UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Farmaceutische Analyse
Drug Quality and Registration (DruQuaR) Group
Academiejaar 2010 - 2011
Vergelijking van methoden voor de activiteitsbepaling van
asparaginase
Jochem VANCOILLIE
Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling
Promotor
Prof. Dr. Apr. B. De Spiegeleer
Commissarissen
Prof. Dr. D. Deforce
Prof. Dr. apr. H. Robays
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Farmaceutische Analyse
Drug Quality and Registration (DruQuaR) Group
Academiejaar 2010 - 2011
Vergelijking van methoden voor de activiteitsbepaling van
asparaginase
Jochem VANCOILLIE
Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling
Promotor
Prof. Dr. Apr. B. De Spiegeleer
Commissarissen
Prof. Dr. D. Deforce
Prof. Dr. apr. H. Robays
AUTEURSRECHT
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik
valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de
verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze
masterproef.”
DATUM
Promotor Auteur
Prof. B. De Spiegeleer Jochem Vancoillie
DANKWOORD
Graag had ik een pagina de tijd genomen om een aantal mensen te bedanken zonder wiens hulp deze thesis nooit
tot stand had kunnen komen.
Vooreerst wil ik mijn promotor en tevens persoonlijke begeleider, professor Bart De Spiegeleer, bedanken. Niet
enkel voor de opportuniteit om aan dit onderzoek deel te nemen, maar ook voor de tijd die hij voor mij
vrijmaakte in zijn drukke dagen om mij te begeleiden, mijn kritische geest aan te scherpen en mij talloze nieuwe
inzichten te verschaffen. Het vertrouwen, de zelfstandigheid en de verantwoordelijkheid die mij werden
toevertrouwd, zullen niet enkel waardevol gebleken zijn voor deze thesis, maar ook voor de verdere stappen in
mijn carrière.
Daarnaast wil ik ook het voltallige personeel van DruQuaR bedanken, die altijd klaar stonden om naar mijn
vragen te luisteren, zijnde praktisch of theoretisch, en deze naar het beste van hun vermogen te beantwoorden.
Deze mensen waren echter meer dan een vraagbaken, ze maakten de tijd in het labo aangenaam. De sporadische
babbels waren een aangename afwisseling.
Verder wil ik ook mijn medestudenten en vrienden in de kijker zetten, daar zonder vriendschap en steun van hen
deze afgelopen 4 jaar minder gemakkelijk zouden verlopen zijn. Ook mijn vriendin mag hierin niet ontbreken,
zij heeft namelijk een groot deel van mijn frustraties tijdens deze 12 weken getemperd en altijd het volste
vertrouwen in mij getoond.
Maar mijn grootste dank gaat uit naar mijn ouders die zich gedurende 22 jaar lang reeds belangeloos hebben
ingezet voor mij, zowel gedurende goede als slechte periodes. De kans om deze studies aan te vangen is aan hen
te danken, het latere succes dat ik hopelijk zal genieten zal een resultaat zijn van hun harde werk, hun opvoeding
en steun.
INHOUDSOPGAVE
1. INTRODUCTIE ............................................................................................................. 1
1.1. LEUKEMIE ..................................................................................................................... 1
1.1.1. Algemeen ..................................................................................................... 1
1.1.2. Acute Lymfoblastische Leukemie .................................................................. 1
1.2. ASPARAGINASE ............................................................................................................ 2
1.2.1. Algemeen ..................................................................................................... 2
1.2.2. Karakterisatie ............................................................................................... 4
1.2.2.1. Enzymactiviteit ................................................................................................. 4
1.2.2.2. Structuuranalyse ............................................................................................... 9
1.2.2.3. Zuiverheidsanalyse ......................................................................................... 12
1.2.3. Actief Centrum ........................................................................................... 12
1.2.4. Soorten asparaginase ................................................................................. 16
1.2.5. Stabiliteit ................................................................................................... 16
2. OBJECTIEF ................................................................................................................ 18
3. MATERIAAL EN METHODEN ..................................................................................... 19
3.1. TOESTELLEN EN REAGENTIA ...................................................................................... 19
3.1.1. UV/Vis spectrofotometer ........................................................................... 19
3.1.2. Centrifuge .................................................................................................. 19
3.1.3. Thermomixer ............................................................................................. 19
3.1.4. pH meter .................................................................................................... 19
3.1.5. Waterstation .............................................................................................. 19
3.1.6. Balansen .................................................................................................... 20
3.1.7. Producten .................................................................................................. 20
3.2. METHODEN ................................................................................................................ 21
3.2.1. Nessler ....................................................................................................... 22
3.2.2. Berthelot .................................................................................................... 24
3.2.3. Indooxine ................................................................................................... 25
3.2.4. Glutamaat dehydrogenase ......................................................................... 26
3.2.5. Aspartaat Transaminase ............................................................................. 28
3.2.6. Methodenevaluatie .................................................................................... 30
4. RESULTATEN ............................................................................................................ 31
4.1. NESSLER ..................................................................................................................... 31
4.2. BERTHELOT ................................................................................................................ 32
4.3. INDOOXINE ................................................................................................................ 33
4.4. GLUTAMAAT DEHYDROGENASE ................................................................................ 34
4.5. ASPARTAAT TRANSAMINASE ..................................................................................... 35
4.6. GESIMULEERDE ASPARAGINASE METHODENEVALUATIE ......................................... 36
4.6.1. Situering..................................................................................................... 36
4.6.2. Nessler ....................................................................................................... 37
4.6.3. Berthelot .................................................................................................... 39
4.6.4. Indooxine ................................................................................................... 40
4.6.5. Glutamaat Dehydrogenase ......................................................................... 42
4.6.6. Aspartaat Transaminase ............................................................................. 43
5. DISCUSSIE ................................................................................................................ 45
5.1. STATISTISCH ............................................................................................................... 45
5.2. NIET-STATISTISCH ...................................................................................................... 47
6. ALGEMEEN BESLUIT ................................................................................................. 49
7. LITERATUURLIJST ..................................................................................................... 50
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
ADP: Adenosine Difosfaat
Ala: Alanine
ALL: Acute lymfoblastische anemie
ASAT: Aspartaat Transaminase
Asn: Asparagine
ASNASE: Asparaginase
Asp: Asparaginezuur
BSA: Bovine Serum Albumine
CD: Circulair Dichroïsme
DAD: Diode Array Detector
DH: Dehydrogenase
DRS: Diffuse Reflectieve Spectroscopie
DSC: Differential Scanning Calorimetry
EFS: Event-Free Survival
ELISA: Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay
ESI: Electrospray Ionisatie
GDH: L-glutaminezuurdehydrogenase
Glu: Glutaminezuur
Gly: Glycine
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
HSD: Honestly Significant Difference
Ig: Immunoglobuline
Ile: Isoleucine
I.m.: intramusculair
IU: International Unit, de hoeveelheid enzym dat de omzetting van 1 µmol substraat tot
product per minuut onder gedefinieerde condities katalyseert
I.v.: intraveneus
KGA: Keto-Glutaarzuur
LoD: Limit of Detection
LoQ: Limit of Quantification
LSD: Least Significant Difference
MG: Moleculair Gewicht.
MS: Massaspectrometrie/Massaspectrometer
NAD: Nicotinamide Adenine Dinucleotide
Ox.: Oxidatie
PPM: Parts Per Million
Ribo: Ribose
RP-HPLC: Reversed-Phase HPLC
RSD: Relatieve Standaard Deviatie
SDS-PAGE: Sodium Dodecylsulfaat Polyacrylamide Gelelectroforese
SEC: Size-Exclusion Chromatografie
SPE: Vaste Fase Extractie
St. Dev.: Standaard Deviatie
Thr: Threonine
UV: Ultraviolet licht
UV-VIS: Ultraviolet en zichtbaar licht
1
1. INTRODUCTIE
1.1. LEUKEMIE
1.1.1. Algemeen
Leukemie is een verzamelterm voor verschillende vormen van bloedkanker, meestal
van de witte bloedcellen of leukocyten. Leukemie wordt gekenmerkt door een ontregelde en
ongecontroleerde groei van verschillende types van witte bloedcellen in het beenmerg.
Vanuit het beenmerg gaan de kankercellen over op het circulerende bloed en zo ook op
andere organen, zoals de lymfeklieren, de milt en de lever. Elk orgaan kan worden
aangetast, inclusief het centraal zenuwstelsel.
(http://www.cancer.org/Cancer/LeukemiainChildren/OverviewGuide/childhood-leukemia-
overview-what-is-childhood-leukemia)
De witte bloedcellen maken deel uit van het immuunsysteem en hebben als functie
vreemde indringers, zoals bacteriën en virussen, te bestrijden. Bij leukemie is de vorming
van deze cellen in het rijpingsproces gestoord. De cellen zijn dus nog niet rijp en bijgevolg
niet in staat hun functie uit te oefenen. Het beenmerg is niet meer in staat voldoende
normaal functionerende bloedcellen te produceren.
Er wordt een onderscheid gemaakt tussen acute leukemie, dat op korte tijd ontstaat
en waarbij de cellen erg onrijp zijn, en chronische leukemie, welke trager verloopt en
waarbij de cellen zich verder in het ontwikkelingsproces bevinden. Verder worden ze nog
onderverdeeld in lymfatische en myeloïde leukemie, afhankelijk van de cellijn waaruit de cel
afkomstig is. (http://www.skion.nl/kbk/leukemieen)
1.1.2. Acute Lymfoblastische Leukemie
Acute lymfoblastische leukemie (ALL) is een vorm van leukemie die gekenmerkt
wordt door een overmaat aan lymfoblasten. Maligne, onrijpe witte bloedcellen worden
continu geproduceerd en vermenigvuldigd in het beenmerg. Het gevolg hiervan is dat de
gezonde cellen verdreven worden uit het weefsel, maar ook dat het overbevolkte beenmerg
lymfoblasten vrij zal stellen in het bloed, met de dood tot gevolg indien onbehandeld.
2
ALL komt het vaakst voor in de kindertijd in de periode van 2 tot 10 jaar. De kans op
genezing bij kinderen is ongeveer 80%, bij volwassenen ligt die kans op zo’n 40%.
Acuut, zoals reeds vermeld, verwijst naar het relatief korte tijdsverloop van de ziekte,
die fataal kan zijn in slechts enkele weken indien men dit onbehandeld laat. Lymfoblastisch
slaat op de cellen die betrokken zijn. Hier zijn het lymfocyten, die echter nog onrijp zijn, ze
bevinden zich nog in de “blast”-staat. (Randolph, 2004)
1.2. ASPARAGINASE
1.2.1. Algemeen
Asparaginasen zijn natuurlijk voorkomende tetramere enzymen die de hydrolyse
katalyseren van het niet-essentiële aminozuur L-asparagine tot L-asparaginezuur en
ammoniak (Figuur 1.1). Dit proces gaat extracellulair door.
Figuur 1.1: Reactiemechanisme van asparaginase gekatalyseerde deaminatie
(Verma et al., 2007)
Asparaginasen kunnen voor verscheidene doeleinden worden aangewend.
Asparaginasen, afkomstig uit bijvoorbeeld erwten (Tuncel et al., 2010), worden industrieel
gebruikt in de voedingsindustrie om de vorming van acrylamide tegen te gaan, een
vermoedelijk carcinogeen. Door het omzetten van asparagine tot asparaginezuur kan de
Maillard-reactie van asparagine tot acrylamide niet meer doorgaan bij de verwerking van
bepaalde types voeding.
3
Asparaginase wordt ook in de medische wereld gebruikt. Deze asparaginasen,
afkomstig van bacteriën zoals Escherichia coli en Erwinia chrysanthemi, zijn een belangrijk
onderdeel in de behandelingstherapie van ALL. Leukemiecellen zijn namelijk beperkt in de
upregulatie van hun asparaginesynthetase en hebben dus nood aan een exogene toevoer
van asparagine. Parenteraal toegediende asparaginase zorgt voor een depletie van
extracellulair asparagine, en in mindere mate van glutamine, waardoor de proteïnesynthese
in de leukemiecel wordt geïnhibeerd. Dit leidt tot selectieve celdood. (Albertsen et al., 2002)
Daar asparaginasepreparaten van bacteriële oorsprong zijn, zijn ze immunogeen en
geven ze tot in 60% van de gevallen aanleiding tot klinische hypersensitiviteit, waarvan de
kans stijgt met het aantal voorafgaande toedieningen. Deze overgevoeligheidsreacties zijn
het gevolg van de productie van anti-asparaginase antilichamen, die van het type IgG zijn.
Enkele symptomen zijn anafylaxis, pijn, oedeem, urticaria en pruritus.
