ภาคผนวก

37

ภาคผนวก ก

ประกาศกระทรวงสาธารณสข

ฉบบท 98 (พ.ศ.2529)

เรอง มาตรฐานอาหารทมสารปนเปอน

38

ประกาศกระทรวงสาธารณสข ฉบบท 98 (พ.ศ.2529)

เรอง มาตรฐานอาหารทมสารปนเปอน -----------------------------------------------

อาศยอ านาจตามความในมาตรา 5 และมาตรา 6 (3) แหงพระราชบญญตอาหาร พ.ศ. 2522 รฐมนตรวาการกระทรวงสาธารณสขออกประกาศไว ดงตอไปน

ขอ 1 ใหยกเลกประกาศกระทรวงสาธารณสข ฉบบท 80 (พ.ศ.2527) เรอง ก าหนด มาตรฐานอาหารทมสารปนเปอน ลงวนท 17 กมภาพนธ พ.ศ.2527

ขอ 2 ใหอาหารทมสารปนเปอนทผลตเพอจ าหนาย น าเขาเพอจ าหนาย หรอท จ าหนาย เปนอาหารทก าหนดมาตรฐาน

ขอ 3 สารปนเปอน หมายความวา สารทปนเปอนกบอาหารซงเกดจากกระบวนการ ผลต กรรมวธการผลต โรงงานหรอสถานทผลต การดแลรกษา การบรรจ การขนสงหรอการเกบ รกษา หรอ เกดเนองจากการปนเปอนจากสงแวดลอม

ขอ 4 อาหารทมสารปนเปอนตองมมาตรฐาน โดยตรวจพบสารปนเปอนไดไมเกน ขอก าหนด ดงตอไปน

(1) โลหะ (ก) ดบก 250 มลลกรม ตออาหาร 1 กโลกรม (ข) สงกะส 100 มลลกรม ตออาหาร 1 กโลกรม (ค) ทองแดง 20 มลลกรม ตออาหาร 1 กโลกรม (ง) ตะกว 1 มลลกรม ตออาหาร 1 กโลกรม เวนแตอาหารทม

สารตะกวปนเปอนตามธรรมชาตในปรมาณสง ใหมไดตามทไดรบความเหนชอบจากส านกงาน คณะกรรมการอาหารและยา

(จ) สารหน 2 มลลกรม ตออาหาร 1 กโลกรม (ฉ) ปรอท 0.5 มลลกรม ตออาหาร 1 กโลกรม ส าหรบอาหาร

ทะเล และไมเกน 0.02 มลลกรม ตออาหาร 1 กโลกรม ส าหรบอาหารอน (2) อะฟลาทอกซน 20 ไมโครกรม ตออาหาร 1 กโลกรม (3) สารปนเปอนอน ตามทไดรบความเหนชอบจากส านกงานคณะกรรมการ

อาหารและยา

39

ขอ 5 ประกาศฉบบน มใหใชบงคบแกอาหารทผลตเพอจ าหนาย น าเขาเพอจ าหนาย หรอทจ าหนาย ทไดมประกาศกระทรวงสาธารณสขก าหนดใหเปนอาหารควบคมเฉพาะ หรออาหารทก าหนดคณภาพหรอมาตรฐาน และในประกาศกระทรวงสาธารณสขไดก าหนดปรมาณของสารปนเปอนไวโดยเฉพาะหรอก าหนดไวเปนอยางอนแลว

ประกาศฉบบน ใหใชบงคบตงแตวนถดจากวนประกาศในราชกจจานเบกษาเปนตนไป

ประกาศ ณ วนท 21 มกราคม พ.ศ.2529

มารต บนนาค

รฐมนตรวาการกระทรวงสาธารณสข

(ราชกจจานเบกษาฉบบพเศษ เลมท 103 ตอนท 23 ลงวนท 16 กมภาพนธ พ.ศ.2529)

40

ภาคผนวก ข การวเคราะหหาอะฟลาทอกซนดวย

ชดตรวจสอบอะฟลาทอกซนในผลตผลเกษตร

41

ชดตรวจสอบอะฟลาทอกซนในผลตผลเกษตร 1 ชด ประกอบดวย

รป ข. 1 ชดตรวจสอบอะฟลาทอกซนในผลตผลเกษตร ของกรมวชาการเกษตร

1. หลมทดสอบ เปนหลมพลาสตกขนาดเลก (1 stripe เทากบ 8 หลมทดสอบ) 2. อะฟลาทอกซนมาตรฐาน (สารละลายมาตรฐานของอะฟลาทอกซนชนดบหนง) ทระดบ

