De invloed van menstrueel bloedverlies en leeftijd op de...

Vakgroep Analytische Chemie

Onderzoeksgroep Atoom- en Massaspectrometrie

De invloed van menstrueel bloedverlies en leeftijd

op de isotopische samenstelling van Fe, Cu en Zn

in volbloed via MC-ICP-MS

Proefschrift voorgelegd tot het behalen van

de graad van Master of Science in de Chemie door

Olivier DELTOMBE

Academiejaar 2012-2013

Promotor: prof. dr. Frank Vanhaecke

Copromotor: dr. Karen Van Hoecke

Begeleidster: Lana Van Heghe

Dankwoord

Na vijf jaar de opleiding Chemie aan de Universiteit Gent te volgen, worden de inspanningen

beloond met deze masterscriptie als resultaat. Tijdens het laatste academiejaar heb ik met

veel plezier mogen meewerken aan dit onderzoek en ik wil het dan ook met groot genoegen

presenteren aan alle mensen die mij hebben gesteund, niet alleen tijdens dit thesisjaar maar

ook tijdens de vijf jaren van studie. Dankzij hun steun was het mogelijk om de opleiding

Chemie te kunnen afronden en om deze masterscriptie af te leveren. Daarom wil ik deze

personen in het bijzonder danken.

Allereerst wens ik mijn promotor, Prof. dr. Frank Vanhaecke te bedanken voor het

wekken van mijn interesse in dit onderzoeksdomein. Zijn enthousiasme tijdens de

gevorderde Massaspectrometrie & Isotopenanalyse les, samen met de vele linken die hij

legde tussen het onderzoek en het dagelijks leven, zorgde ervoor dat ik koos om binnen zijn

onderzoeksgroep mijn masterscriptie aan te vatten. Ik wil hem tevens bedanken voor de

kennis die ik kon opdoen, want in de praktijk leer je nog steeds meer dan tijdens de

theorielessen. Het was dan ook een eer om gebruik te mogen maken van de infrastructuur

en de instrumenten van de onderzoeksgroep.

Op de tweede plaats bedank ik graag mijn begeleidster, Lana Van Heghe, om me elke dag

opnieuw bij te staan en steeds bereid te zijn om te antwoorden op mijn vele vragen. Ik dank

haar ook graag om me te ondersteunen en me advies te geven bij het schrijven van deze

masterscriptie.

Ik wil ook een dankwoord uitbrengen aan mijn ouders, Patrik Deltombe en Lena Deroo.

Zonder hun steun was deze academische ervaring niet mogelijk geweest.

Ik bedank graag mijn vriendin, Debbie Lauwers, om er steeds te zijn voor me. Ook een

dankjewel om advies te geven en de nodige uitleg te verschaffen inzake deze masterscriptie.

Tenslotte gaat er nog een speciaal woord van dank naar mijn vrienden die me gesteund

hebben tijdens de vijf jaar en tijdens deze masterscriptie. Zij zorgden steeds voor de nodige

steun en uitleg, alsook voor het nodig leedvermaak.

Olivier – 4 juni 2013

i

Inhoudsopgave

Dankwoord ...................................................................................................................................................... 5

1 Inleiding ................................................................................................................................................... 1

1.1 De Isotopische Samenstelling van de Elementen............................................................................... 1

1.2 Isotopenanalyse voor Biomedische Toepassingen ............................................................................. 2

1.3 Doel van de Studie ........................................................................................................................... 4

2 Inductief Gekoppeld Plasma- Massaspectrometrie .................................................................................. 5

2.1 Monsterintroductie .......................................................................................................................... 7

2.1.1 Pneumatische Verstuiving ............................................................................................................ 7

2.1.2 De Verstuiverkamer...................................................................................................................... 8

2.2 Inductief Gekoppeld Plasma ............................................................................................................. 9

2.3 De Interface ................................................................................................................................... 11

2.4 De Massaspectrometer .................................................................................................................. 12

2.4.1 De Quadrupoolfilter ................................................................................................................... 12

2.4.2 De Sector-veld Massaspectrometer ............................................................................................ 13

2.5 De Detector ................................................................................................................................... 15

2.5.1 De Elektronenvermenigvuldiger .................................................................................................. 15

2.5.2 De Faraday Cup .......................................................................................................................... 16

2.6 Massaresolutie ............................................................................................................................... 17

2.7 Voor- en Nadelen van ICP-MS ......................................................................................................... 18

2.8 De Gebruikte ICP-MS Toestellen ..................................................................................................... 18

3 Interferentie .......................................................................................................................................... 21

3.1 Spectrale Interferentie ................................................................................................................... 21

3.1.1 De Botsings/Reactiecel ............................................................................................................... 22

3.2 Niet-Spectrale Interferentie............................................................................................................ 24

4 Massadiscriminatie en Correctie ............................................................................................................ 25

4.1 Space-Charge Effect ....................................................................................................................... 25

4.2 Nozzle-Separation Effect ................................................................................................................ 26

4.3 Massadiscriminatie versus Massafractionatie ................................................................................. 26

4.4 Correctiemethoden ........................................................................................................................ 27

4.4.1 Externe Standaardisatie ............................................................................................................. 27

ii

4.4.2 Interne Standaardisatie .............................................................................................................. 28

4.5 Vergelijking van de Verschillende Methodes ................................................................................... 30

5 Monstername en -voorbereiding ........................................................................................................... 31

5.1 Bloedafname .................................................................................................................................. 31

5.2 Het Clean Lab ................................................................................................................................. 31

5.3 Digestie van het Bloed .................................................................................................................... 32

5.4 Ionenuitwisselingschromatografie .................................................................................................. 33

5.4.1 Het Elutieprofiel ......................................................................................................................... 34

6 Metingen ............................................................................................................................................... 36

6.1 Elementbepaling met de Thermo Scientific XSeries II ...................................................................... 36

6.2 Elementbepaling met de Thermo Scientific Element XR .................................................................. 38

6.3 Isotopenanalyse met de Thermo Scientific Neptune ....................................................................... 40

7 Resultaten Isotopenanalyse ................................................................................................................... 43

7.1 Populatie ....................................................................................................................................... 45

7.1.1 Het Hormoonspiraaltje ............................................................................................................... 45

7.1.2 De Menopauze ........................................................................................................................... 45

7.2 Statistische Methoden ................................................................................................................... 46

7.3 Fe-isotopenanalyse ........................................................................................................................ 47

7.3.1 Onderscheidbaarheid van de Verschillende Groepen ................................................................... 47

7.3.2 Correlatie met de Leeftijd? ......................................................................................................... 48

7.4 Cu-isotopenanalyse ........................................................................................................................ 49



7.5 Zn-isotopenanalyse ........................................................................................................................ 51



7.6 Overzicht Resultaten Isotopenanalyse ............................................................................................ 52

7.7 Vergelijkende Isotopenstudie ......................................................................................................... 53

8 Besluit .................................................................................................................................................... 55

9 Referenties ............................................................................................................................................ 58

10 Bijlagen .................................................................................................................................................. 61

Bijlage 1: Informatiebrief voor de Deelnemers aan Experimenten ....................................................... 62

Bijlage 2: Vragenlijst Invloed van menstruatie en leeftijd op de isotopische samenstelling van ijzer in

bloed bij gezonde vrouwen. ................................................................................................................ 68

Bijlage 3: Goedkeuring Commissie voor Medische Ethiek .................................................................... 69

Bijlage 4: Reinigingsprocedure van Savillex bekers in het Clean Lab van de A&MS groep van de UGent 71

Bijlage 5: Overzicht van de Monsters en hun Deltawaarden ................................................................ 72

Bijlage 6: δ56Fe versus δ57Fe met Onzekerheid..................................................................................... 73

iii

Bijlage 7: δ65

Cu met Onzekerheid ........................................................................................................ 73

Bijlage 8: δ66Zn versus δ67Zn met Onzekerheid .................................................................................... 73

11 Samenvatting ......................................................................................................................................... 74

1

1 Inleiding

1.1 De Isotopische Samenstelling van de Elementen

Isotopen zijn nucliden van hetzelfde element die een verschillend aantal neutronen in de

kern bezitten, resulterend in een verschillend massagetal. In een eerste benadering is de

isotopische samenstelling van de elementen een constante in de natuur, wat wordt

verklaard door de grondige menging van de elementen tijdens de vorming van ons

zonnestelsel. Toepassingen zoals isotopendilutie en tracerexperimenten baseren zich hier

op.[1],[2]

Deze constante abundantie is echter niet helemaal correct. Zo ontstaan er kleine

variaties in de isotopische samenstelling door: (i) het verval van natuurlijk voorkomende,

lang-levende radionucliden (bv. -

); (ii) natuurlijke isotopenfractionatie,

gebaseerd op het relatief verschil in massa tussen de verschillende isotopen van hetzelfde

element. Hoe lichter een element, des te groter het relatief verschil in massa tussen de

isotopen (100% voor 1H ten opzichte van 2H). Door dit massaverschil vertonen deze isotopen

een licht verschillend fysisch en chemisch gedrag. Een eenvoudig voorbeeld is het fysisch

proces waarbij water overgaat van de vloeibare fase naar de gasfase: het overwinnen van

intermoleculaire krachten tussen de watermoleculen vergt minder energie bij deze met een

lichtere isotopische samenstelling dan bij deze met een zwaardere isotopische

samenstelling. Afhankelijk of er zich een chemisch evenwicht kan instellen, wordt er een

onderscheid tussen kinetische en thermodynamische isotopenfractionatie gemaakt. In het

geval van bijvoorbeeld enzymatische reacties is de reactie unidirectioneel en kan er bijgevolg

geen chemisch evenwicht bereikt worden. Men spreekt dan van kinetische

isotopenfractionatie. Omdat de mate van isotopenfractionatie afhangt van het massaverschil

tussen de isotopen wordt dit ook massa-afhankelijke isotopenfractionatie genoemd. Ook

massa-onafhankelijke isotopenfractionatie werd aangetoond voor een aantal elementen (S,

2

Mo, Ru, Sn en Hg) en een verklaring hiervoor is onder andere het verschil in kernspin tussen

de isotopen. (iii) De interactie van kosmische straling met materie en (iv) menselijke

activiteiten kunnen tevens een bron van variatie in de natuurlijke abundanties van isotopen

zijn.[1],[2]

Deze kleine variaties in de isotopische samenstelling van een bepaald element zijn

dankzij de precisie van multi-collector inductief gekoppeld plasma-massaspectrometrie (zie §

2.8) te bestuderen.[1],[2]

1.2 Isotopenanalyse voor Biomedische Toepassingen

Stabiele metaalisotopen worden al langer bestudeerd in de geochemie om de geschiedenis

van de Aarde en het zonnestelsel te ontrafelen[3],[4],[5] of in de archeologie om onder meer de

herkomst van gevonden metalen voorwerpen te bepalen.[6] De laatste jaren wordt de

isotopische samenstelling van deze metalen ook in levende organismen bepaald voor onder

andere (i) milieutoepassingen (metaal als spoorelement aanwezig in het organisme kan de

herkomst van bijvoorbeeld vervuiling bepalen) en (ii) biomedische toepassingen (met

diagnose en behandeling als uiteindelijk doel).[7]

De verschillende reacties die in het lichaam optreden kunnen leiden tot

isotopenfractionatie. Wanneer een persoon een afwijkend metabolisme heeft – en er dus

andere reacties optreden in het lichaam – kan dit in essentie leiden tot een andere

isotopische samenstelling voor een bepaald element. Isotopenanalyse van metabolische

relevante spoorelementen zou bijgevolg kunnen leiden tot nieuwe methodes om ziektes op

een minder invasieve manier én in een vroeger stadium te detecteren. Eerder onderzoek

heeft reeds aangetoond dat het bloed van hemochromatose patiënten een afwijkende

isotopische samenstelling van Fe vertoont ten opzichte van het bloed van gezonde personen

(verhoogde 56Fe/54Fe verhouding). Hemochromatose is een erfelijke genetische aandoening,

gekenmerkt door een niet-gereguleerde, te hoge ijzerabsorptie ter hoogte van de dunne

darm. Het menselijk lichaam heeft geen metabolische weg om deze overmaat aan Fe uit te

scheiden waardoor dit overmatig Fe opgeslagen wordt in weefsels (zoals de lever), wat op

termijn leidt tot orgaanschade. Vandaag de dag wordt de ziekte vastgesteld via eenvoudige

3

biochemische parameters (serum ijzergehalte, transferrine saturatie, serum ferritinegehalte)

en dit pas op een later stadium waarbij er al een hoge ijzeropstapeling is. Bovendien hangen

de referentiewaarden van deze parameters af van de leeftijd, wat een negatief effect heeft

op hun betrouwbaarheid. Eigenlijk kan deze ziekte enkel met zekerheid worden vastgesteld

via een leverbiopsie of het opsporen van de mutatie via DNA-analyse. Leverbiopsie is echter

invasief en gaat gepaard met enkele risico’s. DNA-analyse geeft uiteindelijk ook alleen een

indicatie voor de aanleg van een persoon om de ziekte te ontwikkelen. Er zijn namelijk

personen met hemochromatose die geen mutaties in hun DNA hebben, net zoals er

personen zijn met mutaties die geen hemochromatose ontwikkelen.[8],[9],[10]

Voor men kan overgaan naar diagnostiek via isotopenanalyse van volbloed is het

belangrijk een zo volledig mogelijk beeld te krijgen van de mogelijke variaties in isotopische

samenstelling van belangrijke transitiemetalen in menselijk volbloed van gezonde

individuen. Hiertoe dient de invloed van verschillende parameters (geslacht, dieet,

menstruatie, leeftijd,…) binnen de gezonde populatie (referentiepopulatie) geëvalueerd te

worden. In dit werk worden de ijzer- (54Fe, 56Fe, 57Fe en 58Fe), koper- (63Cu en 65Cu) en

zinkisotopen (64Zn, 66Zn, 67Zn en 68Zn) bestudeerd daar de betreffende elementen een

belangrijke katalytische, structurele en regulerende rol vervullen in het menselijk

metabolisme.[11],[12]

Voorgaand onderzoek heeft reeds aangetoond dat de isotopische samenstelling van Fe in

menselijk volbloed significant verschilt tussen mannen en vrouwen: het bloed van mannen is

aangerijkt in de lichtere ijzerisotopen ten opzichte van het bloed van vrouwen.[11],[13]

De isotopische samenstelling van Zn in menselijk volbloed verschilt significant tussen

omnivoren en vegetariërs: het bloed van omnivoren is aangerijkt in de lichtere zinkisotopen.

Er werd geen significant verschil gevonden voor zink tussen mannelijke en vrouwelijke

vegetariërs of omnivoren.[11]

Voor koper werd recent aangetoond dat er een significant verschil is tussen mannen en

vrouwen, alsook dat er geen significant verschil is tussen vegetariërs en omnivoren.[14],[15]

4

1.3 Doel van de Studie

Deze studie heeft als doel om te evalueren of de leeftijd en/of menstruatie een invloed

hebben/heeft op de isotopische samenstelling van Fe, Cu en Zn in volbloed bij gezonde

vrouwen. Hiervoor worden bloedstalen van gezonde vrouwen in de menopauze en van

jongere vrouwen die een specifiek voorbehoedsmiddel (dat de menstruatie voorkomt)

gebruiken, vergeleken met die van jonge menstruerende vrouwen tussen de 20 en 25 jaar.

De deelname van elke gezonde vrouw gebeurde op volledige vrijwillige basis. De

bloeddonoren werden geïnformeerd via een Informed Consent (Bijlage 1) en een vragenlijst

(Bijlage 2) werd ingevuld. Deze studie werd goedgekeurd door een onafhankelijke commissie

voor medische ethiek verbonden aan het UZ Gent (Bijlage 3). Ze werd uitgevoerd volgens de

richtlijnen voor goede klinische praktijken en de verklaring van Helsinki, ter bescherming van

de vrijwilligers die deelnemen aan experimenten. De bloedafname (zie § 5.1) werd

uitgevoerd door Prof. dr. H. Depypere van het Universitair Ziekenhuis in Gent.

De volledige monstervoorbereiding (Hoofdstuk 5) vond plaats in een clean lab klasse 10

en isotopenanalyse werd uitgevoerd door middel van multi-collector ICP-

massaspectrometrie (zie § 2.8) in de Atoom- en Massaspectrometrie onderzoeksgroep

(A&MS) van Prof. dr. F. Vanhaecke.

5

2 Inductief Gekoppeld Plasma-

Massaspectrometrie

Inductief gekoppeld plasma-massaspectrometrie (ICP-MS) is een krachtige analytische

techniek die sinds 1983 commercieel beschikbaar is. Aangezien het ICP resulteert in een

goede ionisatie-efficiëntie voor de meeste elementen en vooral enkelvoudig geladen ionen

levert, is het een uitstekende ionenbron voor element -en isotopenanalyse. Door dit ICP te

koppelen aan een massaspectrometer ontstaat een krachtige en gevoelige multi-element

analysetechniek: de voordelen van eenvoudige monsterintroductie in het ICP en de

eenvoudig te interpreteren massaspectra worden gecombineerd.[1],[16],[17],[18],[19]

Hoewel er verscheidene merken op de markt beschikbaar zijn (Agilent, Perkin Elmer,

Thermo Scientific, …), bezit elk ICP-MS instrument dezelfde drie essentiële onderdelen: (i) de

ionenbron, waarin de ionen worden geproduceerd; (ii) de massaspectrometer, waar de

ionen met verschillende verhouding van massa tot lading van elkaar gescheiden worden en

(iii) de detector (Figuur 2.1). Daarnaast is er een monsterintroductiesysteem aanwezig dat

het monster naar de ionenbron transporteert. Door de massaspectrometer en het

detectiesysteem onder een hoog vacuüm (10-4 – 10-6 mbar) te plaatsen wordt de

geproduceerde ionenbundel zo weinig mogelijk verstoord (botsing met luchtmoleculen

worden vermeden).

Figuur 2.1 Schematische voorstelling van de drie essentiële onderdelen waaruit een MS toestel is opgebouwd.[1],[18]

6

Maar aangezien het plasma opereert bij een atmosferische druk, vormt de interface een

noodzakelijk onderdeel om de overgang van atmosferische druk naar een hoog vacuüm

mogelijk te maken. Na de interface bevindt zich het lenzensysteem, dat de gevormde ionen

introduceert in de massaspectrometer (MS).

Figuur 2.2 toont alle fundamentele onderdelen van een ICP-MS toestel. Deze zullen verder

besproken worden in de volgende paragrafen. Sommige onderdelen kunnen verschillen van

deze in de figuur. Zo kan het type verstuiverkamer wijzigen (zie 2.1.2), de aanwezige

massaspectrometer kan naast een quadrupool ook bijvoorbeeld een sector-veld

massaspectrometer (2.4.2) zijn en als detector kan tevens een Faraday cup gebruikt worden

(2.5.2).

Figuur 2.2 Vereenvoudigde voorstelling van een quadrupool-gebaseerd ICP-MS toestel. Alle fundamentele onderdelen worden weergegeven.[1],[18],[19]

Computer

Detector Quadrupool Lenzensysteem

Inductiespoel

Monsteroplossing

Peristaltische pomp

vacuümpompen

Interface

Verstuiver + verstuiverkamer

Toorts

7

2.1 Monsterintroductie

ICP-MS wordt voornamelijk – ook tijdens deze studie – gebruikt voor de analyse van

waterige oplossingen. Een pneumatische verstuiver (vervaardigd uit glas, kwarts of een

waterstoffluoride-bestendig polymeer), in combinatie met een verstuiverkamer, zorgt voor

efficiënte introductie van een representatief deel van het monster in het ICP (zie Figuur 2.2).

