten. Voorbeelden van biomerkers zijn chromosoomaberraties, lymfocytaire depletie en

proteïne merkers voor dubbelstrengige DNA breuken (bv. gamma-H2AX foci test) [1, 2].

Cytogenetische testen zijn één van de meest gebruikte en precieze methoden om de ontvangen

dosis in te schatten. Deze assays analyseren chromosoomaberraties in perifere bloedlymfocyten

(PBL). De PBL bevinden zich in de G0-fase van de celcylcus, waardoor na stralingsblootstelling

enkel chromosoomaberraties aanwezig zijn [12, 19]. Doordat PBL weinig prolifereren in vivo en

een lang leven hebben, wordt de schade voor enige tijd bewaard tot de cellen in vitro

gestimuleerd worden tot celdeling [19]. Het aantal aberraties wordt gekwantificeerd en

vergeleken met een dosis-respons curve om de ontvangen dosis in te schatten. Onder de

cytogenetische methoden vallen de micronucleus (MN) test, de dicentrische

chromosoomaberratie (DCA) test, de detectie van translocaties (Fluorescentie In Situ

Hybridisatie (FISH)) en de premature chromosoom condensatie (PCC) test (Figuur 3) [16].

Tabel 3: Algemene eigenschappen van de fysische dosimetrie methoden [4].

11

Figuur 3: Cytogenetische methoden. Van links naar rechts: micronucleus test, dicentrische chromosoomaberratie test [Onderzoeksgroep Radiobiologie UGent], chromosoom ‘painting’ techniek: translocatie [16] en premature chromosoom condensatie test [20].

MN zijn niet specifiek voor IR en de spontane frequentie in de gezonde populatie is hoger dan

van de dicentrische chromosomen [4]. Translocaties (FISH) zijn stabiele aberraties, waardoor het

scoren ervan leidt tot een betere inschatting van de ontvangen dosis, in vergelijking met MN en

DC, in het geval van een minder recente blootstelling. Het voordeel van PCC is dat de cellen

geen celdeling moeten ondergaan, in tegenstelling tot de andere cytogenetische methoden,

waardoor PCC bruikbaar is bij hoge dosissen (Tabel 4) [18].

1.3.4 Europese netwerken voor dosimetrie

In het geval van grootschalige stralingsaccidenten is high-throughput dosimetry van groot belang.

Het MULTIBIODOSE (Multi-disciplinary biodosimetric tools to manage high-scale radiological

casualties) project (2010-2013) [4] en het RENEB (Realizing the European Network of

Biodosimetry) project (2012-2015) [18] zijn twee Europese projecten en hebben tot doel het

realiseren van een Europees netwerk dat dosisbepaling en triage van een groot aantal

slachtoffers zal toelaten [4, 22]. Gedurende de loop van de projecten werd de bruikbaarheid van

verschillende methoden, zoals de DCA test, de MN test, de chromosoom ‘painting’ techniek

(FISH), de PCC test, gamma-H2AX test en EPR/OSL dosimetrie, in grootschalige

stralingsaccidenten nagegaan. Een triage-modus werd uitgewerkt voor de verschillende

technieken en geharmoniseerd tussen de verschillende deelnemende laboratoria [4, 18].

Tabel 4: Algemene eigenschappen van de cytogenetische methoden [18] en [21].

Methode Stabiliteit van de biomerker

Type

blootstelling Specifiek

voor IR

Dosisbereik

(Gy) Dagen Weken Maanden Jaren

Acute

WBE

Acute

PBE

DCA x x x x x x 0,1 - 5

MN x x x x x 0,3 - 5

FISH x x x x x 0,3 - 5

PCC x x x x x x 0,3 - 20

12

1.4 De dicentrische test als biologische dosimeter in stralingsaccidenten

De dicentrische chromosoomaberratie (DCA) test is de meest specifieke en gevoelige

cytogenetische methode om de stralingsdosis in te schatten en wordt beschouwd als de “gouden

standaard”. Dicentrische chromosomen worden uitsluitend geïnduceerd door IR en niet

veroorzaakt of gemodificeerd door andere agentia of processen. De hoge gevoeligheid in het

lage dosisgebied (± 0,1 Gy bij het scoren van 1000 metafasen) wordt bekomen doordat de

spontane frequentie in de normale populatie zeer laag is (± 0,5-1 per 1000 metafasen) [16].

Reeds in 1962 suggereerden Bender en Gooch dat dicentrische chromosomen in perifere

lymfocyten bruikbaar zouden kunnen zijn voor de bevestiging van een stralingsblootstelling en

het inschatten van de ontvangen dosis [19]. Ondertussen heeft de DCA test zijn bruikbaarheid

als biologische dosimeter reeds bewezen bij verschillende stralingsaccidenten. Zowel bij

grootschalige stralingsaccidenten, zoals de kernramp van Tsjernobyl (Oekraïne, 1986) [16], het

Dakar accident (2006) [23] en de kernramp van Fukushima (Japan, 2011) [24], als bij

kleinschalige stralingsaccidenten [7, 8, 25].

1.4.1 Dicentrische analyse

Dicentrische chromosomen zijn chromosomen met twee centromeren en zijn het gevolg van een

misrepair event tussen twee DNA dsb gelegen op naburige chromosomen (Figuur 2). Bij de

vorming van een DC ontstaat tevens een acentrisch fragment. Dicentrische chromosomen

kunnen samen met hun acentrisch fragment waargenomen worden in metafase cellen (Figuur

4)[12, 15].

Figuur 4: Een metafase lymfocyt met een dicentrisch chromosoom (DC) en het acentrisch fragment (AF) (Giemsa-kleuring) [Eigen afbeelding].

13

Voor de analyse van dicentrische chromosomen worden de lymfocyten na bloedafname

gestimuleerd tot deling door toevoeging van phytohaemagglutinine (PHA), een mitogen specifiek

voor T-lymfocyten, aan de culturen. Door het toevoegen van colcemid na 24 uur of 45 uur zullen

de lymfocyten geblokkeerd worden in metafase. Colcemid verhindert de vorming van de

spoelfiguur tijdens de celdeling door depolymerisatie van de microtubuli. Na een totale cultuurtijd

van 48 uur worden de lymfocyten geoogst en gefixeerd om metafase preparaten te maken en

deze te kleuren. De dicentrische chromosomen worden vervolgens gekwantificeerd in de

metafase lymfocyten [16]. Aangezien dicentrische chromosomen onstabiele aberraties zijn, is het

essentieel dat deze aberraties gescoord worden in eerste metafase lymfocyten om een accuraat

resultaat te bekomen. Dit kan gerealiseerd worden op twee manieren. Bij de eerste methode

wordt colcemid na 45 uur toegevoegd en wordt een Fluorescentie plus Giemsa-kleuring (FPG)

toegepast. Om een onderscheid te kunnen maken tussen eerste en tweede metafase cellen

wordt bij het opstarten van de culturen bromodeoxyuridine (BrdU) aan het cultuurmedium

toegevoegd. Na kleuring zullen de eerste metafasen uniform kleuren en zullen de cellen in

tweede metafase het ‘harlequin’ effect vertonen (Figuur 5). Bij de tweede methode wordt

colcemid reeds na 24 uur i.p.v. 45 uur cultuurtijd toegevoegd. Op dit tijdstip bevinden alle

lymfocyten zich nog vóór de eerste metafase van de celcyclus en kan er met een eenvoudige

Giemsa-kleuring gewerkt worden. Bij de eerste methode worden de lymfocyten die in eerste

deling gaan voor de 45 uur cultuurtijd niet geblokkeerd in metafase, aangezien nog geen

colcemid werd toegevoegd. Bij de tweede methode zullen deze lymfocyten wel geblokkeerd

worden en zal een hogere opbrengst aan metafasen worden verkregen. Een nadeel van de

langere blootstelling aan colcemid bij de tweede methode (24 uur i.p.v. 3 uur) is dat de

chromosomen meer gecondenseerd zullen zijn [8].

Figuur 5: Links: Schematische weergave van de Fluorescentie plus Giemsa-kleuring om eerste metafasen van tweede metafasen te onderscheiden [26]. Rechts: Het ‘harlequin’ effect bij een tweede metafase lymfocyt gekleurd met FPG [16].

14

Bij een accidentele stralingsblootstelling (in vivo bestraling) wordt de frequentie aan dicentrische

aberraties, gescoord in de metafase lymfocyten van het slachtoffer, omgezet in de ontvangen

dosis aan de hand van een referentie dosis-respons curve opgesteld onder in vitro condities. Dit

is mogelijk omdat het aantal dicentrische chromosomen verkregen bij een bepaalde dosis

hetzelfde is bij in vitro als bij in vivo bestraling. Een duidelijke dosis-effect relatie wordt bekomen

tussen 0.1 en 5 Gy, waarbij het aantal dicentrische aberraties zal toenemen met de dosis [8]. Bij

dosissen hoger dan 5 Gy wordt er geen duidelijke dosis-effect relatie waargenomen en is er een

afvlakking van het effect. Dit fenomeen is het gevolg van het feit dat de celdeling van zwaar

beschadigde cellen zal geïnhibeerd worden waardoor deze cellen niet in metafase zullen

geraken [20, 27]. De relatie tussen het aantal dicentrische aberraties per cel (dicentrische

opbrengst: Y) en de dosis (D) is lineair- kwadratisch (Y = C + αD + βD2) voor lage LET straling en

lineair (Y= C + αD) voor hoge LET straling (Figuur 6), waarbij C de achtergrondfrequentie (0 Gy)

voorstelt. Dicentrische chromosomen ontstaan door uitwisseling tussen twee DNA dsb die

geïnduceerd zijn door ofwel één ioniserende baan (lineaire term αD) ofwel twee onafhankelijke

ioniserende banen (kwadratische term βD2). Bij lage LET straling in het geval van een lage dosis

en bij hoge LET straling zal het grootste deel van de aberraties het gevolg zijn van twee DNA dsb

gevormd door één ioniserende baan (αD term). In tegenstelling tot de lineaire coëfficiënt α is de

kwadratische coëfficiënt β afhankelijk van tijdsfactoren en zal het aantal dicentrische

chromosomen die ontstaan door twee afzonderlijke banen (βD2 term) in het geval van lage LET

straling voornamelijk bij hoge dosissen beïnvloedt worden door dosisfractionatie en het

dosistempo [8, 16].

Figuur 6: Een lineaire (hoge LET) en lineair-kwadratische (lage LET) curve [16].

De standaard biologische dosimetrie procedure (full mode biological dosimetry) bij een

stralingsaccident houdt in dat er 500 metafasen moeten geanalyseerd worden of 100

dicentrische chromosomen moeten gescoord worden, afhankelijk van wat eerst bereikt wordt, om

een betrouwbare inschatting van de dosis te bekomen. In het geval van lage dosissen wordt

15

aangeraden om het aantal metafasen te verhogen tot 1000. Het aantal geanalyseerde metafasen

van het slachtoffer heeft een invloed op de statistische accuraatheid van de ingeschatte dosis,

uitgedrukt in een 95% betrouwbaarheidsinterval [16]. Een nadeel is dat manuele microscopische

analyse van Giemsa-gekleurde metafasen tijdrovend is en veel ervaring vereist [28]. Deze tijd

nodig voor analyse is problematisch in het geval van een grootschalig stralingsaccident. Om dit

probleem op te lossen wordt de klassieke procedure bij grootschalige stralingsaccidenten

gewijzigd en wordt het aantal te analyseren metafasen teruggebracht tot 50. Het analyseren van

50 metafasen laat, met voldoende zekerheid, triage van de slachtoffers toe in volgende

categorieën: < 1 Gy, 1-2 Gy en > 2 Gy [4, 22, 29].

1.4.2 Automatisatie van de dicentrische test

Sinds de jaren 80 zijn computerondersteunde systemen in ontwikkeling, zowel voor het

automatisch zoeken naar geschikte metafasen als voor het detecteren van dicentrische

chromosomen, die de analysecapaciteit sterk kunnen doen toenemen [8, 16]. Veel

onderzoeksgroepen maken gebruik van het Metafer scanningsplatform van Metasystems en

doen onderzoek naar de automatische scoring van dicentrische chromosomen [23, 25, 28, 30].

De Metafer (MetaSystems) is een microscopie scanningssysteem gelinkt aan een computer dat

in combinatie met de geschikte softwareprogramma’s belangrijke toepassingen kent, zoals de

analyse van dicentrische chromosomen, micronucleï, γ-H2AX foci, etc. [31]. Voor automatische

analyse van dicentrische chromosomen worden de slides bij een vergroting van 10x automatisch

gescand voor het vinden van metafasen (MSearch software module). Vervolgens worden de

gevonden metafasen met de Autocapt module bij een vergroting van 63x vastgelegd op beeld

met een hoge resolutie. Nadien kunnen de dicentrische chromosomen automatisch gedetecteerd

worden door het DCScore softwareprogramma. De automatisch gedetecteerde dicentrische

chromosomen kunnen eventueel geëvalueerd worden door een getraind persoon resulterend in

semi-automatische scoring, waarbij vals positieve dicentrische chromosomen worden verworpen

[28]. Wanneer de manuele scoring van dicentrische chromosomen vergeleken wordt met de

automatische scoring van dicentrische chromosomen zal deze laatste slechts 40 tot 50% van de

manueel gedetecteerde dicentrische chromosomen detecteren. Een verhoging van de

analysesnelheid is in dit geval gekoppeld aan een afname van de accuraatheid. Om hiervoor te

compenseren wordt bij de semi-automatische scoring in het geval van triage 150 metafasen in

plaats van 50 metafasen geanalyseerd (Tabel 5) [28, 30]. In het geval van de

standaardprocedure dienen er bij de automatische scoring 3000 metafasen geanalyseerd te

worden om dezelfde minimale detectielimiet te bekomen als bij de manuele scoring van 500

metafase (Tabel 5) [23].

16

Tabel 5: Vergelijking manuele en automatische detectie van dicentrische chromosomen bij triage en bij de standaardprocedure [Samengesteld uit [16], [23] en [28]].

Manuele microscopische scoring (Semi-)automatische scoring

Aantal metafasen

Minimale detectielimiet

Duur Aantal

metafasen Minimale

detectielimiet Duur

Triage situatie

50 ± 0,5 Gy [23]

60 min [28]

150 ± 0,5 Gy [28]

20 min [28]

Standaard-procedure

500 (1000 bij lage

dosissen)

0,1 – 0,2 Gy [16] [23]

10 uur (voor 500

metafasen) [23]

3000 0,2 Gy [23]

3 uur [23]

De duur bij automatische scoring is de som van de tijd nodig voor de MSearch, de Autocapt, de automatische scoring van de dicentrische chromosomen en de evaluatie van de dicentrische kandidaten (= semi-automatische scoring) [28].