De antilichamen tegen asparaginase leiden niet altijd enkel tot klinische
overgevoeligheid, maar veroorzaken ook een snelle inactivatie van het enzym. Dit wordt
“silent hypersensitivity” ten gevolge van “silent antibodies” genoemd. Dit komt voor bij
ongeveer 30% van de patiënten en kan dus leiden tot resistentie en een gedaalde
therapeutische efficaciteit. (Pieters et al., 2010)
Een onderverdeling in de bacteriële asparaginasen wordt gemaakt in type I en type II
asparaginasen. Type I asparaginasen (Km~ 10-3 M) worden tot expressie gebracht in het
cytoplasma en worden gekarakteriseerd door een enzymatische activiteit voor zowel L-
asparagine als L-glutamine. Type II asparaginasen (Km~ 10-5 M) daarentegen worden onder
anaerobe omstandigheden in de periplasmatische ruimte tot expressie gebracht en hebben
een hoge specifieke activiteit ten opzichte van L-asparagine. Het zijn enkel de type II
asparaginasen die als chemotherapeutica worden gebruikt bij de behandeling van ALL.
4
1.2.2. Karakterisatie
Met karakterisatie van asparaginase bedoelen we de technieken waarmee we de
volledige “identiteit” ervan kunnen blootleggen. We willen te weten komen hoe snel en
efficiënt het enzym werkt en hoe het proteïne is opgebouwd. Onderstaande technieken
helpen ons bij deze karakterisatie.
1.2.2.1. Enzymactiviteit
De enzymactiviteit is de omzetting van substraat (in mol) of de vorming van product
(in mol) per tijdseenheid (seconde) door het enzym onder welbepaalde omstandigheden van
pH, temperatuur en substraatconcentratie. Om de enzymactiviteit van L-asparaginase te
bepalen zijn er verscheidene methoden voor handen. we kunnen deze methoden indelen op
basis van het analyt dat kwantitatief bepaald wordt: de daling van het substraat asparagine
of de stijging van de producten asparaginezuur of ammoniak.
Asparaginezuur
o Een aminozuuranalyse van asparaginezuur (ook toepasbaar op het
substraat asparagine, om depletie te bepalen) kan zelf op verscheidene
manieren gebeuren. De meest gebruikte is een RP-HPLC gekoppeld aan
een detector. De detector kan een fluorescentiemeter na derivatisatie
(met LoQ = 0,1 µM) (Nath et al., 2008), (Boos et al., 1996), UV-detector na
derivatisatie (LoQ = 0,01 µM) (Avramis et al., 2007) of ESI-MS (LoQ = 0,35
µM) (Tuncel et al., 2010) zijn.
o Een andere techniek om asparaginezuur te gaan kwantificeren is een
gekoppelde enzymatische assay. Asparaginezuur, afkomstig van de
gekatalyseerde desaminatie van asparagine, reageert met α-
ketoglutaarzuur in de aanwezigheid van aspartaat aminotransferase,
waardoor oxaloacetylzuur ontstaat dat op zijn beurt gereduceerd β-NAD+
(=β-NADH) oxideert in aanwezigheid van malaat dehydrogenase(Figuur
1.2). De oxidatie van NADH resultereert in een daling van absorbantie bij
5
340 nm, wat eenvoudig gemeten wordt met een UV-spectrofotometer
(LoQ = 4,2 µM). (Vrooman et al., 2010)
Figuur 1.2: Reactiemechanisme bij gekoppelde enzymatische assay
o Een aselectieve methode die voorhanden is, is conductometrie. Dit is een
methode die gebaseerd is op een stijging van de geleidbaarheid, te wijten
aan de productie van ammoniak en asparaginezuur. (Drainas et al., 1985)
(Stecher et al., 1999)
Ammoniak
o Nessler-methode. Deze maakt gebruik van het Nessler reagens, wat een
mengels is van K2HgI4 en een KOH of NaOH oplossing (Demuthkaya et al.,
2006). Het Nessler reagens interageert met ammoniak op volgende
manier (Figuur 1.3): (Leonard, 1963)
Figuur 1.3: Reactiemechanisme Nessler
De extinctie wordt gemeten met een UV-VIS spectrofotometer bij 485
nm. (Moorthy et al., 2010) (Demuthkaya et al., 2006) De Nessler-methode
heeft een werkzaam gebied van 0,5 – 12 µg/ml.
o Berthelot-methode. Het gevormde ammonia reageert met hypochloriet
waardoor chloramine wordt gevormd. Dat chloramine reageert met Na-
6
nitroprusside en fenol tot quinone chloramine, dat verder reageert onder
alkalische condities om uiteindelijk indofenolblauw te produceren (Figuur
1.4).
Figuur 1.4: Mechanisme van de indofenol-blauwvorming
De hoeveelheid indofenol dat geproduceerd wordt is direct proportioneel
met de hoeveelheid ammonia dat vrijgesteld werd uit het substraat. De
kwantificatie van indofenol gebeurd spectrofotometrisch, waarbij de
absorbantie bij 675 nm wordt gemeten. (Moliner-Martinez et al., 2005).
Een stijging in blauwe kleur wordt onderscheiden tussen 0 en 20 µg/ml.
(Lau et al., 2004) De Berthelot-methode kent ook vele variaties, die vooral
een verbeterde serum/plasma-staal behandeling beogen. Een van de
recentere variaties voor plasmabepalingen is het gebruik van een SPE
(vaste-fase extractie), gekoppeld aan een DRS (diffuse reflectieve
spectroscopie). Het detectielimiet bij SPE-DRS is 10 µg/l. (Moliner-
Martinez et al., 2005) Een andere methode is het gebruik van een niet-
reversibele solid-phase sensor (sensorstrips). De reactie bij deze
wegwerpstrips gaat veel sneller door, namelijk in 3 minuten in plaats van
20 minuten. De range bij deze methode is van 0,5 – 10 µg/ml. (Lau et al.,
2004) Nog een andere variant is een micel-gemedieerde extractie.
7
Voordeel bij deze werkwijze is dat ze sneller is. Ook de precisie en
accuraatheid ligt hoger. Detectielimiet hier is 1 ng/ml. (Afkhami et al.,
2008) Berthelot heeft als voordeel over Nessler dat ze minder gevoelig is
aan interferenties.
o Verder bestaan er ook enzymatische ammoniakbepalingen. Kits die
gebruik maken van het enzym GDH (glutamaat dehydrogenase) laten toe
de concentratie van ammoniak te bepalen via een NADPH-afhankelijke
reactie (Figuur 1.5). De omzetting van NADPH naar NADP+ wordt
kwantitatief gemeten door de daling in absorbantie bij 340 nm. Met deze
GDH kits kan men concentraties bepalen in de range van 0,2 – 15 µg/ml.
(http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/aa010
0bul.Par.0001.File.tmp/aa0100bul.pdf)
Figuur 1.5: Reactiemechanisme van de Glutamaat Dehydrogenase-kit
o Indooxine-methode. De Indooxine-methode is gebaseerd op de reactie
van hydroxylamine, afkomstig van het gemodificeerd asparagine AHA
(asparaginezuur-β-hydroxamaat), met 8-hydroxyquinoline. (Wehner et al.,
1992) De intens groen gekleurde Indooxine-kleurstof die gevormd wordt
door de reactie (Figuur 1.6) leent zich uitermate tot een spectroscopische
bepaling van de extinctie bij 710 nm. (Lanvers et al., 2002)
8
Figuur 1.6: Reactiemechanisme van de Indooxine-methode
Eiwitbepalingen
o Algemene eiwitbepalingen. Een type proteïne assay dat men reeds
toegepast heeft op asparaginase is het Bradford proteïne assay. De
absorbantie bij deze colorimetrische assay wordt gemeten bij 595 nm. Als
referentie standaard gebruikt men BSA (bovine serum albumine).
(Khushoo et al., 2004) Andere colorimetrische proteïneassays die men nog
niet heeft toegepast op asparaginase, maar wel mogelijk zijn, zijn de
Lowry assay, waarbij met de absorbantie meet bij 750 nm, de modernere
variant van de Lowry assay, namelijk de bicinchoninezuur assay waarbij
we de extinctie meten bij 562 nm (en waarvoor kits bestaan) en de
Biureet test waar we gaan meten bij 540 nm. (Sapan et al., 1999)
o Selectieve asparaginase bepalingen. Electrochemiluminescentie
immunoassay werd reeds toegepast op asparagine synthethase, maar nog
niet op asparaginase. (Lorenzi et al., 2008)
9
o Behalve via deze assays heeft men de concentratie van het enzym ook nog
via UV-spectroscopie bepaald, waarbij men de extinctie bij 280 nm gaat
meten. Ook een differentiële refractometer werd gebruikt om de
concentratie te bepalen, al vereist deze techniek wel een grondige
voorafgaande dialyse. (Cammack et al., 1975)
1.2.2.2. Structuuranalyse
Onder structuuranalyse valt o.a. de primaire, secundaire en tertiaire structuur, maar
ook het moleculair gewicht en fragmentatie vallen hieronder.
Onder primaire structuur verstaan we de opeenvolging van aminozuren. Dit wordt
opgehelderd door middel van diverse technieken. Een klassieke methode is de Edman-
degradatie (Edman et al., 1949), waarbij het N-terminale residu wordt gelabeld en
afgesplitst, zonder dat de rest van de peptidebindingen wordt gebroken. (Maita et al,. 1979)
Een alternatieve, modernere methode is de massaspectrometrie. Eerst wordt via chemische
of enzymatische afbraak het eiwit onder gecontroleerde omstandigheden gehydrolyseerd in
kleinere stukken. Het gevormde mengsel van peptiden wordt doorheen een HPLC gestuurd
om ze te scheiden en detectie gebeurt met MS (voor massabepaling) of MSn (voor
aminozuursequentie van elke fractie).
(https://www.msu.edu/~gallego7/MassSpect/MSandPMM.htm) (Han et al., 2001)
De primaire structuur van enkele asparaginasen zijn reeds volledig opgehelderd (figuur 1.7).
10
Figuur 1.7: Aminozuursequenties van het monomeer van verscheidene asparaginasen.
Getallen bovenaan = sequentie van E. coli asparaginase, onderaan = W. succinogenes
asparaginase. * = residu cruciaal voor de activiteit. Donkerrood = residu voorkomend in
alle enzymen. Licht rood = zeer geconserveerd residu. Paars = vaak voorkomend residu,
behalve in W. succinogenes. Groen = vaak voorkomende residu in elke subfamilie (licht
groen, asparaginasen; donkergroen, glutaminase/asparaginasen). Roze = residu’s zijn zeer
geconserveerd in beide subfamilies. (Lubkowski et al., 1996)
De secundaire structuur, de lokale opvouwing in driedimensionele
structuurelementen, wordt onder andere bepaald met behulp van circulair dichroisme. CD
steunt op het vermogen van de CD-spectrometer om het verschil in absorptie tussen links-
11
en rechts-circulair gepolariseerd licht te meten. Een afwezigheid van een regelmatige
structuur leidt tot een CD-intensiteit van nul. Een geordende structuur, zoals een α-helix of
een β-sheet, daarentegen zal resulteren in een spectrum. CD heeft ook inzicht gegeven over
het ontvouwen van de secundaire structuren van de proteïne. (Benjwal et al., 2006) (Shifrin
et al., 1972) Differential Scanning Calorimetry (DSC) kan worden aangewend om de
thermische stabiliteit te bepalen. Hierbij wordt een staal samen met een referentie
verwarmd en op dezelfde temperatuur gehouden. Het verschil in toegevoegde warmte is
hier dan te wijten aan ontvouwing van de proteïne door breking van de H-bruggen van de α-
helix of β-sheet structuren. (Benjwal et al., 2006) (Bruylants et al., 2005)
De tertiaire structuur van asparaginase (Figuur 1.8) werd bepaald met behulp van X-
straal kristallografie, een techniek die de relatieve positie van atomen binnen een kristal
toont, en NMR (nucleaire magnetische resonantie), een techniek waarmee men de
omgeving van een atoom kan onderzoeken. Elk monomeer is identiek en bestaat uit 2 α/β
domeinen. (Lubkowski et al., 1996) (Wehner et al., 1992)
Figuur 1.8 : Driedimensionale structuur van Erwinia chrysanthemi asparaginase. Een
van de 4 identieke monomeren is aangeduid in felle kleuren. De C-terminale uiteinden zijn
rood gekleurd, de N-terminale uiteinden blauw. Een van de actieve centra wordt
voorgesteld door het grijze gebied. (Lubkowski, 2003)
12
De quaternaire structuur van het enzym werd ook via X-straal kristallografie bepaald.