ความเขมขน 0 4 10 20 และ40 ไมโครกรมตอกโลกรม 3. อะฟลาทอกซนทผกตดกบเอนไซมชบอก (labeled toxin) ซงกคอเอนไซมคอนจเกต

(Aflatoxin B1 Horseradish Peroxidase Conjugate (AFB1-HRP)) จ านวน 6 หลอด (100 ไมโครลตรตอหลอด)

4. conjugate buffer 8 มลลลตร 5. ซบสเตรท (substrate tetramethylbenzidine (TMB)) 12 มลลลตร พรอมใชงาน 6. washing buffer (0.1 M Phosphate Buffer Saline with Tween 20 (PBS-T)) 100 มลลลตร 7. ทลอคหลมทดสอบ

สงทตองเตรยม 1. เมธานอล ความเขมขนรอยละ 70 โดยปรมาตร 2. เครองชง 3. เครองแกวส าหรบกรอง และเจอจางสารสกด 4. กระดาษกรองเบอร 4 5. automatic micropipet ขนาด 50 ไมโครลตรพรอมทป

1 2 4 5

6

3 7

42

ค าแนะน ากอนการวเคราะห 1. กอนท าการวเคราะหน าชดตรวจสอบออกจากตเยนมาวางใหมอณหภมเทากบอณหภมหอง

กอนใชงาน 2. น าอะฟลาทอกซนทผกตดกบเอนไซมชบอก (labeled toxin) จ านวน 1 หลอด มาเจอจางดวย

conjugate buffer สวนทเจอจางแลวถาใชไมหมดปดฝาใหสนทเกบไวทอณหภม 2 – 8 องศาเซลเซยส 3. น า stripe ออกจากถงฟอยดเทาทตองการใชในแตละครง ทเหลอเกบไวในถงเดมท

2-8 องศาเซลเซยส อยาใหโดนน า 4. เปลยนทปทกครงทเปลยนการดดสารสกดตวอยาง 5. การดดหรอปลอยสารละลายอยาใหปลายทปสมผสกบสารละลายในหลมหรอดานขางของ

หลมทดสอบ 6. ระวงขนตอนการบมแตละครง ควรจะบมในทมดทอณหภมหอง 7. ขนตอนการลางเปนขนตอนทส าคญ อาจท าใหผลการวเคราะหไมถกตองได ดงนน

ตองลางหลมทดสอบใหสะอาด 8. น าชดตรวจสอบเกบทอณหภม 2-8 องศาเซลเซยส ทนทหลงการใชงาน

ขนตอนการวเคราะห

1. เตรยมสารละลายทใชในการวเคราะห 1.1 เตรยม washing buffer ทพรอมใชงาน

เตรยมโดยน า washing buffer (0.1 M Phosphate Buffer Saline with Tween 20) 100 มลลลตร มาเจอจางเปน 0.01 M Phosphate Buffer Saline with Tween 20 (PBS-T) โดยเตมน ากลน 900 มลลลตร จะได washing buffer ทพรอมใชงาน 1,000 มลลลตร ส าหรบน าไปใช ในการเจอจางสารสกดตวอยาง และใชลางหลมทดสอบ

1.2 เตรยม อะฟลาทอกซนทผกตดกบเอนไซมชบอก (labeled toxin) ทพรอมใชงาน 1.3 เตรยมโดยการเตม conjugate buffer 1 มลลลตร ลงไปในหลอดอะฟลาทอกซน

ทผกตดกบเอนไซมชบอก (labeled toxin) ซงมปรมาตร 100 ไมโครลตรตอหลอด เขยาเลกนอยใหเปนเนอเดยวกนหรอกลบหลอดขนลงใหเขากน จะไดอะฟลาทอกซนทผกตดกบเอนไซมชบอก (labeled toxin) ทพรอมใชงาน ปรมาตร ถาใชไมหมด เกบสวนทเหลอในหลอดเดมปดฝา ใหสนทแลวเกบทอณหภม 5 องศาเซลเซยส

