De detectie van alfa toxine in de zoektocht naar een...

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2016 - 2017

De detectie van alfa toxine in de zoektocht naar een diagnostische

test voor enterotoxemie bij kalveren

door

Anke DE SCHUTTER

Promotor: dr. E. Goossens Onderzoek uitgevoerd in het

Co- promotor: Prof. dr. F. Van Immerseel kader van de Masterproef

© 2017 Anke De Schutter

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of

volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk

uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor

enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig

vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2016 - 2017

De detectie van alfa toxine in de zoektocht naar een diagnostische

test voor enterotoxemie bij kalveren

door

Anke DE SCHUTTER

Promotor: dr. E. Goossens Onderzoek uitgevoerd in het

Co- promotor: Prof. dr. F. Van Immerseel kader van de Masterproef

© 2017 Anke De Schutter

VOORWOORD

Deze masterproef is een belangrijke mijlpaal in het beëindigen van mijn studies diergeneeskunde. Dit

is daarom het ideale moment om een aantal personen te bedanken die mij geholpen hebben om deze

studie tot een goed einde te brengen.

Eerst en vooral wil ik mijn promotor Evy Goossens bedanken voor de vele tijd en moeite die ze

gestoken heeft in dit onderzoek. Ze stond altijd klaar om mijn vragen te beantwoorden en daarnaast

heeft ze me veel geleerd over wetenschappelijk onderzoek. Daarnaast wil ik ook mijn co- promotor

Filip Van Immerseel bedanken voor de positieve feedback.

Vervolgens wil ik graag mijn vriend Jeroen bedanken. De afgelopen jaren is hij altijd mijn steun en

toeverlaat gebleven op de momenten dat ik het niet meer zag zitten. Hij was diegene die me telkens

weer zelfvertrouwen gaf. Hij lijdt af en toe aan beroepsmisvorming door elke tekst die hij tegenkomt na

te kijken op taalfouten, maar voor de verbetering van mijn masterproef was dit wel een handig

gegeven. Dankjewel om er altijd voor mij te zijn en ik kijk uit naar de toekomst samen met jou.

Emilie is een persoon die zeker moet vermeld worden. Vanaf de eerste week als nieuwe student

diergeneeskunde is er een heel bijzondere vriendschap tussen ons ontstaan zowel op school als

daarbuiten. We hebben zoveel gekke en toffe dingen meegemaakt bij het uitgaan. Zelfs samen de

trein nemen ging nooit zonder slag of stoot. Tijdens de examenperiodes en andere moeilijke periodes

waren we er altijd om elkaar op te peppen. Ik kan mij geen betere beste vriendin voorstellen.

Dankjewel voor al de toffe jaren, de hilarische en diepgaande gesprekken en voor je

onvoorwaardelijke vriendschap. Ik wens je veel succes volgend jaar in het verre Zuid- Afrika.

Verder wil ik mijn vriendinnen Joke, Femke, Lise en Sophie bedanken. Dankzij hen kon ik af en toe

mijn studies vergeten door de leuke uitstapjes en weekendjes. Ze zijn altijd in mij blijven geloven,

maar hebben mij ook altijd met mijn voeten op de grond gehouden. Dank jullie wel voor de

fantastische vriendschap.

Ten slotte mag ik zeker mijn ouders, zus en broer niet vergeten. Het afgelopen jaar was niet

gemakkelijk voor hen. Ik heb veel weekends op de faculteit doorgebracht, waardoor ik weinig thuis

ben geweest. Tijdens de examenperiodes hebben jullie het heel vaak zwaar te verduren gekregen als

de stress mij weer parten speelden, maar jullie zijn mij altijd blijven steunen en jullie hebben mij altijd

geholpen waar jullie konden. Dank jullie wel voor het warme nest dat jullie mij gegeven hebben.

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING ................................................................................................................................... 1

INLEIDING ............................................................................................................................................. 2

LITERATUURSTUDIE ............................................................................................................................ 3

1 CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ..................................................................................................... 3

1.1 ALGEMEEN ............................................................................................................................ 3

1.2 TOXINOTYPERING ................................................................................................................ 3

1.3 TOXINOTYPES ...................................................................................................................... 4

2 ALFA TOXINE ................................................................................................................................. 5

2.1 STRUCTUUR ......................................................................................................................... 5

2.2 WERKING .............................................................................................................................. 6

3 ENTEROTOXEMIE BIJ KALVEREN ............................................................................................... 8

3.1 ETIOLOGIE ............................................................................................................................ 8

3.2 PATHOGENESE .................................................................................................................... 9

3.2.1 Vermenigvuldiging .............................................................................................................. 9

3.2.2 De rol van alfa toxine ........................................................................................................ 10

3.2.3 De rol van bèta- 2 toxine ................................................................................................... 10

3.2.4 De rol van perfringolysine O (Tèta toxine) ........................................................................ 11

3.2.5 De rol van andere enzymen en pathogenen ..................................................................... 12

3.3 SYMPTOMEN EN KLINISCH BEELD .................................................................................. 13

3.4 RISICOFACTOREN .............................................................................................................. 14

3.4.1 Stress en voeding ............................................................................................................. 15

3.4.2 Witvleeskalverenindustrie ................................................................................................. 16

3.5 PREVENTIE ......................................................................................................................... 17

3.5.1 Management ..................................................................................................................... 17

3.5.2 Vaccinatie ......................................................................................................................... 17

PROBLEEMSTELLING EN DOELSTELLINGEN ................................................................................. 20

MATERIAAL EN METHODEN .............................................................................................................. 22

1 HET ALFA TOXINE ....................................................................................................................... 22

2 KALVEREN ................................................................................................................................... 22

3 PROTOCOL .................................................................................................................................. 22

3.1 TEST VOOR DE OPTIMALE CONCENTRATIE ALFA TOXINE VOOR INJECTIE .............. 22

3.2 TEST OP DE INTESTINALE STABILITEIT VAN ALFA TOXINE .......................................... 23

4 DETECTIE .................................................................................................................................... 24

4.1 ELISA ................................................................................................................................... 24

4.2 EIGEEL DIFFUSIE ASSAY .................................................................................................. 25

5 STATISTISCHE ANALYSE ........................................................................................................... 25

RESULTATEN ...................................................................................................................................... 26

1 TEST VOOR DE OPTIMALE CONCENTRATIE ALFA TOXINE VOOR INJECTIE ....................... 26

2 TEST OP DE INTESTINALE STABILITEIT VAN ALFA TOXINE .................................................. 28

2.1 INVLOED VAN INCUBATIE OP DE KLEUR VAN DARMINHOUD....................................... 28

2.2 NECROSE VAN DE DARMVILLI DOOR ALFA TOXINE ...................................................... 28

2.3 INTESTINALE STABILITEIT VAN ALFA TOXINE ................................................................ 31

DISCUSSIE .......................................................................................................................................... 38

1 WAARDE VAN DE DETECTIE VAN ALFA TOXINE IN DE DIAGNOSTIEK ................................. 38

2 NECROSE VAN DE DARMVILLI IN DE DIAGNOSTIEK .............................................................. 39

3 OPMERKINGEN BIJ HET ONDERZOEK ..................................................................................... 40

4 CONCLUSIE ................................................................................................................................. 41

REFERENTIELIJST ............................................................................................................................. 42

1

SAMENVATTING

Enterotoxemie bij kalveren is een ziekte die veroorzaakt wordt door C. perfringens Type A. Deze kiem

is onderdeel van de normale darmmicrobiota en produceert onder andere alfa toxine dat een

belangrijke rol kan spelen in de pathogenese van enterotoxemie. De diagnostiek van enterotoxemie bij

kalveren is een moeilijke opgave, aangezien geen enkele gekende methode een sluitend bewijs

vormt. In dit onderzoek werd nagegaan of de detectie van alfa toxine in darminhoud kan gebruikt

worden voor de diagnose van enterotoxemie. Hiervoor werd de postmortale intestinale stabiliteit van

alfa toxine getest door bij drie geëuthanaseerde kalveren negen darmlussen te maken die

geïnjecteerd werden met PBS (n=3), 2 U/ml (n=3) of 4 U/ml (n=3) alfa toxine. Er werden stalen van de

darminhoud genomen meteen na en om de twee tot zes uur na injectie. Vervolgens werden de stalen

met een commerciële ELISA en een eigeel diffusie assay onderzocht op de aanwezigheid van alfa

toxine. Geen van beide testen kon alfa toxine detecteren in darminhoud van lussen geïnjecteerd met

PBS. Ook na zes uur bleven de testen negatief. Dit kan erop wijzen dat er geen of een zeer lage

productie is van alfa toxine door C. perfringens in de darmen van kalveren zonder enterotoxemie,

waardoor de detectie van alfa toxine bruikbaar kan zijn voor de diagnose van enterotoxemie. De

resultaten van de eigeel diffusie assay tonen een daling van de alfa toxine activiteit aan na verloop

van tijd. Na vier uur is er veel variatie in het al dan niet detecteren van activiteit en na zes uur is de

activiteit bij alle kalveren verdwenen. Er is nog veel onderzoek nodig naar de detectie van alfa toxine

als diagnostische test voor enterotoxemie, maar dit onderzoek suggereert dat staalname waarschijnlijk

snel na de dood (binnen twee uur) zal moeten plaatsvinden, aangezien alfa toxine snel wordt

afgebroken door proteases in de darminhoud.

Key words: Alpha toxin - Calves - Clostridium perfringens - Diagnostics - Enterotoxaemia

2

INLEIDING

In 1936 werd enterotoxemie bij kalveren voor het eerst beschreven. De ziekte was al langer bekend bij

kleine herkauwers, maar plots werd in Australië een zelfde ziektebeeld bij jonge kalveren

teruggevonden. De kalveren stierven acuut terwijl ze graasden op een rijke weide. De darmen

vertoonden bij autopsie bloederige en necrotische segmenten. Het bleef niet bij dit ene geval en de

ziekte werd daarna voornamelijk gediagnosticeerd bij zoogkalveren van vleesrassen (Lebrun et al.,

2010).

Later werd ontdekt dat de ziekte het meest waarschijnlijk door Clostridium perfringens type A wordt

veroorzaakt (Goossens et al., 2017). Dit type produceert tal van toxines en enzymen, waarbij alfa

toxine de belangrijkste rol zou spelen in de pathogenese (Verherstraeten et al., 2013). Daarnaast zijn

er nog enkele risicofactoren zoals stress en eiwitrijke voeding die de ziekte kunnen uitlokken

(Valgaeren, 2015).

Tegenwoordig is de ziekte de tweede belangrijkste oorzaak van verlies van witvleeskalveren tijdens de

opfok van het Belgisch Wit Blauwe ras. Hoewel de ziekte op elke leeftijd kan voorkomen, worden

vaker zoogkalveren van vier maanden oud en witvleeskalveren van acht maanden oud getroffen

(Goossens et al., 2017). De morbiditeit van enterotoxemie is slechts 1,3%. Dit is in vergelijking met de

belangrijkste aandoening bij opfok van witvleeskalveren, namelijk pneumonie (morbiditeit van 56%),

laag. De reden dat enterotoxemie toch voor grote economische verliezen zorgt, is de hoge mortaliteit

(100%), terwijl bij pneumonie slechts 4,8% van de kalveren sterft. Daarnaast worden de best

groeiende, zwaarste en daarom de meest waardevolle dieren het meest en voornamelijk op het einde

van de opfok getroffen. De dieren hebben op dat moment al veel geld gekost aan voeding en

huisvesting (Pardon et al., 2012a; Valgaeren, 2015).

De diagnose van enterotoxemie is niet eenvoudig. De symptomen, bevindingen op autopsie,

histologische bevindingen en bacteriologisch onderzoek kunnen in combinatie een vermoeden doen

ontstaan. Geen enkele van deze diagnostische testen kan echter op zichzelf uitsluitsel geven.

Enterotoxemie wordt daarom vaak overgediagnosticeerd (Valgaeren et al., 2016).

De detectie van alfa toxine werd tot op heden onvoldoende onderzocht als diagnostisch middel voor

enterotoxemie. Darminhoud van dieren die sterven aan enterotoxemie, bevat waarschijnlijk grote

hoeveelheden alfa toxine. C. perfringens is echter onderdeel van de normale darmmicrobiota,

waardoor verondersteld wordt dat alfa toxine eveneens bij gezonde dieren kan gedetecteerd worden

(Uzal en Songer, 2008). Alfa toxine kan daarnaast afgebroken worden door proteases aanwezig in de

darminhoud, waardoor het na verloop van tijd misschien niet meer kan teruggevonden worden

(Verherstraeten et al., 2013; Valgaeren et al., 2016).

In dit onderzoek werd nagegaan of de detectie van alfa toxine in darminhoud van waarde kan zijn voor

de diagnose van enterotoxemie. Hierbij werd de postmortale intestinale stabiliteit van alfa toxine

onderzocht door alfa toxine in darmlussen te injecteren en de detectie van alfa toxine na verloop van

tijd te analyseren met ELISA en een eigeel diffusie assay.

3

LITERATUURSTUDIE

1 CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

1.1 ALGEMEEN

Clostridium perfringens heeft in de afgelopen eeuwen verschillende namen gekregen zoals Bacillus

aerogenes capsulatus, Bacterium welchii en Clostridium welchii. In 1939 werd de speciesnaam

perfringens, wat doorbreken betekent in het Latijn, voor het eerst gebruikt in de vijfde editie van

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Deze naam is tot op heden het meest courant (Lebrun

et al., 2010).

Het is een Gram positieve, staafvormige, sporenvormende bacterie die zoals alle leden van het genus

Clostridium enkel in anaerobe omstandigheden kan groeien (Rood en Cole, 1991). In tegenstelling tot

andere Clostridia species is hij echter wel zuurstoftolerant (Valgaeren, 2015). De optimale

groeitemperatuur bedraagt 37°C (mesofiel). Verder is C. perfringens ubiquitair, wat wil zeggen dat hij

overal in de omgeving kan voorkomen zoals onder andere in de bodem, rioolwater, voeding en

faeces. Daarnaast is de bacterie een normale bewoner van het spijsverteringsstelsel van mens en dier

(Uzal et al., 2014). Clostridium spp. kon in een studie van Mayer et al. (2012) reeds 24 uur tot 48 uur

na de geboorte worden teruggevonden in de faeces van kalveren, waardoor een vroege kolonisatie

van de darm kan vermoed worden.

Clostridium perfringens kan echter ook pathogeen zijn voor zowel mens als dier. Enkele voorbeelden

zijn gasgangreen, voedselvergiftiging, diarree na behandeling met antibiotica, necrotische enteritis en

enterotoxemie bij tal van diersoorten (Uzal et al., 2014). De spores zijn de meest infectieuze vorm. Ze

zijn hitteresistent, UV- resistent en resistent voor sommige desinfectantia, waardoor desinfectie van

materialen moeilijk is. Ze kunnen verschillende jaren in slaapmodus zijn, maar vanaf ze in een

gunstige omgeving komen, kunnen ze binnen twintig minuten vegetatief worden en vermenigvuldigen,

waarna er ziekte ontstaat. Deze gunstige omstandigheden omvatten vooral de aanwezigheid van

essentiële aminozuren en groeifactoren, aangezien een deel van de enzymen voor aminozuur

biosynthese in gebreke zijn. De aanwezigheid van glucose en zetmeel is minder van belang. C.

perfringens heeft immers de nodige enzymen voor glycolyse en voor het glycogeen metabolisme

(Valgaeren, 2015).