Zo weten we bijvoorbeeld dat asparaginase voorkomt als een homotetrameer, die te
beschouwen valt als een dimeer van dimeren. (Swain et al., 1993) (Lubkowski et al., 1996)
1.2.2.3. Zuiverheidsanalyse
Zuiverheid van asparaginase werd nagegaan met behulp van gelelektroforese, zowel
SDS-PAGE (natrium dodecylsulfaat polyacrylaminde gelelektroforese) als 2-dimensionale
elektroforese. Dit werd gekoppeld aan een immunoblotting. Dit laat niet enkel toe met een
bepaalde zekerheid te zeggen of het eiwit wel asparaginase is (identificatie), maar ook of er
degradatie-fragmenten, andere contaminant-eiwitten of andere onzuiverheden in het staal
zitten. (Gupta et al., 2009)
1.2.3. Actief Centrum
Asparaginasen zijn enzymen die actief zijn als homotetrameren met een 222
symmetrie (orthorhombische vorm). Elk monomeer bestaat uit ongeveer 330
aminozuurresidues (in geval van Erwinia chysanthemi zijn het er 327) die 14 β-sheets en 8 α-
helixen vormen, gerangschikt in twee te onderscheiden α/β domeinen, namelijk het grotere
N-terminale domein en het kleinere C-terminale domein (zie figuur 1.9). Beide domeinen zijn
verbonden met een linker die bestaat uit een 20-tal residues. Tussen de 4e en de 5e β-sheet
van het N-terminaal domein bevindt er zich een cross-over die linksdraaiend is, wat vrij
zelden voorkomt. Dit is een belangrijke determinant van hun activiteit. (Lubkowski et al.,
2003) (Papageorgiou et al., 2008)
Asparaginase kan beschouwd worden als een dimeer van 2 intieme dimeren en heeft
4 actieve centra. Elk van deze actieve centra bevat voornamelijk aminozuren uit het N-
terminale domein van de ene subunit, maar bevat contacten uit het C-terminaal domein van
de intiem gebonden subunit (Figuur 1.9). De twee actieve centra van elke dimeer liggen
tussen het N-terminale domein van de ene subunit en het C-terminale domein de andere
subunit. (Lubkowski et al., 2003) (Swain et al., 1993)
13
Figuur 1.9: Actief centrum van een monomeer van Erwinia chrysanthemi. Het N-terminale
domein is in het blauw afgebeeld, het C-terminale domein in het rood, de linker-regio in
het grijs. Een fragment van het tweede monomeer dat bijdraagt tot de actieve site is
afgebeeld in het licht rood. (Aghaiypour et al., 2001)
Twee aminozuurresidu’s die belangrijk zijn in het katalytisch proces en zich in het
actieve centrum bevinden zijn Thr-15 (threonine) en Tyr-29 (tyrosine) (Figuur 1.10). Thr-15
(en voor E. coli Thr-12) is geïdentificeerd als het primaire nucleofiel, Tyr-29 houdt de
aanvallende nucleofiel in de meest gunstige positie. (Kravchenko et al., 2008) Het eerste
tetraëdrische acylenzyme-tussenproduct wordt gevormd na een nucleofiele aanval door Thr-
15 op het carbonzuur koolstof van het substraat. Die koolstof ondergaat dan een nucleofiele
aanval door een watermolecule, en het tweede tetraëdrische intermediair wordt omgezet
tot het uiteindelijke product. (Aghaiypour et al., 2001)
14
Figuur 1.10: Close-up van het actief centrum van Erwinia chrysanthemi met aspartaat
(achtergrond) en sulfaat (voorgrond) gebonden. W = watermolecule, getallen zijn de
bindingslengte (in Angström) van de waterstofbrug met tussen haakjes de
standaarddeviatie. Rood= zuurstof. Blauw = stikstof. (Lubkowski et al., 2003)
In de omgeving van het actief centrum vindt men een flexibele lus (Figuur 1.11), van
residu 14 tot 33, dat de bindingsplaats afdicht bij binding van het substraat aan het enzym.
Residu’s Gly-13 (glycine) tot en met Gly-18 vormen de scharnier van de flexibele lus dat zich
systematisch aanpast aan 1 van de 2 conformaties, namelijk open of gesloten. In gesloten
toestand is de zijketen van Thr15 naar het centrum van het actieve centrum. (Lubkowski et
al., 2003)
15
Figuur 1.11 Flexibele lus van Erwinia chryanthemi asparaginase (Lubkowski et al., 2003)
Om te kunnen binden op het actieve centrum moet het substraat voorkomen in de
zwitterionvorm, m.a.w. moet asparagine elektrisch neutraal zijn. Gebonden asparagine gaat
waterstofbindingen vormen met residu’s uit het rigide deel van de pocket en residue’s van
de mobiele lus (Thr-15 en Tyr-29) waardoor er een soort “brug” ontstaat tussen beide delen.
Moleculen groter dan L-glutamine, een natuurlijk substraat, passen niet in het actieve
centrum. (Lubkowski et al., 1996) (Aghaiypour et al., 2001)
Glutamine speelt een belangrijke rol in het stikstoftransport in het bloed en
langdurige depletie van dit aminozuur gedurende de asparaginasetherapie veroorzaakt
ernstige nevenwerkingen. Sommige asparaginasen, zoals E. coli-asparaginase, hebben
glutaminase-activiteit. In deze glutaminase-activiteit zou residu Asn-248 (asparagine) een
grote rol spelen. Dit residu is in Erwinia chrysanthemi, dat geen glutaminase-activiteit
vertoont, vervangen door Ser-248 (serine). Residu 248 neemt deel in waterstofbindingen
met Asp-90 (asparaginezuur) (zowel het Ser-248 als Asn-248 residu) en met Glu-283 (enkel
het Asn-248 residu). De rol van residu Asp-90 is waarschijnlijk de conformaties van de
negatief geladen zijketens die dicht bij elkaar liggen te stabiliseren. (Lubkowski et al., 1996)
(Aghaiypour et al., 2001)
16
1.2.4. Soorten asparaginase
Er zijn heel wat species die asparaginase tot expressie brengen, waardoor deze
enzymen andere eigenschappen (zoals KM (Michaëlis constante), specifieke activiteit,
moleculair gewicht, optimale temperatuur en pH) kunnen bevatten. Voor een meer
gedetailleerde lijst wordt verwezen naar Bijlage 1.
Bacterieel: Dit koninkrijk bevat de meeste asparaginasen. Hierbij zijn het
voornamelijk de proteobacteriën die dit enzym tot expressie brengen, alsook
sommige firmicutes, deinococcus-thermus, ciliophora en actinobacteriën.
Schimmel: De ascomycota en basidiomycota zijn hier de divisies die het enzym tot
expressie brengt.
Plant: Hierbij is het vooral in de angiospermen dat asparaginase wordt
teruggevonden, hoewel er in enkele pinophyta en bryophyta ook asparaginase is
aangetroffen.
1.2.5. Stabiliteit
Asparaginase (van E. coli) heeft een vrij breed pH-activiteitsgebied gaande van pH 4,5
tot pH 11,5; hierbuiten verliest het zijn activiteit. Rond pH 4,5 en pH 11,5 zakt de activiteit
naar ongeveer 50% van de maximale activiteit. Na tijdelijke blootstelling aan deze pH’s, werd
de pH terug naar 8.5 gebracht, waarna het enzym zijn activiteit terugkreeg. Dit wijst erop dat
de conformationele veranderingen bij deze pH’s nog reversibel zijn.
Er werd een kleine stijging in activiteit opgemerkt als de pH stijgt van ongeveer 4,5
naar 10,5 (Figuur 1.9). De reden dat het activiteitsmaximum in de alkalische regio ligt, is
waarschijnlijk een gevolg van het evenwicht tussen asparaginezuur en asparagine.
Asparaginezuur in zuur milieu is geprotoneerd en heeft een grotere affiniteit voor het actief
centrum. Onder die omstandigheden wordt het een competitieve inhibitor. Bij alkalische pH
verschuift de balans richting gedeprotoneerde vorm, namelijk aspartaat. Dit is de vorm met
een lagere affiniteit voor het actief centrum. Hierdoor is de binding van het actief centrum
met asparagine bij iets hogere pH bevoordeeld.
17
Figuur 1.9 Activiteit/stabiliteits-pH relatie van E. coli asparaginase
Asparaginase kan door temperatuursstijging zijn functie volledig verliezen en deze
ook weer partieel terugwinnen, afhankelijk van de condities waarin het enzym zich bevindt.
Na opwarming (65°C, 20 min) bleek er na afkoeling (37°C) geen herstel van activiteit bij pH 5
en pH 11,5. Bij pH 8,6 werd 50% van de oorspronkelijke activiteit waargenomen. Stecher et
al. toonde hiermee aan dat er een irreversibele structurele verandering bij pH 5 en 11,5
plaatsvond, zonder herstel, terwijl er bij pH 8,6 wel partieel herstel optreed. Deze
denaturatie kan een gevolg zijn van de dissociatie van asparaginase subunits. (Stecher et al.,
1999)
18
2. OBJECTIEF
Er is tegenwoordig nog geen consensus over welke toedieningsweg (i.v. of i.m.),
snelheid van toediening en concentratie de meest effectieve en veilige is. Gezien de klinische
vraag naar infuustoediening, die afwijkt van de beperkte en enige erkende toedieningswijze
(i.m. bolus), en het gebrek aan stabiliteitsgegevens, wensen wij in deze initiële
onderzoeksfase de verschillende methoden te vergelijken waarmee we de activiteit van het
enzym als farmaceutisch preparaat kunnen bepalen.
Het hoofdobjectief van deze masterthesis is dus een comparatieve studie maken van
de verschillende methoden om de activiteit van asparaginase als farmaceutisch preparaat
te bepalen. Deelaspecten daartoe zijn:
1. De ontwikkeling van verschillende methoden, aangepast voor het onderzoek
in QC omstandigheden.
2. De evaluatie van de verschillende methoden.
3. Het vergelijken van deze methoden, gebaseerd op statistische en andere
descriptoren.
Aan de hand de aldus bekomen kengetallen, kan een prioriteitslijst van methoden
opgesteld worden.
Deze thesis is een pilootwerk, dat kadert binnen een collaboratief onderzoek om
uiteindelijk de stabiliteit van asparaginase in een farmaceutisch preparaat te kunnen
bepalen. Daarnaast zal men ook andere technieken, zoals MS en CD gebruiken om de
stabiliteit te karakteriseren.
19
3. MATERIAAL EN METHODEN
3.1. TOESTELLEN EN REAGENTIA
3.1.1. UV/Vis spectrofotometer
Het toestel waarop de metingen zijn uitgevoerd is een UV/Vis spectrofotometer
(interne referentie QR-185) “Ultraspec 4000” van Pharmacia Biotech. Deze is uitgerust met
een deuterium lamp van Cathodion. De cuvetten die gebruikt werden zijn quartz-suprasil
cuvetten met een weglengte van 1 cm. Een cuvetcorrectie werd doorgevoerd voor iedere
proefneming.
3.1.2. Centrifuge
De centrifuge is een gekoelde tafelcentrifuge “Eppendorf Centrifuge 5417” (interne
referentie QR-263), afkomstig van Voor’t Labo, Eeklo.
3.1.3. Thermomixer
Het apparaat om de Eppendorfs te verwarmen is een “Eppendorf Thermomixer
Comfort” (interne referentie QR-412). Deze werd aangekocht bij Fisher Scientific, Aalst.
3.1.4. pH meter
De gebruikte pH meter is een “SevenEasy pH Meter S20” (interne referentie QR-333),
aangeschaft bij Mettler Toledo, Schwerzenbach.
3.1.5. Waterstation
Het waterzuiveringsstation dat werd gebruikt om het water te deïoniseren is een
Arium 611VF Water Purification System (interne referentie QR-233), aangekocht bij Sartorius,
Leuven.
20
3.1.6. Balansen
De gebruikte balansen om af te wegen zijn Analytical Balance XS-105 D (interne
referentie QR-277) en Analytical Balance XS-204 (interne referentie QR-196), beide
aankomstig van Mettler Toledo, Zaventem.
3.1.7. Producten
In onderstaande Tabel 3.1 staan alle producten die voor deze masterthesis zijn
gebruikt, inclusief lotnummer en productcode.
