Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
Opleiding Lichamelijke Opvoeding en Bewegingswetenschappen
Academiejaar 2011-2012
Differentiële effecten van androgenen
op de hypertrofie en atrofie
signaalwegen in de skeletspier tijdens
‘disuse’ atrofie
Masterproef voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in Lichamelijke Opvoeding
en Bewegingswetenschappen
Door: Rombaut Toon
Promotor: Prof. Dr. Derave Wim
Begeleider: De Naeyer Hélène
I
Voorwoord
Beste lezer,
De keuze om een thesisonderwerp te zoeken in het vakgebied van de fysiologie had ik al een
tijdje gemaakt. Ik ben al langer erg geïnteresseerd in het menselijke lichaam en al zijn
complexiteiten. Dit was ook één van de redenen om voor deze studie te gaan.
Elk jaar kregen we wel een vak welke deze interesse nog extra aanwakkerde: in het eerste jaar
was er biochemie, in het tweede fysiologie en in het derde jaar de inspanningsfysiologie.
Ik wist dat het niet eenvoudig zou worden om deze thesis tot een goed einde te brengen en
heb dan ook meerdere moeilijke momenten gekend. Het was een uitdaging om alles goed te
vinden, lezen, begrijpen, onderzoeken, analyseren en uiteindelijk zelf te gaan neerschrijven.
Deze thesis was zeker een zeer leerrijkproces, waar ik onder meer heb leren doorwerken
ondanks grote tegenslagen. Deze thesis was niet enkel intellectueel een zeer verruimende
ervaring, maar ik heb mijzelf ook beter leren kennen.
Graag zou ik nog gebruik willen maken van het voorwoord om enkele mensen te bedanken.
Prof. W. Derave zou ik graag bedanken voor zijn noodzakelijk kordaatheid en opbouwende
kritiek.
Mijn ouders om hun geduld en steun. Ik was zeker niet altijd de gemakkelijkste persoon
tijdens het hele proces.
Als laatste zou ik de persoon willen bedanken zonder wie ik deze thesis nooit had kunnen
volbrengen. Voor haar geduld en sturing, voor haar raad en hulp, voor haar tijd en vertrouwen
dat ze in mij heeft gevestigd en geïnvesteerd.
Bedankt Hélène.
II
Abstract
Doelstellingen
Het androgeen testosteron is een hormoon met een spierhypertrofie inducerende werking.
Deze kan van belang zijn in de strijd tegen disuse atrofie. Omwille van de systemische
werking van testosteron en zijn neveneffecteten is het noodzakelijk te zoeken naar
spierspecifieke moleculaire signaalmoleculen die als therapeutische targets kunnen dienen. In
dit onderzoek werd er onderzocht welke effecten testosteron suppletie heeft op de hypertrofie
en atrofie signaalwegen in de skeletspier tijdens disuse atrofie. Ook willen we een beter beeld
krijgen van de moleculaire inwerking op beide signaalwegen door disuse atrofie en wordt er
na gegaan of cryptorchisme wel degelijk van belang is in het tail suspension model.
Methoden
90 muizen werden ad random toegewezen aan één van de drie onderzoeksgroepen: de
controlegroep (SHAM), en twee tail suspension condities, deze met en zonder testosteron
behandeling (respectievelijk TS+V en TS+T). Na 1, 5 en 14 dagen durende
interventieperioden werden de spieren gedissecteerd en werd de spiemassa bepaald, daarna
werd het mRNA geïsoleerd uit de spieren om de moleculaire regulatie na de gaan.
Resultaten
De spieratrofie was na 5 dagen tail suspension ongeveer gelijk in de EDL (daling van 21% in
spiermassa) en SOL (daling van 23% in spiermassa). Echter, na 14 dagen tail suspension was
daling in de massa van de SOL (32%) 10% hoger dan deze van de EDL(22%). Na 1 dag tail
suspension werd er reeds een significante opregulatie van de atrogenen Atrogin-1 en MuRF-1
gevonden welke zich meestal verder zette tot de 5e dag tail suspension. Na 14 dagen werd er
niet langer een significant verschil gevonden tussen de tail suspension condities en de controle
groep. In de EDL was de opregulatie van de atrogenen steeds hoger (+ maal 6) na 5 dagen tail
suspension dan in de SOL (+ maal 3).
Conclusie
Er kan verondersteld worden dat de spiervezeltypes I en II verschillend reageren op disuse
atrofie. Het moleculaire mechanisme tijdens disuse atrofie blijkt tijdsafhankelijk te zijn. Er is
echter geen bewijs gevonden voor een disuse geïnduceerde downregulatie van de hypertrofie
signaalweg. Testosteron heeft geen enkele invloed op de spiermassa en de twee signaalwegen
tijdens disuse atrofie.
III
Inhoudstafel
Voorwoord ................................................................................................................................... I
Abstract ...................................................................................................................................... II
Doelstellingen ........................................................................................................................ II
Methoden ............................................................................................................................... II
Resultaten .............................................................................................................................. II
Conclusie ............................................................................................................................... II
1 Literatuurstudie ................................................................................................................... 1
1.1 Inleiding ....................................................................................................................... 1
1.2 Spieratrofie ................................................................................................................... 2
1.2.1 Mechanismen van spieratrofie .............................................................................. 2
1.2.2 Hypertrofie en atrofie signaalwegen .................................................................... 3
1.3 Oorzaken van spieratrofie ............................................................................................ 6
1.3.1 Pathologieën ......................................................................................................... 6
1.3.2 Sarcopenie ............................................................................................................ 6
1.3.3 Disuse ................................................................................................................... 7
1.4 Klinische relevantie ..................................................................................................... 9
1.5 Huidige therapieën ..................................................................................................... 11
1.5.1 Fysieke activiteit ................................................................................................. 11
1.5.2 Nutritionele interventies ..................................................................................... 12
1.6 Testosteron, een hormonale interventie ..................................................................... 12
1.6.1 Androgenen ........................................................................................................ 12
1.6.2 Synthese .............................................................................................................. 14
1.6.3 Werkingsmechanisme ......................................................................................... 15
1.6.4 Suppletie ............................................................................................................. 16
2 Probleemstelling ............................................................................................................... 20
3 Hypothese ......................................................................................................................... 21
4 Materialen en methoden ................................................................................................... 22
4.1 Studie design .............................................................................................................. 22
4.2 Operatie en behandeling ............................................................................................ 23
4.3 Biopten ....................................................................................................................... 23
4.4 RNA-isolatie en qPCR ............................................................................................... 24
4.5 Statistische analyse .................................................................................................... 25
5 Resultaten ......................................................................................................................... 26
5.1 Lichaamsgewicht, zaadblaasjes en testes ................................................................... 26
5.1.1 Lichaamsgewicht ................................................................................................ 26
IV
5.1.2 Zaadblaasjes ....................................................................................................... 27
5.1.3 Testes ................................................................................................................. 27
5.2 EDL en SOL massa ................................................................................................... 28
5.2.1 Musculus extensor digitorum longus ................................................................. 28
5.2.2 Musculus soleus ................................................................................................. 28
5.3 Genexpressies in de EDL .......................................................................................... 30
5.3.1 Atrogin-1 ............................................................................................................ 30
5.3.2 MuRF-1 .............................................................................................................. 30
5.3.3 4EBP1 ................................................................................................................ 31
5.3.4 S6K1................................................................................................................... 32
5.4 Genexpressies in de SOL .......................................................................................... 32
5.4.1 Atrogin-1 ............................................................................................................ 32
5.4.2 MuRF-1 .............................................................................................................. 33
5.4.3 4EBP1 ................................................................................................................ 34
5.4.4 S6K1................................................................................................................... 35
6 Discussie .......................................................................................................................... 36
6.1 Relevantie van cryptorchisme tijdens tail suspension ............................................... 36
6.2 Spiervezelspecificiteit tijdens disuse atrofie ............................................................. 37
6.3 Spiervezelspecificiteit van testosteron tijdens disuse atrofie .................................... 37
6.4 Genexpressies ............................................................................................................ 39
6.4.1 Invloed van testosteron tijdens disuse atrofie .................................................... 39
6.4.2 Invloed van het spiervezeltype op disuse atrofie ............................................... 39
6.4.3 Up- en Down regulatie ....................................................................................... 40
6.4.4 Tijdsafhankelijkheid........................................................................................... 41
6.5 Conclusie ................................................................................................................... 42
7 Referentielijst ................................................................................................................... 43
1
1 Literatuurstudie
1.1 Inleiding
Skeletale spieren in verschillende delen van het lichaam worden onderworpen aan
verschillende patronen van rekrutering en activiteit. De anti-zwaartekracht m. soleus (SOL),
bijvoorbeeld, is belangrijk in het onderhouden van de lichaamshouding en wordt gedurende
langere periodes gerekruteerd op een gemiddelde intensiteit; terwijl de m. extensor digitorum
longus (EDL) minder vaak wordt gerekruteerd, korte en relatief krachtige contracties uitvoert.
Dit verschillend rekruteringspatroon toont zich in trage contractiele eigenschappen, hoge
uitputtingsweerstand en hoge oxidatieve capaciteit van de soleus spier, terwijl de EDL snelle
contractiele eigenschappen bevat, vlug uitgeput en een hoge glycolytische capaciteit heeft. De
contractiele eigenschappen worden duidelijk afgestemd op de functionele vraag opgelegd aan
de spier (Degens & Alway, 2005).
Spiermassa en –functionaliteit zijn dus zeer plastisch. Wanneer spiermassa afneemt door een
onevenwicht in spierproteïne synthese en degradatie spreekt men over spieratrofie. Deze is
tegengesteld aan spierhypertrofie waar spierproteïne synthese groter is dan de degradatie.
Vaak gepaard gaande met, en meer problematisch dan het verlies aan spiermassa, is de
verminderde functionele capaciteit van de spieren, waardoor het probleem klinisch relevant
wordt omdat sprake is van een negatieve impact op de levenskwaliteit en levensverwachting
(Debigar et al, 2001).
Verschillende condities worden in verband gebracht met spieratrofie en –zwakte. Zo kan
atrofie ontstaan ten gevolge van pathologieën en fysiologische processen, maar ook ten
gevolgen van immobilisatie, gewichtloosheid en een sedentaire levensstijl. Spieratrofie kan in
alle condities ten minste deels worden toegeschreven aan het verminderde spiergebruik,
ongebruik of beter gekend als disuse (Degens & Alway, 2005).
De onderliggende moleculaire mechanismen verantwoordelijk voor deze musculaire
adaptaties zijn tot op heden nog niet volledig ontrafeld. Vanuit de gedachte dat deze echter
van groot belang kunnen zijn in de strijd tegen spieratrofie is dit onderzoek uitgevoerd.
2
1.2 Spieratrofie
1.2.1 Mechanismen van spieratrofie
Spierproteïnen worden continu gesynthetiseerd en afgebroken, dit dagelijks met een
gemiddelde turnover van 1-2% (Fearon et al). In normale omstandigheden is de synthese
gelijk aan de afbraak waardoor de spiermassa constant blijft. Spieratrofie treedt dus op
wanneer de synthese afneemt, de afbraak toeneemt of een combinatie van beide. Factoren
zowel binnen als buiten de spiercel beïnvloeden deze processen.
Verschillende intracellulaire signaalwegen zijn reeds in verband gebracht met de regulatie van
spieratrofie. Hoewel deze signaalwegen voornamelijk anabool of katabool zijn van natuur,
zijn er sterke aanwijzingen dat er een cross-relatie bestaat tussen deze individuele cascades.
Als gevolg ontstaat spieratrofie door een chronisch onevenwicht in de activatie van deze
signaalwegen (Skipworth et al, 2006).
Verschillende systemische mediatoren hebben ook een belangrijke invloed op de spieratrofie.
Circulerende mediatoren omvatten de pro-inflammatoire cytokines, neuro-endocrine
hormonen, homeostatische groeifactoren en in het geval van cachexie tumor afgeleide
proteolytische factoren (Skipworth et al, 2006).
Ook worden er verscheidene intracellulaire effector mechanismen in verband gebracht met
proteïne degradatie. Ubiquitine is hier het voornaamste protease, zij breekt namelijk de
belangrijkste spierproteïnen actine en myosine af. Ubiquitine kan echter niet de hieruit
ontstane actine-myosine complexen of myofibrillen afbreken. Hiervoor zijn andere proteasen
noodzakelijk die zowel upstream als downstream in de ubiquitine-protease signaalweg
inwerken om een volledige afbraak van de spierproteïnen te garanderen (Skipworth et al,
2006).
De relevante signaalwegen voor zowel spieratrofie als –hypertrofie worden hieronder
uitgelegd.
3
1.2.2 Hypertrofie en atrofie signaalwegen
Zoals reeds aangegeven wordt de spiercelgrootte bepaald door het evenwicht in spierproteïne
synthese en degradatie. Deze beide processen zijn strak geregeld en met elkaar verbonden.
Beiden worden gestimuleerd en geïnhibeerd door enerzijds verschillende en anderzijds
gemeenschappelijke signaalwegen.
1.2.2.1 Hypertrofie signaalwegen
Er wordt algemeen aangenomen dat hypertrofie voor volwassen individuen voornamelijk
afhankelijk is van proteïne turnover (fig. 1). De cellulaire turnover speelt enkel een
belangrijkere rol in embryonale en postnatale fase van de levensloop (Moss & Leblond,
1971).
Fig. 1. Schematische weergave van de atrofie en hypertrofie signaalwegen.
IGF-1 signaalweg
Het eiwit verantwoordelijk voor de activatie van de PI3K/Akt signaalweg is insuline-like
growth factor 1 (IGF-1). Phosphatidylinositol3-kinase (PI3K) wordt als eerste geactiveerd in
de hypertrofiesignaalweg en zorgt voor de productie van Phosphatidylinositol-3,4,5-
triphosphates. Deze laatste zorgt op zijn beurt voor de activatie Akt. Er zijn 3 vormen van Akt
genen gevonden bij zoogdieren; Akt1, Akt2 en Akt3. Elke vorm schijnt een verschillende
functie te vervullen. In de skeletspier komen voornamelijk Akt1 en Akt2 voor terwijl in de
hersenen voornamelijk Akt3 voorkomt. Training wordt dan ook in verband gebracht met de
activatie van Akt1 in de contraherende spieren (Turinsky & Damrau-Abney, 1999). Aan het
plasmamembraan wordt Akt gefosforyleerd door minstens twee verschillende kinase, PDK1
4
en het mTOR-Rictor complex. De hieruit volgende relevante downstream tak is de mTOR
signaalweg.