1.2 TOXINOTYPERING

Clostridium perfringens kan verschillende ziektes veroorzaken, omdat het zo’n dertigtal toxines en

enzymen kan produceren. Het zijn deze toxines en enzymen die weefselschade op verschillende

niveaus kunnen aanrichten. De toxines worden onderverdeeld in major en minor toxines. Er zijn vier

major toxines, namelijk alfa, bèta, epsilon en iota toxine. Afhankelijk van de major toxines die een

isolaat kan produceren, wordt hij ingedeeld in een toxinotype (Tabel 1). Er zijn momenteel vijf

toxinotypes bekend, namelijk type A, B, C, D en E (Lebrun et al., 2010; Uzal et al., 2014).

4

Tabel 1: Overzicht van de vijf toxinotypes en de toxines die ze produceren (Overgenomen en

aangepast uit Li et al., 2013).

TYPE Alfa Bèta Epsilon Iota

A + - - -

B + + + -

C + + - -

D + - + -

E + - - +

De ontwikkeling van de eerste methode om isolaten te classificeren in toxinotypes dateert van 1931.

Hierbij brengt men de geïsoleerde kiem in cultuur en tijdens de exponentiële groeifase produceert de

kiem zijn toxines. De bovenstaande vloeistof van de cultuur die de toxines bevat, wordt vervolgens

intraperitoneaal geïnjecteerd bij muizen. Daarna krijgen de muizen neutraliserende antistoffen

toegediend die ontwikkeld zijn tegen de verschillende toxinotypes. De muizen die antistoffen tegen

een ander toxinotype dan het toxinotype van het isolaat krijgen, sterven. De muizen die overleven,

hebben antistoffen gekregen tegen het toxinotype waartoe het isolaat behoort. Bij een andere

methode wordt de bovenstaande vloeistof van de cultuur intradermaal bij cavia’s geïnjecteerd. Er

ontstaan necrotische en erythemateuze letsels die gelinkt kunnen worden aan een bepaald toxinotype

(Petit et al., 1999).

Beide methodes zijn tegenwoordig verdrongen door polymerase chain reaction (PCR), aangezien de

oude methodes arbeidsintensief, duur en ethisch niet verantwoord zijn. Hierbij worden de genen

opgespoord die coderen voor de verschillende toxines en aan de hand daarvan worden de isolaten

ingedeeld in toxinotypes. Er is een multiplex PCR ontwikkeld die verschillende toxines tegelijk kan

opsporen, namelijk genen van de hoofdtoxines alfa, bèta, epsilon en iota en daarnaast ook de genen

van het enterotoxine en beta-2 toxine (van Asten et al., 2009).

Verdere onderverdeling binnen deze toxinotypes gebeurt aan de hand van het al dan niet produceren

van minor toxines. Minor toxines zijn onder andere NetB toxine dat necrotische enteritis veroorzaakt

bij kippen en enterotoxine dat voedselvergiftiging kan veroorzaken bij mensen (Uzal et al., 2014). De

minor toxines zijn dus niet minder belangrijk in het veroorzaken van pathologieën. Daarom kan de

vraag gesteld worden of de huidige classificatie op basis van de genen voor major toxines nog

relevant is. De productie van toxines overlapt immers tussen de verschillende types en er worden nog

altijd nieuwe toxines ontdekt. Een alternatieve classificatie bedenken, is echter moeilijk omdat de rol

van bepaalde toxines in pathologieën nog niet volledig is blootgelegd en vaak door dieper onderzoek

opnieuw weerlegd kan worden.

1.3 TOXINOTYPES

Clostridium perfringens type A wordt gekarakteriseerd door zijn productie van maar één major toxine,

namelijk het alfa toxine. Ook andere types produceren alfa toxine, maar type A produceert de hoogste

hoeveelheden. Dit type komt het meest voor in de omgeving en maakt bovendien deel uit van de

5

darmmicrobiota van mens en dier. Type A kan ook een aantal ziektes veroorzaken zoals gasgangreen

(McDonel, 1980; Petit et al., 1999). Daarnaast is een aandoening bij lammeren bekend die als

symptomen erge hemolyse, icterus en nefrose door hemoglobinurie geeft. Het wordt “yellow lamb

disease” genoemd en de letsels worden voornamelijk verklaard door de werking van alfa toxine (Li et

al., 2013). Sommige stammen bevatten een gen dat codeert voor enterotoxine en kunnen zorgen voor

voedselvergiftiging bij mensen (Uzal et al., 2014; Uzal et al., 2015). Andere stammen produceren

naast het alfa toxine het NetB toxine. Dit veroorzaakt necrotische enteritis bij kippen wat grote

economische verliezen in de vleeskippensector tot gevolg heeft ten gevolge van de daling in

productie-efficiëntie (Uzal et al., 2014).

C. perfringens type B wordt zo genoemd, omdat hij het major toxine bèta produceert. Daarnaast

produceert hij ook alfa toxine en epsilon toxine (ETX). De toxines zorgen voor acute sterfte of

zenuwsymptomen al dan niet met bloederige diarree bij schapen, runderen en paarden. Type B is

echter vooral gekend omdat het dysenterie bij pasgeboren lammeren veroorzaakt (Niilo, 1980; Li et

al., 2013).

Om tot het type C te behoren, moet zowel bèta als alfa toxine geproduceerd worden, waarbij

voornamelijk het bèta toxine zorgt voor letale letsels. Het veroorzaakt hemorragische necrotische

enteritis en enterotoxemie bij zowel mens als dier, waaronder schapen, runderen, paarden en

varkens. De symptomen zijn acute sterfte of koliek met diarree en soms zenuwsymptomen (Li et al.,

2013; Uzal et al, 2015).

Type D produceert alfa en epsilon (ETX) toxine en is de voornaamste oorzaak van enterotoxemie bij

schapen en geiten. Epsilon toxine veroorzaakt hierbij het meeste schade en is het meest

verantwoordelijk voor de symptomen (Nillo, 1980; Uzal et al., 2014; Uzal et al., 2015).

C. perfringens type E wordt gekarakteriseerd door de productie van iota toxine en is tevens het enige

toxinotype dat dit toxine produceert. Dit type zorgt onder andere voor hemorragische enteritis en acute

sterfte bij kalveren en lammeren en enterotoxemie bij konijnen (Nillo,1980; Li et al., 2013; Uzal et al.,

2014).

2 ALFA TOXINE

Het gen dat codeert voor alfa toxine bevindt zich op het chromosoom van Clostridium perfringens. Het

kan bijgevolg zoals eerder vermeld door alle toxinotypes geproduceerd worden. Het is een zink

metallofosfolipase C enzym met fosfolipase C en sfingomyelinase activiteit (Li et al., 2013).

2.1 STRUCTUUR

De structuur van het alfa toxine bestaat uit twee domeinen, namelijk een N (stikstof)- enzymatisch

domein en een C (koolstof)- bindingsdomein (Figuur 1). Het N- domein bestaat uit negen α-helixen

met twee tot drie divalente zinkionen. Deze bevinden zich op de actieve plaats van het enzym

(McDonel, 1980; Petit et al., 1999; Sakurai et al., 2004; Li et al., 2013). De actieve plaats wordt

geflankeerd door twee lussen die van conformatie kunnen veranderen, waardoor een open (actieve)

6

en een gesloten (inactieve) vorm van het toxine bestaat. Bij de gesloten vorm gaan de lussen de

actieve plaats afschermen, zodat deze geen substraat kan binden en dus zijn activiteit niet kan

uitvoeren. Bij de open vorm is de actieve plaats vrij. De zinkionen staan in voor de katalytische

activiteit en zijn essentieel voor de enzymatische activiteit van het alfa toxine (Eaton et al., 2002).

Het C- domein bestaat uit acht β-bladen die antiparallel georiënteerd zijn en bevat drie

bindingsplaatsen voor calcium (C1, C2 en C3). Hierdoor kan het op een calciumafhankelijke manier

binden aan fosfolipiden van de celmembraan (Jepson en Titball, 2000; Eaton et al., 2002). Beide

domeinen zijn vermoedelijk verbonden door een flexibele linker regio en hydrofobe interacties tussen

aminozuren van de vermeende actieve plaats van het N- domein en de bindingsplaatsen voor calcium

van het C- domein. Via deze interactie zouden beide domeinen met elkaar kunnen communiceren

tijdens de binding met de celmembraan (Titball et al., 1999; Jepson en Titball, 2000). Beide domeinen

zijn essentieel voor de toxiciteit van het toxine. Het N- domein zorgt dan wel voor de enzymatische

activiteit. Zonder binding aan de celmembraan door het C- domein kan het zijn activiteit niet

uitoefenen (Titball et al., 1999; Jepson en Titball, 2000; Eaton et al., 2002).

Figuur 1: De structuur van het alfa toxine: het N- domein met gebonden zinkionen en het C- domein met

gebonden calciumionen verbonden met elkaar door een flexibele linker regio (Uit Titball et al., 1999).

2.2 WERKING

Zoals eerder vermeld is alfa toxine een fosfolipase C dat behoort tot de groep van de zink

metallofosfolipases C. Het richt zich tegen de fosfolipiden (fosfatidylcholine) en sfingomyelines van de

celmembraan, waarna deze worden gehydrolyseerd. Liposomen en erythrocyten bevatten in hun

celmembraan veel fosfatidylcholine en sfingomyelines en zijn daarom bijzonder gevoelig aan alfa

toxine. De hemolyse, necrose en de cytolyse die vaak worden teruggevonden bij C. perfringens type A

infecties zijn hierdoor te verklaren (Titball et al., 1999; Sakurai et al., 2004).

7

De werking van het alfa toxine begint bij de binding aan de celmembraan. Dit gebeurt in twee stappen.

In de eerste stap gaan hydrofobe aminozuurresiduen van zowel het N- als het C- domein interageren

met de fosfolipiden van de celmembraan, waarna het actieve gedeelte op het N- domein correct

gepositioneerd wordt ten op zichte van de celmembraan (Titball et al., 1999; Jepson en Titball, 2000;

Eaton et al., 2002). Bij de tweede stap zijn calcium ionen essentieel. Deze geven de polaire hoofden

van de membraanfosfolipiden een positieve lading, waardoor er makkelijk interacties optreden met het

negatief geladen C- domein (Moreau et al.,1988). Hierbij wordt eveneens het alfa toxine geactiveerd

van de gesloten naar de open vorm. Aminozuurresiduen van de bindingsplaatsen voor calcium op het

C- domein gaan namelijk na binding van calcium via hydrofobe interacties met aminozuurresiduen van

de actieve plaats op het N- domein communiceren, waarna een conformatieverandering optreedt met

vrijstelling van de actieve plaats op het N- domein. Vervolgens kan alfa toxine zijn werking uitoefenen

en fosfatidylcholines en sfingomyelines hydrolyseren (Titball et al., 1999; Eaton et al., 2002).

In hoge concentraties zal alfa toxine zorgen voor volledige destructie van de celmembraan met cellyse

tot gevolg. In lage concentraties zullen door de afbraakproducten van fosfatidylcholine en

sfingomyeline intracellulaire pathways in gang worden gezet. Ceramide, een afbraakproduct van

sfingomyeline, gaat de celgroei inhiberen en apoptose stimuleren, waardoor de weefselschade niet

hersteld wordt. Diacylglycerol, een afbraakproduct van fosfatidylcholine, activeert proteïne kinase C

dat op zijn beurt de eukaryote cel membraangebonden fosfolipases A2 en fosfoinositide fosfolipase C

activeert (Figuur 2). Fosfolipase A2 kan de arachidonzuur cascade stimuleren, waarna leukotriënes,

tromboxaan, PAF (platelet- activating factor) en prostacyclines worden gevormd. Deze molecules

veroorzaken ontsteking, vasoconstrictie, verhoogde vasculaire permeabiliteit, aggregatie van

bloedplaatjes en myocardiale stoornissen. Dit kan leiden tot shock en sterfte. Fosfoinositide

fosfolipase C kan op zijn beurt zorgen voor de vorming van inositoltrifosfaat (IP3). IP3 speelt een rol bij

de vrijstelling van calcium uit het endoplasmatisch reticulum, waarna de intracellulaire concentratie

aan calcium stijgt. Hierdoor gaan calciumkanalen in de celmembraan open. In spiercellen betekent dit

dat de spieren zullen contraheren en in de hartspier leidt dit tot hartritmestoornissen. Calcium activeert

eveneens de eerder vermelde membraangebonden fosfolipases met alle gevolgen van dien (Titball et

al., 1999; Sakurai et al., 2004).

De vasoconstrictie, de aggregatie van bloedplaatjes en de beschadiging van het endotheel werkt

rechtstreeks in het voordeel van C. perfringens. De kiem is anaeroob en dankzij deze factoren daalt

het zuurstofgehalte in de weefsels, waardoor hij de kans heeft om verder te groeien en alfa toxine te

produceren (Titball et al., 1999; Eaton et al., 2002). Verder moet opgemerkt worden dat de werking

van alfa toxine kan verschillen naargelang de diersoort en het weefseltype. Zo zal bijvoorbeeld bij

gasgangreen trombose, verstoorde leukocyteninfiltratie en weefselnecrose optreden, terwijl bij

enterotoxemie bij kalveren congestie van de capillairen, bloedingen en inflammatie van de darmen

optreedt. Bij beide speelt alfa toxine de hoofdrol in de pathogenese, maar werkt het niet op dezelfde

manier (Verherstraeten et al., 2013). Dit verschil kan echter ook te wijten zijn aan een

concentratieverschil van het alfa toxine bij de verschillende ziektes. Zo kan in lage concentraties alfa

toxine zorgen voor de expressie van adhesiemolecules en IL-8 op endotheelcellen en leukocyten,

https://en.wikipedia.org/wiki/Phosphoinositide_phospholipase_C



8

waardoor er meer leukocyten aan endotheelcellen gaan adhereren en extravaseren. Bij enterotoxemie

wordt het alfa toxine verdund in de darminhoud. Hierdoor is er een aanzienlijke influx van

ontstekingscellen, zoals neutrofielen en leukocyten. Bij gasgangreen wordt alfa toxine in hoge

concentraties in de spieren geproduceerd. Hier gebeurt het omgekeerde en gaan er minder

ontstekingscellen zich naar het geïnfecteerde weefsel begeven (Goossens et al., 2017).

Figuur 2: De intracellulaire signaalwegen van diacylglycerol, een afbraakproduct van fosfatidylcholine (Uit Titball

et al., 1999)

3 ENTEROTOXEMIE BIJ KALVEREN

3.1 ETIOLOGIE

Initieel werd ervan uit gegaan dat het agens dat enterotoxemie bij kalveren veroorzaakt hetzelfde

agens is dat de ziekte bij kleine herkauwers veroorzaakt, namelijk Clostridium perfringens. De

darmlaesies zijn echter niet pathognomonisch en kunnen ook veroorzaakt worden door andere

Clostridia species en/of genera (Manteca et al., 2001).