1.4.3 De dicentrische test met telomeer- en centromeerprobes

Analyse van Giemsa-gekleurde metafasen, waarbij alle chromosomen uniform worden gekleurd

(Figuur 4), is gebaseerd op de morfologie van de chromosomen. Voor het correct herkennen van

de dicentrische chromosomen is er veel ervaring vereist. Door het toepassen van fluorescentie in

situ hybridisatie (FISH), waarbij de centromeren en telomeren van alle chromosomen simultaan

gekleurd worden, wordt de detectie van dicentrische chromosomen vereenvoudigd en is een

correctere scoring mogelijk. Dicentrische chromosomen zullen bij een telomeer– en

centromeerkleuring (TC-kleuring) twee centromeersignalen (Figuur 7) vertonen [32].

Figuur 7: Een metafase met vier dicentrische chromosomen (DC) met de bijhorende acentrische fragmenten (AF), waarvan er één ontbreekt. TelC Cy3 telomeer PNA FISH Probe (rood signaal) en CentFAM centromeer PNA FISH Probe (groen signaal) [Eigen afbeelding].

17

In de studie van M’kacher et al. werd gebruik gemaakt van peptide nucleïnezuur (PNA) probes

[32]. PNA probes zijn artificieel gesynthetiseerde polymeren gelijkend op DNA en RNA

moleculen. De geladen fosfodiësterbinding tussen de nucleotiden wordt vervangen door een

polyamide (peptide) ruggengraat, bestaande uit N-(2-amino-ethyl)glycine eenheden. De basen

worden gekoppeld aan de pseudopeptide ruggengraat via een methyleen carbonyl binding

(Figuur 8) [33].

Figuur 8: Binding van een PNA probe (A: pseudopeptidebinding, B: N-(2-amino-ethyl)glycine, C: methyleen carbonyl linker, D: base) aan het doelwit DNA [33].

PNA probes zijn efficiënt te gebruiken voor fluorescentie in situ hybridisatie, enerzijds hebben ze

een hoge bindingsaffiniteit voor het target DNA door hun elektrische neutraliteit, anderzijds

binden ze met een zeer hoge specificiteit aan het target DNA. Bovendien hebben PNA probes

een kortere hybridisatietijd dan DNA probes [33, 34].

1.4.4 De dicentrische test voor partiële lichaamsbestraling

Zoals reeds vermeld zullen de meeste stralingsaccidenten resulteren in een gedeeltelijke

lichaamsbestraling [8, 9]. Om een correcte dosisinschatting te bekomen, is het essentieel om na

te gaan of het slachtoffer volledig of partieel werd blootgesteld. De dicentrische test is één van de

weinige technieken (Tabel 4) [18] die, in zekere mate, een partiële lichaamsbestraling kan

identificeren [9, 11, 25, 29, 30]. De differentiatie tussen een volledige en gedeeltelijke

lichaamsbestraling is gebaseerd op het feit dat de verdeling van het aantal dicentrische

chromosomen per cel de Poisson distributie volgt bij een volledige lichaamsbestraling, terwijl er

bij partiële blootstelling overdispersie is van de distributie (Figuur 9). De Poisson distributie is een

discrete kansverdeling dat de waarschijnlijkheid van optreden van zeldzame, toevallige

gebeurtenissen, zoals de vorming van chromosoomaberraties, weergeeft [16].

N-(

M

m

e

t

h

u

A B

C

D

18

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 1 2 3 4 5 6

Ge

ob

serv

eed

e f

req

ue

nti

e

Aantal dicentrische chromosomen per cel

Volledige lichaamsbestraling: Poisson distributie

Partiële lichaamsbestraling: Overdispersie

Figuur 9: De Poisson distributie bij een volledige lichaamsbestraling (WBD: 4 Gy) en overdispersie van de Poisson distributie bij een partiële lichaamsbestraling (PBD: 4 Gy - IR F: 50% - WBD: 2 Gy) [Eigen afbeelding].

Om overdispersie na te gaan, wordt na het scoren van de dicentrische chromosomen de

frequentie distributie geanalyseerd op afwijking van de Poisson distributie met de Papworth’s u-

test vertrekkend vanuit de dispersie-index (DI = σ2/y (variantie/frequentie)). Bij een Poisson

distributie is de variantie (σ2) gelijk aan het gemiddeld aantal dicentrische chromosomen per cel

(y) en is de DI gelijk aan 1. De u-waarde is een genormaliseerde eenheid van de dispersie-index.

De bekomen u-waarde wordt vergeleken met de theoretische waarde van 1,96. Een u-waarde

groter dan 1,96 wijst op een significantie afwijking (P < 0.05) van de dispersie-index van één en

is indicatief voor een overdispersie (σ2/ y > 1) van de frequentie distributie. In het geval van

overdispersie kunnen twee mathematische modellen gebruikt worden om de bestraalde fractie

van het lichaam (IR F) en de dosis van deze fractie (PBD) te bepalen, namelijk Dolphin’s

gecontamineerde Poisson methode en de Qdr (Quantity of Dicentrics and Rings) methode van

Sasaki en Miyata. Bij de gecontamineerde Poisson methode worden de gescoorde dicentrische

chromosomen over alle geanalyseerde metafasen, zowel met als zonder onstabiele aberraties,

beschouwd. Lymfocyten met dicentrische chromosomen zijn afkomstig van de bestraalde fractie

van het lichaam, terwijl de onbeschadigde cellen ofwel niet blootgesteld werden ofwel bestraald

werden zonder er chromosoomaberraties aan over te houden. De bekomen frequentie distributie

is samengesteld uit twee componenten (a) de Poisson distributie die de bestraalde fractie van

het lichaam voorstelt en (b) de overige onbestraalde fractie. Bij de Qdr methode worden zowel

dicentrische chromosomen als ringen gescoord, maar enkel beschouwd over de cellen die

onstabiele aberraties bevatten [16].

19

1.5 Doelstelling

Het hoofddoel van deze studie was om het gebruik van FISH-TC-gekleurde dicentrische

chromosoomaberraties bij een partiële lichaamsbestraling na te gaan. De beschikbare studies

omtrent de DCA test en partiële lichaamsbestraling maakten steeds gebruik van de Giemsa-

kleuring [9, 11, 25, 30].

In het eerste deel van de studie werd de FISH-TC-procedure geoptimaliseerd. In de masterproef

2015-2016 (UGent, Onderzoeksgroep Radiobiologie) [35] werden bij de FISH-TC-kleuring weinig

metafasen gedetecteerd op de preparaten in vergelijking met de Giemsa-kleuring tijdens het

uitvoeren van de MSearch. Twee mogelijke oorzaken werden genoemd: ofwel leidde de FISH-

TC-kleuring tot het wegwassen van de metafasen, ofwel waren de beschikbare MSearch

classifiers van de Metafer niet optimaal voor de detectie van de metafasen.

In het tweede deel werden de verschillende dosis-respons curves voor de dicentrische test

(Giemsa en FISH-TC), opgesteld in 2015-2016 [35], gevalideerd en eventueel geoptimaliseerd.

Hierbij werden de resultaten van de verschillende scoringsmethoden met elkaar vergeleken.

In het derde deel van de studie werd de bruikbaarheid van de dicentrische chromosoomaberratie

(DCA) test in combinatie met de FISH-TC-kleuring voor het detecteren van een partiële

lichaamsblootstelling en het bepalen van de opgelopen stralingsdosis tijdens een

stralingsaccident geëvalueerd.

Ten slotte werd deelgenomen aan het Europees project RENEB ‘Realizing the European

Network of Biodosimetry’, waarbij een dosisbepaling door middel van de dicentrische test werd

uitgevoerd op ‘blinde’ stalen ontvangen via het RENEB netwerk.

20

2 Materiaal en methoden

2.1 In vitro simulatie van volledige en partiële lichaamsbestralingen

Het bloed van twee gezonde donoren (D1 en D57) werd afgenomen in een heparine buis door de

bloedprikdienst van het UZ Gent. De bloedstalen werden bestraald in een warmwaterbad (37°C)

met een kobalt-60 γ-bron (dosistempo: 0,25 Gy per minuut). Voor de validatie van de dosis-

respons curven en de vergelijking tussen de verschillende scoringsmethoden werden de

bloedstalen bestraald met een dosis van 1, 2 en 4 Gy. Om verschillende situaties van partiële

lichaamsbestraling na te bootsen, werd bestraald bloed (2 Gy en 4 Gy) gemengd met niet

bestraald bloed in verschillende verhoudingen (Tabel 6).

Tabel 6: Gesimuleerde situaties van partiële lichaamsbestraling bij 2 Gy en 4 Gy.

Partiële lichaamsdosis

(Partial body dose, PBD)

(Gy)

Percentage

bestraald bloed

(Irradiated fraction,

IR F) (%)

Volledige

lichaamsdosis

(Whole body dose,

WBD) (Gy)

Verhouding

bestraald: niet bestraald

bloed

2 0 0 0:1

2 12,5 0,25 1:7

2 25 0,50 1:3

2 37,5 0,75 3:5

2 50 1 1:1

2 100 2 1:0

4 0 0 0:1

4 6,25 0,25 1:15

4 12,50 0,50 1:7

4 18,75 0,75 3:13

4 25 1 1:3

4 50 2 1:1

4 100 4 1:0

2.2 Cultuur en fixatie procedure

Samenstelling compleet RPMI (Roswell Park Memorial Institute)-1640 medium:

500 ml RPMI-1640 medium (Gibco)

5 ml L-glutamine (200mM) (Gibco)

2,5 ml penicilline/streptomycine (50 U/ml + 50 µg/ml) (Gibco)

De bloedculturen werden opgestart door in een 25 cm2 falcon 4 ml cRPMI-1640 medium, 0,5 ml

foetaal kalfsserum (FKS) (Gibco), 0,5 ml bloed en 100 µl phytohaemagglutinine (Gibco) te

brengen. cRPMI en FKS voorzien de nodige stoffen voor de groei van de lymfocyten. De falcons

werden rechtop in de incubator (5% CO2, 37ºC) geplaatst. Na 24 uur werd 50 µl colcemid (10

µg/ml) (Serva) toegevoegd. Na 48 uur cultuurtijd werden de culturen geoogst, overgebracht in

21

centrifugebuisjes en gecentrifugeerd gedurende 8 minuten aan een snelheid van 1000 rounds

per minute (rpm). Het supernatans werd verwijderd en er werd al vortexend 5 ml KCl (75 mM,

37°C) (Sigma) toegevoegd, gevolgd door 15 minuten incubatie bij 37°C.

KCl is verantwoordelijk voor het lyseren van de rode bloedcellen en het opzwellen van de

lymfocyten. De celsuspensies werden gecentrifugeerd (8 min, 1000 rpm), het supernatans werd

verwijderd en al vortexend en druppelsgewijs werd 5 ml methanol/azijnzuur fixatief (3/1, 4°C)

toegevoegd. Deze drie stappen werden tweemaal herhaald tot het fixatief helder was. De

celsuspensies werden geconcentreerd en 40 µl werd op de draagglaasjes, bewaard in een

methanol oplossing (4°C), aangebracht, gevolgd door 80 µl methanol/azijnzuur fixatief. De slides

werden gedroogd aan de lucht en werden in de diepvries bewaard in een slide-box met silica

kristallen. De slides van de volledige lichaamsbestralingen werden gekleurd met zowel Giemsa

als FISH. De slides van de partiële lichaamsbestralingen werden gekleurd met FISH.

2.3 Giemsa-kleuring

Samenstelling Hepesbuffer-werkoplossing (0,03 M, pH 6,5):

3/10de Hepesbuffer-stockoplossing (0,1 M, pH 6,5)

900 ml HEPES-zuur (23,83 g opgelost in 200 ml gedestilleerd water (AD, aqua

destillata) en aangelengd tot 1 liter) (Sigma-Aldrich)

100 ml HEPES-natriumzout (26 g opgelost in 200 ml AD en aangelengd tot 1

liter) (Sigma-Aldrich)

7/10de AD

De kleuroplossing werd gemaakt aan de hand van 3 ml methyleenblauwe azuur-eosine, Giemsa

(VWR) en 75 ml Hepesbuffer-werkoplossing (0,03 M, pH 6,5) in een coplin jar (verhouding: 1/25).

De slides werden 3 minuten gekleurd in het donker en werden onmiddellijk daarna gespoeld in

twee maatbekers met AD. De slides werden rechtstaand in een rekje geplaatst om te drogen.

Vervolgens werden de slides voorzien van een dekglaasje door middel van DPX mounting

medium (VWR) dat ongeveer 1 dag nodig had om te drogen bij 37°C.

2.4 Fluorescentie in situ hybridisatie met telomeer- en centromeerprobes

Samenstelling 4% paraformaldehyde (PFA):

½ 8% paraformaldehyde (VWR) en ½ PBS 1X

Pepsine werkoplossing (0,1 mg/ml in 0,01 M HCl) (30 minuten voorverwarmd in de oven, 37°C):

100 µl stockoplossing (1 mg/ml in 0,1 M HCl) (Sigma-Aldrich)

900 µl AD

22

Samenstelling 1% Triton wasoplossing (voorverwarmd in warmwaterbad, 37°C):

75 ml 2X SSC

2X SSC: 10 ml 20X SSC (87,5 g NaCl (Sigma-Aldrich) + 44,12 g NaCitraat

(VWR) in 400 ml AD, pH brengen tot 7,4 en aanlengen tot 500 ml) aanlengen met

AD tot 100 ml

75 µl Triton X-100 (Sigma-Aldrich)

Verdunde probe-oplossing:

200 µl hybridisatiebuffer

70% formamide (VWR)

1% blocking agent (Boehringer-Mannheim)

in 10 mM Tris (Sigma-Aldrich) pH 7,2

2 µl telomeerprobe (1/100) (5 nmol gevriesdroogde TelC Cy3 telomeer PNA FISH Probe

(Panagene (Eurogentec)) opgelost in 1 ml H2O)

1 µl centromeerprobe (1/200) (5 nmol gevriesdroogde CentFAM centromeer PNA FISH

Probe (Panagene (Eurogentec)) opgelost in 0,6 ml H2O)

Samenstelling Wash I 70% formamide/10 mM Tris pH 7,2:

140 ml formamide (VWR)

60 ml AD

2 ml Tris-HCl 1M pH 7,2 (12,114g Tris-base (Sigma-Aldrich) in 70 ml AD, pH brengen tot

7,2 en aanlengen tot 100 ml met AD)

Samenstelling Wash II 50 mM Tris pH 7,2/150 mM NaCl pH 7,5/0,05% Tween-20:

300 ml AD

15 ml Tris-HCl 1 M

9ml NaCl 5M (29,22 g NaCl (Sigma-Aldrich) in 100 ml AD)

150 μl Tween 20 (VWR)

De metafase preparaten werden 5 minuten gewassen in phosphate buffered saline PBS (10 mM,

pH 7,2) en nadien gefixeerd in 4% PFA gedurende 2 minuten. Vervolgens werden de slides drie

keer 5 minuten gewassen in PBS. Hierna werd 100 μl pepsine werkoplossing aan elke slide

toegevoegd en werden de slides voorzien van een dekglaasje (ontvet in alcohol 96%+1%HCl).