Een andere tak is de glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) welke geblokkeerd wordt door
Akt. GSK3β inhibeert proteïne synthese gestart door eukariotic initiation factor 2B (eIF2B)
(Hardt & Sadoshima, 2002). Expressie van een inactieve dominante negatieve kinase vorm
van GSK3β induceert drastisch hypertrofie in skeletale myotubes (Rommel et al, 2001). In
vivo is het echter nog niet bewezen dat inhibitie van de negatieve actie van GSK3β op eIF2B
voldoende is om hypertrofie te bevorderen.
mTOR wordt indirect geactiveerd door Akt door de inactiviteit van het kleine G proteïne
Rheb ongedaan te maken. Deze Rheb activeert op zijn beurt het mTOR complex dat deel
uitmaakt van twee multiproteïne complexen: mTORC1 en mTROC2. mTORC1 is
noodzakelijk voor de fosforylatie van het ribosomale proteïne S6 (S6K1) en 4EBP1, een
onderdrukker van het cap-bindend proteïne eIF4E. mTOR1 stimuleert dus proteïne synthese
via S6K1 en inhibeert de synthese onderdrukkende werking van 4EBP1. De S6K1 op zijn
beurt heeft een negatieve invloed op PI3K. mTORC2 is verantwoordelijk voor de signalisatie
tussen Akt-FoxO, welke later zal worden besproken.
Andere gekende triggers van deze signaalweg zijn catecholamines, onder meer vrijgezet door
fysieke inspanningen, die inwerken op de aanmaak van IGF-1 en β-agonisten die rechtstreeks
inwerken op Akt.
1.2.2.2 Atrofie signaalwegen
Cellulaire turnover is niet zozeer belangrijk in daadwerkelijke atrofie processen, maar wel in
het al dan niet falen van de groei in de embryonale en postnatale periode. Als gevolg is ook
hier de proteïne turnover de te bespreken factor (Sandri M, 2008) (fig. 1).
FoxO signaalweg
De FoxO familie van transcriptie factoren bestaat uit drie isovormen; FoxO1, FoxO3 en
FoxO4 zijn betrokken in de upregulatie van ubiquitine ligasen Atrogin-1 of muscle atrophy F-
box (MAFbx) en muscle ring finger1 (MuRF-1). Deze ubiquitine ligasen zijn onderdeel van
het ubiquitine-proteasoom systeem, welke uiteindelijk verantwoordelijk zijn voor proteïne
degradatie of atrofie. Het systeem bestaat uit drie verschillende enzymatische componenten:
E1 ubiquitine-activerend enzym, E2 ubiquitine-conjugerend enzym en E3 ubiquitine-ligase
5
enzym (Hershko & Ciechanover, 1998). Deze laatste zijn verantwoordelijk voor de substraat
specificiteit.
FoxO3 bleek voldoende te zijn in het bevorderen van Atrogin-1 expressie en spieratrofie
(Sandri et al, 2004), terwijl FoxO1 een reductie in spiermassa en vezelatrofie veroorzaakt
(Southgate et al, 2007).
Energie stress in spiercellen is een trigger voor atrofie (Aguilar et al, 2007). AMPK is de
cellulaire sensor voor de energy balans. Er is dan ook een verband gevonden tussen AMPK en
FoxO3. AMPK fosforyleert verschillende AKT onafhankelijke sites op FoxO3, waardoor
transcriptie wordt geactiveerd (Greer et al, 2007). De behandeling van spiercellen met
AICAR, een AMPK activator, veroorzaakt een verhoging van de proteïne afbraak en Atrogin-
1 expressie via de FoxO familie (Nakashima et al,2007).
1.2.2.3 Onderling verband
De IGF-1 signaalweg werkt in op de FoxO transcriptie factoren via Akt. Akt zorgt ervoor dat
FoxO uit de nucleus wordt uitgesloten naar het cytoplasma door deze te fosforyleren. Op deze
manier wordt de upregulatie van zowel Atrogin-1 als MuRF-1 tegen gegaan. Ondanks deze
inhiberende werking op FoxO, is een upregulatie van de IGF-1 signaalweg onvoldoende om
atrofie volledig te blokkeren (Criswell et al, 1998).
De IGF-1 signaalweg zou ook inwerken op de foxO-familie downstream van Akt. mTOR is in
staat de meerderheid van veranderingen door IGF-1 geïnduceerd te blokkeren, inclusief de
omgekeerde regulering van atrofie-gestimuleerde genen. mTOR zou echter niet inwerken
door fosforylatie van de FoxO transcriptie factoren. Het lijkt er dus op dat er verschillende
check-points van atrofie signalering downstream van de Akt activatie liggen (Laters et al,
2004).
Omgekeerd zorgt de activatie van de FoxO familie voor een upregulatie van 4EBP1 en
downregulatie van mTOR (Southgate et al, 2007). Dus, wanneer Akt wordt onderdrukt in
actieve proteïne afbraak en FoxO wordt opgewekt, wordt proteïne synthese verder onderdrukt.
De TNF-α signaalweg activatie leidt tot de onderdrukking van de IGF-1 signaalweg (de
Alvaro et al, 2004; Droga et al, 2007). IKK inhibeert de IGF-1 signaalweg ter hoogte van het
PI3K.
6
1.3 Oorzaken van spieratrofie
1.3.1 Pathologieën
Mogelijke pathologische oorzaken van spieratrofie zijn cachexie, uithongering, primaire
neurogene degeneratie en neuromusculaire aandoeningen.
Cachexie wordt in verband gebracht met tal van aandoeningen, waarvan AIDS en kanker de
meest frappante voorbeelden zijn, en deze heeft een direct negatief effect op de spiermassa
door de aanwezigheid van pro-inflammatoire cytokines (Visser et al, 2002).
Bij uithongering wordt er traditioneel aangenomen dat eerst de vetreserves worden uitgeput
alvorens de vetvrije massa wordt aangesproken, deze uitputting kan echter afhankelijk zijn
van de snelheid van uithongering. Uithongering, om welke reden dan ook, leidt uiteindelijk
tot het verlies van spiermassa en –kracht.
Vaak gepaard gaande met deze pathologische condities treedt er veel minder fysieke activiteit
op, welke leidt tot een gebrek aan mechanische stress in de spieren. Pathologische condities
brengen dan ook vaak disuse atrofie met zich mee.
1.3.2 Sarcopenie
Sarcopenie is een fysiologisch proces wat momenteel wordt gedefinieerd als het verlies aan
spiermassa, spierfunctie en spierkwaliteit gerelateerd aan veroudering (Zinna et al, 2003). Om
sarcopenie functioneel te kunnen benoemen worden personen waarvan de skeletale
spiermassa gedeeld door de lengte meer dan twee standaardafwijkingen onder het
gemiddelde van de jongeren liggen gezien als personen met sarcopenie. Deze operationele
definitie gebruikend blijkt dat in de verenigde staten 53% van de mannen en 43% van de
vrouwen ouder dan 80 jaar sarcopenie hebben. Op jongere leeftijden liggen deze percentages
merkelijk lager: 27% van de mannen en 36% van de vrouwen met een leeftijd tussen 75 en
80, 20% van mannen en 33% van de vrouwen met een leeftijd tussen 70 en 74 jaar
(Baumgartner et al, 1999).
Het verlies aan spiermassa komt zowel bij sedentaire als fysiek actieve ouderen voor, des al
niet te min wordt disuse toch ook aangehaald als een oorzaak van het verlies. Wat in
tegenstelling staat met de gezonde volwassenen populatie, waar geen netto verlies aan
spiermassa optreedt in een evenwichtige situatie door het feit dat bij deze populatie de
spierproteïne synthese en degradatie in balans zijn.
Deze daling van de spiermassa is het resultaat van een daling in zowel de spiervezeldoorsnede
als in het –aantal (Kobayashi et al, 1992). De daling in spiermassa komt voornamelijk voor in
7
de type II vezels, waarbij de type I vezels relatief onaangetast blijven (Jakobsson et al, 1990;
Tomonaga M, 1977). Deze type I vezels kunnen relatief onaangetast blijven doordat er
denervatie van de type II vezels plaats vindt en partiële reinnervatie door motorneuronen van
type I vezels (Larsson et al, 1978) (fig. 2).
Fig. 2. Leeftijdsgerelateerder motorische eenheid aanpassingen. Figuur overgenomen uit Saini
et al, 2009.
1.3.3 Disuse
Een langdurige periode met verminderde activiteiten, zoals het geval bij sedentairen,
inactiviteit of immobiliteit ten gevolge van ziekte en gewichtloosheid, wordt in verband
gebracht met veranderingen in de expressie van metabole, structurele en contractiele
proteïnen van de skeletspier (Jones et al, 2004).
Deze al dan niet gedwongen fysieke inactiviteit zorgt voor het ontstaan van een vicieuze
cirkel. Door de daling aan fysieke activiteit neemt de spieratrofie toe, welk op zijn beurt zorgt
voor een stijging in de relatieve belasting van activiteiten. Deze stijging in relatieve belasting
maakt het moeilijker om fysiek actief te zijn waardoor deze verder zal afnemen en op deze
manier de cirkel sluit (Glass DJ, 2003).
Deze disuse geïnduceerde atrofie resulteert in een verminderde dwarsdoorsnede van de
spiervezel, spiermassa en capaciteit om kracht te produceren. Ook is er een algemene
verschuiving naar het snelle spiervezel fenotype (Stevenson et al, 2003). Disuse induceert een
meer uitgesproken spieratrofie en slow-to-fast myosine heavy chain (MHC) transitie in de
soleus dan in snelle spieren (Fitts et al, 2001; Fluckey et al, 2002; Stevens et al, 2000;
8
Talmadge et al, 1995). De contractiele eigenschappen van de EDL tonen kwalitatief
gelijkaardige, maar kleinere veranderingen dan de soleus spier (Aboudrar et al, 1992). In de
EDL kan de slow-to-fast MHC zelfs volledig afwezig zijn en de massa bewaard blijven (Fitts
et al, 2001; Fluckey et al, 2002; Stevens et al, 2000). Deze verschillende reactie van de trage
soleus en de snelle EDL kan te wijten zijn aan de omvang van verandering in activiteitsniveau
van de spier, waar de soleus een relatief grote reductie in activiteit ondergaat tijdens disuse
vergeleken met de EDL. Ook kan het verband houden met het feit dat de EDL reeds
ruimschoots samengesteld is uit snelle MHC isovormen wat zich dan zou verzetten tegen een
significante slow-to-fast transitie. In lijn hiermee ondergaat de snelle m. Gastrocnemius een
significante fast-to-fast MHC transitie (Stevens et al, 2000). Als gevolg zullen spieren
aangetast door disuse atrofie sneller kunnen contraheren en relaxeren (Bigard et al, 1998).
Spier disuse gaat tevens vaak samen met een verhoogde vermoeibaarheid (Fitts et al, 2001;
Mc Donald et al, 1992). Eén van de oorzaken van deze verhoging is de verminderde
oxidatieve capaciteit van de spier (Degens & Veerkamp, 1994; Ohira et al, 2002, Fitts et al,
2001). Verder kunnen ook het verlies aan capillairen, reductie van de doorbloeding in rust en
de verminderde arteriolaire reactiviteit bijdragen aan een verminderde vermoeibaarheid door
de vertraagde energie en zuurstof voorziening naar de spier (Aboudrar et al, 1992; Larsson et
al, 1997; Tyml & Costello, 2001). Echter, het verlies aan capillairen en gereduceerde
maximale doorbloeding is grotendeels proportioneel met het verlies van spiermassa
(Aboudrar et al, 1992; Kano et al, 2000). De slow-to-fast transitie kan hier dus
verantwoordelijk voor geacht worden. Deze transities is omgekeerd aan deze bij sarcopenie.
Hoewel de aantasting van het spiervezeltype totaal verschillend is, volgt de daling in
spiermassa geassocieerd met disuse het zelfde overkoepelende mechanisme, namelijk de
daling in proteïne synthese en toename in proteïne degradatie (Taillandier et al, 1996).
De afname in spierkracht tijdens disuse is voornamelijk toe te schrijven aan het verlies van
spiermassa. Toch is het moeilijk om de fysiologische dwarsdoorsnede van de spier in vivo te
bepalen. Het is vaak waargenomen in volledige spieren en spiervezels dat het krachtverlies
tijdens disuse groter is dan verwacht wordt van het verlies in spiermassa (Fitts et al, 2001;
Larsson et al, 1996; Reid et al, 2002; Tesch et al, 2004; Widrick et al, 1999). De vermindering
in specifieke spanning als gevolg van disuse is grotendeels te wijten aan een verminderde
myofibrillaire volumedensiteit per spiervezel (Fitss et al, 2001; Larsson et al, 1996).
9
Apoptose is de intern gecodeerde celdood en speelt een belangrijke rol in de balans tussen cel
overleving en cel dood. Hoe apoptose wordt gereguleerd tijdens disuse is nog niet volledig
gekend. Correlaties tussen de expressie van inhibitor of differentiation-2 (Id2) en markers van
apoptose suggereren dat Id2 kan leiden tot apoptose tijdens spieratrofie (Alway et al, 2002;
Alway et al, 2003; Siu & Alway, 2005).
Immobilisatie is echter een speciale vorm van disuse atrofie omdat de spierlengte van groot
belang is. Het is namelijk zo dat immobilisatie met verkorte positie spieratrofie induceert,
maar immobilisatie met verlengde positie spierhypertrofie induceert. Deze hypertrofie is
grotendeels te wijten aan de toevoeging van sarcomeren in de longitudinale richting
(Goldspink et al, 1992; Hnik et al, 1989). Immobilisatie in de verkorte positie veroorzaakt een
preferentiële transcriptie van snelle isovormen, welke doet denken aan de slow-to-fast
transitie waargenomen bij disuse modellen, terwijl in verlengde positie er een upregulatie van
onrijpe en trage myosine isovormen plaats vindt (Goldspink et al, 1992; Talmadge et al,
1995). Deze verschillende reactie zou het resultaat kunnen zijn van de verhoogde expressie
van Insuline-like Growth Factor 1 (IGF-1) in de verlengde positie, welke onveranderd blijft in
de verkorte positie (Yang et al, 1997).
Hoewel de effecten van disuse op de spieren reeds relatief goed gekend zijn, blijven de
onderliggende moleculaire mechanismen onduidelijk. Een vaak toegepast model om disuse
atrofie te onderzoeken is tail of hindlimb suspension. Beide methoden bestaan er in de
proefdieren te beletten de achterste ledematen mechanische te kunnen belasting. Dit door deze
op te hangen aan hun achterste ledematen zelf of aan de staart. Eén probleem bij dit model is
dat het feit dat de testes in het abdomen kunnen afzakken waardoor de testosteron productie
wordt beïnvloed (Royland et al, 1994; Wright et al, 1997; Amann et al, 1992).
1.4 Klinische relevantie
De daling in functionele capaciteit en spierkracht maakt spieratrofie klinisch relevant. Er is
niet enkel een daling in de kwantiteit van de spieren, er is ook een daling in de kwaliteit.
Hierdoor ondervinden personen geconfronteerd met spieratrofie hinder in het dagelijkse
leven. Uit de huidige literatuur blijkt echter dat er zeer weinig aandacht wordt besteed aan dit
aspect van spieratrofie. Implicaties worden enkel omschreven voor geïsoleerde ziektebeelden.
