Verschil in veiligheid en opbouw van antistoffen tussen...

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014-2015

Verschil in veiligheid en opbouw van antistoffen tussen het gelijktijdig en

enkelvoudig toedienen van vaccins bij gelten

door

Lode VRIELINCK

Promotoren: Prof. dr. D. Maes Onderzoek uitgevoerd in het kader

Prof. dr. E. Cox van de Masterproef

Drs. A. Michiels

© 2015 Vrielinck Lode

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2014-2015

Verschil in veiligheid en opbouw van antistoffen tussen het gelijktijdig en

enkelvoudig toedienen van vaccins bij gelten

door

Lode VRIELINCK

Promotoren: Prof. dr. D. Maes Onderzoek uitgevoerd in het kader

Prof. dr. E. Cox van de Masterproef

Drs. A. Michiels

© 2015 Vrielinck Lode

VOORWOORD

Graag wil ik starten met een oprecht woord van dank aan enkele personen die geholpen hebben voor

het tot stand brengen van dit onderzoek. Eerst en vooral hartelijk dank aan mijn promotor drs.

Annelies Michiels voor alle hulp tijdens de proef, het verwerken van de resultaten en het nalezen van

het eindwerk. Daarnaast ook dank aan Prof. dr. Dominiek Maes en Prof. dr. Eric Cox voor het

organiseren van de proefopzet en het kritisch nalezen van dit werk. Verder nog een woord van dank

aan Tom Meyns (firma MERIAL), fokbedrijf Maenhout voor het meewerken aan deze proef, en alle

personen die meegeholpen hebben bij het uitvoeren van het praktische werk. Voor steun en advies

kon ik ook altijd terecht mij mijn ouders, vriendin en vrienden.

SAMENVATTING ................................................................................................................................................ p.1

1. INLEIDING. ..................................................................................................................................................... p.2

2. LITERATUURSTUDIE...................................................................................................................................... p.3

2.1 Porcine Circovirus ................................................................................................................................ p.3

2.1.1 Inleiding .................................................................................................................................. p.3

2.1.2 Epidemiologie ........................................................................................................................ p.4

2.1.3 Pathogenese .......................................................................................................................... p.4

2.1.4 Symptomen en letsels ........................................................................................................... p.6

2.1.5 Behandeling en preventie ..................................................................................................... p.9

2.1.6 Vaccineren tegen PCV2 ....................................................................................................... p.10

2.2 Enterotoxigene Escherichia coli ...................................................................................................... p.15

2.2.1 Inleiding ................................................................................................................................ p.15

2.2.2 Epidemiologie ...................................................................................................................... p.16

2.2.3 Pathogenese ........................................................................................................................ p.16

2.2.4 Symptomen en letsels ......................................................................................................... p.18

2.2.5 Behandeling en preventie ................................................................................................... p.18

2.2.6 Vaccineren tegen PCV2 ....................................................................................................... p.20

2.3 Combineren van vaccins .................................................................................................................. p.23

2.4 Werking adjuvans .............................................................................................................................. p.26

2.4.1 Algemene werking ............................................................................................................... p.26

2.4.2 Circovac® .............................................................................................................................. p.30

2.4.3 Neocolipor® .......................................................................................................................... p.31

3 MATERIAAL EN METHODEN ................................................................................................................... p.33

3.1 Doen van de studie ............................................................................................................................ p.33

3.2 Bedrijf van herkomst ......................................................................................................................... p.33

3.3 Proefopzet .......................................................................................................................................... p.33

3.4 De aangewende vaccins .................................................................................................................. p.35

3.4.1 Neocolipor® .......................................................................................................................... p.35

3.4.2 Circovac® .............................................................................................................................. p.35

3.5 Onderzochte parameters .................................................................................................................. p.36

3.5.1 Anti-F4 antistoffentiterbepaling (ELISA) ............................................................................ p.36