Voor de directe studie van een vast materiaal wordt het monster bv. via laser ablatie (laser

ablation, LA) omgezet in een droog aërosol en vervolgens in het ICP geïntroduceerd.[20],[21]

2.1.1 Pneumatische Verstuiving

Bij pneumatische verstuivers wordt de monsteroplossing omgezet tot een primair aerosol als

gevolg van de interactie tussen een versnelde gasstroom (argon) en een vloeistof

(oplossing). Twee types worden tijdens deze studie gebruikt (zie 2.8), namelijk de

concentrische en de microconcentrische verstuiver.

Bij een concentrische verstuiver (ca. 1 mL/min) wordt het monster via een capillair –

volledig omgeven door een ander capillair dat het gas (argon) bevat – tot aan het uiteinde

van de verstuiver gebracht. Zoals de naam al doet vermoeden, is deze gasstroom parallel aan

het capillair (Figuur 2.3 a). Een vernauwing op het einde van de concentrische verstuiver

versnelt de argongasstroom zodat er hier ten gevolge van het Venturi-effect een onderdruk

ontstaat, wat zorgt voor een spontane aanzuiging van de monsteroplossing (Figuur 2.3).

Ondanks de spontane aanzuiging, wordt er meestal toch gebruik gemaakt van een

peristaltische pomp, waardoor de gebruiker het monsterdebiet naar eigen keuze kan

instellen en de aanvoersnelheid niet afhankelijk is van de viscositeit van de oplossing

(monster, standaard of blanco).[1],[19],[21]

Een microconcentrische verstuiver (ca. 10 tot enkele honderd µL/min) is een

miniatuurversie van de concentrische verstuiver die aangewend wordt als een laag

monsterverbruik noodzakelijk is. Dit kan belangrijk zijn in toepassingen waarbij maar een

kleine hoeveelheid monster beschikbaar is. Bovendien wordt de monster introductie-

efficiëntie verhoogd, daar de druppelgroottedistributie beter is. Dit resulteert in een

signaalintensiteit die toch voldoende hoog ligt.[1],[18],[19],[21]

8

2.1.2 De Verstuiverkamer

Het primair aerosol wordt verder naar de verstuiverkamer geleid, die ervoor zorgt dat enkel

de kleinste druppeltjes het plasma bereiken zodat een snelle desolvatatie, atomisatie en

ionisatie mogelijk is.[1],[19],[21]

Het werkingsprincipe van de double-pass verstuiverkamer (Scott-type) (Figuur 2.3 a) is

vrij eenvoudig. Bij de doorgang van de aerosoldruppeltjes botsen de grotere, zwaardere

druppels tegen de wand ten gevolge van hun traagheid en worden door de zwaartekracht

geleid naar een afvalcontainer. De voldoende kleine druppels (< 10 µm) kunnen de bocht in

de verstuiverkamer wel volgen en worden naar het ICP getransporteerd.[18],[19]

De cyclonische verstuiverkamer (Figuur 2.3 b) werkt op basis van een centrifugale kracht

uitgeoefend door de argonstroom: de kleinere druppels gaan mee met de gasstroom richting

het plasma, terwijl de grotere druppels tegen de wand botsen, naar beneden vallen en via

een buisje naar de afvalcontainer geleid worden.[18],[19]

Een derde type is de impact bead verstuiverkamer (Figuur 2.3 c), waarin zich een klein

intern volume (ca. 1 cm in diameter) bevindt waartegen de gesolvateerde monsterdeeltjes

botsen. De voordelen van dit volume zijn de snelle uitwas en de gereduceerde

geheugeneffecten.[18],[19],[22],[23]

Figuur 2.3 Voorstelling van een concentrische verstuiver in combinatie met een double pass verstuiverkamer (Scott-type) (a), een cyclonische verstuiverkamer (b) en een impact bead verstuiverkamer (c).[18],[21],[22],[24]

Concentrischeverstuiver

Monster+ matrix

Verstuivergas (Ar)

Richting ICP

Double pass verstuiverkamer(Scott-type)

Afval

(a) Monster+ matrixAfval

Richting ICP

(b)

(c) Monster+ matrix

Richting ICP

Afval

9

2.2 Inductief Gekoppeld Plasma

Zoals hoger vermeld, opereert het inductief gekoppeld plasma (inductively coupled plasma,

ICP) als ionenbron bij atmosferische druk. Een plasma is per definitie een gasmengsel van

atomen, ionen, elektronen en neutrale componenten bij een hoge temperatuur. Door de

samenstelling van het plasma is deze elektrisch geleidend waardoor er energie kan

toegevoegd worden via inductie, vandaar de naam ‘inductief gekoppeld plasma’.[1],[18],[19],[25]

Het ICP wordt gegenereerd aan het uiteinde van een toorts (Figuur 2.4), meestal

vervaardigd uit kwarts en bestaande uit drie concentrische buizen waardoor telkens

argongas stroomt aan verschillende debieten (Figuur 2.5). Door de buitenste buis stroomt

het zgn. plasmagas of koelgas (12-17 L/min), dat een dubbele functie heeft: (i) het plasma

onderhouden en (ii) een thermische afscherming bieden tussen het plasma en de

kwartsbuis, die verhindert dat de toorts smelt. Door de middelste buis stroomt het zgn.

hulpgas (ca. 1 L/min) dat dient om de positie van het plasma in die toorts te regelen. Door de

binnenste buis (voor zeer corrosieve materialen kan aluminium oxide, platina, … gebruikt

worden i.p.v. kwarts) stroomt het zgn. draaggas (ca. 1 L/min), dat samen met het

monsteraerosol rechtstreeks uit de verstuiver en de verstuiverkamer in het plasma wordt

geïnjecteerd. Hierdoor ontstaat een toroïdaal plasma (cfr. Donut-vorm).[1],[18],[19],[25]

Voordat het plasma als ionisatiebron kan optreden, dient het opgestart te worden door

middel van een Tesla-ontlading. Hierbij wordt het aanvankelijk neutraal Ar-gas geïoniseerd

waarbij een fractie van de neutrale argon atomen omgezet wordt in argonionen en

elektronen. Door een watergekoelde, spiraalvormige inductiespoel rond de toorts te

plaatsen – waar men een hoogfrequente wisselstroom (27,12 of 40,68 MHz) door stuurt –

ontstaat een wisselend magnetisch veld, dat de aanwezige ionen en elektronen doet

versnellen en ze laat bewegen in cirkelvormige banen (Figuur 2.4). Door inelastische

botsingen van elektronen met argonatomen, treedt er verdere ionisatie op en wordt het

plasma in stand gehouden. Het monsteraerosol wordt via de binnenste concentrische buis in

het plasma gebracht dat het monster vervolgens desolvateert, verdampt, atomiseert,

exciteert en uiteindelijk ioniseert. De belangrijkste ionisatiemechanismen in het plasma zijn:

(i) electron impact en (ii) Penning-ionisatie:

10

(i)

(ii)

Ion-elektron recombinatie zorgt voor de emissie van een continu spectrum. Het is de

verdeling van de kinetische energie van de ionen die dit continu emissiespectrum verklaart.

Het blauwachtig-wit licht – ook waargenomen door de gebruiker – wordt verklaart door het

lijnenspectrum van Ar, bovenop het continu spectrum van ion-elektron combinatie. Het

plasma wordt in stand gehouden zolang er een wisselstroom door de inductiespoel wordt

gestuurd en zolang er Ar wordt toegevoerd (typisch 15-20 L/min). [1],[18],[19],[25],[26]

Figuur 2.4 De toorts waar het plasma wordt gecreëerd en in stand gehouden wordt, samen met de voornaamste onderdelen.[18]

Figuur 2.5 De toorts bestaat uit drie concentrische buizen waar argon doorstroomt, telkens met een bepaald debiet.

Elektronen bewegen in een cirkelvormige baan

Koelgas

Draaggas + monsteraërosol

Oscillerend magnetisch veld

ICP

Toorts Plasmagas (Ar)

Hulpgas (Ar)

Draaggas (Ar) + monsteraërosol

11

2.3 De Interface

De interface bevindt zich tussen het ICP en de massaspectrometer (Figuur 2.2) en heeft als

doel het grote drukverschil tussen beide te overbruggen: het ICP werkt bij atmosferische

druk, terwijl de massaspectrometer een hoog vacuüm vereist. De interface bestaat uit twee

coaxiale kegels met een centrale kleine opening: de sampling cone (0.8-1.2 mm) en de

skimmer (0.4-0.8 mm), meestal vervaardigd uit nikkel of platina (zie Figuur 2.6 ).[1],[18],[19],[27]

Het mengsel van ionen, elektronen en neutrale componenten, afkomstig van het ICP,

passeert eerst de sampling cone waarna het geheel supersonisch expandeert door het grote

drukverschil. Het grootste deel van het geëxpandeerde gas wordt uit de expansiekamer

(ruimte tussen de sampling cone en de skimmer) verwijderd door middel van een

vacuümpomp. De centrale bundel echter wordt efficiënt geëxtraheerd door de opening van

de skimmer. Vervolgens zorgen de extractielenzen er voor dat enkel positieve ionen richting

de massaspectrometer gestuurd worden.[1],[18],[19]

Het proces tot na de interface wordt schematisch voorgesteld in Figuur 2.7.

Figuur 2.6 Skimmer (links) en Sampling cone (rechts).[1]

Figuur 2.7 De analietionen worden geëxtraheerd uit het ICP d.m.v. de interface. Vervolgens worden ze via de ionenlenzen de massaspectrometer in geleid.

[28]

Skimmer Sampling cone

Toorts

Plasma

Inductiespoel

Expansieionenbundel

Mach diskExtractielenzen

12

2.4 De Massaspectrometer

Meteen na de elektrostatische lenzen bevindt zich de massaspectrometer (Figuur 2.2). Het

doel van dit onderdeel is de positief geladen ionen te scheiden volgens hun verhouding van

massa tot lading (m/z). Er wordt onderscheidt gemaakt tussen vier types

massaspectrometers: (i) een quadrupoolfilter; (ii) een dubbel focusserende sector veld

massaspectrometer; (iii) een time of flight (TOF) massaspectrometer en (iv) een ion-

cyclotron resonantie (ICR) massaspectrometer. Enkel deze die relevant zijn in dit onderzoek

worden toegelicht.[29]

2.4.1 De Quadrupoolfilter

Een quadrupoolfilter (Figuur 2.8) bestaat uit vier parallelle cilindrische of hyperbolische

staven die bestaan uit, of op z’n minst gecoat zijn met een geleidend materiaal. De

diametraal tegenover elkaar staande staven vormen een elektrodepaar waarbij de

aangelegde spanning – bestaande uit een gelijkspannings- en een

wisselspanningscomponent – op beide elektrodeparen even groot is, maar tegengesteld van

teken. Het opgewekte elektrisch veld laat enkel de positief geladen ionen met een

welbepaalde m/z ± 1 u toe een stabiele baan te volgen, richting de detector. Alle andere

ionen buiten dit nauw venster vertonen een onstabiele baan en worden aldus uit de bundel

verwijderd (Figuur 2.8). Door de aangelegde spanning te variëren kan het volledige

massabereik gescand worden (massascan). Men kan echter ook de spanning discontinu

variëren zodat die overeenstemt met vooraf geselecteerde m/z waarden (peak hopping).

[1],[18],[19],[30]

Figuur 2.8 Het principe van de quadrupoolfilter.[18]

Ionenbundel StabielebaanOnstabiele

baanIngangsspleet

Uitgangsspleet

Quadrupoolstaven Richtingdetector

13

2.4.2 De Sector-veld Massaspectrometer

In een sector-veld massaspectrometer wordt een magnetische sector als massaspectrometer

gebruikt of de combinatie van een magnetische sector en een elektrostatische sector.

In de magnetische sector (Figuur 2.9) worden de ionen gescheiden van elkaar op basis

van hun verhouding van massa tot lading. Wanneer de ionen – afkomstig uit de ionenbron –

versneld worden over een potentiaalverschil V en vervolgens in een magnetisch veld B

gebracht worden, waarbij de richting van dit veld loodrecht op de bewegingsrichting staat,

beschrijven ze een eenparig cirkelvormige beweging. De centripetale kracht (Fcp) die de

ionen hiertoe dwingt wordt gelijk gesteld aan de Lorentzkracht (FL), uitgeoefend door het

magnetisch veld:

(2.1)

Waarbij:

= kracht uitgeoefend op het ion

= de lading van het ion (in ICP-MS bedraag q meestal +1)

= snelheid van het ion

= de grootte van het magnetisch veld

= de massa van het ion

= de straal van de cirkelvormige baan dat het ion beschrijft.

Anderzijds kunnen we de kinetische energie van het ion beschrijven als:

(2.2)

Met V het aangelegde potentiaal.

Omvormen van formules (2.1) en (2.2) levert:

(2.3)

Met andere woorden, bij een constante V en B is de straal van de cirkelvormige baan die het

ion beschrijft in het magnetisch veld, enkel afhankelijk van zijn verhouding van massa tot

lading. Dit geldt echter enkel wanneer alle ionen dezelfde kinetische energie bezitten, wat in

de praktijk niet het geval is.[1],[18],[19],[31]

14

Aangezien het ICP ionen produceert met een bepaalde energiespreiding, worden de

ionen met een verschillende kinetische energie, van elkaar gescheiden in de elektrostatische

sector (Figuur 2.10). Dit wordt verwezenlijkt door gebruik te maken van twee gebogen

platen waarop een gelijke, doch tegengestelde spanning wordt aangelegd. Hierbij draagt in

het algemeen de buitenste plaat een positieve lading en de binnenste een negatieve lading.

Door de kracht dat het elektrisch veld uitoefent op de positieve ionen beschrijven ze een

cirkelvormige baan als ze tussen beide platen heen bewegen. De centripetale kracht (Fcp) die

de ionen hiertoe dwingt wordt gelijk gesteld aan de elektrische veldkracht (FE):

(2.4)

Waarbij E de elektrische veldsterkte voorstelt. De straal van de cirkelvormige baan dat een

ion dus zal afleggen wordt gegeven door:

(2.5)

Figuur 2.9 De magnetische sector: inkomende ionen worden versneld over een potentiaalverschil tussen opening S1 en S2, waarna ze in een magnetisch veld komen dat ervoor zorgt dat de ionen een cirkelvormige baan beschrijven en uiteindelijk gedetecteerd worden.[18],[19]

Figuur 2.10 De elektrostatische sector: inkomende ionen met een verschillende kinetische energie (hier is E2>E1) worden van elkaar gescheiden. Enkel de ionen met een kinetische energie binnen een klein energievenster worden door een nauwe spleet doorgelaten.[18],[19]

Een hogere resolutie wordt verkregen door een nauwe spleet te plaatsen na de

elektrostatische sector: deze treedt op als een energiefilter. Echter, dit leidt tot een lagere

transmissie-efficiëntie aangezien een groot deel van de ionen verwijderd wordt.[1],[18],[19],[31]

Een zogenaamde dubbelfocusserende massaspectrometer combineert een magnetische

sector met een elektrostatische sector op zo’n wijze dat de spreiding veroorzaakt door de

ene sector gecompenseerd wordt door de andere: ionen met eenzelfde m/z maar met een

Detectie

Ionenbron

Magnetisch veld

Versnelling

S1

S2

(+) elektrode

(-) elektrodeIonenbron

15

verschillende bewegingsrichting en kinetische energie worden uiteindelijk toch in hetzelfde

punt gefocusseerd. Afhankelijk van de opstelling, wordt een Mattauch-Herzog, een Nier-

Johnson of een omgekeerde Nier-Johnson geometrie bekomen (Figuur 2.11 en Figuur 2.12).

Figuur 2.11 De voorstelling van een dubbel-focusserende opstelling met omgekeerde Nier-Johnson geometrie waarbij er gewerkt wordt met één detector.[18]

Figuur 2.12 De voorstelling van een dubbel-focusserende opstelling met Nier-Johnson geometrie waarbij gewerkt wordt met negen detectoren die simultaan kunnen meten.[1]

2.5 De Detector

Na de massaspectrometer bevindt zich de detector, waarvan er ook verschillende soorten op

de markt beschikbaar zijn, elk met hun eigen voor- en nadelen. Hier worden de

elektronenvermenigvuldiger en de Faraday cup besproken, daar enkel deze twee relevant

zijn in deze studie.

2.5.1 De Elektronenvermenigvuldiger

De elektronenvermenigvuldiger (Figuur 2.13) bestaat uit een aantal discrete dynodes

(typisch Cu/Be legering) die op een steeds hogere potentiaal zijn gebracht. Wanneer een

positief ion op de kathode (eerste dynode) invalt, wordt deze geneutraliseerd en zgn.

secundaire elektronen worden losgeslagen. Deze versnellen naar de tweede dynode waarbij

voor elk invallend elektron, meerdere elektronen worden losgeslagen die uiteindelijk

worden versneld naar de derde dynode, enz. Deze elektronenvermenigvuldiging (tot 107 -

108 elektronen) zorgt ervoor dat bij de laatste dynode een meetbaar signaal optreedt (pulse

counting mode).[1],[18],[19],[32]

Elektrostatischesector

Magnetische sector

Detector

Ionenbron

Ion versnelling

Elektrostatischesector

Magnetischesector

Reeks Faradaydetectoren

16

Omdat de detectie van een ion in de pulse counting mode enige tijd vergt (het proces van

elektronen vermenigvuldigen en het verwerken van de puls door de elektronica), is een

elektronenvermenigvuldiger onderhevig aan een bepaalde dode tijd τ. De dode tijd is

afhankelijk van de gebruikte vermenigvuldiger en bedraagt 5 tot 100 ns. Uiteraard zal er bij

een hogere ionenintensiteit een hogere fractie van de ionen niet gedetecteerd

worden.[18],[19]

Daarom is het aangewezen om bij hogere intensiteit te meten in analog mode. Hier

wordt de stroom na versterking gemeten. Het meten van dergelijke intense ionenbundels

heeft ook als nadeel dat de detector minder lang zal meegaan aangezien vooral de laatste

dynodes veel elektronen verliezen. Om de levensduur (typisch 1 tot 2 jaar) van de detector

te verhogen, kan men ook meten op een eerdere dynode.[18],[19]

Men kan kiezen voor één van de twee modi, ofwel het toestel automatisch laten kiezen,

op basis van de signaalintensiteit.[18],[20]

2.5.2 De Faraday Cup

De Faraday cup is een derde detectie-optie. Als de signaalintensiteit te hoog wordt om te

meten via een elektronenvermenigvuldiger kan men kiezen om de invallende ionenbundel te

detecteren via een Faraday cup. Dit is een metalen cup dat wordt geaard via een zeer hoge

weerstand (typisch 1011 Ω). Het werkingsprincipe wordt voorgesteld in Figuur 2.14. Als een

kation tegen de metalen wand van de Faraday cup botst, wordt deze onmiddellijk

geneutraliseerd door een elektron via de aarding. Dit levert een potentiaalverschil op over

de weerstand, dat een maat is voor de signaalintensiteit.[1],[18]

Het voordeel van een Faraday cup t.o.v. een elektronenvermenigvuldiger is de zeer lange

levensduur en de afwezigheid van een dode tijd. Dit betekent dat deze detector ideaal is om

een hoge intensiteit aan ionen te detecteren. Deze voordelen moeten in een experiment

opwegen tegen de lagere gevoeligheid van een Faraday cup omdat voor elk kation slechts

één elektron aangevoerd wordt. Dit resulteert in een detectielimiet dat 103 keer hoger ligt

dan bij een elektronenvermenigvuldiger.[18],[29],[32]

17

Figuur 2.13 De elektronenvermenigvuldiger, bestaande uit n discrete dynodes.[1]

Figuur 2.14 Werkingsprincipe van de Faraday cup.[1]

2.6 Massaresolutie

De massaresolutie van een massaspectrometer geeft kwantitatieve informatie over de

mate waarin twee aangrenzende pieken kunnen gescheiden worden. De massaresolutie kan

op twee manieren gedefinieerd worden. Een eerste definitie is een mathematische

uitdrukking, gebaseerd op de breedte van de piek op 5% van de hoogte ( ) (Figuur 2.15).

