De detectie van de ALK-translocatie in de diagnostiek van longkanker

hoe kunnen we dat nu het beste doen ?

Ed Schuuring

(klinisch) moleculair bioloogHoofd Moleculaire Diagnostiek

Laboratorium voor Moleculaire PathologieAfdeling Pathologie van UMCG

e.schuuring@umcg.nl

Effect van crizotinib bij patiënt met FISH positieve EML4-ALK translokatie

Voor start crizotinib Na 6 weken crizotinib

Groen NTvG 155; 2032: 2011

Respons op crizotinib van 31 EML4-ALK-positieve niet-kleincellige longcarcinoompatiënten is indrukwekkend

Kwak NEJM 2010

pretreatment After 2 cycles

Resultaten in 2012:

Tumor respons > 60%Median PFS > 2 jaar

Respons op crizotinib van 143 EML4-ALK-positieve niet-kleincellige longcarcinoompatiënten (update 2012)

Camidge Lancet Oncol 2012

Wat is de beste ALK-detectie test ?

Hirsch CCR 2010

EML4EML4--ALKALK translocaties/inversies in NSCLCtranslocaties/inversies in NSCLC

Soda et al., Nature 448: 561-566, 2007 Soda et al., Nature 448: 561-566, 2007

ALKALK--translocatie: feitentranslocatie: feiten• EML4-ALK translocaties in 3.8% van ongeselecteerd NSCLC.

• De ALK-EML4 translocatie komt vaker voor:

* in (signet cell) adenocarcinomas* jong-volwassenen

* never-smokers (< 100 cigarettes in lifetime)

* light-smokers (< 15 pack-years)* tumoren zonder EGFR en KRAS mutatie (geen overlap)

• Aanbeveling: adenocarcinoom zonder EGFR en KRAS mutatie

Sasaki Eur J Cancer 2010

Solomon J Thor Oncol 2009

13.14 Mb

EML4EML4--ALKALK translocaties/inversies in NSCLCtranslocaties/inversies in NSCLC

EML4

EML4/ALK fusie-produkt

ALK-gen

EML4-gen

inversie

13.14 Mb

EML4EML4--ALKALK translocaties/inversies in NSCLCtranslocaties/inversies in NSCLC

EML4/ALK fusie-produkt

ALK-gen

EML4-gen

inversie

Soda et al., Nature 448: 561-566, 2007 Soda et al., Nature 448: 561-566, 2007

Sasaki Eur J Cancer 2010

EML4

ALK fusieALK fusie--genen: 14 partners ?genen: 14 partners ?

Takeuchi CCR 2011

Sasaki Eur J Cancer 2010

�VCL-ALK in renal cell carcinoma (Debelenko Mod pathol 2011)

� ALK-C2orf44 in colonkanker (Lipson Nat Med 2012)

� NPM1-ALK (classical example), ALK-MSN and ALK-MYH9 in ALCL

� ALK-RANBP2, ALK-SEC31L1, ALK-CARS and ALK-CLTC in inflammatory myofibroblastic tumors)

Jung GCC 2012

In longkanker: 5 ALK-fusie-partners:

De detectie van breuken in het ALK genin-situ-hybridizatie voor de detectie van translocaties/inversies mbv Abbott LSI-ALK

Commerciële ALK-in-situ-hybridisatie-probes:

• Vysis LSI ALK FISH break apart (Abbott)

• LPS ALK FISH break apart (Cytocell)

• Zytolight SPEC ALK/EML4 TriCheck (ZytoVision)

• Poseidon ALK FISH break apart (Kreatech)

• Ventana ALK BRISH break apart (Roche)

EML413.14 Mb

De detectie van breuken in het ALK genin-situ-hybridizatie voor de detectie van translocaties/inversies mbv Abbott LSI-ALK

• Normaal

• Translocatieen Inversie

EML413.14 Mb

Sasaki EJC 2010

FISH als gouden standaard

ALK Break Apart Probe VysisFDA-approved assay (Pfizer-trial)

• Normaal

• Translocatieen Inversie

FISH segregatie

assay (klassiek)14 14

11

Interphase

nucleus

Interphase

nucleus11

Interfase (kern) segregatie FISH assay

break apart FISH assay

FISH segregatie

assay (inversie)

Interphase

nucleus

Interphase

nucleus2 2

Normal tissues (tonsil)

Sample N nuclei

Tonsil 39B 100 76 24 0

Tonsil 37A 100 70 30 0

Tonsil 36D 100 93 7 0

Tonsil 24E 100 95 5 0

ALK breakpoint apart FISH (VYSIS) on 4 independent reactive tonsils:

� Segregation of one signal (signals closer than one single signal)

in considerable number of cases

ALK break-apart FISH (VYSIS) on cell lines pos/neg for EML4-ALK

Sample N kernen

H460 (pos) 100 74 23 3

H1650 (neg) 100 95 5 0

H1975 (pos) 100 89 9 2

HT29 (neg) 100 90 10 0

A375 (neg) 100 93 7 0

ZR-75 (pos) 100 87 13 0

ZR-75 FFPE 100 97 3 0

> EML4-ALK pos/neg based on RT-PCR (Lin Mol Cancer Res 2009)

� None is convincing positive with FISH break apart� In none of these cell lines we detected a specific EML4-ALK-RT-PCR product� None of the 3 NSCLC cell lines was positive in the study of Koivunen (CCR 2009)� H2228/H3122 (reported later) are the only 2 cell lines with ALK-translocation

H460H460

1975

H1975

Sample N kernen

Ital 1 100 64 21 15

Ital 2 100 89 9 2

� Both cases should be positive� Any segregation is considered pos in Cappuzzo’s lab

ALK breakapart FISH (VYSIS) on two NSCLC with EML4-ALK inversion (Cappuzzo’s lab)

Sample N kernen

ALCL pos control 100 41 19 40

FISH-ALK-negatief

FISH-ALK-positief

De detectie van ALK-EML4-translocatienaast klassieke segregatie, ook alternatieve patronen

Camidge CCR 2010

EML4-ALK FISH op paraffine coupesMeer complexe patronen (D-H) dan klassiek (C)

Lastige moleculaire test !

A B C D

E F G H

A B C D E F G HYoshida J Thor Oncol 2011

Camidge Clin Canc Res 2010

Klassiek translocatie

patroon C in ALK-positieve

tumoren is NIET zichtbaar

Guidelines on scoring FISH-ALK

A sample is considered negative if < 5 cells out of 50 (< 5/50 or < 10%) are positive.

A sample is considered positive if > 25 cells out of 50 (> 25/50 or > 50%) are positive.

A sample is considered equivocal if 5 to 25 cells (10 to 50%) are positive. If the sample is equivocal, a second reader should evaluate the slide:

� The first and second cell count readings are added together and a percent is calculated out of 100 cells (average percent of positive cells)

� If the average percent positive cells is < 15% (< 15/100), the sample is considered negative� If the average percent positive cells is > 15% (> 15/100), the sample is considered positive

Abbott/Vysis package insert including guideline for scoring

UMCG:

�2 analisten scoren onafhankelijk van elkaar 100 kernen (vanaf 01012013 50 kernen elk)

� 3de analist als score discordant is

� gedefinieerd welke patronen als positief of negatief gescoored worden

� ook polysomie wordt geteld en geregistreerd

A B C D

Fused pattern

(negative)

Split pattern

(positive)

Single red (3’)

pattern (positive)

Copy number gain of

fused, isolated red

and/or isolated green

signals common

Camidge et al, CCR 2010

Complexe patronen met de ALK-segregatie assay

Goede training van de analisten

Meerdere analisten die elke casus beoordelen

Veel kijken/scoren

Uitwisseling met andere expertise-labs

SOP met gedefinieerde criteria voor scoren/interpretatie

Optimale positieve en negatieve controles

Bright-field in-situ-hybridizatiehelderveld-ISH, automatisering en standarisatie

voor ALK-segregatie (R&D; nog niet-commercieel)

Samenwerking UMCG met Ventana/Roche: validatie BRISH versus FISH (ongoing)

Yoshida J Thor Oncol 2011

KimJ Thor Oncol 2011

Door FDA goedgekeurd alleen in combinatie met FDA approved test

Abbott/Vysis ALK-SA FISH test De selectie van patiënten die in aanmerking komen voor

behandeling met crizotinib:

ALK immunohistochemie ?