Concrete voorbeelden hiervan zijn deze van sarcopenie en disuse atrofie bij chronic
obstuctive pulmonary disease (COPD ). Echter, onderzoek bij gezonde individuen
10
geconfronteerd met een extreme vorm van spieratrofie, heeft aangetoond dat er wel degelijk
een verband bestaat tussen spieratrofie en een verhoogde morbiditeit en mortaliteit (Metter et
al, 2002).
Bij sarcopenie dalen zowel de dynamische, statische als kinetische spierkracht met de leeftijd
(Aniansson et al, 1980). De capaciteit om kracht te produceren, de contractiekracht en de
algemene contractie- en relaxatietijd gaan achteruit. De daling in functionele capaciteit wordt
duidelijk door het gestegen relatief risico op het hebben van evenwichtsstoornissen, het
gebruik van een wandelstok en het hebben van een handicap bij ten minste drie instrumentale
activiteiten van het dagelijkse leven (Baumgartner et al, 2004).
De relatie tussen sarcopenie en functionele handicaps wordt echter verstoord door andere
variabelen. Wanneer deze relatie wordt uitgezuiverd voor leeftijd, ras, BMI, gezondheid en
comorbiditeit verzwakt de kracht van deze relatie significant (Janssen et al, 2004).
Uit verder onderzoek is dan ook gebleken dat niet zozeer de spiermassa, maar wel de
spierkracht een predictiefactor in de mortaliteit van ouderen is (Gale et al, 2007).
Hieruit blijkt dat sarcopenie niet enkel morbiditeit maar ook mortaliteit in combinatie met
andere pathologieën veroorzaakt.
COPD is bewezen op een zelfde manier in te werken op de mortaliteit als sarcopenie.
Gebaseerd op de gevestigde relatie tussen lichaamsgewicht en overleving, en het preferentieel
verlies van spierweefsel bij COPD, kan er worden gespeculeerd dat spieratrofie een sterke
predictor is van mortaliteit bij COPD (Shols et al, 1998; Bernard et al, 1998).
Het verlies aan spiermassa zorgt niet enkel voor een gedaalde spierkracht, maar ook voor een
gedaalde VO2max. Deze daalt aan een snelheid van 3.8% per decennium vanaf de leeftijd van
30 jaar (Astrand et al, 1973). In deze daling is spiermassa de enige significante factor
gebleken (Fleg et al, 1985). Op deze manier komt de VO2max steeds dichter bij de kritieke
grens van 18ml/min/kg voor mannen en 15ml/min/kg voor vrouwen. Deze kritische grens
houdt in dat, wanneer deze overschreden wordt het zelfstandig functioneren praktisch
onmogelijk wordt. Dagdagelijkse taken worden ontzettend zwaar en zullen anaëroob
verlopen. Stofzuigen, bijvoorbeeld, vereist een VO2max van 17 ml/min/kg.
Disuse atrofie gaat vaak gepaard met nadelige veranderingen in botsterkte als gevolg van de
verminderde mechanische loading, welke normaal wordt gegenereerd door contraherende
11
spieren (Aguire et al, 2006). Deze veranderingen in botsterkte kunnen ernstige gevolgen
hebben, het bot kan broos en meer vatbaar voor breuken worden. Breuken zullen moeten
worden ingegipst waardoor er verdere disuse atrofie optreedt: een nieuwe vicieuze cirkel
ontstaat.
1.5 Huidige therapieën
Elke behandeling van spieratrofie heeft tot doel de spiermassa te verhogen en de functionele
resultaten te bevorderen, welke uiteindelijk leiden tot een verbeterde levenskwaliteit voor de
patiënten.
De volgende therapieën kunnen specifiek of in een specifieke combinatie worden toegepast
voor elke conditie, dit omdat het onderliggende mechanisme kan verschillen naar gelang de
oorzaak.
1.5.1 Fysieke activiteit
In sommige gevallen wordt de atrofie gecompliceerd en versneld door andere medische
condities en medicaties. Deze kunnen potentieel de capaciteit om fysieke activiteit uit te
voeren verhinderen of reduceren, welke op hun beurt de vicieuze cirkel versterken (Peel &
Mossberg, 1995).
Krachttraining is de meest effectieve oefening om atrofie af te remmen en spierkracht te
behouden of te verhogen. Met krachttraining wordt de spiermassa en spierkracht verhoogd bij
zowel vrouwen als mannen. Deze verhoging van spiermassa en spierkracht is tevens waar te
nemen bij de bijzonder oude bevolking (Balagopal et al, 2001; Drukker et al, 2001).
Samenvallend is er een stijging in de maximale vrijwillige spierkracht en hypertrofie in de
spiervezel (Parise et al, 2000).
Progressieve krachttraining twee tot drie keer per week verbeteren de fysieke functies en
verminderen de fysieke handicaps en spierzwaktes bij ouderen. Functionele beperkingen zoals
evenwicht, wandelsnelheid, recht staan uit een stoel en de trap opgaan verbeteren door middel
van krachttraining (Liu et al, 2009).
Aërobe training geeft dan weer belangrijke voordelen in de cardiovasculaire fitheid.
Er is echter weinig geweten over de duur van deze effecten na stopzetting van training.
Een voorgeschreven trainingsprogramma ter behoud van een onafhankelijke levensstijl hoort
dan ook een combinatie van zowel krachttraining voor de spierkracht, als aërobe training voor
12
de cardiovasculaire fitheid, te bevatten. Meestal worden er ook lenigheids- en
evenwichtsoefeningen aan toegevoegd (Singh, 2002).
In de meeste gevallen kan krachttraining echter niet instaan voor het stoppen of omkeren van
het atrofie proces (Lynch, 2004). Desondanks wordt er algemeen aangenomen dat het deze
wel afremt en daarom ook moet overwogen worden in elke interventie waar mogelijk.
1.5.2 Nutritionele interventies
Proteïne poeders en specifieke aminozuren worden verwacht het verlies aan spierproteïne te
verzachten en een meer gunstige intracellulair milieu te voorzien om zo proteïne synthese te
promoten (Dorrens & Rennie, 2003; Volpi et al, 2003).
Creatine suppletie is effectief bevonden voor patiënten met musculaire dystrofie en
mitochondriale myopathie, en is bekwaam sarcopenie te verzachten en nuttig om rehabilitatie
te faciliteren na disuse atrofie (Pearlman & Fielding, 2006).
Nutritionele strategieën hebben dus hun bijdrage in het verzachten van atrofie, maar zijn
efficiënter wanneer deze gecombineerd worden met fysieke activiteit. Een complementaire
benadering met geneesmiddelentherapie in de behandeling van ernstige vormen van atrofie is
aangewezen.
1.6 Testosteron, een hormonale interventie
In vele gevallen vereist de ernst van atrofie een farmaceutische interventie die de synthese van
proteïnen promoot en/of de degradatie van proteïnen reduceert.
1.6.1 Androgenen
Androgenen worden gedefinieerd als hormonen die de groei en ontwikkeling stimuleren van
het mannelijke voortplantingssysteem. Dit omvat het scrotum, het mannelijke ductus systeem
en bijhorende organen zoals de prostaat, zaadcellen en de penis.
Deze mannelijke hormonen zijn tevens noodzakelijk voor het optreden en ontwikkelen van de
secundaire geslachtskenmerken. Deze omvatten de mannelijke lichaamsbouw als gevolg van
de musculaire ontwikkeling en lineaire groei.
Daarenboven zijn androgenen noodzakelijk voor de normale seksuele functie en
vruchtbaarheid (George et al, 1994). Tevens hebben zij belangrijke metabole effecten op
proteïne- (Urban et al,1995), koolhydraat- (Marin et al, 1995) en vetmetabolisme (Kohn FM,
2006). Als zodanig dragen zij bij tot de bepaling van spiermassa en –kracht, alsook van bot-
13
en vetmassa. Bovendien beïnvloeden androgenen het gedrag (Olweus et al, 1980) en cognitie
(Newman et al, 2005).
Testosteron (fig. 3), dihydrotestosteron, androsteendion, dehydroepiandrosteron en zijn
sulfaat zijn de hoofdandrogenen in de bloedsomloop.
Fig. 3. Structuurformule van testosteron, overgenomen van
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Testosteron.PNG.
1.6.1.1 Fysiologie
Testosteron maakt deel uit van de menselijke fysiologie. Het mannelijke hormoon speelt reeds
een belangrijke rol vanaf de zwangerschap. Testosteron is onder meer verantwoordelijk voor
de seksuele ontwikkeling (Hannema & Hughes, 2007; Kellokumpu-Lehtinen, 1980),
spermatogenese (Sanborn et al, 1997; Singh et al, 1995), seksueel functioneren (Guay AT,
2006; Mikhail N, 2006) en de lineaire groei (Vandershueren et al, 2004; Kerrigan & Rogol,
1992). Meer van belang zijn de invloeden op de secundaire geslachtskenmerken en
lichaamssamenstelling.
1.6.1.2 Secundaire geslachtskenmerken
Seksuele differentiatie begint reeds tijdens de zwangerschap, wanneer de gonaden zich
vormen (Sobel et al, 2004). De aanvang van differentiatie wordt geassocieerd met hoge
gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH) pulsen. Deze stimuleren de secretie van
luteïniserend hormoon, LH, en follikel stimulerend hormoon, FSH, door de hypofyse, die op
hun beurt de stijging van sekshormonen vooraf gaan. De mannelijke puberteit is de periode
waarin de testosteronsecretie stijgt tot de volwassenen productie. Testosteron verhoogt
14
rechtstreeks de spiergrote en –massa, stembanden, botten, kracht, verdiept de stem en
verandert de vorm van het aangezicht en het skelet (Cartault et al, 2008). Wanneer testosteron
in de huid wordt omgezet in DHT versnelt het de groei van gezichts- en lichaamshaar (Randal
VA, 1994). Wanneer testosteron omgezet wordt in 17-β-estradiol, (E2) , speelt deze een
beslissende rol in botmaturatie en de groei van het kraakbeen (Juul A, 2001).
1.6.1.3 Lichaamssamenstelling
Sinds decennia is het gekend dat skeletale spiermassa één van de doelwit weefsels is voor
androgenen. Personen met een verlaagde vrij testosteron index hebben dan ook lagere
appendiculaire spiermassa dan deze met een normale index (Roy et al, 2002). De
appendiculaire spiermassa bestaat uit de spieren in de schouder- en bekken gordel en deze
van de ledematen. Testosteron levels correleren ook met visceraal en subcutaan vetweefsel,
hoe lager het testosteron niveau hoe hoger het aandeel vetweefsel (Rebuffescrive et al, 1991;
Seidell et al, 1990)
Omdat er lage 5α-reductase levels aanwezig zijn in de skeletale spieren wordt er aangenomen
dat niet DHT maar testosteron het belangrijkste androgeen is in de spieren (Bahsin et al,
2003). Bij mannen zijn androgenen noodzakelijk om de normale spiermassa en –kracht te
behouden (Mauras et al, 1998). Het mechanisme van testosteron actie is echter weinig
bekend. Mannelijke spieren bevatten aromatase enzym activiteit, welke een potentiele
werking van testosteron via E2 suggereert (Matsumine et al, 1986).
1.6.2 Synthese
De aanmaak van testosteron gebeurt bij de man voor 95% in de testis en voor 5% in de
bijnier. Alle steroïde hormonen worden gesynthetiseerd vanuit de precursor cholesterol
(Stocco & Clark, 1996). Er zijn drie bronnen van cholesterol in de aanmaak van steroïde
hormonen: de novo synthese vanuit acetaat, een pool cholesterolesters in steroïdogene
weefsels en voedingsbronnen. Ongeveer 80% van het cholesterol, gebruikt voor de
steroïdhormoon synthese, is afkomstig van de voedingsbronnen. In het menselijk plasma
wordt deze getransporteerd onder de vorm van low-density lipoproteïnen (LDL) partikels.
De eerste stap in de steroïde hormoon synthese is de omzetting van cholesterol naar
pregnenolon. Deze staat onder controle van het luteïniserend hormoon en vind plaats in de
mitochondria en is de snelheid beperkende stap.
15
In het endoplasmatisch reticulum wordt het verkregen pregnenolon verder omgezet tot
testosteron via verschillende enzymatische reacties (fig. 4).
Fig. 4. schematische voorstelling van de steroïdogenese, overgenomen van
http://carolguze.com/text/442-6-sexual_differentiation.shtml.
1.6.3 Werkingsmechanisme
Een hormoon kan enkel invloed uit oefenen op die weefsels die de juiste receptoren bevatten.
Om te kunnen inwerken op de receptoren moeten de hormonen eerst de cel binnen dringen.
Zo is testosteron in staat om passief door het celmembraan te diffunderen om zich vervolgens
te binden op de androgeen receptor (AR) waardoor de androgene acties plaats kunnen vinden
(Giorgi & Stein, 1981). Ook is het mogelijk dat het testosteron eerst wordt omgezet in
dihydrotestosteron (DHT) door 5α-reductase, alvorens zich te binden aan de AR. DHT heeft
een 10 keer hogere affiniteit voor de AR en wordt gezegd een hogere efficiëntie te hebben dan
testosteron (Wilbert et al, 1983; Deslypere et al, 1992).
Androgeen receptoren zijn in tal van weefsels aanwezig. AR zijn in een relatieve overvloed
aanwezig in de hypothalamus, bijnier, epididymis, prostaat, hypofyse, skeletale spieren,
nieren, lever en hart (Sar et al, 1990). Ook zijn er AR aanwezig in tal van andere weefsels
waaronder botweefsel (Abu et al, 1997).
16
Wanneer testosteron zich op de AR bindt, vormt zich een ligandbinding welke ervoor zorgt
dat de AR dissocieert van zijn chaperonne-eiwit en een dimeer vormt. Dit dimeer is in staat
om de celkern binnen te dringen, waar hij de reactieve elementen op de promotor van de
doelgenen herkent en de transcriptiefactoren rekruteert (Chang et al, 1995).
1.6.3.1 Indirecte effecten via IGF-1
Data suggereren dat androgenen de circulerende en lokale IGF-1 levels kunnen reguleren
(Hobbs et al, 1993).
IGF-1 wordt verondersteld een mediator te zijn in de anabole acties van androgenen op de
spieren. IGF-1 lijkt belangrijk te zijn voor zowel de proliferatie als de differentiatie van de
skeletspier myoblasten (Florini et al, 1996).
Desondanks het feit dat studies de androgeen actie op de regulatie van IGF-1 in skeletspieren
ondersteunen, is de omvang van inwerking van deze signaalweg op het gehele proces nog
onduidelijk.
1.6.4 Suppletie
Ondanks de goed omschreven effecten van testosteron suppletie blijven de onderliggende
moleculaire mechanismen relatief ongekend.
1.6.4.1 Invloed op spiermassa
Serumlevels van testosteron en adrenale androgenen dalen met de leeftijd. Er zijn dan ook
epidemiologische data die de relatie tussen deze daling in testosteron en daling in spiermassa,
spierkracht en functionele status ondersteunen (Perry et al,2000). Recent onderzoek heeft
tevens onweerlegbaar aangetoond dat androgenen, zoals testosteron, de spiermassa bij mensen
reguleert (Herbst & Bahsin, 2004; Brill et al, 2002; Schroeder et al, 2003; Bahsin et al,
2003;Harman et al, 2003; Wittert et al, 2003; Woodhouse et al, 2004).
