basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

door Peter RoelsMonitoraat Wetenschappen

K.U. Leuven

Deel 2

• DNA-dubbelhelix

• inleiding: 3 pijlers

• restrictiefragment-lengtepolymorfisme

• Southern-vlektechniek

• genkloning

• polymerase-kettingreactie

• DNA-sequentiebepaling

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

polymerase-kettingreactie

DNA-dubbelhelix

RENATURATIESTAP 40-60°C

enkelstrengs DNA+ primer

5’...ATTCGCTCGCAATATAGATCTC 3’3’ GCGTTATATCTCGAG 5’

DENATURATIESTAP 92°C

enkelstrengs DNA

polymerase-kettingreactie

DNA-dubbelhelix

RENATURATIESTAP 40-60°C

enkelstrengs DNA+ primer

DENATURATIESTAP 92°C

enkelstrengs DNA

POLYMERISATIESTAP 72°C

bijna voltooide DNA-dubbelhelices

polymerase-kettingreactie

5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

nieuwe streng

polymerase-kettingreactie

5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

nieuwe streng

polymerase-kettingreactie

polymerase-kettingreactie

polymerase-kettingreactie

polymerase-kettingreactie

polymerase-kettingreactie

cyclus gewenste fragmenten totaal aantal ds % gewenst/totaal

1 0 2 0

2 0 4 0

3 2 8 25

4 8 16 50

…

20 1.048.536 1.048.576 > 99,9

30 1.073.741.764 1.073.741.824 >>99,9

polymerase-kettingreactie:meer over primers…

5’ …GCGGTGCAAG… 3’3’ CACGT 5’ 45°Cspecifiek

3’ CACGT 5’5’ …GCGGTGCAAG… 3’ 40°Caspecifiek

5’ …GCGGTGCAAG… 3’

3’ CACGT 5’

50°Cgeen

binding temperatuur

polymerase-kettingreactie:meer over primers…

geenpolymerisatie

5’ …GCGATGCAAG… 3’3’ CACGT 5’

nietcomplementair

aan 3’-einde primer

polymerisatie5’ …GCGGTGCGAG… 3’3’ CACGT 5’

nietcomplementair

aan 5’-einde primer

polymerisatie5’ …GCGGTGCAAG… 3’3’ CACGT 5’

complementair

PCR versus celkloning

PCR Celkloningsnel, makkelijk omslachtig

in principe vanaf 1 cel voldoende uitgangsmateriaal nodig

PCR versus celkloning

PCR Celkloningsnel, makkelijk omslachtig

in principe vanaf 1 cel voldoende uitgangsmateriaal nodig

kennis sequentie flankerende gebieden nodig

geen a priori kennis sequentie nodig

relatief korte fragmenten lange fragmenten

• DNA-dubbelhelix

• inleiding: 3 pijlers

• restrictiefragment-lengtepolymorfisme

• Southern-vlektechniek

• genkloning

• polymerase-kettingreactie

• DNA-sequentiebepaling

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

DNA-sequentiebepaling: reacties

5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’

stop A stop C stop G stop T

stop A

DNA-sequentiebepaling: reactiesstop A

5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’

+

polymerase

nucleotiden(A, C, G, T*)

primer (5’ ACCG 3’)

stopnucleotide A

stop A

5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCGTGACGAT 3’

3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCGTGACGAT 3’

3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCGTGACGAT 3’

3’ TGGCACTGCTA 5’

3’ TGGCACTGCTA 5’5’ ACCG 3’

3’ TGGCACTGCTA 5’5’ ACCG 3’

3’ TGGCACTGCTA 5’5’ ACCG 3’

5’ ACCG 3’ 5’ ACCG 3’ 5’ ACCG 3’

TGA TGACGA TGACGAT

stop A

5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCGTGACGAT 3’3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCGTGACGAT 3’

3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCGTGACGAT 3’

3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCGTGACGAT 3’

3’ TGGCACTGCTA 5’

5’ ACCG 3’ 5’ ACCG 3’ 5’ ACCG 3’

5’ ACCG 3’ 5’ ACCG 3’ 5’ ACCG 3’

TGA TGACGA TGACGAT

stop A

DNA-sequentiebepaling: reacties

stop A stop C stop G stop T

DNA-sequentiebepaling: elektroforese

-

+

stop A stop C stop G stop T stop A stop C stop G stop T

DNA-sequentiebepaling: interpretatie

stop A stop C stop G stop T

5’ ACCGT

DNA-sequentiebepaling: interpretatie

stop A stop C stop G stop T

5’ ACCGTG

DNA-sequentiebepaling: interpretatie

stop A stop C stop G stop T

5’ ACCGTGA

DNA-sequentiebepaling: interpretatie

stop A stop C stop G stop T

5’ ACCGTGAC

DNA-sequentiebepaling: interpretatie

stop A stop C stop G stop T

5’ ACCGTGACG

DNA-sequentiebepaling: interpretatie

stop A stop C stop G stop T

5’ ACCGTGACGA

DNA-sequentiebepaling: interpretatie

stop A stop C stop G stop T

5’ ACCGTGACGA? 3’

DNA-sequentiebepaling: interpretatie

stop A stop C stop G stop T

5’ ACCGTGACGA? 3’3’ TGGCACTGCT? 5’

DNA-sequentiebepaling:cycle sequencing

simulatie

http://www.dnalc.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htm

DNA-sequentiebepaling:cycle sequencing