In 2001 werd voor het eerst door Manteca et al. op grote schaal een case- control onderzoek gedaan

bij Belgisch Wit Blauwe kalveren. Dit onderzoek had als doel te bewijzen dat C. perfringens bij

enterotoxemie voldoet aan het eerste postulaat van Koch. Het eerste postulaat van Koch zegt dat de

9

kiem in hoge aantallen aanwezig moet zijn in alle gevallen van enterotoxemie maar niet bij gezonde

dieren. In de eerste fase van het onderzoek werd bij kalveren met enterotoxemie effectief een groter

aantal C. perfringens geïsoleerd en bij meer dieren dan bij de controlegroep. Daarnaast was het

aantal ter hoogte van de laesies groter dan erboven en eronder. Als er vervolgens geen andere

bacteriën, zowel aerobe als anaerobe in grote aantallen zouden worden teruggevonden bij de

kalveren met enterotoxemie in vergelijking met de controlegroep, dan voldoet C. perfringens voor

enterotoxemie aan het eerste postulaat van Koch. In de tweede fase van het onderzoek werden wel

andere Clostridia species in grote aantallen geïsoleerd. Het ging voornamelijk om C. bifermentans en

urease- negatieve C. sordelli, maar deze werden slechts bij een beperkt aantal van de kalveren met

enterotoxemie teruggevonden. C. bifermentans is niet pathogeen, maar urease- negatieve C. sordelli

wordt wel eens geassocieerd met enterotoxemie en gasgangreen. Urease- negatieve C. sordelli

produceert HT (hemorragisch toxine) en wordt vaak samen met grote aantallen van C. perfringens

teruggevonden, waardoor het moeilijk is om te weten welke bacterie nu de oorzaak is van

enterotoxemie. De stammen die hier werden teruggevonden, produceerden echter geen toxine. In

deze studie konden andere Clostridia species bijgevolg niet als oorzaak van enterotoxemie naar voor

geschoven worden. In andere individuele gevallen kan dit niet met zekerheid gezegd worden. Ook

Salmonella typhimurium en E. coli konden teruggevonden worden bij de kalveren met enterotoxemie.

De eerste kiem slechts bij 25% en de tweede kiem slechts bij twee dieren dus hun rol werd in deze

studie uitgesloten. Samengevat wordt in deze studie niet- enterotoxigene C. perfringens type A als

etiologisch agens voor enterotoxemie bij Belgisch Wit Blauwe kalveren aangeduid (Manteca et al.,

2001).

Bij dit onderzoek werden de stalen echter pas 24 uur na de dood van de kalveren genomen. C.

perfringens kan na de dood snel beginnen woekeren, waardoor de betrouwbaarheid van dit onderzoek

in vraag kan gesteld worden. Bovendien is uit een studie van Valgaeren et al. (2013b) recent gebleken

dat het aantal C. perfringens dat men vindt na de dood geen diagnostische waarde heeft. De aantallen

binnen de controle en de enterotoxemie groep varieerden te veel en ook tussen de groepen bestond

er veel overlap. Echter in de meeste gevallen van enterotoxemie bij kalveren wordt C. perfringens type

A geïsoleerd uit de letsels, waardoor deze bacterie het meest waarschijnlijke etiologisch agens van

enterotoxemie lijkt (Goossens et al., 2017).

3.2 PATHOGENESE

3.2.1 Vermenigvuldiging

Zoals eerder vermeld, is Clostridium perfringens onderdeel van de normale darmmicrobiota. De ziekte

start met een overgroei van Clostridium perfringens type A in de dunne darm. Zoals eerder vermeld,

heeft C. perfringens een aantal enzymen te kort die nodig zijn voor aminozuur biosynthese. Hierdoor

zijn er veel essentiële aminozuren die noodzakelijk zijn voor de groei. Een hoog proteïnedieet kan

bijgevolg de kiem de kans geven om te vermeerderen. Vervolgens produceert C. perfringens toxines

die eukaryote cellen beschadigen en zorgen voor de vrijstelling van voedingsstoffen die de kiem

eveneens kan benutten om verder te groeien (Lebrun et al., 2010).

10

Bij vermeerdering gaat de bacterie dicht in contact komen tot zelfs binden aan de enterocyten.

Vervolgens gaat C. perfringens toxines produceren die concentreren op de plaatsen met een nauw

contact met de enterocyten. De toxines worden op die manier beschermd tegen afbraak en er is

minder verlies door de darmtransit, proteases en bindende antistoffen. Zo kunnen de toxines

ongestoord hun schadelijke werking uitoefenen (Lebrun et al., 2010).

3.2.2 De rol van alfa toxine

C. perfringens type A speelt niet alleen bij enterotoxemie een belangrijke rol maar ook bij verschillende

ziektes in verschillende diersoorten zoals bij gasgangreen, bovine hemorragic bowel disease,

necrotische enteritis bij kippen, voedselvergiftiging bij mensen … De letsels die hierbij ontstaan,

werden initieel voornamelijk gelinkt aan de werking van alfa toxine. Dit is namelijk het enige major

toxine dat geproduceerd kan worden door type A. Verder onderzoek heeft echter uitgewezen dat

minor toxines een belangrijke rol kunnen spelen bij het ontstaan van deze ziektes, zoals enterotoxine

bij voedselvergiftiging bij mensen. Type A wordt daarnaast vaak geïsoleerd uit darminhoud van

gezonde dieren (Morris et al., 2011). De rol van alfa toxine kan daarom in vraag gesteld worden.

Valgaeren et al. (2013a) en Morris et al. (2011) hebben echter in beide studies necro- hemorragische

letsels kunnen opwekken in darmlussen door inoculatie met type A isolaten die geen genen bevatten

voor een selectie aan minor toxines zoals NetB en enterotoxine, waardoor de rol van alfa toxine ook

niet volledig genegeerd kan worden. Waarschijnlijk krijgt alfa toxine hulp van een minor toxine zoals bij

andere type A ziektes. Welk minor toxine en welk mechanisme hierachter zit, is nog onduidelijk (Morris

et al., 2011).

De werking van het alfa toxine werd in paragraaf 2.2 uitvoerig besproken. Verder zou het alfa toxine

de matrixmetalloprotease activiteit verhogen. Dit enzym breekt bindweefsel tussen cellen af. Hierdoor

wordt de normale epitheliale groei geremd en de subepitheliale matrix afgebroken, waardoor het

epitheel los kan komen van de onderliggende lamina propria. Alfa toxine zou daarnaast de vrijstelling

van tumor necrosis factor- alfa (TNF- α) veroorzaken. Deze ontstekingsmediator kan eveneens zorgen

voor loslating van het epitheel en zorgt voor verhoging van de vasculaire permeabiliteit met oedeem

en bloedingen tot gevolg. Hoewel vaak wordt gedacht dat alfa toxine een necrotiserende werking

heeft, kan dit niet bevestigd worden. Necrose is bij enterotoxemie wel steeds aanwezig, wat opnieuw

doet vermoeden dat nog een ander toxine een rol moet spelen (Goossens et al., 2017).

3.2.3 De rol van bèta- 2 toxine

Eén van de suggesties voor een minor toxine dat een bijkomende rol speelt bij enterotoxemie is bèta-

2 toxine. Dit is een porievormend toxine dat enteritis bij neonatale biggen en gentamycine-

geassocieerde diarree bij paarden kan veroorzaken (Goossens et al., 2017).

Het alfa toxine en het bèta- 2 toxine zouden synergistisch werken om de typische necrotische

hemorragische enteritis te bekomen. Hierbij zou de aanwezigheid van bèta- 2 toxine essentieel zijn.

Door beschadiging van de darm door bèta- 2 toxine kan het alfa toxine makkelijk in de bloedbaan

terecht komen met enterotoxemie en plotse sterfte tot gevolg. Dit laatste is echter eerder een

veronderstelling, aangezien er nog geen studies zijn die dit werkelijk aantonen (Lebrun et al., 2010).

11

In 2002 werd door Manteca et al. een studie uitgevoerd, waarbij darmlussen geïnfecteerd werden met

stammen met en zonder het gen voor bèta- 2 toxine, respectievelijk cpb2 positieve stammen en cpb2

negatieve stammen. De lussen geïnoculeerd met cpb2 positieve stammen kregen de hoogste

laesiescore, maar cpb2 negatieve stammen konden evengoed laesies veroorzaken. Cpb2 positieve

stammen produceerden daarnaast grotere hoeveelheden alfa toxine. De betrouwbaarheid van de

studie kan in vraag gesteld worden aangezien het maar op één kalf werd uitgevoerd en er geen

isogene cpb2 negatieve stam werd gebruikt als controle. Daarnaast kunnen de hogere producties van

het alfa toxine bij de cpb2 positieve de reden zijn dat deze lussen meer necrotische en hemorragische

letsels hadden (Goossens et al., 2017).

Een studie van Lebrun et al. (2007) heeft eveneens proberen aantonen dat bèta- 2 toxine een rol

speelt in de pathogenese van enterotoxemie. C. perfringens werd geïsoleerd uit darminhoud van acht

kalveren met enterotoxemie en van veertien gezonde kalveren. Na geno- en fenotypering bevatten

68% van de isolaten uit darminhoud van enterotoxemische kalveren het gen voor bèta-2 toxine (cpb2

positief) en slechts 46% van de isolaten van de controlegroep. Bovendien werd aangetoond aan dat

voornamelijk de consensus variant van bèta- 2 toxine kan geassocieerd worden met enterotoxemie,

aangezien 100% van de cpb2 positieve stammen van de kalveren met enterotoxemie het consensus

allel hadden ten op zichte van 67,5% van de cpb2 positieve stammen van de controlegroep. Welke rol

dit speelt in de pathogenese is onbekend. Deze studie suggereert dus wel degelijk een rol van bèta- 2

toxine bij enterotoxemie. Het is echter nog altijd mogelijk dat de verschillende isolaten binnen

eenzelfde dier en binnen dezelfde groep telkens tot dezelfde stam behoren (van Asten et al., 2010).

Cpb2 positieve stammen van C. perfringens kunnen zowel bij zieke als bij gezonde koeien van

verschillende leeftijden worden teruggevonden. Hoewel er een sterk vermoeden is van een verband

tussen bèta- 2 toxine en enterotoxemie, is er nog altijd geen sluitend bewijs. Een in vivo studie met

isogene cpb2 positieve en negatieve stammen zou meer uitsluitsel kunnen geven over de werkelijk rol

van bèta- 2 toxine bij enterotoxemie (van Asten et al., 2010).

3.2.4 De rol van perfringolysine O (Tèta toxine)

Meer recent kwam een derde toxine in aanmerking voor bijdrage aan de pathogenese van

enterotoxemie. In een studie van Morris et al. (2011) werden uit darmen van kalveren met

enterotoxemie cpb2 negatieve stammen geïsoleerd en bij inoculatie in darmen konden deze eveneens

necrotische en hemorragische letsels veroorzaken. Hierdoor ontstond er twijfel over de rol van bèta- 2

toxine. Er werden darmlussen geïnoculeerd met verschillende boviene en niet- boviene stammen van

type A, zowel cpb2 positief als negatief. Hieruit bleek dat alle stammen necro- hemorragische letsels

konden veroorzaken en dat het toxine dat meespeelt in de pathogenese dus door alle stammen moet

kunnen geproduceerd worden. Het toxine dat hiervoor in aanmerking kwam, was perfringolysine O. Dit

wil echter niet zeggen dat bèta- 2 toxine en andere toxines geen rol kunnen spelen (Verherstraeten et

al., 2013).

Alfa toxine en perfringolysine O zouden synergistisch kunnen werken. Zoals eerder vermeld is

perfringolysine O een porievormend toxine dat cholesterolafhankelijk is. Er moet minstens 35 mol%

12

cholesterol in de celmembraan aanwezig zijn voor perfringolysine O kan binden. Na binding gaan

verschillende monomeren oligomeriseren tot een preporiecomplex dat door de celmembraan dringt.

Alfa toxine gaat fosfatidylcholine en sfingomyeline, die onderdeel zijn van de celmembraan

hydrolyseren, waardoor er meer vrije cholesterolmolecules aanwezig zijn. Op die manier zou

perfringolysine O makkelijker kunnen interageren met de celmembraan en poriën vormen (Moe en

Heuck, 2010). In de studie van Moe en Heuck (2010) is deze synergistische werking enkel

aangetoond bij membranen die net iets minder dan 35 mol% cholesterol bevatten en was dit

synergisme bij membranen met 25 mol% cholesterol niet meer significant. In een studie van

Verherstraeten et al. (2013) werden darmlussen geïnjecteerd met stammen van C. perfringens die

beide (wild type) of één van beide toxines kan produceren. Van de lussen die geïnjecteerd werden

met één van beide toxines, vertoonden een kleiner aantal necro- hemorragische letsels dan de

darmlussen die geïnjecteerd waren met het wild type. Het verschil was echter niet significant. Het

cytotoxisch effect van beide op boviene endotheliale cellen was echter wel significant. Het wild type

veroorzaakte meer schade dan stammen die slechts één van beide toxines kunnen produceren en het

perfringolysine O veroorzaakt op zichzelf minder schade dan het alfa toxine. Een invloed van

perfringolysine O op letsels kan dus vermoed worden. Perfringolysine O werkt voornamelijk in op het

endotheel, waardoor congestie van de bloedvaten, bloedingen en uiteindelijk necrose van de

darmmucosa ontstaat (Verherstraeten et al., 2013).

3.2.5 De rol van andere enzymen en pathogenen

Naast toxines produceert C. perfringens nog een aantal enzymen die eveneens een steentje kunnen

bijdragen aan de pathogenese. Zo produceert hij sialidases die oligosachariden in de mucinelaag van

de darm afbreken met de vrijstelling van siaalzuur tot gevolg. Hierdoor zou C. perfringens makkelijker

aan de darm kunnen binden en de darm kunnen koloniseren. Daarnaast produceert hij

hyaluronidases, die het hyaluron in de extracellulaire matrix en rond de cellen afbreekt, waardoor de

viscositeit verlaagt. Bacteriën en toxines zouden op die manier makkelijker kunnen spreiden en een

nauwer contact kunnen hebben met het celoppervlak om hun functie uit te voeren. De

afbraakproducten kunnen als voedingsbodem dienen voor C. perfringens. Een laatste enzym dat

mogelijk meespeelt, is collagenase. Dit enzym gaat net zoals hyaluronidase de weefselintegriteit

aantasten, waardoor bacteriën en toxines makkelijker kunnen spreiden. Het zorgt eveneens voor

weefselnecrose en beschadigt de basaalmembraan met loslating van het epitheel tot gevolg. Bij deze

drie enzymen is de exacte rol echter nog onvoldoende bewezen (Goossens et al., 2017).

Parasieten en virussen kunnen predisponerend werken, wanneer ze schade toebrengen aan het

darmepitheel, zoals coccidiose, rota- en coronavirus. Door de schade kunnen plasma-eiwitten in het

lumen van de darm sijpelen en deze kunnen als voedingsbron dienen voor C. perfringens. De toxines

die geproduceerd worden, kunnen bovendien dieper in de darmwand dringen en op die manier zoals

eerder in de pathogenese uitgelegd hun werking uitoefenen op het endotheel. Na beschadiging van

het endotheel kunnen de toxines van C. perfringens, maar ook van andere darmbacteriën in de

bloedbaan terecht komen met enterotoxemie tot gevolg (Verherstraeten et al., 2013; Valgaeren et al.,

2016). Ten slotte zorgen melkvervangende proteïnes in de voeding van kalveren voor een verhoging

13

van de permeabiliteit van de darmmucosa, waardoor de toxines makkelijker door de darmwand

migreren (Verherstraeten et al., 2013).

3.3 SYMPTOMEN EN KLINISCH BEELD

De symptomen en het klinisch beeld werden hier en daar al aangehaald, maar ze zullen nu kort

samengevat en geïllustreerd worden. Meestal worden de kalveren dood teruggevonden zonder

klinische symptomen vooraf. De ziekte verloopt dus voornamelijk acuut tot peracuut met sterfte binnen

enkele minuten tot uren. Soms krijgen de dieren eerst zenuwsymptomen, koliek en tekenen van

agonie voor ze sterven. Dit laatste wordt gekenmerkt door een versnelde ademhaling, zijlig, convulsies

en uiteindelijk coma. In heel uitzonderlijk gevallen is er voor de dood sprake van diarree en

meteorisme. Dit werd enkel in respectievelijk 6% en 2% van de gevallen waargenomen (Lebrun et al.,

2010; Valgaeren, 2015; Valgaeren et al., 2016).