De preparaten werden gedurende 7 minuten in de oven (37°C) geplaatst. De slides werden 5

minuten gewassen in PBS, vervolgens gefixeerd in 4% PFA gedurende 2 minuten en opnieuw

gewassen in PBS gedurende 5 minuten. Daarna werden de slides gewassen in 1% Triton

wasoplossing in een warmwaterbad (37°C) gedurende 30 minuten. Vervolgens werden de slides

twee keer 5 minuten gewassen in PBS. Daarna werden de slides gedehydrateerd door ze

gedurende 5 minuten achtereenvolgens in een 50%, 70% en 100% ethanol oplossing te

brengen. De slides werden gedroogd aan de lucht en wanneer ze droog waren, werd 25 μl

23

verdunde probe-oplossing en een ontvet dekglaasje aangebracht. De slides werden in de

Thermobrite geplaatst waarna het programma PGM 08 werd ingesteld. Hierdoor werd het DNA

gedenatureerd gedurende 3 minuten bij 80°C. Na deze stap volgde er hybridisatie in het donker

(2 uur; kamertemperatuur). De niet gebonden probes werden weggewassen door de slides

tweemaal 15 minuten in Wash I en driemaal 5 minuten in Wash II te plaatsen. De slides werden

gespoeld in PBS en 2 druppels 4',6-diamidino-2-fenylindool-vectashield (DAPI) werden op de

slides aangebracht. De slides werden bedekt met een dekglaasje en bewaard bij 4°C.

2.5 Inscannen van de slides en acquisitie van metafase cellen

De slides werden ingescand met een Metafer 4 scanningssysteem (MetaSystems, Duitsland) dat

gebruik maakt van een Carl Zeiss AxioImager.Z2 microscoop (Zeiss, Duitsland) en een

CoolCube1 CCD camera (MetaSystems) voor het vastleggen van de beelden.

2.5.1 MSearch Classifier

De MSearch software detecteerde tijdens het inscannen van de slides op 10x vergroting

automatisch de metafasen. Voor de Giemsa-gekleurde slides werd gebruik gemaakt van

lichtmicroscopie en voor de FISH-TC-gekleurde slides werd gebruik gemaakt van

fluorescentiemicroscopie (DAPI-filter).

Vergelijken van de MSearch Classifiers

Aan het begin van het onderzoek werd een vergelijking gemaakt tussen de reeds bestaande

MSearch classifiers, zodat tijdens deze studie gebruik kon gemaakt worden van de beste

classifier. Op verschillende slides werd een MSearch uitgevoerd.

Optimaliseren van de MSearch Classifier

Voor de FISH-TC slides werd een nieuwe classifier gecreëerd op basis van de basisinstellingen

van een reeds bestaande classifier. De nieuwe classifier werd getraind aan de hand van een

aantal metafase preparaten. In de trainingsbeelden werden de metafasen aangeduid waarvan er

gewenst werd dat de classifier ze detecteerde. Gewenste metafasen zijn metafasen die niet

bedekt worden door celkernen of door debri eventueel aanwezig op de slide. Aan de hand van

de aangeduide metafasen op de trainingsbeelden werd door de Metafer de nieuwe MSearch

classifier berekend. Wanneer het proces voltooid was, werd de nieuwe classifier getest en

vergeleken met de reeds bestaande classifiers.

2.5.2 Autocapt Classifier

Na het uitvoeren van de MSearch werd een selectie gemaakt van de aanvaardbare metafasen

voor verdere analyse van de chromosomen. De geselecteerde metafasen werden met hoge

24

resolutie op sterke vergroting (63x, immersie-olie) ingescand aan de hand van de geschikte

Autocapt software module. Voor de Giemsa-kleuring werd de Autocapt software module

‘Autocapt TL’ (Transmitted Light) toegepast. Bij de FISH-TC-kleuring FISH werd gebruik gemaakt

van de classifier ‘Cent+Telo 63 Olivia’, waarbij achtereenvolgens drie kleurkanalen werden

gebruikt. De DAPI-filter (Chroma SP100v2: λexcitatie 350nm, λemissie 470nm), een tweede filter (Chroma

31001: λexcitatie 480nm, λemissie 535nm) voor de visualisatie van de centromeren (FAM-gelabelde PNA

probe) en een derde filter (Chroma 31003: λexcitatie 546nm, λemissie 580nm) voor de visualisatie van de

telomeren (Cy3-gelabelde PNA probe:).

2.6 Scoren van dicentrische chromosoomaberraties

Dicentrische chromosomen kunnen op verschillende manieren gescoord worden. Voor de

Giemsa-gekleurde slides werden de dicentrische chromosomen automatisch, semi-automatisch I

en semi-automatisch II gescoord. Bij de TC-gekleurde preparaten werd enkel een semi-

automatische scoring II uitgevoerd. Op het laboratorium is er nog geen TCScore software

beschikbaar voor automatische scoring van TC-gekleurde dicentrische chromosomen.

Automatische scoring Giemsa (AS G)

Voor de automatische scoring van dicentrische chromosomen werd na het inscannen van de

metafase cellen op 63x, gebruik gemaakt van de DCScore classifier geoptimaliseerd door het

Duits bedrijf Bfs (Bundesamt für Strahlenschutz). De classifier detecteert op een volledig

automatische manier de dicentrische chromosomen aanwezig in de ingescande metafasen.

Semi-automatische scoring I Giemsa (SAS I G)

Na het uitvoeren van de automatische scoring werden de metafasen waarin één of meerdere

dicentrische chromosomen werden gedetecteerd, overlopen en gecorrigeerd voor vals positieve

en vals negatieve (niet gedetecteerde) dicentrische chromosomen. De metafasen waarin geen

dicentrische chromosomen werden gedetecteerd, werden niet geanalyseerd.

Semi-automatische scoring II Giemsa (SAS II G) en TC (SAS II TC)

De dicentrische chromosomen werden ook manueel gescoord op digitale beelden. Hierbij

werden alle op 63x ingescande metafasen geanalyseerd.

2.7 Statistische analyse

Dosis-respons curves

In het geval van een stralingsaccident wordt de dosis ingeschat aan de hand van een in vitro

dosis-respons curve. De in vitro dosis-respons curves voor de verschillende scoringsmethoden,

AS G, SAS I G, SAS II G en SAS II TC, werden reeds opgesteld door de onderzoeksgroep

Radiobiologie (UGent; 2015-2016) [35].

25

De coëfficiënten van de lineair-kwadratische curves (Y = C + αD + βD2) kunnen teruggevonden

worden in Tabel 7.

Tabel 7: De waarden van de coëfficiënten van de verschillende dosis-respons curves.

Scoringsmethode C α (Gy-1

) β (Gy-2

)

AS G 0,0285 0,0280 0,0285

SAS I G 0,0010 0,0260 0,0262

SAS II G 0,0006 0,0721 0,0517

SAS II TC 0,0000 0,0296 0,0548

De dosis-respons curves werden opgesteld aan de hand van 12 dosispunten (0; 0,1; 0,2; 0,5;

0,75; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4 en 4,5 Gy) (Figuur 10).

Figuur 10: De dosis-respons curves voor de verschillende scoringsmethodes [Onderzoeksgroep Radiobiologie UGent 2015-2016]. Opmerking: het dosispunt 4,5 Gy ontbreekt op deze figuur.

Volledige lichaamsbestralingen: inschatting van de dosis

Voor de analyse van de frequentie distributie t.o.v. de Poisson distributie werd de u-test gebruikt.

De dosis werd ingeschat aan de hand van de geobserveerde dicentrische opbrengst en de

dosis-respons curve. Voor het uitdrukken van de statistische onzekerheid op de dosisinschatting

werd een 95% betrouwbaarheidsinterval (BI) berekend a.d.h.v. de Poisson fout van de

dicentrische opbrengst en de 95% betrouwbaarheidslimieten van de dosis-respons curve [16].

Detectie van partiële lichaamsbestraling, inschatting van de dosis aan de hand van de

gecontamineerde Poisson methode en berekening van de bestraalde fractie

Wanneer met de u-test een overdispersie van de frequentie distributie (σ2/y > 1; u-waarde >

1,96) werd geobserveerd, werd de gecontamineerde Poisson methode gebruikt om de partiële

lichaamsdosis (PBD) te bepalen. Daarnaast werd ook een inschatting gemaakt van de

bestraalde fractie (irradiated fraction IR F) en van de volledige lichaamsdosis (WBD). Er werd

gebruik gemaakt van de biodosimetrie softwareprogramma’s Dose Estimate en/of CABAS [16].

Semi-automatisch II Giemsa

Semi-automatisch II TC

Automatisch Giemsa

o Semi-automatisch I Giemsa

26

Bij de berekeningen werden volgende formules toegepast door de softwareprogramma’s [16]:

U-test:

N: Aantal geanalyseerde metafasen

X: Aantal gedetecteerde dicentrische chromosomen

σ2: Variantie

Y: Dicentrische opbrengst (=X/N)

Partiële lichaamsdosis:

De gecontamineerde Poisson methode:

YIRF: Dicentrische opbrengst van de bestraalde fractie (IR F)

e–YIRF: Vertegenwoordigt het aantal onbeschadigde cellen in de bestraalde fractie

X: Aantal gedetecteerde dicentrische chromosomen

N: Aantal geanalyseerde metafasen

n0: Aantal metafasen zonder dicentrische chromosomen

Aan de hand van de berekende waarde van YF en de dosis-respons curve werd de dosis van de

bestraalde fractie (PBD) berekend.

Bestraalde fractie:

Om de bestraalde fractie van de gescoorde cellen (f) te bepalen, werd de volgende formule

toegepast.

De werkelijke in vitro bestraalde fractie (of de in vivo bestraalde fractie van het lichaam bij een

stralingsaccident), IR F, werd bekomen wanneer gecorrigeerd werd voor het selectief verlies van

bestraalde cellen door interfase celdood en vertraagde celdeling. Bestraalde cellen, ook deze

zonder aberraties, hebben een lagere probabiliteit dan niet-blootgestelde cellen om de metafase

te bereiken binnen de 48 uur.

P: Fractie van de bestraalde cellen die de metafase bereiken

D: Ingeschatte dosis van de bestraalde fractie (PBD)

D0: De D0-waarde beschrijft de helling van de overlevingscurve van lymfocyten en is de dosis

waarbij 37% van de bestraalde cellen overleven. Do is 3,5 Gy voor 60Co γ-stralen [25].

)11(2

1)1( 2

X

NYu

1

.....1100222

N

yndicnwithcellsydicwithcellsydicwithcellsVAR

o

Y

IRF

nN

X

e

YIRF

1

IRFYN

Xf

*

pff

pfIRF

/1

/

)/( 0DD

eP

27

3 Resultaten

3.1 MSearch Classifier

De reden dat bij de MSearch van FISH-TC-slides tijdens de vorige masterproefstudie weinig

metafasen werden gedetecteerd, is dat de classifiers niet optimaal waren voor de detectie van de

FISH-gekleurde metafasen (Tabel 8). Er was tijdens deze masterproef geen reden om aan te

nemen dat de TC-kleuring zou leiden tot het wegwassen van de metafasen. Na een eerste

vergelijking tussen de reeds bestaande classifiers werd beslist om een nieuwe classifier,

‘MPhaseDetect FL Celine1’, te ontwikkelen op basis van de ‘MPhaseDetect FL’ classifier en de

aangeduide metafasen in de trainingsbestanden. Nadien werden de classifiers opnieuw

vergeleken door acht verschillende slides in te scannen (Tabel 8). De classifier ‘MPhaseDetect

FL Celine1’ detecteerde opmerkelijk meer en goede metafasen, daarom werd gedurende deze

studie gebruik gemaakt van de nieuwe classifier.

Tabel 8: Vergelijking tussen de MSearch Classifiers.

Donor en dosis

Totaal aantal “metafasen”a gedetecteerd door de classifier:

MPhaseDetect FL Oliviab MPhaseDetect FL

b MPhaseDetect FL Celine1

c

D57 0 Gy 46 324 1707d

D57 0 Gy 27 42 1334

D57 0 Gy 9 18 363

D1 1 Gy 47 2 603

D1 2 Gy 26 18 575

D1 4 Gy 4 15 1014

D57 2 Gy 267 74 1734d

D57 4 Gy 97 61 1776d

a Tijdens het inscannen van de slides werden ook niet-metafasen gedetecteerd (in de minderheid), dit waren voornamelijk kernen van

lymfocyten; b Reeds bestaande classifiers; c De nieuwe classifier; d Het aantal metafasen werd reeds halverwege de slide bekomen.

Voor de MSearch van Giemsa-slides werd geen probleem vastgesteld omtrent de detectie van

Giemsa-gekleurde metafasen. Er werd gedurende deze masterproef gebruik gemaakt van de

reeds bestaande classifier ‘MPhaseDetect Original’.

3.2 Dosis-respons curves

3.2.1 FISH-TC dosis-respons curve

Wanneer de eerste resultaten van de SAS II TC van de in vitro gesimuleerde volledige

lichaamsbestralingen (1, 2 en 4 Gy), uitgevoerd in deze masterproef (2016-2017), werden

vergeleken met de dosis-respons curve voor SAS II TC opgesteld in 2015-2016, werd er in deze

masterproef voor eenzelfde dosis een hoger aantal dicentrische chromosomen gedetecteerd. De

geobserveerde dicentrische opbrengsten van de bloedstalen bestraald met 1, 2 en 4 Gy (2016-

2017) (Tabel 9) worden t.o.v. de dosis-respons curve 2015-2016 (Y= 0 + 0,0296D + 0,0548D2)

28

weergegeven in Figuur 11. Daarnaast werden de dosissen ingeschat aan de hand van deze

dosis-respons curve. De ingeschatte dosissen en de betrouwbaarheidsintervallen worden

weergegeven in Tabel 9. De 95% betrouwbaarheidsintervallen van de ingeschatte dosissen

includeerden in geen enkel geval de werkelijke dosis.

0

0,441

0,147

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5

# D

icen

tris

ch

e p

er

cel

Dosis (Gy)

FISH-TC 2015-2016

Figuur 11: Vergelijking eerste resultaten FISH-TC 2016-2017 (zie Tabel 9) en FISH-TC dosis-respons curve 2015-2016.