Tabel 3.1: Gebruikte producten
Product Leverancier Productcode Lotnummer
Kwik(II)-jodide Merck (Whitehouse Station, USA) 4420 4168046
Kaliumjodide Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) 100934463 BCBB9119
Natriumhydroxide Fluka Analytical (Buchs, Zwitserland)
71694 1421467
DruQuaR water Jochem 14/03/2011 10h21
Ammoniumchloride UCB (Brussel, België) 1141 89079051
Natriumcarbonaat (watervrij)
UCB (Brussel, België) 1720 99D210054
Natriumwaterstofcarbonaat UCB (Brussel, België) 1707 92287083
Natrium nitroprusside Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) 13451 SZBA0970
Thymol Janssen Chimica (Geel, België) 15.033.95 2378912
Ethanol Chem-lab (Zedelgem, België) CL00.0112.2500 18.2400710.2400
Natriumhypochloriet Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) 425044 STBB7477V
Fenol kristallen Conforma S.A. (Destelbergen, België) / 100g 14253
Hydroxylamine hydrochloride
UCB (Brussel, België) 1391 94027196
Zoutzuur Sigma-Aldrich St.-Louis, USA) 30721 91770
8-hydroxyquinoline Aldrich (St.-Louis, USA) 252565-50G BCBD6040V
Absolute ethanol Riedel-de Haën (Seelze, Duitsland)
nbs 7118A
Citroenzuur monohydraat Merck (Whitehouse Station, USA) 244.1000 K16008444
Dinatriumwatterstoffosfaat dihydraat
Merck (Whitehouse Station, USA) 10.6580.1000 K28624480
Trichloorazijnzuur Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) 33731 90340
Ammonia Assay Kit Sigma (St.-Louis, USA) AA0100-1KT 100M6204
Malaat Dehydrogenase Sigma (St.-Louis, USA) 63228-10MG 1441510V
Aspartaat transaminase Sigma (St.-Louis, USA) 62751-1KU 069K7003V
21
β-nicotinamide Adenine Dinucleotide
Sigma (St.-Louis, USA) N4505-100MG 010M5153V
Kaliumwaterstoffosfaat Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) 00662-1K6 063K0147
Asparaginezuur ABC Chemicals (Lancashire, Engeland)
260204 04B23M0126
Dinatrium α-ketoglutaarzuur dihydraat
Aldrich (St.-Louis, USA) 101031942 BCBC9151V
Kaliumwaterstoffosfaat Merck (Whitehouse Station, USA) 1.048.731.000 A0188073101
Albumine Standaard BSA Thermo (Scientific Rockford, USA) 23209 IL116702
PBS-buffer Sigma (St.-Louis, USA) P-3813 060M8222
3.2. METHODEN
In de literatuur worden verscheidene technieken beschreven om de activiteit van
asparaginase te bepalen (zie sectie 1.2.2. Karakterisatie). Hieruit werden 5 methoden
geselecteerd: Nessler, Berthelot, Indooxine, Glutamaat Dehydrogenase en Aspartaat
Transaminase. De keuze werd bepaald door enkele voorafgaande overwegingen:
De substraat/productbepaling dient selectief, maar instrumenteel en
operationeel zo eenvoudig en robuust mogelijk te zijn.
De methode dient kwantificatie toe te laten, waarbij accuraatheid, precisie en
lineariteit belangrijke aspecten zijn.
Algemene kosten, inclusief analysetijd, dienen zo minimaal mogelijk gehouden te
worden.
Gezien deze “gebruikerswensen”, werden methoden gebaseerd op elektrische
geleidbaarheid (selectiviteit?) of HPLC bepalingen (eenvoud? kost?) niet weerhouden.
Methoden die finaal gebruik maken van UV-VIS werden dus verkozen. Hierbij werd steeds
voor elke methode gestart met een literatuurstudie, waarna er één protocol geselecteerd
werd op basis van de gebruiksfrequentie in publicaties en detail van de beschrijvingen (Tabel
3.2).
22
Tabel 3.2: Basisprotocols
Methode Basisprotocols
Nessler EPA method 350.2, 1974
Franklin Township Municipal Sanitary Authority, 2006
Berthelot
Searcy et al., 1964
Afkhami et al., 2008
Moliner-Martinez et al., 2005
Indooxine Frear et al., 1955
Lanvers et al., 2002
Glutamaat Dehydrogenase Sigma Aldrich gebruikersprotocol, 2008
Aspartaat Transaminase Wilkinson et al., 1972
Asselin et al., 1993
In vele gevallen ging het echter om bio-activiteitsbepalingen die asparaginase in
serum/plasma bepalen. Dit protocol werd dan door ons aangepast, waarbij eenvoud en
lineariteit de belangrijkste ontwikkelingscriteria waren.
3.2.1. Nessler
Reagentia
o Nessler reagens: 1,4 g kaliumjodide en 2,2 g kwik(II)-jodide oplossen in
enkele ml water en aanlengen tot 10 ml. 3,2 g natriumhydroxide oplossen
in enkele ml water en aanlengen tot 10 ml. Meng beide oplossingen.
Hierbij kan een kleine hoeveelheid rood-bruine neerslag van kalium
tetraiodomercuraat ontstaan. Bewaard in een donkere fles, uit het directe
zonlicht, blijft dit reagens tot 1 jaar stabiel.
23
Standaardreeks
o Ammonium referentie stockoplossing: 315,0 mg ammoniumchloride
oplossen in water en aanlengen tot 100,0 ml (1000 ppm). Hiervan 10,0 ml
pipetteren in een maatkolf van 100,0 ml en aanlengen tot de ijkstreep
(100 ppm). Van deze stockoplossing werd de standaardreeks bereid (Tabel
3.3).
Tabel 3.3: Standaardreeks Nessler
Concentratie (ppm) Volume stockoplossing (ml) Totaal volume (ml)
blanco 0,0 10,0
0.5 5,0 1000,0
1 5,0 500,0
3 6,0 200,0
5 10,0 200,0
10 5,0 50,0
15 15,0 100,0
20 10,0 50,0
Werkwijze: Van bovenstaande oplossingen werd 10,0 ml gepipetteerd in een
proefbuis en in iedere proefbuis werd 0,2 ml van de heldere fractie van het
Nessler reagens gepipetteerd. De oplossingen werden gemengd en de reactie
ging door gedurende 10 minuten. Hierna werd de absorbantie van de oplossingen
bepaald met behulp van de spectrofotometer bij een golflengte van 425 nm ten
opzichte van een blanco.
Berekeningen: Om via deze methode de concentratie van ammonium in een
onbekend staal te berekenen, stelt men een ijkcurve op van de standaardreeks.
Met de vergelijking van die ijkcurve kan men, met behulp van de absorbantie, de
concentratie bepalen.
24
3.2.2. Berthelot
Reagentia
o Fenol kleurreagens: 5 g fenol en 25 mg natrium-nitroprusside oplossen in
water en aan te lengen tot 100 ml.
o Alkalisch hypochlorietreagens: 2,5 g natriumhydroxide oplossen in water,
3 ml 10-15% natriumhypochloriet toevoegen en aanlengen tot 100 ml.
Standaardreeks
o Ammonium referentie stockoplossing: 315,0 mg ammoniumchloride
oplossen in water en aanlengen tot 100,0 ml (1000 ppm). Hiervan 10,0 ml
pipetteren in een maatkolf van 100,0 ml en aanlengen tot de ijkstreep
(100 ppm). Hiervan nogmaals 10,0 ml pipetteren in een maatkolf van
100,0 ml en aanlengen tot de ijkstreep (10 ppm). De standaardreeks werd
vanuit deze stockoplossing bereid (Tabel 3.4).
Tabel 3.4: Standaardreeks Berthelot
Concentratie (ppm) Volume stockoplossing (ml) Totaal volume (ml)
blanco 0,0 10,0
0,1 1,0 100,0
0,2 2,0 100,0
0,5 5,0 100,0
1 10,0 100,0
3 30,0 100,0
5 50,0 100,0
Werkwijze: 1,0 ml van het fenol kleurreagens werd toegevoegd aan 10,0 ml van
de ammonium standaarden, waarna 30 seconden geschud werd. Vervolgens
werd 1,0 ml van het alkalisch hypochlorietreagens toegevoegd en opnieuw
gedurende 30 seconden geschud. De reactie ging gedurende 15 minuten door bij
37,0°C. Hierna werd de absorbantie van de stalen gemeten bij 633 nm ten
opzichte van een blanco.
25
Berekeningen: Aan de hand van de ijkcurve, die kan worden opgesteld met
behulp van de standaardreeks, kan men de concentratie van ammonium in een
onbekend staal bepalen.
3.2.3. Indooxine
Reagentia
o 8-hydroxyquinoline reagens: 0,2 g 8-hydroxyquinoline oplossen in 10 ml
absolute ethanol (2% (w/v)). 5,3 g natriumcarbonaat oplossen in water en
aanlengen tot 50 ml (1M). Meng 10 ml van de 2% (w/v) 8-
hydroxyquinoline-oplossing met 30 ml van de 1M natriumcarbonaat-
oplossing.
o 0,05 M fosfaatbuffer (pH 6,8): 7,15 g dinatriumwaterstoffosfaat oplossen
in water en aanlengen tot 100 ml. 1,05 g citroenzuur oplossen in water en
aanlengen tot 50 ml. Meng 77,3 ml van de dinatriumwaterstoffosfaat-
oplossing met 22,7 ml van de citroenzuuroplossing.
o Trichloorazijnzuur (12% (w/v)): 1,2 g trichloorazijnzuur oplossen in 10 ml
water.
o 0,01 N HCl oplossing: 100 µl 37 % (m/m) aanlengen tot 100 ml met water.
Standaardreeks
o Hydroxylamine referentie stockoplossing: 84,17 mg
hydroxylamine.hydrochloride oplossen in water en aanlengen tot 1,0 l (40
ppm). Hiervan 25,0 ml pipetteren in een maatkolf van 100 ml, naar pH 3,0
brengen met behulp van een 0,01 N HCl-oplossing en aanlengen tot aan
de ijkstreep (10 ppm). Deze stockoplossing werd gebruikt om de
standaardreeks te bereiden (Tabel 3.5)
26
Tabel 3.5: Standaardreeks Indooxine
Concentratie (ppm) Volume stockoplossing (ml) Totaal volume (ml)
blanco 0,0 10,0
1 1,0 10,0
2 2,0 10,0
3 3,0 10,0
4 4,0 10,0
5 5,0 10,0
6 6,0 10,0
7 7,0 10,0
8 8,0 10,0
9 9,0 10,0
10 10,0 10,0
Werkwijze: 1,0 ml van de standaarden werd aangelengd met 0,8 ml water.
Daarna werd 1,0 ml buffer toegevoegd, alsook 2,0 ml trichloorazijnzuur oplossing.
Dit werd gemengd en daarna werd 2,0 ml van het 8-hydroxyquinoline reagens toe
gevoegd. De stop werd onmiddellijk op de proefbuis geplaatst en er werd hevig
geschud. De oplossingen werden gedurende 1 minuut in een warmwaterbad van
95,0°C verwarmd. De oplossingen lieten we nadien gedurende ongeveer 15
minuten afkoelen in een rek tot kamertemperatuur. Hierna werd de absorbantie
bepaald bij 705 nm ten opzichte van een blanco.
Berekeningen: De concentratie van hydroxylamine in een onbekend staal kan
berekend worden door van de standaard reeks een ijkcurve op te stellen. Met de
vergelijking van die ijkcurve kan men de concentratie van het staal berekenen.
3.2.4. Glutamaat dehydrogenase
Reagentia
o “Ammonia Assay” reagens: Reconstitueer één vial door 10,0 ml water in
de vial te pipetteren, meng door inversie. Gesloten blijft de
gereconstitueerde vial stabiel bij 2-8°C gedurende 2 weken.
27
Standaardreeks
o Ammonium referentie stockoplossing: 157,5 mg ammoniumchloride
oplossen in water en aanlengen tot 500,0 ml (100 ppm). Vanuit deze
stockoplossing werd de standaardreeks bereid, die gelegen is tussen de
aanbevolen range van de “Assay Kit”, zijnde 0,2 – 15 ppm. (Tabel 3.6).
Tabel 3.6: Standaardreeks Glutamaat Dehydrogenase
Werkwijze: In een cuvet werd 1,0 ml van het reagens gepipetteerd, samen met
100 µl van de oplossing met gewenste ammoniak concentratie of water. De
inhoud werd gemengd en geïncubeerd gedurende 5 minuten bij 18-35°C. Water
werd als referentie genomen om de absorbantie bij 340 nm op nul te zetten.
Daarna werden de absorbanties van de verschillende cuvetten bepaald bij 340
nm. Bij elke oplossing voegden we nadien 10,0 µl glutamaat dehydrogenase toe
en lieten opnieuw gedurende 5,0 minuten incuberen bij 18-35°C waarna de
absorbantie opnieuw werd gemeten.
Berekeningen: De concentratie van ammonium in een onbekend staal kan
bepaald worden door middel van een ijkcurve, opgesteld met behulp van de
standaardreeks.
De concentratie kan echter ook berekend worden via Vergelijking 3.1:
Δ A = Ainitieel – AFinaal.