De tweede definitie, de 10 % valley definitie, is geschikt om de minimaal vereiste resolutie –

nodig om twee pieken te scheiden – te berekenen: twee pieken van gelijke hoogte worden

als gescheiden beschouwd wanneer het dal (valley) tussen deze twee niet hoger is dan 10%

van de piekintensiteit (Figuur 2.16). Een typische massaresolutie voor een quadrupoolfilter

bedraagt R ≈ 300, voor een sector-veld instrument daarentegen kan R ≈ 10 000 – 14 000

zijn.[18],[19],[30]

Figuur 2.15 Grafische voorstelling van de definitie van massaresolutie.[1],[18],[19]

Figuur 2.16 Grafische voorstelling van de 10% valley definitie voor massaresolutie. [1],[18],[19]

Ion Signaal

d1

d2

d3

d4 dnkathode

Ve-

Ionenbundel

Signaalintensiteit (a.e.)

18

2.7 Voor- en Nadelen van ICP-MS

De voor- en nadelen in het gebruik van ICP-MS analyse worden weergegeven in Tabel 2.1.

Afhankelijk van de toepassing, kunnen sommige nadelen verholpen of aanvaard worden.[19]

Tabel 2.1 De voor- en nadelen van ICP-MS.

Voordelen Nadelen

Lage detectielimieten (ppt of beter) Interferenties (spectraal/niet-spectraal) Groot lineair dynamisch bereik Kostprijs bij aankoop toestel Eenvoudige spectra Kostprijs gebruik (Ar verbruik ca. 20 L/min) Multi-elementanalyse (kwalitatief/kwantitatief) Beperkte robuustheid Hoge ‘sample-throughput’ Hoge analysesnelheid Mogelijkheid tot informatie isotopische samenstelling Mogelijkheid om - gebruik te maken van een alternatief monsterintroductiesysteem - te koppelen aan chromatografische scheidingstechnieken

2.8 De Gebruikte ICP-MS Toestellen

Tijdens dit werk wordt er gebruik gemaakt van drie verschillende ICP-MS toestellen: (i) een

quadrupool-gebaseerd toestel (Thermo Scientific XSeries II, Figuur 2.20); (ii) een single-

collector sector-veld instrument met omgekeerde Nier-Johnson geometrie (Thermo Scientific

Element XR, Figuur 2.21) en (iii) een multi-collector sector-veld instrument met Nier-Johnson

geometrie (Thermo Scientific Neptune, Figuur 2.22). Tabel 2.2 toont welk type verstuiver en

verstuiverkamer er aangesloten is op elk toestel.

Tabel 2.2 De combinatie van verstuiver en verstuiverkamer waarmee elk gebruikt instrument uitgerust is.

ICP-MS toestel Verstuiver Verstuiverkamer

Thermo Scientific XSeries II Concentrisch Impact bead Thermo Scientific Element XR Concentrisch Cyclonisch Thermo Scientific Neptune Microconcentrisch in PFA Combinatie van Double-pass +

Cyclonisch

De Thermo Scientific Element XR bezit twee verschillende detectoren: (i) een

elektronenvermenigvuldiger en (ii) een Faraday cup. Er kan slechts bij één massa gemeten

worden elk moment. Om in een ander gebied van het spectrum te meten dient de

versnellingspotentiaal (V, ‘E-scannen’) of het magnetisch veld (B, ‘B-scannen’) gewijzigd te

19

worden. Net voor de magnetische sector bevindt zich een ingangsspleet, met een instelbare

opening van 250, 30 en 16 µm. Dit resulteert in een lage (zie Figuur 2.17) en twee hoge

massaresolutie (zie Figuur 2.18) modi (‘medium’ en ‘hoge’ massaresolutie genaamd) en het

is mogelijk om te veranderen van modus terwijl het plasma aanstaat.[1],[18],[19]

De Thermo Scientific Neptune beschikt over negen Faraday cups – vandaar de naam

multi-collector inductief gekoppeld plasma-massaspectrometer (MC-ICP-MS) – die de

mogelijkheid bieden om simultaan ionen te detecteren met een verschillende verhouding

van massa tot lading. Het grote voordeel hierbij is dat de verschillende isotopen van

eenzelfde element simultaan gedetecteerd kunnen worden. Bijgevolg levert dit een

automatische correctie voor signaalinstabiliteit en signaaldrift en resulteert dus is een

hogere precisie (tot 0,002% RSD). De aanwezigheid van één centrale en acht verstelbare

Faraday cups laat de gebruiker toe om deze volgens een geschikte configuratie in te stellen

waardoor de doelnucliden in de cups invallen. Dit toestel beschikt tevens over een instelbare

openingsspleet, maar deze bevindt zich uiteraard net voor de elektrostatische sector. De

opening van de uitgangsspleet na de magnetische sector wordt zodanig ingesteld dat er bij

lage resolutie trapeziumvormige pieken ontstaan (Figuur 2.17). Dit wordt verwezenlijkt door

de opening van de uitgangsspleet groter te maken dan de breedte van de ionenbundel.

Meten met trapeziumvormige pieken heeft als voordeel dat een kleine variatie op de m/z

verhouding geen invloed zal hebben op het signaal, wat leidt tot een hoge precisie. [1],[33],[34]

Het voordeel van de trapeziumvormige pieken (hoge precisie) is ook zijn grote nadeel:

interfererende (moleculaire) ionen treden tevens de cup binnen, wat leidt tot een lage

massaresolutie. Bij overgang van lage naar hoge massaresolutie (door aanpassing van de

ingangs- en uitgangsspleet), gaan de trapeziumvormige pieken verloren en worden er

driehoekvormige pieken verkregen. De oplossing bij de Neptune om interferentievrij te

meten en tegelijk de trapeziumvormige pieken te behouden, is werken bij een zogenaamde

pseudo-hoge massaresolutie, met een iets lagere precisie (tot 0,005% RSD), door enkel de

ingangsspleet kleiner te maken. Dit leidt dan tot een signaalverloop zoals weergegeven in

Figuur 2.19. Uiteindelijk wordt de cup gepositioneerd op het deel van de piek waar enkel het

analiet ion invalt (interferentie-vrij plateau). Bij de Neptune is het niet mogelijk om te meten

bij een lage of hoge massaresolutie, maar enkel bij een pseudo-medium of pseudo-hoge

massaresolutie.[1],[33],[34]

20

Figuur 2.17 Trapeziumvormige pieken bekomen door een brede uitgangsspleet. Levert een hoge precisie, maar een lage massaresolutie.[2]

Figuur 2.18 Wanneer er gewerkt wordt bij een hoge massaresolutie, worden de analiet ionen en de moleculaire ionen volledig gescheiden.[2]

Figuur 2.19 Interferentievrije meting van het analiet ion bekomen door een smallere ingangsspleet, maar een even brede uitgangs-spleet. Dit levert een iets lagere precisie, maar een hogere

massaresolutie.[2]

Figuur 2.20 Het gebruikte quadrupool toestel in de A&MS groep is een Thermo Scientific XSeries II apparaat.

Figuur 2.21 Het gebruikte Thermo Scientific Element XR apparaat.

Figuur 2.22 Het gebruikte Thermo Scientific Neptune apparaat.

Sign

aalin

ten

site

it

m/z (a.e.)

Analiet ion + moleculair ion

Sign

aalin

ten

site

it

m/z (a.e.)

Analiet ion + moleculair ionAnaliet ion

Moleculair ion

Sign

aalin

ten

site

it

m/z (a.e.)

Analiet ion + moleculair ion

Moleculair ion

Analiet ion

Analiet ion + Moleculair ion

21

3 Interferentie

3.1 Spectrale Interferentie

Spectrale interferentie bij lage resolutie toestellen (quadrupool ICP-MS) treedt op als twee

of meerdere ionen eenzelfde verhouding van massa tot lading hebben. Bij sector-veld

toestellen daarentegen treedt er in hoge massaresolutie pas spectrale interferentie op als

het verschil kleiner is dan een honderdste u. De grootste bron van dit type interferentie ligt

bij het voorkomen van polyatomische ionen gevormd uit elementen in het plasmagas,

solvent, matrix, lucht, … met eenzelfde nominale massa als het analiet. Ook meervoudig

geladen ionen kunnen samenvallen met enkelvoudig geladen analieten.[1],[19]

In Tabel 3.1 worden enkele spectrale interferenties weergegeven die tijdens deze studie

van belang zijn, vooral bij de precieze bepaling van isotopenratio’s.

Tabel 3.1 Spectrale interferenties die optreden tijdens deze studie (niet beperkende lijst).

Type interferentie Analiet Interferentie

Isobare nuclide 54

Fe+

58Fe+

66Zn+

54Cr

+

58Ni+

132Ba++

Ar-gebaseerde interferentie

Andere

54Fe

+

56Fe+ 57Fe+ 63

Cu+

67Zn+

68Zn+

40Ar

14N

+

40Ar16O+

40Ar16OH+ 40

Ar23

Na+

35Cl16O2+

35Cl16O2H+

Er bestaan een aantal oplossingen om spectrale interferentie te vermijden, of toch op z’n

minst te reduceren. Zo zal een correcte monsterbehandeling, een goede scheiding van de

analietelementen uit hun matrix (ionenuitwisselingschromatografie), uitdampen van de

stalen, gebruik van een botsings/reactiecel en/of een alternatief

monsterintroductiesysteem, … leiden tot eliminatie of reductie van bepaalde gevallen van

overlap. Ook een blancocorrectie (evt. met ‘matrix-matching’) is mogelijk, maar enkel

22

succesvol wanneer de graad van overlap eerder beperkt is. Bij hoge-resolutie toestellen,

zoals een sector-veld massaspectrometer kunnen de meeste spectrale interferenties

geresolveerd worden.[1],[18],[19],[35],[36]

3.1.1 De Botsings/Reactiecel

De botsings/reactiecel in een quadrupool-gebaseerd toestel (Figuur 3.1) bevindt zich tussen

de interface en de quadrupoolfilter en biedt een universele en elegante manier om met

spectrale interferentie om te gaan. De cel bevat een multipooleenheid (quadrupool,

hexapool of octopool) en kan gevuld worden met een geschikt gas.

Naargelang de spectrale interferentie wordt een ander gas gekozen om de interferentie

te elimineren. De verschillende processen die kunnen optreden tussen dit gekozen gas en de

(moleculaire) ionen uit het ICP zijn: (i) dissociatie van moleculaire ionen door botsing, (ii)

selectieve ladingsoverdracht en (iii) chemische reactie met atoomtransfer, vandaar de naam

botsings/reactiecel. Het nadeel van zo’n cel is dat ongewenste reacties aanleiding kunnen

geven tot nieuwe polyatomische ionen. Als de cel uitgerust is met een quadrupooleenheid,

kan die de ongewenste ionen destabiliseren en uit de ionenbundel verwijderen. Een cel met

een hexapool- of octopooleenheid daarentegen kan dit niet. In dit geval is er een

alternatieve manier om het verwijderen van deze ongewenste ionen: energiediscriminatie.

De ionen die door reactie in de cel gevormd werden, bezitten een lagere kinetische energie

dan de ionen afkomstig uit het ICP. Door het aanleggen van een potentiaal (energiebarrière)

geraken de ongewenste ionen niet verder tot in de massaspectrometer, waardoor het

doelnuclide minder tot geen concurrentie meer heeft van interfererende ionen. Een andere

mogelijkheid om louter via energiediscriminatie interfererende ionen te verwijderen, is de

botsing met inerte gasatomen (bijvoorbeeld helium, 7% H2 in He, 1% NH3 in He,…): door de

botsing verliezen moleculaire ionen (rotatie en vibratiemogelijkheid) meer energie dan

atomaire ionen. Het aanleggen van een potentiaal (energiebarrière) leidt opnieuw tot

selectieve eliminatie van de interfererende moleculaire ionen (Figuur 3.2).[1],[19]

In deze studie wordt gebruik gemaakt van de botsings/reactiecel in een Thermo Scientific

XSeries II apparaat om de interferentie van 40Ar16O+ met 56Fe+ te verlagen. Dit toestel is

uitgerust met een hexapooleenheid waardoor er dus gewerkt wordt met de

energiediscriminatie zoals hierboven beschreven. Het gebruikte gas is een mengsel van 7%

23

H2 in He, waardoor onder meer de 40Ar16O+ ionen meer energie verliezen door botsing met

He. Het H2 reageert met Ar volgens (i) en (ii) maar dragen in dit specifiek voorbeeld niet bij

tot het vermijden van de 40Ar16O+ interferentie:

(i)

(ii)

Het optimale gasdebiet voor dit specifiek voorbeeld is terug te vinden in Hoofdstuk 6.

Figuur 3.1 Voorstelling van een quadrupool-gebaseerd ICP-MS toestel met een botsings/reactiecel. Als voorbeeld wordt de interferentie van 40Ar16O+ op de 56Fe+ bepaling getoond.[1]

Figuur 3.2 Schematische voorstelling van de kinetische energiediscriminatie: moleculaire ionen die botsen met een inert gas verliezen meer energie dan atomaire ionen. Door het aanleggen van een potentiaal worden deze moleculaire ionen niet verder geleid tot in de massaspectrometer. CCT staat voor Collision Cell Technology.[1],[19]

Botsings/reactiecelQuadrupoolfilter

Extractielenzen

Energie-barrière Botsingsgas: atoom of molecule

Analietion M+

Moleculair ion bv. ArX+

Botsings/reactiecel

CCTED – Kinetische Energiediscriminatie

Van plasma

Naar quadrupool

Toen

emen

de

ener

gie

24

3.2 Niet-Spectrale Interferentie

Niet-spectrale interferentie wordt verkregen door de matrix die een signaalonderdrukking of

-verhoging induceert, waardoor het signaal van alle analietelementen wordt beïnvloed. Dit

type interferentie wordt veroorzaakt door een aantal effecten:[1]

Fysische effecten: bv. verschil in viscositeit tussen monster en standaard;

Verschuiving van het ionisatie-evenwicht: bij de aanwezigheid van een grote

hoeveelheid van een eenvoudig ioniseerbaar matrix-element;

Ambipolaire diffusie in het ICP: radiale diffusie van elektronen en ionen van het

centrum van het ICP naar buiten toe. Elektronen diffunderen sneller waardoor een

elektrisch veld ontstaat zodat kationen ook elektromigratie vertonen. Dit effect heeft

meer invloed op de lichtere ionen;

Verschuiving van de maximale M+ zone: tussen de inductiespoel en de sampling cone

in functie van de temperatuur in het ICP;

Specifieke effecten: door introductie van een bepaald matrix-element;

Space-charge effect en Nozzle-separation: worden verder besproken in Hoofdstuk 4.

25

4 Massadiscriminatie en Correctie

Massadiscriminatie is een onvermijdelijk fenomeen bij ICP-MS dat onder andere veroorzaakt

wordt door: (i) het space-charge effect en (ii) het nozzle-separation effect. Beide effecten

resulteren in een efficiënter transport van de zwaardere ionen t.o.v. de lichtere in de richting

van de massaspectrometer, waardoor er een continu verlaagd signaal voor een lichter

isotoop t.o.v. elk zwaarder isotoop verkregen wordt (Figuur 4.1 rechts).[1],[18]

Het is duidelijk dat hiervoor dient gecorrigeerd te worden om accurate

isotopenverhoudingen te krijgen. Een aantal correctiemethoden worden verder in dit

hoofdstuk besproken.

4.1 Space-Charge Effect

De bundel die de expansiekamer verlaat via de skimmer bestaat uit elektronen, kationen,

anionen en neutrale componenten. De extractielens die zich na de interface bevindt, is

negatief geladen en zorgt ervoor dat enkel de kationen uit de bundel worden geëxtraheerd

zodat de neutrale en negatief geladen –afgestoten – deeltjes verwijderd worden via een

vacuümpomp. De geëxtraheerde bundel bevat nu dus enkel nog positieve ladingen, die

elkaar onderling afstoten (wet van Coulomb). De maat van afstoting is afhankelijk van de

kinetische energie van deze kationen. Argon is het meest abundante atoom dat zich in de

bundel bevindt en laat alle deeltjes bewegen met een zelfde snelheid, waardoor de

kinetische energie van elk deeltje afhankelijk is van zijn massa. Zwaardere deeltjes (hogere

kinetische energie) worden hierdoor efficiënter getransporteerd naar de

massaspectrometer, terwijl de lichtere meer repulsie ondervinden. Dit leidt dus tot

defocussering en wijziging van de bundelsamenstelling en wordt het space-charge effect

genoemd.[1],[18],[19],[35]

26

4.2 Nozzle-Separation Effect

Dit effect treedt op in de expansiekamer. Omwille van hun lagere massa zullen de lichtere

ionen ook hier meer van het centrum van de bundel verwijderd worden en dus de kleine

opening van de skimmer niet bereiken. De nozzle-separation leidt dus tot massadiscriminatie

in dezelfde richting als het space-charge effect waardoor de bijdrage van deze twee effecten

zeer moeilijk experimenteel kan onderscheiden worden.[18]

4.3 Massadiscriminatie versus Massafractionatie

De twee bovenstaande effecten resulteren in een continue aanrijking van de ionenbundel in

de zwaardere isotopen, m.a.w. zwaardere ionen worden efficiënter getransporteerd dan de

lichtere waardoor ICP-MS minder gevoelig is voor deze laatste. Dit fenomeen blijft ongeveer

constant in de tijd en wordt aangeduid met de term massadiscriminatie (mass

discrimination). Er dient hiervoor duidelijk gecorrigeerd te worden.[1],[2],[18]

Er moet toch even bij stilgestaan worden dat tijdsafhankelijke massafractionatie, zoals

aanwezig in thermische ionisatie massaspectrometrie (TIMS), een volledig ander proces is

dan de statische massadiscriminatie, waargenomen bij ICP-MS. Het verschil tussen beide

wordt geïllustreerd aan de hand van Figuur 4.1. Bij TIMS worden de lichtere isotopen iets

efficiënter geïoniseerd dan de zwaardere. Na verloop van tijd zijn er relatief meer van de

lichtere isotopen uit het monster verdampt en blijft een steeds groter wordende fractie van

de zwaardere isotopen over. Als een gevolg hiervan wordt de geproduceerde ionenbundel

dus rijker aan de zwaardere isotoop in functie van de tijd.[1],[18]

Figuur 4.1 Vergelijking tussen massafractionatie in TIMS (links) en massadiscriminatie bij ICP-MS (rechts).

[2]

Tijd (a.e.) Tijd (a.e.)

TIMS

ICP-MS

27

4.4 Correctiemethoden

In de correctiemethodes zullen de volgende vergelijkingen toegepast worden:

(4.1)

Waarbij de werkelijke verhouding (van het aantal mol of het aantal deeltjes)

voorstelt van twee isotopen, met de zwaarste isotoop in de teller en de lichtste in de

noemer en:

(4.2)

Waarbij de gemeten verhouding is van beide isotopen. Door het effect van

massadiscriminatie is . Zo kunnen , ,

en gedefinieerd worden waarbij ‘std’ staat voor ‘standaard’.