3.5.2 Titerbepaling PCV2 (IPMA) ................................................................................................. p.37

3.5.3 Rectale temperatuur ............................................................................................................ p.38

3.5.4 Eetlust ................................................................................................................................... p.38

3.5.5 Lokale huidreacties ............................................................................................................. p.38

3.6 Statistische analyses ......................................................................................................................... p.39

4 RESULTATEN ............................................................................................................................................ p.39

4.1 Antistoffentiter en temperatuur (continue data) .............................................................................. p.39

4.2 Buikvulling en huidscore (binaire data) ............................................................................................ p.43

5 BESPREKING ............................................................................................................................................. p.46

6 REFERENTIES ........................................................................................................................................... p.50

7 BIJLAGEN .................................................................................................................................................. p.58

1

SAMENVATTING

In de praktijk gebeurt het vaak dat verschillende vaccins gelijktijdig worden toegediend. Het is dus van

belang te weten of het al dan niet gelijktijdig toedienen van vaccins invloed heeft op de veiligheid en

de opbouw van antistoffen. Hiervoor werden op een varkensbedrijf 70 gezonde gelten van 17 weken

oud geselecteerd. De gelten werden ad random verdeeld over vier groepen (drie groepen van 20 en

één controlegroep van tien gelten). Ze werden tweemaal gevaccineerd met drie weken tussen: groep

1 kreeg links een injectie met Neocolipor®, groep 2 kreeg links Neocolipor en tegelijk rechts Circovac

®,

groep 3 kreeg enkel rechts Circovac en groep 4 kreeg geen vaccins toegediend (controlegroep). Van

de 70 gelten werd drie keer bloed genomen om de serologische respons op te volgen. Voor PCV2

werden IPMA antistoffen bepaald, voor Escherichia. coli (E. coli) waren dit anti-F4 antistoffen.

Volgende parameters werden op een geblindeerde manier opgevolgd: rectale temperatuur, eetlust

(buikvulling) en huidreactie.

De antistoffentiter (log-waarde) tegen F4 fimbriae van E. coli drie weken na eerste vaccinatie was van

groep één (enkel Neocolipor) 2,24 en van groep twee (Neocolipor + Circovac) 2,79. Drie weken na

tweede vaccinatie was deze waarde voor groep één 2,89 en voor groep twee 3,45. Na simultane

vaccinatie was er een significant hogere antistoffentiter (P<0.05) waar te nemen tegen F4 van E. coli

drie weken na eerste én na de tweede vaccinatie in vergelijking met enkelvoudige toediening van het

vaccin. De antistoffentiter (log-waarde) tegen PCV2 was drie weken na eerste vaccinatie 4,83 voor

groep drie (enkel Circovac) en 4,52 voor groep twee (beide vaccinaties). Drie weken na tweede

vaccinatie was deze waarde voor groep drie 5,40 en voor groep twee 5,36. Er was geen significant

verschil voor zowel eerste als tweede vaccinatie (P<0.05). De temperaturen van groep 1 (Neocolipor)

één dag na eerste vaccinatie, vlak voor tweede vaccinatie en 24h na tweede vaccinatie waren

respectievelijk 39,5°C, 39,3°C, 39,3°C en deze van groep 3 (enkel Circovac) 39,5°C, 39,4°C en

40,0°C. Voor groep 2 die beide vaccinaties simultaan kreeg waren deze temperaturen respectievelijk

39,6°C, 39,3°C en 40,2°C. Er was enkel een significante verhoging in temperatuur 24 uur na tweede

vaccinatie bij groep 2 en 3 in vergelijking met groep 1 (P<0.05). Er werden geen significante

verschillen (P<0.05) gezien in buikvulling na vaccinatie tussen de verschillende groepen. Na

statistische analyse werden ook geen verschillen in huidreactie gezien tussen simultane en

enkelvoudige toediening (P<0.05).

