De moleculaire diagnostiek van BNHL: detectie FISH BNHL breuken

De moleculaire diagnostiek van

B-NHL: detectie van breuken met

behulp van FISH

Philip Kluin, UMCG,

Daphne de Jong, VUMC

Yvonne van Norden, HOVON

en

Alle deelnemers HOVON kwaliteitsronde

http://www.pathology.nl/

Ontwikkeling

rijpe B-cellen

in lymfeklier,

MALT etc

De oorsprong en de verspreiding van normale

B-lymfocyten

Ontwikkeling

voorloper

B-cellen

Plasmacellen in

lymfeklier, MALT,

beenmerg etc

antigen onafhankelijk antigen afhankelijk

Aanmaak Ig Ig affiniteits verhoging

en Ig klasseswitch

MALT MALT

Ontwikkeling

rijpe B-cellen

in lymfeklier,

MALT etc

B cel maligniteiten in alle stadia

Ontwikkeling

voorloper

B-cellen

Plasmacellen in

lymfeklier, MALT,

beenmerg etc

MALT MALT

acute lymfatische leukemie maligne lymfomen plasmacel tumoren

& CLL

RAG1/2 gemedieerde VDJ recombinatie in

voorloper B-cellen

VH DH C JH C C3 C1 C1 C2 C4 C2 C E E E

V D J

E

IgM transcript Chromosoom 14

In voorloper B-cel van folliculair lymfoom

gaat iets mis….

VH DH C JH C C3 C1 C1 C2 C4 C2 C E E E

BCL2

+

E

BCL2

Chromosoom 18

Chromosoom 14

Kiemcentrumreactie in rijpe B cellen

Somatic

hyper

mutations:

affinity

maturation

of BCR

Class

switching:

from IgM to

IgG / IgA etc

Activation induced deaminase – AID / AICDA /

HIGM2

VDJ recombinaties, somatische

hypermutaties en klasseswitch

De enzymen (RAG1/2 en AID) en DNA

repair mechanismen treffen ook andere

targets: inmiddels groot aantal targets

van AID bekend waaronder MYC

Het ontstaan van DNA breuken in zowel

de IG genen als deze targets kan zorgen

voor chromosomale translocaties met

activatie van oncogenen zoals MYC.

Meest bekende translocaties in B-

NHL

t(14;18)(q21;q32): BCL2 en IGH*

t(3;?)(q27;?): BCL6 en IGH, IGK, IGL of

andere genen

t(8;14)(q24;q32): MYC en IGH*

t(11;14)(q13;q32): CCND1 en IGH*

t(11;18)(q21;q21): BIRC3 en MALT1

* of IGK of IGL op #2, resp. #22

Welke NHL hebben een t(14;18)?

90% folliculair lymfoom graad 1&2,

30-50% folliculair lymfoom 3A & B

15-20% DLBCL 30-35% GCB type (CD10+, MUM1-), deel is

progressie uit folliculair lymfoom?

0-5% ABC type (CD10-, MUM1+)

Meeste dubbelhit lymfomen (MYC breuk met andere breuk (BCL2 > BCL6 > 9p13 > CCND1 > IRF4)

Welke NHL hebben een t(11;14)?

99% MCL // CCND1 +

<5% atypische CLL & 15% SLVL = indolente variant MCL, SOX11 negatief

33% B-PLL & paraimmunoblastair lymfoom = blastair MCL

15% myeloma (breakpoints in Ig switch sites), all strongly CCND1 +

Welke NHL hebben een MYC / 8q24

breuk?

90-100% Burkitt lymfomen // goede prognose en genezing mits adekwaat behandeld

10-15% DLBCL Slechte prognose en nieuwe therapie nodig

>50% “dubbelhit” met ook BCL2/BCL6 breuk of beide

30-50% “intermediate” lymfomen Erg slechte prognose

>50% “dubbelhit” met ook BCL2/BCL6 breuk of beide

10% van getransformeerde folliculaire lymfomen (dus ook dubbelhit), sporadisch ook MCL (idem)

fors deel van progressief multipel myeloom

Hoe belangrijk is het detecteren van een

MYC breuk? MMML data, S Aukema et al,

Haematologica 2014

MYCR+ lymfomen

mBL

non mBL (GEP)

Zeer belangrijk, alles in de juiste context

Waarom niet alleen MYC IHC?

Y69 rabbit monoclonal

Afkappunten verschillen (mediaan, 40, 50, 70% etc)

Eenzijdige relatie: de meeste MYC-breuk+ lymfomen hebben hoge MYC

expressie

In DLBCL vaker MYC expressie (30-40%) dan breuk (10-15%)

Verschillen in GCB en ABC groepen: MYC breuken vaker in GCB, BCL2 breuken uitsluitend in GCB

MYC en BCL2 expressie juist vaker in ABC

Vooral MYC+ BCL2+ dubbelexpressie is belangrijk

MYC en overleving (563 R-CHOP

behandelde DLBCL; Mod Pathol 2013)

MYC breuk in alle DLBCL

MYC breuk in DLBCL met hoge MYC expressie (>75%)

MYC breuk in GCB DLBCL

Nieuwe HOVON studie(s)

Alle DLBCL, BL & “intermediate” lymfomen:

screening voor MYC breuken

niet BL:

Dus voorbereiden op wat komen

gaat …..