Tabel 9: Ingeschatte dosissen van de eerste resultaten 2016-2017 aan de hand van de FISH-TC dosis-respons curve 2015-2016

Werkelijke dosis (Gy) (studie 2016-2017)

Aantal dicentrische per cel* Ingeschatte dosis

1 0,147 1,40 [1,29-1,49]

2 0,441 2,58 [2,38-2,79]

4 1,25 4,52 [4,28-4,75]

*Aantal dicentrische per cel (of geobserveerde dicentrische opbrengst) is het gemiddelde van donor 1 en donor 57 (zie Tabel 14 en Tabel 16; 3.2.3 Validatie dosis-respons curves)

Bij het scoren van dicentrische chromosomen is er steeds enige variatie tussen verschillende

scorers/tellers. Het leek onwaarschijnlijk dat dit uitgesproken verschil te wijten was aan

twijfelgevallen. Wanneer twee slides (1 en 4 Gy) van de studie 2015-2016 herteld werden in deze

studie (Tabel 10) werden ook op deze slides consequent meer dicentrische chromosomen

gedetecteerd dan door de scorer uit 2015-2016.

Tabel 10: Vergelijking semi-automatische scoring II TC scorer 1 (2015-2016) en scorer 2 (2016-2017).

De resultaten verkregen in deze studie met huidige slides (Tabel 9) en vroegere slides (Tabel 10)

waren vergelijkbaar. Omdat de resultaten echter consequent hoger lagen dan de vroegere dosis-

respons curve werd beslist om een nieuwe SAS II TC dosis-respons curve op te stellen. Het

hoofddoel van deze masterproef was namelijk om de bruikbaarheid van de dicentrische test in

Werkelijke dosis (Gy) (studie 2015-2016)

Aantal dicentrische per cel

Scorer 1 (2015-2016) Scorer 2 (2016-2017)

1 0,116 0,177

4 0,987 1,319

29

combinatie met de FISH-TC-kleuring in het geval van een partiële lichaamsblootstelling te

evalueren. De nieuwe dosis-respons curve werd opgesteld aan de hand van zes dosispunten. De

slides, afkomstig van twee verschillende donoren (D1 en D47), waren reeds beschikbaar voor

scoring en werden ook gebruikt in de studie 2015-2016 voor het opstellen van de dosis-respons

curve.

Tabel 11: De dicentrische opbrengst bij de verschillende dosispunten na SAS II van FISH-TC-gekleurde metafasen.

Dosis (Gy) N X Y

0 1302 3 0,002

0,50 442 10 0,023

1 838 103 0,123

2 763 336 0,440

3 338 268 0,793

4 340 447 1,310

Tabel 11 toont de verschillende dosispunten, het aantal geanalyseerde metafasen (N), het aantal

gedetecteerde dicentrische chromosomen (X) en de dicentrische opbrengst (Y=X/N) per

dosispunt. De gegevens van Tabel 11 werden ingegeven in Dose Estimate en gefit aan een

lineair-kwadratisch model, Y = C + αD + βD2. De coëfficiënten (+/- standaardfout) van de nieuwe

FISH-TC dosis-respons curve (Figuur 12; A) zijn: C = 0,0021 (+/- 0,0023), α = 0,0450 (+/- 0,0244)

en β = 0,0745 (+/- 0,0101). De nieuwe dosis-respons curve (2016-2017) ligt duidelijk hoger dan

de vroegere dosis-respons curve (2015-2016) (Figuur 12; B).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

# D

icen

tris

ch

e p

er

cel

Dosis (Gy)

FISH-TC 2016-2017

FISH-TC 2015-2016

Figuur 12: A: De dosis-respons curve (2016-2017) na semi-automatische scoring II van FISH-TC-

gekleurde metafasen (Dose Estimate). B: Vergelijking tussen dosis-respons curve 2016-2017 en 2015-2016 voor semi-automatische scoring II van FISH-TC gekleurde metafasen.

A. B.

30

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 0,5 1 1,5 2

# D

icen

tris

ch

e p

er

cel

Dosis (Gy)

3.2.2 Vergelijking FISH-TC en Giemsa dosis-respons curve

In Figuur 13 wordt de nieuwe curve voor semi-automatische scoring II TC (2016-2017)

vergeleken met de curve voor semi-automatische scoring II Giemsa opgesteld in 2015-2016. In

het lage dosisgebied ligt de FISH-TC curve iets lager dan de Giemsa curve. Vanaf de dosis 1,2

Gy ligt de FISH-TC curve hoger dan de Giemsa-curve.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5

# D

icen

tris

ch

e p

er

cel

Dosis (Gy)

FISH-TC 2016-2017

Giemsa 2015-2016

Figuur 13: Vergelijking dosis-respons curves FISH-TC en Giemsa (+ het dosisgebied van 0 tot 1,5 Gy).

3.2.3 Validatie dosis-respons curves

Om de verschillende dosis-respons curves voor de dicentrische test (Tabel 12) te valideren, werd

de dosis van vier gesimuleerde volledige lichaamsbestralingen van twee donoren (D1 en D57)

ingeschat. De ingeschatte dosissen werden vergeleken tussen de verschillende

scoringsmethoden.

Tabel 12: De waarden van de coëfficiënten (+/- standaardfout) van de verschillende dosis-respons curves.

Scoringsmethode C α (Gy-1

) β (Gy-2

)

AS Ga

(2015-2016) 0,0285 (+/- 0,0035) 0,028 (+/- 0,0076) 0,0285 (+/- 0,0022)

SAS I Gb (2015-2016) 0,001 (+/- 0,009 ) 0,026 (+/- 0,0048 ) 0,0262 (+/- 0,0016 )

SAS II Gc

(2015-2016) 0,0006 (+/- 0,0016 ) 0,0721 (+/- 0,0142 ) 0,0517 (+/- 0,0049 )

SAS II TCd

(2016-2017) 0,0021 (+/- 0,0023) 0,0450 (+/- 0,0244) 0,0745 (+/- 0,0101) a

Automatische scoring Giemsa c Semi-automatische scoring II Giemsa

b Semi-automatische scoring I Giemsa

d Semi-automatische scoring II TC

31

Tabel 13 toont de resultaten van donor 1 verkregen via de verschillende scoringsmethoden. In

Bijlage A Tabel I wordt het aantal geanalyseerde slides, het aantal vastgelegde beelden en het

percentage verworpen metafasen weergegeven.

Na SAS I G van de volledige lichaamsbestraling van 4 Gy werd een significante overdispersie

van de frequentie distributie gedetecteerd (u > 1,96), waardoor deze situatie foutief werd

beschouwd als een partiële lichaamsbestraling. De overige situaties werden correct

geclassificeerd als een volledige lichaamsbestraling (Tabel 13).

Tabel 13: Distributie van de dicentrische chromosomen en de u-waarde voor elke situatie (Donor 1).

Methode WBD

(Gy) N X Y

Frequentie distributie van het #

dicentrische chromosomen per cel σ

2/y

(DI) u-test

0 1 2 3 4 5 6

AS G 0 461 33 0,072 428 33 0 0 0 0 0 0,93 -1,071

1 405 23 0,057 382 23 0 0 0 0 0 0,95 -0,79

2 99 23 0,232 79 18 1 1 0 0 0 1,13 0,91

4 154 46 0,299 113 36 5 0 0 0 0 0,93 -0,67

SAS I G 0 448 1 0,002 447 1 0 0 0 0 0 1 0

1 403 8 0,020 395 8 0 0 0 0 0 0,98 -0,26

2 95 10 0,105 86 8 1 0 0 0 0 1,11 0,77

4 151 42 0,278 120 22 7 2 0 0 0 1,35 3,07

SAS II G 0 298 2 0,007 296 2 0 0 0 0 0 0,99 -0,06

1 328 22 0,067 306 22 0 0 0 0 0 0,94 -0,84

2 62 21 0,339 42 19 1 0 0 0 0 0,77 -1,31

4 134 94 0,70 63 52 15 4 0 0 0 0,88 -0,99

SAS II TC 0 914 1 0,001 913 1 0 0 0 0 0 1 0

1 557 86 0,154 479 70 8 0 0 0 0 1,03 0,56

2 692 281 0,406 463 183 40 6 0 0 0 1,01 0,15

4 157 179 1,140 44 66 32 12 2 1 0 0,87 -1,14

N: Aantal geanalyseerde metafasen; X: Aantal gedetecteerde dicentrische chromosomen; Y: Dicentrische opbrengst u > 1,96: wijst op overdispersie van de frequentie distributie.

Tabel 14: Ingeschatte dosissen a.d.h.v. de verschillende scoringsmethoden (Donor 1).

Werkelijke

WBD (Gy)

Ingeschatte WBD (Gy)

AS G SAS I G SAS II G SAS II TC

0 0,83 [0,47-1,20] 0,05 [0,00-0,74] 0,08 [0,00-0,27] 0,00 [0,00-0,15]

1 0,62 [0,22-1,02] 0,49 [0,00-0,97] 0,63 [0,39-0,88] 1,16 [0,96-1,36]

2 2,23 [1,65-2,80] 1,56 [0,92-2,20] 1,95 [1,48-2,43] 2,05 [1,81-2,28]

4 2,62 [2,16-3,10] 2,80a [2,30-3,29]

3,05 [2,72-3,38] 3,62 [3,17-4,06]

De ingeschatte dosissen van donor 1 worden weergegeven in Tabel 14 voor de verschillende

scoringsmethoden. Bij de AS G methode includeerde het 95% BI van de ingeschatte dosis van

het niet bestraalde bloedstaal 0 niet. Bovendien was deze ingeschatte dosis niet significant

verschillend van 1 Gy. Na SAS I G van 4 Gy werd een partiële lichaamsbestraling aangetoond

(Tabel 13). Naast een inschatting van de WBD, 2,80a Gy, werden ook de IR F en de PBD

berekend. Er werd bekomen dat 73,22% van het bloed bestraald werd bij een dosis van 4,47 Gy.

32

Figuur 14 geeft de ingeschatte dosissen ten opzichte van de werkelijke dosissen weer voor de

verschillende scoringsmethoden. Bij 4 Gy was er in het algemeen een onderschatting van de

dosis, dat het grootst was bij AS G en het kleinst bij SAS II TC. Aan de hand van de AS G

methode was er een duidelijke overschatting van het niet bestraalde bloedstaal (0 Gy).

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5

Ingeschatte dosis (Gy)

Werkelijke dosis (Gy)

AS G

SAS I G

SAS II G

SAS II TC

Figuur 14: De ingeschatte dosissen verkregen via de verschillende scoringsmethoden in functie van de werkelijke dosissen (Donor 1). Opmerking: de rode stip van SAS I G bij 0 Gy ligt onder de groene en blauwe stip. De donker paarse stip van AS G bij 1 Gy ligt onder de blauwe stip.

33

Tabel 15 en Tabel 16 geven een overzicht van de resultaten van donor 57. In Bijlage A Tabel II

wordt het aantal geanalyseerde slides, het aantal vastgelegde beelden en het percentage

verworpen metafasen weergegeven.

Na SAS I G van zowel 2 Gy als 4 Gy was de dispersie-index significant verschillend van één (u >

1,96). Bij de overige volledige lichaamsbestralingen volgde de frequentie distributie de Poisson

distributie (u <1,96) (Tabel 15).

Tabel 15: Distributie van de dicentrische chromosomen en de u-waarde voor elke situatie (Donor 57).

Methode WBD

(Gy) N X Y



2/y

(DI) u-test

0 1 2 3 4 5 6

AS G 0 670 30 0,045 641 28 1 0 0 0 0 1,02 0,44

1 643 64 0,100 584 54 5 0 0 0 0 1,06 1,05

2 672 125 0,186 560 102 7 3 0 0 0 1,07 1,32

4 547 331 0,605 310 160 63 12 1 1 0 1,09 1,52

SAS I G 0 661 0 0,000 661 0 0 0 0 0 0 / /

1 634 24 0,038 610 24 0 0 0 0 0 0,96 -0,66

2 669 104 0,156 585 67 14 3 0 0 0 1,29 5,30

4 496 304 0,613 319 87 62 20 7 1 0 1,54 8,43

SAS II G 0 555 3 0,005 552 3 0 0 0 0 0 0,99 -0,07

1 548 57 0,104 492 55 1 0 0 0 0 0,93 -1,12

2 564 187 0,332 406 133 21 4 0 0 0 1,02 0,40

4 428 437 1,021 154 157 82 25 9 1 0 0,99 -0,11

SAS II TC 0 855 2 0,002 853 2 0 0 0 0 0 1,00 -0,03

1 895 125 0,140 781 103 11 0 0 0 0 1,04 0,80

2 422 202 0,479 261 130 23 6 2 0 0 1,05 0,71

4 468 639 1,365 118 157 122 54 11 4 2 0,95 -0,75

N: Aantal geanalyseerde metafasen; X: Aantal gedetecteerde dicentrische chromosomen; Y: Dicentrische opbrengst u > 1,96: wijst op overdispersie van de frequentie distributie.

De ingeschatte dosissen van donor 57 worden weergegeven in Tabel 16. Nagenoeg alle 95% BI

includeerden de werkelijke dosis. Bij twee situaties werd na SAS I G een overdispersie van de

distributie waargenomen. Naast de ingeschatte WBD 1,98a Gy werd een PBD van 3,63 Gy

bekomen en een IR F van 60,49%. Bij de ingeschatte WBD 4,36b Gy werd een PBD van 6,29 Gy

en een IR F van 86,3% bekomen.

Tabel 16: Ingeschatte dosissen a.d.h.v. de verschillende scoringsmethoden (Donor 57).

Werkelijke

WBD (Gy)


AS G SAS I G SAS II G SAS II TC

0 0,41 [0,04-0,78] 0,00 [0,00-0,75] 0,06 [0,00-0,23] 0,01 [0,00-0,18]

1 1,16 [0,86-1,47] 0,79 [0,39-1,19] 0,88 [0,66-1,10] 1,09 [0,91-1,27]

2 1,91 [1,62-2,21] 1,98a [1,64-2,32] 1,93 [1,68-2,17] 2,25 [1,99-2,50]

4 4,03 [3,69-4,38] 4,36b [4,00-4,72] 3,80 [3,43-4,17] 3,99 [3,58-4,39]

34

De gegevens uit Tabel 16 worden grafisch weergegeven in Figuur 15. Bij donor 57 was er minder

spreiding van de ingeschatte dosissen aan de hand van de verschillende scoringsmethoden

(Figuur 15) in vergelijking met donor 1 (Figuur 14). Net zoals bij donor 1 was er een overschatting

van het niet bestraalde bloedstaal (0 Gy) na AS G (Figuur 15).

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5


Werkelijke dosis (Gy)

AS G

SAS I G

SAS II G

SAS II TC

Figuur 15: De ingeschatte dosissen verkregen via de verschillende scoringsmethoden in functie van de werkelijke dosissen (Donor 57). Opmerking: de rode stip van SAS I G bij 0 Gy ligt onder de groene en de blauwe stip.