Eenmaal dood gaat het abdomen snel opzwellen door gasvorming (Figuur 3A) en gaat het karkas snel

rotten met een onaangename geur tot gevolg. Wanneer een autopsie wordt uitgevoerd, valt het snelle

postmortale verval van alle organen op. De dunne darmen (jejunum en ileum) vertonen een acute

necro- hemorragische jejunoileitis (Figuur 3B) met een verdikte necrotische en hemorragische

darmwand en een overvloedige bloederige inhoud (Valgaeren et al., 2016). Enkel de aangetaste delen

bevatten bloederige inhoud. Hierdoor kan vermoed worden dat enterotoxemie gepaard gaat met een

paralytische ileus. De letsels kunnen slechts tien centimeter van de dunne darm bedragen maar ook

de gehele dunne darm kan aangetast zijn. Daarnaast kunnen de letsels uitgebreid zijn tot het ileum,

het caecum, het colon en zelfs tot de lebmaag. Al komt dit bij deze laatste drie minder voor (Goossens

et al., 2017). Verder vertonen de mesenteriale lymfeknopen een secundaire reactieve satelliet

adenitis, waardoor ze vergroot zijn en kunnen er tekenen zijn van enterotoxemische shock, zoals

petechiën en congestie op andere organen. Verder lijkt alles normaal op autopsie (Lebrun et al., 2010;

Valgaeren, 2015; Valgaeren et al., 2016; Goossens et al., 2017).

Bij histologie van de aangetaste delen van de dunne darm kan een necro- hemorragische enteritis

worden waargenomen met necrose van de darmvilli en bloedingen. De necrose van de darmvilli

Figuur 3: Macroscopisch beeld van een BWB kalf gestorven aan enterotoxemie. A) Het kadaver met een duidelijk

opgezwollen abdomen door meteorisme. B) Diffuse hemorragische enteritis van de dunne darmen (Uit Valgaeren,

2015).

A B

14

bevindt zich voornamelijk aan de toppen van de villi, maar dit kan doorlopen tot aan de basis. Initieel

is er enkel congestie van de bloedvaten en loslating van het darmepitheel, waardoor het zich in

strengen in het darmlumen bevindt (Figuur 4B en C). Dit zou te wijten kunnen zijn aan postmortaal

verval, maar in een studie werd dit in de controlegroep niet geobserveerd. Vervolgens treedt er

oedeem van de mucosa, infiltratie van lymfocyten en neutrofielen en bloedingen op en gaan de villi

afstompen (Figuur 4D). In een vergevorderde stadia wordt de necrose duidelijk. De necrotische

toppen van de villi gaan zich scheiden van onderliggend levend weefsel, wat doet vermoeden dat de

necrose begint ter hoogte van de basaalmembraan en dan uitbreidt naar de lamina propria (Goossens

et al., 2017). Daarnaast is er hydropische degeneratie van ortho- en parasympathische ganglia in de

mucosa en de spierlaag van de darmwand. Gram positieve staafjes bevinden zich in het lumen van de

darm, vastgehecht aan de darmcellen en blijven oppervlakkig in de necrotische gebieden gevestigd.

Bij histologie van de andere organen kunnen deze tekenen vertonen van toxemie. Zo bevat het

leverparenchym soms centrolobulaire vacuolaire degeneratie tot necrose en het nierparenchym

degeneratie van de tubuli contorti (Lebrun et al., 2010).

Figuur 4: Histologische coupes van een dunne darm geïnoculeerd met steriel bacterie cultuur medium (A) of een C. perfringens type A stam bekeken na 30 minuten (B), 3 uur (C) en 5 uur (D) incubatie: A) Normaal histologisch

beeld van een dunne darm B) Loslating van het epitheel C) Volledige loslating van het epitheel en congestie van de bloedvaten D) Erge bloedingen en necrose van de toppen van de villi (Uit Goossens et al., 2017).

3.4 RISICOFACTOREN

Clostridium perfringens komt in de normale darmmicrobiota voor, maar kan niet explosief

vermeerderen door competitie met de andere darmmicrobiota en door een gebrek aan nutriënten. Alle

factoren die de normale darmmicrobiota verstoren en zorgen voor een aanvoer van nutriënten zullen

bijgevolg de overgroei bevorderen (Valgaeren et al., 2016).

15

3.4.1 Stress en voeding

Stress is een heel belangrijke predisponerende factor, aangezien het kan zorgen voor een

paralytische ileus. Door stase van de darminhoud zijn er meer nutriënten beschikbaar, waardoor C.

perfringens kan vermeerderen en toxines produceren. Deze toxines worden geconcentreerd op

bepaalde plekken, aangezien het verlies aan peristaltiek geen doorschuiven van de toxines toelaat.

Op histologische coupes kan aantasting van de ortho- en parasympathische ganglia in de mucosa en

de spierlaag van de darmwand waargenomen worden. Deze schade kan veroorzaakt worden door de

doorsijpelende toxines na beschadiging van de darmmucosa. Hierdoor kan de peristaltiek van de

gehele darm worden stilgelegd, waardoor een vicieuze cirkel kan ontstaan (Figuur 5). Factoren die

stress veroorzaken, zijn groeperen, transport en (medische) handelingen (Valgaeren, 2015).

Daarnaast speelt voeding een belangrijke rol. Zo kunnen plotse voederwijzigingen het evenwicht in de

darmmicrobiota verstoren, waardoor C. perfringens de kans krijgt om zich te vermenigvuldigen. De

plotse voederwijziging kan bovendien stress met zich meebrengen met paralytische ileus en een

vicieuze cirkel zoals hierboven beschreven tot gevolg. Daarnaast kan overvoedering zorgen voor een

aanvoer van nutriënten die essentieel is voor woekering van C. perfringens. De bacterie produceert

toxines en opnieuw wordt de vicieuze cirkel van beschadiging van de ganglia in de darmwand en

paralytische ileus doorlopen (Figuur 5) (Valgaeren, 2015; Valgaeren et al., 2016).

Figuur 5: De vicieuze cirkel van verschillende factoren in het tot stand komen van

enterotoxemie (Overgenomen en aangepast uit Valgaeren, 2015).

16

3.4.2 Witvleeskalverenindustrie

De witvleeskalverenindustrie in België is een sterk geïntegreerde sector met voornamelijk grote

bedrijven (meer dan 600 kalveren). De grootste moeilijkheid in de deze sector is het behouden van de

bleke kleur van het vlees. Hiervoor wordt een ijzerarm dieet gehandhaafd, zodat de productie van

hemoglobine daalt met een lichte anemie tot gevolg. De dieren mogen echter volgens de wetgeving in

het kader van dierenwelzijn niet te extreem in anemie gaan (min. 7,5 gram hemoglobine/liter bloed).

Daarnaast is het niet voordelig, aangezien extreme anemie voor een eetlustdaling en groeiachterstand

zorgt (Valgaeren, 2015).

Een ijzerarm dieet bestaat voornamelijk uit melk gemaakt van melkpoeder. Naargelang het ras wordt

een ander soort melkpoeder gebruikt. Zo krijgen Holstein Friesian (HF) kalveren voornamelijk melk

van weipoeder aangevuld met plantaardige eiwitten, terwijl Belgisch Wit Blauwe (BWB) kalveren

voornamelijk melk van vetarm melkpoeder krijgen. Dit laatste bevat hoofdzakelijk dierlijke eiwitten.

Omwille van dierenwelzijn moet in tegenstelling tot vroeger een minimum aan ruwvoeder gegeven

worden. De hoeveelheid die ze krijgen verschilt eveneens tussen HF en BWB kalveren. Zo krijgen HF

kalveren grotere hoeveelheden aan ruwvoeder (Valgaeren, 2015).

De suggestie dat vleesrassen genetisch gepredisponeerd zijn, zou dus misschien eerder te wijten aan

de verschillen in dieet tussen beide rassen bij de kalveropfok (Goossens et al., 2017). Bij de Belgisch

Wit Blauwe witvleeskalverenindustrie wordt immers na zes weken de hoeveelheid melk per

voedingsbeurt snel opgedreven. Dit kan tot tien liter per voedingsbeurt gaan in tegenstelling tot zes

liter bij HF kalveren. Daarnaast wordt de concentratie (150-190 g/L vs. 125 g/L bij HF) sterk verhoogd,

waardoor er grote hoeveelheden onverteerd melkeiwit in de dunne darmen terecht komt. Deze

eiwitten verstoren de normale flora van de darmen en dienen als nutriënten voor de vermenigvuldiging

van C. perfringens (Valgaeren, 2015; Valgaeren et al., 2016; Goossens et al., 2017). In een studie van

Valgaeren et al. (2013a) werd gekeken in hoeverre de kiem schade toebrengt aan darmen aan de

hand van darmlussen die geïnoculeerd werden met Clostridium perfringens geïsoleerd uit

enterotoxemische kalveren. In sommige darmlussen werd ook melkvervanger geïnjecteerd om de

invloed hiervan op de letsels na te gaan. Eerder werd al in andere studies verondersteld dat een bron

van eiwit nodig is om de karakteristieke letsels te veroorzaken. In deze studie vertoonden 90% van de

darmlussen die met C. perfringens en melkvervanger werden geïnjecteerd macroscopische letsels ten

op zichte van 10% van de darmlussen die enkel geïnjecteerd waren met C. perfringens. Dit doet een

predisponerende invloed van melkvervanger vermoeden, maar het exacte mechanisme is nog niet

volledig duidelijk. Zoals eerder vermeld kan de grote hoeveelheid onverteerd eiwit als nutriënt dienen

voor de groei van C. perfringens. Maar daarnaast kunnen de ruwe eiwitten uit de melk de mucine

productie in de dunne darm verhogen, waarna C. perfringens makkelijker de mucuslaag kan

koloniseren en toxines kan produceren die plaatselijk hun schadelijke effecten kunnen uitoefenen. De

kleine hoeveelheid ruwvoeder die witvleeskalveren in het algemeen krijgen in tegenstelling tot

roodvleeskalveren zorgt daarnaast voor minder ontwikkeling van de darmmicrobiota, waardoor er

geen competitie is met C. perfringens en deze dus gemakkelijk kan woekeren. De invloed van het

dieet bij enterotoxemie is kort samengevat een complex gegeven, waarbij verschillende

17

eigenschappen van de voeding en de darmmicrobiota een rol spelen (Goossens et al., 2017). Ten

slotte wordt in de BWB witvleeskalverenindustrie vaak hergroepering van de kalveren gedaan omdat

er gestreefd wordt naar uniforme groepen. Dit brengt stress met zich mee met een hogere kans op

enterotoxemie tot gevolg (Valgaeren, 2015).

Een studie van Valgaeren et al. (2015) heeft aangetoond dat de verschillen in management in de

roodvleesindustrie en de witvleesindustrie naast een rechtstreekse invloed op de groei van C.

perfringens ook een invloed kunnen hebben op de productie van antistoffen tegen alfa toxine. Slechts

16% van de witvleeskalveren hadden op zesentwintig weken leeftijd antistoffen tegen alfa toxine in

tegenstelling tot roodvleeskalveren, waarvan 85% antistoffen heeft op zesentwintig weken leeftijd. Dit

suggereert dat witvleeskalveren geen actieve immuniteit ontwikkelen tegen alfa toxine en dat

vaccinatie bijgevolg nuttig kan zijn. Bovendien heeft slechts 17% van de witvleeskalveren op veertien

weken leeftijd antistoffen tegen alfa toxine, waardoor vaccinatie op veertien weken niet zal interfereren

met maternale antistoffen. Hierdoor zullen de dieren voor de kritieke leeftijd van 22 weken beschermd

zijn. Het verschil in productie van antistoffen werd niet aangetoond voor perfringolysine O (Valgaeren

et al., 2015).

3.5 PREVENTIE

Enterotoxemie loopt in de meeste gevallen snel fataal af, waardoor een curatieve behandeling altijd te

laat komt. De bestrijding van enterotoxemie moet daarom voornamelijk preventief gebeuren (Lebrun et

al., 2010).

3.5.1 Management

Een structuurrijk, stabiel en evenwichtig dieet kan de kans op enterotoxemie sterk verminderen. Dit

houdt in dat de hoeveelheid melk per voederbeurt maximum twee liter mag bedragen en dat het

aantal voederbeurten per dag bijgevolg stijgt. De melkbeurten moeten gespreid worden en er moet

voldoende ruwvoeder gegeven worden. Daarnaast moet stress zo veel mogelijk vermeden worden

(Lebrun et al., 2010; Valgaeren, 2015; Valgaeren et al., 2016).

3.5.2 Vaccinatie

Naast veranderingen in het management is vaccinatie een belangrijke methode om enterotoxemie bij

kalveren te voorkomen. Door de jaren heen is er veel onderzoek gebeurd naar het vinden van een

effectief vaccin. Hieronder zal ik de ontwikkelingen en de eventuele knelpunten bespreken die hieruit

voortvloeiden.

De eerste vaccins die ontwikkeld zijn, zijn zogenaamde toxoid vaccins. Deze vaccins worden

geproduceerd door uit een cultuur van Clostridium perfringens toxines af te zonderen door middel van

een ultrafiltratie zuiveringsproces, waarbij de bacteriële cellen worden uitgefilterd. Deze toxines

worden dan geïnactiveerd door een behandeling met formol. Deze vaccins bevatten vaak proteïnes

die niet van nut zijn en mogelijk de immuunrespons tegen de toxines kunnen verstoren. De

behandeling met formol kan bovendien de tertiaire structuur aantasten, waardoor de immuunrespons

onefficiënt kan zijn. Deze vaccins bleken vooral effectief te zijn tegen enterotoxemie bij schapen. Bij

18

runderen zijn er nog geen studies die aantonen dat ze ook werken tegen enterotoxemie bij kalveren.

De vaccins zorgen wel voor de productie van antistoffen, maar hoelang ze aanwezig blijven, is

onbekend. Vaak moet het vaccin regelmatig herhaald worden om de antistoffentiters hoog genoeg te

houden. Een probleem bij het onderzoeken van de efficaciteit van vaccins is de reproduceerbaarheid

van de studies. Vaak verschillen de toxoiden van verschillende producties in antigeniciteit en zorgen

de toxoiden van dezelfde productielijn voor verschillende antistoffentiters in verschillende groepen van

dieren. Een ander probleem bij het onderzoek naar de werking van een vaccin is de diagnose van

enterotoxemie, aangezien het enige symptoom vaak plotse sterfte is zonder voorafgaande

symptomen. Plotse sterfte is niet pathognomonisch en kan ten gevolge van onder andere pneumonie

of anafylaxie voorkomen. Nog een nadeel van de toxoid vaccins is dat er vaak een reactie optreedt ter

hoogte van de injectieplaats. Naarmate de antistoffentiters verhogen, verergert de lokale reactie. De

dieren gaan minder eten, waardoor ze trager groeien en dus minder opbrengen (Goossens, 2016).

Deze knelpunten wakkerden verder onderzoek naar een effectief vaccin aan. Nu wordt de werking van

subunit vaccins volop onderzocht. Het bevat minder storende proteïnes in tegenstelling tot toxoid

vaccins, waardoor de immuunrespons sterker is en de lokale reactie op de injectieplaats minder erg is.

Zo wordt er geëxperimenteerd met recombinante toxoiden. Dit bevat niet- toxische delen van het

toxine of niet- toxische vormen van het toxine, maar heeft wel antigene eigenschappen. Een voordeel

is dat het niet geïnactiveerd hoeft te worden door formol, waardoor de tertiaire structuur niet kan

aangetast worden. In eerdere studies werd reeds voor alfa toxine en epsilon toxine vastgesteld dat er

wel degelijk antistoffentiters werden bereikt met deze vaccins. Deze studies werden enkel in vitro

uitgevoerd. Daarom is er nog niet geweten of de vaccins in vivo effectief beschermen tegen

enterotoxemie (Goossens, 2016).