FISH rondzending voor MYC, BCL2 en

BCL6

TMA gemaakt van 11 cases uit Würzburg

(gouden standaard)

7 augustus 2013 verstuurd aan 17 labs,

sommige labs kregen op verzoek een

nieuwe coupe

Gegevens verwerkt en 13 december

feedback

Probes in 17 labs

Abbot / Vysis Dako Kreatech geen

BCL2 ba 8 9 0

BCL6 ba 8 6 1 2

MYC ba 9 7 1

MYC-IGH 6 0 0 13

Probes

02

04

06

08

01

00

Num

ber

of re

su

lts

BCL2 BCL6 MYC_BA

Probe 1

goed vals+ vals-

goed-dubieus fout-dubieus No concl

No core

02

04

06

08

01

00

Num

ber

of re

su

lts

BCL2 BCL6 MYC_BA

Probe 2

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of re

su

lts

BCL2 BCL6 MYC_BA

Probe 3

goed vals+ vals-


No core

Abbott/Vysis (6-9 labs)

Dako (6-9 labs)

Kreatech (1 lab)

02

04

06

08

01

00

Num

ber

of re

su

lts

BCL2 BCL6 MYC_BA

Probe 1

goed vals+ vals-


No core

Scores

Goed: zowel lab als ref zijn beide pos of beide

neg

Vals+: ref is negatief en lab oordeelt positief

Vals-: ref is positief en lab oordeelt negatief

No core: core er af

No concl: geen (interpreteerbare) data

Goed-dubieus: afgegeven als dubieuze conclusie, maar wel juist beoordeeld

Fout-dubieus: afgegeven als dubieuze conclusie, maar wel fout beoordeeld

02

04

06

08

01

00

Num

ber

of re

su

lts

BCL2 BCL6 MYC_BA

Probe 1

goed vals+ vals-


No core

05

10

15

20

Num

ber

of la

bs

BCL2 BCL6 MYC_BA

Case 7

goed vals+ vals-


No core

05

10

15

20

Num

ber

of la

bs

BCL2 BCL6 MYC_BA

Case 10

goed vals+ vals-


No core

Forse verschillen tussen cases

Lab 11:

BCL2: <10%, geen breuk, polysomie

BCL6: <5%, geen breuk, polysomie

MYC: breuk in 63%

MYC –IGH: fusie in 76%

Lab 11:

BCL2: breuk in 73%

BCL6: <5%, geen breuk

MYC: breuk in 65%

MYC –IGH: <5% geen fusie

Nog een casus 0

51

01

52

0

Num

ber

of la

bs

BCL2 BCL6 MYC_BA

Case 9

goed vals+ vals-


No core

Lab 11:

BCL2: breuk, 81%

BCL6: <5%, geen breuk

MYC: breuk in 25% (andere labs hoger %) tgv extra losse signalen 5’ zijde (centromeer)

MYC –IGH: <5%, geen fusie

Dus breuk met deletie

Individuele labs, voorbeeld lab 1

0

24

68

10

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 1

goed vals+ vals-


No core

02

04

06

08

01

00

Num

ber

of re

su

lts

BCL2 BCL6 MYC_BA

Probe 1

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 2

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 3

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 4

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 5

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 6

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 8

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 9

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 10

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 11

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 12

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 13

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 14

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 15

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 16

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

sBCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 17

goed vals+ vals-


No core

0

2

4

6

8

10

Nu

mb

er

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 7

goed vals+ vals-


No core

maar 1 vals+!

Welke labs tellen en heeft dat

invloed? 0

24

68

10

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 1

goed vals+ vals-


No core

semiquantitatief

quantitatief

02

04

06

08

01

00

Num

ber

of re

su

lts

BCL2 BCL6 MYC_BA

Probe 1

goed vals+ vals-


No core

0

2

4

6

8

10

Nu

mb

er

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 7

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 3

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 8

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 11

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 4

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 5

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 6

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 9

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 10

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 12

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 13

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 14

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 15

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 16

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

sBCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 17

goed vals+ vals-


No core

02

46

81

0

Num

ber

of ca

se

s

BCL2 BCL6 MYC_BA

Lab 2

goed vals+ vals-


No core

Percentages breuk per lab (alleen

als geteld)

BCL2 MYC

Grote & consistente verschillen tussen labs!

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 2 4 5 7 8 11 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 4 5 6 7 8 11

Vals + casus

Tellen is meer

dan tellen, lab 11

2 of 3 analisten kijken

1 telt, 2 kijken globaal

evt kijkt patholoog mee

vast score formulier

Geen goede verklaring voor

verschillen tussen labs: vergelijking exacte

werkwijze noodzakelijk

CONCLUSIES

Goede participatie en waardevolle resultaten

Geen grote verschillen tussen probe sets

Maar 2/17 labs (12%) hadden alles goed 5 labs (incl 1 met missing core; 30%) hadden alle MYC break

apart tests goed

Grote verschillen in kwantificering tussen labs

Relatie tussen tellen en scores niet keihard, maar de twee labs zonder fouten tellen

Vaker vals negatief dan vals positief worden losse signalen van één kleur (= breuk) over het hoofd

gezien?

Sommige labs hebben vaak een onzekere uitslag; deze is voor de kliniek niet erg behulpzaam

Tot slot: dank aan de

organisatoren en

De moleculaire diagnostiek van BNHL: detectie FISH BNHL breuken

Documents

Transcript of De moleculaire diagnostiek van BNHL: detectie FISH BNHL breuken