Δ(ΔAStaal) = ΔAstaal - ΔABlanco
Concentratie (ppm) Volume stockoplossing (ml) Totaal volume (ml)
blanco 0,0 1,0
0,5 5,0 1000,0
1 5,0 500,0
3 6,0 200,0
5 10,0 200,0
10 5,0 50,0
15 15,0 100,0
20 10,0 50,0
28
# mg NH3/ml oorspronkelijk staal
=
(3.1)
=
=
A = Δ(ΔAstaal)
TV = Totaal Volume van het assay in ml
SV = Staal Volume in ml
MW van ammonia = 17 g/mol
F= Verdunningsfactor van bij staalvoorbereiding
ε = millimolaire extinctiecoëfficiënt voor NADPH bij 340 nm [in mM-1 cm-1 of
equivalent ml/µmol)(1/cm)]
d = weglengte van het licht (cm) = 1 cm
3.2.5. Aspartaat Transaminase
Reagentia
o Fosfaatbuffer (1,0 M en 0,1 M): 13,6 g kaliumdiwaterstoffosfaat en 3,3 g
natriumhydroxide oplossen in water en aanlengen tot 100 ml (1,0 M, pH
7,5). Pipetteer hiervan 25 ml in een maatkolf van 100 ml en leng aan tot
de ijkstreep.
o NADH oplossing: 4 mg β-NADH oplossen in 2 ml 0,1 M fosfaatbuffer. Deze
oplossing is slechts 1 dag stabiel.
o α-ketoglutaarzuur oplossing: 0,73 g α-ketoglutaarzuur oplossen in 35 ml
water en 5 ml buffer. De pH werd gemeten en indien nodig gecorrigeerd
naar 7,5. Deze oplossing is een maand houdbaar bij 4 °C
29
o Aspartaat transaminase oplossing (9-10 U): 30 µl aspartaat transaminase
suspensie (434 U/mg) pipetteren in een maatkolf van 2 ml en aanlengen
tot de ijkstreep met 0,1 M fosfaatbuffer.
o Malaat dehydrogenase oplossing (9-10 U): 1 mg malaat dehydrogenase
(432 U/mg) op lossen in 0,1 M fosfaatbuffer en aanlengen tot 5 ml.
Standaardreeks
o Asparaginezuur referentie stockoplossing: 25,0 mg asparaginezuur op
lossen in 350,0 ml water en 50,0 ml 1,0 M fosfaatbuffer, de pH indien
nodig corrigeren naar 7,5 en aanlengen tot 500,0 ml met water (50 ppm).
Deze stockoplossing werd gebruikt om de standaardreeks te bereiden
(Tabel 3.7).
Tabel 3.7: Standaardreeks Aspartaat Transaminase
Concentratie (ppm) Volume stockoplossing (ml) Totaal volume (ml)
blanco 0,0 50
5 5,0 50
10 10,0 50
15 15,0 50
20 10,0 25
25 25,0 50
30 15,0 25
35 35,0 50
40 20,0 25
Werkwijze: 1,3 ml van de 0,1 M fosfaatbuffer, 1,0 ml asparaginezuuroplossing,
0,2 ml NADH, 0,1 ml malaat dehydrogenase en 0,2 ml aspartaat transaminase
werden in een proefbuis gepipetteerd en geïncubeerd gedurende 15 minuten bij
25,0 °C. De reactie werd gestart door 0.2 ml van de α-ketoglutaarzuur oplossing
toe te voegen, waarna voorzichtig werd gemengd. De reactie ging door bij 25,0 °C
gedurende 5,0 minuten. De daling in absorbantie werd na deze 5 minuten
bepaald bij 340 nm.
30
Berekeningen: Aan de hand van een ijkcurve, die kan worden opgesteld met de
standaardreeks, kan men de concentratie van asparaginezuur in een onbekend
staal bepalen.
3.2.6. Methodenevaluatie
De stockoplossingen werden als volgt bereid:
Stockoplossingen Protocol
o Ammonium stockoplossing: 20,0 mg ammoniumchloride in water en
aanlengen tot 100,0 ml (63,7 ppm). Dit 10 en 100 maal verdunnen om
respectievelijk een 6,37 ppm en 0,637 ppm stockoplossing te bekomen.
o Hydroxylamine stockoplossing: 26,0 mg hydroxylamine.hydrochloride in
water en aan lengen tot 200,0 ml. Dit 10 maal verdunnen teneinde een
6,18 PPM stockoplossing te bekomen.
o Asparaginezuur stockoplossing: 20,0 mg asparaginezuur in water en
aanlengen tot 100,0 ml. Deze oplossing 10 maal verdunnen, teneinde een
20 ppm stockoplossing te bekomen.
Stockoplossingen andere stalen
o Ammonium stockoplossing: 200,0 mg ammoniumchloride in PBS en
aanlengen tot 100,0 ml
o Hydroxylamine stockoplossing: 130,0 mg hydroxylamine.hydrochloride in
PBS en aanlengen tot 100,0 ml.
o Asparaginezuur stockoplossing: 250,0 mg asparaginezuur in PBS en
aanlengen tot 50,0 ml.
31
4. RESULTATEN
4.1. NESSLER
In Bijlage 2 vindt men de absorbantiewaarden terug, gemeten bij 425 nm. Figuur 4.1
geeft deze waarden grafisch weer. Op de bekomen waarden werd een lineaire regressie
toegepast: R² was 0,9989, de F-waarde bedroeg 1800,6. De 95% betrouwbaarheids-
intervallen voor het snijpunt en de richtingscoëfficiënt zijn respectievelijk [-0,03764;0,04450]
en [0,1226;0,1503]. De R² en F-waarde vertellen ons dat er een sterk lineair verband is
tussen de concentratie en de absorbantie bij 425 nm. In Bijlage 2 vindt men eveneens de
plot van de gestandaardiseerde residuen, waarop men een parabolische vorm kan
waarnemen. Deze kan indicatief zijn voor een kwadratisch verloop. Dit is echter niet zo daar
de kwadratische coëfficiënt niet significant is. Gezien het betrouwbaarheidsinterval van het
snijpunt de nul bevat, kunnen we er ook vanuit gaan dat deze lineaire curve door de
oorsprong gaat, zodat in de toekomst een 1-puntscalibratie kan volstaan. Ervan uitgaande
dat absorbantiewaarden boven 1 minder gunstig zijn voor kwantitatieve doeleinden, is de
bovengrens van het werkzame gebied met onze Nessler methode dus 7,3 ppm.
Figuur 4.1: ijkcurve Nessler
y = 0,1365x + 0,0034R² = 0,9989
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
0 1 2 3 4 5 6 7
Ab
sorb
anti
e (
42
5 n
m)
PPM
Nessler: ijkcurve
32
4.2. BERTHELOT
De absorbantiewaarden, gemeten bij 633 nm, vindt men terug in Bijlage 3. Deze
waarden worden grafisch weergegeven in Figuur 4.2. Op de bekomen waarden werd een
lineaire regressie toegepast: R² was op 0,9922, de F-waarde bedroeg 380,8. Het 95%
betrouwbaarheidsinterval voor het snijpunt is [-0,1180;0,05323] en het 95 %
betrouwbaarheidsinterval voor de richtingscoëfficiënt is [0,7892;1,097]. Het
betrouwbaarheidsinterval van het snijpunt bevat de nul, waardoor we kunnen aannemen
dat deze deze ijkcurve ook door de oorsprong gaat, waardoor in de toekomst een 1-
puntscalibratie kan volstaan. Uit de R² en F-waarde kunnen we afleiden dat er tussen de
concentratie en de absorbantie bij 633 nm een sterk lineair verband is, wat bevestigd wordt
door de gestandaardiseerde residuen (Bijlage 3). De helling bij Berthelot is veel groter dan
deze bij Nessler, waaruit we kunnen concluderen dat Berthelot een grotere sensitiviteit
heeft. Absorbantiewaarden boven de 1 zijn, zoals bij 4.1 reeds aangehaald, minder geschikt
voor kwantitatieve doeleinden. Daarom is de bovenlimiet van deze methode 1,1 ppm.
Figuur 4.2: ijkcurve Berthelot
y = 0,943x - 0,0324R² = 0,9922
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Ab
sorb
anti
e (
63
3 n
m)
PPM
Berthelot: ijkcurve
33
4.3. INDOOXINE
Figuur 4.3 geeft de absorbantiewaarden, die we hebben bekomen bij 705 nm,
grafisch weer. Deze waarden, samen met de grafiek van de gestandaardiseerde residuen,
vindt men terug in Bijlage 4. Op deze waarden werd een lineaire regressie toegepast: de
gevonden R² was 0, 9975 terwijl de F-waarde 3153,1 bedroeg. Uit deze gegevens kunnen we
afleiden dat er voor deze methode een sterk lineair verband bestaat tussen de concentratie
en de absorbantie bij 705 nm Voor het snijpunt en de richtingscoëfficiënt waren de 95%
betrouwbaarheidsintervallen respectievelijk [0,005816;0,05192] en [0,08675;0,09416]. Het
interval van het snijpunt bevat de waarde nul niet, waardoor we niet met zekerheid kunnen
zeggen dat een 1-puntscalibratie met deze methode mogelijk is. De sensitiviteit van deze
methode kleiner dan deze van Berthelot en Nessler, daar de richtingscoëfficiënt kleiner is
dan die van de twee voorgaande methoden. De bovenlimiet bij onze Indooxine methode is
10,7 ppm (Absorbantie = 1) .
Figuur 4.3: ijkcurve Indooxine
y = 0,0905x + 0,0289R² = 0,9975
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 2 4 6 8 10 12
Ab
sorb
anti
e (
70
5 n
m)
PPM
Indooxine: ijkcurve
34
4.4. GLUTAMAAT DEHYDROGENASE
Bijlage 5 bevat de absorbantiewaarden van deze methode, gemeten bij 340 nm en
Figuur 4.4 geeft deze waarden grafisch weer. De resultaten van de lineaire regressie, die op
deze waarden werden toegepast, zijn de volgende: R² was 0, 9991 en de F-waarde bedroeg
6377,6. Deze resultaten wijzen op een sterk lineair verband tussen de concentratie en
absorbantie bij 340 nm. In bijlage 5 vindt men ook de grafische weergave van de
gestandaardiseerde residuen terug, die ook een lineair verband bevestigen. Het 95%
betrouwbaarheidsinterval van het snijpunt bedroeg [0,9902;1,0091], het 95%
betrouwbaarheidsinterval de richtingscoëfficiënt bedroeg [-0,03258;-0,03065]. Dit interval
bevat absolute waarden kleiner dan de richtingscoëfficiënten van de voorgaande methoden,
waardoor we kunnen besluiten dat deze methode minder sensitief is. Daar het bij deze
methode om een daling in absorbantie gaat, hebben we vastgelegd dat een daling van meer
dan 0,5 absorbantie-eenheden minder gunstig is voor een kwantitatieve bepaling. De
bovenlimiet van de range is bijgevolg 15,8 ppm voor deze methode.
Figuur 4.4: ijkcurve Glutamaat Dehydrogenase
y = -0,0316x + 0,9996R² = 0,9991
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
0 5 10 15 20 25
Ab
sorb
anti
e (
34
0 n
m)
PPM
Glutamaat Dehydrogenase: ijkcurve
35
4.5. ASPARTAAT TRANSAMINASE
In Bijlage 6 vindt men de absorbantiewaarden, gemeten bij 340 nm, die op Figuur 4.5
grafisch weergegeven worden. Op deze waarden werd een lineaire regressie toegepast: R²
was 0, 9963 en de F-waarde bedroeg 1864,9. Hierdoor kunnen we besluiten dat er een sterk
lineair verband bestaat tussen de concentratie en de absorbantie bij 340 nm, wat bevestigd
wordt door de gestandaardiseerde residuen die terug te vinden zijn in Bijlage 6. De
betrouwbaarheidsintervallen voor het snijpunt en de richtingscoëfficiënt zijn respectievelijk
[0,8854;0,9135] en [-0,01137;-0,01019]. De richtingscoëfficiënt heeft een absolute waarde
kleiner dan de voorgaande methodes, waardoor we kunnen besluiten dat deze methode de
minst sensitieve is. Gezien dalingen van meer dan 0,5 absorbantie-eenheden minder gunstig
zijn voor kwantitatieve doeleinden, werd de bovengrens het werkzaam gebied voor onze
methode bepaald op 46,3 ppm.
Figuur 4.5: ijkcurve Aspartaat Transaminase
y = -0,0108x + 0,8995R² = 0,9963
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Ab
sorb
anti
e (
34
0 n
m)
PPM
Aspartaat Transaminase: ijkcurve
36
4.6. GESIMULEERDE ASPARAGINASE METHODENEVALUATIE
4.6.1. Situering
Om na te gaan of de methoden ook toepasbaar zijn wanneer ze gebruikt worden om
de activiteit van asparaginase te bepalen, werd elke methode onderworpen aan een
gesimuleerde asparaginase-activiteitsbepaling. Er werd in deze fase van methode-
ontwikkeling dus nog niet gewerkt met asparaginase zelf, gezien de hoge kostprijs ervan.