Daar het verschil in isotopische samenstelling tussen de monsters zeer klein is, worden

de verhouding van de intensiteiten omgezet in een meer werkbare eenheid: de deltawaarde,

uitgedrukt in promille:

- (4.3)

Deze deltawaarde geeft het relatieve verschil weer in isotopische samenstelling van het

monster t.o.v. een referentiemateriaal.[1]

4.4.1 Externe Standaardisatie

Bij externe standaardisatie is de kalibratie meestal sequentieel (standaard-monster-

standaard-monster-…-standaard; sample-standard bracketing, SSB). Bij deze

correctiemethode wordt aangenomen dat de massadiscriminatie lineair fluctueert (neemt

lineair toe of af in functie van de tijd). Hierdoor zal de gemeten waarde van een standaard

ook variëren in tijd. De afwijking van de werkelijke verhouding t.o.v. de waargenomen

verhouding van het monster is bij dit model louter het gemiddelde van de afwijkingen van de

waargenomen verhoudingen t.o.v. de werkelijke verhoudingen van de standaarden,

gemeten net voor en net na het beschouwde monster:

28

(4.4)

Of

(4.5)

Als wordt de waarde gebruikt die het ‘institute for reference materials and

measurements’ (IRMM) of het ‘national institue for standards and technology’ (NIST)

meedelen op hun referentiemateriaal. Dit correctiemodel wordt aan de hand van een

voorbeeld voorgesteld in Figuur 4.2.

Figuur 4.2 Grafische voorstelling van de bracketing methode.

4.4.2 Interne Standaardisatie

Bij dit soort correcties wordt er een element met gelijkaardige massa als het doelelement

aan de monsteroplossing en standaarden toegevoegd. Er wordt verondersteld dat de

massadiscriminatie voor deze inwendige standaard gelijkaardig is als deze voor de

doelisotopen in het monster. Voor Fe kan bijvoorbeeld Ni gebruikt worden, voor Zn kan men

Cu toevoegen en omgekeerd. De afwijking op de isotopenverhoudingen van deze inwendige

standaarden kan dan gebruikt worden om de massadiscriminatie per massa-eenheid (ε) te

bepalen. Afhankelijk van de veronderstelling of de massadiscriminatie varieert volgens een

lineaire -, machts - of exponentiële functie met het verschil in massa ( ) tussen de twee

isotopen, worden er verschillende modellen gehanteerd:[1],[2],[18],[37],[38]

(4.6)

(4.7)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

R (

a.e

.)

Tijd (a.e.)

29

(4.8)

In de Russell vergelijking daarentegen, wordt de verhouding van beide isotopenmassa’s

beschouwd als de bepalende factor in massadiscriminatie:

(4.9)

Hieronder volgen drie methodes die gebaseerd zijn op het gebruik van een inwendige

standaard en de Russell vergelijking.[1],[2],[18],[37],[38]

Methode 1

Deze methode is gebaseerd op de Russell vergelijking en de beschrijving van Malinovsky et.

al[39] en Meija et. al[38] en wordt in wat volgt de ‘inter-element’ methode genoemd:

, en zijn gekend en wordt gemeten, zowel in de

standaard als in het monster. Hieruit kan berekend worden. Aangezien de massa van

de doelisotopen gelijkaardig is aan die van de inwendige standaard, wordt er verondersteld

dat . Zo kan de werkelijke isotopenverhouding van het monster (en van

de standaard) bepaald worden:

(4.10)

Methode 2

Deze methode – gebaseerd op wat Woodhead et. al[40] publiceerden – hanteert ook de

Russell vergelijking om de massadiscriminatiefactoren te berekenen. Maar er wordt gebruik

gemaakt van lineaire regressie om de correlatie tussen

en

in de

standaardoplossing (gekende isotopensamenstelling) te documenteren. Via de vergelijking

van de bekomen rechte kan voor de monsters berekend worden uit

. Vervolgens wordt bekomen op dezelfde wijze als bij de

‘inter-element’ correctie. In wat volgt wordt deze methode kortweg de ‘Woodhead’

methode genoemd.

Methode 3

Deze methode – beschreven door Mason et. al[41] – is een combinatie van de SSB-methode

en de inter-element methode. De deltawaarde van het analiet in het monster wordt

berekend ten opzichte van de standaard en vervolgens verminderd met de deltawaarde

30

berekend voor de inwendige standaard in het monster, relatief t.o.v. de inwendige

standaard in de standaard. Hierbij wordt er ook gecorrigeerd voor een niet-lineaire shift in

de massadiscriminatie, wat niet gebeurd bij de lineaire benadering van de SSB-methode.

4.5 Vergelijking van de Verschillende Methodes

Massadiscriminatie wordt in feite opgedeeld in twee componenten: (i) instrumentele

massadiscriminatie effecten en (ii) matrix-afhankelijke massadiscriminatie, veroorzaakt door

een verschil in monstersamenstelling.[41]

Wat de instrumentele massadiscriminatie betreft houdt de standard-sample bracketing

(SSB) methode geen rekening met niet-lineaire fluctuaties tussen twee standaarden. Dit

maakt deze methode minder robuust t.o.v. interne standaardisatiemethoden, waar een

inwendige standaard continu gemeten wordt en aldus informatie verschaft over de

eigenlijke variatie in massadiscriminatie. Bijgevolg werkt de externe correctiemethode het

best bij een stabiele massadiscriminatie. Dit laatste is meestal het geval bij de Neptune,

zodat externe en interne standaardisatiemethoden algemeen zeer gelijkwaardige resultaten

geven.[41]

Opdat een accurate correctie voor matrix-afhankelijke massadiscriminatie mogelijk zou

zijn dienen in de eerste plaats zoveel mogelijk matrixcomponenten verwijderd te worden om

matrix-gerelateerde massadiscriminatie in het monster te minimaliseren. Een standaard

bevat (praktisch) geen matrixcomponenten, wat dus een verkeerde correctie zou geven

indien het monster niet zuiver genoeg zou zijn (bij de SSB-methode).[41]

Interne standaardisatiemethoden zijn robuuster tegenover variaties in matrix tussen de

standaarden en de stalen, maar toch maar in beperkte mate. De matrix-afhankelijke

component van de massadiscriminatie verklaart ook de noodzaak om bij het meten van

isotopenverhoudingen met een MC-ICP-MS de concentraties van het analietelement zo goed

mogelijk overeen te laten komen tussen stalen en standaarden (maximum 20 % verschil).

Tussen de interne standaardisatiemethoden blijkt de ‘Woodhead’ methode het meest

betrouwbare resultaten te geven. Daarom werden meestal de door deze methode bekomen

resultaten gebruikt om verder mee te werken.

31

5 Monstername en -voorbereiding

Een correcte monstervoorbereiding is een belangrijke stap om betrouwbare resultaten te

verkrijgen in alle domeinen van de analytische chemie en zeker bij isotopenanalyse. Allerlei

maatregelen worden genomen om een bloedmonster niet te contamineren vanaf de

bloedafname tot bij het meten van het monster. In dit hoofdstuk wordt een beschrijving

gegeven van de bloedafname en het clean lab waarin de volledige monstervoorbereiding

werd uitgevoerd, bestaande uit twee grote stappen: (i) digestie van het bloed en (ii) isolatie

van de analietelementen via ionenuitwisselingschromatografie.[11]

5.1 Bloedafname

Na het spoelen van de naald met 10 mL bloed (gecollecteerd in urinebuisjes die verder geen

functie hebben), wordt er 6 mL afgenomen in buisjes bestemd voor spoorelementanalyse

(BD Vacutainer). De spoeling van de naald is belangrijk om contaminatie te vermijden. De

bloedmonsters werden op het UZ Gent afgenomen. Tot de monstervoorbereiding van start

gaat, worden de buisjes bewaard bij -20°C.

5.2 Het Clean Lab

Om contaminatie van de stalen te vermijden, vindt de gehele monstervoorbereiding plaats

in een PicoTrace clean lab klasse 10 (volgens de US FED-STD-209E standaard). Andere

maatregelen om contaminatie te vermijden zijn het gebruik van Teflon PFA Savillex bekers

(die een specifieke reinigingsprocedure ondergaan hebben, zie Bijlage 4) van verschillende

groottes, verdere in-house opzuivering van de aangekochte zuren (HNO3, 14 M en HCl, 12

32

M; pro analysi, Chem-Lab, Zedelgem) met behulp van een sub–kookpuntsdestillatie (sub-

boiled, sb.) in Teflon apparatuur voor HNO3 en in kwarts apparatuur voor HCl. Er werd ook

gebruik gemaakt van ultra-zuiver water (Milli-Q, resistiviteit ≥ 18.2 MΩ.cm bij

25°C).[11],[42],[43],[44]

5.3 Digestie van het Bloed

Omdat het ontdooide bloed vrij viskeus is – wat kan leiden tot een verkeerd opgenomen

volume via ‘normaal pipetteren’ – wordt er 3 mL in een 60 mL Teflon Savillex beker gebracht

via ‘omgekeerd pipetteren’. Hierbij wordt de pipet tot de tweede stop ingedrukt, de

pipetpunt wordt in het bloed gebracht en een bepaald volume (iets meer dan 3 mL) wordt

opgezogen. Vervolgens wordt het pipetpunt geleegd tot de eerste stop, waardoor er exact

drie milliliter in de beker terecht komt. Het bloed dat achter blijft in de pipetpunt wordt

verwijderd. Aan het bloed in de Savillex beker wordt vervolgens 7 mL 14 M HNO3

toegevoegd om Cu, Fe en Zn, die normaal gebonden zijn aan biomoleculen in het bloed, vrij

te stellen. Na een uurtje wachten (en eventuele ontgassing), worden de gesloten bekers op

een verwarmplaat geplaatst, waar ze gedurende 14 uur bij 110 °C worden verwarmd.[11],[45]

De verkregen oplossing wordt vervolgens bij 95 °C drooggedampt. Het droge residu

wordt hierna heropgelost in 5 mL 8 M HCl die ook 0.001% H2O2 bevat om alle Fe- en Cu-

ionen in hun hoogste oxidatietoestand te krijgen. Dit laatste is nodig om Cu en Fe elk als één

fractie op het juiste moment te laten elueren tijdens de ionenuitwisselingschromatografie (§

5.4). Om het residu volledig te heroplossen, dienen de bekers (uiteraard gesloten) op een

verwarmplaat (110 °C) gezet te worden voor een aantal uur. Eventueel kan er, na het

heroplossen, wat extra H2O2 (bv. 50 µL) toegevoegd worden om er zeker van te zijn dat de

koper- en ijzerionen in hun hoogste oxidatietoestand blijven, aangezien verwarming het

waterstofperoxide uit de oplossing doet verdwijnen.[11]

Na de vorige stap is er enige precipitatie aanwezig, waardoor de monsters

gecentrifugeerd moeten worden, vooraleer ze in het tweede deel van de

monstervoorbereiding op het hars worden geladen. Eerdere studie heeft aangetoond dat dit

geen invloed heeft op de resultaten van de isotopenanalyse.[11]

33

5.4 Ionenuitwisselingschromatografie

Deze stap in de monstervoorbereiding is van groot belang: er wordt een strategie gevolgd

om achtereenvolgens de Cu-, Fe- en Zn-ionen te isoleren van alle andere componenten die

aanwezig zijn in het monster. Als chromatografiekolom wordt er gebruik gemaakt van een

Bio-Rad Poly-Prep kolom, gevuld met 2 mL van het sterke anion uitwisselingshars AG MP-1

(korrelgroottediameter 75 tot 150 µm). Deze bestaat uit quaternaire ammoniumgroepen die

aan een styreen divinylbenzeen copolymeer met hoge porositeit (droog: effectief oppervlak

van ± 23 m²/g) gebonden zijn en waarvan het tegenion in normale condities Cl- is. Aangezien

in de laatste stap van het digestieproces HCl toegevoegd wordt aan de monsteroplossing,

worden er metaalchloride complexen gevormd die resulteren in een beter ligand voor de

ammoniumgroep, dan het Cl- anion. De complexen relevant voor dit werk zijn en

, met Cu(II) of Zn(II) en

. Boven het hars wordt er een zogenaamde ‘stopper’

geplaatst om te voorkomen dat het hars opwervelt wanneer er oplossing wordt

opgebracht.[11],[46],[47],[48]

Het hars wordt gereinigd met 3 mL 7 M HNO3, ca. 5 mL 8 M HCl en ca. 5 mL 0.7 M HNO3,

telkens met ca. 5 mL H2O tussen elke stap. Het hars wordt driemaal gebruikt en er dient

opgemerkt te worden dat na het toevoegen van de 8 M HCl de eluerende oplossing geel kan

kleuren. De exacte reden hiervoor is niet gekend maar hoogstwaarschijnlijk komt dit door de

aanwezigheid van matrixelementen van een vorige scheiding. Spoelen met extra 8 M HCl tot

de gele kleur verdwijnt is in dit geval noodzakelijk. Conditioneren gebeurt door 10 mL 8 M

HCl + 0.001% H2O2 op het hars te brengen. Vervolgens wordt de monsteroplossing geladen,

waarna 8 mL 8 M HCl + 0.001% H2O2 wordt gebruikt om de matrix te verwijderen.[11]

Na de matrix, elueren achtereenvolgens het Cu, Fe en Zn door respectievelijk 12 mL 5 M

HCl + 0.001% H2O2, 10 mL 0.6 M HCl en 10 mL 0.7 M HNO3 op de kolom te brengen. Deze

opgezuiverde analietelementfracties worden na elkaar opgevangen in Teflon Savillex bekers.

Om chloor te verwijderen, worden de fracties uitgedampt op een verwarmplaat bij 95 °C,

heropgelost in 10 mL 0.7 M HNO3 en nogmaals uitgedampt (enkel voor Cu en Zn).

Uiteindelijk worden de residuen heropgelost in 5 mL 0.7 M HNO3 voor Zn en 800 µL 0.7 M

HNO3 voor Cu. Indien deze tweede uitdampingsstap niet uitgevoerd wordt, zullen de

signalen van 35Cl16O2+ en 35Cl16O2

1H+ interfereren met deze van respectievelijk 67Zn+ en 68Zn+.

34

Voor 63Cu+ zouden de signalen van 14N12C37Cl+ en 35Cl 16O12C+ kunnen overlappen en voor

65Cu+ kan er interferentie optreden met 37Cl 16O12C+.[11],[47]

5.4.1 Het Elutieprofiel

Een elutieprofiel toont aan in welke mate bepaalde componenten gescheiden werden van

de matrixcomponenten en van elkaar tijdens een scheidingsmethode en hoeveel eluens

hiervoor nodig is. Hieruit kan er dan geconcludeerd worden of de gebruikte methode al dan

niet geschikt is. In deze studie werden de voornaamste elementen in menselijk volbloed

bepaald, gebaseerd op de gegevens die beschikbaar zijn in menselijk referentiebloed

(Seronorm Trace Elements Whole Blood L-1).[49]

Het elutieprofiel wordt bekomen door als eerste een staal te laden (sample load) en de

eerste fractie die van de kolom komt als één fractie op te vangen. Vervolgens wordt het zuur

dat dient om de matrixelementen te elueren (matrix) op de kolom gebracht en per milliliter

opgevangen. De Cu, Fe en Zn fracties worden op een analoge manier gecollecteerd als de

matrixfracties. Het opvangen van elke milliliter gebeurt door middel van een

microcentrifugebuis (aangekocht bij Carl Roth, Duitsland) en dit wordt onder de

ionenuitwisselingschromatografiekolom gehouden.

Om het elutieprofiel op te stellen werd gebruik gemaakt van een gewoon bloedstaal dat

dezelfde monstervoorbereiding en scheidingsmethode onderging als elk ander staal. Er werd

een kleine hoeveelheid monster apart gemeten (verdunde oplossing die geen scheiding

onderging) voor concentratiebepaling om de hoeveelheid dat van elk analietelement op de

kolom werd gebracht te kunnen bepalen. Eenmaal elke fractie geanalyseerd op de

elementaire samenstelling, kan het percentage aan elk element berekend worden dat terug

te vinden is in iedere fractie.

Figuur 5.1 toont het verkregen elutieprofiel en er is duidelijk te zien dat een groot aantal

matrixelementen reeds verwijderd wordt in de eerste fracties. Cu, Fe en Zn zijn zuiver

teruggewonnen in hun eigen fracties (Figuur 5.2).

35

B

Na

Rb

BaMg

SiP

SCa

FeCu

ZnSe

KBr

0

20

40

60

80

100

120

140

slm 1 m 2 m 3 m 4 m 5 m 6 m 7 m 8 Cu

FeZn

Opbr

engs

t (%)

B

Na

Rb

Ba

Mg

Si

P

S

Ca

Fe

Cu

Zn

Se

K

Br

Figuur 5.1 Het elutieprofiel bewijst dat de aangewende scheidingsmethode goed werkt om Cu, Fe en Zn van elkaar en de matrixelementen te scheiden.

0

10

20

30

40

50

60

70

Cu 1

Cu 2

Cu 3

Cu 4

Cu 5

Cu 6

Cu 7

Cu 8

Cu 9

Cu 1

0

Cu 1

1

Cu 1

2

Fe 1

Fe 2

Fe 3

Fe 4

Fe 5

Fe 6

Fe 7

Fe 8

Fe 9

Fe 1

0

Zn 1

Zn 2

Zn 3

Zn 4

Zn 5

Zn 6

Zn 7

Zn 8

Zn 9

Zn 1

0

Cu

Fe

Zn

Figuur 5.2 Wanneer enkel de Cu, Fe en Zn fracties bekeken worden, ziet men dat Cu teruggewonnen wordt in 1-mL fracties Cu 4 tot Cu 10, Fe in fractie Fe 2 & Fe 3 en Zn in fractie Zn 4 & Zn 5.

36

6 Metingen

Om de concentraties van Fe, Cu en Zn in de opgevangen fracties te bepalen, werd gebruik

gemaakt van een Thermo Scientific XSeries II quadrupool ICP-MS apparaat.

Concentratiebepaling is steeds noodzakelijk omdat voor betrouwbare meting van de

isotopenverhoudingen met het Thermo Scientific Neptune MC-ICP-MS apparaat zowel de

standaarden als de stalen in eenzelfde concentratie (± 20%) aanwezig moeten zijn om de

matrix-afhankelijke component van massadiscriminatie te minimaliseren (zie ook § 4.5). Om

het elutieprofiel (zie § 5.4.1) en de detectielimieten (limit of detection, LOD) te bepalen,

werd het Thermo Scientific Element XR sector-veld ICP-MS apparaat gekozen omdat er in de

matrixfracties een groot aantal geïnterfereerde elementen zitten en deze interferenties niet

allemaal te verhelpen zijn met de XSeries II. Door te meten bij een hogere (medium of hoge)

massaresolutie konden met dit instrument de aanwezige spectrale interferenties worden

vermeden.

Bij elke monster-, standaarden blanco-oplossing wordt er een gekende hoeveelheid

inwendige standaard toegevoegd. Deze heeft een massa gelijkaardig aan het analietelement,

waardoor beide op eenzelfde (of toch zeer gelijkaardige) manier reageren op de

beïnvloeding van het signaal door instrumentinstabiliteit en matrixeffecten. Door de verdere

berekeningen uit te voeren met de verhouding van beide signalen wordt er gecorrigeerd

voor signaalinstabiliteit en signaaldrift.