ALK1-IHC used for the detection of ALK-translocations in anaplastic lymphoma is not suitable for the detection of EML4-ALK inversion in NSCLC

Mino-Kenudson Clin Cancer Res 2010

D5F3 commercieel verkrijgbaar sinds 2012

(Cell Signaling Technology – CTS)

De detectie van ALK-EML4-translocatie

Dmv IHC en signaalamplificatie(ALK01 en 5A4)

Yoshida J Thor Oncol 2011

Thunnissen Virchow Arch 2012

ALK-IHC for the detection of EML4-ALK inversion in NSCLC

Ventana ALK-IHC test (D5F3) beschikbaar sinds oct 2012:

�CE-IVD in Europa

�Gestandaariseerde uitvoering (op Benchmark met gevalideerd kit)

Thunnissen Virchow Arch 2012

ALK-IHC for the detection of EML4-ALK inversion in NSCLC

Ventana package insert 2012

IHC with ALK-5A4: 4 scoring catagories IHC with Ventana-ALK-D5F3: binair scoring

ALK-D5F3-CTS IHC (manueel)

Harms, vd Sluis, Menkema, Den Dunnen, Kooistra, Timens, Schuuring

Haacke (CTS)

FISH-ALK-positief FISH-ALK-negatief

ALK IHC 5A4 vs D5F3

Murakami Front Oncol 2012

UMCG (preliminary resultaten):

�247 aanvragen voor ALK-FISH hebben we parallel IHC met D5F3 (manual CTS protocol)

�Frequent membraneuze ALK-kleuring > niet geassocieerd ALK-FISH-segregatie

�Sterke cytoplasmatisch kleuirng sterk geassocieerd met ALK-FISH-segregatie

� 14% 5A4-positieve ALK hebben geen breuk

� in andere 5A4-studies wel goede associatie IHC3+ en FISH-pos (Park, McLeer, Paik, Kim)

� 6.7% (1/13) D5F3-positiieve is vals-positief

ALK-IHC for the detection of EML4-ALK inversion in NSCLCgestandariseerde test

Ventana ALK-IHC test (D5F3):

�CE-IVD in Europa

�Gestandaariseerde uitvoering (op Benchmark met gevalideerd kit)

�Binair scoringsalgorithm

�UMCG valideert deze test met Ventana op locatie

�geen membraan-kleuring, hele hoge concordantie met FISH (ongoing)

Kunnen we ALK IHC gebruiken voor de detectie (of voorscreening) van longtumoren met een ALK-breuk ?

� 3 verschillende antilichamen: d5F3 (CTS/Ventana); ALK01 (DAKO); 5A4 (Abcam)

� Verschillende signaalamplificatie methoden

� Verschillende detectie-systemen

� Verschillende criteria voor scoren (kwalitatief, semi-kwantitatief en subjectief)

�Verschillende workflows (voorscreenen, screenen)

Uitdagingen:

� Alle ALK-translocatie-positieve cases > ALK-IHC-positief ?

� Alle ALK-translocatie-negatieve cases > ALK-IHC-negatief ?

� Klinische validatie (CCKL): we hebben weinig positieve controles !

� Eerste europese rondzending laat grote spreiding in performance zien

� kunnen we leren van HER2-testing in Nederland ???

• Goede training analisten• Optimale referenties• Concrete definities• Uitgebreide validatie• Ervaring opbouwen (veel en regelmatig scoren)

FISH-ALK-SA-positief

Nieuw screening algorithme voor ALK-positieve NSCLC ?

Thunnisssen Virch Arch 2012

Andere methoden om de ALK-activiteit te meten ?

• Detectie van fusie-produkt op RNA-niveau met RT-PCR (multiplex), RNA-seq, targeted RNA-seq

• quantitatieve RT-PCR ALK predictief ?• Commerciële kits zijn beschikbaar voor RT-PCR

(gevalideerd ?)

� nu te duur (wel gemakkelijk in te passen in mutatie-profiling)� veel splice-varianten, veel partners� zelfde procedure voor ROS1-translocatie detectie

ROS1-rearrangements in NSCLCtarget for crizotinib

ROS1-rearrangements in NSCLC:

* 9/556 NSCLC (1.6%)

• sensitive to crizotinib

• detected by FISH (2012: Kreatech/CytoCell)

• detected by IHC (Rimkunas, clin canc res 2012)

• >7 partners

• splicing ?

Stumpfova CCR 2012, commentary

Andere methoden om de ALK-activiteit te meten ?

VRAAG: welke methode is predictief ?

�1) Vysis FISH ALK SA (FDA-approved)�2) IHC (voldoende gevalideerd ? Trials FISH-/IHC+ cases)�3) (q)RT-PCR (veel belovend maar geen validatie)

VRAAG: wat is praktisch ?

�IHC is goedkoper�IHC is te standariseren in routine (in gevalideerde labs)�IHC is veel minder bewerkelijk > snellere doorlooptijd

Dank voor uw aandacht

e.schuuring@umcg.nl