Bij mensen zijn er duidelijke bewijzen dat fysiologische testosterontoediening de vetvrije
massa doet toenemen in condities met lage circulerende androgenen. Testosteron substitutie is
dan ook effectief in het bestrijden van spieratrofie bij hypogonadale mannen (Brodsky et al,
1996; Bahsin et al, 1997), oudere mannen met normaal of laag serum testosteron (Snyder et
al, 1999, 2000; Ferrando et al, 2002) en Hiv-geïnfecteerde mannen met laag serum testosteron
(Bahsin & Javanbakht, 1999).
Vergelijkbare resultaten werden aangetoond met suprafysiologische toediening bij eugonadale
gezonde mannen (Griggs et al; Bahsin et al, 1996) en Hiv-geïnfecteerde mannen met normaal
testosteron niveau (Fairfield et al, 2001).
17
Opkomende data suggereren dat testosteron spiervezel hypertrofie induceren door in te
werken op verschillende stappen in de signaalwegen van zowel proteïne synthese als
degradatie (Bahsin & Herbst, 2004).
1.6.4.2 Invloed op spierkracht
Ondanks het feit dat er consensus heerst over het feit dat androgeen toediening leidt tot een
verhoogde spiermassa, is deze minder aanwezig over de inwerking op spierprestatie en
fysieke functie. De huidige klinische toepassingen van androgenen als anabole agentia zijn
dan ook gebaseerd op de hypothese dat testosteron geïnduceerde spiermassa aangroei zou
geassocieerd zijn met klinisch betekenisvolle verbeteringen in spierprestatie en fysieke functie
(Bahsin S, 2003).
Uit twee verschillende onderzoeken (Storer et al, 2003; Bahsin et al, 2000) blijkt dat de
maximale vrijwillige kracht en het spiervermogen verbeteren door testosteron toediening.
Deze verbetering is echter proportioneel met de verhoging van de spiermassa waardoor er
geen verbeteringen optreden in zake contractiliteit. Bij krachttraining is er wel een verbetering
in de contractiele eigenschappen van de spieren. De vermoeibaarheid van de spieren bleef
echter onveranderd bij testosteron toediening.
Bepaald onderzoek illustreerde niet enkel een toename in spiermassa, maar ook in
spiergrootte en spierkracht (Bhasin et al, 1996). De dwarsdoorsnede van de spier nam toe bij
zowel de personen behandeld met testosteron zonder extra krachttraining als deze met
krachttraining. Deze met krachttraining toonden echter een grotere toename in
dwarsdoorsnede. De spierkracht steeg net zoals de dwarsdoorsnede voor beide groepen en ook
hier was er een grotere toename voor de personen die testosteron suppletie combineerden met
krachttraining. Men kan dan ook besluiten dat supra fysiologische dosissen van testosteron,
zonder krachttraining, volstaan om de spiermassa, -grootte en –kracht te doen toenemen. De
toename kan echter worden gemaximaliseerd door suppletie te combineren met krachttraining
(Bhasin et al, 1996).
Hoewel sommige studies een verbeterde spierkracht wisten aan te tonen als gevolg van
testosteron toediening (Schroeder et al, 2003), faalden anderen er in om significante effecten
te bewijzen ondanks de winst in spiermassa door androgeen toediening (Wang et al, 2004).
18
De effecten van androgenen op de spierkracht blijven als gevolg minder duidelijk (Axell et al,
2006).
1.6.4.3 Invloed op spierfunctionaliteit
Hypogonadisme wordt geassocieerd met een verhoogd risico op vallen, verminderd statisch
en dynamisch evenwicht, verzwakt vermogen om recht te staan vanop een stoel en de tandem
walk (hiel telkens tegen de tenen plaatsen) uit te voeren. Verminderde testosteron levels
worden dan ook in verband gebracht met een verhoogd risico op functionele beperkingen
(Szulc et al, 2003).
De effecten van testosteron toediening op het fysiek functioneren en gezondheidsgerelateerde
outcomes zijn echter nog niet aangetoond. Het is enkel voor ouderen geweten of
testosterontoediening volstaat om het risico op vallen, breuken en beperkingen te reduceren.
Bij jongeren is hier geen onderzoek naar verricht. Tevens kan fysiek functioneren en
gezondheid gerelateerde kwaliteit van hun leven verbeteren (Bahsin S, 2003). Pilootstudies
(Bakhshi et al, 2000; Amory et al, 2002) bieden echter een rationale voor verdere trails in
zake testosteron suppletie.
1.6.4.4 Somatische Neveneffecten
Er wordt algemeen aanvaard dat het misbruik van anabole androgene steroïden geassocieerd
kan worden met somatische neveneffecten, maar de incidentie en prevalentie lijkt echter
beperkt. Neveneffecten blijken enkel tot stand te komen wanneer er sprake is van een
langdurig en vaak excessief gebruik. Om deze redenen worden steroïden gecatalogeerd bij
andere illegale substanties met een relatief lage schade impact.
Acute neveneffecten
Kleinere acute neveneffecten van steroïdengebruik zijn: vochtretentie voornamelijk in de
extremiteiten, gastro-intestinale irritatie, diarree, buikpijn en een vettige huid.
Acute neveneffecten met een meer klinische impact zijn: geelzucht, menstruele
abnormaliteiten en hypertensie. Er kunnen zich infecties voordoen op de plaats van injectie,
welke pijn en abcessen veroorzaken. Omdat er aromatisatie van de toegediende steroïden kan
voorkomen, waardoor er verhoogde oestrogeen levels kunnen optreden bij mannen (Wilson
JD, 1988), kan dit leiden tot borstpijnen en vaak irreversibele gynaecomastie.
Observationele studies duiden aan dat de meerderheid (88-96%) van de anabole
steroïdengebruikers minstens één neveneffect ondervinden. De meest voorkomende zijn acne
19
( 40-54%), testiculaire atrofie (40-51%), gynaecomastie ( 10-34%), huidstriemen (34%) en
injectie-gebied pijnen (36%) (Evans NA, 2004).
Chronische neveneffecten
Gezondheidsgevolgen in verband gebracht met anabool steroïdenmisbruik omvatten onder
meer urogenitale problemen en acne. De grootste zorgen gaan echter uit naar de
cardiovasculaire neveneffecten; hypertensie, artherosclerose, hartaanvallen, beroertes en
hepatische ziekten; levercystes en andere leververanderingen als ook leverkanker ( Melchert
& Welder, 1995; Sulivan et al, 1998). Veranderingen bij mannen die reversibel zijn, omvatten
de spermaproductie, impotentie, pijnlijk urineren en het krimpen van de testes. Steroïden
worden tevens in verband gebracht met prostaatkanker (Creagh et al, 1988). Veranderingen
bij vrouwen zijn onder meer het ontstaan van een onregelmatige menstruele cyclus en het
ontwikkelen van meer mannelijke karakteristieken zoals minder lichaamsvet, kleinere borsten,
lagere stem, buitensporige groei van lichaamshaar en een irreversibel verlies van hoofdhaar
als ook clitorale groei.
Bezorgdheden omtrent deze chronische neveneffecten hebben investeringen in de
ontwikkeling van selective androgen receptor modulator (SARM) doen toenemen.
Deze SARM’s hebben dezelfde anabole effecten op de spier, maar hebben niet dezelfde
neveneffecten. Het idee achter deze SARM’s is dat deze een grotere androgeen receptoren
(AR) en weefselspecificiteit kunnen bezitten door hun grotere vatbaarheid tot structurele
modificaties. De eerste generatie SARM’s is er in geslaagd om een agonistische werking in
zowel het spier- als botweefsel te bekomen en slechts een gedeeltelijke agonistische werking
in de prostaat en zaadblaasjes (Bhasin et al, 2006).
20
2 Probleemstelling
Disuse atrofie is een wijd verspreid probleem waar iedereen vroeg of laat mee geconfronteerd
wordt. Hindlimb of tail suspension is een model dat frequent gebruikt wordt ter inductie
disuse atrofie in een onderzoekssetting. Het probleem met dit model is dat er door het
inzakken van de testes een gedaalde testosteron productie optreed, welke een bias in het
onderzoek vormt. In dit onderzoek trachten we te achterhalen of deze gedaalde testosteron
productie ook daadwerkelijk een significant effect heeft op de atrofie.
Desondanks het feit dat het globale mechanisme, het onevenwicht in proteïne degradatie en
synthese, verantwoordelijk voor spieratrofie bekend is, blijven de onderliggende
mechanismen onduidelijk. Er zijn genen gekend die verantwoordelijk zijn voor ofwel
hypertrofie, ofwel atrofie. Deze lijst van gekende genen is nog zeer beperkt en dus lang niet
exhaustief. Daarenboven wordt de genen transcriptie steeds vooraf gegaan door een
signaalweg. Deze staat onder invloed van tal van factoren, een enorme verzameling van
factoren die men nu enigszins in kaart begint te brengen, maar nog lang niet compleet is.
Bovendien wordt er aangenomen en is er reeds aangetoond dat er een wisselwerking bestaat
tussen verschillende signaalwegen. Hoe deze wisselwerking juist in elkaar zit en op welke
niveaus deze allemaal plaats vinden is nog steeds relatief ongekend.
Dus, de kennis waarover men momenteel beschikt is jammer genoeg slechts een deel van een
veel groter geheel. Kennis die men zou kunnen gebruiken om de aanmaak van adequate
geneesmiddelen te garanderen. Geneesmiddelen die in tal van condities zouden kunnen
worden toegepast, enerzijds om daadwerkelijke pathologieën te bestrijden, en anderzijds om
ongemakken gepaard gaande met leeftijd, ziekte, omgeving te verhelpen.
Testosteron lijkt een zeer goede oplossing voor disuse atrofie door zijn sterk anabole werking.
Echter, door zijn systemische werking geeft testosteron behandeling ook tal van
nevenwerkingen die niet wenselijk zijn. In dit onderzoek trachten we aan de hand van
testosteron behandeling moleculaire signaalwegen die betrokken zijn bij disuse atrofie en
testosteron, bloot te leggen om zo therapeutische targets te ontdekken.
21
3 Hypothese
De spier specifieke ubiquitine ligasen Atrogin-1 en MuRF-1 worden gezien als mastergenen
in de regulatie van spieratrofie, terwijl S6K1 en 4EBP1 bepalende genen zijn in de regulatie
van de spierhypertrofie. De moleculaire regulatie van deze genen tijdens disuse atrofie is
echter niet gekend en het is onduidelijk of er een spiervezelspecifieke respons is. Bovendien
zijn de effecten van testosteron suppletie tijdens disuse atrofie op de moleculaire targets
ongekend.
Is de androgeen deficiëntie daadwerkelijk betrokken bij atrofie tijdens tail suspension?
Disuse atrofie zal gepaard gaan met een upregulatie van de atrofie inducerende genen,
met tegelijk een down regulatie van de hypertrofie inducerende genen.
Disuse atrofie induceert een tijdsafhankelijk effect op de mRNA expressie van deze
genen.
Testosteron behandeling in suprafysiologische hoeveelheden zal een positief effect
hebben op disuse atrofie.
Het spiervezeltype, glycolytische tegen over oxidatieve spiervezels, zal bepalen hoe er
moleculair wordt gereageerd op disuse atrofie, maar ook op de testosteron
behandeling.
22
4 Materialen en methoden
4.1 Studie design
Negentig mannelijke C57BL/6JOla muizen (Harlan Laboratories) van 8 weken oud werden ad
random toegewezen aan één van de 3 interventie groepen (fig. 5). In de controle groep
(SHAM) ondergingen de muizen een schijnoperatie, de muizen werden verdoofd, er werd een
incisie gemaakt en vervolgens werden de muizen weer toe genaaid. Dit om de effecten van
een chirurgische ingreep uit te kunnen sluiten.
In een tweede groep (TS+V) kregen de muizen subcutaan een lege silastic tube (Silclear
tubing 1.57 × 2.41 mm, Degania, Israel ) van 1 cm lengte (vehicle) ingepland in de nek. Deze
groep onderging tail suspension als atrofie inductor. De tail suspension hield in dat de muizen
aan hun staart werden opgetild, zodanig dat de achterste ledematen niet meer mechanisch
belast werden. De staart werd vastgehecht met tape aan een S-vormige paperclip. Dit werd via
een metalen draad aan een rail boven de kooi (type C) vastgemaakt, zodanig dat de muizen
zich in een hoek van 30 graden ten opzicht van de bodem vrij konden bewegen op de
voorpoten, met de achterpoten opgeheven van de bodem. In de derde en laatste groep (TS+T)
ondergingen de muizen tail suspension en kregen zij een zelfde silastic tube als de TS+V
groep subcutaan in de nek ingepland, met een suprafysiologische hoeveelheid testosteron
(Sigma-Aldrich), ½ verdund met cholesterol zoals beschreven door Vanderschueren et al.
Sacrifiëring werd uitgevoerd op 3 tijdstippen, respectievelijk 1 dag, 5 dagen en 14 dagen. Bij
elke interventie bestond iedere groep uit 10 muizen.
Het protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie dierproeven, van de faculteit
geneeskunde en gezondheidswetenschappen, Universiteit Gent.
23
Fig. 5. Schematische weergaven van het studie design
4.2 Operatie en behandeling
Bij aankomst kregen de dieren 2 weken tijd om te acclimatiseren alvorens te starten met de
operatie. Voor het inplanten de silastic tubes werden de muizen verdoofd met Isofluraan aan
de hand van inhalatie (Forene; Abbott, Brussels, Belgium).
De implantatie van de silastic tubes gebeurde steeds 2 dagen voor aanvang van de tail
suspension, op deze manier konden de muizen recupereren van de ondergane operatie en
kregen de silastic tubes de tijd om de release aan te vatten. De toediening van testosteron werd
nadien gecontroleerd door het wegen van de zaadblaasjes en de testes. Er werd dagelijks
toegekeken op het welzijn van de muizen. Hierbij werd aandacht besteed aan de voedsel- en
waterinname, uitzicht van de vacht, ademhaling en het lichaamsgewicht werd opgevolgd.
4.3 Biopten
Na 1 dag, 5 dagen of 14 dagen werden de dieren gesacrifieerd via cervicale dislocatie en
werden de soleus (SOL) en extensor digitorum longus (EDL) gedissecteerd, zowel aan het
linker als rechter lidmaat.
Verder werden ook de zaadblaasjes en testes gedissecteerd. Al de verkregen biopten werd
onmiddellijk ingevroren in vloeibaar stikstof en later bewaard op een temperatuur van -80° C
om verdere mRNA expressie analyse mogelijk te maken.