6.1 Elementbepaling met de Thermo Scientific XSeries II

Tabel 6.1 geeft weer wat typische concentratiewaarden zijn die voor Fe, Cu en Zn in

menselijk volbloed in de literatuur terug te vinden zijn samen met de overeenkomstige

gemiddelde experimentele waarden van dit werk. De experimentele waarden wijken lichtjes

37

af van de referentiewaarden uit de literatuur. Dit kan mogelijk verklaard worden door de

neerslagvorming tijdens de monstervoorbereiding. Dit concentratieverschil heeft echter

geen invloed op de isotopische samenstelling van elk monster, zoals eerder onderzoek[11]

heeft bevestigd. Aangezien Fe, Cu en Zn in een hoge concentratie aanwezig zijn, worden

deze voor hun bepaling verdund. Als inwendige standaard wordt 10 µg/L Co gebruikt voor Fe

en 10 µg/L Ga voor Cu en Zn: de twee meest abundante isotopen (59Co en 69Ga) worden

gemeten. Met behulp van een uitwendige standaardreeks wordt de concentratie van Fe, Cu

en Zn in elk monster bekomen. De gebruikte instrumentinstellingen en meetparameters

voor de Thermo Scientific XSeries II zijn weergegeven in Tabel 6.1. Deze instellingen variëren

echter licht tussen elke meetdag: tijdens de tuning worden de instrumentinstellingen

geoptimaliseerd om tegelijkertijd een voldoende hoge signaalintensiteit te verkrijgen, terwijl

het niveau van oxide-ionen en dubbel geladen ionen voldoende laag wordt gehouden. Om

de best mogelijke detectielimiet te verkrijgen en geen kostbare tijd verloren te laten gaan,

wordt er gekozen om in peak-hopping modus te meten.[11],[50],[51]

Om de interferentie van 40Ar16O+ met de meest abundante isotoop van ijzer (56Fe) te

reduceren werd de Collision Cell Technology op de XSeries II gebruikt (zie § 3.1.1) en werd

het optimaal gasdebiet (H2/He mengsel) bepaald door het maximum te bepalen van de

verhouding van signaal (voor een 10 µg/L ijzer-oplossing in 2% HNO3 (sb.)) tot achtergrond

(2% HNO3 (sb.)-oplossing) in functie van het gasdebiet. Uit Figuur 6.1 en Figuur 6.2 valt af te

leiden dat het maximum ligt bij ongeveer 4.6 L/min van het botsings-/reactiegas, een

mengsel van 7 % H2 in He.

Tabel 6.1 Het concentratie-interval voor Fe, Cu en Zn gevonden in menselijk volbloed: vergelijking tussen experimenteel bekomen waarden en deze gevonden in de literatuur.

Element Concentraties Experimenteel

(ppm) Literatuur[51]

(ppm)

Fe Cu Zn

324 0.56 5.23

420-560 0.8-2 6-7

38

Tabel 6.2 Instrumentinstellingen en meetparameters voor de Thermo Scientific XSeries II.

Cu en Zn Fe (CCT-modus)

Instrumentinstellingen Monster opnamesnelheid (µL/min) 500 Plasmagasdebiet (L/min) 13.0

0.7 0.78-0.90

Hulpgasdebiet (L/min) Draaggasdebiet (L/min) RF vermogen (W) 1200-1400 CCT-gas (L/min) 0.0 4.6 Hexapool bias (V)1 0.50 -20.00 Pole bias (V)2 -4.00 -17.00 Focus (V)3 13.10 -10.00 D2 (V)

3 -140 -100

Sampling cone Ni; 1.1 mm openingsdiameter Skimmer Ni; 0.75 mm openingsdiameter Meetparameters Meetmodus peak-hopping Runs 3 Sweeps4 300

38 10

Acquisitietijd (s)5

Dwell time (ms)6

1De spanning op de hexapool en de 2quadrupool, 3De spanning op de elektrostatische lenzen, 4Het aantal keer elke massa geanalyseerd wordt tijdens een run,5De duur van één enkele run, 6De duur dat één bepaalde massa geanalyseerd wordt.

Figuur 6.1 Gasdebiet He/H2(7%) versus de signaal/achtergrond verhouding. Een maximum wordt gevonden tussen 4 en 5 L/min.

Figuur 6.2 Gasdebiet He/H2(7%) versus de signaal/achtergrond verhouding, tussen 4 en 5 L/min. Het optimum wordt gevonden op 4.6 L/min.

6.2 Elementbepaling met de Thermo Scientific Element XR

De Element XR werd gebruikt om het elutieprofiel op te stellen en de detectielimieten te

bepalen van dit toestel voor de – voor dit onderzoeksproject – belangrijkste elementen in

menselijk bloed. Tabel 6.3 geeft de gebruikte instrumentinstellingen en meetparameters

weer. Standaard wordt er gekozen om te meten in E-scan modus: dit is sneller dan B-scan

modus.

In Tabel 6.4 zijn de detectielimieten terug te vinden. Hiervoor werden 10 blanco’s (2%

HNO3 (sb.)) gemeten om de standaardafwijking op de blanco te meten en tweemaal een 2

0

20

40

60

80

0 5 10

Sign

aal/

Ach

terg

ron

d

Gasdebiet (L/min)

50

60

70

80

3,9 4,4 4,9

Sign

aal/

Ach

terg

ron

d

Gasdebiet (L/min)

39

µg/L multi-elementstandaard gemeten om de gevoeligheid van het element na te gaan.

Vervolgens wordt voor elk geanalyseerd element de detectielimiet (Limit of Detection, LOD)

berekend volgens volgende vergelijking:[52],[53]

De Element XR laat – op basis van mogelijke interferenties – verschillende resolutiemodi

waarin elk element gemeten wordt toe: lage (LR), medium (MR) of hoge (HR) resolutie. Dit

komt respectievelijk overeen met R ≈ 400, 4000 en 10000. Zo kunnen bijvoorbeeld argon-

bevattende polyatomische ionen (40Ar14N+,40Ar16O+, 40Ar16OH+,…) gemakkelijk gescheiden

worden van de signalen van 54Fe, 56Fe en 57Fe door te werken bij medium resolutie.

Tabel 6.3 Instrumentinstellingen en meetparameters voor de Thermo Scientific Element XR.

Instrumentinstellingen Monster opnamesnelheid (µL/min) 200 Plasmagasdebiet (L/min) 15

0.85 1.0 – 1.1

Hulpgasdebiet (L/min) Draaggasdebiet (L/min) RF vermogen (W) 1200 Sampling cone Ni; 1.1 mm openingsdiameter Skimmer Ni; 0.8 mm openingsdiameter Meetparameters Scan-type E-scan Runs

3

Passes1 4 Segmentduur (s)

2 0.25

Monstertijd (ms)3 10 1Dit zijn het aantal spectra nodig om met de ingestelde analysetijd elke berekende run te vullen, 2Is de duur van een scan per isotoop,

3De tijd waarin het instrument integreert voor elk massapunt (meettijd/punt).

[53]

Tabel 6.4 Bekomen detectielimieten van enkele elementen, op de Thermo Scientific Element XR.

LOD (µg/L) 11B (LR) 0.1 23Na (LR) 1 85Rb (LR) 0.001 137Ba (LR) 0.007 24Mg (MR) 0.07 28Si (MR) 0.08 31P (MR) 0.7 32S (MR) 0. 2 44Ca (MR) 1 56

Fe (MR) 0.4 63Cu (MR) 0.02 66Zn (MR) 0.7 77

Se (MR) 0.02 38

K (HR) 0.7 79Br (HR) 0.04

40

6.3 Isotopenanalyse met de Thermo Scientific Neptune

De Neptune werd gebruikt om isotopenverhoudingen met hoge precisie te meten. In Tabel

6.5 zijn de instrumentinstellingen en meetparameters weergegeven die gebruikt werden

voor de isotopenanalyse van Fe, Cu en Zn. Zoals hoger vermeld, wordt er bij de Cu-monsters

1 mg/L Ni (in-house) toegevoegd dat dient voor de correctie voor massadiscriminatie, bij de

Cu- en Zn-monsters is dit respectievelijk 1 mg/L Zn (in-house standaard) en 1 mg/L Cu (in-

house standaard). Deze in-house standaarden werden bereid uit commercieel beschikbare

oplossingen van 1 g/L (Inorganic Ventures, Nederland; lot C2-CU02116 voor Cu in-house, lot

D2-FE03110 voor Fe in-house en lot D2-ZN02061 voor Zn in-house) om het verbruik van dure

isotopische referentiematerialen te reduceren.

Vooraleer de meting van start kan gaan, moet het toestel getuned worden en dienen de

Faraday cups correct geplaatst te worden. Als eerste handeling wordt de ionenbundel van

58Fe gecentreerd in de middelste (center) Faraday cup. Hierbij wordt een E-scan uitgevoerd

om het midden van de trapeziumvormige spectrale piek te localiseren. De E-scanning wordt

éénmaal van lage naar hoge massa uitgevoerd en éénmaal andersom. Het centrum van de

spectrale piek en het meetpunt (voor statische datacollectie) worden vastgelegd. Vervolgens

wordt er een peakscan uitgevoerd voor 56Fe, waarvoor het signaal onderhevig is aan

interferentie vanwege 40Ar16O+. Dit wordt verwezenlijkt door een E-scan rond deze massa. In

Figuur 6.4 is het duidelijk te zien dat het signaal voor de blanco-oplossing (lichtgroen) op een

hogere massa start dan deze voor een 56Fe-standaaroplossing (donkergroen). Voor dit

isotoop moet op het linker plateau gemeten worden op zo’n manier dat het blancosignaal

minder dan 0.1% bijdraagt tot de totale signaalintensiteit. Ook voor de overige isotopen van

ijzer moet er op het interferentie-vrij plateau gemeten worden (Figuur 6.5). Deze plateaus

zijn echter breder dan het plateau van 56Fe, waardoor de positie – bepaald via de 56Fe piek –

ook voor de andere isotopen zal voldoen indien de pieken goed uitgelijnd worden t.o.v.

elkaar (zie Figuur 6.5). Voor Cu en Zn geldt een analoge procedure. [54]

41

Tabel 6.5 Instrumentinstellingen en meetparameters voor de Thermo Scientific Neptune.[54]

Cu en Zn (MR) Fe en Ni (MR)

Instrumentinstellingen Monster opnamesnelheid (µL/min) 100 Plasmagasdebiet (L/min) 15.00

0.6 1.01-1.08

Hulpgasdebiet (L/min) Draaggasdebiet (L/min) RF vermogen (W) 1246-1302 Sampling cone Ni; 1.1 mm openingsdiameter Skimmer Ni; 0.8 mm openingsdiameter Meetparameters Scan-type Statisch; multi-collectie Aantal blokken

1 9

Aantal cycli/blok2 5 Integratietijd (s)3 4 Magneet insteltijd (s) 0 Cupconfiguratie L3: 63Cu

L2: 64Zn L1: 65Cu C: 66Zn

H1: 67Zn H2: 68Zn

L4: 54Fe L2: 56Fe L1: 57Fe C: 58Fe

H1: 60Ni H2: 62Ni

1Een blok is een set van cycli en kan gepauzeerd/gestopt worden. Bij hervatten worden de eerder gemeten cycli van dit blok gewoon opnieuw gemeten. 2Een cyclus is de simultane detectie op de zes Faraday cups gedurende een bepaalde integratietijd. 3De tijd waarin één cyclus gemeten wordt.

Een meting bestaat dus uit het aantal blokken, vermenigvuldigd met het aantal cycli/blok.[54]

Figuur 6.3 Spectrale piek voor 58Fe gemeten in de center cup bij lage massaresolutie.

42

Figuur 6.4 Spectrale piek van 56Fe bij hogere massaresolutie. De geschikte massa waarop 56Fe kan gemeten worden via statische datacollectie is deze waarbij het blanco signaal minder dan 0.1% bijdraagt tot de totale signaalintensiteit.

Figuur 6.5 Genormaliseerde spectrale signalen voor alle ijzer- en nikkelisotopen (hogere massaresolutie).

56Fe+

56Fe+ + 40Ar16O+

40Ar16O+

L4 L2 L1 C H1 H3

= 54Fe= 56Fe= 57Fe= 58Fe= 60Ni= 62Ni

43

7 Resultaten Isotopenanalyse

De meetgegevens, verkregen met de Neptune, werden gecorrigeerd voor

massadiscriminatie en de resultaten werden uitgedrukt in deltawaarden. Voor de

massadiscriminatiecorrectie werden verschillende methodes geëvalueerd (zie § 4.4). Hiervan

vertoonde de ‘Woodhead’ methode meestal de beste resultaten (zie § 4.5); vaak waren de

finale resultaten verkregen via de verschillende methoden vrij gelijkaardig. In Tabel 7.1 staat

vermeld welke gecertificeerde isotopische referentiematerialen gebruikt werden om de

deltawaarde te berekenen voor elk monster. Om de vier monsters werd er ook een in-house

standaard gemeten. Na correctie voor massadiscriminatie wordt geverifieerd of voor deze

in-house standaard een correcte deltawaarde wordt bekomen en dus, of de resultaten voor

de stalen betrouwbaar zijn. Soms tekende zich een trend af in de voor de in-house standaard

berekende deltawaarden, waarbij de gewijzigde waarde voor de in-house standaard dan een

indicatie geeft in welke mate de resultaten voor de stalen gemeten “rond dezelfde tijd als”

deze standaard ook beïnvloed zijn.

Niettegenstaande de in-house standaard en het gecertificeerd isotopisch

referentiemateriaal voor elk van de analietelementen een natuurlijke isotopische

samenstelling hebben, verschillen ze toch van elkaar. Dit is een gevolg van de verschillende

herkomst van de bronmaterialen. De deltawaarden voor de in-house standaarden ten

opzichte van het gecertificeerd isotopisch referentiemateriaal zijn ook weergegeven in Tabel

7.1. De onzekerheid op elke deltawaarde is weergegeven door de externe precisie, daar dit

de inter-analyse herhaalbaarheid weergeeft.[55]

Tabel 7.1 De in-house standaarden (Inorganic Ventures, Nederland) met de bijhorende deltawaarden, berekend ten opzichte van gecertificeerd isotopisch referentiemateriaal. De onzekerheid op elke deltawaarde is een externe precisie (2s).

In-house standaard

Gecertificeerd isotopisch referentiemateriaal

Isotopische samenstelling uitgedrukt als

Deltawaarde (‰)

Cu (lot C2-CU02116) NIST-976 δ65Cu 0.235 ± 0.015 Fe (lot D2-FE03110) IRMM-014 δ 56Fe 0.477 ± 0.021 δ 57Fe 0.699 ± 0.046 Zn (lot D2-ZN02061) IRMM-3702 δ

66Zn -7.041 ± 0.018

δ 67Zn -10.51 ± 0.034 δ 68Zn -13.93 ± 0.015

44

Vooraleer de data verder te verwerken werd er nagegaan of de experimentele

deltawaarden op de theoretische massa-afhankelijke fractionatielijn vallen. Hierbij wordt er

van uit gegaan dat voor een systeem – bestaande uit drie isotopen x, y en z – geldt dat

waarbij en . Voor Fe resulteert dit in de volgende twee

vergelijkingen: [56]

(i)

(i)

Voor 58Fe is dit echter niet experimenteel te bepalen, daar 58Fe storende overlap kent van

58Ni. Voor Zn worden de volgende twee vergelijkingen bekomen: [56]

(i)

(ii)

In Figuur 7.1 is duidelijk te zien dat voor Fe praktisch alle experimentele waarden op de

theoretische massa-afhankelijke fractionatielijn vallen. Voor δ68Zn daarentegen, werden er

in Figuur 7.2 twee monsters (OV1 en OV2, omcirkeld) weggelaten daar deze duidelijk

afwijkende resultaten hebben. Voor Cu is dergelijke validatie niet mogelijk aangezien er

slechts twee stabiele isotopen (63Cu en 65Cu) bestaan.

y = 1.469xR² = 0.8704

-5.0

-4.8

-4.6

-4.4

-4.2

-4.0

-3.8

-3.6

-3.4

-3.2

-3.0

-3.4 -3.2 -3.0 -2.8 -2.6 -2.4 -2.2 -2.0

δ5

7Fe

(‰)

δ 56Fe (‰)

Figuur 7.1 δ56Fe vs δ57Fe: praktisch alle experimentele deltawaarden vallen op de theoretische massa-afhankelijke fractionatielijn van Fe.

y = 1.7617xR² = 0.9211

y = 1.9459xR² = 0.9865

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

-0,1 0,2 0,4 0,6 0,8

δ6

7Zn

, δ6

8Zn

(‰

)

δ 66Zn (‰)

δ 67Zn

δ 68Zn

Figuur 7.2 δ67Zn vs δ66Zn en δ68Zn vs δ66Zn: praktisch alle experimentele deltawaarden vallen op de theoretische massa-afhankelijke fractionatielijn van Zn. De twee weggelaten monsters zijn omcirkeld.

45

7.1 Populatie

De populatie waarvan het bloed werd geanalyseerd bestaat uit gezonde (of misschien beter,

gezond veronderstelde) vrouwen. De referentiegroep wordt gevormd door normaal

menstruerende vrouwen (17 monsters). Daarnaast werden er bloedmonsters geanalyseerd

van vrouwen met een in-uterus hormonaal anticonceptiemiddel (Mirena) (4 monsters) en

vrouwen die zich in de menopauze bevinden (10 monsters).

In Bijlage 5 zijn voor alle stalen de leeftijd van de donor, de groep waartoe de donor

behoort en de berekende deltawaarden weergegeven. De resultaten van de referentiegroep

werden overgenomen van een eerdere studie.[57]

7.1.1 Het Hormoonspiraaltje

Een spiraaltje is een voorbehoedsmiddel dat door een arts in de baarmoeder van een vrouw

geplaatst wordt. Over het algemeen is een spiraaltje 24 tot 36 mm lang en is het één van de

veiligste voorbehoedsmiddelen: de kans om zwanger te geraken ligt slechts tussen 0.1 – 1 %.

Naast het koperspiraaltje – spiraaltje omwikkeld met een koperdraadje dat er voor zorgt dat

het baarmoederslijmvlies niet goed ontwikkeld wordt – bestaat er ook het

hormoonspiraaltje. Dit laatste is T-vormig en geeft een lage dosering hormonen af. Deze

hormonen zorgen er ook voor dat het baarmoederslijmvlies niet goed ontwikkeld wordt

zodat de eicellen zich niet meer kunnen nestelen. Hierdoor wordt een zwangerschap

voorkomen. Het hormoonspiraaltje wordt ook vaak een Mirena genoemd en het hormoon

dat afgegeven wordt is levonorgestrel. Enkele maanden na de plaatsting van een Mirena,

neemt de menstruatie aanzienlijk af en kan ze uiteindelijk helemaal verdwijnen. Een

dergelijk spiraaltje gaat 5 tot 10 jaar mee.[58],[59]

Bij de bloeddonoren die in deze studie een Mirena hebben blijft de menstruatie volledig

uit.

7.1.2 De Menopauze

Bij de geboorte van een vrouw bevinden zich in beide ovaria 1 tot 2 miljoen follikels,

waarvan elk follikel een gedeeltelijk ontwikkeld eicel bevat. Hiervan zullen er slechts

46

ongeveer 500 volledig rijpen tussen de pubertijd en de menopauze. Rond de leeftijd van 35

jaar neemt het aantal follikels geleidelijk af waardoor een daling van de oestrogeensynthese

optreedt. Na ongeveer 500 menstruele cycli blijft de ovulatie – en dus ook de menstruatie–

uit. Een vrouw bevindt zich dan in de menopauze en heeft een leeftijd bereikt tussen 46 en

54 jaar. Tijdens dit stadium dalen de oestrogeen, progesteron en inhibine spiegels drastisch.

De lage oestrogeen concentraties zijn verantwoordelijk voor lichamelijke veranderingen

zoals warmte-opstoten, afname van vaginale secreties, afname van botdensiteit enzovoort.

Om deze veranderingen aangenamer te maken wordt er soms hormoon supplementatie

voorgeschreven. Na de menopauze stoppen de ovaria volledig met de productie van

oestrogeen en testosteron. Dit stadium wordt ook wel de post-menopauze

genoemd.[60],[61],[62]

Enkele van de bloeddonoren volgen een dergelijk hormonenbehandeling maar dit werd

niet vermeld op de vragenlijst. Isotopenanalyse van volbloed van deze bloeddonoren kan

hier misschien meer duidelijkheid in brengen.