Figuur 4.6: schema asparaginase
Steeds werden 4 verschillende stalen aangemaakt, ieder in drievoud: staal W (water),
staal B (buffer), staal A (acid) en staal BSA. Het staal W volgde de bereiding zoals beschreven
wordt in sectie 3.2.1. en in vorige secties geëvalueerd werden. De stalen B, A en BSA volgden
het schema afgebeeld in Figuur 4.6 en de samenstelling van de stalen vindt men in Tabel 4.1.
Hierdoor kan een eventuele interferentie of interactie opgespoord worden.
Tabel 4.1: Staalsamenstelling
Volume stock (ml) Volume BSA (µl) Volume HCl (µl) Volume PBS (µl) Totaal volume (ml)
Staal W 0 0 0 0 2,21
Staal B 2 0 0 21 2,21
Staal A 2 0 10 11 2,21
Staal BSA 2 11 10 0 2,21
37
Vooraleer het afgenomen supernatans kan worden gebruikt, moet deze verdund
worden in functie van de methode gezien de verschillende werk-concentraties. Tabel 4.2
geeft de verdunningsfactoren en uiteindelijke concentraties weer.
Tabel 4.2: Verdunningsreeks
Protocol Verdunningsfactor Eindconcentratie te meten product (ppm)
Nessler 1/100 6,39
Berthelot 1/1000 0,639
Indooxine 1/100 6,18
Glutamaat Dehydrogenase 1/100 6,39
Aspartaat Transaminase 1/250 19,97
Hieronder vindt men de resultaten van de methodenevaluatie. Ieder staal werd
standaard in twee- of drievoud bereid. Gemiddelden, st. dev. (standaard deviatie) en RSD
(relatieve standaard deviatie) worden gegeven van de verschillende stalen, alsook de
resultaten van de one-way ANOVA en Post-Hoc analyses (Tukey’s HSD (Honestly Significant
Difference), Bonferroni en LSD (Least Significant Difference)).
4.6.2. Nessler
Tabel 4.3 toont de gemeten waarden van de stalen onderworpen aan de Nessler
methode. De RSD’s van deze stalen hebben een waarde die lager is dan 2,5: dit is de door
ons opgelegde grens waaronder we de herhaalbaarheid als aanvaardbaar definiëren.
38
Tabel 4.3: Nessler
Staal Absorbantie425 nm Statistiek
Staal W1 0,877 Gemiddelde: 8,72E-01
Staal W2 0,872 St. Dev.: 5,00E-03
Staal W3 0,867 RSD: 5,73E-01
Staal B1 0,862 Gemiddelde: 8,61E-01
Staal B2 0,862 St. Dev.: 2,31E-03
Staal B3 0,858 RSD: 2,68E-01
Staal A1 0,862 Gemiddelde: 8,54E-01
Staal A2 0,847 St. Dev.: 7,64E-03
Staal A3 0,852 RSD: 8,95E-01
Staal BSA1 0,849 Gemiddelde: 8,58E-01
Staal BSA2 0,866 St. Dev.: 8,54E-03
Staal BSA3 0,859 RSD: 9,96E-01
Figuur 4.7: Plot Nessler
De Levene homogeniteitstest van de variantie leverde een Levene statistiek waarde op van
1,170 met significantie 0,380. Vervolgens gaf een one-way ANOVA analyse ons een F(3,8) =
4,549 met significantie 0,038. Gezien onze F-waarde statistisch significant is, kunnen we
besluiten dat minstens een van de gemiddelden statistisch verschillend is van de andere.
Omwille hiervan werden Post-Hoc testen uitgevoerd en deze wezen uit dat er een significant
39
verschil is tussen de staal W- en staal A-populatie (Tukey HSD, Bonferroni en LSD) en tussen
de staal W- en staal BSA-populatie ( enkel LSD). Er worden 2 homogene subsets gedefinieerd,
namelijk staal W-staal B-staal BSA en staal B-staal A-staal BSA. Figuur 4.7 geeft grafisch de
resultaten weer. De resultaten van de Levene-, ANOVA- en Post Hoc-testen vindt men terug
in Bijlage 7.
4.6.3. Berthelot
In Tabel 4.4 worden de gemeten waarden getoond van de stalen die werden
onderworpen aan de Berthelot methode. Deze stalen hebben RSD’s met een waarde die
lager is dan 2,5, wat een goede herhaalbaarheid aantoont.
Tabel 4.4: Berthelot
Staal Absorbantie633
nm Statistiek
Staal W1 0,612 Gemiddelde: 6,12E-01
Staal W2 0,608 St. Dev.: 3,51E-03
Staal W3 0,615 RSD: 5,74E-01
Staal B1 0,624 Gemiddelde: 6,25E-01
Staal B2 0,624 St. Dev.: 2,31E-03
Staal B3 0,628 RSD: 3,69E-01
Staal A1 0,632 Gemiddelde: 6,28E-01
Staal A2 0,623 St. Dev.: 4,73E-03
Staal A3 0,630 RSD: 7,52E-01
Staal BSA1 0,625 Gemiddelde: 6,22E-01
Staal BSA2 0,619 St. Dev.: 3,06E-03
Staal BSA3 0,621 RSD: 4,91E-01
40
Figuur 4.8: Plot Berthelot
De Levene statistiek gaf ons een waarde 0,741 met significantie 0,557, wat ons toeliet
om een ANOVA uit te voeren. Deze ANOVA resulteerde in F(3,8) = 12,800 met significantie
0,002. Met andere woorden, de vier stalen komen niet uit eenzelfde populatie. De Post-Hoc
testen toonden aan dat de W-stalen statistisch significant verschillend zijn van de drie
andere stalen, zoals Figuur 4.8 visueel weergeeft. De detailresultaten van de statistische
testen vindt men terug in bijlage 8.
4.6.4. Indooxine
De gemeten waarden van de stalen van de indooxine methode vindt men terug in
Tabel 4.5. De waarden van de RSD’s zijn kleiner dan 2,5. De Levene statistiek had een waarde
0,075 en significantie 0,972, waardoor we een ANOVA konden uitvoeren. Deze one-way
ANOVA gaf een F(3,8) = 36,975 met significantie 4,9 x 10-5. De F waarde was significant,
waardoor we Post-Hoc analysesuitvoerden die aantoonden dat er een statistisch significant
verschil is tussen de populatie van staal W en de andere stalen. De 2 homogene subsets
41
worden grafisch weergegeven in Figuur 4.9. De resultaten van de statistische testen vindt
men terug in bijlage 9.
Tabel 4.5: Indooxine
Staal Aborbantie705 nm Statistiek
Staal W1 0,664 Gemiddelde: 6,51E-01
Staal W2 0,637 St. Dev.: 1,35E-02
Staal W3 0,652 RSD: 2,08E+00
Staal B1 0,5701 Gemiddelde: 1,12E+00
Staal B2 0,5491 St. Dev.: 2,15E-02
Staal B3 0,5591 RSD: 1,92E+00
Staal A1 0,5781 Gemiddelde: 1,15E+00
Staal A2 0,5641 St. Dev.: 2,36E-02
Staal A3 0,5871 RSD: 2,05E+00
Staal BSA1 0,5881 Gemiddelde: 1,16E+00
Staal BSA2 0,5841 St. Dev.: 1,99E-02
Staal BSA3 0,5691 RSD: 1,71E+00 1 ) Deze waarden zijn gecorrigeerde waarden, de concentratie bedroeg 12.34 ppm tov 6.18 ppm voor de waarden van referentie
Figuur 4.9: Plot Indooxine
42
4.6.5. Glutamaat Dehydrogenase
Tabel 4.6 geeft de gemeten waarden weer van de stalen van de Glutamaat
Dehydrogenase methode.
Tabel 4.6: Glutamaat Dehydrogenase
Staal (PPM) Absorbantieinitieel,340 nm Absorbantieeind, 340 nm ΔA Δ(ΔA) Statistiek
BLANCO 1,033 1,001 0,032
Staal W1 1,018 0,775 0,243 0,211 Gemiddelde: 2,11E-01
Staal W2 1,023 0,781 0,242 0,210 St. Dev.: 7,07E-04
RSD: 3,36E-01
Staal B1 1,029 0,778 0,251 0,219 Gemiddelde: 2,20E-01
Staal B2 1,017 0,765 0,252 0,220 St. Dev.: 7,07E-04
RSD: 3,22E-01
Staal A1 1,027 0,773 0,254 0,222 Gemiddelde: 2,25E-01
Staal A2 1,037 0,777 0,260 0,228 St. Dev.: 4,24E-03
RSD: 1,89E+00
Staal BSA1 1,025 0,774 0,251 0,219 Gemiddelde: 2,22E-01
Staal BSA2 1,024 0,771 0,253 0,221 St. Dev.: 3,61E-03
Staal BSA3 1,026 0,768 0,258 0,226 RSD: 1,62E+00
Figuur 4.10: Plot Glutamaat Dehydrogenase
43
De RSD’s van deze stalen liggen allen onder de grens van 2,5, waardoor de
herhaalbaarheid aanvaardbaar is. De Levene statistiek werd gevonden op 4,246 met
significantie 0,077, waardoor we een ANOVA konden uitvoeren. Deze ANOVA gaf als
resultaat F(3,5) = 8,934 met significantie 0,019 , waaruit we kunnen besluiten dat niet alle
stalen tot dezelfde populatie behoren. De hierop volgende Post-Hoc analyses toonden aan
dat staal W hier een afwijkend gedrag vertoont. Op Figuur 4.10 kunnen deze staalresultaten
visueel worden gezien. De statistische resultaten vindt men terug in bijlage 10.
4.6.6. Aspartaat Transaminase
De gemeten waarden van de Aspartaat Transaminase methode zijn terug te vinden
in Tabel 4.7. De goede herhaalbaarheid van de methode wordt aangetoond door de RSD’s
van de stalen die een waarde hebben die lager ligt dan 2,5.. We voerden een ANOVA uit en
deze resulteerde in F(3,4) = 75,526 met significantie 0,001, waaruit we concludeerden dat
minstens één van de stalen tot een verschillende populatie behoorde. Met behulp van de
daaropvolgende Post-Hoc analyses vonden we de twee variatie-populaties, namelijk staal W
enerzijds en staal B-staal A-staal BSA anderzijds, zoals grafisch weergegeven in Figuur 4.11.
De statistische resultaten vindt men terug in bijlage 11.
Tabel 4.7: Aspartaat Transaminase
Staal Absorbantie340 nm Statistiek
BLANCO 1,004 Gemiddelde: 7,60E-01
Staal W1 0,766 St. Dev.: 8,49E-03
Staal W2 0,754 RSD: 1,12E+00
Gemiddelde: 8,26E-01
Staal B1 0,828 St. Dev.: 3,54E-03
Staal B2 0,823 RSD: 4,28E-01
Gemiddelde: 8,25E-01
Staal A1 0,828 St. Dev.: 4,24E-03
Staal A2 0,822 RSD: 5,14E-01
Gemiddelde: 8,20E-01
Staal BSA1 0,818 St. Dev.: 2,12E-03
Staal BSA2 0,821 RSD: 2,59E-01
44
Figuur 4.11: Plot Aspartaat Transaminase
45
5. DISCUSSIE
Met behulp van alle gegevens uit de sectie Resultaten, kunnen we nu een statistische
en niet-statistische vergelijking maken van de 5 methoden, om uiteindelijk de beste
methode te selecteren.
5.1. STATISTISCH
Onderstaande tabel geeft de belangrijkste eigenschappen weer van de verschillende
methodes, bekomen met de statistische gegevens uit de sectie Resultaten.
Tabel 5.1: Statistische methodenvergelijking
Nessler Berthelot Indooxine
Glutamaat Dehydrogenase
Aspartaat Transaminase
Bovenlimiet Range (ppm)
7,30 1,10 10,74 15,80 46,33
Herhaalbaarheid (RSD)
5,22E-01 3,11E-01 1,39E-00 1,15E-00 5,73E-01
Lineariteit F 1800,6 380,8 3153,1 6377,6 1864,9
R² 0,9989 0,9922 0,9975 0,9991 0,9963
LoD (ppm) 0,073 0,049 0,15 0,24 1,44
LoQ (ppm) 0,30 0,082 1,24 0,80 4,80
Sensitiviteit 1,37E-01 9,43E-01 9,05E-02 -3,16E-02 -1,08E-02
We definieerden de bovenlimiet van het lineaire gebied (range) als de concentratie
van het analyt (in ppm) die overeenstemt met 1 absorptie-eenheid, daar we er vanuit gaan
dat absorbantiewaarden boven 1 minder geschikt zijn voor robuuste kwantitatieve
doeleinden. Bij Glutamaat Dehydrogenase en Aspartaat Transaminase is de bovengrens
gedefinieerd als de concentratie die een daling van 0,500 absorptie-eenheden veroorzaakt.