Groep 14
dagen 5dagen 1dag Muizen
C57BL/6JOla N=90
N=10 N=10 N=10 SHAM
N=10 N=10 N=10 TS+V
N=10 N=10 N=10 TS+T
24
4.4 RNA-isolatie en qPCR
RNA-isolatie gebeurde met behulp van Tripure Isolation Reagent (Roche Diagnostics,,
Vilvoorde, België) gevolg door een clean-up met de RNaesy mini kit (Qiagen, Venlo,
Nederland) volgens de instructies van de fabrikant. DNase behandeling werd uitgevoerd door
middel van de RNAse-Free DNase kit (Qiagen). RNA-concentratie werd gemeten met de
Nanodrop ND-2000 Spectrophotometer (Thermo-Scientific). De zuiverheid van het RNA
werd beoordeeld aan de hand van de A260/A280 ratio. De daarop volgende cDNA synthese
gebeurde aan de hand van de iScript cDNA Synthesis kit (BioRad, Nazareth, Belgium)
volgens de instructies van de fabrikant.
Hierna kon de real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) worden uitgevoerd op
het Lightcycler 480 system (Roche), gebruik makende van een 8µl reactiemix. Deze
reactiemix bestond uit 3 µl cDNA (1/10 verdund), 300 nM forward en reverse primer en 4 µl
SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Halle, Belgium). Het cyclische
programma bestaat uit een polymerase activatie bij 95°C gedurende 10 minuten, gevolgd door
40 cycli bij 95°C gedurende 15 seconden en 60°C gedurende 60 seconden. In deze cycli
ondergaan de cDNA strengen achtereenvolgens denaturatie (bij 95°C), welke ervoor zorgt dat
het dubbelstrengig cDNA afwikkelt en splitst in enkelvoudige strengen, met vervolgens
primer annealing met elongatie (bij 60°C). Deze primer annaeling met elongatie staat in voor
het opnieuw verkrijgen van dubbelstrengig cDNA (fig. 6).
Primer sequenties voor Atrogin-1, Murf-1, 4EBP1 en S6K1 werden overgenomen van de
RTprimerDB site (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/). De sequentie specificiteit werd
bevestigd door gebruik te maken van NCBI Blast analyse
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Om de specificiteit van het amplicon na te gaan werd
de smeltcurve onderzocht (15sec bij 95°C, 1min bij 60°C en 15sec bij 95°C, waarbij telkens
om de 3°C het fluorescentiemateriaal gemeten werd) en qPCR efficiëntie berekend (E = 10^(-
1/slope)). Genormaliseerde genexpressie waarden werden berekend door de ruwe
genexpressie waarden van elk staal te delen door het geometrisch gemiddelde van de 3 meest
stabiele referentie genen (Ppia, Rplp0 and B2M) zoals bepaald met behulp van GeNorm.
Relatieve genexpressie niveaus werden berekend via de delta-delta-Ct method (2 Ct, controle -
Ct, test) (Vandesompele et al, 2002).
25
Fig. 6. Schematische weergaven van de qPCR. Figuur overgenomen van
http://en.wikipedia.org/wiki/File:PCR.svg)
4.5 Statistische analyse
Data analyse gebeurde met behulp van het software programma SPSS (SPSS 19.0, Chicago,
IL). Om statistische verschillen tussen gemiddelden te bepalen werd er gebruik gemaakt van
de one-way ANOVA test, met als post-hoc analyse de LSD test. Significantie werd
verondersteld indien de p-waarde minder dan 0,05 bedroeg.
26
5 Resultaten
5.1 Lichaamsgewicht, zaadblaasjes en testes
5.1.1 Lichaamsgewicht
Na één dag tail suspension, met of zonder testosteron behandeling (respectievelijk TS+V en
TS+T), werd er geen significant verschil gevonden in het lichaamsgewicht van de muizen
vergeleken met de controle groep (SHAM). Na 5 en 14 dagen tail suspension was het
lichaamsgewicht van beide interventiegroepen significant gedaald in vergelijking met de
controle groep (fig. 7).
De TS+V groep had na 5 dagen een daling van 24% en na 14 dagen een daling van 19% in
lichaamsgewicht vergeleken met de SHAMs. De TS+T groep kende een gelijkaardige daling,
na 5 dagen 21% en na 14 dagen 12% tegen over de controle groep. Er werd geen significant
verschil in lichaamsgewicht tussen de TS+V en TS+T groep gevonden.
Fig. 7. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op het lichaamsgewicht. De foutenbalken stellen de standaard deviatie
voor. * (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van SHAM.
27
5.1.2 Zaadblaasjes
Testosteron suppletie was succesvol, de androgeen gevoelige zaadblaasjes vertoonden
duidelijke hypertrofie. Het gewicht van de zaadblaasjes was bij elke interventie periode (1, 5
en 14 dagen), significant hoger bij de testosteron toegediende groep (TS+T) vergeleken met
deze met vehicle (TS+V; P<0,001) of de controle groep (SHAM). Na 5 en 14 dagen tail
suspension zonder testosteron toediening (TS+V) was de massa van de zaadblaasjes
significant gedaald vergeleken met de controle groep (fig. 8). Wanneer we naar de relatieve
massa van de zaadblaasjes kijken ten op zichte van het lichaamsgewicht vonden we na tail
suspension geen significant verschil in vergelijking met de controle groep.
Fig. 8. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op de massa van de zaadblaasjes. De foutenbalken stellen de standaard
deviatie voor. * (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van SHAM.
5.1.3 Testes
De massa van de testes vertoonde eveneens een duidelijke atrofie. Na 1 dag tail suspension
was het gewicht van testes bij de TS+V groep reeds significant lager vergeleken met de
controle groep. 5 en 14 dagen tail suspension, met of zonder testosteron behandeling
(respectievelijk TS+V en TS+T) resulteerde in een significante daling in het gewicht van de
testes vergeleken met de controle groep. Geen significante verschillen tussen de twee tail
suspension condities werden waargenomen (fig. 9). Wanneer we naar de relatieve massa ten
opzichte van het lichaamsgewicht van de testes kijken, werd er geen significant verschil
gevonden tussen de verschillende groepen.
28
Fig. 9. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op de massa van de testes. De foutenbalken stellen de standaard deviatie
voor. * (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van SHAM.
5.2 EDL en SOL massa
5.2.1 Musculus extensor digitorum longus
Na 1 dag tail suspension werd er zoals verwacht, geen significante daling in de EDL
spiermassa gevonden vergeleken met de controle groep. Na 5 en 14 dagen tail suspension was
er een significante daling in EDL massa vergeleken met de controle groep. De TS+V groep
kent een significante daling in de EDL massa van respectievelijk 21% na 5 dagen en 22% na
14 dagen. De TS+T groep toont een significante daling in EDL massa na 5 dagen 15% en na
14 dagen 19% vergeleken met de controle groep. Geen significante verschillen tussen de
TS+V en TS+T groep werd gevonden wat erop wijst dat testosteron behandeling de disuse
atrofie niet kon tegengaan. De SHAM groep vertoond een significante stijging (p<0.05) in de
EDL massa tussen de 1 en 14 dagen. De TS+V vertoond een significante daling (P<0.05) in
EDL massa tussen 1 en 5 dagen tail suspension terwijl de TS+T geen significante daling
overheen de verschillende interventieperiodes vertoond (fig. 10).
5.2.2 Musculus soleus
Zoals verwacht werd er na 1 dag tail suspension geen significante daling in de SOL massa
waargenomen. Na 5 en 14 dagen tail suspension werd er een significante daling in SOL massa
vergeleken met de controle groep. De TS+V groep kende een daling in de SOL massa van
respectievelijk 23% na 5 dagen en 32% na 14 dagen. De TS+T groep toont een significante
29
daling in SOL massa na 5 dagen 22% en na 14 dagen 36% vergeleken met de controle groep.
Geen significante verschillen tussen de TS+V en TS+T groep werd gevonden wat erop wijst
dat testosteron behandeling de disuse atrofie niet kon tegengaan. Net zoals in de EDL is er een
significante stijging in de massa te vinden tussen 1 en 14 dagen. De TS+V en TS+T groep
toonden een significant gedaalde (P<0.05) SOL massa na 5 en 14 dagen tail suspension tegen
over de 1e dag. (fig. 11).
Fig. 10. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op de EDL massa. De foutenbalken stellen de standaard deviatie voor.
* (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van SHAM.
Fig. 11. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op de SOL massa. De foutenbalken stellen de standaard deviatie voor.
* (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van SHAM.
30
5.3 Genexpressies in de EDL
5.3.1 Atrogin-1
Na 1 dag tail suspension (TS+V, TS+T) werd er een significant hogere Atrogin-1 mRNA
expressie gevonden vergeleken met de controle groep. Na 5 dagen tail suspension was de
Atrogin-1 mRNA 4 en 6-voudig opgereguleerd in respectievelijk de TS+T en TS+V groep.
Na 14 dagen werden geen significante verschillen in genexpressie gevonden (fig. 12).
Fig. 12. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op mRNA expressie van Atrogin-1 in de EDL. De foutenbalken stellen
de standaard deviatie voor. * (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van
SHAM.
5.3.2 MuRF-1
De MuRF-1 mRNA expressie in de EDL was na 1 dag tail suspension significant hoger dan
deze in de controle groep (respectievelijk 3- en 2.5-voudige opregulatie voor respectievelijk
TS+V en TS+T). Na 5 dagen tail suspension werd een significante verdere opregulatie in de
MuRF-1 mRNA expressie waargenomen (respectievelijk 7- en 8-voudige opregulatie voor
respectievelijk TS+V en TS+T). Na 14 dagen tail suspension werd een significant verschil in
MuRF1 mRNA expressie waargenomen tussen de TS+V en TS+T groep (fig. 13).
31
Fig. 13. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op mRNA expressie van MuRF-1 in de EDL. De foutenbalken stellen de
standaard deviatie voor. * (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van
SHAM; $ (P<0.001) significant verschil tussen TS+V en TS+V.
5.3.3 4EBP1
De 4EBP1 mRNA expressie was na 1 dag tail suspension significant hoger dan deze bij de
controle groep. Na 5 dagen tail suspension werd de 4EBP1 mRNA expressie verder
opgereguleerd in de TS+V groep (6,5-voudig) en TS+T groep (4-voudig) in vergelijking met
de controle groep. Na 5 dagen tail suspension werd een hogere 4EBP1 mRNA expressie
waargenomen in de TS+V vergeleken met de TS+T groep dewelke borderline significant
verschillend was (P=0.05). De 4EBP1 mRNA expressie was na 14 dagen tail suspension niet
significant verschillend tussen de interventiegroepen (fig. 14).
32
Fig. 14. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op mRNA expressie van 4EBP1 in de EDL. De foutenbalken stellen de
standaard deviatie voor. * (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van
SHAM.
5.3.4 S6K1
Na 1 dag tail suspension zonder testosteron suppletie was de S6K1 expressie significant lager
dan deze bij de groep met testosteron suppletie en de controle groep. Na 5 en 14 dagen tail
suspension werden geen significante verschillen met de controle groep gevonden (fig. 15).
Fig. 15. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op mRNA expressie van S6K1 in de EDL. De foutenbalken stellen de ±
standaard deviatie voor. * (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van
SHAM; $ (P<0.05) significant verschil tussen TS+V en TS+V.
5.4 Genexpressies in de SOL
5.4.1 Atrogin-1
Atrogin-1 mRNA expressie was na 1 dag tail suspension significant hoger vergeleken met de
controle groep (respectievelijk 2- en 2,5-voudige opregulatie in de TS+T en TS+V groep).
Tevens, Atrogin-1 mRNA expressie was in de groep TS+V significant (p<0,05) hoger dan
deze van de TS+T groep na 1 dag. Na 5 dagen tail suspension met testosteron toediening
(TS+T) was de Atrogin-1 mRNA expressie verder opgereguleerd (4,5-voudig) vergeleken met
de controle groep. Hoewel er voor de groep TS+V na 5 dagen geen significante stijging in
Atrogin-1 mRNA expressie was gevonden, verschilt deze niet significant van de TS+T groep.
33
Na 14 dagen tail suspension werd er geen enkel verschil waargenomen in Atrogin-1 mRNA
expressie tussen de verschillende groepen (fig. 16).
Fig. 16. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op mRNA expressie van Atrogin-1 in de SOL. De foutenbalken stellen
de standaard deviatie voor. * (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van
SHAM.
5.4.2 MuRF-1
Na 1 dag tail suspension was de MuRF-1 mRNA expressie significant hoger dan deze in de
controle groep (respectievelijk 2- en 2,5-voudige opregulatie voor TS+T en TS+V). De
MuRF-1 mRNA expressie was na de 5 dagen tail suspensions met testosteron suppletie
significant gestegen tegen over de controle groep (5-voudige opregulatie). Na 14 dagen tail
suspension werd er geen enkel verschil terug gevonden in de MuRF-1 mRNA expressie
tussen de drie groepen. Geen significante verschillen tussen de TS+V en TS+T groep werd
gevonden (fig. 17).
34
Fig. 17. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op mRNA expressie van MuRF-1 in de SOL. De foutenbalken stellen de
standaard deviatie voor. * (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van
SHAM.
5.4.3 4EBP1
Na 1 dag tail suspension was de 4EBP1 mRNA expressie significant hoger dan deze bij de
controle groep (respectievelijk 2-voudige opregulatie voor zowel TS+T als TS+V). Na 5
dagen tail suspension was de 4EBP1 mRNA expressie significant gestegen tegen over de
controle groep (respectievelijk 5- en 3,5-voudige opregulatie voor TS+T en TS+V). Na 14
dagen tail suspension was er geen verschil te vinden in 4EBP1 mRNA expressie tussen de
verschillende groepen. Geen significante verschillen tussen de TS+V en TS+T groep werd
gevonden (fig. 18).
35
Fig. 18. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op mRNA expressie van 4EBP1 in de SOL. De foutenbalken stellen de
standaard deviatie voor. * (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van
SHAM.
5.4.4 S6K1
Na 1 dag tail suspension werd er een significant hogere S6K1 mRNA expressie gevonden in
vergelijking met de controle groep (respectievelijk 1,5-voudige opregulatie voor zowel TS+T
als TS+V). Na 5 dagen tail suspension was de S6K1 mRNA expressie nog steeds 1,5-voudig
opgereguleerd tegen over de controle groep. Na 14 dagen tail suspension was er niet langer
een verschil in S6K1 expressie tussen de verschillende groepen. Deze upregulatie is
tegengesteld aan de downregulatie die normaal wordt waargenomen tijdens disuse atrofie en
is dan ook zeer eigenaardig (fig. 19).
Fig. 19. Effecten van 1, 5 en 14 dagen tail suspension, zonder (TS+V) of met testosteron
behandeling (TS+T), op mRNA expressie van S6K1 in de SOL. De foutenbalken stellen de ±
standaard deviatie voor. * (P<0.05), † (P<0.01), ‡ (P<0.001): significant verschillend van
SHAM.