7.2 Statistische Methoden

Na de isotopenanalyse van Fe, Cu en Zn werden de verkregen resultaten aan volgende

statistische testen onderworpen via SPSS (Statistical Package for the Social Sciences)

software: (i) éénweg variantie-analyse (one-way analysis of variance, one-way ANOVA) om

te testen of een factor (referentie, Mirena en menopauze) een invloed heeft op een respons

(isotopische samenstelling van Fe, Cu en Zn in volbloed). Na een F-toets die test of de

variantie binnen de groepen al dan niet significant verschilt van de variantie tussen de

groepen, wordt er ook een post-hoc toets uitgevoerd om te bepalen welke

groepsgemiddelden significant van elkaar verschillen. De gekozen post-hoc toets is de a

priori LSD (least significant difference) toets aangezien er telkens twee verschillende groepen

(referentie, Mirena en menopauze) vergeleken worden met de overgebleven derde. (ii) Met

hiërarchische clusteranalyse (HCA) kan nagegaan worden of de verschillende groepen ook

effectief te onderscheiden zijn op basis van de resultaten van isotopenanalyse van Fe, Cu en

Zn. (iii) Principale componentenanalyse (PCA) werd aangewend om te bepalen welke

47

informatie in de verschillende variabelen vervat zit, terwijl via (iv) lineaire regressie werd

geëvalueerd of er al dan niet een significante correlatie bestaat tussen twee veranderlijken,

in dit geval de leeftijd en de isotopische samenstelling van Fe, Cu en Zn in volbloed van een

vrouw in de menopauze.[63]

Door gebruik te maken van de resultaten voor de referentiepopulatie en deze voor de

niet-menstruerende vrouwen kan er geen algemene correlatie gemaakt worden tussen de

isotopische samenstelling en de leeftijd van de vrouwen, daar de leeftijd niet de enige factor

is dat het verschillend resultaat tussen deze referentiegroep en de andere groepen kan

beïnvloed hebben (menstruatie). Tevens kon er geen significante correlatie worden

gevonden tussen de isotopische samenstelling en de leeftijd binnen de referentiegroep

omdat de spreiding op de leeftijd te klein is: de leeftijd van de donoren van de

referentiegroep schommelt slechts tussen de 20 en 25 jaar.

De statistische testen werden steeds uitgevoerd op het 5% betrouwbaarheidsniveau, de

kans dat de nulhypothese ten onrechte verworpen wordt moet met andere woorden kleiner

zijn dan of gelijk aan 5%.

7.3 Fe-isotopenanalyse

7.3.1 Onderscheidbaarheid van de Verschillende Groepen

One-way ANOVA en hiërarchische clusteranalyse tonen aan dat er via de isotopische analyse

van Fe in volbloed twee groepen kunnen onderscheiden worden op basis van al dan niet

menstrueren. De isotopische samenstelling in volbloed van de menstruerende

referentiegroep verschilt significant van die van de niet-menstruerende groep die bestaat uit

vrouwen met een Mirena en vrouwen in de menopauze. Ondanks het verschil in leeftijd

tussen de vrouwen met een Mirena (jonger, gem. 44 jaar, SD 10 jaar) en de vrouwen in hun

menopauze (ouder, gem. 61 jaar, SD 6 jaar), verschillen de resultaten voor deze twee

subgroepen niet significant van elkaar. Er kan met andere woorden vermoed worden dat er

geen significante correlatie bestaat tussen de isotopische samenstelling van Fe in volbloed

en de leeftijd. Maar zoals hoger vermeld zou verder onderzoek hier meer duidelijkheid

48

geven. In Figuur 7.3 wordt δ56Fe uitgezet in functie van δ57Fe en de twee significant

verschillende groepen zijn er in aangeduid. In Bijlage 6 is dezelfde grafiek weergegeven maar

met de bijhorende onzekerheid (2s). Deze onzekerheid is klein en wordt weggelaten in

Figuur 7.3 om de overzichtelijkheid te bewaren.

Uit de statistische tests is gebleken dat enkele stalen niet tot de groep behoren waar ze –

in theorie – zouden moeten toebehoren. Ook in Figuur 7.3 is het duidelijk te zien dat een

bloedstaal van een vrouw met een Mirena tussen de referentiestalen plot, alsook dat er zes

referentiestalen in de niet-menstruerende groep plotten.

Het gevonden resultaat is niet onlogisch: een studie uitgevoerd door Walcyk en von

Blanckenburg[13] en door Van Heghe et. al[11] toonde reeds aan dat de isotopische

samenstelling van Fe in volbloed van gezonde menstruerende vrouwen significant verschilt

van deze bij gezonde mannen: bloed van vrouwen heeft voor Fe een lichtere

isotopensamenstelling dan die van mannen. In deze studie wordt aangetoond dat door het

gebruik van een Mirena of tijdens de menopauze, het bloed van vrouwen een significant

lichtere Fe isotopische samenstelling (lagere δ56Fe en δ57Fe-waarden) vertoont dan het bloed

van de menstruerende vrouwen. Het bloed van deze groep van niet-menstruerende

vrouwen heeft een Fe isotopische samenstelling die eerder neigt naar die van de mannen.[11]

De relaties nagaan tussen de isotopische samenstelling van volbloed bij mannen en niet-

menstruerende vrouwen behoort niet tot het opzet van deze thesis. In dit geval zal dus

verder onderzoek noodzakelijk zijn.

7.3.2 Correlatie met de Leeftijd?

Er werd geen significante correlatie (p = 0.432) gevonden tussen de isotopische samenstelling van Fe

in volbloed van vrouwen in de menopauze en hun leeftijd. Dit is ook terug te vinden in Figuur 7.4.

49

-5,0

-4,8

-4,6

-4,4

-4,2

-4,0

-3,8

-3,6

-3,4

-3,2

-3,0

-3,4 -3,2 -3,0 -2,8 -2,6 -2,4 -2,2 -2,0

δ5

7Fe

(‰)

δ 56Fe (‰)

Referentie

Mirena

Menopauze

Figuur 7.3 Plotten van δ56Fe versus δ57Fe maakt duidelijk dat er twee groepen aanwezig zijn: de isotopische samenstelling van Fe in volbloed van de referentiegroep verschilt significant van die van de niet-menstruerende vrouwen.

y = -0,0106x - 2,3065R² = 0,0784

-3,4

-3,2

-3,0

-2,8

-2,6

-2,4

-2,2

-2,0

45 50 55 60 65 70

δ5

6Fe

(‰)

Leeftijd (jaar)

Figuur 7.4 Er bestaat geen significante correlatie tussen de isotopische samenstelling van Fe in volbloed van vrouwen in de menopauze en hun leeftijd.

7.4 Cu-isotopenanalyse


One-way ANOVA en hiërarchische clusteranalyse bewezen dat de isotopische samenstelling

van Cu in volbloed significant verschilt tussen de referentiegroep en de twee niet-

menstruerende groepen. Aangezien Cu slechts twee stabiele isotopen heeft (63Cu en 65Cu),

kan er enkel een grafiek opgesteld worden zoals weergegeven in Figuur 7.5. Opnieuw vallen

enkele stalen buiten de groep waar ze zouden moeten bijhoren. Net zoals voor Fe kan er

gesuggereerd worden dat de isotopische samenstelling van Cu in volbloed bij vrouwen die

niet menstrueren opschuift in de richting van die van de mannen. Het significant verschil in

de isotopische samenstelling in rode bloedcellen tussen mannen en vrouwen werd recent in

50

de literatuur gepubliceerd. In-house onderzoek heeft dit bevestigd voor volbloed.[15],[14] In

Bijlage 7 is dezelfde grafiek terug te vinden, maar met aanduiding van de onzekerheid op de

resultaten (2s). Voor de duidelijkheid werd er geopteerd om deze aanduiding van de onzekerheid

weg te laten in Figuur 7.5.


Er werd geen significante correlatie (p = 0.121) gevonden tussen de isotopische

samenstelling van Cu in volbloed van vrouwen in de menopauze en hun leeftijd. Aangezien

er tijdens de monstervoorbereiding twee monsters verloren gegaan zijn, zijn er in Figuur 7.6

slechts acht waarden opgenomen. Men telt er echter zeven omdat twee monsters dezelfde

leeftijd en praktisch dezelfde δ65Cu waarde hebben, waardoor deze twee datapunten

overlappen.

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

δ 65Cu (‰)

Referentie

Mirena

Menopauze

Figuur 7.5 Uitzetten van de drie verschillende groepen op de δ65Cu-as geeft weer dat de Cu isotopische samenstelling van de referentiegroep significant verschilt van die van de overige twee groepen.

y = 0.0229x - 1.1947

R² = 0.2663

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

45 50 55 60 65 70

δ6

5C

u (‰

)

Leeftijd (jaar)

Figuur 7.6 Er bestaat geen significante correlatie tussen de isotopische samenstelling van Cu in volbloed van vrouwen in de menopauze en hun leeftijd.

51

7.5 Zn-isotopenanalyse


De statistische methodes hebben aangetoond dat de Zn isotopische samenstelling van

volbloed van de referentiegroep significant verschilt van deze van vrouwen met een Mirena.

De Zn isotopische samenstelling van het bloed van vrouwen in hun menopauze ligt verspreid

over beide groepen (Figuur 7.7). Wanneer rekening gehouden wordt met de leeftijd van de

vrouwen die zich in de menopauze bevinden, is er een verband op te merken tussen de

leeftijd en de isotopische samenstelling van Zn; het bloed van de oudere vrouwen die zich in

de menopauze bevinden heeft een deltawaarde die aansluit bij die van de referentiegroep,

terwijl het bloed van jongere vrouwen in de menopauze eerder een zwaardere Zn

isotopensamenstelling hebben, zoals die van de vrouwen met een Mirena. Een mogelijke

verklaring voor deze zwaardere Zn isotopische samenstelling zou kunnen liggen in het

gebruik van hormonen (oestradiol). Maar het is echter niet geweten of deze jongere

vrouwen in de menopauze daadwerkelijk het hormoon innemen. Verder studie zou hierover

meer duidelijkheid moeten brengen. In Bijlage 8 is opnieuw dezelfde grafiek gegeven, maar

met de bijhorende onzekerheid (2s). Ook hier werd er geopteerd om de onzekerheid op de

datapunten weg te laten om de grafiek duidelijk te houden.


Er werd een significante correlatie (p = 0.009) vastgesteld tussen de isotopische samenstelling van

bloed van vrouwen in de menopauze en hun leeftijd. De Zn isotopensamenstelling in volbloed van

vrouwen in de menopauze wordt lichter naarmate de leeftijd toeneemt en is te zien in Figuur 7.8.

Deze correlatie zou kunnen gelinkt worden aan het gebruik van het hormoon oestradiol bij deze

jongere vrouwen, indien deze hypothese bevestigd kan worden door verdere studie.

52

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

δ6

7Zn

(‰)

δ66Zn (‰)

Referentie

Mirena

Menopauze

Figuur 7.7 Plotten van δ66Zn versus δ67Zn toont twee groepen: vrouwen met een Mirena en de referentiegroep. Vrouwen in de menopauze zijn verdeeld over beide groepen.

y = -0.0205x + 1.4964

R² = 0.5929

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

45 50 55 60 65 70

δ66

Zn (‰

)

Leeftijd (jaar)

Figuur 7.8 Er bestaat een significante correlatie tussen de isotopische samenstelling van Zn in volbloed van vrouwen in de menopauze en hun leeftijd.

7.6 Overzicht Resultaten Isotopenanalyse

Op basis van zowel de isotopische samenstelling van Fe als Cu kunnen er twee groepen van

elkaar onderscheiden worden in de onderzochte populatie: de groep van de menstruerende

vrouwen verschilt voor beide parameters significant van de groep van de niet-

menstruerende vrouwen, de isotopische samenstelling van de niet-menstruerende vrouwen

schuift op in de richting van die van de mannen.

In het geval van Zn verschilt de isotopische samenstelling van volbloed van de

referentiegroep significant van die van de Mirena-groep, terwijl de vrouwen in de

menopauze verdeeld zijn over beide groepen. De jongere vrouwen in hun menopauze

vertonen een hogere δ66Zn-waarde dan hun oudere groepsgenoten. Bijkomend onderzoek

53

moet uitsluitsel geven of deze spreiding verklaard kan worden door de inname van het

hormoon oestradiol bij deze jongere vrouwen in de menopauze.

Enkel voor Zn werd er een significante correlatie gevonden tussen de isotopische

samenstelling en de leeftijd van vrouwen in de menopauze, wat misschien gelinkt kan

worden aan de inname van oestradiol.

7.7 Vergelijkende Isotopenstudie

Bij principale componentenanalyse bevatten de twee loodrecht op elkaar staande principale

componenten (PC 1 en PC 2) complementaire informatie. In de ladinggrafiek (Figuur 7.9) is

er te zien dat de deltawaarden voor Fe en Cu dezelfde informatie bevatten en dat deze

complementair is aan de informatie die de deltawaarden voor Zn bevatten. PC 1 bevat dus

de informatie vervat in de deltawaarden voor Fe en Cu, voor PC 2 is dit het geval voor de

deltawaarden voor Zn. Aangezien δ56Fe en δ66Zn respectievelijk praktisch samenvallen met

de y-as en de x-as, en ze dezelfde informatie bevatten als hun overige isotopen (en de

deltawaarden voor Fe dezelfde informatie als die voor Cu), kan een scoregrafiek (Figuur

7.10) bekomen worden door δ56Fe uit te zetten in functie van δ66Zn, in plaats van de

principale componenten uit te zetten.

Uit Figuur 7.10 is duidelijk te zien dat de menstruerende vrouwen gescheiden worden

van de niet-menstruerende vrouwen (Mirena en menopauze) op basis van de Fe isotopische

samenstelling (rode lijn). Op basis van de Zn isotopische samenstelling kunnen vrouwen met

een Mirena gescheiden worden van de referentiegroep (groene lijn). Opmerkelijk hierbij is

dat de vrouwen in de menopauze zich aan beide kanten van de groene lijn bevinden. Het

blijkt dat de jongere vrouwen een hogere δ66Zn waarde bezitten dan hun oudere

groepsgenoten. Misschien kan deze shift verklaard worden door de inname van het

hormoon oestradiol bij deze jongere vrouwen in de menopauze (zie hoger).

Er kan dus via de Fe en Cu isotopische samenstelling in volbloed onderscheid gemaakt

worden tussen menstruerende en niet-menstruerende vrouwen. Via de isotopische

samenstelling van Zn in volbloed worden de vrouwen met een Mirena onderscheiden van

deze in de referentiegroep.

54

Figuur 7.9 Ladinggrafiek bekomen door PCA.

-3.4

-3.2

-3.0

-2.8

-2.6

-2.4

-2.2

-2.0

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

δ5

6Fe

(‰)

δ66Zn (‰)

Referentie

Mirena

Menopauze

Figuur 7.10 Scoregrafiek bekomen door PCA.

55

8 Besluit

Het doel van deze studie was om te evalueren of de leeftijd en/of menstruatie een invloed

hebben/heeft op de isotopische samenstelling van Fe, Cu en Zn in volbloed van gezonde

vrouwen. Het onderzoek verliep in samenwerking met dr. H. Depypere van het Universitair

Ziekenhuis in Gent, die het bloed volgens een strikte procedure afnam. Elke bloeddonor

werkte vrijwillig mee aan dit onderzoek en verkreeg achtergrondinformatie over het

onderzoeksproject via een Informed Consent en verstrekte verdere informatie door het

invullen van een vragenlijst. Deze studie werd goedgekeurd door een onafhankelijke

commissie voor medische ethiek verbonden aan het UZ Gent. Ze werd uitgevoerd volgens de

richtlijnen voor goede klinische praktijken en de verklaring van Helsinki, ter bescherming van

de vrijwilligers die deelnemen aan experimenten.

De volledige monstervoorbereiding, bestaande uit een digestiestap en een isolatiestap,

vond plaats in een clean lab klasse 10. De digestie van het bloed werd uitgevoerd door

toevoeging van 7 mL 14 M HNO3 aan 3 mL volbloed. Fe, Cu en Zn werden vervolgens

geïsoleerd met behulp van ionenuitwisselingschromatografie (AG-MP 1 hars) door eerst de

matrixelementen te laten elueren (8 mL 8 M HCl + 0.001% H2O2). Hierna elueren Cu, Fe en Zn

als zuivere fracties door het spoelen van het hars met respectievelijk 12 mL 5 M HCl +

0.001% H2O2, 10 mL 0.6 M HCl en 10 mL 0.7 M HNO3. De isotopische samenstelling van Fe,

Cu en Zn, op deze wijze geïsoleerd uit het volbloed van deze gezonde vrouwen, werd

bepaald via multi-collector ICP-massaspectrometrie. Om te corrigeren voor

massadiscriminatie werden vier methodes gebruikt: een externe standaardisatie methode

(sample-standard bracketing, SSB), twee interne standaardisatie methodes (inter-

element[38], [39] en de methode beschreven door Woodhead[40]), alsook een combinatie van

beide standaardisatie methodes, de gemodificeerde sample-standard bracketing methode,

zoals gepubliceerd door Mason et. al.[41] De hier onderzochte populatie bestaat uit vrouwen

met een Mirena anticonceptiesysteem dat leidt tot uitblijven van menstruatie (4 monsters)

en vrouwen in de menopauze (10 monsters). De gemeten isotopische samenstelling van Fe,

56

Cu en Zn in het volbloed van deze twee groepen werd vergeleken met deze van een

referentiepopulatie van normaal menstruerende vrouwen (17 monsters), afkomstig van

eerder onderzoek.[57]

One-way ANOVA en hiërarchische clusteranalyse toonden beide aan dat er voor de

isotopische samenstelling van Fe, Cu en Zn in menselijk volbloed enkele groepen op

statistisch significante wijze van elkaar onderscheiden konden worden.

Zo is er voor de isotopische samenstelling van Fe in volbloed een significant verschil

tussen normaal menstruerende vrouwen enerzijds en niet-menstruerende vrouwen (Mirena

en menopauze) anderzijds. In deze studie werd aangetoond dat door het gebruik van een

Mirena of tijdens de menopauze, het bloed van vrouwen een significant lichtere isotopische

samenstelling (lagere δ56Fe en δ57Fe-waarden) vertoont dan het bloed van de

menstruerende vrouwen. Reeds eerder werd beschreven dat de isotopische samenstelling

van Fe in volbloed voor respectievelijk vrouwen en mannen significant verschillen: bloed van

vrouwen heeft voor Fe een lichtere isotopensamenstelling dan dat van mannen. In deze

studie werd aangetoond dat het bloed van deze groep van niet-menstruerende vrouwen een

Fe isotopische samenstelling heeft die eerder neigt naar die van de mannen.

Ook de isotopische samenstelling van Cu in volbloed verschilt significant voor normaal

menstruerende vrouwen enerzijds en niet-menstruerende vrouwen (Mirena en menopauze)

anderzijds. Ook voor Cu kan worden gesteld dat de isotopische samenstelling in volbloed van

niet-menstruerende vrouwen in de richting van die van de mannen opschuift (zwaardere

isotopische samenstelling, hogere δ65Cu-waarden).

Voor de isotopische samenstelling van Zn in volbloed is er een significant verschil

aangetoond tussen die van de normaal menstruerende vrouwen enerzijds en die van de

vrouwen met een Mirena anderzijds, terwijl de isotopische samenstelling van Zn voor

vrouwen in de menopauze verspreid ligt over beide groepen. Wanneer rekening gehouden

wordt met de leeftijd van de vrouwen die zich in de menopauze bevinden, is er een verband

op te merken tussen de leeftijd en de isotopische samenstelling van Zn; het bloed van de

oudere vrouwen die zich in de menopauze bevinden heeft een deltawaarde die aansluit bij

die van de referentiegroep, terwijl het bloed van jongere vrouwen in de menopauze eerder

een zwaardere Zn isotopensamenstelling heeft, zoals die van de vrouwen met een Mirena.

Een mogelijke verklaring hiervoor zou kunnen liggen in het gebruik van het hormoon

oestradiol bij deze jongere vrouwen in de menopauze.