In een studie van Jiang et al. (2014) werd het C- domein van alfa toxine, bèta toxine en epsilon toxine

naar voren geschoven als mogelijke kandidaat voor de vaccinatie tegen enterotoxemie bij kalveren. Er

werd bewezen dat dit onderdeel van alfa, bèta en epsilon toxine veilig is. Bij inoculatie bij muizen was

er na 72 uur nog geen teken van ziekte of sterfte en ook na vier weken bleken de muizen nog

kerngezond. Bij inoculatie bij kalveren waren er geen reacties ter hoogte van de injectieplaats. In de

week na de injectie vertoonden de kalveren bovendien geen koorts, ademhalingsgeluiden of

abnormaal gedrag, waardoor kan besloten worden dat het veilig is. Wanneer de dieren voor het eerst

gevaccineerd werden, waren de antistoffentiters nog ondetecteerbaar of heel laag. Na meerdere

injecties werden de antistoffentiters wel significant hoger. Dit geldt voor zowel het C- domein van alfa,

bèta als epsilon toxine, waardoor ze alle drie als onderdeel van een vaccin tegen enterotoxemie

zouden kunnen gebruikt worden (Jiang et al., 2014). Goossens et al. (2016) heeft vervolgens

onderzocht in welke mate de antistoffen die geproduceerd worden bij de immunisatie met het C-

domein van alfa toxine beschermen tegen de endotheliale cytotoxiciteit van alfa toxine in vitro en

tegen de laesievorming in een darmlusmodel. De antistoffen tegen het C- domein van alfa toxine

bleken minder te beschermen tegen de cytotoxische eigenschappen van alfa toxine dan antistoffen

tegen alfa toxine. Dit zou te wijten kunnen zijn aan het GST (glutathion S- transferase) aanhangsel dat

aan het C- domein hangt ten gevolge van het proteïne zuiveringsproces. Een andere reden zou

19

kunnen zijn dat ook antistoffen tegen het N- domein van het alfa toxine nodig zijn om voldoende

bescherming te bieden. Bij gasgangreen bleken antistoffen tegen het N- domein echter niet effectief.

De reden hiervoor is dat het N- domein bij binding aan een celmembraan van conformatie veranderd,

waardoor de antistoffen niet meer werken. Beide delen in een vaccin gebruiken, is geen optie,

aangezien de toxische activiteit van alfa toxine hersteld wordt (Goossens et al. 2016).

Het gebruik van enkel het C- domein van het alfa toxine in vaccins is veelbelovend in de zin dat het

wel bescherming biedt, maar geen volledige bescherming. Daarom zullen ook andere toxines zoals

perfringolysine O of proteïnes van Clostridium perfringens in het vaccin moeten vervat zitten om

volledige bescherming te bieden tegen enterotoxemie. In een recent onderzoek van Verherstraeten et

al. (2016) werd perfringolysine O onderzocht als mogelijk onderdeel van een vaccin. In het

perfringolysine O werd een leucine vervangen door een aspartaat, waardoor het niet meer aan de

celmembraan kan binden en dus niet meer toxisch is. Het onderzoek toonde aan dat dit

perfringolysine O bij immunisatie neutraliserende antistoffen kan opwekken, waardoor het zijn werking

niet meer kan uitoefenen en dus nuttig kan zijn als onderdeel van een vaccin. Er werd daarnaast

gekeken of sera die antistoffen bevatten tegen GST- alfa toxine en tegen perfringolysine O in vitro

beschermen tegen de cytotoxische effecten van de toxines in een cultuur van boviene endotheliale

cellen. Verder onderzoek is echter nodig om na te gaan of het vaccin kalveren ook in vivo beschermt

tegen enterotoxemie (Verherstraeten et al., 2016).

Nog een opmerking die gegeven kan worden, is dat de immuniteit systemisch wordt opgewekt, terwijl

de infectie zich lokaal ter hoogte van darmen bevindt. Enterotoxemie veroorzaakt echter een

verhoogde vasculaire permeabilteit en beschadiging van de bloedvaten, waardoor de antistoffen

buiten de bloedbaan kunnen treden. Er is nog niet geweten in welke mate de antistoffen die

geproduceerd worden door de beschadigde darmwand kunnen infiltreren om de toxines in de darm te

neutraliseren. Het ontwikkelen van een vaccin tegen enterotoxemie vraagt daarom nog veel

onderzoek (Goossens et al., 2016; Verherstraeten et al., 2016).

20

PROBLEEMSTELLING EN DOELSTELLINGEN

De diagnose van enterotoxemie is nog steeds een pijnpunt bij de bestrijding van enterotoxemie. De

symptomen beperken zich tot acute sterfte zonder voorafgaande symptomen. Pneumonie kan ook

acute sterfte veroorzaken, waardoor dit niet als criterium kan gebruikt worden voor de diagnose van

enterotoxemie. Een autopsie kan vervolgens meer informatie geven over de doodsoorzaak. De letsels

(necrotische hemorragische enteritis) doen vaak vermoeden dat het om enterotoxemie gaat, maar ook

dit is niet pathognomonisch (Valgaeren et al., 2013b). Salmonellose kan immers dezelfde letsels

veroorzaken (Deprez, 2015).

Histologisch onderzoek kan een belangrijk hulmiddel zijn, aangezien de letsels vrijwel typisch zijn. Een

belangrijk kenmerk van enterotoxemie is echter een snel postmortaal verval. Hierdoor is het moeilijk

om epitheliale loslating door enterotoxemie te onderscheiden van postmortale loslating door verval

(Valgaeren et al., 2016).

Het aantonen van C. perfringens type A in darminhoud met bacteriologisch onderzoek of PCR heeft

geen diagnostische waarde, aangezien de kiem onderdeel is van de normale darmmicrobiota (Lebrun

et al., 2010). Het aantal kolonies in de darminhoud ter hoogte van de letsels werd initieel wel gebruikt

als criterium. Bij zoogkalveren werd gebruik gemaakt van een cut off waarde van 106-10

7 CFU voor de

diagnose van enterotoxemie (Deprez, 2015). Recent onderzoek van Valgaeren et al. (2013b) toont

echter aan dat er geen significant verschil is in het aantal CFU tussen kalveren gestorven aan

enterotoxemie en kalveren gestorven door een andere oorzaak. Binnen elke groep van enterotoxemie

en controle kalveren was er veel variatie in het aantal CFU dat werd teruggevonden en was er

bovendien veel overlap tussen beiden groepen. Dit kan verklaard worden door de snelle woekering

van C. perfringens na de dood en de moeilijke bewaring van de stalen.

Al deze methodes kunnen in combinatie enterotoxemie doen vermoeden. Geen enkele methode levert

op zichzelf een sluitend bewijs. Daarom wordt enterotoxemie vaak overgediagnosticeerd. De detectie

van alfa toxine aanwezig in de darminhoud kan eventueel meer inzicht geven, want logischerwijs

kunnen bij kalveren met enterotoxemie hoge concentraties aan alfa toxine worden teruggevonden. De

detectie van alfa toxine wordt echter als onbruikbaar bestempeld, aangezien alfa toxine in lage

hoeveelheden kan aanwezig zijn in darmen van gezonde dieren. C. perfringens is immers onderdeel

van de normale darmmicrobiota, waardoor de darminhoud met een gevoelige ELISA onterecht positief

zou kunnen testen (Uzal en Songer, 2008). Na de dood kan C. perfringens beginnen woekeren en alfa

toxine produceren, waardoor de concentratie snel kan stijgen. In de darminhoud bevinden zich echter

proteases zoals trypsine en chymotrypsine, die het alfa toxine kunnen afbreken, waardoor de

concentratie kan dalen (Verherstraeten et al., 2013; Valgaeren et al., 2016). In een onderzoek van

Ginter et al. (1996) werd evenwel aangetoond dat alfa toxine geproduceerd door C. perfringens

stammen geïsoleerd uit enterotoxemie gevallen resistenter is voor afbraak door chymotrypsine, in

tegenstelling tot alfa toxine afkomstig van isolaten uit gevallen van gasgangreen. In principe zou alfa

toxine dus minder afgebroken mogen worden, tenzij door andere proteases in de darminhoud.

21

Dit is onvoldoende bewezen en er is meer onderzoek nodig naar de detectie van alfa toxine als

diagnostische test voor enterotoxemie. In dit onderzoek wordt de aanzet gegeven door na te gaan of

alfa toxine in darminhoud kan gedetecteerd worden. Door darmlussen van geëuthanaseerde kalveren

te injecteren met alfa toxine en om de twee tot zes uur na de injectie stalen te nemen, zal de

postmortale intestinale stabiliteit van alfa toxine onderzocht worden. De detectie zal gebeuren met een

commerciële ELISA en een eigeel diffusie assay.

22

MATERIAAL EN METHODEN

1 HET ALFA TOXINE

In dit onderzoek werd fosfolipase C type I van C. perfringens (Sigma- Aldrich®, Saint Louis, Missouri,

Verenigde Staten) gebruikt. Het bestaat onder de vorm van een gevriesdroogd poeder dat 25 units per

flesje bevat en bewaard moet worden bij -20°C.

Voor gebruik wordt het poeder opgelost in 250 µl gedestilleerd water, zodat een concentratie van 0,1

U/µl wordt gevormd. Deze stockoplossing werd verder verdund in PBS tot een finale concentratie van

1 U/ml, 0,5 U/ml, 0,25 U/ml en 0,125 U/ml voor de optimalisatie- test. Om de intestinale stabiliteit van

alfa toxine na te gaan, werd 2 U/ml en 4 U/ml gebruikt. Om de resultaten van de eigeel diffusie assay

kwantitatief te kunnen beoordelen, werden verschillende concentraties van alfa toxine gebruikt om een

standaardcurve te maken (0,03 U/ml, 0,06 U/ml, 0,125 U/ml, 0,25 U/ml, 0,5 U/ml en 1 U/ml).

2 KALVEREN

Alle kalveren gebruikt in deze studie waren afkomstig van de dienst Inwendige Ziekten van de

Faculteit Diergeneeskunde in Merelbeke. Ze werden geëuthanaseerd voor diverse redenen. Voor het

bepalen van de hoeveelheid in te spuiten alfa toxine (optimalisatie- test) werd een Holsteinkalf van

twee maanden oud gebruikt. Het werd geëuthanaseerd omwille van chronische diarree die te wijten

was aan voederfouten.

Voor de test op de intestinale stabiliteit van alfa toxine werden drie BWB kalveren van één maand

gebruikt. Het eerste kalf had neonatal respiratory distress syndrome (NRDS) en kromme poten. Hij

werd geëuthanaseerd omwille van cachexie. Het tweede kalf werd geopereerd voor een

mesenteriumtorsie. Later bleek hij ook een navelontsteking te hebben, waarvoor hij eveneens werd

geopereerd. Niet veel later kreeg hij opnieuw een navelabces met een erge peritonitis. Daarom werd

beslist de behandeling stop te zetten. Het derde kalf had koliek door ileus. Na operatie kreeg het dier

peritonitis en tympanie. Hij leed veel pijn, waardoor werd overgegaan tot euthanasie. Op autopsie

werd een stenose van de darm ontdekt.

3 PROTOCOL

3.1 TEST VOOR DE OPTIMALE CONCENTRATIE ALFA TOXINE VOOR INJECTIE

Alfa toxine kan in de darmen afgebroken worden door enzymen, verdund worden in de darminhoud of

gebonden worden aan de darminhoud en het darmepitheel, waardoor een groot deel niet meer

beschikbaar is om te detecteren. Daarom werd in een eerste test nagegaan wat de optimale

concentratie van alfa toxine is, die kan gedetecteerd worden na incubatie in de darm.

Na euthanasie van het kalf werd een flankincisie gemaakt. Het jejunum werd uit de buikholte gehaald

en er werden vijf darmlussen van drie centimeter gemaakt op willekeurige plaatsen met hechtdraad

https://www.google.be/search?biw=1517&bih=708&q=St.+Louis&stick=H4sIAAAAAAAAAOPgE-LUz9U3sLC0SK5U4gAxzcoryrW0spOt9POL0hPzMqsSSzLz81A4VhmpiSmFpYlFJalFxQDMHhGVQwAAAA&sa=X&ved=0ahUKEwiQ0Zamrp7TAhUCVhQKHeimCeIQmxMIiwEoATAP

https://www.google.be/search?biw=1517&bih=708&q=St.+Louis&stick=H4sIAAAAAAAAAOPgE-LUz9U3sLC0SK5U4gAxzcoryrW0spOt9POL0hPzMqsSSzLz81A4VhmpiSmFpYlFJalFxQDMHhGVQwAAAA&sa=X&ved=0ahUKEwiQ0Zamrp7TAhUCVhQKHeimCeIQmxMIiwEoATAP

23

(Supramid® White, B. Braun Medical N.V., Diegem, België). Tussen elke lus werd ruimte gelaten om

lekkage van darminhoud van de ene darmlus naar de andere te vermijden. De lussen werden

geïnjecteerd met een naald van 26 G 1/2” RB (0,45 x 13mm) (Microlance®, BD Benelux N.V.,

Erembodegem, België). In de eerste lus werd 1 ml PBS geïnjecteerd ter controle. In de volgende lus

werd 1 ml van 0,125 U/ml alfa toxine geïnjecteerd, in de derde 1 ml van 0,250 U/ml alfa toxine, in de

vierde 1 ml van 0,5 U/ml alfa toxine en in de vijfde 1 ml van 1 U/ml alfa toxine (Figuur 6). De

darmlussen werden na injectie van alle lussen afgesneden en de darminhoud werd opgevangen in

gelabelde potjes. De stalen werden ingevroren tot -20°C.

3.2 TEST OP DE INTESTINALE STABILITEIT VAN ALFA TOXINE

Er werd getracht de test onmiddellijk na de euthanasie uit te voeren. Het eerste kalf lag echter reeds

een uur in de koelcel. Bij kalf 2 en 3 werd onmiddellijk na euthanasie gestart. Zoals bij de optimalisatie

werd eerst een flankincisie gemaakt en werd het jejunum vervolgens naar buiten gebracht. Daarna

werden negen darmlussen van ongeveer zes centimeter gemaakt met telkens drie centimeter tussen

elke lus. Er werd hiervoor dezelfde hechtdraad gebruikt als bij de optimalisatie- test. In drie lussen

werd 1 ml PBS geïnjecteerd ter controle, in drie 1 ml van 2 U/ml alfa toxine en in de overige drie 1 ml

van 4 U/ml alfa toxine (Figuur 7). De injectie gebeurde met eenzelfde type naald als bij de

optimalisatie- test. Dit veroorzaakt het minste trauma.

Bij de staalname werd afhankelijk van de totale hoeveelheid darminhoud 0,2-0,5 ml geaspireerd met

een naald van 21G 1 ½ ” RB (0,8 x 40 mm) (Microlance®, BD Benelux N.V., Erembodegem, België).

Een dikkere naald vergemakkelijkt de aspiratie van darminhoud. De stalen werden meteen ingevroren

Figuur 7: Model van de geïnjecteerde darmlussen voor de test op de

intestinale stabiliteit van alfa toxine.

Figuur 6: Model van de geïnjecteerde darmlussen voor de optimalisatie- test.