36
6 Discussie
6.1 Relevantie van cryptorchisme tijdens tail suspension
Tijdens tail en hindlimb suspension dalen de testes in het abdomen af (Royland et al, 1994;
Wright et al, 1997). In het abdomen is het steeds warmer dan in het scrotum, en deze
hyperthermische omgeving veroorzaakt een daling in de productie van testosteron (Amann et
al, 1992). Een onderdrukking van het testosteronniveau zorgt voor een daling van de proteïne
synthese in het gehele lichaam (Mauras et al, 1998). Ook wordt spontaan en experimenteel
geïnduceerde androgeen deficiëntie geassocieerd met een lagere vetvrije massa (Roy et al,
2002; Szulc et al, 2003; van den Beld, 2000). Deze ontwikkeling kan dus zorgen voor een
versterkend effect boven op de atrofie inductie via disuse.
De massa van de testes nam duidelijk af gedurende de interventie periode voor beide tail
suspension groepen. Tevens is er een daling te zien in de massa van de zaadblaasjes na 5 en
14 dagen tail suspension in de TS+V groep vergeleken met de controle groep. Dit wijst op een
daling in het testosteron niveau in deze groep. Het gewicht van de zaadblaasjes was
significant toegenomen in de groep met testosteron behandeling (TS+T) tegenover de twee
andere groepen (respectievelijke SHAM en TS+V), wat duidt op een geslaagde testosteron
behandeling. Ook in ons onderzoek is er dus sprake van cryptorchisme en een gedaalde
testosteron productie als gevolg hiervan. Als we kijken naar de geïnduceerde atrofie en
mRNA expressies van de atrogenen is er geen enkel verschil te vinden tussen tail suspension
met of zonder testosteron behandeling (respectievelijk TS+T en TS+V). Hieruit kan je de
veronderstelling maken dat, een door cryptorchisme geïnduceerde milde androgeendeficiëntie
geen enkele invloed heeft op het atrofieproces tijdens disuse atrofie.
Echter, wanneer we de massa van de zaadblaasjes en de testes relatief gaan bekijken ten
opzichte van het lichaamsgewicht worden er geen significante verschillen gevonden. Enkel
een meting van het testosteronniveau in het serum kan hierover dus uitsluitsel bieden.
37
6.2 Spiervezelspecificiteit tijdens disuse atrofie
De anti-zwaartekracht SOL is belangrijk in het onderhouden van de lichaamshouding en
wordt gedurende langere periodes gerekruteerd op een gemiddelde intensiteit. Deze SOL
wordt dan ook gezien als een tonische spier omwille van zijn bijna constante spierspanning.
De EDL wordt dan weer gezien als een fasische spier omdat deze slechts actief is tijdens
dynamische bewegingen. De EDL wordt minder vaak gerekruteerd en voert korte en relatief
krachtige contracties uit. Tail suspension zorgt dan ook voor een veel grotere reductie in
activiteit in de SOL dan bij de EDL (Degens & Alway, 2005). Doordat de omvang van
verandering in spieractiviteit veel groter is in de tonische spieren dan bij de fasische spieren is
dit een mogelijke verklaring voor de meer uitgesproken atrofie in de SOL dan deze in de
EDL. De trage spiervezels lijken dus gevoeliger aan disuse atrofie dan de snelle spiervezels.
Deze veronderstelling wordt ondersteund door verschillende studies (Fitts et al, 2001; Fluckey
et al, 2002; Stevens et al, 2000; Talmadge et al, 1995;).
Zowel de massa van de EDL als deze van de SOL waren na 5 en 14 dagen tail suspension
significant gedaald tegen over de controle groep. Tijdens tail suspension met en zonder
testosteron behandeling is de evolutie in spiermassa bijna gelijk in beide spieren. Na 14 dagen
tail suspension echter merken we op dat in de SOL een 10% hogere reductie in spiermassa
heeft plaats gevonden dan in de EDL tegen over de controle groep. Wanneer deze echter in de
tijd worden vergeleken blijkt dat er enkel een significante daling in EDL massa is ontstaan na
5 dagen tail suspension. Bij de SOL is zowel na 5 als 14 dagen de SOL massa significant
gedaald tegenover 1 dag tail suspension. Ons onderzoek geeft dan ook een bevestiging van de
veronderstelling dat trage spiervezels gevoeliger zijn aan disuse atrofie dan de snelle
spiervezels.
6.3 Spiervezelspecificiteit van testosteron tijdens disuse atrofie
Het is reeds onweerlegbaar aangetoond dat androgenen, waaronder testosteron, de spiermassa
beïnvloeden in het menselijke lichaam (Herbst & Bahsin, 2004). De toediening van
suprafysiologische dosissen testosteron heeft positieve effecten op de spiergroei bij jonge
gezonde mannen, ouderen (Griggs et al, 1989; Bhasin et al 1996;; Snyder et al, 1999, 2000;
Ferrando et al, 2002). Bij hypogonadale mannen bekomt men zelfs positieve effecten met een
fysiologische hoeveelheid (Brodsky et al, 1996; Bahsin et al, 1997). Androgenen verhogen de
spiermassa en –kracht in verschillende condities van atrofie, zoals cachexie, kanker en AIDS
(Gold et al, 2006; Hart et al, 2001; Kicman AT, 2008).
38
In dit onderzoek waarbij het effect van testosteron behandeling tijdens disuse atrofie werd
onderzocht, is er echter geen positieve invloed gevonden op de spiermassa. Dit kan te wijten
zijn aan het feit dat de suprafysiologische dosis te laag was om de disuse atrofie tegen te gaan.
Echter, het is geweten dat muizenspieren minder gevoelig zijn dan mensen voor testosteron.
Om deze reden is het niet uit te sluiten dat een testosteron behandeling van 2 maal de
fysiologische hoeveelheid bij de mens wel voor een positieve impact zou kunnen zorgen.
Hogere dosissen zouden dus wel in staat kunnen zijn om een positieve invloed op de
spieratrofie te bekomen. Hierbij moeten we echter de bedenking maken wat de biologische
relevantie is van zulke hoeveelheden testosteron. De neveneffecten zullen hierdoor niet te
vermijden zijn. In experimentele context kan dit echter wel worden toegepast om duidelijke
verandering te bekomen en op deze manier moleculaire targets bloot te leggen. Ook kan een
onderliggend mechanisme, geactiveerd door disuse, aan de basis liggen van het niet inwerken
van testosteron. Een eerder uitgevoerde pilootstudie door H. De Naeyer gaf een reductie in
spiermassa van 14% bij muizen na orchidectomie. Deze daling kon echter worden tegen
gegaan door het toedienen van fysiologische hoeveelheden testosteron. Dit leid ons naar de
veronderstelling dat testosteron enige vorm van spiercontractie nodig heeft om actief te
kunnen zijn.
Testosteron induceert zowel in de snelle als de trage spiervezels hypertrofie. Er wordt in de
literatuur echter gesuggereerd dat het grootste verschil in spiergrootte tussen testosteron
gebruikers en niet-gebruikers gevonden wordt in de trage type I spiervezels (Kadi et al, 1999;
Kadi et al, 2000; Eriksson et al, 2005). In overeenstemming hiermee werd reeds aangetoond
dat type I spiervezels gevoeliger zijn voor anabole middelen dan type II spiervezels (Hartgens
et al, 1996). Uit onze resultaten kan echter verondersteld worden dat tijdens disuse atrofie
testosteron behandeling zowel op de snelle als de trage spiervezels geen enkel effect heeft.
39
6.4 Genexpressies
De spier specifieke ubiquitine ligasen Atrogin-1 en MuRF-1 worden gezien als mastergenen
in de regulatie van spieratrofie, terwijl S6K1 en 4EBP1 bepalende genen zijn in de regulatie
van de spierhypertrofie. De atrogenen Atrogin-1 en MuRF-1vertoonden dan ook een duidelijk
upregulatie gedurende de interventie perioden van 1 en 5 dagen tail suspension. Na 14 dagen
was er niet langer een significant verschil te vinden tussen de tail suspension condities en de
controle groep. Ook het 4EBP1 gen vertoonde een zelfde evolutie overheen de verschillende
interventie perioden. Deze upregulatie wordt verondersteld te zijn veroorzaakt door de
gekende inwerking van de FoxO-familie op 4EBP1.
6.4.1 Invloed van testosteron tijdens disuse atrofie
Testosteron behandeling bleek geen significant effect te hebben op de spiermassa van zowel
EDL als SOL. Ook op moleculair niveau blijkt dit zo te zijn. Opmerkelijk is dat de groep met
testosteron behandeling een lagere, maar niet significante, mRNA expressie had van Atrogin-
1 en 4EBP1 in de snelle EDL-spier vergeleken met deze zonder testosteron behandeling.
Terwijl in de trage SOL de mRNA expressies van zowel Atrogin-1 als MuRF-1 en deze van
4EBP1 bij de groep met testosteron behandeling steeds hoger lagen, maar niet significant, dan
deze zonder testosteron behandeling. Hieruit rijst de vraag of er significante effecten zouden
kunnen gevonden worden wanneer er hogere dosissen testosteron worden gebruikt in de
interventie.
6.4.2 Invloed van het spiervezeltype op disuse atrofie
Tijdens atrofie ten gevolge van sepsis en chronisch hartfalen werd reeds aangetoond dat zowel
Atrogin-1 als MuRF-1 een hogere genexpressie vertonen in het snelle spiervezeltype (Yu et
al, 2008; Lecker et al, 2004). Het is echter niet geweten of veranderingen in de mRNA
expressie van de atrogenen als gevolg van disuse atrofie verschillen tussen de verschillende
spiertypes (Okamoto et al, 2011). Eén onderzoek heeft aangetoond dat zowel Atrogin-1 en
MuRF-1 mRNA een hogere expressie kent in het snelle spiervezeltype tijdens disuse atrofie
(Okamoto et al, 2011). Deze resultaten worden ook in ons onderzoek ondersteund. In de SOL,
het trage spiervezeltype, stegen de Atrogin-1 en MuRF-1 mRNA expressies tijdens tail
suspension maximaal tot het drievoud van de SHAM’s. Terwijl in de EDL, het snelle
spiervezeltype, deze mRNA expressies tijdens tail suspension tot het 6- en zelfs 7-voud van
de SHAM’s stegen.
40
Deze hogere mRNA expressies in de EDL tegen over de SOL komen niet overeen met de
hogere atrofie gevonden in SOL. Deze discrepantie wijst enerzijds op een verschillende
moleculaire reactie op disuse atrofie, anderzijds kan er ook verondersteld worden dat de snelle
spiervezels minder gevoelig zijn voor deze atrogenen. Op deze laatste stelling zou het meten
van de eiwitexpressie uitsluitsel moeten bieden.
De mRNA expressie van 4EBP1 in de SOL steeg in de tail suspension groep tot een 4-voud
van de SHAM’s, deze in de EDL steeg tot een 7-voud van de SHAM’s. Deze verschillen
tussen de spiervezeltypes vertonen duidelijk een overeenkomst met de atrogenen. Dit tegen
over de S6K1 mRNA expressie waar er in de EDL geen duidelijk te verklaren patroon in
terug te vinden was. In de SOL was deze genexpressie gestegen na 1 en 5 dagen tail
suspension. Deze ontwikkeling is niet zoals verwacht, en is dan ook niet te verklaren in dit
studiedesign. Echter, een mogelijke verklaring is het in actie treden van een
tegenwerkingsmechanisme om totale atrofie tegen te gaan. Het meten van de gefosforyleerde
eiwitexpressies (S6K1 en 4EBP1 zijn enkel actief wanneer deze gefosforyleerd zijn) en
upstream targets, zou hierover meer duidelijkheid kunnen scheppen.
6.4.3 Up- en Down regulatie
Disuse atrofie wordt steeds verondersteld gepaard te gaan met een upregulatie van de
ubiquitine ligasen Atrogin-1 en MuRF-1. De ubiquitine proteasoom signaalweg wordt dan
ook gezien als diegene met de belangrijkste rol in spier atrofie (Lecker et al, 1999).
Hypertrofie wordt dan verondersteld samen te gaan met een upregulatie van het kinase S6K1
en een downregulatie van de repressor 4EBP1. Door het feit dat er verbindingen bestaan
tussen deze twee verschillende signaalwegen rijst er dan ook de veronderstelling dat disuse
atrofie niet enkel een upregulatie van de atrofie genen induceert, maar ook een downregulatie
van de hypertrofie genen. Ubiquitine ligasen Atrogin-1 en MuRF-1 worden niet geactiveerd in
condities gepaard gaande met hypertrofie. Wat suggereert dat hun expressie wordt
geïnhibeerd tijdens hypertrofie (Saini et al, 2009; Brunet et al, 1999). Tijdens atrofie is het
echter nog niet geweten of er zowel een upregulatie van de atrogenen als downregulatie van
de hypertrofie genen plaats vindt. In ons onderzoek geven de mRNA expressies duidelijk
weer dat er wel degelijk een upregulatie van de atrogenen Atrogin-1 en MuRF-1 aanwezig is
tijdens tail suspension. In 2004 bekwam Jones et al. eveneens een significante stijging in
beide atrogenen onder invloed van immobilisatie. Ook het hypertrofie inhiberende gen,
4EBP1, onderging een upregulatie gedurende de tail suspension. Deze upregulatie is
41
waarschijnlijk en voornamelijk het gevolg van de gestegen activiteit van de FoxO-familie in
de atrofie signaalweg. Deze upregulatie kan gezien worden als een bevestiging van de reeds
gekende verbinding tussen FoxO en 4EBP1.De verwachte downregulatie van het hypertrofie
inducerende gen, S6K1, was echter minder duidelijk aanwezig, integendeel. In de SOL werd
er zelfs een upregulatie gevonden na 1 en 5 dagen tail suspension. In de EDL werd er wel een
significante daling gevonden na 1 dag tail suspension. Hierover is er dus geen duidelijkheid
gevonden in dit onderzoek. Het feit dat S6K1 enkel aangetoond is hypertrofie te induceren als
reactie op kracht training, kan hier een verklaring zijn (Bodine et al, 2001). Want, om deze
reden is het niet zo dat S6K1 dan ook zo’n belangrijke rol speelt in het behoud van de basale
proteïne turnover. Welke genen wel deze rol vervullen is onmogelijk af te leiden uit dit
onderzoek.
Uit dit onderzoek is niet duidelijk of disuse atrofie al dan niet voor de combinatie van een up-
en downregulatie van de atrofie en hypertrofie signaalwegen zorgt. In de snelle EDL-spier
lijkt er wel indicatie in deze richting te zijn, in de trage SOL is er geen enkele reden om deze
stelling aan te nemen. Het zou dan ook zeer interessant zijn om te gaan kijken naar upstream
targets van de besproken genen.