57

Via lineaire regressie werd vastgesteld dat er een significante correlatie (p = 0.009)

bestaat tussen de isotopische samenstelling van Zn in het bloed van vrouwen in de

menopauze en hun leeftijd. De Zn isotopensamenstelling in volbloed van vrouwen in de

menopauze wordt lichter naarmate de leeftijd toeneemt. De hypothese van het

hormoongebruik valt hier misschien aan te linken.

Samenvattend kan er gesteld worden dat werd aangetoond dat het verschil in isotopische

samenstelling inzake Fe en Cu in het volbloed tussen mannen en vrouwen toe te schrijven is

aan het verlies van deze elementen via menstruele bloeding. Voor Zn is de situatie minder

duidelijk, gezien enkel een onderscheid kon gemaakt worden tussen de menstruerende

vrouwen en degene die niet menstrueerden ten gevolge van het gebruik van een Mirena.

Verder onderzoek is vereist om de vermoedelijke invloed van een oestradiolbehandeling te

evalueren.

58

9 Referenties

1. Vanhaecke, F., Massaspectrometrie en Isotopenanalyse, mastercursus. 2012. 2. Vanhaecke, F., L. Balcaen, and D. Malinovsky, Use of single-collector and multi-collector ICP-

mass spectrometry for isotopic analysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2009. 24(7): p. 863-886.

3. Wood, B.J., M.J. Walter, and J. Wade, Accretion of the Earth and segregation of its core. Nature, 2006. 441(7095): p. 825-833.

4. Hauri, E., Earth science: Keeping score on the core. Nature, 2004. 427(6971): p. 207-208. 5. Halliday, A., HF-W Chronometry and Inner Solar System Accretion Rates. Space Science

Reviews, 2000. 92(1-2): p. 355-370. 6. Resano, M., et al., Laser ablation single-collector inductively coupled plasma mass

spectrometry for lead isotopic analysis to investigate evolution of the Bilbilis mint. Analytica Chimica Acta, 2010. 677(1): p. 55-63.

7. Bullen, T.D. and T. Walczyk, Environmental and Biomedical Applications of Natural Metal Stable Isotope Variations. Elements, 2009. 5(6): p. 381-385.

8. Tavill, A.S., Diagnosis and management of hemochromatosis. Hepatology, 2001. 33(5): p. 1321-1328.

9. Swinkels, D.W., et al., Richtlijn Hereditaire Hemochromatose, in Diagnostiek en behandeling van hereditaire hemochromatose. 2007.

10. Marris, B. Haemochromatosis Australia. 2012 [cited 2013; Available from: http://haemochromatosis.org.au/genetics/.

11. Van Heghe, L., et al., Isotopic analysis of the metabolically relevant transition metals Cu, Fe and Zn in human blood from vegetarians and omnivores using multi-collector ICP-mass spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2012. 27(8): p. 1327-1334.

12. Krayenbuehl, P.A., et al., Hereditary hemochromatosis is reflected in the iron isotope composition of blood. Blood, 2005. 105(10): p. 3812-3816.

13. Walczyk, T. and F. von Blanckenburg, Natural iron isotope variations in human blood. Science, 2002. 295(5562): p. 2065-2066.

14. Van Heghe, L. 2013. 15. Albarede, F., et al., Isotopic evidence of unaccounted for Fe and Cu erythropoietic pathways.

Metallomics, 2011. 3(9): p. 926-933. 16. Thomas, R., Spectroscopy tutorial - A beginner's guide to ICP-MS - Part I. Spectroscopy, 2001.

16(4): p. 38-+. 17. Aggarwal, S.K. and H.C. Jain, Introduction to Mass Spectrometry. 1997: Indian Society for

Mass Spectrometry. 18. Vanhaecke, F., Single-Collector Inductively Coupled Mass Spectrometry, in Isotopic Analysis,

Fundamentals and Applications Using ICP-MS, F. Vanhaecke and P. Degryse, Editors. 2012, Wiley-VCH.

19. Vanhaecke, F., Spectroscopische analysemethoden, bachelorcursus. 2010. 20. Montaser, A., et al., Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Sample Introduction in

ICPMS, ed. A. Montaser. 1998: Wiley-VCH. 21. Thomas, R., Spectroscopy tutorial - A beginner's guide to ICP-MS - Part II: The sample-

introduction system. Spectroscopy, 2001. 16(5): p. 56-+.

http://haemochromatosis.org.au/genetics/

59

22. Kotrebai, M., et al., Characterization of selenium species in biological extracts by enhanced ion-pair liquid chromatography with inductively coupled plasma-mass spectrometry and by referenced electrospray ionization-mass spectrometry. Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy, 1999. 54(11): p. 1573-1591.

23. Thermo. From first principles: An introduction to the ICP-MS technique. maart 2013]. 24. Pohl, P. and R.E. Sturgeon, Simultaneous determination of hydride- and non-hydride-forming

elements by inductively coupled plasma optical emission spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2010. 29(11): p. 1376-1389.

25. Thomas, R., A beginner's guide to ICP-MS - Part III: The plasma source. Spectroscopy, 2001. 16(6): p. 26-+.

26. Turner, I. and A. Montaser, Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Plasma Generation in ICPMS, ed. A. Montaser. 1998: Wiley-VCH.

27. Thomas, R., A beginner's guide to ICP-MS - Part IV: The interface region. Spectroscopy, 2001. 16(7): p. 26-+.

28. Klinkenberg, H., et al., On the use of inductively coupled plasma mass spectrometry as an element specific detector for liquid chromatography: optimization of an industrial tellurium removal process. Journal of Chromatography A, 1998. 794(1-2): p. 219-232.

29. Turner, P., et al., Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Instrumentation For Low- and High-Resolution ICPMS, ed. A. Montaser. 1998: Wiley-VCH.

30. Thomas, R., Beginner's guide to ICP-MS - Part VI - The mass analyzer. Spectroscopy, 2001. 16(10): p. 44-48.

31. Thomas, R., A beginner's guide to ICP-MS - Part VII: Mass separation devices - Double-focusing magnetic-sector technology. Spectroscopy, 2001. 16(11): p. 22-+.

32. Thomas, R., A beginner's guide to ICP-MS part X - Detectors. Spectroscopy, 2002. 17(4): p. 34-+.

33. Weyer, S. and J. Schwieters, High precision Fe isotope measurements with high mass resolution MC-ICPMS. International Journal of Mass Spectrometry, 2003. 226(3): p. 355-368.

34. Wieser, M., J. Schwieters, and C. Douthitt, Multic-Collector Inductively Coupled Mass Spectrometry, in Isotopic Analysis Fundamentals and Applications Using ICP-MS, F. Vanhaecke and P. Degryse, Editors. 2012, Wiley-VCH.

35. Thomas, R., A beginner's guide to ICP-MS - Part V: The ion focusing system. Spectroscopy, 2001. 16(9): p. 38-+.

36. Thomas, R., A beginner's guide to ICP-MS Part XII - A review of interferences. Spectroscopy, 2002. 17(10): p. 24-+.

37. Yang, L. and R.E. Sturgeon, Comparison of mass bias correction models for the examination of isotopic composition of mercury using sector field ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2003. 18(12): p. 1452-1457.

38. Meija, J., et al., Correction for Instrumental Mass Discrimination in Isotope Ratio Determination with Multi-Collector ICP-MS, in Isotopic Analysis Fundamentals and Applications Using ICP-MS, F. Vanhaecke and P. Degryse, Editors. 2012, Wiley-VCH.

39. Malinovsky, D., et al., Performance of high resolution MC-ICP-MS for Fe isotope ratio measurements in sedimentary geological materials. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2003. 18(7): p. 687-695.

40. Woodhead, J., A simple method for obtaining highly accurate Pb isotope data by MC-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2002. 17(10): p. 1381-1385.

41. Mason, T.F.D., et al., High-precision Cu and Zn isotope analysis by plasma source mass spectrometry - Part 2. Correcting for mass discrimination effects. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2004. 19(2): p. 218-226.

42. Corporation, M., Milli-Q® Element System, Water Quality Assessment - Ultrapure Water For Trace Element Analysis. 2003.

43. Systems, A.C. Cleanroom Classifications. 2013 [cited 2013; Available from: http://www.americancleanrooms.com/cleanroom-classifications/.

http://www.americancleanrooms.com/cleanroom-classifications/

60

44. Latimer, B. Clean Room Classification Case Study. 2012 [cited 2013; Available from: http://www.particle.com/technical-library/faqs/clean-room-classification.

45. Inc., T.F.S. Tips for Good Laboratory Pipetting. 2007 [cited 2013; Available from: http://fpb.case.edu/smartcenter/docs/SpitCamp/Pipetting%20Guide_Thermo%20Scientific_25440.pdf.

46. Marechal, C.N., P. Telouk, and F. Albarede, Precise analysis of copper and zinc isotopic compositions by plasma-source mass spectrometry. Chemical Geology, 1999. 156(1-4): p. 251-273.

47. Marechal, C. and F. Albarede, Ion-exchange fractionation of copper and zinc isotopes (vol 66, pg 1499, 2002). Geochimica Et Cosmochimica Acta, 2002. 66(20): p. 3675-3675.

48. Laboratories, B.-R., AG® 1, AG MP-1 and AG 2 Strong Anion Exchange Resin - Instruction Manual.

49. Labmark. Seronorm Trace Elements Whole Blood L-3. 2010 [cited 2013; Available from: http://www.labmark.cz/soubory/package-insert-seronorm-trace-elements-whole-blood-l-3.pdf.

50. Thomas, R., A beginner's guide to ICP-MS - Part XI - Peak measurement protocol. Spectroscopy, 2002. 17(7): p. 28-+.

51. Prohaska, C., K. Pomazal, and I. Steffan, Determination of Ca, Mg, Fe, Cu, and Zn in blood fractions and whole blood of humans by ICP-OES. Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 2000. 367(5): p. 479-484.

52. Meisel, T., Quality Control in Isotope Ratio Applications, in Isotopic Analysis Fundamentals and Applications Using ICP-MS, F. Vanhaecke and P. Degryse, Editors. 2012, Wiley-VCH.

53. Corporation, T.E., FinniganTM ELEMENT XR/FinniganTM ELEMENT2 Operating Manual. 2006. 54. Corporation, T.E., Finnigan™ Neptune Multicollector Software Version 3.1 Operating Manual.

2004. 55. Williams, R. Uncertainty in Measurement of Isotope Ratios by Multi-Collector Mass

Spectrometry. 2010 [cited 2013; Available from: http://www.iaea.org/safeguards/Symposium/2010/Documents/PapersRepository/168.pdf.

56. Balter, V., et al., Bodily variability of zinc natural isotope abundances in sheep. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2010. 24(5): p. 605-612.

57. Van Heghe, L., Intern Rapport. 2012. 58. Spiraaltje. [cited 2013; Available from: http://www.spiraaltje.net/. 59. Spiraaltje. 2013 [cited 2013; Available from: http://www.spiraaltje.org/. 60. Vanheel, B., Stelselmatige Fysiologie Deel 1: Fysiologie van de endocriene klieren,

bachelorcursus Biomedische Wetenschappen. 2010: Acco Leuven. 61. Marieb, E.N., P.B. Wilhelm, and J. Mallat, Human Anatomy. 6th edition ed. 2011: Pearson

Education Inc. 62. Campbell, N.A., et al., Biology. 8th edition ed. 2008: Pearson Education Inc. 63. Strijckmans, K., Chemometrie, mastercursus. 2011.

http://www.particle.com/technical-library/faqs/clean-room-classification

http://fpb.case.edu/smartcenter/docs/SpitCamp/Pipetting%20Guide_Thermo%20Scientific_25440.pdf

http://fpb.case.edu/smartcenter/docs/SpitCamp/Pipetting%20Guide_Thermo%20Scientific_25440.pdf

http://www.labmark.cz/soubory/package-insert-seronorm-trace-elements-whole-blood-l-3.pdf

http://www.labmark.cz/soubory/package-insert-seronorm-trace-elements-whole-blood-l-3.pdf

http://www.iaea.org/safeguards/Symposium/2010/Documents/PapersRepository/168.pdf

http://www.spiraaltje.net/

http://www.spiraaltje.org/

61

10 Bijlagen

Vakgroep Analytische Chemie, onderzoeksgroep Atoom- en massaspectrometrie

62

Bijlage 1: Informatiebrief voor de Deelnemers aan Experimenten

Titel van de studie:

Ontwikkeling en evaluatie van methoden, gebaseerd op multi-collector ICP

massaspectroscopie, voor hoge precisie isotopenanalyse van Zn, Fe en Cu in bloed,

toepasbaar in de medische diagnostiek.

Doel van de studie:

Men heeft u gevraagd om deel te nemen aan een studie, uitgaande van de

Universiteit Gent in samenwerking met UZ Gent, met als doel nieuwe methodes te

vinden voor het diagnosticeren van niet, moeilijk of met onvoldoende zekerheid

opspoorbare aandoeningen of ziekten.

Beschrijving van de studie:

In uw bloed zal zowel de concentratie als de

natuurlijke isotopische samenstelling van ijzer,

koper en zink (Fe, Cu en Zn) bepaald worden.

Isotopen zijn atomen van hetzelfde element (zelfde

aantal protonen in de kern) maar met een

verschillende massa (verschillend aantal neutronen

in de kern). De drie elementen waarvan hier sprake

is beschikken van nature uit over verschillende

isotopen. We hebben hier dus zeker niet te maken

met radioactiviteit. In het menselijke lichaam en

eigenlijk bij elke chemische of fysiche reactie zal

een lichte voorkeur uitgaan naar een zwaarder of

een lichter isotoop. Daarom wordt verwacht dat in bloed de samenstelling van de

isotopen licht verschillend is naargelang de reacties die plaatsgrijpen. Bloed van

mensen met een aandoening of ziekte dat het metabolisme van deze elementen

beïnvloedt zou dus een andere samenstelling kunnen vertonen.

Om dit te bereiken dient het bloed (en dan bedoelen we vooral de eiwitten en cellen)

opgelost te worden zodat alle elementen zich vrij in oplossing bevinden. Dit is nodig

omdat vervolgens Fe, Cu en Zn geïsoleerd zullen worden uit de oplossing zodat drie

afzonderlijke oplossingen die enkel ijzer, zink of koper bevatten bekomen worden.

Deze oplossing kunnen dan gemeten met een massaspectrometer om de


63

concentratie en isotopische samenstelling van deze elementen te bepalen. Een

massaspectrometer is een toestel dat ionen (dit zijn atomen die een elektron meer of

minder hebben dan het ongeladen atoom. De gevormde ionen zijn in deze

toepassing positief geladen) kan scheiden op basis van hun massa op

ladingsverhouding (m/z). Die ionen worden dan afzonderlijk gedetecteerd zodat kan

bepaald worden hoeveel van elk ion in het staal aanwezig is. De gebruikte

massaspectrometer is uitgerust met een systeem dat de atomen in oplossing eerst

omzet in ionen, namelijk het plasma.

De resultaten voor verschillende subgroepen (leeftijd, geslacht, ziekte,…) zullen

vergeleken worden. De subgroepen zoals leeftijd en geslacht zullen een zicht geven

op de normale variaties binnen de referentiepopulatie. Zijn de resultaten voor het

bloed van bepaalde patiëntgroepen significant verschillend, dan vormt dit mogelijk de

basis voor de ontwikkeling van een methode om de betreffende aandoening of ziekte

op te sporen.

In verder onderzoek kan deze informatie ook gebruikt worden voor het ophelderen

van het metabolisme van het betreffende metaal in het menselijk lichaam.

Voor deze studie zal bij elke deelnemer ongeveer 6 mL bloed afgenomen worden.

De verwachte totale duur van de studie is niet langer dan de bloedname die voor

klinische redenen al bij u gepland was.

Er zullen in totaal 12 personen per subgroep p aan deze studie deelnemen. Er zijn

een 10-tal mogelijke subgroepen. Dit brengt het totaal op maximaal 120

deelnemende personen.

Wat wordt verwacht van de deelnemer?

Voor het welslagen van de studie, is het uitermate belangrijk dat u volledig meewerkt

met de onderzoeker en dat u zijn/haar instructies nauwlettend opvolgt evenals dat we

uw toestemming kregen om de gegeven die u invult op het bijgevoegde vragenblad

anoniem te verwerken.

Bovendien moet u aan onderstaande items voldoen:

- U bent onlangs niet sterk vermagerd - U bent onlangs niet gehospitaliseerd - U neemt geen voorgeschreven medicatie - U ben het laatste jaar niet voor langer dan een maand buiten Europa geweest


64

Deelname en beëindiging:

De deelname aan deze studie vindt plaats op vrijwillige basis.

Deelname aan deze studie brengt voor u geen therapeutisch voordeel. Uw deelname

in de studie kan helpen om in de toekomst patiënten beter te kunnen helpen.

U kan weigeren om deel te nemen aan de studie, en u kunt zich op elk ogenblik

terugtrekken uit de studie zonder dat u hiervoor een reden moet opgeven en zonder

dat dit op enigerlei wijze een invloed zal hebben op uw verdere relatie en/of

behandeling met de onderzoeker of de behandelende arts.

Uw deelname aan deze studie zal worden beëindigd als de onderzoeker meent dat

dit in uw belang is. U kunt ook voortijdig uit de studie worden teruggetrokken als u de

in deze informatiebrief beschreven procedures niet goed opvolgt of u de beschreven

items niet respecteert.

Als u deelneemt, wordt u gevraagd het toestemmingsformulier te tekenen.

Procedures:

Tijdens de studie zal u gevraagd worden een vragenlijst in te vullen zodat kan

bepaald worden in welke subgroep van onderzochte personen u zich bevindt. Uw

bloeddruk zal gemeten worden en er zal bloed afgenomen worden.

In totaal wordt ongeveer 6 ml bloed afgenomen.

Risico’s en voordelen:

De risico’s van deze studie zijn niet hoger dan voor eender welke bloedafname. Er

wordt voor de deelnemers geen voordeel verwacht door deelname aan het

onderzoek.

U hebt het recht op elk ogenblik vragen te stellen over de mogelijke en/of gekende

risico’s, nadelen van deze studie. Als er in het verloop van de studie gegevens aan

het licht komen die een invloed zouden kunnen hebben op uw bereidheid om te

blijven deelnemen aan deze studie, zult u daarvan op de hoogte worden gebracht.

Mocht u door uw deelname toch enig nadeel ondervinden, zal u een gepaste

behandeling krijgen.

Deze studie werd goedgekeurd door een onafhankelijke Commissie voor Medische

Ethiek verbonden aan het UZ Gent en wordt uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de

goede klinische praktijk (ICH/GCP) en de verklaring van Helsinki opgesteld ter

bescherming van mensen deelnemend aan klinische studies. In geen geval dient u


65

de goedkeuring door de Commissie voor Medische Ethiek te beschouwen als een

aanzet tot deelname aan deze studie.

Kosten:

Uw deelname aan deze studie brengt geen extra kosten mee voor U.

Vergoeding:

Er is geen vergoeding voorzien voor de deelnemers aan deze studie.

Vertrouwelijkheid:

In overeenstemming met de Belgische wet van 8 december 1992 en de Belgische

wet van 22 augustus 2002, zal u persoonlijke levenssfeer worden gerespecteerd en

zal u toegang krijgen tot de verzamelde gegevens. Elk onjuist gegeven kan op uw

verzoek verbeterd worden.

Vertegenwoordigers van de opdrachtgever, auditoren, de Commissie voor Medische

Ethiek en de bevoegde overheden hebben rechtstreeks toegang tot Uw dossiers (=

de vragenlijst) om de procedures van de studie en/of de gegevens te controleren,

zonder de vertrouwelijkheid te schenden. Dit kan enkel binnen de grenzen die door

de betreffende wetten zijn toegestaan. Door het toestemmingsformulier, na

voorafgaande uitleg, te ondertekenen stemt U in met deze toegang.