Na gelijktijdige toediening van beide vaccinaties was er dus geen nadeel in opbouw van antistoffen in

vergelijking met een enkelvoudige toediening van dezelfde vaccins en werd er geen verschil in eetlust

en huidreactie gezien.

SLEUTELWOORDEN: SIMULTANE VACCINATIE - E. COLI - PCV2 - ADJUVANS

2

1. INLEIDING

In de varkenshouderij worden zeugen en gelten intensief gevaccineerd om ziekte en productieverlies

zoveel mogelijk te voorkomen. Het gebeurt hierbij regelmatig dat meerdere vaccins tegelijk worden

toegediend om de arbeid te verlichten en om de dieren stress te besparen. Het is dan ook de vraag of

dit een invloed kan hebben op de werkzaamheid ervan. Op de bijsluiter van een vaccin wordt vaak

vermeld dat er geen informatie beschikbaar is over het gelijktijdig gebruik van het vaccin met andere

vaccins of enig ander diergeneesmiddel (o.a. bij Neocolipor en Circovac). Er zijn natuurlijk talrijke

voordelen van simultane vaccinatie. Pijn en stress kunnen gereduceerd worden door de tijd van

vaccineren te beperken, dit komt het dierenwelzijn ten goede. De arbeid voor de varkenshouder wordt

ook verminderd. Men kan zich echter de vraag stellen of er een limiet bestaat in het aantal vaccins dat

tegelijk gegeven kan worden. Simultane vaccinatie zou eventueel immunosuppressie, reacties of

overstimulatie van het immuunstelsel kunnen veroorzaken (Falvo en Horowitz., 1994; Offit et al.,

2002). Anderzijds kan het ook zijn dat werking van het ene vaccin versterkt wordt door het andere

vaccin, hierbij kunnen bijhorende adjuvantia een rol spelen (De Clerck et al., 1989; Altaf et al., 2012).

Correct vaccineren is belangrijk om het gebruik van antibiotica te reduceren, het is dan ook van

cruciaal belang een correct vaccinatieschema te volgen en te weten of er al dan niet interferentie kan

zijn wanneer meerdere vaccins op één tijdstip toegediend worden. In deze studie wordt de combinatie

bestudeerd van twee courant gebruikte vaccins. Circovac wordt gebruikt ter controle van Porcine

Circovirus type 2 (PCV2) infecties. Dit virus kan mee de oorzaak zijn van wegkwijnziekte, vaak te zien

in de batterij of bij het begin van de afmestperiode, maar het kan ook subklinisch aanwezig zijn op een

bedrijf. Neocolipor kan helpen bij de controle van neonatale diarree veroorzaakt door E. coli infecties.

Deze laatste kiem kan voor grote economische verliezen zorgen in de kraamstal.

In deze proef werd onderzocht of het gelijktijdig toedienen van deze vaccins een invloed had op de

veiligheid en de antistoffenopbouw in vergelijking met het enkelvoudig toedienen. Verder werd ook

rekening gehouden met ongewenste neveneffecten, hiervoor werden de parameters temperatuur,

huidreactie en buikvulling opgevolgd.

3

2. LITERATUURSTUDIE

2.1. Porcine Circovirus

2.1.1. Inleiding

Het Porcine circovirus type 2 (PCV2) is tegenwoordig één van de belangrijkste pathogenen in de

varkenshouderij die wereldwijd voor grote economische schade zorgt, het komt dan ook voor op alle

continenten. Het porcine circo virus (PCV) werd voor het eerst beschreven in 1974 als een

contaminant van de PK-15 niercelcultuur (Porcine Kidney-15 cellijn, deze cellijn wordt ook gebruikt

voor de immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) test, zie verder). Zeventien jaar later werd in

Canada een nieuw syndroom beschreven veroorzaakt door een variant (PCV2, zie Figuur 1) van het

eerder gekend PCV, het zogenaamde postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Het

virus wordt ook geassocieerd met het porcine dermatitis en nefropathie syndroom (PDNS) en porcine

respiratoire disease complex (PRDC). Soms spreekt men algemeen ook over porcine circovirus

diseases (PCVD) (Allan en Ellis, 2000; Segales et al., 2013).