3.3 Partiële lichaamsbestraling

Om de bruikbaarheid van de dicentrische test in combinatie met de FISH-TC-kleuring in het

geval van een partiële lichaamsblootstelling (PBE) te evalueren, werden negen verschillende

PBE-situaties gesimuleerd per donor. Voor elke situatie werd de semi-automatische scoring II TC

zowel volgens de triage procedure (± 50 metafasen) als volgens de standaardprocedure (± 500

metafasen of 100 dicentrische chromosomen) uitgevoerd. Tabel 17 en Tabel 19 geven de

statistische gegevens (dispersie-index en u-test) van de frequentie distributie per in vitro

gesimuleerde situatie weer voor respectievelijk donor 1 en donor 57. Een u-waarde groter dan

1,96 is indicatief voor een PBE. Indien dit het geval was, werden de partiële lichaamsdosis (PBD)

en de bestraalde fractie (IR F) ingeschat (Tabel 18 (donor 1) en Tabel 20 (donor 57)).

35

Tabel 17: De statistische gegevens van de frequentie distributie per in vitro gesimuleerde situatie (Donor 1).

PBD (Gy) IR F

(%) N X Y



2/y

(DI) u-test

0 1 2 3 4 5 6

0 0 50 0 0,000 50 0 0 0 0 0 0 * * 720

1 0,001 719 1 0 0 0 0 0 1 0

2 12,50 50 0 0,000 50 0 0 0 0 0 0 * * 672

18 0,027 654 18 0 0 0 0 0 0,98 -0,48

2 25 50 1 0,020 49 1 0 0 0 0 0 1 0 472

21 0,044 454 15 3 0 0 0 0 1,24 3,83

2 37,50 50 3 0,060 47 3 0 0 0 0 0 0,96 -0,25 491

49 0,100 452 30 8 1 0 0 0 1,35 5,57

2 50 50 11 0,220 41 7 2 0 0 0 0 1,17 0,87 375

47 0,125 337 30 7 1 0 0 0 1,30 4,20

2 100 50 23 0,460 33 12 4 1 0 0 0 1,17 0,87 302

122 0,404 204 77 19 1 1 0 0 1,06 0,72

4 6,25 50 1 0,020 49 1 0 0 0 0 0 1 0

590

13 0,022 580 7 3 0 0 0 0 1,44 7,89

4 12,50 50 1 0,020 49 1 0 0 0 0 0 1 0

436

15 0,034 427 6 1 1 1 0 0 2,30 19,91

4 18,75 50 0 0,000 50 0 0 0 0 0 0 * *

448

13 0,029 438 8 1 1 0 0 0 1,59 9,18

4 25 50 9 0,180 44 4 1 1 0 0 0 1,74 3,90

548

46 0,084 515 23 7 3 0 0 0 1,62 10,28

4 50 50 13 0,260 44 2 2 1 1 0 0 2,48 7,63

594

129 0,217 514 47 21 8 4 0 0 1,86 14,79

4 100 50 52 1,040 21 13 10 5 1 0 0 1,18 0,88

130

134 1,031 48 41 32 7 2 0 0 0,95 -0,43 N: Aantal geanalyseerde metafasen; X: Aantal gedetecteerde dicentrische chromosomen; Y: Dicentrische opbrengst Triage procedure. Standaardprocedure. Gesimuleerde volledige lichaamsbestralingen.

* Voor het bepalen van de DI en de u-test moet minimaal één dicentrisch chromosoom gedetecteerd worden. u > 1,96: wijst op een PBE.

Tabel 18: De ingeschatte PBD, IR F en WBD per in vitro gesimuleerde situatie (Donor 1).

PBD

(Gy)

Ingeschatte

PBD (Gy) IR F (%)

Ingeschatte

IR F (%) WBD

(Gy)


Triage Standaard Triage Standaard Triage Standaard

0 ** ** 0 ** ** 0 0,00 [0,00-0,13] 0,00 [0,00-0,16]

2 ** ** 12,5 ** ** 0,25 0,00 [0,00-0,13] 0,35 [0,18-0,52]

2 ** 1,79 25 ** 21,15 0,50 0,27 [0,00-0,74] 0,51 [0,32-0,70]

2 ** 2,25 37,50 ** 33,21 0,75 0,63 [0,14-1,12] 0,88 [0,68-1,08]

2 ** 2,14 50 ** 42,26 1 1,44 [0,96-1,91] 1,02 [0,80-1,24]

2 ** ** 100 ** ** 2 2,20 [1,76-2,63] 2,04 [1,77-2,30]

4 ** 2,43 6,25 ** 7,68 0,25 0,27 [0,00-0,74] 0,30 [0,12-0,47]

4 ** 3,60 12,50 ** 8,03 0,50 0,27 [0,00-0,74] 0,42 [0,23-0,62]

4 ** 2,43 18,75 ** 9,99 0,75 0,00 [0,00-0,13] 0,37 [0,18-0,56]

4 3,12 2,80 25 38,79 22,80 1 1,27 [0,79-1,75] 0,79 [0,60-0,98]

4 4,63 3,46 50 38,48 41,07 2 1,58 [1,12-2,05] 1,42 [1,22-1,63]

4 ** ** 100 ** ** 4 3,44 [2,84-4,04] 3,43 [2,98-3,88]

** Werden niet berekend aangezien er geen PBE werd gedetecteerd (u < 1,96; Tabel 17). Gesimuleerde volledige lichaamsbestralingen

36

Tabel 19: De statistische gegevens van de frequentie distributie per in vitro gesimuleerde situatie (Donor 57).

PBD (Gy) IR F

(%) N X Y



2/y

(DI) u-test

0 1 2 3 4 5 6

0 0 50 0 0,000 50 0 0 0 0 0 0 * *

886

0 0,000 886 0 0 0 0 0 0 * *

2 12,50 50 1 0,020 49 1 0 0 0 0 0 1 0 556

23 0,041 536 17 3 0 0 0 0 1,22 3,78

2 25 50 12 0,240 45 1 2 1 1 0 0 2,65 8,51 523

41 0,078 491 26 4 1 1 0 0 1,56 9,14

2 37,50 50 11 0,220 40 9 1 0 0 0 0 0,98 -0,10 514

86 0,167 444 55 14 1 0 0 0 1,23 3,71

2 50 50 17 0,340 38 7 5 0 0 0 0 1,27 1,40 460

92 0,200 387 56 15 2 0 0 0 1,26 3,95

2 100 50 28 0,583 27 18 5 0 0 0 0 0,81 -0,94 350

162 0,463 217 109 19 5 0 0 0 0,96 -0,54

4 6,25 50 7 0,140 46 3 0 0 1 0 0 2,63 8,70 513

14 0,027 503 8 1 0 1 0 0 1,98 16,21

4 12,50 50 10 0,200 46 1 2 0 0 1 0 3,27 11,82 504

35 0,069 484 9 9 1 0 1 0 2,19 19,18

4 18,75 50 2 0,040 49 0 1 0 0 0 0 2,00 7,00 550

45 0,082 528 7 8 6 1 0 0 2,34 22,53

4 25 50 12 0,240 45 1 2 1 1 0 0 2,65 8,51 552

64 0,116 518 13 14 5 2 0 0 2,17 19,56

4 50 50 13 0,260 43 4 1 1 1 0 0 2,33 6,83 381

91 0,239 333 21 16 7 3 1 0 2,20 16,57

4 100 50 75 1,500 10 16 16 5 3 0 0 0,82 -0,88

105

170 1,619 20 35 26 16 6 1 1 0,98 -0,16 N: Aantal geanalyseerde metafasen; X: Aantal gedetecteerde dicentrische chromosomen; Y: Dicentrische opbrengst Triage procedure. Standaardprocedure. Gesimuleerde volledige lichaamsbestralingen.

* Voor het bepalen van de DI en de u-test moet minimaal één dicentrisch chromosoom gedetecteerd worden. u > 1,96: wijst op een PBE.

Tabel 20: De ingeschatte PBD, IR F en WBD per in vitro gesimuleerde situatie (Donor 57).

PBD

(Gy)

Ingeschatte

PBD (Gy) IR F (%)

Ingeschatte

IR F (%) WBD

(Gy)


Triage

Standaard

Triage Standaard Triage Standaard

0 ** ** 0 ** ** 0 0,00 [0,00-0,13] 0,00 [0,00-0,13]

2 ** 1,69 12,5 ** 21,18 0,25 0,27 [0,00-0,74] 0,48 [0,30-0,67]

2 5,03 2,35 25 34,86 25,72 0,50 1,51 [1,04-1,98] 0,75 [0,56-0,95]

2 ** 2,11 37,50 ** 53,73 0,75 1,44 [0,96-1,91] 1,22 [1,01-1,43]

2 ** 2,25 50 ** 57,50 1 1,85 [1,40-2,30] 1,36 [1,14-1,57]

2 ** ** 100 ** ** 2 2,45 [2,04-2,87] 2,20 [1,94-2,47]

4 3,80 2,82 6,25 27,08 8,06 0,25 1,09 [0,61-1,58] 0,35 [0,17-0,54]

4 5,17 3,80 12,50 30 14,76 0,50 1,36 [0,88-1,83] 0,69 [0,50-0,89]

4 4,32 4,41 18,75 8,10 15,44 0,75 0,47 [0,00-0,96] 0,78 [0,59-0,97]

4 5,03 4,08 25 34,86 21,98 1 1,51 [1,04-1,98] 0,97 [0,78-1,17]

4 4,04 4,12 50 41,81 38,84 2 1,58 [1,12-2,05] 1,51 [1,27-1,74]

4 ** ** 100 ** ** 4 4,19 [3,56-4,83] 4,37 [3,84-4,90]

** Werden niet berekend aangezien er geen PBE werd gedetecteerd (u < 1,96; Tabel 19). Gesimuleerde volledige lichaamsbestralingen.

37

Detectie partiële lichaamsbestraling

Zowel bij de triage situatie (50 metafasen) als bij de standaardprocedure (± 500 metafasen of ±

100 dicentrische chromosomen) werden de volledige lichaamsbestralingen (2 Gy - IR F 100% en 4

Gy - IR F 100%) als dusdanig herkend voor beide donoren (Tabel 17 en Tabel 19).

Per donor werden vier PBE met een PBD van 2 Gy en vijf PBE met een PBD van 4 Gy

gesimuleerd. In het geval van de triage modus werden de situaties waarbij 25% en 50% van het

bloed bestraald werd met 4 Gy correct geclassificeerd als een PBE bij donor 1 (Tabel 17). Bij

donor 57 werden alle vijf de partiële lichaamsbestralingen met een dosis van 4 Gy correct

geïdentificeerd als een PBE. De partiële lichaamsbestraling waarbij 25% van het bloed bestraald

werd met 2 Gy werd eveneens gedetecteerd bij donor 57. Dit kan verklaard worden doordat van

de vijf beschadigde metafasen één metafase drie dicentrische en één metafase vier dicentrische

chromosomen had. Bij de overige gesimuleerde partiële lichaamsbestralingen van donor 1 en 57

kon in triage modus geen overdispersie van de frequentie distributie waargenomen worden.

Na het uitvoeren van de standaardprocedure werden acht van de negen partiële

lichaamsbestralingen gedetecteerd bij donor 1 (Tabel 17). Bij één situatie (PBD 2 Gy – 12,5%) was

er geen overdispersie van de distributie. Bij donor 57 (Tabel 19) werden de negen gesimuleerde

partiële lichaamsbestralingen als dusdanig herkend.

Naast een correcte identificatie van het type blootstelling is eveneens een correcte inschatting

van de partiële lichaamsdosis (PBD), het percentage bloed/lichaam blootgesteld aan straling (IR

F) en de volledige lichaamsdosis (WBD) essentieel.

Correctheid van de inschattingen

Figuur 16 geeft de ingeschatte volledige lichaamsdosissen ten opzichte van de werkelijke

volledige lichaamsdosissen weer, zowel voor de triage procedure als de standaardprocedure.

Figuur 16: De ingeschatte WBD in functie van de werkelijke WBD. De omkaderde situaties stellen de volledige lichaamsbestralingen bij een dosis van 2 Gy voor. De omcirkelde situaties stellen de volledige lichaamsbestralingen bij een dosis van 4 Gy voor. Links: donor 1 (Tabel 18) Opmerking: de blauwe stip van ‘triage PBD 4 Gy’ bij WBD 4 Gy ligt onder de groene stip van ‘standaard PBD 4 Gy’. Rechts: donor 57 (Tabel 20).

38

De triage procedure en de standaardprocedure leidden tot vergelijkbare inschattingen van de

WBD bij de gesimuleerde volledige lichaamsbestralingen (Figuur 16). Bij donor 1 was er een

onderschatting van de WBD van 4 Gy (Tabel 18). In het geval van de partiële

lichaamsbestralingen waren de over- of onderschattingen van WBD vaak groter bij de triage

modus dan bij de standaardprocedure. Voornamelijk bij donor 57 was er meer spreiding van de

ingeschatte volledige lichaamsdosissen (Figuur 16).

Figuur 17 toont de ingeschatte PBD ten opzichte van de werkelijke PBD in functie van de IR F. Bij

een PBD van 4 Gy was er bij donor 1 een duidelijke onderschatting van de werkelijke PBD bij

een IR F van 6,25%, 18,75% en 25%. Bij donor 57 was dit enkel het geval bij een IR F van

6,25%. Figuur 18 geeft de ingeschatte IR F ten opzichte van de werkelijke IR F in functie van de

PBD weer. Er waren zowel over- als onderschattingen van de werkelijke IR F.

Figuur 17: De ingeschatte PBD ten opzichte van de werkelijke PBD in functie van de IR F. Links: donor 1 (Tabel 18). Rechts: donor 57 (Tabel 20).

Figuur 18: De ingeschatte IR F ten opzichte van de werkelijke IR F in functie van de PBD. Links: donor 1 (Tabel 18). Rechts: donor 57 (Tabel 20).

39

3.4 Realizing the European Network of Biodosimetry

Voor het EU project RENEB werden drie bloedstalen, A, B en C, opgestuurd door één van de

partners uit het RENEB netwerk (Institut de radioprotection et de sûreté nucléaire (ISRN),

Frankrijk). De bloedstalen werden verwerkt volgens het protocol beschreven in het onderdeel

‘Materiaal en methoden’. De dosissen werden bepaald aan de hand van zowel SAS II G als SAS

II TC. Tabel 21 en Tabel 22 geven een overzicht van de resultaten.

Tabel 21: De statistische gegevens van de frequentie distributies van de RENEB bloedstalen na analyse van 250 metafasen.