43

2. เตรยมตวอยาง ตวอย า งพ รก ปน ท ใชตอง สมมาอย า งนอย 1 ก โลก รม แลวน ามาสกด

อะฟลาทอกซนดวยวธการ ดงน 2.1 ชงพรกปน 20 กรมลงในขวดแกว 2.2 เตมเมธานอลความเขมขนรอยละ 70 โดยปรมาตรลงในขวด เขยานาน 5 นาท 2.3 ตงทงไวประมาณ 5 - 10 นาท 2.4 น าสวนใสมากรองผานกระดาษกรองเบอร 4 2.5 เกบสวนทกรองไดไวในหลอดแกวทสะอาดปดสนท 2.6 เจอจางสารสกดโดยใชสารละลาย washing buffer ทพรอมใชงานกอนน าไป

วเคราะห ในอตราสวน 1:3 (สารสกดตวอยาง 1 มลลลตร รวมกบสารละลาย washing buffer ทพรอมใชงาน 3 มลลลตร) ในสารละลายทเตรยมไดนคออะฟลาทอกซนทสกดไดจากตวอยาง

3. วเคราะหหาอะฟลาทอกซน 3.1 เตรยมหลมทดสอบใหเพยงพอกบตวอยางทจะทดสอบ ใชหลมทดสอบ 5 หลม

ทดสอบส าหรบอะฟลาทอกซนมาตรฐาน และหลมทดสอบอนๆทเหลอส าหรบอะฟลาทอกซน ทไดจากการสกดตวอยาง

3.2 หยดอะฟลาทอกซนมาตรฐานทกระดบความเขมขน ปรมาตร 50 ไมโครลตรตอหลมทดสอบตอความเขมขน

3.3 หยดอะฟลาทอกซนทไดจากการสกดตวอยาง (free aflatoxin) ตวอยางปรมาตร 50 ไมโครลตรตอหลมทดสอบ จ านวน 3 หลมทดสอบ (1 ตวอยางท า 3 ซ า)

3.4 หยดอะฟลาทอกซนทผกตดกบเอนไซมชบอก (labeled toxin) หลงจากนน บมในทมดทอณหภมหองเปนเวลา 20 – 30 นาท อะฟลาทอกซนชนดบหนงจากอะฟลาทอกซน ทผกตดกบเอนไซมชบอก (labeled toxin) จะแขงขนกนจบแอนตบอดทกนหลมทดสอบกบ อะฟลาทอกซนทสกดไดจากตวอยาง

3.5 หลงจากครบเวลาการบมแลว เทสารในหลมทดสอบทงโดยการคว าหลมทดสอบ

3.6 ลางหลมทดสอบ โดยเตม washing buffer ลงในหลมทดสอบใหเตมทกหลม แลวคว าทง ควรลางอยางนอย 3 ครง

3.7 คว าหลมทดสอบบนกระดาษแลวเคาะใหแหง 3.8 หยด ซบสเตรท ปรมาตร 100 ไมโครลตร ลงในหลมทดสอบทกหลม แลวบม

ไวทอณหภมหองในทมดเปนเวลา 5 – 10 นาท ซบสเตรทจะจบกบเอนไซมทผกตดกบ

44

อะฟลาทอกซน เกดปฏกรยาสฟา หากเกดสฟาเขมแสดงวาไมมอะฟลาทอกซนจากตวอยาง (free toxin)หรอมนอย หากเกดสฟาออนแสดงวามอะฟลาทอกซนจากตวอยาง (free toxin) มาก และถาหากวาในหลมทดสอบของตวอยางมสออนมากหรอเกอบใส แสดงวาตวอยางน นม อะฟลาทอกซนสงกวา 40 ไมโครกรมตอกโลกรม 4. การอธบายขนตอนการเกดปฏกรยาในหลมทดสอบของสารละลายมาตรฐาน