PCV2 behoort tot het genus Circovirus van de familie Circoviridae. Het virale genoom dat omgeven is

door een icosahedrale capsid met een diameter van 17±1,3 nm bestaat uit een circulaire,

enkelvoudige DNA-streng (ssDNA). De replicatieve vorm is een intermediaire dubbelstrengig DNA. Er

is geen envelop aanwezig waardoor het PCV2 virus zeer resistent is aan vetoplosbare desinfectantia.

Het virus is ook chemisch en thermisch resistent, hoewel hoge temperaturen de infectiviteit kunnen

doen afnemen (Finsterbusch en Mankertz, 2009; Grau-Roma et al., 2011). De PCV2 genen zijn

geordend in 11 zogenaamde open reading frames (ORF). Drie ervan zorgen voor proteïne-expressie.

Een experimentele infectie met een ORF3-deficiënt PCV2 zou minder pathogeen zijn dan een infectie

met het wilde type (Karuppannan et al., 2009). Er zijn ook meerdere genotypes: genotype PCV2b zou

meer virulent zijn dan PCV2a. PCV2c wordt vooral in Denemarken gezien (Grau-Roma et al. 2011).

Fig.1 Elektronenmicroscopische opname van PCV2

na negatieve kleuring van PK15 celcultuur lysaat

geïnoculeerd met materiaal van een big met PMWS

(uit Allan en Ellis, 2013).

4

2.1.2. Epidemiologie

Het Porcine circovirus is momenteel zodanig verspreid dat bijna alle bedrijven seropositief zijn. In

Nederland werd vastgesteld dat in 2014 85% van de bedrijven vaccineert tegen PCV2, het aantal

bedrijven neemt nog ieder jaar toe (http://www.veearts.nl/2014/meer-vaccinaties-tegen-circo-en-

mycoplasma/). Op geïnfecteerde bedrijven kan bij de biggen een hoge titer antistoffen gevonden

worden. Deze antistoffen zijn afkomstig uit het colostrum. Hoe hoger deze titer, hoe lager de kans op

viremie. Sommige biggen blijven levenslang geïnfecteerd. PCV2 infectie gebeurt vooral bij biggen van

acht tot 16 weken oud, in theorie kan een varken op elke leeftijd geïnfecteerd worden (Grau-Roma et

al., 2009; Grau-Roma et al. 2011). Het aantal biggen met typische klinische symptomen van PMWS in

een toom is meestal laag en tussen de leeftijd van vijf tot twaalf weken oud (Allan en Ellis, 2000).

Er bestaat een horizontale en verticale transmissie en het virus blijft zeer stabiel in de omgeving. Het

virus kan transplacentair en via het sperma overgedragen worden, dit is de verticale route. Wanneer

er direct contact is tussen de biggen kan er eveneens een oronasale overdracht gebeuren, dit wordt

gezien als de belangrijkste oorzaak van infectie. Infectie kan dan gebeuren door mengen van

positieve dieren met naïeve dieren. PCV2 is verder ook aanwezig in andere lichaamssecreties (urine,

feces, ooguitvloei etc.). (Park et al., 2009; Larochelle et al., 2000; Grau-Roma et al. 2011). Een minder

waarschijnlijke vorm van overdracht is via muizen. Het virus kan overgedragen worden tussen muizen

onderling en kan vermeerderen in beperkte mate. De transmissie via lucht is niet duidelijk en het is

niet geweten of dit een belangrijke wijze van verspreiding kan zijn (Patterson en Opriessnig, 2010;

Zimmerman et al., 2012).