6.4.4 Tijdsafhankelijkheid
Eerder in de literatuur wordt al aangegeven dat zowel Atrogin-1 als MuRF-1 een belangrijke
rol zouden spelen in de aanvang van het atrofie proces en dus niet alleen in het onderhouden
van de atrofie (Centner et al, 2001). Voorgaand onderzoek met disuse condities (denervatie en
immobilisatie) suggereerde reeds dat de mRNA expressie pieken van zowel Atrogin-1 als
MuRF-1 na 3 dagen interventie plaatsvinden (Akamoto et al, 2011; Sacheck et al, 2007; Zhao
et al, 2008; Krawieck et al, 2005). Er worden in de literatuur echter geen verschillen
aangegeven tussen de snelle en trage spiervezeltypes. Ons onderzoek geeft inzake tijdseffect
een meer gedetailleerd beeld inzake spiervezeltype. Op basis van onze resultaten zijn we in
staat om verschillen tussen de snelle en trage spiervezels bloot te leggen. In de SOL had
MuRF-1 mRNA na 1 dag tail suspension reeds het hoogste expressie niveau bereikt. Het
Atrogin-1 mRNA kende nog een zeer lichte stijging na 5 dagen in de expressie. In de EDL
wordt het hoogste niveau van zowel Atrogin-1 als MuRF-1 pas na 5 dagen bereikt.
42
Hieruit kan je dus de veronderstelling maken dat de trage spiervezels sneller de maximale
upregulatie van de atrogenen bereiken dan de snelle spiervezels. Het is wel zo dat het
onmogelijk is uit te sluiten dat in ons onderzoek de eigenlijk expressie pieken na 3 dagen
interventie zouden liggen. Er is in gelijkaardig onderzoek telkens op de 3e dag de hoogste
mRNA expressie gevonden van Atrogin-1 en MuRF-1 in zowel de trage als snelle spiervezels,
maar hier werden geen metingen gedaan na 5 dagen. (Okamoto et al, 2011).
6.5 Conclusie
Cryptorchisme kan verondersteld worden het atrofie proces niet te beïnvloeden tijdens de
disuse atrofie modellen tail en hindlimb suspension. Net als in tal van andere onderzoeken
(Fitts et al, 2001; Fluckey et al, 2002; Stevens et al, 2000; Talmadge et al, 1995;) blijkt disuse
atrofie ook in ons onderzoek een grotere impact te hebben op de trage spiervezels dan op de
snelle spiervezels. Trage spiervezels vertonen echter lagere mRNA expressies van de
atrogenen in de trage spiervezels welke een verschillende gevoeligheid suggereren in de
verschillende spiervezeltypes. Testosteron heeft geen enkele positieve invloed op de disuse
geïnduceerde atrofie, zowel op spiermassa als op mRNA niveau. Er is tevens geen bewijs
gevonden voor een downregulatie van de hypertrofie genen tijdens disuse atrofie.
43
7 Referentielijst
- Aboudrar S, Desplanches D, Graber-von Bergen F, Favier R, Okyayuz-Baklouti I,
Hoppler H. Effects of torbafylline on muscle atrophy: prevention and recovery. Can J
Physiol Pharmacol 1992;70:814-820.
- Abu EO, Horner A, Kusec V, Triffitt JT, Compston JE. The localization of androgen
receptors in human bone. J Clin Endocrinol Metab 1997;82:3493-3497.
- Aguirre, J. I., Plotkin, L. I., Stewart, S. A., Weinstein, R. S., Parfitt, A. M., Manolagas,
S., et al. Osteocyte apoptosis is induced by weightlessness in mice and precedes
osteoclast recruitment and bone loss. J Bone Miner Res 2006:21; 605−615.
- Akiko O, Qibin J, Yasuharu N, Takayuki A, Toshikazu M, Susumu M, Toru F.
Acupuncture ameliorated skeletal muscle atrophy induced by hindlimb suspension in
mice. Biomechanical and Biophysical Research Communications 2011;410:434-439.
- Altuwaijiri S, Lee DK, Chuang KH, Ting HJ, Yang Z, Xu Q, et al. Androgen receptor
regulates expression of skeletal muscle-specific proteins and muscle cell types.
2004;25:27-32.
- Always SE, Degens H, Krihnamurth G, Smith CA. Potential role for Id myogenic
repressors in apoptosis and attenuation of hypertrophy in muscles of aged rats. Am J
Physiol Cell Physiol 2002;283:C66-76.
- Always SE, Martyn JK, Ouyang J, Chaudrai A, Murlastis ZS. Id2 expression during
apoptosis and satellite cell activation in unloaded and loaded quail skeletal muscles.
Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003;284:R540-549.
- Amann RP, Deaver DR, Zirkin BR, Grills GS, Sapp WJ, Veeramachaneni DN,
Clemens JW, Banerjee SD, Folmer J, Gruppi CM, et al. Effects of microgravity or
simulated launch on testicular function in rats. J Appl Physiol 1992:73;174S–185S
- Amory JK, Chansky HA, Chansky HL, et al. Preoperative supraphysiological
testosterone in older men undergoing knee replacement surgery. J Am Geriatr Soc
2002;50:1698-1701.
- Aniansson A Grimby G, Rundgren A. Isometric and isokinetic quadriceps muscle
strength in 70-year-old men and women. Scand J Rehabil Med 1980;12(4):161-8.
- Aquirre JL, PLotkin LI, Steward SA, Weinstein RS, Parfitt AM, Manolagas SC, et al.
Osteocyte apoptosis is induced by weightlessness in mice and precedes osteoclast
recruitment and bone loss. J Bone Miner Res 2006;21:605-615.
44
- Astrand I, Astrand PO, Hallback I, et al. Reduction in maximal oxygen uptake with
age. J appl Phys 1973;35(5):649-54.
- Axell AM, MacLean HE, Plant DR, Harcourt LJ, Davis JA, Jimenez M, et al. Am J
Physiol Endocrinol Metab 2006;291:E506-E516.
- Bahsin S, Storer TW, Javanbakht M, et al. Testosterone replacement and resistance
exercise in HIV-infected men with weight loss and low testosterone levels. JAMA
2000;283:763-770.
- Bahsin S, Woodhouse L, Storer TW. Androgen effects on body composition. Growth
Horm IGF Res 2003;13(suppl A):S63-S71.
- Bahsin S, Woodhouse L, Storer TW. Androgen effects on body composition. Growth
Horm IGF Res 2003;13SupplA:S63-71.
- Bahsin S. Testosterone supplementation for aging-associated sarcopenie. J Gerontol A
Biol Sci Med Sci 2003;58:1002-1008.
- Bakhshi V, Elliot M, Gentili A, et al. Testosterone improves rehabilitation outcomes
in ill older men. J Am Geriatr Soc 2000;48:550-553.
- Balagopal P, Schimke J, Ades P, et al. Age effect on transcript levels and synthesis
rate of muscle MHC and response to resistance exercise. Am J Physiol Endocrinol
Metab 2001;280:E203-8.
- Baumgartner RN, Koehler KM, Gallagher D, et al. Epidemiology of sarcopenie among
the elderly in New Mexico. Am J Epidemol 1998;147:755-63.
- Baumgartner RN, Waters DL, Gallagher D, et al. Predictors of skeletal muscle mass in
eldery men and women. Mech ageing Dev 1999;107:123-36.
- Bhasin S, Storer T, Berman N, et al. The effects of suprafysiologic doses of
testosterone on muscle size and strength in normal men. The New England J of Med
1996;335(1):1-7.
- Bigard AX, Boehm E, Veksler V, Mateo P, Anflous K , Ventura-Clapier R. Muscle
unloading induces slow to fast transition in myofibrillar but not mitochondrial
properties. Relevance to skeletal muscle abnormalities in heart failure. J Physiol
1998;548:649-661.
- Bodine SC, Latres E, Baumhueter S, Lai VK, Nunez L, Clarke BA, Poueyimour WT,
Glass DJ. Identification of ubiquitin ligasen required for skeletal muscle atrophy.
Science 2001:295(5547);1704-1708.
- Borst SE. Interventions for sarcopenie and muscle weakness in older people. Age
Ageing 2004;33:548-55.
45
- Brill KT, Weltman AL, Gentili A, et al. Single and combined effects of growth
hormone and testosterone administration on measures of body composition, physical
performance, mood, sexual function, bone turnover, and muscle gene expression in
healthy older men. J Clin Endocrinol Metab 2002;87:5649-5657.
- Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P Hu LS, Anderson MJ, Arden KC,
Blenis J, Greenberg ME. Akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting
a Forkhead transcription factor. Cell 1999:96(6);857-868.
- Butterfield GE, Thompson J, Rennie MJ, et al. Effect of rhGH and rhIGF-1 treatment
on protein utilization in elderly women. Am J Endocrinol Metab 1997;35:E94-9.
- Cartault A, Edouard T, Pienkowki C, Tauber M. [Normal puberty]. Rev Prat
2008;58:1311-1316.
- Chang C, Saltzman A, Yeh S, Young W, Keller E, Lee HJ, Wang C, Mizokami A.
Androgen receptor: an overview. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1995;5:97-125.
- Chen Y, Zajac JD, MacLean HE. Androgen regulation of satellite cell function. J
Endocrinol 2005;186:21-31.
- David R Thomas. Sarcopenia. Clin Geriatr Med 26 (2010) 331-3346.
- Debigare R, Cote CH, Maltais F. Peripheral muscle wasting in chronic obstructive
pulmonary disease. Clinical relevance and mechanisms. Am J Respir Crit Care Med
2001;164:1712-1717.
- Degens H & Always SE. Control of muscle size during disuse, disease, and aging. Int
J Sports Med 2006;27:94-99.
- Degens H, Veerkamp JH. Changes in oxidative capacity and fatigue resistance in
skeletal muscle. Int J Biochem 1994;26:871-878.
- Deslypere JP, Young M, Wilson JD, McPhaul MJ. Testosterone and 5[alpha]-
dihydrotestosterone interact differently with the androgen receptor to enhance
transcription of the MMTV-CAT reporter gene. Mol Cell Endocrinol 1992;88:15-22.
- Drukker M, de Bie RA, Van Rossum E. The effects of exercise training in
institutionalized elderly people: a systematic review. Phys Ther Rev 2001;6(4):273-
85.
- Eriksson A, Kadi F, Malm C, Thornell LE. Skeletal muscle morphology in power-
lifters with and without anabolic steroids. Histochem Cell Biol 2005:124;167–175.
Essential amino acids are primarily responsible for the amino acid stimulation of
muscle protein anabolism in healthy elderly adults. Am J Clin Nutr 2003:78; 250−258.
46
- Evans NA. Current concepts in anabolic-androgenic steroids. Am J Sports Med
2004;32:534-542.
- Evans WJ, Morley JE, Argiles J, et al. Cachexia: a new definition. Clin Nutr
2008;27(6):793-9.
- Fearon KC, Hansell DT, Preston T, Plumb JA, Davies J, Sharipo D, et al. Influence of
whole body protein turnover rate in resting energy expenditure in patients with cancer.
Cancer Res 1988;48(4):2294-303.
- Ferrando AA, Sheffield-Moore M, Yeckel CW, et al. Testosterone administration to
older men improves muscle function: Molecular and physiological mechanisms. Am J
Physiol Endocrinol Metab 2002;282(3):E601-7.
- Fitts RH, Riley DR, Widrick JJ. Functional and structural adaptations of skeletal
muscle to microgravity. J Exp Biol 2001;204:3201-3208.
- Fleg JL, Lakatta EG. Loss of muscle mass is a major determinant of the age-related
decline in maximal aerobic capacity. Circulation 1985;72S:464.
- Florini JR, Ewton DZ, Coolican SA. Growth hormone and the insuline-like growth
factor system in myogenesis. Endocr Rev 1996;17:481-517.
- Fluckey JD, Dupont-Versteegden EE, Montague DC, Knox M, Tesch P, Peterson CA,
Gaddy-Kurten D. A rat resistance exercise regimen attenuates losses of
musculoskeletal mass during hindlimb suspension. Acta Physiol Scand 2002;176:293–
300.
- Gale CR, Martyn CN, Cooper C, et al. Grip strenght, body composition and mortality.
Int J Epidemol 2007;36:228-35.
- George FW & Wilsonn JD. Sex determination and differentiation. In The Physiology
of Reproduction eds. Knobel E & Neil JD. Raven Press Ltd, New York 1994.
- Giogi EP & Stein WD. The transport of steroids into animal cells in culture.
Endocrinology 1981;108:688-697.
- Glass DJ. Molecular mechanisms modulating muscle mass. Trends Mol Med
2003;9(8):344-350.
- Goldspink G, Scutt A, Martindale J, Jaenicke T, Turay L, Gerlach GF. Stretch and
force generation induce rapid hypertrophy and myosin isoform gene switching in adult
skeletal muscle. Biochem Soc Trans 1991;19:368–373.
- Guay AT. Testosterone and erectile physiology. Aging Male 2006;9:201-206.
- Hannema SE & Hughes IA. Regulation of wolffian duct development. Horm Res
2007;67:142-151.
47
- Harman SM, Blackman MR. The effects of growth hormone and sex steroid on lean
body mass, fat mass, muscle strength cardiovascular endurance and adverse in healthy
elderly women and men. Horm Res 2003;60(Suppl 1):121-124.
- Hartgens F, Kuipers H, Wijnen JA, Keizer HA. Body composition, cardiovascular risk
factors and liver function in long-term androgenic–anabolic steroids using
bodybuilders three months after drug withdrawal. Int J Sports Med 1996:17;429–433.
- Herbst KL & Bhasin S. Testosterone action on skeletal muscle. Curr Opin Clin Nutr
Metab Care 2004;7:271-277.
- Hnik P, Bass A, Vejsada R, Mackova EV, Goldspink DF, Teisinger J, Kasicki S. Is
maintained stretch another factor determining muscle status? In: Rose FC, Jones R,
Vrbova G (eds). Comprehensive Neurologic Rehabilitation. New York: Demos
1989:15–26.
- Hobbs CJ, Plymate SR, Rosen CJ, Adler RA. Testosterone administration increases
insulin-like growth factor-I levels in normal men. J Clin Endocrinol Metab
1993;77:776-779.
- Jakobsson, F., Borg, K., & Edström, L. Fiber-type composition, structure and
cytoskeletal protein location of fibers in anterior tibial muscle. Acta Neuropathol
1990:80; 459−468.
- Janssen I, Baumgartner RN, Ross R, et al. Skeletal muscle cutpoints associated with
elevated physical ability risk in older men and women. Am J Epidemol
2004;159(4):413-21.
- Jones SW, Hill RJ, Krasney PA, O’Conner B, Peirce N, Greenhaff PL. Disuse atrophy
and exercise rehabilitation in humans profoundly affects the expression genes
associated with the regulation of skeletal muscle mass. FASEB J 2004;18:155-165.
- Jones SW, Hill RJ, Krasney PA, O’Conner B, Peirce N, Greenhaff PL. Disuse atrophy
and exercise rehabilitation in humans profoundly affects the expression of genes
associated with the regulation of skeletal muscle mass. FASEB J 2004:18(9):1025-
1027.
- Juul A. The effects of oestrogens on linear bone growth. Hum Reprod update
2001;7:303-313.
- Kadi F, Eriksson A, Holmner S, Thornell L-E. Effects of anabolic steroids on the
muscle cells of strength-trained athletes. Med Sci Sports Exerc 1999:31;1528–1534.