3 cm

6 cm

3 cm

24

tot -20°C. De eerste staalname werd vlak na de injectie van het alfa toxine uitgevoerd. Vervolgens

werd om de twee uur tot zes uur na de eerste staalname stalen genomen. Tussen elke staalname

werden de darmen weer terug in het abdomen geduwd. Bij kalf 3 werden na de laatste staalname (zes

uur na injectie) stukjes weefsel van elke darmlus genomen en met formaldehyde gefixeerd. Na 24 uur

werden de stukjes weefsel ingebed in paraffine en in dwarse sneden met een dikte van 5 µm

gesneden. Vervolgens werd een hematoxyline- eosinekleuring uitgevoerd. De histologische coupes

werden met een lichtmicroscoop beoordeeld en er werd gezocht naar de typische histologische letsels

die veroorzaakt worden door alfa toxine, zoals necrose van de darmvilli en bloedingen.

4 DETECTIE

Voor de detectie van alfa toxine in de darminhoud werden twee verschillende methodes toegepast. In

de eerste methode werd gebruik gemaakt van een commerciële ELISA. Daarnaast werd ook het

gebruik van een activiteits- assay nagegaan.

4.1 ELISA

De stalen werden onderzocht met een ELISA kit voor de detectie van C. perfringens alfa toxine (Bio K

289/2, Bio- X Diagnostics®, Jemelle, België). Het is een sandwich ELISA die geschikt is voor zowel

cultuur supernatants als biologische vloeistoffen van alle diersoorten. De kit bevat een

microtitratieplaat. De helft van de welletjes is gecoat met polyclonale antistoffen tegen het alfa toxine.

De andere helft is gecoat met niet- specifieke antistoffen. Deze rijen worden gebruikt ter controle van

niet- specifieke bindingen.

Elk staal darminhoud moet eerst verdund worden met verdunningsbuffer. Van het verdunde darmstaal

wordt telkens 100 µl gepipetteerd in een welletje gecoat met polyclonale antistoffen tegen het alfa

toxine en in een welletje gecoat met niet- specifieke antistoffen. Er wordt eveneens controle antigeen

gepipetteerd in welletjes als positieve controle. De plaat wordt afgedekt en bij kamertemperatuur

geïncubeerd gedurende een uur. Tijdens de incubatie kan het vrije alfa toxine in de darminhoud

binden aan de gecoate antistoffen in het welletje.

Na een uur incubatie wordt de microtiterplaat driemaal gewassen. Bij dit wasproces wordt niet-

gebonden alfa toxine en overbodige darminhoud weggewassen. Vervolgens wordt de conjugaat

oplossing aan elke wel toegevoegd. Dit conjugaat bestaat uit monoclonale antistoffen die gelabeld zijn

met peroxidase. De plaat wordt opnieuw afgedekt en bij kamertemperatuur geïncubeerd gedurende

een uur. Tijdens de incubatie binden de gelabelde antistoffen aan het alfa toxine dat reeds gebonden

is aan de antistoffen in de welletjes. De plaat moet na een uur opnieuw driemaal gewassen worden

om het overbodig conjugaat dat niet gebonden is aan het alfa toxine weg te wassen.

Ten slotte wordt het chromogeen aan elke wel toegevoegd. Dit chromogeen is tetramethylbenzidine

(TMB) dat door het peroxidase van het conjugaat wordt geperoxideerd, waardoor de kleur van

kleurloos naar blauw veranderd. De plaat wordt daarna bij kamertemperatuur afgeschermd van het

licht. Afhankelijk van de snelheid van de reactie wordt na ongeveer tien minuten stopvloeistof

toegevoegd. De stopvloeistof bevat fosforzuur en zet de peroxidatie van TMB stop, waarna het van

25

blauw naar geel verkleurt. De resultaten kunnen afgelezen worden met een spectrofotometer met een

filter van 450 nm. Dit moet zo snel mogelijk na het toevoegen van de stopvloeistof gebeuren.

Met de spectrofotometer wordt de optische densiteit van elk welletje gemeten. De volgende formule

wordt gebruikt om te bepalen of het resultaat positief of negatief is:

D staal D ctl niet specifieke bindingen

D positieve ctl D ctl niet specifieke bindingen x 100

Als het percentage hoger is dan 7%, wordt het staal als positief beschouwd. De validiteit van de ELISA

wordt bepaald door te kijken naar de gecorrigeerde optische densiteit van de positieve controle. Als

deze zich boven 1,106 bevindt, dan is de ELISA valide.

4.2 EIGEEL DIFFUSIE ASSAY

Naast het gebruik van ELISA, kan de hoeveelheid alfa toxine in de darminhoud ook bepaald worden

door de alfa toxine activiteit te meten. Hiervoor werd de lecithinase activiteit nagegaan in een eigeel

diffusie assay. Er werden welletjes gemaakt in Columbia agar platen gesupplementeerd met 2%

eigeel. Eigeel bevat lecithine (fosfatidylcholine) dat door alfa toxine wordt afgebroken. Hierbij wordt

onoplosbaar diacylglycerol gevormd dat een opake cirkel rond de welletjes vormt. De diameter van de

cirkel geeft de relatieve alfa toxine activiteit weer.

In een eerste test werd 20 µl van verschillende concentraties van alfa toxine in de welletjes

gepipetteerd (1 U/ml, 0,5 U/ml, 0,25 U/ml, 0,125 U/ml, 0,06 U/ml en 0,03 U/ml) om een

standaardcurve te kunnen maken. Van de darminhoud uit de optimalisatie- test en de test op de

intestinale stabiliteit van alfa toxine werd eveneens 20 µl van elk staal in een welletje gepipetteerd. Dit

werd telkens in tweevoud gedaan. Na 24 uur incubatie bij 37°C werden de platen ingescand met een

GS-800 Calibrated Densitometer (Bio- Rad Laboratories®, Nazareth Eke, België). De diameter van de

cirkels werd gemeten met behulp van Quantity One 1-D analyse software (Bio- Rad Laboratories®,

Nazareth Eke, België).

5 STATISTISCHE ANALYSE

Per concentratie alfa toxine werd het verschil in alfa toxine activiteit tussen nul, twee, vier en zes uur

incubatie bepaald met behulp van de Friedman test voor gepaarde observaties. Daarnaast werd per

concentratie alfa toxine de correlatie tussen de incubatietijd en de alfa toxine activiteit bepaald met

behulp van de Spearmans rangcorrelatiecoëfficiënt. Er werd voor de berekeningen gebruik gemaakt

van GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, VSA), waarbij gewerkt werd met een

significantieniveau van α= 0,05.

26

RESULTATEN

1 TEST VOOR DE OPTIMALE CONCENTRATIE ALFA TOXINE VOOR INJECTIE

Om de optimale concentratie van alfa toxine voor gebruik bij volgende experimenten te bepalen,

werden verschillende concentraties van alfa toxine (1 U/ml, 0,5 U/ml, 0,25 U/ml, 0,125 U/ml en 0 U/ml)

in darmlussen geïnjecteerd en getest met een commerciële ELISA en een eigeel diffusie assay. Op

ELISA testte enkel de darminhoud van de lussen die geïnjecteerd werden met 0,250 U/ml en 1 U/ml

positief op alfa toxine (>7%) (Tabel 2). De darminhoud met 1 U/ml alfa toxine was bovendien maar net

positief. De validiteit van de ELISA is in orde, aangezien de gecorrigeerde optische densiteit van de

positieve controle 1,945 bedraagt, wat hoger is dan 1,106.

Tabel 2: De detectie van alfa toxine met behulp van ELISA in de stalen van de optimalisatie- test. De percentages geven de aan- of afwezigheid van alfa toxine weer (>7% = positief (+), <7% = negatief (-)).

Vervolgens werd de activiteit van alfa toxine in dezelfde darminhoud getest met een eigeel diffusie

assay. Door verschillende concentraties van alfa toxine (0,03 U/ml, 0,06 U/ml, 0,125 U/ml, 0,25 U/ml,

0,5 U/ml en 1 U/ml) te pipetteren in de welletjes van de eigeelplaat (Figuur 8A) werd een poging

ondernomen om een standaardcurve te maken. Op die manier zouden de resultaten van de testen

kwantitatief beoordeeld kunnen worden. Darminhoud heeft echter een kleur in tegenstelling tot de

verschillende concentraties van alfa toxine voor de standaardcurve. De kleur beïnvloedt de resultaten.

Daarom kunnen de resultaten van de concentraties voor de standaardcurve niet vergeleken worden

met de resultaten van de darmstalen. Een kwantitatieve beoordeling is dus niet mogelijk. Volgens de

standaardcurve kan er wel van uitgegaan worden dat naargelang de cirkels groter zijn, de activiteit

van alfa toxine hoger is in een staal (r2= 0,9631) (Figuur 9).

U/ml

Resultaat

(%)

Positief

als

>7%

0 (PBS) 0,0 3 0,088

2,028 0,083 x 100 -0,771 -

0,125 0,123 0,0 3

2,028 0,083 x 100 2,571 -

0,250 0,463 0,064

2,028 0,083 x 100 20,514 +

0,5 0,103 0,065

2,028 0,083 x 100 1,954 -

1 0,21 0,066

2,028 0,083 x 100 7,763 +

Positieve

ctl

2,028 0,083

2,028 0,083 x 100 100 +

27

Op de scan van de eigeelplaat van de test voor optimalisatie (Figuur 8B) werd een zeer lichte reactie

bij de stalen van de darmlussen geïnjecteerd met 1 U/ml en 0,5 U/ml alfa toxine vastgesteld. Dit is een

ander resultaat dan de ELISA, waar een positief resultaat werd geregistreerd bij de darmlussen

geïnjecteerd met 1 U/ml en 0,25 U/ml alfa toxine.

De ELISA en de eigeel diffusie assay lijken aan te tonen dat een groot deel van het alfa toxine

afgebroken wordt door enzymen in de darm of gebonden wordt aan de darminhoud en het

darmepitheel. Om zeker een positief staal te verkrijgen op tijdstip nul na injectie, werd daarom in

verdere experimenten een hogere concentratie alfa toxine geïnjecteerd (2 U/ml en 4 U/ml).

Figuur 9: De relatieve alfa toxine activiteit van verschillende concentraties van alfa toxine (0,03; 0,06; 0,125;

0,25; 0,5 en 1 U/ml).

Figuur 8: Scan van de eigeelplaten na 24 uur incubatie bij 37°C van de optimalisatie- test. A) Het

resultaat in tweevoud (1&2) van de verschillende concentraties alfa toxine (1 U/ml, 0,5 U/ml, 0,25 U/ml, 0,125 U/ml, 0,06 U/ml en 0,03 U/ml) voor een standaardcurve. B) Het resultaat in tweevoud (1&2) van darminhoud uit de optimalisatie- test (S1: 1 U/ml, S2: 0,5 U/ml, S3: 0,25 U/ml, S4: 0,125 U/ml, S5: PBS).

A1 A2

B1 B2

28

2 TEST OP DE INTESTINALE STABILITEIT VAN ALFA TOXINE

2.1 INVLOED VAN INCUBATIE OP DE KLEUR VAN DARMINHOUD

Bij aspiratie van de darminhoud was duidelijk merkbaar dat de darminhoud van de darmlussen waarin

alfa toxine werd geïnjecteerd na verloop van tijd rood verkleurde (Figuur 10). De darminhoud van de

lussen waarin enkel PBS werd geïnjecteerd bleef geel tot oranje. Bovendien gebeurde de verkleuring

sneller bij de lussen geïnjecteerd met 4 U/ml alfa toxine dan bij de lussen met 2 U/ml. Dit wijst op meer

bloedvermenging naarmate er meer alfa toxine aanwezig is in de lussen en naarmate het alfa toxine

langer kan inwerken.

2.2 NECROSE VAN DE DARMVILLI DOOR ALFA TOXINE

Door de bloederige verkleuring van de darminhoud werd vermoed dat het alfa toxine schade

veroorzaakt aan de darmvilli en het endotheel van de bloedvaten. Op histologie van de darmlussen

van kalf 3 werd op zowel de coupes van de darmlussen geïnjecteerd met PBS als de coupes van de

darmlussen geïnjecteerd met 2 U/ml of 4 U/ml afwezigheid van het oppervlakkig darmepitheel

waargenomen (Figuur 11). Dit is een typisch beeld van postmortaal verval. Op de coupes van

darmlussen geïnjecteerd met alfa toxine is daarnaast necrose van de darmvilli op te merken. De

necrose van de lamina propria is bovendien erger bij lussen geïnjecteerd met 4 U/ml alfa toxine dan bij

lussen geïnjecteerd met 2 U/ml alfa toxine. De necrose van de darmvilli werd niet waargenomen bij

coupes van lussen geïnjecteerd met PBS. Deze letsels zijn daarom waarschijnlijk het gevolg van de

inwerking van alfa toxine.

Figuur 10: Macroscopische beoordeling van de darminhoud van kalf 1. A) Darminhoud van een lus 0, 2, 4 en 6

uur na injectie met PBS. B) Darminhoud van een lus 0, 2, 4 en 6 uur na injectie met 2 U/ml alfa toxine. C) Darminhoud van een lus 0, 2, 4 en 6 uur na injectie met 4 U/ml alfa toxine.

A

0 u 2 u 4 u 6 u

B

0 u

2 u

4 u

6 u

C

0 u

2 u

4 u

6 u

29

PBS 2 U/ml 4 U/ml

30

PBS 2 U/ml

2 U/ml

4 U/ml

4 U/ml

Figuur 11: Histologische coupes van de dunne darmlussen van kalf 3 zes uur na injectie van PBS, 2 U/ml en 4 U/ml alfa toxine. PBS: Volledige afwezigheid van het

darmepitheel. 2 U/ml: Volledige afwezigheid van het darmepitheel met necrose van de darmvilli. 4 U/ml: Volledige afwezigheid van het darmepitheel met necrose van de darmvilli.

31

2.3 INTESTINALE STABILITEIT VAN ALFA TOXINE

De intestinale stabiliteit van alfa toxine werd nagegaan door darmlussen te injecteren met PBS, 2 U/ml

of 4U/ml alfa toxine en de aanwezigheid van alfa toxine te testen om de twee uur tot zes uur na

injectie met een commerciële ELISA of eigeel diffusie assay.

Eerst zullen de resultaten van de ELISA worden besproken. Elk staal afkomstig van een darmlus dat

geïnjecteerd werd met PBS is negatief (Tabel 3, 4 en 5). Ook tijdens de uren na injectie blijft het

resultaat negatief. In tabel 3 wordt per darmlus en per tijd na injectie van alfa toxine het resultaat voor

kalf 1 weergegeven. De resultaten van de lussen die geïnjecteerd werden met 2 U/ml en 4 U/ml, zijn

allemaal meer dan positief (plateau) (Tabel 3). De ELISA was valide (2,518>1,106). Initieel werd

gedacht dat de stopvloeistof te laat werd toegevoegd, maar bij de ELISA van kalf 2 en 3 werd duidelijk

dat de welletjes met de stalen van de darmlussen geïnjecteerd met alfa toxine veel sneller

aankleurden dan de positieve controle. Hierdoor werd de stopvloeistof vroeger toegevoegd, waardoor

de ELISA niet valide is (0,169 voor kalf 1 en 0,283 voor kalf 3 <1,106). De optische densiteiten van de

stalen waren veel hoger dan de positieve controle (tabel 4 en 5). Indien de stopvloeistof later zou

worden toegediend, zou hetzelfde resultaat bereikt worden als bij kalf 1. Dit doet vermoeden dat de

stalen meer alfa toxine bevatten dan de positieve controle. Hierdoor kan met ELISA niet nagegaan

worden of de concentratie van het alfa toxine daalt na verloop van tijd. Aan de hand van verdunningen

van de stalen zou dit kunnen onderzocht worden, maar door een gebrek aan tijd werd dit niet meer

uitgevoerd.