Methode RENEB

Staal N X Y



2/y

(DI) u-test

0 1 2 3 4 5 6

SAS II G A 250 60 0,240 194 53 2 1 0 0 0 0,93 -0,78

SAS II TC A 250 77 0,308 176 71 3 0 0 0 0 0,77 -2,55

SAS II G B 250 1 0,004 249 1 0 0 0 0 0 1,00 0,00

SAS II TC B 250 0 0,000 250 0 0 0 0 0 0 * *

SAS II G C 250 8 0,032 242 8 0 0 0 0 0 0,97 -0,34

SAS II TC C 250 9 0,036 242 7 1 0 0 0 0 1,19 2,26

N: Aantal geanalyseerde metafasen; X: Aantal gedetecteerde dicentrische chromosomen; Y: Dicentrische opbrengst

*Voor het bepalen van de DI en de u-test moet minimaal één dicentrisch chromosoom gedetecteerd worden.

u > 1,96: wijst op een PBE.

De werkelijke en ingeschatte dosissen kunnen teruggevonden worden in Tabel 22. De 95%

betrouwbaarheidsintervallen includeerden de werkelijke dosis. Na SAS II TC van bloedstaal C

was er een overdispersie van de frequentie distributie. Naast de ingeschatte WBD van 0,44 Gy

werd een ingeschatte PBD van 1,51 Gy en een ingeschatte IR F van 21,32% bekomen.

Tabel 22: De werkelijke en de ingeschatte dosissen van de toegestuurde bloedstalen.

Bloedstaal Werkelijke

dosis (Gy)


SAS II G SAS II TC

RENEB A 1,80 1,57 [1,28-1,85] 1,75 [1,48-2,01]

RENEB B 0,00 0,05 [0,00-0,23] 0,00 [0,00-0,13]

RENEB C 0,40 0,35 [0,10-0,59] 0,44 [0,20-0,68]

40

4 Bespreking

4.1 MSearch Classifier

De nieuwe classifier ‘MPhaseDetect FL Celine1’ detecteerde opmerkelijk veel meer metafasen

dan de reeds bestaande classifiers. Hoewel de classifier getraind werd om enkel metafasen te

detecteren, werden ook steeds kernen van lymfocyten ingescand. Toch opteerden we hiermee

verder te werken wegens een duidelijk hoger aantal metafasen (Tabel 8).

4.2 Dosis-respons curves

Tot op heden is de dicentrische chromosoomaberratie test de ‘gouden standaard’ methode voor

het bepalen van de opgelopen stralingsdosis tijdens een stralingsaccident [16]. In het

biodosimetrie laboratorium van de UGent werden tijdens de masterproef 2015-2016 vier

verschillende scoringsmethodes uitgewerkt: automatische scoring (Giemsa), semi-automatische

scoring I (Giemsa) en semi-automatische scoring II (Giemsa en FISH-TC). In deze studie (2016-

2017) werd een nieuwe dosis-respons curve voor semi-automatische scoring II TC opgesteld.

4.2.1 FISH-TC dosis-respons curve

Wanneer de nieuwe SAS II TC curve (2016-2017) vergeleken wordt met de SAS II G curve

(2015-2016), ligt de FISH-TC-curve hoger vanaf 1,2 Gy (Figuur 13). In de studie van M’kacher et

al. (2014) [32] werd eveneens een dosis-respons curve opgesteld voor SAS II van zowel Giemsa

als FISH-TC metafasen. Voor de FISH-TC-kleuring werden dezelfde probes gebruikt als in deze

masterproef. De FISH-TC curve in de studie van M’kacher et al. ligt over het volledige

dosisgebied hoger dan hun Giemsa-curve.

In de IAEA manual wordt aanbevolen om een dosis-respons curve op te stellen aan de hand van

tien dosispunten in het bereik van 0,25 tot 5 Gy, waarvan een minimum aan vier dosispunten in

het gebied van 0,25 tot 1 Gy ligt. Bovendien wordt aangeraden om 3000 tot 4000 metafasen te

analyseren per dosispunt kleiner dan 1 Gy. Wanneer dit het geval is, is de fout op de curve

minimaal en verwaarloosbaar [16]. In het lage dosisgebied (<1 Gy) voldoet de in deze

masterproef opgestelde SAS II TC dosis-respons curve (Tabel 11) niet aan de IAEA

aanbevelingen. Daarom wordt aangeraden om in de toekomst de SAS II TC dosis-respons curve

verder uit te werken door het aantal dosispunten in het lage dosisgebied te verhogen. Daarna

kan de minimale detectielimiet van deze SAS II TC respons-curve onderzocht worden.

41

Verschillen tussen FISH-TC en Giemsa kleurmethode voor de detectie van dicentrische

chromosomen

In deze paragraaf worden de algemene verschillen tussen FISH-TC en Giemsa besproken. Deze

bevindingen hebben betrekking op de volledige studie, maar zeggen nog niets over de

correctheid omtrent de dosisinschattingen (zie 4.2.2. Validatie dosis-respons curves).

Voor eenzelfde dosis werd een hoger aantal dicentrische chromosomen gedetecteerd bij de

FISH-TC-kleuring in vergelijking met de Giemsa-kleuring (zie Resultaten 3.2.2 Vergelijking FISH-

TC en Giemsa dosis-respons curve). De verklaring is dat de efficiëntie van detectie werd

verhoogd door de visualisatie van de centromeren én de telomeren, voornamelijk als een

centromeer dicht nabij de telomeren lag of wanneer beide centromeren in elkaars nabijheid lagen

of als twee chromosomen elkaar overlapten [32] (Figuur 19). Tijdens de volledige studie werd dan

ook bevonden dat het scoren van dicentrische chromosomen na FISH-TC-kleuring gemakkelijker

was en met meer zekerheid verliep in vergelijking met de Giemsa-kleuring (Figuur 19). De studie

van M’kacher et al. gaf aan dat het gebruik van TC-probes leidt tot een reductie van de

analysetijd [32]. Doch was het verschil in tijd voor het analyseren van 100 metafasen gedurende

deze masterproefstudie miniem. Voor beide methoden was dit ongeveer 30 minuten. Voor het

scoren van dicentrische chromosomen speelde ook de kwaliteit van de metafasen een grotere

rol bij de Giemsa-kleuring dan bij de TC-kleuring. Bij de Giemsa-kleuring werden veel meer

metafasen verworpen (Bijlage A Tabel I en II). In de studie van M’kacher et al. werd ook

aangetoond dat het analyseren van FISH-TC metafasen veel minder afhankelijk is van de

expertise van de operator [32].

Een nadeel van de FISH-TC-kleuring was de duur van de kleuring. Bovendien werden tijdens

deze masterproef veel minder slides gekleurd tijdens een FISH-kleuring dan tijdens een Giemsa-

kleuring, dit wegens de complexiteit van de FISH-kleuring (zie Materiaal en methoden). De

Autocapt van de FISH-TC-gekleurde metafasen nam ook veel meer tijd in beslag dan van de

Giemsa-gekleurde metafasen: 2 uur 20 minuten per 500 metafasen versus 1 uur per 500

metafasen. Dit was op zich geen probleem, aangezien dit vaak ’s nachts gebeurde.

42

Figuur 19: Bij de FISH-TC-kleuring is het duidelijk dat het gaat om A. een tricentrisch chromosoom in een

kromming. B. een centromeer dicht nabij het telomeer (links onder), een dicentrisch chromosoom dicht nabij een chromosoom (rechts boven). Bij de Giemsa-kleuring is het minder zeker of het gaat om

aangrenzende chromosomen (C, D en E) of een dicentrisch (C en D) of tricentrisch chromosoom (E).

F. Twee overlappende chromosomen, door de FISH-TC-kleuring is het duidelijk dat het onderliggende

chromosoom geen tweede centromeer bevat. G. De veronderstelling is dat het twee afzonderlijke chromosomen zijn, toch weet je niet of het lange chromosoom op zijn uiteinde nog een centromeer bevat t.h.v. de overlapping [Onderzoeksgroep Radiobiologie UGent].

A B

D E

F G

C

43

4.2.2 Validatie dosis-respons curves

De focus tijdens dit onderdeel van studie was om de dosis-respons curves te valideren en de

geschiktheid van de verschillende scoringsmethoden (AS G, SAS I G, SAS II G en SAS II TC)

van de dicentrische test te vergelijken. Hiervoor werden vier volledige lichaamsbestralingen (0, 1,

2 en 4 Gy) gesimuleerd per donor.

Na AS G werden alle volledige lichaamsbestralingen als dusdanig herkend. Bij het niet

bestraalde bloedstaal (0 Gy) was er een duidelijke overschatting van de dosis na AS G, zowel bij

donor 1 (0,83 Gy) (Tabel 14) als bij donor 57 (0,41 Gy) (Tabel 16). Na SAS I G werd een

inschatting van 0,05 Gy voor donor 1 en 0 Gy voor donor 57 bekomen. Dit toont aan dat een zeer

groot aantal automatisch gedetecteerde dicentrische chromosomen in feite geen dicentrische

chromosomen waren. Bij donor 57 werd met de AS G methode een goede inschatting van de

werkelijke dosissen 1, 2 en 4 Gy bekomen, maar dit was niet het geval bij donor 1. In de studie

van Romm et al. (2013) werd aangegeven dat de kwaliteit van de metafasen een impact heeft op

het aantal gedetecteerde dicentrische chromosomen door de DCScore software [28]. Dit zou een

verklaring kunnen zijn voor de minder goede inschatting bij donor 1. De overschattingen van de

niet bestraalde bloedstalen wijzen erop dat volledige automatische scoring in het lage

dosisgebied niet is aangeraden. In de studie van Romm et al. (2013) werd eveneens vermeld dat

het gebruik van de dicentrische test met een volledige automatische scoring niet mogelijk is door

het groot aantal vals positieve dicentrische chromosomen in het lage dosisgebied [28].

Bij SAS I G werden de volledige lichaamsbestralingen (WBE) niet altijd correct geclassificeerd.

Bij donor 1 werd de WBE bij 4 Gy foutief aanzien als een partiële lichaamsbestraling (Tabel 14).

Bij donor 57 was dit het geval voor de WBE bij 2 en 4 Gy (Tabel 16). In de studie van Romm et al.

(2014) werd eveneens gebruik gemaakt van semi-automatische scoring voor het inschatten van

de dosis van bloedstalen bestraald met 2 en 4 Gy. Het is niet duidelijk of de frequentie

distributies effectief werden geanalyseerd met de u-test vooraleer de dosissen werden ingeschat

[30]. In de studie van Vaurijoux et al. (2012) werd na semi-automatische scoring van een WBD

van 2 Gy geen overdispersie van de frequentie distributie vastgesteld en werd de situatie correct

geclassificeerd [25]. De semi-automatische scoring toegepast in de besproken artikels is

verschillend van de semi-automatische scoring in deze masterproefstudie: in de artikels werd na

automatische scoring enkel gecorrigeerd voor vals positieve dicentrische chromosomen, terwijl in

deze masterproef gecorrigeerd werd voor zowel vals positieve als niet gedetecteerde

dicentrische chromosomen in de geselecteerde metafasen (semi-automatische scoring I). Hoe

dan ook, de foute classificatie van de volledige lichaamsbestralingen na SAS I G is een

belangrijk punt dat verder onderzocht moet worden, vooraleer deze scoringsmethode te

integreren in het biodosimetrie laboratorium als een bruikbare methode.

44

Na SAS II G werden alle volledige lichaamsbestralingen als dusdanig herkend. Net zoals bij AS

G en SAS I G was er bij SAS II G een onderschatting van de werkelijke WBD 1 en 4 Gy bij donor

1 (Tabel 14) en includeerden de 95% betrouwbaarheidsintervallen de werkelijke dosis niet. Bij

donor 57 werd voor alle volledige lichaamsbestralingen een goede inschatting van de werkelijke

dosis bekomen en includeerden de 95% BI de werkelijke dosis (Tabel 16).

Bij SAS II TC werden eveneens de volledige lichaamsbestralingen als dusdanig herkend. SAS II

TC leidde tot een correcte inschattingen van alle werkelijke volledige lichaamsdosissen, zowel bij

donor 1 als bij donor 57. Bovendien bevatte elk 95% BI de werkelijke dosis. In deze

masterproefstudie werd geen onderzoek gedaan naar de automatische scoring van TC-

gekleurde probes, vermits het biodosimetrie laboratorium niet beschikt over de nodige software.

In de studie van M’kacher et al. (2014) werden de TC-gekleurde dicentrische chromosomen wel

automatisch gescoord door een zelf ontwikkeld TCScore softwareprogramma. Hierbij werden

95% van de manueel gescoorde dicentrische chromosomen gedetecteerd en was er een

tienvoudige reductie van de analysetijd (TCScore + manuele correctie) ten opzichte van hun

manuele scoring (cfr. semi-automatische scoring II) [32]. Het percentage automatisch

gedetecteerde dicentrische chromosomen door de TCScore software is een enorme verbetering

ten opzichte van de 40 à 50% bij de automatische scoring van Giemsa-gekleurde preparaten

door de DCScore software [28]. De onderzoeksgroep van M’kacher (Commissariat à l’Energie

Atomique (CEA)) is naast de onderzoeksgroep Radiobiologie van de UGent de enige

onderzoeksgroep die onderzoek doet naar de bruikbaarheid van de TC-probes voor de DCA test.

Wanneer de verschillende methoden werden vergeleken op basis van 1) de dosisinschatting van

de niet bestraalde bloedstalen, 2) de correcte herkenning van de WBE en 3) de over- en

onderschattingen van de dosissen 1, 2 en 4 Gy, kan in deze masterproefstudie de SAS II TC in

het algemeen beschouwd worden als de beste methode. De SAS II TC methode was bij donor

57 zeer goed vergelijkbaar met de SAS II G methode. Echter werd in deze studie voor SAS II G

gebruik gemaakt van een eerder opgestelde dosis-respons curve, terwijl voor SAS II TC een

nieuwe (eigen) opgestelde dosis-respons curve werd gebruikt.

4.3 Partiële lichaamsbestraling

De DCA test wordt preferentieel verkozen om het type blootstelling na een stralingsaccident te

bepalen [9, 11, 25]. De studies omtrent de bruikbaarheid van de DCA test maakten echter

allemaal gebruik van Giemsa-gekleurde metafasen. In dit onderzoek werd de bruikbaarheid van

DCA test in combinatie met de FISH-TC-kleuring in het kader van een partiële lichaamsbestraling

(PBE) geëvalueerd om een antwoord te vinden op volgende vragen: 1) kan via de SAS II TC

methode een partiële lichaamsbestraling gedetecteerd worden? 2) zo ja, hoe goed kan de PBD,

IR F en WBD worden ingeschat?.