- Kadi F. Adaptation of human skeletal muscle to training and anabolic steroids. Acta
Physiol Scand 2000:646;1–52.
48
- Kano Y, Shimegi S, Takahashi H, Masuda K, Katsuta S. Changes in capillary luminal
diameter in rat soleus muscle after hind- limb suspension. Acta Physiol Scand
2000;169:271–276.
- Kellokumpu-Lehtinen P. The histochemical localization of acid phosphates in human
fetal urethral and prostatic epithelium. Invest Urol 1980;17:435-440.
- Kerrigan JR & Rogol AD. The impact of gonadal steriod hormone action on growth
hormone secretion during childhood and adolescence. Endocr Rev 1992;13:281-298.
- Kobayashi, H., Robbins, N., & Rutishauser, U. Neural cell adhesion molecule in aged
mouse muscle. Neuroscience 1992:48; 237−248.
- Kohn FM. Testosterone and body functions. Aging male 2006;9:183-188.
- Krawiec BJ, Frost RA, Vary TC, Jefferson LS, Lang CH. Hindlimb casting decreases
muscle mass in part by proteasomedependent proteolysis but independent of protein
synthesis. Am J Physiol Endocrinol Metab 2005:289;E969–E980.
- Larsson L, Li X, Berg HE, Frontera WR. Effects of removal of weightbearing function
on contractility and myosin isoform composition in single human skeletal muscle
cells. Pflugers Arch 1996;432:320–328.
- Larsson L, Li X, Frontera WR. Effects of aging on shortening velocity and myosin
isoform composition in single human skeletal muscle cells. Am J Physiol
1997;272:C638 –649.
- Larsson, L., Sjödin, B., & Karlsson, J. Histochemical and biochemical changes in
human skeletal muscle with age in sedentary males, age 22–65 years. Acta Physiol
Scand 1978:103; 31−39.
- Lecker SH, Solomon V, Mitch WE, Golberg AL. Muscle protein breakdown and
critical role of the ubiquitine-proteasome pathway in normal and disease states. J Nutr
1999:129;227S-237S.
- Liu CJ, Latham NK. Progressive resistance strength training for improving physical
function in older adults. Cochrane Database Syst Rev 2009;4:CD002759.
- Lynch GS, Schertzer JD, Ryall JG. Therapeutic approaches for muscle wasting
disorders. Pharmacology and Therapeutics 2007;113:461-487.
- Lynch GS. Emerging drugs for sarcopenie: age-related muscle wasting. Expert Opin
Emerg Drugs 2004;9:345-361.
- Marin P, Oden B, Bjorntorp P. Assimilation and mobilization of triglycerides in
subcutaneous abdominal and femoral adipose tissue in vivo in men: effects of
androgens. J Clin Endocrinol Metab 1995;80:239-243.
49
- Matsumine H, Hirato K, Yanaihara T, Tamada T, Yoshida M. Aromatization by
skeletal muscle. J Clin Endocrinol Metab 1986;63:717-720.
- Mauras N, Hayes V, Welch S, Rini A, Helgeson K, Dokler M et al.. Testosterone
deficiency in young men: marked alterations in whole body protein kinetics, strength,
and adiposity. J Clin Endocrinol Metab 1998:83; 886–1892.
- Mauras N, Hayes V, Welch S, Rini A, Helgeson K, Dokler M, Veldhuis JD, Urban RJ.
Testoterone deficiency in young men: marked alterations in whole body protein
kinetics, strength, and adiposity. J Clin Endocrinol Metab 1998;83:1886-1892.
- McDonald KS, DelpMD, Fitts RH. Fatigability and blood flow in the rat
gastrocnemius-plantaris-soleus after hindlimb suspension. J Appl Physiol
1992;73:1135–1140.
- Metter EJ, Talbot LA, Schrager M, Conwit R. Skeletal muscle strength as a predictor
of all-cause mortality in healthy men. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2002;57A:359-
365.
- Mikhail N. Does testosterone have a role in erectile function? Am J Med
2006;119:373-382.
- Morley JE, Baumgartner RN, Roubenoff R, et al. Sarcopenia. J Lab Clin Med
2001,137(4):231-43.
- Newman ML, Sellers JG, Josephs RA. Testosterone, Cognition, and social status.
Horm Behav 2005;47:205-211.
- Ohira M, Hanada H, Kawano F, Ishihara A, Nonaka I, Ohira Y. Regulation of the
properties of rat hind limb muscles following gravitational unloading. Jpn J Physiol
2002;52:235–245.
- Olweus D, Mattson A, Schalling D, Low H. Testosterone, aggression, physical, and
personality dimensions in normal adolescent males. Psycosom Med 1980;42:253-269.
- Paddon-Jones D, Sheffield-Moore M, Creson DL, et al. Hypercortisolemia alters
muscle protein anabolism following ingestion of essential amino acids. Am J Physiol
Endocrinol Metab 2003;284:E946-53.
- Papadakis MA, Grady D, Black D, et al. Growth hormone replacement in healthy
older men improves body composition but not functional ability. Ann Intern Med
1996;124:708-16.
- Parise G, Yarasheski KE. The utility of resistance training and amino acid
supplementation for reversing associated decrements in muscle protein mass ad
function. Curr Opin Clin Nutr Metab 2000;3(6):489-95.
50
- Randall VA. Role of 5 alpha-reductase in healthy and disease. Baillieres Clin
Endocrinol Metab 1994;8:405-431.
- Rebuffescrive M, Marin P, Bjorntorp P. Effect of testosterone on abdominal adipose-
tissue in men. International Journal of Obesity 1991;15:791-795.
- Reid MB, Lannergren J, Westerblad H. Respiratory and limb muscle weakness
induced by tumor necrosis factor-alpha: involvement of musclemyofilaments. Am J
Respir Crit Care Med 2002;166:479–484.
- Rogol AD & Yeslasis CE. Clinical review 31: anabolic-androgenic steroids and
athletes: what are the issues? J Clin Endocrinol Metab 1992;74:465-469.
- Rolf C. Potential adverse effects of long-term testosterone therapy. Bailliére’s Clin
Endocrinol and Metab 1998;12(3):521-534.
- Roy TA, Blackman MR, Harman SM, et al. Interrelationships of serum testosterone
and free testosterone index with FFM and strength in aging men. Am J Physiol
Endocrinol Metab 2002;283:E284-E294.
- Royland JE, Weber LJ, and Fitzpatrick M. Testes size and testosterone levels in a
model for weightlessness. Life Sci 1994:54;545–554.
- Sacheck JM, Hyatt JP, Raffaello A, Jagoe RT, Roy RR, Edgerton VR, Lecker SH,
Goldberg AL. Rapid disuse and denervation atrophy involve transcriptional changes
similar to those of muscle wasting during systemic diseases. FASEB J 2007:21;140–
155.
- Saini A, Faulkner S, Al-Shanti N, Stewart C. Powerful signals for weak muscles.
Ageing research reviews 2009:8;251-267.
- Sanborn BM, Steinberger A, Tcholakian RK, Steinberger E. Direct measurement of
androgen receptors in cultured Sertoli cells. Steroids 1977;29:493-502.
- Sandri Marco. Signaling in muscle atrophy and hypertrophy. Physiology 2008;23:160-
170.
- Sar M, Lubahn DB, French FS, Wilson EM. Immunohistochemical localization of the
androgen receptor in rat and human tissues. Endocrinology 1990;127:3180-3186.
- Schols AM, Buurman WA, Staal van den Brekel AJ, et al. Evidence for a relation
between metabolic derangements and increased levels of inflammatory mediators in a
subgroup of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Thorax
1996;51:819-24.
51
- Schroeder ET, Singh A Bahsin S, et al. Effects of an oral androgen on muscle and
metabolism in older, community-dwelling men. Am J Physiol Endocrinol Metab
2003,284:E120-E128.
- Seidell JC, Bjorntorp P, Sjostrom L, Kvist H, Sannerstedt R. Visceral fat accumulation
in men is positively associated with insulin, glucose and C-peptide levels, but
negatively with testosterone levels. Metabolism 1990;32:897-901.
- Signh MA. Exercise comes of age: rationale and recommendations for a geriatric
exercise prescription. J Gerontol 2002;57:M262-M282.
- Singh J, O’Neil C, Handelsman DJ. Induction of spermatogenesis by androgens in
gonadotropin-deficient (hpg) mice. Endocrinology 1995;136:5311-5321.
- Singh MA, Ding W, Manfredi TJ, et al. Insulin-like growth factor I in skeletal muscle
after weight-lifting exercise in frail elder. Am J Physiol 1999;277:E135-44.
- Siu PM, Alway SE. Id2 and p53 participate in apoptosis during unloading-induced
muscle atrophy. Am J Physiol Cell Physiol 2005; in press.
- Skipworth RJE, Stewart GD, Ross JA, Guttridge DC, Fearon KCH. The molecular
mechanisms of skeletal muscle wasting: Implications for therapy. Surgeon
2006;4(5):273-283.
- Snyder PJ, Peachey H, Hannoush P, et al. Effect of testosterone treatment on body
composition and muscle strength in men over 65 years of age. J Clin Endocrinol
Metab 1999;84:2647-53.
- Sobel V, Zhu YS, Imperato-McGinley J. Fetal hormones and sexual differentiation.
Obstet Gynecol Clin North Am 2004;31:837-856,x-xi.
- Stevens L, Firinga C, Gohlsch B, Bastide B, Mounier Y, Pette D. Effects of
unweighting and clenbuterol onmyosin light and heavy chains in fast and slowmuscles
of rat. Am J Physiol Cell Physiol 2000;279:C1558–1563.
- Stevenson EJ, Giresi PG, Koncarevic A, Kandarian SC. Global analysis of gene
expression patterns during disuse atrophy in rat skeletal muscle. J Physiol
2003;551:33-48.
- Stocco DM & Clark BJ. Regulation of the acute production of steroids in
steriodogenic cells. Endocr Rev 1996;17:221-244.
- Storer TW, Magliano L, Woodhouse L, et al. Testosterone dose-dependently increases
maximal voluntary strength and leg power, but does not affect fatigability or specific
tension. J Clin Endocrinol Metab 2003;88:1478-1485.
52
- Sullivan ML, Martinez CM, Gennis P, Gallagher EJ. The cardiac toxicity of anabolic
steroids. Prog Cardiovasc Dis 1998;41:1-15.
- Szulc P, Claustrat B, Marchand F, Delmas PD. Increased risk of falls and increased
bone resorption in elderly men with partial androgen deficiency: the MINOS study. J
Clin Endocrinol Metab 2003;88:5240-5247.
- Taillandier D, Aurousseau E, Meynial-Denis D, Bechet D, Ferrara M, Cottin P, et al.
Coorination of lysosomal, Ca2+
-activated and ATP-Ubiquitin-dependent proteinases in
the unweighted rat soleus muscle. Biochem J 1996;15: 65-72.
- Talmadge RJ, Roy RR, Bodine-Fowler SC, Pierotti DJ, Edgerton VR. Adaptations in
myosin heavy chain profile in chronically unloaded muscles. Basic Appl Myol
1995;5:117–137.
- Tesch PA, Trieschmann JT, Ekberg A. Hypertrophy of chronically unloaded muscle
subjected to resistance exercise. J Appl Physiol 2004;96:1451–1458.
- Thomas DR. Anorexia: etiology, epidemiology, and management in the older people.
Drugs Aging 2009;26:557-70.
- Thomas DR. Loss of skeletal muscle mass in aging: examining the relationship of
starvation. Sarcopenie and cachexia. Clin Nutr 2007;26(4):389-99.
- Tomonaga, M. Histochemical and ultrastructural changes in senile human skeletal
muscle. J Am Geriatr Soc 1977:25; 125−131.
- Tyml K, Mathieu-Costello O. Structural and functional changes in the
microvasculature of disused skeletal muscle. Front Biosci 2001;6:D45–52.
- Urban RJ, Bodenburg YH, Gilkison C, Foxworth J, Coggan AR, Wolfe RR, Ferrande
A. Testosterone administration to elderly men increases skeletal muscle strength and
protein synthesis. Am J Physiol 1995;169:E820-826.
- Van Amsterdam J, Opperhuizen A, Hartgens F. Adverse health effects of anabolic-
androgenic steroids. Regulatory toxicology and pharmacology 20120;57:117-123.
- van den Beld AW, de Jong FH, Grobbee DE, et al. Measures of bioavailable serum
testosterone and estradiol and their relationships with muscle strength, bone density,
and body composition in elderly men. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85:3276–3282.
- Vanderschueren D, Vandeput L, Boonen S, Lindberg MK, Bouillon R, Ohlsson C.
Androgens and bone. Endocr Rev 2004;25:389-425.
- Visser M, Pahor M, Taaffe DR, et al. Relationship of interleukine-6 and tumor
necrosis factor-alpha with muscle mass and muscle strength in elderly man and
women: the Health ABC Study. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2002;57(5):M326-32.
53
- Volpi E, Mittendorfer B, Wolf SE, et al. Oral amino acids stimulate muscle protein
anabolism in the elderly despite higher first-pass splanchnic extraction. Am J Physiol
Endocrinol Metab 1999;277:E513-20.
- Volpi, E., Kobayashi, H., Sheffield-Moore, M., Mittendorfer, B., &Wolfe, R. R.
- Welle S, Thornton CA. High-protein meals do not enhance myofibrillar synthesis after
resistance exercise in 62- to 75-yr old men and women. Am J Physiol Endocrinol
Metab 1998;274:E677-83.
- Wilbert DM, Griffin JE, Wilson JD. Characterization of the cytosol androgen receptor
of the human prostate. J Clin Endocrinol Metab 1983;56:113-120.
- Wilson JD. Androgen abuse by athletes. Endocr Rev 1988;9:181-199.
- Wittert GA, Chapman IM, Haren MT, et al. Oral testosterone supplementation
increases muscle and decreases fat mass in healthy elderly males with low-normal
gonadal status. J Gerontol A Biol Sci Mes Sci 2003;58:618-625.
- Woodhouse LJ, Gupta N, Bahsin M, et al. Dose-dependent effects of testosterone on
regional adipose tissue distribution in healthy young men. J Clin Endocrinol Metab
2004;89:718-726.
- Wright EJ, Young GP, and Goldstein M. Reduction in testicular temperature after
varicocelectomy in infertile men. Urology 1997:50;257–259.
- Yang H, Alnaqeeb M, Simpson H, Goldspink G. Changes inmuscle fibre type,
musclemass and IGF-I gene expression in rabbit skeletal muscle subjected to stretch. J
Anat 1997;190:613–622.
- Zhao J, Zhang Y, Zhao W, Wu Y, Pan J, Bauman WA, Cardozo C. Effects of
nandrolone on denervation atrophy depend upon time after nerve transection. Muscle
Nerve 2008:37;42–49.
- Zinna EM, Yarasheski KE. Exercise treatment to counteract protein wasting of chronic
diseases. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2003;6(1):87-93.
Top Related