De bovengrenzen werden bepaald met behulp van de lineaire vergelijking van de ijkcurve.
De herhaalbaarheid werd bepaald aan de hand van de metingen die men terug vindt
onder 4.6.1. De RSD’s werden berekend met behulp van de gepoolde standaarddeviatie. De
concentraties waarbij dit gebeurde waren 6,37 ppm voor Nessler en Glutamaat
Dehydrogenase, 0,637 ppm voor Berthelot, 6,18 ppm voor Indooxine en 20 ppm voor
46
Aspartaat Transaminase. Deze concentraties liggen ongeveer in het midden van de range. De
herhaalbaarheid krijgt een waarde < 2,5 wanneer geen enkele RSD deze grens overschrijdt.
De lineariteit werd beoordeeld aan de hand van 2 descriptoren, namelijk de F- en de
R²-waarde. Samen geven deze waarden aan of er een sterk lineair verband is tussen de
concentratie en de absorbantie bij een bepaalde golflengte. Een F-waarde groter dan 20 en
een R² groter dan 0,99 zijn de vereisten.
LoD (Detectielimiet) en LoQ (Kwantificatielimiet) werden berekend met behulp van
de gepoolde standaard deviatie sp, berekend aan de hand van de Vergelijking (5.1):
(5.1)
met de waarden die men terug vindt onder 4.6.1.2. resultaten. LoD en LoQ zijn die
concentraties die overeenstemmen met 3 x sp voor LoD en 10 x sp voor LoQ en die berekend
werden met behulp van de lineaire vergelijking van de ijkcurves.
De sensitiviteit wordt weerspiegeld door de richtingscoëfficiënt van de ijkcurve. Hoe
steiler deze curve verloopt, hoe gevoeliger de methode is. De waarden in de tabel zijn de
richtingscoëfficiënten die men terug vindt op de grafieken in 4.1 tot en met 4.5, en die dus
de verandering in absorbantie per ppm analyt weergeven.
Zoals blijkt uit Tabel 5.1 is aan de voorwaarde van lineariteit bij iedere methode
voldaan, gezien de hoge F- en R²-waarden. Geen enkel staal in geen enkel protocol heeft een
RSD die hoger ligt dan 2,5, de arbitraire waarde door ons vastgelegd, waardoor we kunnen
besluiten dat ieder protocol een voldoende herhaalbaarheid vertoont. De belangrijkste
selectiecriteria zijn de LoQ, die bij voorkeur zo laag mogelijk ligt, en de sensitiviteit, die bij
voorkeur zo hoog mogelijk dient te zijn.
De selectiviteit met betrekking tot de asparaginas condities tonen aan dat voor alle
methoden het waterstaal zich anders gedraagt dan de 3 andere stalen. Echter, dit hoeft geen
onoverkomelijk probleem te zijn, gezien de keuze van de referentie standaard. Uit deze
statistische methodenvergelijking blijkt Berthelot de laagste detectielimiet te hebben, met
47
de beste gevoeligheid. Nessler was statistisch de tweede meest geschikte methode, met het
tweede laagste detectielimiet en de tweede beste gevoeligheid. Indooxine eindigt statistisch
op de derde plaats , Glutamaat Dehydrogenase als vierde en Aspartaat Transaminase als
vijfde.
5.2. NIET-STATISTISCH
In de Tabel 5.2 vindt men een niet-statistische beoordeling van de verschillende
methoden terug.
Tabel 5.2: Niet-statistische methodenvergelijking
Nessler Berthelot Indooxine Glutamaat Dehydrogenase Aspartaat Transaminase
Aantal producten1 3 (1) 4 (2) 7 (4) 2 (1) 6 (6)
Tijd 13,5 min 20 min 25,5 min 11 min 30 min
Prijs 0,4064 € 0,9409 € 0,4430 € 1,8831 € 2,3158 €
Moeilijkheidsgraad 1 3 6 3 13
1) De waarde tussen haakjes is het aantal reagentia dat met deze producten wordt bereid.
De parameter “Aantal producten” geeft weer hoeveel verschillende producten er
nodig zijn om de nodige reagentia te bereiden, stockoplossingen en water niet inbegrepen.
De waarde tussen haakjes is het aantal reagentia dat hiermee wordt bereid.
De parameter “Tijd” is de tijd nodig om de proef uit te voeren. Het correct afwegen
of pipetteren van 1 product wordt gerekend op een halve minuut, het bereiden van een
reagens op 1 minuut. Voor verwarmen, afkoelen, schudden, etc. worden de aangegeven of
werkelijke tijden in rekening gebracht.
De parameter “Prijs” weerspiegelt de kost om de proef uit te voeren op 1 staal.
48
De parameter “Moeilijkheidsgraad” Vergelijking 5.2 weergegeven:
(5.2)
#R: het aantal gemaakte reagentia
#pH: het aantal opgegeven pH-verificatie/correcties.
#T: Het aantal stappen die een specifieke temperatuur vereisen
#t: Het aantal stappen met een kritische tijdsduur. Deze worden een gewicht van 2
toegekend.
Nessler blijkt de eenvoudige en goedkoopste methode te zijn met een relatief korte
tijdsduur, waardoor deze aan de hand van de niet-statistische descriptoren als eerste keuze
wordt genomen. Een tweede plaats werd toegekend aan Berthelot, met een lage
moelijkheidsgraad en relatief lage kost. Glutamaat Dehydrogenase, met zijn vergelijkbare
moeilijkheidsgraad ten opzichte van Berthelot maar een kostprijs die tweemaal zo hoog ligt,
is volgens deze niet-statistische methodenvergelijken de derde aangewezen methode.
Indooxine volgt als vierde methode en Aspartaat Transaminase maakt het lijstje af met een
hoge moelijkheidsgraad en kostprijs.
Samenvattend kan men stellen dat Berthelot de eerst aangewezen keuze is, daar de
statistische eigenschappen zwaarder doorwegen dan de niet-statistische, gevolgd door
Nessler. Indooxine krijgt de derde plaats toebedeeld, daar deze statistisch iets beter is dan
Glutamaat Dehydrogenase door de lagere LoD en betere gevoeligheid. De minst aangewezen
keuze van deze methodenvergelijking is de Aspartaat Transaminase methode.
49
6. ALGEMEEN BESLUIT
Voor ieder van de vijf asparaginase activitetisbepalingsmethoden is een protocol
opgesteld en geëvalueerd. In principe zijn alle methoden geschikt om opgenomen te worden
in de verdere onderzoeksfase naar de activiteit en stabiliteit van asparaginase. Verscheidene
statistische en niet-statistische selectiecriteria werden opgesteld en geëvalueerd, teneinde
een finaal protocol te kiezen. Aan de hand van alle beschikbare gegevens, en het
orthogonaliteitsprincipe verwaarlozend, hebben we de keuze laten vallen op zowel Nessler
als Berthelot.
De Berthelot methode vertoont de laagste LoQ en de hoogste sensitiviteit. Dit laat
ons toe minieme wijzigingen in concentratie met hoge nauwkeurigheid te detecteren.
Daardoor is deze methode uiterst geschikt om op te nemen in de latere stabiliteitsstudies,
daar kleine veranderingen in de stabiliteit van het enzym mogelijks kleine verschillen in
enzymactiviteit kunnen teweegbrengen. De lineariteit en herhaalbaarheid voldoen aan onze
vooropgestelde eisen en de niet statistische kenmerken maken van deze methode een snelle,
gemakkelijke en relatief goedkope kwantitatieve test. Deze criteria samen maken van
Berthelot de voor ons meest geschikte methode.
De Nessler methode wordt als tweede methode gekozen gezien deze methode de
tweede laagste LoQ en tweede hoogste sensitiviteit heeft, waardoor we met deze methode
reeds lage concentraties kunnen detecteren, alsook kleine stijgingen in concentratie kunnen
waarnemen. Deze methode heeft een lagere kostprijs, moeilijkheidsgraad en tijdsduur dan
Berthelot. Door deze eigenschappen, samen met het hogere bovenlimiet waardoor
concentraties hoger dan 1,1 ppm kunnen worden bepaald, hebben er toe geleid dat ook
deze methode in de verdere stabiliteitsstudies kan worden opgenomen.
50
7. LITERATUURLIJST
Afkhami, A.; Norooz-Asl, R. (2008). Micelle-Mediated Extraction and Spectrophotometric Determination of Ammonia in Water Samples utilizing Indophenol Dye Formation. Journal of the Brazilian Chemical Society, 19, 1546-1552.
Aghaiypour, K.; Wlodawer, A.; Lubkowski, J. (2001). Do bacterial L-asparaginases utilize a catalytic triad Thr-Tyr-Glu? Biochimica Et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1550, 117-128.
Albertsen, B. K.; Schroder, H.; Jakobsen, P.; Avramis, V. I.; Muller, H. J.; Schmiegelow, K.; Carlsen, N. T. (2002). Antibody formation during intravenous and intramuscular therapy with Erwinia asparaginase. Med Pediatr Oncol, 38, 310-316.
Avramis, V. I.; Martin-Aragon, S.; Avramis, E. V.; Asselin, B. L. (2007). Pharmacoanalytical assays of Erwinia asparaginase (erwinase) and pharmacokinetic results in high-risk acute lymphoblastic leukemia (HR ALL) patients: simulations of erwinase population PK-PD models. Anticancer Res, 27, 2561-2572.
Benjwal, S.; Verma, S.; Rohm, K. H.; Gursky, O. (2006). Monitoring protein aggregation during thermal unfolding in circular dichroism experiments. Protein Sci, 15, 635-639.
Boos, J.; Werber, G.; Ahlke, E.; Schulze-Westhoff, P.; Nowak-Gottl, U.; Wurthwein, G.; Verspohl, E. J.; Ritter, J.; Jurgens, H. (1996). Monitoring of asparaginase activity and asparagine levels in children on different asparaginase preparations. Eur J Cancer, 32A, 1544-1550.
Bruylants, G.; Wouters, J.; Michaux, C. (2005). Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem, 12, 2011-2020.
Cammack, K. A.; Marlborough, D. I.; Miller, D. S. (1972). Physical properties and subunit structure of L-asparaginase isolated from Erwinia carotovora. Biochem J, 126, 361-379.
Demuthkaya, L. N.; Kalinichenko, I. E. (2006). Interaction of aliphatic polyamines with Nessler reagent. Journal of Analytical Chemistry, 61, 1063-1066.
Drainas, D.; Drainas, C. (1985). A conductimetric method for assaying asparaginase activity in Aspergillus nidulans. Eur J Biochem, 151, 591-593.
51
Edman, P. (1949). A method for the determination of amino acid sequence in peptides. Arch Biochem, 22, 475.
EPA Method 350.2. (1974). Nitrogen, ammonia (colorimetric, titrimetric, potentiometric, distillation procedure).
Franklin Township Municipal Sanitary Authority. (2006). Laboratory standard operating procedures.
Frear, D. S.; Burrell, R. C. (1955). Spectrophotometric Method for Determining Hydroxylamine Reductase Activity in Higher Plants. Analytical Chemistry, 27, 1664-1665.
Gupta, M. K.; Subramanian, V.; Yadav, J. S. (2009). Immunoproteomic identification of secretory and subcellular protein antigens and functional evaluation of the secretome fraction of Mycobacterium immunogenum, a newly recognized species of the Mycobacterium chelonae-Mycobacterium abscessus group. J Proteome Res, 8, 2319-2330.
Han, J.; Sheng, L. S.; Yang, Z. Y.; Xiang, B. R.; An, D. K. (2001). [High performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometric characterization of recombinant L-asparaginase II]. Yao Xue Xue Bao, 36, 46-50.
http://www.cancer.org/Cancer/LeukemiainChildren/OverviewGuide/childhood-leukemia-overview-what-is-childhood-leukemia (14/02/2011)
https://www.msu.edu/~gallego7/MassSpect/MSandPMM.htm (23/02/2011)
http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/aa0100bul.Par.0001.File.tmp/aa0100bul.pdf (28/03/2011)
http://www.skion.nl/kbk/leukemieen (14/02/2011)
Khushoo, A.; Pal, Y.; Singh, B. N.; Mukherjee, K. J. (2004). Extracellular expression and single step purification of recombinant Escherichia coli L-asparaginase II. Protein Expr Purif, 38, 29-36.
Kravchenko, O. V.; Kislitsin, Y. A.; Popov, A. N.; Nikonov, S. V.; Kuranova, I. P. (2008). Three-dimensional structures of L-asparaginase from Erwinia carotovora complexed with aspartate and glutamate. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 64, 248-256.
52
Lanvers, C.; Vieira Pinheiro, J. P.; Hempel, G.; Wuerthwein, G.; Boos, J. (2002). Analytical validation of a microplate reader-based method for the therapeutic drug monitoring of L-asparaginase in human serum. Anal Biochem, 309, 117-126.