32

Tabel 3: De detectie van alfa toxine met behulp van ELISA in de darmlussen geïnjecteerd met PBS, 2 U/ml of 4

U/ml alfa toxine 0, 2,4 en 6 uur na injectie bij kalf 1. De percentages geven de aan- of afwezigheid van alfa toxine weer (>7% = positief (+), <7% = negatief (-)).

Darmlus 0 u na injectie 2 u na injectie 4 u na injectie 6 u na injectie

1

(PBS)

-0,238% (-)

4,170% (-)

-0,119% (-)

0,119% (-)

2

(2 U/ml)

108,141% (+)

102,900% (+) 108, 419% (+)

110,365% (+)

3

(4 U/ml)

115,052% (+)

109,452% (+)

117,514% (+)

115,330% (+)

4

(PBS)

0,635% (-)

-0,278% (-)

0,040% (-)

-0,040% (-)

5

(2 U/ml)

108,697% (+)

107,943% (+)

126,092% (+)

116,283% (+)

6

(4 U/ml)

114,893% (+)

115,290% (+)

113,026% (+)

109,889% (+)

7

(PBS)

0,119% (-)

0,635% (-)

0,040% (-)

-0,119% (-)

8

(2 U/ml)

109,095% (+)

104,210% (+) 103,813% (+)

105,719% (+)

9

(4 U/ml)

110,882% (+)

107,466% (+)

110,683% (+)

104,329% (+)

33

Tabel 4: De detectie van alfa toxine met behulp van ELISA in darmlussen geïnjecteerd met PBS, 2 U/ml of 4 U/ml

alfa toxine na 0, 2,4 en 6 uur incubatie bij kalf 2. De optische densiteiten worden weergegeven per darmlus en per tijdstip. Tussen haakjes wordt de optische densiteit van de controle voor aspecifieke bindingen vermeld. De optische densiteit van de positieve controle wordt eveneens gerapporteerd.

Darmlus 0 u 2 u 4 u 6 u

1

(PBS)

0,053

(0,055)

0,047

(0,051)

0,054

(0,056)

0,054

(0,087)

2

(2 U/ml)

0,912

(0,056)

0,796

(0,05)

0,826

(0,069)

0,74

(0,065)

3

(4 U/ml)

0,963

(0,061)

0,961

(0,06)

0,819

(0,062)

0,843

(0,053)

4

(PBS)

0,049

(0,053)

0,05

(0,051)

0,049

(0,054)

0,071

(0,053)

5

(2 U/ml)

0,871

(0,053)

0,701

(0,059)

0,683

(0,056)

0,585

(0,057)

6

(4 U/ml)

0,92

(0,063)

0,868

(0,061)

0,858

(0,056)

0,834

(0,066)

7

(PBS)

0,047

(0,054)

0,05

(0,056)

0,052

(0,053)

0,055

(0,051)

8

(2 U/ml)

0,806

(0,062)

0,749

(0,055)

0,65

(0,059)

0,736

(0,052)

9

(4 U/ml)

0,923

(0,083)

0,891

(0,077)

0,866

(0,061)

0,901

(0,068)

Positieve ctl 0,224

(0,055)

34

Tabel 5: De detectie van alfa toxine met behulp van ELISA in darmlussen geïnjecteerd met PBS, 2 U/ml of 4 U/ml

alfa toxine na 0, 2,4 en 6 uur incubatie bij kalf 3. De optische densiteiten worden weergegeven per darmlus en per tijdstip. Tussen haakjes wordt de optische densiteit van de controle voor aspecifieke bindingen vermeld. De optische densiteit van de positieve controle wordt eveneens gerapporteerd.

Darmlus 0 u 2 u 4 u 6 u

1

(PBS)

0,056

(0,056)

0,053

(0,057)

0,049

(0,049)

0,047

(0,054)

2

(2 U/ml)

0,69

(0,056)

0,791

(0,053)

0,71

(0,052

0,643

(0,058)

3

(4 U/ml)

0,689

(0,059)

0,751

(0,057)

0,622

(0,055)

0,598

(0,066)

4

(PBS)

0,06

(0,063)

0,057

(0,055)

0,054

(0,057)

0,057

(0,058)

5

(2 U/ml)

0,68

(0,055)

0,668

(0,059)

0,62

(0,062)

0,512

(0,062)

6

(4 U/ml)

0,652

(0,058)

0,753

(0,063)

0,501

(0,066)

0,655

(0,065)

7

(PBS)

0,046

(0,047)

0,046

(0,044)

0,047

(0,046)

0,047

(0,05)

8

(2 U/ml)

0,662

(0,053)

0,44

(0,046)

0,66

(0,05)

0,594

(0,053)

9

(4 U/ml)

0,76

(0,049)

0,687

(0,047)

0,648

(0,048)

0,552

(0,051)

Positieve ctl 0,338

(0,055)

35

De activiteit van alfa toxine in darminhoud van de verschillende darmlussen werd naast de ELISA ook

onderzocht met een eigeel diffusie assay. In figuur 12 wordt een voorbeeld weergegeven van de

eigeelplaten na 24 uur incubatie bij 37°C. Er wordt geen activiteit van alfa toxine waargenomen bij

stalen van darmlussen geïnjecteerd met PBS (L1, L4 en L7). Bij stalen van darmlussen geïnjecteerd

met alfa toxine (L2, L3, L5, L6, L8 en L9) wordt wel activiteit van alfa toxine onder de vorm van opake

cirkels geconstateerd.

Figuur 12: Scan van de eigeelplaten van kalf 1 na 24 uur incubatie bij 37°C. L1, L4 en L7 = stalen van

darmlussen geïnjecteerd met PBS. L2, L5 en L8 = stalen van darmlussen geïnjecteerd met 2 U/ml alfa toxine. L3, L6 en L9 = stalen van darmlussen geïnjecteerd met 4 U/ml alfa toxine. T0 = 0 uur, T1= 2 uur, T2 = 4 uur en T3 = 6 uur na injectie.

De relatieve activiteit van alfa toxine werd per tijdstip uitgezet op een grafiek (Figuur 13, 14 en 15).

Hierbij werd onderscheid gemaakt tussen stalen afkomstig van darmlussen geïnjecteerd met PBS, 2

U/ml of 4 U/ml alfa toxine. Bij geen enkel kalf werd activiteit van alfa toxine gedetecteerd in

darminhoud van darmlussen geïnjecteerd met PBS. Bij kalf 1 kan er tot en met zes uur na injectie

activiteit van alfa toxine waargenomen worden in de darminhoud van de darmlussen geïnjecteerd met

alfa toxine (Figuur 13). Bij kalf 2 en 3 treedt daarentegen na vier uur meer variatie op in het al dan niet

detecteren van activiteit van alfa toxine in stalen van lussen geïnjecteerd met 2 U/ml en 4 U/ml (Figuur

14 en 15). Na zes uur wordt in dezelfde darminhoud geen activiteit van alfa toxine meer

teruggevonden. Op basis van de eigeel diffusie assay kan daarom besloten worden dat de activiteit

van alfa toxine twee uur na injectie aanzienlijk vermindert en na vier uur in sommige gevallen reeds

afwezig is.

36

In tabel 6 worden de correlaties tussen de incubatietijd en de activiteit van alfa toxine in darminhoud

van lussen geïnjecteerd met 2 U/ml of 4 U/ml per kalf weergegeven. In alle gevallen is er een

negatieve correlatie. Dit betekent concreet dat naargelang de tijd verstrijkt, de activiteit van alfa toxine

daalt. Aan de hand van een Friedman test van kalf 1 kan echter enkel tussen de resultaten van nul en

zes uur na injectie van 2 U/ml alfa toxine een significant verschil aangetoond worden (P<0,05) (Figuur

13). Bij kalf 2 en 3 doet zich enkel een significant verschil voor tussen de resultaten van nul en zes uur

na injectie van 4 U/ml alfa toxine (P<0,05) (Figuur 14 en 15). De reden dat er tussen andere

tijdstippen geen significant verschil kan aangetoond worden ondanks de negatieve correlatie tussen

de incubatietijd en de activiteit van alfa toxine is waarschijnlijk te wijten aan het kleine aantal

darmlussen per groep.

Figuur 13: Relatieve activiteit van alfa toxine in darminhoud van kalf 1 na 0, 2, 4 en 6 uur incubatie. De

darmlussen werden geïnjecteerd met PBS (n=3), 2 U/ml (n=3) of 4 U/ml (n=3) alfa toxine (* P<0,05).



37



Tabel 6: De correlatie tussen de incubatietijd en de activiteit van alfa toxine in darminhoud. De Spearmans rangcorrelatiecoëfficiënt (ρ) wordt per concentratie geïnjecteerd alfa toxine (2 U/ml of 4 U/ml) en per kalf weergegeven met het 95% betrouwbaarheidsinterval (** P<0,01,*** P<0,001). Een Spearmans rangcorrelatiecoëfficiënt tussen 0 en 1 wijst op een positieve correlatie, waarbij 1 een perfect positieve correlatie aantoont. Een Spearmans rangcorrelatiecoëfficiënt tussen 0 en -1 wijst op een negatieve correlatie, waarbij -1 een perfect negatieve correlatie aantoont.

2 U/ml 4 U/ml

Kalf 1 ρ= -0,8017** ρ= -0,8003**

95% Betrouwbaarheidsinterval -0.9443 to -0.4058 -0.9439 to -0.4025

Kalf 2 ρ= -0,9403*** ρ= -0,9578***


Kalf 3 ρ= -0,9403*** ρ= -0,9785***


38

DISCUSSIE

Enterotoxemie bij kalveren is een ziekte die acute sterfte op het einde van de opfok veroorzaakt.

Voornamelijk in de witvleeskalverensector leidt dit tot economische verliezen. Als etiologisch agens

wordt C. perfringens Type A aangeduid. Deze kiem produceert verschillende toxines en enzymen die

schade kunnen veroorzaken aan de darmen. Daarbij is alfa toxine waarschijnlijk de belangrijkste

speler in de pathogenese. De diagnose van enterotoxemie is een pijnpunt, aangezien geen enkele

methode een sluitend bewijs vormt (Valgaeren et al., 2016).

1 WAARDE VAN DE DETECTIE VAN ALFA TOXINE IN DE DIAGNOSTIEK

De detectie van alfa toxine zou meer duidelijkheid kunnen brengen, maar werd tot nu toe als

onbruikbaar bestempeld, aangezien C. perfringens onderdeel is van de normale darmmicrobiota en de

postmortale woekering van C. perfringens gepaard zou gaan met de productie van alfa toxine (Uzal en

Songer, 2008; Valgaeren et al., 2016). Er werd daarom verondersteld dat alfa toxine in lage

hoeveelheden kan aanwezig zijn in darmen van gezonde dieren. Deze lage hoeveelheid zou

vervolgens kunnen gedetecteerd worden met een gevoelige ELISA en een vals positief resultaat

geven (Uzal en Songer, 2008). Daarnaast kan alfa toxine afgebroken worden proteases in de

darminhoud, waardoor het na verloop van tijd niet meer gedetecteerd zou kunnen worden (Valgaeren

et al., 2016). De detectie van alfa toxine als diagnostische middel voor enterotoxemie werd echter

onvoldoende onderzocht. In dit onderzoek werd de eerste stap gezet door de postmortale intestinale

stabiliteit van alfa toxine te onderzoeken.

Bij de drie kalveren die in dit onderzoek werden gebruikt, kon zowel met de ELISA als met de eigeel

diffusie assay geen alfa toxine gedetecteerd worden in darminhoud van darmlussen die met PBS

werden geïnjecteerd. Ook zes uur na de injectie bleven de stalen negatief. Een reden kan zijn dat de

darminhoud verdund werd door PBS. C. perfringens is onderdeel van de darmmicrobiota en kan na de

dood woekeren en alfa toxine produceren. Hierdoor zou het alfa toxine opnieuw moeten concentreren,

aangezien er om de twee uur stalen worden genomen. De jongere leeftijd (1 maand) van de kalveren

in vergelijking met de leeftijd waarop enterotoxemie voorkomt, kan een andere reden zijn dat er geen

alfa toxine wordt gedetecteerd in lussen geïnjecteerd met PBS. Misschien is C. perfringens zo vroeg

nog geen onderdeel van de darmmicrobiota. De studie van Mayer et al. (2012) stelt echter dat de

darm binnen 24 tot 48 uur na de geboorte wordt gekoloniseerd door Clostridium spp. en het is bekend

dat C. perfringens hemorragische enteritis kan veroorzaken bij neonatale kalveren (Uzal et al., 2014).

Hierdoor kan verondersteld worden dat C. perfringens in kalveren zonder enterotoxemie waarschijnlijk

geen of zeer lage hoeveelheden alfa toxine produceert die zelfs niet door de gevoelige ELISA kunnen

gedetecteerd worden. Een andere verklaring kan zijn dat er wel productie is, maar dat de afbraak door

proteases in de darminhoud hoger is. Deze bevinding kan een indicatie zijn dat alfa toxine wel

bruikbaar is voor de diagnose van enterotoxemie.

De resultaten van de eigeel diffusie assay geven een negatieve correlatie weer tussen de incubatietijd

en de alfa toxine activiteit in de darminhoud van lussen geïnjecteerd met alfa toxine. Met de Friedman

test werd een significant verschil aangetoond tussen de alfa toxine activiteit na nul en zes uur

39

incubatie. Op de grafieken (Figuur 13, 14 en 15) werd een duidelijke daling van de relatieve alfa toxine

activiteit waargenomen naarmate de tijd na injectie stijgt. Na vier uur ontstond bij kalf 2 en 3 reeds

variatie in het al dan niet detecteren van alfa toxine activiteit. Bij kalf 1 kon echter na zes uur nog alfa

toxine activiteit teruggevonden worden. De verklaring hiervoor is waarschijnlijk dat kalf 1 de dagen

voor de euthanasie anorectisch was en daarom minder darminhoud had dan de andere kalveren.

Hierdoor werd het alfa toxine minder verdund en kon het daarom langer gedetecteerd worden. Bij

enterotoxemie worden meestal de best drinkende kalveren getroffen, waardoor de resultaten van kalf

2 en 3 meer representatief zijn. Er mag verondersteld worden dat de opake cirkels wel degelijk

veroorzaakt worden door afbraak van lecithine door alfa toxine en niet door andere lecithinases in de

darminhoud, aangezien de controle van darminhoud geïnjecteerd met PBS negatief is. Of de daling

van de detectie van alfa toxine ook waar te nemen is met de ELISA, kan niet met zekerheid gezegd

worden, doordat de optische densiteiten van de stalen hoger waren dan de optische densiteit van de

positieve controle. Hiervoor moeten verdunningen van de darmstalen opnieuw getest worden of moet

de proef herhaald worden met een lagere concentratie van alfa toxine. De daling van de detectie van

alfa toxine geeft een indicatie dat staalname bij enterotoxemie gevallen waarschijnlijk snel (binnen

twee uur) na de dood zal moet gebeuren om alfa toxine nog te kunnen detecteren.

2 NECROSE VAN DE DARMVILLI IN DE DIAGNOSTIEK

Bij gevallen van acute sterfte bij kalveren wordt vaak door autopsie en histologie van de aangetaste

weefsels beoordeeld of het om enterotoxemie gaat. In dit onderzoek kon aangetoond worden dat

onder invloed van alfa toxine de darminhoud zoals bij enterotoxemie bloederig wordt (Valgaeren et al.,

2016). Op histologie van de weefsels van darmlussen (zes uur na injectie) was bij zowel de lussen

geïnjecteerd met PBS als de lussen geïnjecteerd met alfa toxine het oppervlakkig darmepitheel

verdwenen. Deze afwezigheid is typisch te wijten aan postmortaal verval. Darmweefsel van lussen

geïnjecteerd met alfa toxine vertoonden daarnaast necrose van de darmvilli die erger was bij lussen

geïnjecteerd met 4U/ml dan met 2 U/ml. De necrose is waarschijnlijk te wijten aan de inwerking van

alfa toxine en wordt eveneens waargenomen bij gevallen van enterotoxemie (Lebrun et al., 2010;

Goossens et al., 2017).