2.1.3. Pathogenese

De pathogenese van PMWS is niet helemaal gekend en een vast herhaalbaar ziektemodel is nog

steeds niet gevonden. Wel weet men dat er een combinatie nodig is van PCV2 met al dan niet

infectieuze cofactoren. Immunostimulatie bevordert dan ook de replicatie van het virus. Door de

directe en/of indirecte invloed van PCV2 ontstaat bij PMWS lymfoïde depletie en lymfopenie (Sarli et

al., 2001; Allan et al., 2004). Veel biggen op onze commerciële bedrijven komen ooit in contact met

PCV2 maar enkel een klein deel ervan krijgt PMWS. Vroeger dacht men o.a. aan een co-infectie met

het porcine parvovirus, momenteel denkt men dat ook kiemen zoals het porcine reproductive and

respiratory syndrome virus (PRRSv) en Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) een rol

kunnen spelen. Zelfs factoren zoals vaccins, adjuvantia, lipopolysachariden (LPS) kunnen mee helpen

PMWS te veroorzaken en sommige spreken zelfs over het bestaan van verschillende sub-genotypes

van PCV2. De meesten zijn er dan ook van overtuigd dat één of andere stimulatie van de

immuunrespons een belangrijke oorzaak is (Darwich en Mateu, 2012).

Voor de replicatie heeft het virus cellen in de S-fase en met een hoge mitotische activiteit nodig. T

cellen (CD4+ en CD8+) en B lymfocyten komen hiervoor in aanmerking. In tegenstelling tot wat men

vroeger dacht kunnen ook macrofagen (naast epitheliale en endotheliale cellen) de replicatie

5

ondersteunen. De hoogste hoeveelheid virus wordt gevonden in het cytoplasma van de monocyten en

macrofagen. In vitro werd aangetoond dat het virus deze cellen kan infecteren en erin persisteren

(zonder actieve replicatie). Ze staan ook in voor het verspreiden van het virus in het lichaam.

Ongeveer één week na de infectie wordt de PCV2 viremie voor het eerst gezien en de virale titer piekt

op 14 tot 21 dagen na infectie. Ondertussen verspreidt het virus zich en is het vooral in de

lymfeknopen terug te vinden. Seroconversie na infectie in het veld gebeurt meestal op zeven tot twaalf

weken leeftijd en antistoffen blijven op zijn minst tot 28 weken leeftijd aanwezig. Het virus kan

uiteindelijk teruggevonden worden in epitheelcellen (zowel van nier als luchtwegen), endotheelcellen,

enterocyten, hepatocyten, gladde spiercellen, lymfocyten etc. (Vincent et al., 2003; Sànchez et al.,

2004).

Apoptose van B-cellen ontstaat na infectie van delende cellen, macrofagen en B lymfocyten. Er

ontstaat histiocyteninfiltratie en lymfocytendepletie van zowel de folliculaire centra als van de

parafolliculaire zones. Algemeen gezien ontstaat dan ook immunosuppressie en verhoogde

gevoeligheid voor andere infecties (Darwich et al., 2004; Kixmöller et al., 2008).

De complexiteit van de pathogenese wordt tenslotte ook aangetoond door verschillende in vitro

studies. Men zag een verandering in productie van cytokines/chemokines van alveolaire macrofagen

in cultuur wanneer PCV2 wordt toegevoegd (Chang et al., 2006). PCV2 kon ook dentritische cellen

verzwakken (Vincent et al., 2007). Een samenvatting van de pathogenese is te vinden in Figuur 2.

6

2.1.4. Symptomen en letsels

De term PMWS wordt gebruikt om het syndroom te beschrijven dat progressief conditieverlies en

letsels in verschillende organen veroorzaakt. Het syndroom wordt in de volksmond ook wel eens

‘wegkwijnen’ genoemd. PCV2 kan een hele reeks klinische manifestaties veroorzaken, echter deze

komen niet steeds allemaal tegelijk en duidelijk voor.