45

In het geval van een triage situatie worden 50 metafasen gescoord [23]. Het scoren van 50

metafasen leidde in deze masterproefstudie, net zoals in de studie van Lloyd et al. (2000) [29] en

in de studie van Prasanna et al. (2010) [9], tot goede dosisinschattingen van de WBD bij de

gesimuleerde volledige lichaamsbestralingen (Figuur 16).

Na het scoren van slechts 50 metafasen was de kans op detectie van een PBE bij 2 Gy nihil. Bij

een PBD van 4 Gy was de kans op detectie veel groter en het grootst wanneer 25% of 50% van

het bloed bestraald werd (Tabel 17 en Tabel 19). In de studie van Lloyd et al. (2000) werden

verschillende situaties van PBE gesimuleerd [29], waarvan de situaties PBD 2 Gy - IR F 50% en

PBD 4 Gy - IR F 50 % ook in deze masterproef werden gehanteerd. In deze masterproefstudie

werden de partiële lichaamsbestralingen waarbij 50% van het bloed bestraald werd met 2 Gy niet

herkend als een PBE. Terwijl de partiële lichaamsbestralingen waarbij 50% van het bloed

bestraald werd met 4 Gy wel werden geïdentificeerd als een PBE bij donor 1 én donor 57. Ook

de situaties waarbij 25% van het bloed bestraald werd met 4 Gy werden als een PBE

geclassificeerd bij donor 1 én donor 57. In de studie van Lloyd et al. werd eveneens geen enkele

PBE van 2 Gy - 50% als dusdanig herkend en werd één van de acht gesimuleerde PBE van 4 Gy

- 50% niet als dusdanig herkend. In diezelfde studie werd één van vier gesimuleerde PBE van 3

Gy - 50% niet als dusdanig herkend en werden alle PBE 5 Gy - 50% correct herkend [29]. In de

studie van Prasanna et al. (2010) werd één situatie waarbij 50% van het bloed werd bestraald

met 3 Gy gesimuleerd, maar deze PBE werd niet als dusdanig herkend [9]. In de studie van Lloyd

et al. werden de ingeschatte waarden van de werkelijke PBD vergeleken ten opzichte van

dosisintervallen, die in de studie van Lloyd werden beschouwd als voldoende accuraat voor

triage. Ingeschatte dosissen van 4 Gy werden als correct beschouwd wanneer ze binnen het

dosisinterval van 3 tot 5 Gy vielen [29]. Wanneer de ingeschatte waarden van de PBD van 4 Gy

van de gedetecteerde PBE uit deze masterproefstudie (Tabel 18 en Tabel 20) werden vergeleken

met het dosisinterval uit de studie van Lloyd et al., dan konden nagenoeg alle dosisinschattingen

van de PBD als correct beschouwd worden.

Voor het inschatten van de IR F en WBD leidde de triage modus meestal tot een minder correcte

inschatting dan de standaardprocedure (Tabel 18 en Tabel 20). Maar bij de situatie waarbij 50%

van het bloed bestraald werd met 4 Gy waren de ingeschatte waarden van de werkelijke PBD, IR

F en WBD zeer vergelijkbaar tussen beide procedures voor beide donoren. Bij beide procedures

was er wel een onderschatting van de WBD 2 Gy (Tabel 18 en Tabel 20).

Enerzijds bevestigen deze observaties dat het analyseren van 50 metafasen een betrouwbare

aanpak is in het geval van grootschalige stralingsaccident, waarbij de slachtoffers volledig

werden blootgesteld aan straling. Anderzijds benadrukken deze observaties dat het scoren van

50 metafasen onvoldoende is om een PBE bij een lage dosis en/of bij een klein bestraald volume

op te sporen en initieel kan leiden tot foute conclusies.

46

Dit toont het belang aan om na triage het aantal metafasen te verhogen, aangezien het meer

waarschijnlijk is dat de slachtoffers partieel werden blootgesteld aan straling. Deze bevindingen

gelden zowel voor SAS II TC (deze masterproefstudie) als voor SAS II G (studie Lloyd et al. en

studie Prasanna et al.), waaruit kan geconcludeerd worden dat ook bij SAS II TC het detecteren

van een PBE afhankelijk is van het aantal geanalyseerde metafasen, de ontvangen partiële

lichaamsdosis en de bestraalde fractie.

Na het uitvoeren van de standaardprocedure werden alle PBE als dusdanig gedetecteerd op één

situatie na (Donor 1: PBD 2 Gy – IR F 12,50%) (Tabel 17). In deze masterproef werd 12,5%, 25%,

37,50% en 50% van het bloed bestraald met 2 Gy en werd 6,25%, 12,5%, 18,75%, 25% en 50%

van het bloed bestraald met 4 Gy. In het onderzoek van Barquinero et al. (1997) werd naast

12,5%, 25% en 50% ook 75% en 87,5% van het bloed bestraald met 2 en 4 Gy. Per conditie

werden 500 metafasen of 100 dicentrische chromosomen manueel (microscopisch) gescoord.

Wanneer het percentage bestraald bloed kleiner of gelijk aan 75% was, werden de PBE als

dusdanig herkend. De situaties waarbij 87,5% van het bloed bestraald werd met 2 en 4 Gy,

werden niet herkend als een PBE. Wanneer 87,5% van het bloed bestraald werd met 5 Gy, werd

er wel een PBE gedetecteerd [11]. In de studie van Vaurijoux et al. (2012) werd 5%, 15%, 25%,

50%, 60%, 75% en 90% van het bloed bestraald met 2 Gy. De dicentrische chromosomen

werden automatisch gescoord door de DCScore software en nadien gecontroleerd door een

operator. Hierbij werden 6000 cellen per conditie geanalyseerd. Enkel de conditie waarbij 90%

van het bloed bestraald werd, werd niet herkend als een PBE [25]. In deze masterproefstudie

waren de IR F niet groter dan 50%. De detectie van een PBE met een grotere IR F aan de hand

van de SAS II TC methode zal in de toekomst nog moeten nagegaan worden.

In deze masterproefstudie werden de ingeschatte WBD, PBD en IR F uitgezet ten opzichte van

hun werkelijke waarde in de Figuren 16, 17 en 18. Hierin kon geen duidelijke trend waargenomen

worden. Er waren zowel onder- als overschattingen, maar meestal waren de waarden nog in

goede overeenkomst met de werkelijke waarde. Bij donor 57 was er een overschatting van alle

WBD bij de gesimuleerde PBE van 2 Gy (Figuur 16). Bij zowel donor 1 als donor 57 was er een

onderschatting van de WBD bij de situatie waarbij 50% van het bloed bestraald werd met 4 Gy

(±1,50 Gy i.p.v. de werkelijke 2 Gy) (Figuur 16). Bij de verschillende situaties met PBD van 2 Gy

lagen de ingeschatte waarden van de PBD rond de werkelijke waarde 2 Gy, voor zowel donor 1

als donor 57. Bij een PBD van 4 Gy waren er enkele duidelijke onderschattingen van de PBD

(Figuur 17).

De meest vergelijkbare studie met deze masterproef is de studie uitgevoerd door de

onderzoeksgroep Radiobiologie van de UGent (2015-2016) [35], waarbij identieke situaties voor

de standaardprocedure werden gehanteerd, maar met Giemsa-gekleurde preparaten. Er werd

eveneens gebruik gemaakt van twee donoren, D1 en D2.

47

Donor 1 is dezelfde donor als donor 1 in deze masterproefstudie. De resultaten uit de studie

2015-2016 kunnen geraadpleegd worden per donor in Bijlage B: Tabellen III, IV, V en VI. Op één

situatie na (donor 2: PBD 2 Gy – IR F 37,50%) werden alle PBE als dusdanig herkend. In deze

masterproefstudie werd eveneens één situatie niet gedetecteerd (donor 1: PBD 2 Gy- IR F 12,50%).

De procentuele afwijking op de ingeschatte waarden van de WBD, PBD en IR F werden

berekend zodat een betere vergelijking kon gemaakt worden tussen SAS II G en SAS II TC

(Bijlage C: Tabellen VII, VIII en IX). Voor het berekenen van de procentuele afwijkingen werd

volgende formule toegepast: (werkelijke waarde - ingeschatte waarde) / werkelijke waarde * 100.

Hoe groter de procentuele afwijking, hoe lager de accuraatheid van de inschatting. De

gemiddelde procentuele afwijkingen op de ingeschatte WBD, PBD en IR F waren meestal groter

bij SAS II G dan bij SAS II TC. Dit betekent dat SAS II TC in de meeste gevallen leidde tot een

accuratere inschatting.

In de masterproef 2015-2016 werden ook situaties gesimuleerd met een PBD van 6 Gy [35].

Alhoewel de inschattingen van de WBD vrij correct waren, was er een duidelijke onderschatting

van de PBD wanneer een klein percentage van het bloed werd bestraald. Bovendien was er bij

elke situatie een duidelijke overschatting van de werkelijke IR F. Het zou interessant zijn om na

te gaan of SAS II van TC-gekleurde metafasen bij een PBD van 6 Gy kan leiden tot een

correctere voorspelling van de PBD en IR F.

Samengevat kan geconcludeerd worden dat een correcte scoring zeer belangrijk is bij een

partiële lichaamsbestraling. Semi-automatische scoring II van FISH-TC gekleurde preparaten

leidde in deze masterproefstudie tot relatief goede inschattingen van de PBD, IR F en WBD.

Deze inschattingen waren vaak correcter dan de inschattingen verkregen via SAS II G. Dit kan

verklaard worden door het feit dat er bij de FISH-TC minder ervaring vereist is voor het correct

herkennen van de dicentrische chromosomen en er minder twijfelgevallen zijn (Figuur 19).

4.4 Realizing the European Network of Biodosimetry

In deze masterproef werd de dosis van drie bloedstalen ingeschat aan de hand van de

dicentrische chromosoomaberratie test. De ingeschatte waarden van zowel de Giemsa-tellingen

als de FISH-TC-telling vertoonden een goede overeenkomst met de werkelijke dosissen. Echter,

werd bij het RENEB-staal C op basis van 250 geanalyseerde metafasen een PBE gedetecteerd

na SAS II TC, maar niet na SAS II G. Het miniem verschil in frequentie distributie (Tabel 21)

leidde er toe dat bij SAS II G geen overdispersie werd waargenomen, maar bij SAS II TC wel.

Wanneer 500 metafasen geanalyseerd werden bij bloedstaal C, werd na SAS II TC opnieuw een

PBE (u = 2,84) gedetecteerd. Naast de ingeschatte WBD van 0,46 Gy werd bekomen dat

23,12% van het bloed bestraald werd met een dosis van 1,47 Gy. Na SAS II G van 500

48

metafasen werd opnieuw geen PBE gedetecteerd (u = -0,40). De frequentie distributie bij SAS II

TC was na het analyseren van 500 metafasen als volgt: 483 metafasen met nul dicentrische

chromosomen, vijftien metafasen met één dicentrisch chromosoom en twee metafasen met twee

dicentrische chromosomen, waarvan één tricentrisch chromosoom (werd gescoord als twee

dicentrische chromosomen). Na het scoren van 500 metafasen was er dus nog steeds

discrepantie tussen SAS II G en SAS II TC. Het is echter vreemd dat een tricentrisch

chromosoom werd gedetecteerd, aangezien multicentrische chromosomen nog zeldzamer zijn

dan dicentrische chromosomen en enkel worden gezien bij hoge dosissen [2]. In dit geval was de

werkelijke dosis slechts 0,40 Gy. Wanneer de initiële ingeschatte dosis laag is, wat hier het geval

was, en wanneer men weinig informatie heeft over de accidentele situatie (PBE of WBE), is het

immers aangeraden om meer dan 1000 metafasen te analyseren [16]. In deze masterproef

werden niet zoveel metafasen gescoord. Daarom werden voor de SAS II TC enkele analyses

gesimuleerd om aan te tonen dat één klein verschil in frequentie distributie leidt tot een groot

verschil bij het bepalen van het type blootstelling, terwijl de ingeschatte WBD bij de gesimuleerde

analyses wel zeer vergelijkbaar zullen zijn (Tabel 23). Een analyse van 1000 metafasen had de

initiële veronderstelling kunnen bevestigen of ontkennen.

Tabel 23: Werkelijke analyse (500 metafasen) en gesimuleerde analyses.

Methode RENEB

Staal N X Y



2/y

(DI) u-test

0 1 2 3 4 5 6

SAS II TC C 500 19 0,038 483 15 2 0 0 0 0 1,18 2,84

SAS II TC C 1000 34 0,034 968 30 2 0 0 0 0 1,09 1,92

SAS II TC C 1000 35 0,035 967 31 2 0 0 0 0 1,08 1,82

SAS II TC C 1000 36 0,036 967 30 3 0 0 0 0 1,13 2,99

5 Algemeen besluit

De resultaten verkregen in deze masterproef tonen aan dat de dicentrische

chromosoomaberratie test in combinatie met de telomeer- en centromeerprobes bruikbaar is

voor het bepalen van het type blootstelling in het geval van een stralingsaccident. In vergelijking

met de klassieke Giemsa methode is de FISH-TC methode een vergelijkbare of misschien zelfs

een betere methode voor het inschatten van de partiële lichaamsdosis, de bestraalde fractie en

de volledige lichaamsdosis. Een verdere optimalisatie en validatie aan de hand van een groter

aantal donoren en verschillende gesimuleerde lichaambestralingen is echter nog nodig. Ook

dient de FISH-TC dosis-respons curve nog verder uitgewerkt te worden in het lage dosisgebied.

49

6 Referentielijst

1. Perumal, V. et al. Radiation signature on exposed cells: Relevance in dose estimation. World

Journal of Radiology 7, 266-278 (2015).

2. Rana, S., Kumar, R., Sultana, S. & Sharma, R.K. Radiation-induced biomarkers for the detection

and assessment of absorbed radiation doses. Journal of Pharmacy And Bioallied Sciences 2, 189-

196 (2010).

3. International Atomic Energy Agency (IAEA) and World Health Organization. Diagnosis and

treatment of radiation injuries, safety reports series, No. 2. (1998).

4. Jaworska, A. et al. Guidance for using MULTIBIODOSE tools in Emergencies – for Radiation

Emergency Response Organisations in Europe.

5. https://www.nrc.gov/reading-rm/doc-collections/fact-sheets/chernobyl-bg.html.

6. http://www.fanc.fgov.be/nl/news/fukushima-een-jaar-later/493.aspx.

7. Thierens, H. et al. Cytogenetic biodosimetry of an accidental exposure of a radiological worker

using multiple assays. Radiation Protection Dosimetry 113, 408-414 (2005).

8. Romm, H., Oestreicher, U. & Kulka, U. Cytogenetic damage analysed by the dicentric assay.

Annali dell'Istituto Superiore di Sanità 45, 251-259 (2009).

