Laboratorium diagnostiek van cystine

dr. Leo A.J. KluijtmansLab. Genetische, Endocrine en Metabole Ziekten

UMC St Radboud

Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten

(Klein beetje) biochemie

Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten

Meting cystine (eigenlijk: cysteine)

Hoe kunnen we elkaar vinden

Vragen

Inhoud presentatie

Gespecialiseerd laboratorium op het terrein van de erfelijke stofwisselingsziekten (metabole ziekten)

Ca. 170 fte, waarvan de ~50% in de diagnostiek

8 stafleden, waarvan 2 in de metabolieten diagnostiek (lichaamsvloeistoffen)

Ca. 2000 nieuwe patiënten / jaar

Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten

Het UMC St Radboud, Nijmegen

LGEM laboratorium

LGEM laboratorium

De humane cel

1. Lysosoom2. Celmembraan3. Mitochondrion4. Endoplasmatisch

reticulum5. Cytoplasma6. Kernmembraan7. Kernporie8. Kern9. Kernlichaampje10.Ribosoom11.Golgi-systeem.

Ontdekt in 1949 door Christian de Duve

De stofzuigers van de cel

Afbraak van allerlei celcomponenten (vetten, eiwitten, complexe suikers, erfelijk materiaal)

Afbraakproducten gaan naar cel plasma

Zuur milieu (zuurtegraad (pH): ~5); cel: ~7.2

Het lysosoom

Cysteine: HOOC HC-CH2-SH ( )

NH2

Cystine: HOOC COOH HC-CH2-S-S-CH2-CH

( ) NH2 NH2

Cysteamine: NH2-CH2-CH2-SH ( )

COOH Cysteamine-cysteine disulfide: NH2-CH2-CH2-S-S-CH2-CH (

)NH2

De belangrijkste spelers

Hoe gaat het ‘normaal’?

cystine

Lysosoom

Cysteine-transporter

Lysine-transporter

De cel

Cystine-transporter

Wat gebeurt er bij Cystinosis

cystine

Lysosoom

Cysteine-transporter

Lysine-transporter

De cel

Cystine-transporter

cystine

Wat gebeurt er bij Cystinosis

Lysosoom

Cysteine-transporter

Lysine-transporter

De cel

Cystine-transporter

cystine

Werking van cysteamine

cysteamine

cysteine

Lysosoom

Cysteine-transporter

Lysine-transporter

De cel

Cystìne-transporter

Cystine stapelt in lysosoom tgv het transporter defect

Cystine is (fors) verhoogd in m.n. de granulocyt (= witte bloedcel waarin veel lysosomen zitten)

Cystine is ook verhoogd in gekweekte huidfibroblasten

DNA diagnostiek van het Cystinosine gen (17p13)

Diagnose cystinosis

Isolatie granulocyten uit bloed◦ Vermijden contaminatie met andere bloedcellen

(mn rode)

Vermijden artificiële vorming van cystine uit cysteine◦ Oxidatie van cysteine geeft cystine◦ Rode- en witte bloedcellen bevatten veel

cysteine

Wat zijn de ‘challenges’

Granulocyt isolatie(polymorphonucleaire cellen)

Met behulp van dextraan (complex suiker molecuul) worden de bloedcellen gescheiden

Aan buis bloed wordt dextraan toegevoegd, incubatie 1 uur op ijs.

Leukocyt isolatie, procedure

Dextraan incubatie, 1 uur op ijs

Leukocyten (witte cellen)

Erythrocyten (rode cellen)

Het leukocyten isolaat

Neutrofiele granulo

Eosinofiele granulo

Basofiele granulo

Lymfocyt Monocyt

35-75% 0-5% 0-2% 15-40% 0-6%

Totaal: 4.4-11.0 x 109 per liter

granulocyten

Dextraan incubatie

Leukocyten (witte cellen)

Erythrocyten (rode cellen)

Het leukocyten isolaat wordt behandeld met Ficoll (= complexe suiker).

Ficoll wordt onder leukocyt suspensie gepipetteerd (géén menging lagen)

Centrifugatie, 20 min, 4°C, 500g (1800 rpm)

Scheiding op soortelijk gewicht

Granulocyt isolatie uit leukocyt suspensie

De Centrifuge

De Ficoll gradient

lymfocyten

granulocyten

Echter nog wel mét rode bloedcellen erbij

Rode bloedcellen nemen makkelijk water op uit hun omgeving

Plaats rode bloedcellen in een “waterige omgeving” en ze zullen opzwellen en barsten

+ 3 mL ijskoude MilliQ (= zuiver labwater)

Contaminatie met rode bloedcel

De geïsoleerde granulocyten worden 3 x gewassen met fysiologisch zout (PBS).

Tussendoor: centrifugeren 10 min, 4°C, 500g

Afzuigen wasbuffer en invriezen invloeibare stikstof (-196°C)

Opslag in -80°C vriezer tot analyse

Wassen en opslag geïsoleerde granulocyten

Meting cystine uit de granulocyt met HPLC

Wat is de situatie ?