Als u akkoord gaat om aan deze studie deel te nemen, zullen uw persoonlijke

gegevens tijdens deze studie worden verzameld en gecodeerd (hierbij kan men uw

gegevens nog terug koppelen naar uw persoonlijk dossier).

Verslagen waarin U wordt geïdentificeerd, zullen niet openlijk beschikbaar zijn. Als de

resultaten van de studie worden gepubliceerd, zal uw identiteit vertrouwelijke

informatie blijven.

Letsels ten gevolge van deelname aan de studie:

De onderzoeker voorziet in een vergoeding en/of medische behandeling in het geval

van schade en/of letsel ten gevolge van deelname aan de studie. Voor dit doeleinde

is een verzekering afgesloten met foutloze aansprakelijkheid conform de wet inzake


66

experimenten op de menselijke persoon van 7 mei 2004. Op dat ogenblik kunnen uw

gegevens doorgegeven worden aan de verzekeraar.

Contactpersoon:

Als er letsel optreedt tengevolge van de studie, of als U aanvullende informatie wenst

over de studie of over uw rechten en plichten, kunt U in de loop van de studie op elk

ogenblik contact opnemen met:

Lana Van Heghe

Vakgroep Analytische Chemie

Universiteit Gent

Krijgslaan 281 – S12

B-9000 GENT

Tel: +32(0)9 264 48 40

[email protected]

Prof. Dr. Hans Van Vlierberghe

Dienst Gastro-enterologie

Universitair Ziekenhuis Gent

De Pintelaan 185 – 1K12IE

B-9000 Gent

Tel: +32 (0) 9 332 23 71

[email protected]

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]


67

Toestemmingsformulier

Ik, ondergetekende heb het document “Informatiebrief voor de deelnemers aan experimenten, dd. 14/04/2011 pagina 1 tot en met 4 gelezen en er een kopij van gekregen. Ik stem in met de inhoud van het document en stem ook in deel te nemen aan de studie. Ik heb een kopij gekregen van dit ondertekende en gedateerde “Toestemmingsformulier”. Ik heb uitleg gekregen over de aard, het doel, de duur, en de te voorziene effecten van de studie en over wat men van mij verwacht. Ik heb uitleg gekregen over de mogelijke risico’s en voordelen van de studie. Men heeft me de gelegenheid en voldoende tijd gegeven om vragen te stellen over de studie, en ik heb op al mijn vragen een bevredigend antwoord gekregen. Ik stem ermee in om volledig samen te werken met de toeziende onderzoeker. Ik zal hem/haar op de hoogte brengen als ik onverwachte of ongebruikelijke symptomen ervaar. Ik ben me ervan bewust dat deze studie werd goedgekeurd door een onafhankelijke Commissie voor Medische Ethiek verbonden aan het UZ Gent en dat deze studie zal uitgevoerd worden volgens de richtlijnen voor de goede klinische praktijk (ICH/GCP) en de verklaring van Helsinki, opgesteld ter bescherming van mensen deelnemend aan experimenten. Deze goedkeuring was in geen geval de aanzet om te beslissen om deel te nemen aan deze studie. Ik mag me op elk ogenblik uit de studie terugtrekken zonder een reden voor deze beslissing op te geven en zonder dat dit op enigerlei wijze een invloed zal hebben op mijn verdere relatie met de onderzoeker. Ik begrijp dat auditors, vertegenwoordigers van de opdrachtgever, de Commissie voor Medische Ethiek of bevoegde overheden, mijn gegevens mogelijk willen inspecteren om de verzamelde informatie te controleren. Door dit document te ondertekenen, geef ik toestemming voor deze controle. Bovendien ben ik op de hoogte dat bepaalde gegevens doorgegeven worden aan de opdrachtgever. Ik geef hiervoor mijn toestemming, zelfs indien dit betekent dat mijn gegevens doorgegeven worden aan een land buiten de Europese Unie. Ten alle tijden zal mijn privacy gerespecteerd worden. Ik ben bereid op vrijwillige basis deel te nemen aan deze studie Code van de vrijwilliger: _________________________________________ Datum: _________________________________________ Handtekening: Ik bevestig dat ik de aard, het doel, en de te voorziene effecten van de studie heb uitgelegd aan de bovenvermelde vrijwilliger. De vrijwilliger stemde toe om deel te nemen door zijn/haar persoonlijk gedateerde handtekening te plaatsen.


68

Naam van de persoon die voorafgaande uitleg heeft gegeven: ________________________ Handtekening:

Bijlage 2: Vragenlijst

Invloed van menstruatie en leeftijd op de isotopische samenstelling

van ijzer in bloed bij gezonde vrouwen.

Datum: …………………………………

Geboortedatum: ......................

Geslacht: (m) (v)

Lengte:………………m.................. Gewicht: .........................kg

1. Wat is uw bloedgroep? …………………..

2. Heeft u last van een hoge bloeddruk? (j) (n)

3. Hebt u specifieke eetgewoontes? (j) (n) (Vegetariërs en personen op dieet horen hier ook bij)

Zo ja, graag een beschrijving: …………………………………………………..

4. Bent u recent veel gewicht verloren? (j) (n)

5. In dit deel van het onderzoek worden 3 groepen vrouwen onderzocht.

Tot welke groep behoort u?

a) normaal menstruerend

b) menopauze

c) niet menstruerend door voorbehoedsmiddel

indien u tot groep b of c behoord, graag een indicatie van tijd sinds uw laatste

menstruatie: …………………

69

Bijlage 3: Goedkeuring Commissie voor Medische Ethiek

Afz: Commissie voor Medische Ethiek COMMISSIE VOOR MEDISCHE ETHIEK

Gastro-enterologie Voorzitter: Kliniekgebouw 12-E - 1ste Verdieping Prof. Dr. R. Rubens Prof. dr. Hans VAN VLIERBERGHE Secretaris:

ALHIER Prof. Dr. D. Matthys

CONTACT TELEFOON FAX E-MAIL Secretariaat +32 (0)9 332 56 13 +32 (0)9 332 49 62 [email protected] +32 (0)9 332 59 25

UW KENMERK ONS KENMERK DATUM KOPIE 2011/276 10-mei-11 Zie "CC"

BETREFT

Advies voor monocentrische studie met als titel: Ontwikkeling en evaluatie van methoden, gebaseerd op multi-collector ICP masssaspectroscopie, voor hoge precisie isotopenanalyse van Zn, Fe en Cu in bloed, toepasbaar in de medische diagnostiek.

Belgisch Registratienummer: B670201111272

* Adviesaanvraagformulier (versie 2, dd. 18/04/2011) (volledig ontvangen dd. 19/04/2011) * Begeleidende brief dd. 15/04/2011 * Vragenlijst voor bloeddonoren dd. 14/04/2011 * IWT-overeenkomst dd. 24/02/2010 * Antwoord onderzoeker via mail dd. 10/05/2011 op opmerkingen EC dd. 06/05/2011 * (Patiënten)informatie- en toestemmingsformulier dd. 9/05/2011

Advies werd gevraagd door: Prof. dr. H. VAN VLIERBERGHE ; Hoofdonderzoeker

BOVENVERMELDE DOCUMENTEN WERDEN DOOR HET ETHISCH COMITÉ BEOORDEELD. ER WERD EEN POSITIEF ADVIES GEGEVEN OVER DIT PROTOCOL OP 10/05/2011. INDIEN DE STARTDATUM NA 9/05/2012 IS, VERVALT HET ADVIES EN MOET HET PROJECT TERUG INGEDIEND WORDEN.

Vooraleer het onderzoek te starten dient contact te worden genomen met het Trial Bureau (09/332 05 00).

THE ABOVE MENTIONED DOCUMENTS HAVE BEEN REVIEWED BY THE ETHICS COMMITTEE. A POSITIVE ADVICE WAS GIVEN FOR THIS PROTOCOL ON 10/05/2011. IF THE STARTING DATE OF THE PROTOCOL IS AFTER 9/05/2012, THE POSITIVE ADVICE IS RECALLED AND THE PROJECT HAS TO BE SUBMITTED AGAIN TO THE ETHICS COMMITTEE. Before initiating the study, please contact the Trial Bureau (09/332 05 00).

DIT ADVIES WORDT OPGENOMEN IN HET VERSLAG VAN DE VERGADERING VAN HET ETHISCH COMITE VAN 17/05/2011

THIS ADVICE WILL APPEAR IN THE PROCEEDINGS OF THE MEETING OF THE ETHICS COMMITTEE OF 17/05/2011

° Het Ethisch Comité werkt volgens 'ICH Good Clinical Practice' - regels ° Het Ethisch Comité beklemtoont dat een gunstig advies niet betekent dat het Comité de verantwoordelijkheid voor het onderzoek op zich neemt. Bovendien dient U er over te waken dat Uw mening als betrokken onderzoeker wordt weergegeven in publicaties, rapporten voor de overheid enz., die het resultaat zijn van dit onderzoek.

° In het kader van 'Good Clinical Practice' moet de mogelijkheid bestaan dat het farmaceutisch bedrijf en de autoriteiten inzage krijgen van de originele data. In dit verband dienen de onderzoekers erover te waken dat dit gebeurt zonder schending van de privacy van de proefpersonen.

° Het Ethisch Comité benadrukt dat het de promotor is die garant dient te staan voor de conformiteit van de anderstalige informatie- en toestemmingsformulieren met de nederlandstalige documenten.

° Geen enkele onderzoeker betrokken bij deze studie is lid van het Ethisch Comité. ° Alle leden van het Ethisch Comité hebben dit project beoordeeld. (De ledenlijst is bijgevoegd)

70

CONTACT TELEFOON FAX E-MAIL Secretariaat +32 (0)9 332 56 13 +32 (0)9 332 49 62 [email protected] +32 (0)9 332 59 25

UW KENMERK ONS KENMERK DATUM KOPIE 2011/276 10-mei-11 Zie "CC"

Vervolg blz. 2 van het adviesformulier betreffende project EC UZG 2011/276

° The Ethics Committee is organized and operates according to the 'ICH Good Clinical Practice' rules. ° The Ethics Committee stresses that approval of a study does not mean that the Committee accepts responsibility for it. Moreover, please keep in mind that your opinion as investigator is presented in the publications, reports to the government, etc., that are a result of this research.

° In the framework of 'Good Clinical Practice', the pharmaceutical company and the authorities have the right to inspect the original data. The investigators have to assure that the privacy of the subjects is respected.

° The Ethics Committee stresses that it is the responsibility of the promotor to guarantee the conformity of the non-dutch informed consent forms with the dutch documents.

° None of the investigators involved in this study is a member of the Ethics Committee. ° All members of the Ethics Committee have reviewed this project. (The list of the members is enclosed)

Namens het Ethisch Comité / On behalf of the Ethics Committee Prof. dr. R. RUBENS Voorzitter / Chairman

CC: UZ Gent - Trial Bureau UZ Gent - Beheer en algemene directie FAGG - Research & Development; Victor Hortaplein 40, postbus 40 1060 Brussel Prof. dr. M. DE VOS

Universitair Ziekenhuis Gent Wendy Van de Velde De Pintelaan 185,B- 9000 Gent 09/332 56 13

www.uzgent.be [email protected]

71

Bijlage 4: Reinigingsprocedure van Savillex bekers in het Clean Lab

van de A&MS groep van de UGent

1. Verwijder de deksels van de bekers, ledig de bekers en spoel zowel de bekers als

deksels met MilliQ H2O.

2. Plaats alle bekers en deksels in een basisch zeepbad (hoge pH) gedurende 24 uur.

Was de bekers en deksels na deze stap zodat ze zichtbaar schoon zijn.

3. Spoel de bekers en deksels met MilliQ H2O.

4. Vul de bekers ongeveer halfvol met 7 M pro analysi (p.a.) HNO3, sluit ze af met de

deksels en plaats ze op een verwarmplaat van 110°C gedurende 24 uur. De 7 M HNO3

kan drie keer gebruikt worden voor deze stap.

5. Herhaal stap 3 en 4.

6. Vul de bekers ongeveer halfvol met 6 M p.a. HCl, sluit ze af met de deksels en plaats

ze op een verwarmplaat van 110°C gedurende 24 uur. De 6 M HCl kan drie keer

gebruikt worden voor deze stap.

7. Spoel de bekers en de deksels met MilliQ H2O en herhaal stap 6.

8. Spoel de bekers en de deksels met MilliQ H2O en plaats ze op een verwarmplaat van

110°C tot ze droog zijn.

9. Sluit de bekers en plaats ze in de kast.

72

Bijlage 5: Overzicht van de Monsters en hun Deltawaarden

Staal leeftijd Groep 56Fe 57Fe 65Cu 66Zn 67Zn 68Zn H026 20 Referentie* -2.512 ± 0.023 -3.715 ± 0.032 -0.200 ± 0.041 0.112 ± 0.030 0.180 ± 0.057 0.203 ± 0.037

H029 20 Referentie* -2.481 ± 0.022 -3.636 ± 0.034 0.037 ± 0.037 0.101 ± 0.023 0.154 ± 0.067 0.233 ± 0.043

H030 20 Referentie* -2.829 ± 0.021 -4.166 ± 0.035 -0.154 ± 0.035 0.095 ± 0.028 0.113 ± 0.075 0.157 ± 0.040

H036 20 Referentie* -2.860 ± 0.016 -4.088 ± 0.015 -0.183 ± 0.019 0.185 ± 0.006 0.324 ± 0.050 0.497 ± 0.162

H037 20 Referentie* -2.395 ± 0.013 -3.508 ± 0.014 -0.246 ± 0.025 0.149 ± 0.023 0.197 ± 0.060 0.260 ± 0.035

H038 22 Referentie* -2.690 ± 0.022 -3.989 ± 0.033 -0.152 ± 0.012 0.042 ± 0.023 0.039 ± 0.071 0.073 ± 0.040

H039 20 Referentie* -2.929 ± 0.010 -4.329 ± 0.017 -0.004 ± 0.006 -0.011 ± 0.006 0.009 ± 0.062 0.029 ± 0.095

H042 20 Referentie* -2.589 ± 0.011 -3.828 ± 0.018 -0.520 ± 0.031 0.210 ± 0.002 0.352 ± 0.059 0.426 ± 0.045

H043 20 Referentie* -2.524 ± 0.010 -3.758 ± 0.015 -0.376 ± 0.024 0.138 ± 0.003 0.241 ± 0.070 0.233 ± 0.037

H044 20 Referentie* -2.790 ± 0.009 -4.110 ± 0.015 -0.121 ± 0.030 0.092 ± 0.003 0.134 ± 0.080 0.171 ± 0.034

H045 20 Referentie* -2.383 ± 0.009 -3.521 ± 0.014 -0.574 ± 0.051 0.165 ± 0.008 0.433 ± 0.177 0.277 ± 0.037

H047 20 Referentie* -2.571 ± 0.010 -3.794 ± 0.014 -0.131 ± 0.089 0.114 ± 0.004 0.231 ± 0.127 0.210 ± 0.041

H049 20 Referentie* -2.448 ± 0.009 -3.593 ± 0.014 -0.288 ± 0.032 0.051 ± 0.003 0.170 ± 0.055 0.128 ± 0.035

H068 48 Referentie* -2.384 ± 0.050 -3.564 ± 0.051 0.499 ± 0.025 0.268 ± 0.033 0.602 ± 0.033 0.503 ± 0.070

OV1 25 Referentie* -2.540 ± 0.070 -3.846 ± 0.013 -0.142 ± 0.090 0.103 ± 0.007 0.261 ± 0.077 0.861 ± 0.295

OV2 24 Referentie* -2.759 ± 0.063 -4.305 ± 0.031 0.174 ± 0.027 0.036 ± 0.034 0.016 ± 0.077 0.013 ± 0.024

OV5 25 Referentie* -2.645 ± 0.008 -3.804 ± 0.060 -0.094 ± 0.056 0.189 ± 0.033 0.307 ± 0.062 0.776 ± 0.213

H096 49 mirena -3.147 ± 0.037 -4.591 ± 0.015 0.161 ± 0.028 0.452 ± 0.020 0.792 ± 0.005 0.882 ± 0.062

H102 45 mirena -2.868 ± 0.005 -4.407 ± 0.034 1.572 ± 0.036 0.318 ± 0.014 0.577 ± 0.039 0.629 ± 0.027

H103 30 mirena -2.782 ± 0.308 -4.077 ± 0.293 0.317 ± 0.014 0.562 ± 0.018 0.981 ± 0.037 1.102 ± 0.021

H104 52 mirena -2.554 ± 0.038 -3.852 ± 0.049 0.047 ± 0.012 0.385 ± 0.019 0.696 ± 0.033 0.747 ± 0.022

H064 56 menopauze -3.075 ± 0.090 -4.108 ± 0.138 **

** 0.468 ± 0.018 0.676 ± 0.050 0.922 ± 0.044

H066 66 menopauze -3.289 ± 0.152 -4.636 ± 0.148 -0.183 ± 0.039 0.352 ± 0.009 0.570 ± 0.032 0.659 ± 0.028

H067 49 menopauze -2.854 ± 0.046 -4.219 ± 0.030 -0.149 ± 0.018 0.410 ± 0.010 0.717 ± 0.025 0.795 ± 0.061

H069 54 menopauze -2.570 ± 0.024 -3.815 ± 0.044 0.078 ± 0.022 0.461 ± 0.031 0.772 ± 0.014 0.875 ± 0.039

H101 58 menopauze -2.967 ± 0.035 -4.400 ± 0.065 0.201 ± 0.013 0.332 ± 0.020 0.640 ± 0.025 0.641 ± 0.024

H051B 62 menopauze -3.064 ± 0.343 -4.374 ± 0.377 **

** 0.102 ± 0.023 0.299 ± 0.057 0.208 ± 0.028

H052B 63 menopauze -2.834 ± 0.089 -4.192 ± 0.085 0.335 ± 0.027 0.060 ± 0.020 0.248 ± 0.055 0.134 ± 0.026

H053B 68 menopauze -2.854 ± 0.446 -4.269 ± 0.392 0.323 ± 0.026 0.107 ± 0.022 0.245 ± 0.059 0.197 ± 0.033

H054B 68 menopauze -2.675 ± 0.066 -4.093 ± 0.043 0.324 ± 0.024 0.049 ± 0.021 0.206 ± 0.050 0.093 ± 0.029

H055B 66 menopauze -3.333 ± 0.005 -4.729 ± 0.011 0.805 ± 0.029 0.125 ± 0.026 0.326 ± 0.058 0.287 ± 0.034

*De deltawaarden voor de referentiegroep zijn afkomstig van een eerdere studie, uitgevoerd door Van Heghe, L.[57]

**Voor de monsters H064 en H051 zijn de Cu-fracties verloren gegaan tijdens de ionenuitwisselingschromatografie.

73

Bijlage 6: δ56Fe versus δ57Fe met Onzekerheid

-5,0

-4,8

-4,6

-4,4

-4,2

-4,0

-3,8

-3,6

-3,4

-3,2

-3,0

-3,6 -3,4 -3,2 -3,0 -2,8 -2,6 -2,4 -2,2 -2,0

δ5

7Fe

(‰)

δ65Fe (‰)

Referentie

Mirena

Menopauze

Bijlage 7: δ65Cu met Onzekerheid

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

δ65Cu (‰)

Referentie

Mirena

Menopauze

Bijlage 8: δ66Zn versus δ67Zn met Onzekerheid

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

δ6

7Zn

(‰)

δ66Zn (‰)

Referentie

Mirena

Menopauze

74

11 Samenvatting

De invloed van menstrueel bloedverlies en leeftijd op de...

Documents

Transcript of De invloed van menstrueel bloedverlies en leeftijd op de...