เพอใหเขาใจไดงายยงขนจงไดก าหนดสญลกษณของสารตางๆ ทเกยวของใน การเกดปฏกรยา (รป ข.2) ส าหรบการเกดปฏกรยาในหลมทดสอบสารละลายมาตรฐานนนเปนไปตามขนตอนของการว เคราะหหาอะฟลาทอกซนในหวขอ 3 ซงแสดงไวในรป ข . 3 หลงเกดปฏกรยาแลวท าการเทยบสของสารละลายในหลมทดสอบของตวอยางกบสของสารละลายมาตรฐานทเกดขน หากความเขมของสฟาในสารละลายทไดจากตวอยางมคาอยระหวางความเขมของสฟาใดๆ สามารถอานคาออกมาเปนความเขมขนของ อะฟลาทอกซนอยในชวงนน ดงนนชดตรวจสอบนสามารถอานคา ความเขมขนของอะฟลาทอกซนได 5 ชวง ดงน ชวง 0 – 4 ไมโครกรมตอกโลกรม ชวง > 4 – 10 ไมโครกรมตอกโลกรม ชวง > 10 – 20 ไมโครกรมตอกโลกรม ชวง > 20 – 40 ไมโครกรมตอกโลกรม และ > 40 ไมโครกรมตอกโลกรม ในรป ข. 4 สของสารละลายมสเกอบใส แสดงวาตวอยางนมการปนเปอนของอะฟลาทอกซนสงกวา 40 ไมโครกรมตอกโลกรม

แทน แอนตบอด

แทน อะฟลาทอกซนจากตวอยาง (free toxin)

แทน อะฟลาทอกซนทผกตดกบเอนไซมชบอก (labeled toxin)

แทน สฟาทเกดขน

รป ข. 2 สญลกษณแทนสารตางๆทท าปฏกรยาในหลมทดสอ ขนตอนการท าปฏกรยาในหลมทดสอบ

45

1 เตรยมหลมทดสอบซงเคลอบดวยแอนตบอด

2 หยดอะฟลาทอกซนมาตรฐานทกระดบความเขมขน ปรมาตร 50 ไมโครลตรตอหลมทดสอบตอความเขมขน

3. หยดอะฟลาทอกซนทไดจากการสกดตวอยาง (free aflatoxin)ตวอยางปรมาตร 50 ไมโครลตรตอหลมทดสอบ จ านวน 3 หลมทดสอบ (1 ตวอยางท า 3 ซ า)

46

4. หยดอะฟลาทอกซนทผกตดกบเอนไซมชบอก (labeled toxin)

4. บมในทมด 20 – 30 นาท

นาท

4.

5. เทสารในหลมทดสอบทงโดยการคว าหลมทดสอบ

6. ลางหลมทดสอบ โดยเตม washing buffer ลงในหลมทดสอบใหเตม ทกหลม แลวคว าทง ควรลางอยางนอย 3 ครง

47

7. คว าหลมทดสอบบนกระดาษแลวเคาะใหแหง

8. หยด ซบสเตรท ปรมาตร 100 ไมโครลตร ลงในหลมทดสอบทกหลม

แลวบมไวทอณหภมหองในทมดเปนเวลา 5 – 10 นาทซบสเตรทจะจบกบ

เอนไซมทผกตดกบอะฟลาทอกซน เกดปฏกรยาสฟา

ลกษณะของสญลกษณในหลมทดสอบทไมมอะฟลาทอกซน

จากตวอยาง หรอมอะฟลาทอกซน 0 ไมโครกรมตอกโลกรม

ลกษณะของสญลกษณในหลมทดสอบทไมมอะฟลาทอกซน

จากตวอยาง หรอมอะฟลาทอกซน 20 ไมโครกรมตอกโลกรม

48

รป ข. 3 สญลกษณการท าปฏกรยาในหลมทดสอบ

รป ข. 4 สของสารละลายหลงการทดสอบกบสารละลายมาตรฐาน เทากบ 0 4 10 20 และ 40 ไมโครกรมตอกโลกรม

หลมทดสอบอะฟลาทอกซนมาตรฐาน ทความเขมขน

0 4 10 20 และ 40 ไมโครกรมตอกโลกรม

หลมทดสอบของตวอยาง

พรกปน ซ าท 1 2 และ3

ลกษณะของสญลกษณในหลมทดสอบทไมมอะฟลาทอกซน

จากตวอยาง หรอมอะฟลาทอกซน 40 ไมโครกรมตอกโลกรม

49

ประวตผเขยน

ชอ – สกล นางสาวดจดาว ชนอย

วน เดอน ป เกด 13 มถนายน 2528

ประวตการศกษา

2545 มธยมศกษาปท 6 โรงเรยนจฬาภรณราชวทยาลย จงหวดตรง

2551 ปรญญาตร วทยาศาสตรบณฑต (วทยาศาสตรและเทคโนโลย การอาหาร) มหาวทยาลยธรรมศาสตร