9. Prasanna, P.G., Moroni, M. & Pellmar, T.C. Triage dose assessment for partial-body exposure:

dicentric analysis. Health Physics 98, 244-251 (2010).

10. Lopez, M. & Martin, M. Medical management of the acute radiation syndrome. Reports of Practical

Oncology and Radiotherapy 16, 138-146 (2011).

11. Barquinero, J.F. et al. Biological dosimetry in simulated in vitro partial irradiations. International

Journal of Radiation Biology 71, 435-440 (1997).

12. Pouget, J.P. & Mather, S.J. General aspects of the cellular response to low- and high-LET

radiation. European Journal of Nuclear Medicine 28, 541-561 (2001).

13. Pfeiffer, P., Goedecke, W., Kuhfittig-Kulle, S. & Obe, G. Pathways of DNA double-strand break

repair and their impact on the prevention and formation of chromosomal aberrations. Cytogenetic

and Genome Research 104, 7-13 (2004).

14. Mladenov, E., Magin, S., Soni, A. & Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher

eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent

regulation. Seminars in Cancer Biology 37-38, 51-64 (2016).

15. Savage, J.R. An introduction to chromosomal aberrations. Atlas of Genetics and Cytogenetics in

Oncology and Haematology (1999).

16. International Atomic Energy Agency (IAEA). Cytogenetic dosimetry: applications in preparedness

for and response to radiation emergencies (2011).

17. Mettler, F.A. Medical effects and risks of exposure to ionising radiation. Journal of Radiological

Protection 32, N9-N13 (2012).

18. Wojcik, A. et al. The RENEB operational basis: complement of established biodosimetric assays.

International Journal of Radiation Biology, 1-5 (2016).

https://www.nrc.gov/reading-rm/doc-collections/fact-sheets/chernobyl-bg.html

http://www.fanc.fgov.be/nl/news/fukushima-een-jaar-later/493.aspx

50

19. Bender, M.A. & Gooch, P.C. Types and rates of x-ray-induced chromosome aberrations in human

blood irradiated in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48, 522-532

(1962).

20. Karachristou, I. et al. Triage biodosimetry using centromeric/telomeric PNA probes and Giemsa

staining to score dicentrics or excess fragments in non-stimulated lymphocyte prematurely

condensed chromosomes. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental

Mutagenesis 793, 107-114 (2015).

21. Kulka, U. et al. RENEB - Running the European Network of biological dosimetry and physical

retrospective dosimetry. International Journal of Radiation Biology 93, 2-14 (2017).

22. Oestreicher, U. et al. RENEB intercomparisons applying the conventional Dicentric Chromosome

Assay (DCA). International Journal of Radiation Biology, 1-10 (2016).

23. Vaurijoux, A. et al. Strategy for population triage based on dicentric analysis. Radiation Research

171, 541-548 (2009).

24. Suto, Y. et al. Biodosimetry of restoration workers for the Tokyo Electric Power Company

(TEPCO) Fukushima Daiichi nuclear power station accident. Health Physics 105, 366-373 (2013).

25. Vaurijoux, A. et al. Detection of partial-body exposure to ionizing radiation by the automatic

detection of dicentrics. Radiation Research 178, 357-364 (2012).

26. Hall, E.J. & Giaccia, A.J. Radiobiology for the Radiologist. Lippincott Williams & Wilkins (2012).

27. Vral, A., Fenech, M. & Thierens, H. The micronucleus assay as a biological dosimeter of in vivo

ionising radiation exposure. Mutagenesis 26, 11-17 (2011).

28. Romm, H. et al. Automatic scoring of dicentric chromosomes as a tool in large scale radiation

accidents. Mutation Research 756, 174-183 (2013).

29. Lloyd, D.C., Edwards, A.A., Moquet, J.E. & Guerrero-Carbajal, Y.C. The role of cytogenetics in

early triage of radiation casualties. Applied Radiation and Isotopes 52, 1107-1112 (2000).

30. Romm, H. et al. Validation of semi-automatic scoring of dicentric chromosomes after simulation of

three different irradiation scenarios. Health Physics 106, 764-771 (2014).

31. https://metasystems-international.com/.

32. M'Kacher, R. et al. New tool for biological dosimetry: reevaluation and automation of the gold

standard method following telomere and centromere staining. Mutation Research 770, 45-53

(2014).

33. http://pnabio.com/products/PNA_oligo.htm

34. http://www.panagene.com/hp_yeh/eng/product/product_fish.php

35. Castelein, E. & Vral, A. Faculteit geneeskunde en gezondheidswetenschappen, Onderzoeksgroep

Radiobiologie (Universiteit Gent, 2015-2016).

https://metasystems-international.com/

http://pnabio.com/products/PNA_oligo.htm

http://www.panagene.com/hp_yeh/eng/product/product_fish.php

I

Bijlagen

Bijlage A

Tabel I: Detailweergave: volledige lichaamsbestralingen voor het valideren van de dosis-respons curves. (Donor 1, studie 2016-2017).

Scoringsmethode Dosis

(Gy)

Aantal

slides

Aantal

vastgelegde

beelden

(Autocapt)

Aantal

geanalyseerde

metafasen

Aantal

verworpen

metafasen

Percentage

verworpen

metafasen

(%)

AS G 0 1 731 461 270 36,9%

1 3 502 405 97 19,3%

2 1 132 99 33 25,0%

4 2 198 154 44 22,2%

SAS I G 0 1 731 448 283 38,7%

1 3 502 403 99 19,7%

2 1 132 95 37 28,0%

4 2 198 151 47 23,7%

SAS II G 0 1 731 298 433 59,2%

1 3 502 328 174 34,7%

2 1 132 62 70 53,0%

4 2 198 134 64 32,3%

SAS II TC 0 2 1064 914 150 14,1%

1 2 645 557 88 13,6%

2 2 758 692 66 8,7%

4 1 165 157 8 4,8%

Tabel II: Detailweergave: volledige lichaamsbestralingen voor het valideren van de dosis-respons curves. (Donor 57, studie 2016-2017).

Scoringsmethode Dosis

(Gy)

Aantal

slides

Aantal

vastgelegde

beelden

(Autocapt)

Aantal

geanalyseerde

metafasen

Aantal

verworpen

metafasen

Percentage

verworpen

metafasen

(%)

AS G 0 1 800 670 130 16,3% 1 1 800 643 157 19,6% 2 1 800 672 128 16,0% 4 1 600 547 53 8,8%

SAS I G 0 1 800 661 139 17,4% 1 1 800 634 166 20,8% 2 1 800 669 131 16,4% 4 1 600 496 104 17,3%

SAS II G 0 1 800 555 245 30,6% 1 1 800 548 252 31,5% 2 1 800 564 236 29,5% 4 1 600 428 172 28,7%

SAS II TC 0 1 1030 855 175 17,0% 1 1 1082 895 187 17,3% 2 1 500 422 78 15,6% 4 1 520 468 52 10,0%

II

Bijlage B

Tabel III: De statistische gegevens van de frequentie distributie per in vitro gesimuleerde situatie (Donor 1, studie 2015-2016).

PBD (Gy) IR F

(%) N X Y



2/y

(DI) u-test

0 1 2 3 4 5 6

2 12,50 393 12 0,031 382 10 1 0 0 0 0 1,14 2,03

2 25 452 9 0,020 444 7 1 0 0 0 0 1,21 3,26

2 37,50 263 19 0,072 248 11 4 0 0 0 0 1,35 4,16

2 50 587 44 0,075 550 31 5 1 0 0 0 1,29 5,04

4 6,25 767 11 0,014 761 3 1 2 0 0 0 2,26 25,88

4 12,50 596 24 0,040 576 16 4 0 0 0 0 1,29 5,20

4 18,75 244 21 0,086 231 7 5 0 1 0 0 1,97 10,95

4 25 375 29 0,077 356 12 4 3 0 0 0 1,82 11,47

4 50 341 81 0,238 291 27 16 6 1 0 0 1,76 9,91


Cijfers in het rood: u > 1,96: wijst op overdispersie van de frequentie distributie.

Tabel IV: De ingeschatte PBD, IR F en WBD per in vitro gesimuleerde situatie (Donor 1, studie 2015-2016).

PBD

(Gy)

Ingeschatte

PBD (Gy) IR F (%)

Ingeschatte

IR F (%)

WBD

(Gy) Ingeschatte WBD (Gy)

2 1,29 12,5 22,77 0,25 0,33 [0,12-0,55]

2 1,56 25 12,37 0,50 0,23 [0,04-0,42]

2 2,46 37,50 25,79 0,75 0,67 [0,41-0,93]

2 2,03 50 31,88 1 0,69 [0,49-0,90]

4 4,50 6,25 3,66 0,25 0,17 [0,00-0,40]

4 2,10 12,50 17,71 0,50 0,42 [0,23-0,62]

4 3,86 18,75 21,10 0,75 0,77 [0,49-1,04]

4 3,55 25 20,31 1 0,71 [0,47-0,94]

4 3,88 50 46,53 2 1,55 [1,29-1,82]

** Werden niet berekend aangezien er geen PBE werd gedetecteerd (u < 1,96; Tabel III).

III

Tabel V: De statistische gegevens van de frequentie distributie per in vitro gesimuleerde situatie (Donor 2, studie 2015-2016).

PBD (Gy) IR F

(%) N X Y



2/y

(DI) u-test

0 1 2 3 4 5 6

2 12,50 79 7 0,089 74 4 0 1 0 0 0 1,79 5,33

2 25 734 61 0,083 680 47 7 0 0 0 0 1,15 2,86

2 37,50 571 36 0,063 538 30 3 0 0 0 0 1,11 1,81

2 50 620 47 0,076 580 33 7 0 0 0 0 1,22 3,98

4 6,25 350 18 0,051 335 12 3 0 0 0 0 1,29 3,88

4 12,50 393 38 0,097 368 17 5 2 0 1 0 2,01 14,38

4 18,75 310 18 0,058 296 10 4 0 0 0 0 1,39 5,00

4 25 572 62 0,108 526 35 7 3 1 0 0 1,60 10,29

4 50 413 69 0,167 359 41 12 0 1 0 0 1,36 5,18


Cijfers in het rood: u > 1,96: wijst op overdispersie van de frequentie distributie.

Tabel VI: De ingeschatte PBD, IR F en WBD per in vitro gesimuleerde situatie (Donor 2, studie 2015-2016).

PBD

(Gy)

Ingeschatte

PBD (Gy) IR F (%)

Ingeschatte

IR F (%)

WBD

(Gy) Ingeschatte WBD (Gy)

2 3,10 12,5 25,28 0,25 0,78 [0,35-1,22]

2 1,61 25 44,00 0,50 0,75 [0,55-0,94]

2 ** 37,50 ** 0,75 0,60 [0,40-0,81]

2 1,92 50 33,98 1 0,70 [0,49-0,90]

4 2,10 6,25 22,13 0,25 0,51 [0,28-0,75]

4 3,55 12,50 24,60 0,50 0,83 [0,60-1,07]

4 2,58 18,75 20,38 0,75 0,57 [0,32-0,81]

4 2,86 25 31,90 1 0,91 [0,69-1,12]

4 2,52 50 49,91 2 1,23 [0,99-1,47]

**Werden niet berekend aangezien er geen PBE werd gedetecteerd (u < 1,96; Tabel V)

IV

Bijlage C

Tabel VII: De procentuele afwijkingen op de ingeschatte WBD.

PBD

(Gy)

WBD

(Gy)

Giemsa (2015-2016) FISH-TC (2016-2017)

D1 D2 Gemiddelde

D1 en D2 D1 D57

Gemiddelde D1 en D57

2 0,25 32,00% 212,00% 122,00% 40,00% 92,00% 66,00%

2 0,50 54,00% 50,00% 52,00% 2,00% 50,00% 26,00%

2 0,75 10,67% 20,00% 15,33% 17,33% 62,67% 40,00%

2 1 31,00% 30,00% 30,50% 2,00% 36,00% 19,00%

4 0,25 32,00% 104,00% 68,00% 20,00% 40,00% 30,00%

4 0,50 16,00% 66,00% 41,00% 16,00% 38,00% 27,00%

4 0,75 2,67% 24,00% 13,33% 50,67% 4,00% 27,33%

4 1 29,00% 9,00% 19,00% 21,00% 3,00% 12,00%

4 2 22,50% 38,50% 30,50% 29,00% 24,50% 26,75%

Tabel VIII: De procentuele afwijkingen op de ingeschatte PBD.

PBD

(Gy)

IR F

(%)

Giemsa (2015-2016) FISH-TC (2016-2017)

D1 D2 Gemiddelde

D1 en D2 D1 D57


2 12,5 35,50% 55,00% 45,25% ** 15,50% 15,50%

2 25 22,00% 19,50% 20,75% 10,50% 17,50% 14,00%

2 37,5 23,00% ** 23,00% 12,50% 5,50% 9,00%

2 50 1,50% 4,00% 2,75% 7,00% 12,50% 9,75%

4 6,25 12,50% 47,50% 30,00% 39,25% 29,50% 34,38%

4 12,5 47,50% 11,25% 29,38% 10,00% 5,00% 7,50%

4 18,75 3,50% 35,50% 19,50% 39,25% 10,25% 24,75%

4 25 11,25% 28,50% 19,88% 30,00% 2,00% 16,00%

4 50 3,00% 37,00% 20,00% 13,50% 3,00% 8,25%

**Werden niet berekend aangezien er geen PBE werd gedetecteerd (u < 1,96)

Tabel IX: De procentuele afwijkingen op de ingeschatte IR F.

PBD

(Gy)

IR F

(%)

Giemsa (2015-2016) FISH-TC (2016-2017)

D1 D2 Gemiddelde

D1 en D2 D1 D57


2 12,5 82,16% 102,24% 92,20% ** 69,44% 69,44%

2 25 50,52% 76,00% 63,26% 15,40% 2,88% 9,14%

2 37,5 31,23% ** 31,23% 11,44% 43,28% 27,36%

2 50 36,24% 32,04% 34,14% 15,48% 15,00% 15,24%

4 6,25 41,44% 254,08% 147,76% 22,88% 28,96% 25,92%

4 12,5 41,68% 96,80% 69,24% 35,76% 18,08% 26,92%

4 18,75 12,53% 8,69% 10,61% 46,72% 17,65% 32,19%

4 25 18,76% 27,60% 23,18% 8,80% 12,08% 10,44%

4 50 6,94% 0,18% 3,56% 17,86% 22,32% 20,09%

**Werden niet berekend aangezien er geen PBE werd gedetecteerd (u < 1,96)

HET GEBRUIK VAN DICENTRISCHE ......Voorwoord Het heeft mij bloed, zweet en tranen (én veel...

Documents

Transcript of HET GEBRUIK VAN DICENTRISCHE ......Voorwoord Het heeft mij bloed, zweet en tranen (én veel...