Lau, K. T.; Edwards, S.; Diamond, D. (2004). Solid-state ammonia sensor based on Berthelot's reaction. Sensors and Actuators B-Chemical, 98, 12-17.
Leonard (1963). Quantitative Range of Nessler's Reaction with Ammonia. Clinical Chemistry, 9, 417-422.
Lorenzi, P. L.; Llamas, J.; Gunsior, M.; Ozbun, L.; Reinhold, W. C.; Varma, S.; Ji, H.; Kim, H.; Hutchinson, A. A.; Kohn, E. C.; Goldsmith, P. K.; Birrer, M. J.; Weinstein, J. N. (2008). Asparagine synthetase is a predictive biomarker of L-asparaginase activity in ovarian cancer cell lines. Mol Cancer Ther, 7, 3123-3128.
Lubkowski, J.; Dauter, M.; Aghaiypour, K.; Wlodawer, A.; Dauter, Z. (2003). Atomic resolution structure of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 59, 84-92.
Lubkowski, J.; Palm, G. J.; Gilliland, G. L.; Derst, C.; Rohm, K. H.; Wlodawer, A. (1996). Crystal structure and amino acid sequence of Wolinella succinogenes L-asparaginase. Eur J Biochem, 241, 201-207.
Maita, T.; Morokuma, K.; Matsuda, G. (1979). Amino acid sequences of the tryptic peptides from carboxymethylated L-asparaginase from Escherichia coli. Hoppe Seylers Z Physiol Chem, 360, 1483-1495.
Moliner-Martinez, Y.; Herraez-Hernandez, R.; Campins-Falco, P. (2005). Improved detection limit for ammonium/ammonia achieved by Berthelot's reaction by use of solid-phase extraction coupled to diffuse reflectance spectroscopy. Analytica Chimica Acta, 534, 327-334.
Moorthy, V.; Ramalingam, A.; Sumantha, A.; Shankaranaya, R. T. (2010). Production, purification and characterisation of extracellular L-asparaginase from a soil isolate of Bacillus sp. African Journal of Microbiology Research, 4, 1862-1867.
Nath, C. E.; Dallapozza, L.; Eslick, A. E.; Misra, A.; Carr, D.; Earl, J. W. (2009). An isocratic fluorescence HPLC assay for the monitoring of l-asparaginase activity and l-asparagine depletion in children receiving E. colil-asparaginase for the treatment of acute lymphoblastic leukaemia. Biomed Chromatogr, 23, 152-159.
53
Papageorgiou, A. C.; Posypanova, G. A.; Andersson, C. S.; Sokolov, N. N.; Krasotkina, J. (2008). Structural and functional insights into Erwinia carotovora L-asparaginase. FEBS J, 275, 4306-4316.
Pieters, R.; Hunger, S. P.; Boos, J.; Rizzari, C.; Silverman, L.; Baruchel, A.; Goekbuget, N.; Schrappe, M.; Pui, C. H. (2011). L-asparaginase treatment in acute lymphoblastic leukemia: a focus on Erwinia asparaginase. Cancer, 117, 238-249.
Pritsa, A. A.; Kyriakidis, D. A. (2001). L-asparaginase of Thermus thermophilus: purification, properties and identification of essential amino acids for its catalytic activity. Mol Cell Biochem, 216, 93-101.
Randolph, T. R. (2004). Advances in acute lymphoblastic leukemia. Clin Lab Sci, 17, 235-245.
Sapan, C. V.; Lundblad, R. L.; Price, N. C. (1999). Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol Appl Biochem, 29 ( Pt 2), 99-108.
Scotti, C.; Sommi, P.; Pasquetto, M. V.; Cappelletti, D.; Stivala, S.; Mignosi, P.; Savio, M.; Chiarelli, L. R.; Valentini, G.; Bolanos-Garcia, V. M.; Merrell, D. S.; Franchini, S.; Verona, M. L.; Bolis, C.; Solcia, E.; Manca, R.; Franciotta, D.; Casasco, A.; Filipazzi, P.; Zardini, E.; Vannini, V. (2010). Cell-cycle inhibition by Helicobacter pylori L-asparaginase. PLoS One, 5, e13892.
Searcy, R. L.; Simms, N. M.; Foreman, J. A.; Bergquist, L. M. (1965). A study of the specificity of the Berthelot colour reaction. Clin Chim Acta, 12, 170-175.
Shifrin, S.; Grochowski, B. J. (1972). L-Asparaginase from escherichia coli B. Succinylation and subunit interactions. J Biol Chem, 247, 1048-1054.
Stecher, A. L.; de Deus, P. M.; Polikarpov, I.; Abrahao-Neto, J. (1999). Stability of L-asparaginase: an enzyme used in leukemia treatment. Pharm Acta Helv, 74, 1-9.
Swain, A. L.; Jaskolski, M.; Housset, D.; Rao, J. K.; Wlodawer, A. (1993). Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 1474-1478.
Tuncel, N. B.; Yilmaz, N.; Sener, E. (2010). The effect of pea (Pisum sativum L.)-originated asparaginase on acrylamide formation in certain bread types. International Journal of Food Science and Technology, 45, 2470-2476.
Verma, N.; Kumar, K.; Kaur, G.; Anand, S. (2007). L-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent. Crit Rev Biotechnol, 27, 45-62.
54
Vrooman, L. M.; Supko, J. G.; Neuberg, D. S.; Asselin, B. L.; Athale, U. H.; Clavell, L.; Kelly, K. M.; Laverdiere, C.; Michon, B.; Schorin, M.; Cohen, H. J.; Sallan, S. E.; Silverman, L. B. (2010). Erwinia asparaginase after allergy to E. coli asparaginase in children with acute lymphoblastic leukemia. Pediatr Blood Cancer, 54, 199-205.
Wehner, A.; Harms, E.; Jennings, M. P.; Beacham, I. R.; Derst, C.; Bast, P.; Rohm, K. H. (1992). Site-specific mutagenesis of Escherichia coli asparaginase II. None of the three histidine residues is required for catalysis. Eur J Biochem, 208, 475-480.
Wilkinson, J. H.; Baron, D. N.; Moss, D. W.; Walker, P. G. (1972). Standardization of clinical enzyme assays: a reference method for aspartate and alanine transaminases. J Clin Pathol, 25, 940-944.
Wriston, J. C., Jr. (1985). Asparaginase. Methods Enzymol, 113, 608-618.
Yao, M.; Yasutake, Y.; Morita, H.; Tanaka, I. (2005). Structure of the type I L-asparaginase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii at 2.16 angstroms resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 61, 294-301.
BIJLAGE 1
Species Δ Type KM Specifieke activiteit Optimale temperatuur
(°C) Optimale pH
Moleculair gewicht Referentie
(mM) (µmol/min/mg) (dalton)
BACTERIE
Proteobacteriën
Enterobacter cloacae Verma et al., 2007
Erwinia aroidae II Lubkowski et al., 1996
Erwinia carotovora II Lubkowski et al., 1996
Erwinia chrisanthemi II Lanvers et al., 2002
Escherichia coli II Lanvers et al., 2002
Helicobacter pylori 0,29 7 140000 Scotti et al., 2010
Photobacterium leiognathi
Verma et al., 2007
Photobacterium phosphoreum
Verma et al., 2007
Proteus Vulgaris 0,026 300 57 7 Wriston et al., 1985
Pseudomonas fluorescens
II Lubkowski et al., 1996
Pseudomonas ovalis II Lubkowski et al., 1996
Pseudomonas Stutzeri II 0,145 132,3 37 9 132000 Lubkowski et al., 1996
Salmonella enterica Verma et al., 2007
Serratia marcenscens 0,1 226 8,5 147000 Verma et al., 2007
Vibrio fisheri Verma et al., 2007
Vibrio harveyi Verma et al., 2007
Vibrio succinogenes Moorthy et al., 2010
Wolinella succinogenes II 0,0478 202 7,3 146000 Lubkowski et al., 1996
Firmicutes
Bacillus mesentericus Verma et al., 2007
Brevibacillus brevis Verma et al., 2007
Staphylococcus sp.-6A 8,6 Verma et al., 2007
Deinococcus-thermus
Thermus aquaticus Verma et al., 2007
Thermus thermophilus 2,8 840 9,2 200000 Pritsa et al., 2001
Ciliophora
Tetrahymena pyriformis
Pritsa et al., 2001
Actinobacteriën
Mycobacterium phlei 0,7 Verma et al., 2007
Nocardia asterodies Verma et al., 2007
Streptomyces karnatakensis Moorthy et al., 2010
Streptomyces longsporusflavus Verma et al., 2007
Streptomyces venezualae Moorthy et al., 2010
SCHIMMEL
Ascomycota
Candida utilis Verma et al., 2007
Aspergillus nidulans Verma et al., 2007
Aspergillus niger Tuncel et al., 2010
Aspergillus oryzae Tuncel et al., 2010
Aspergillus tamari Moorthy et al., 2010
Aspergillus terreus Verma et al., 2007
Saccharomyces cerevisiae I 0,74 6,5
Verma et al., 2007
II 0,35 6,8 Verma et al., 2007
Basidiomycota
Rhodosporidium toruloides Verma et al., 2007
Rhodotorula rubra Verma et al., 2007
PLANT
Angiosperm
Arabidopsis thaliana Verma et al., 2007
Lupinus angustifolius 8,5 150000 Verma et al., 2007
Lupinus angustiplius Verma et al., 2007
Lupinus araboreus 6,6 150000 Verma et al., 2007
Lupinus arborens Verma et al., 2007
Lupinus luteus Verma et al., 2007
Lupinus polyphylus 12,2 1,65 144000 Verma et al., 2007
Phaseolus multiflorus Tuncel et al., 2010
Pisum sativum 3,2 136600 Tuncel et al., 2010
Vicia faba Tuncel et al., 2010
Zea mays Tuncel et al., 2010
Pinophyta
Pinus pinaster Verma et al., 2007
Pinus radiata Verma et al., 2007
Bryophyta
Sphagnum fallax I 7,4 Verma et al., 2007
BIJLAGE 2
Concentratie (ppm) Absorbantievoor cuvetcorrectie Absorbantiena cuvetcorrectie
0,5 0,064 0,063
1 0,144 0,144
3 0,474 0,424
5 0,673 0,679
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
0 1 2 3 4 5 6
Stan
dar
d R
esi
du
als
PPM
Nessler : gestandaardiseerde residuen plot
BIJLAGE 3
Concentratie (ppm) Absorbantievoor cuvetcorrectie Absorbantiena cuvetcorrectie
0,1 0,055 0,054
0,2 0,169 0,169
0,5 0,526 0,476
0,5 0,396 0,396
1 0,906 0,912
3 2,779 2,78
5 3,709 3,704
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Stan
dar
d R
esi
du
als
PPM
Berthelot: gestandaardiseerde residuen plot
BIJLAGE 4
Concentratie (ppm) Absorbantievoor cuvetcorrectie Absorbantiena cuvetcorrectie
1 0,093 0,093
2 0,221 0,219
3 0,319 0,316
4 0,452 0,399
5 0,47 0,472
6 0,571 0,571
7 0,675 0,68
8 0,758 0,757
9 0,832 0,832
10 0,927 0,925
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
0 2 4 6 8 10 12
Stan
dar
d R
esi
du
als
PPM
Indooxine: gestandaardiseerde residuen plot
BIJLAGE 5
Concentratie (ppm) Ainitieel, voor cuvetcorrectie Ainitieel, na cuvetcorrectie Aeind, voor cuvetcorrectie Aeind, na cuvetcorrectie
0 1,027 1,027 0,991 0,991
0,5 1,029 1,028 0,984 0,983
1 1,029 1,029 0,966 0,966
3 1,085 1,035 0,964 0,914
5 1,028 1,036 0,844 0,850
10 1,026 1,027 0,682 0,683
15 1,028 1,033 0,510 0,515
20 1,027 1,032 0,364 0,372
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
0 5 10 15 20 25
Stan
dar
d R
esi
du
als
PPM
Glutamaat Dehydrogenase: gestandaardiseerde residuen plot
BIJLAGE 6
Concentratie (ppm) Absorbantievoor cuvetcorrectie Absorbantiena cuvetcorrectie
0 0,915 0,913
5 0,844 0,833
10 0,843 0,788
15 0,726 0,729
20 0,69 0,696
25 0,627 0,631
30 0,615 0,577
35 0,515 0,515
40 0,475 0,473
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Stan
dar
d R
esi
du
als
PPM
Aspartaattransaminase: gestandaardiseerde residuen plot
BIJLAGE 7
BIJLAGE 8
BIJLAGE 9
BIJLAGE 10
BIJLAGE 11
Top Related