Door injectie van alfa toxine werden min of meer dezelfde macroscopische en microscopische

bevindingen opgewekt als bij enterotoxemie. Dit bevestigt nogmaals de belangrijke rol van alfa toxine

in de pathogenese. Dit toont eveneens aan dat autopsie en histologisch onderzoek een belangrijke

indicatie kunnen geven van enterotoxemie. Loslating van het epitheel is echter geen criterium voor

enterotoxemie, aangezien dit typisch te wijten is aan postmortaal verval. De bevindingen zijn

daarnaast op zichzelf niet pathognomonisch, dus een combinatie van de verschillende bevindingen is

nodig om enterotoxemie te kunnen vermoeden. De detectie van alfa toxine kan later misschien

toegevoegd worden als sluitend bewijs.

40

3 OPMERKINGEN BIJ HET ONDERZOEK

Bij de optimalisatie- test was een verschil op te merken in detectie van alfa toxine tussen de ELISA en

eigeel diffusie assay. Bij de ELISA kon enkel in de lussen geïnjecteerd met 0,25 en 1 U/ml alfa toxine

gedetecteerd worden. Bij de eigeel diffusie assay testte de lus geïnjecteerd met 0,5 en 1 U/ml licht

positief. Dit verschil kan verklaard worden doordat de lus geïnjecteerd met 0,5 U/ml alfa toxine meer

darminhoud bevatte dan de andere darmlussen, waardoor het alfa toxine waarschijnlijk te veel

verdund werd en het staal negatief testte op ELISA. Een reden waarom alfa toxine in darmlussen

geïnjecteerd met 0,25 U/ml wel te detecteren was met ELISA en niet met de eigeel diffusie assay, kan

zijn omdat de ELISA test op de aanwezigheid van een (deel van het) antigeen, terwijl de eigeel

diffusie assay test op de activiteit van alfa toxine. Als alfa toxine afgebroken wordt door chymotrypsine

kan een onderdeel eventueel wel gedetecteerd worden door de ELISA, maar heeft het geen activiteit

meer.

Aan de hand van de resultaten van de optimalisatie- test werd besloten om een aanzienlijk hogere

concentratie van alfa toxine te injecteren bij de test op de intestinale stabiliteit van alfa toxine. Echter

de diameter van de opake cirkel bij de eigeel diffusie assay van de lus geïnjecteerd met 1 U/ml alfa

toxine van de optimalisatie- test is veel kleiner en niet in verhouding met de diameters van de opake

cirkels van de lussen geïnjecteerd met 2 U/ml alfa toxine. Dit kan te wijten zijn aan het verschil in type

kalveren die werden gebruikt bij beide testen. Misschien heeft het ras, de leeftijd of diarree een

invloed op de activiteit van alfa toxine in de darminhoud, waardoor deze verschillen in diameter

aanwezig waren en er onterecht te veel alfa toxine werd ingespoten.

Er moet opgemerkt worden dat de afkomst van het alfa toxine dat gebruikt werd niet geweten is.

Ginter et al. (1996) heeft aangetoond dat isolaten van enterotoxemie gevallen een alfa toxine variant

produceren die minder gevoelig is voor afbraak door chymotrypsine dan alfa toxine geproduceerd

door gasgangreen isolaten. Als het alfa toxine in dit onderzoek afkomstig is van enterotoxemie

isolaten dan kon er wel afbraak van alfa toxine door chymotrypsine of andere proteases opgemerkt

worden. Als het alfa toxine afkomstig is van isolaten van gasgangreen, dan kan er geen uitspraak

gedaan worden over de postmortale intestinale stabiliteit van alfa toxine in het kader van de diagnose

van enterotoxemie. Alfa toxine bij gasgangreen is immers gevoeliger voor afbraak door chymotrypsine

in de darminhoud. Het zou dus kunnen dat alfa toxine bij gevallen van enterotoxemie wel langer te

detecteren is.

Een andere bedenking is dat er niet geweten is hoeveel alfa toxine aanwezig is in darminhoud van

gevallen van enterotoxemie. Er is wel een indicatie van de hoeveelheid alfa toxine dat C. perfringens

type A in vitro produceert. Afhankelijk van de cultuur condities (pH) en de stam worden hoeveelheden

van 11-15 U/ml tot minder dan 0,2 U/ml teruggevonden (Möllby et al., 1976). In een onderzoek van

Goossens et al. (2016) werd gewerkt met een stam dat slechts 0,031392 U/ml alfa toxine

produceerde. Deze hoeveelheden zijn lager dan de hoeveelheid alfa toxine die in dit onderzoek werd

gebruikt en als dit ook effectief zo is in vivo dan kan bij een geval van enterotoxemie het alfa toxine

sneller niet meer detecteerbaar zijn. In deze onderzoeken waren de stammen echter geïsoleerd uit

gevallen van gasgangreen (Möllby et al., 1976; Goossens et al., 2016). Stammen geïsoleerd uit

41

enterotoxemie gevallen produceren misschien meer alfa toxine. Anderzijds kan in klinische gevallen

van enterotoxemie de productie opgereguleerd worden, waardoor de productie hoger is in vivo dan in

vitro. Er is nog geen onderzoek dat dit uitwijst. Meer onderzoek is daarom geboden.

4 CONCLUSIE

Dit onderzoek geeft een indicatie dat de detectie van alfa toxine bruikbaar kan zijn voor de diagnose

van enterotoxemie. Verder onderzoek is echter nodig. Zo moet een groter aantal kalveren zonder

enterotoxemie onderzocht worden om na te gaan of er effectief geen alfa toxine wordt gedetecteerd.

Daarnaast moet verder onderzoek gebeuren naar de gemiddelde hoeveelheid alfa toxine in

darminhoud van enterotoxemie gevallen vlak na de dood. Er moet nagegaan worden of deze

hoeveelheid kan gedetecteerd worden. Als dat zo is, kan gekeken worden naar de tijdspanne waarin

alfa toxine nog detecteerbaar is om te weten binnen hoeveel tijd na de dood stalen moeten genomen

worden voor de diagnose van enterotoxemie.

42

REFERENTIELIJST

van Asten A.J.A.M., van der Wiel C.W., Nikolaou G., Houwers D.J. en Gröne A. (2009). A multiplex

PCR for toxin typing of Clostridium perfringens isolates. Veterinary Microbiology 136, 411-412.

van Asten A.J.A.M., Nikolaou G.N. en Gröne A. (2010). The occurrence of cpb2-toxigenic Clostridium

perfringens and the possible role of the β2-toxin in enteric disease of domestic animals, wild animals

and humans. The Veterinary Journal 183, 135-140.

Deprez P. (2015). Clostridium perfringens infections - a diagnostic challenge. Veterinary record 177,

388-389.

Eaton, J. T., Naylor, C. E., Howells, A. M., Moss D.S., Titball R.W. en Basak A.K. (2002). Crystal

structure of the C. perfringens alpha-toxin with the active site closed by a flexible loop region. Journal

of molecular biology 319, 275-281.

Ginter A., Williamson E.D., Dessy F., Coppe P., Bullifent H., Howells A. en Titball R.W. (1996).

Molecular variation between the α-toxins from the type strain (NCTC 8237) and clinical isolates of

Clostridium perfringens associated with disease in man and animals. Microbiology 142, 191-198.

Goossens E. (2016). Alpha toxin and its C-terminal domain as vaccine candidates for Clostridium

perfringens-associated bovine necro-haemorrhagic enteritis. PhD thesis, p. 179.

Goossens E., Verherstraeten S., Valgaeren B.R., Pardon B., Timbermont L., Schauvliege S., Rodrigo-

Mocholi D., Haesebrouck F., Ducatelle R., Deprez P.R. en Van Immerseel F. (2016). The C‑terminal

domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine

necrohemorrhagic enteritis. Veterinary Research 47 (52), 1-9.

Goossens E., Valgaeren B.R., Pardon B., Haesebrouck F., Ducatelle R., Deprez P.R. en Van

Immerseel F. (2017). Rethinking the role of alpha toxin in Clostridium perfringens- associated enteric

diseases: a review on bovine necrohaemorrhagic enteritis. Veterinary Research 48 (9), 1-17.

Jepson M. en Titball R. (2000). Structure and function of clostridial phospholipases C. Microbes en

infection 2, 1277- 1284.

Jiang Z., De Y., Chang J., Wang F. en Yu L.(2014). Induction of potential protective immunity against

enterotoxemia in calves by single or multiple recombinant Clostridium perfringens toxoids.

Microbiology Immunology 58, 621-627.

Lebrun M., Filée P., Mousset B., Desmecht D., Galleni M., Mainil J.G. en Linden A. (2007). The

expression of Clostrium perfringens consensus beta2 toxin is associated with bovine enterotoxaemia

syndrome. Veterinary Microbiology 120, 151-157.

Lebrun M., Mainil J.G. en Linden A. (2010). Cattle enterotoxaemia and Clostridium perfringens:

description, diagnosis and prophylaxis. Veterinary record 167, 13-22.

43

Li J., Adams V., Bannam T.L., Miyamoto K., Garcia J.P., Uzal F.A., Rood J.I. en McClane B.A. (2013).

Toxin Plasmids of Clostridium perfringens. Microbiology and Molecular Biology Reviews 77, 208-233.

Manteca C., Daube G., Pirson V., Limbourg B., Kaeckenbeeck A. en Mainil J.G. (2001). Bacterial

intestinal flora associated with enterotoxaemia in Belgian Blue calves. Veterinary Microbiology 81, 21-

32.

Manteca C., Daube G., Jauniaux T., Linden A., Pirson V., Detilleux J., Ginter A., Coppe P.,

Kaeckenbeeck A. en Mainil J.G. (2002). A role for the Clostridium perfringens β2 toxin in bovine

enterotoxaemia? Veterinary microbiology 86, 191-202.

Mayer M., Abenthum A., Matthes J.M., Kleeberger D., Ege M.J., Hölzel C., Bauer J. en Schwaiger K.

(2012). Development and genetic influence of the rectal bacterial flora of newborn calves. Veterinary

Microbiology 161, 179-185.

McDonel J.L. (1980). Clostridium perfringens toxins (type A, B, C, D en E). Pharmacology &

Therapeutics 10, 617-655.

Moe P.C. en Heuck A.P. (2010). Phospholipid Hydrolysis Caused by Clostridium perfringens α-Toxin

Facilitates the Targeting of Perfringolysin O to Membrane Bilayers. Biochemistry 49, 9498-9507.

Möllby R., Holme T., Nord C.E., Smyth C.J. en Wadström T. (1976). Production of phospholipase C

(alpha-toxin), haemolysins and lethal toxins by Clostridium perfringens types A to D. Journal of

General Microbiology 96, 137-144.

Moreau H., Pieroni, G., Jolivet-Reynaud C., Alouf, J.E. en Verger, R. (1988). A new kinetic approach

for studying phospholipase C (Clostridium perfringens alpha toxin) activity on phospholipid

monolayers. Biochemistry 27, 2319-2323.

Morris W.E., Venzano A.J., Elizondo A., Vilte D.A., Mercado E.C. en Fernandez- Miyakawa M.E.

(2011). Necrotic enteritis in young calves. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 23, 254-259.

Niilo L. (1980). Clostridium perfringens in Animal Disease: A Review of Current Knowledge. The

Canadian Veterinary Journal 21, 141-148.

Pardon B., De Bleecker K., Hostens M., Callens J., Dewulf J. en Deprez P. (2012a). Longitudinal study

on morbidity and mortility in white veal calves in Belgium. BMC Veterinary research 8 (26), 1-14.

Petit L., Gibert M. en Popoff M.R. (1999). Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in

microbiology 7, 104-110.

Rood J.I. en Cole S.T. (1991). Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens.

Microbiological Reviews 55, 621-648.

Sakurai J., Nagahama M. en Oda M. (2004). Clostridium perfringens Alpha-Toxin: Characterization

and Mode of Action. Journal of Biochemistry 136, 569-574.

44

Titball R.W., Naylor C.E. en Basak A.K. (1999). The Clostridium perfringens α- toxin. Anaerobe 5, 51-

64.

Uzal F.A., Freedman J.C., Shrestha A., Theoret J.R., Garcia J., Awad M.M., Adams V., Moore R.J.,

Rood J.I. en McClane B.A. (2014). Towards an understanding of the role of Clostridium perfringens

toxins in human and animal disease. Future Microbiology 9, 361-377.

Uzal F.A., McClane B.A., Cheung J.K., Theoret J., Garcia J.P., Moore R.J. en Rood J.I. (2015). Animal

models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary

microbiology 179, 23-33.

Uzal F.A. en Songer J.G. (2008). Diagnosis of Clostridium Perfringens Intestinal Infections in Sheep

and Goats. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 20, 253-265.

Valgaeren B., Pardon B., Goossens E., Verherstraeten S., Schauvliege S., Timbermont L., Ducatelle

R., Deprez P. en Van Immerseel F. (2013a). Lesion Development in a New Intestinal Loop Model

Indicates the Involvement of a Shared Clostridium perfringens Virulence Factor in Haemorrhagic

Enteritis in Calves. Journal of Comparative Pathology 149, 103-112.

Valgaeren B., Pardon B., Verherstraeten S., Goossens E., Timbermont L., Haesebrouck F., Ducatelle

R., Deprez P. en Van Immerseel F. (2013b). Intestinal clostridial counts have no diagnostic value in

the diagnosis of enterotoxaemia in veal calves. Veterinary Record 172, 237.

Valgaeren B. (2015). New insights into the pathogenesis of gastrointestinal Clostridium perfringens

infections in veal calves. PhD thesis, p. 191.

Valgaeren B., Pardon B., Goossens E., Verherstraeten S., Roelandt S., Timbermont L., Van Der

Vekens N., Stuyvaert S., Gille L., Van Driessche L., Haesebroeck F., Ducatelle R., Van Immerseel F.

en Deprez P. (2015). Veal Calves Produce Less Antibodies against C. perfringens Alpha Toxin

Compared to Beef Calves. Toxins 7, 2586-2597.

Valgaeren B., Goossens E., Verherstraeten S., Gille L., Van Driessche L., Van Immerseel F.,

Ducatelle R., Deprez P. en Pardon B. (2016). Gastro-intestinale Clostridium perfringens- infecties: een

blijvend gevaar in de Belgische rundveehouderij. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 85, 41-49.

Verherstraeten S., Goossens E., Valgaeren B., Pardon B., Timbermont L., Vermeulen K., Schauvliege

S., Haesebrouck F., Ducatelle R., Deprez P. en Van Immerseel F. (2013). The synergistic

necrohemorrhagic action of Clostridium perfringens perfringolysine and alpha toxin in the bovine

intestine and against bovine endothelial cells. Veterinary research 44 (45), 1-8.

Verherstraeten S., Goossens E., Valgaeren B., Pardon B., Timbermont L, Haesebrouck F., Ducatelle

R., Deprez P. en Van Immerseel F. (2016). Non-toxic perfringolysin O and α-toxin derivatives as

potential vaccine candidates against bovine necrohaemorrhagic enteritis. The veterinary journal 217,

89-94.

De detectie van alfa toxine in de zoektocht naar een...

Documents

Transcript of De detectie van alfa toxine in de zoektocht naar een...