De cel

Lysosoom

cysteine

Andere –SH

verbindingen

cystine

HOOC HC-CH2-SH NH2

Cellen kapot maken

Als we cellen kapot maken, komt er zuurstof bij…

Door “oxidatie” krijgen we foutief verhoogd cystine uit 2 moleculen cysteine

Vals verhoogd cystine

N-ethylmaleimide (NEM)

Het NEM reageert met –SH verbindingen (o.a cysteine)

De oplossing…

Als we cellen kapot maken, in aanwezigheid van NEM ( )

+ NEM

Het NEM bindt aan alle –SH groepen en vangt daarmee ook

het aanwezige cysteine weg

Het bindt NIET aan cystine

in overmaat

Complex mengsel van verbindingen

Cystine ( ) is moeilijk te meten. Cysteine ( ) is makkelijk te meten!

Complex mengsel van verbindingen

In het isolaat zit nog cystine (moeilijk meetbaar) en verder het cysteine-NEM en andere SH-NEM stoffen.

De overmaat aan NEM is weggevangen en kan géén cysteine meer binden

Na wegvangen overmaat NEM kunnen we cystine “breken” tot 2 x cysteine en dit meten.

Er wordt een ‘kleurstof’ specifiek voor cysteine toegevoegd

Het complexe mengsel

Complex mengsel van verbindingen

Gekleurd cysteine te meten met fluorescentiedetector

HPLC: High Performance Liquid Chromatography(hogedruk vloeistof chromatografie)

Chromatografie: het scheiden van een mengsel van stoffen op basis van hun eigenschappen

Cysteine meting met HPLC

Hoe werkt HPLC?

De ‘cystine’ HPLC in het lab.

De HPLC kolom waarop de stoffen gescheiden worden

De vloeistoffen

De monster verwisselaar van de HPLC

Om de hoeveelheid te kunnen bepalen wordt een zogenaamde ijklijn opgenomen.

Bekende concentraties cysteine worden geanalyseerd en piekoppervlakten worden gemeten

Cysteine kwantificeren

Chromatogram

Diverse bekende (!) concentraties cysteine in tweevoud bepaald op de HPLC. Computer berekent het piekoppervlak.

Van piekoppervlak naar concentratie

Hoeveelheid cysteine

Oppervlakte piek

In patiëntenmonsters wordt het piekoppervlak van de cysteine piek bepaald en met behulp van de ijklijn wordt cysteine concentratie bepaald.

Stel: piekopp is 150000; dan is de bijbehorende cysteine concentratie: 14.20 µM

Oppervlak ~ Concentratie cysteine

Cysteine is afkomstig van cystine (= ½ cystine)

Cysteine concentratie wordt gehalveerd.

Hoeveelheid eiwit (in mg) is een maat voor de hoeveelheid geïsoleerde cellen.

Uitslag is xx nmol cystine / mg eiwit.

Van cysteine concentratie naar uitslag

In gezonde personen: < 0.17 nmol/mg (in granulo’s)

Targetwaarde: lager dan de range zoals gezien wordt bij “obligaat dragers” (dwz ouders van patiënten)

Referentiewaarden / Targetwaarden

Cystinosis is een autosomaal recessief ziektebeeld:

Ouders zijn drager maar hebben géén klachten.

Kinderpoli: 11-01-2011 Volwassenen: 17-01-2011 Kinderpoli: 25-01-2011 Meetweek Nijmegen: week 4 (ma 24-01)

Kinderpoli: 12-04-2011 Volwassenen: 18-04-2011 Kinderpoli: 26-04-2011 Meetweek Nijmegen: week 17 (ma 25-04)     Kinderpoli: 14-06-2011 Kinderpoli: 21-06-2010 Volwassenen: 27-06-2011 Meetweek Nijmegen: week 26 (ma 27-06)

Volwassenen: 26-09-2011

Kinderpoli: 11-10-2011 Kinderpoli: 25-10-2011 Meetweek Nijmegen: week 43 (ma 24-10)

Wat bieden we aan in 2011?

In de 3 weken voorafgaand aan de Nijmeegse meetweek kunnen op maandag én woensdag bloedmonsters worden ingestuurd naar Nijmegen voor granulocyt isolatie in Nijmegen.

Samples dienen te worden aangekondigd en moeten voor 12 uur in het lab zijn (ivm langdurige opwerking)

Monsters worden dan in de eerstvolgende meetsessie meegenomen.

Isolatie granulocyten in Nijmegen

Veel stappen in de opwerking van de bloedmonsters tot een uitslag in nmol cystine/mg eiwit

Complexe diagnostiek met veel ‘pitfalls’

Graag bereid met u van gedachte te wisselen hoe we de dienstverlening nog beter kunnen afstemmen op uw wensen.

Ter afsluiting

Analisten:Dinny van Oppenraaij-EmmerzaalJenneke Keizer-GarritsenGwendolyn BeckmannLouk Geelen

“Het Oude Team”Addy de Graaf-HessHenk Blom

Elena Levtchenko

Marjolein Bos

Acknowledgments

Ter afsluiting nog een mooi plaatje…

ERNDIM, kwaliteitsrondzendingenEuropean Research Network Inherited Disorders of Metabolism