Fig.2 Pathogenese van PMWS veroorzaakt door PCV2 (uit Darwich et al., 2004).

7

PMWS komt zowel endemisch als epidemisch voor. Een verhoogde gevoeligheid voor PMWS hangt

van vele factoren af zoals aanwezigheid van bepaalde genen of co-infecties (zie eerder). Het is

bekend dat het ras Piétrain zorgt voor een reductie van PCV2 en vooral van de pathologische letsels

(Opriessnig et al., 2009). Niet specifieke immunostimulatie zoals vaccinatie (tegen PRRSv of tegen

Escherichia coli (E. coli) speelt ook een rol, zeker met een op olie-gebaseerde adjuvans. Men spreekt

verder nog over Agent X om de onbekende oorzaak aan te duiden, aangezien men via proeven met

enkel en alleen PCV2 inoculatie niet de PMWS-symptomen kon reproduceren. Wel staat vast dat

PCV2 het essentiële infectieuze agens is voor het veroorzaken van PMWS. Het succes na vaccineren

bevestigt dit onrechtstreeks. PCV2 kan dan ook deel uitmaken van het porcine respiratoire disease

complex (PRDC zie verder) (Chae, 2005; Tomas et al., 2008; Grau-Roma et al., 2011).

Bij biggen met PMWS kunnen volgende symptomen gezien worden: bleke huid en icterus,

vermageren en wegkwijnen, dyspnee, diarree (Figuur 3). Bij een acute uitbraak kan de mortaliteit

stijgen tot 10%, bij subklinisch geïnfecteerde dieren is dit lager. Morbiditeit kan van 4% tot 30%

oplopen. PMWS letsels worden vaak eerst in de lymfoïde weefsels gezien. Men ziet eerst vergrote

lymfeknopen (vooral de lies, submandibulaire, mesenteriale en mediastinale lymfeknopen)

(Zimmerman et al., 2012). Dit typische kenmerk is echter niet steeds aanwezig, soms treedt er zelfs

atrofie op bij erge letsels en in een verder stadium van PMWS (Ségales et al.,2004). Necrotiserende

letsels in de lymfeknopen kunnen dan ook gevonden worden. Histopathologisch ziet men letsels in de

lymfoïde weefsels. Er is een lymfocytendepletie. Dit gaat vaak gepaard met multifocale tot diffuse

histiocyten en reuzencel infiltratie. Ook ziet men cyotplasmatische inclusies van PCV2. De longen zijn

vergroot, ze collaberen niet en er is een verhoogde stevigheid (rubberachtig). In het subacute stadium

vindt men een interstitiële pneumonie (Zimmerman et al., 2012). Chronische gevallen kunnen leiden

tot bronchiolitis fibrosa obliterans (Allan en Ellis, 2000). Er is een lymfocytendepletie en histiocyten

infiltratie in het broncho-alveolaire lymfoïde weefsel (BALT). Verder kan ook een vergrote lever

aanwezig zijn (met icterus symptomen), nieren met witte vlekjes, maagulcera, anemie en/of vetatrofie

(Allan en Ellis, 2000). Bij symptomen van PMWS kan ook gedacht worden aan PRRSv, Glässer’s

disease, salmonellose, porcine intestinale adenomatose (PIA),.. Niet-infectieuze oorzaken en fouten

met het algemeen management mogen niet uit het oog verloren worden.

(http://www.merckmanuals.com/vet/generalized_conditions/porcine_circovirus_diseases/overview_of_

porcine_circovirus_diseases.html).

8

Porcine dermatitis en nefropathie syndroom (PDNS) wordt ook geassocieerd met PCV2 infectie.

Meestal is de prevalentie niet meer dan 1%, er is dan eerder sterfte bij biggen ouder dan twaalf

weken. Dit ziektebeeld zou door afzetting van immuuncomplexen in de nieren veroorzaakt worden.

Deze immuuncomplexen ontstaan door massale antistof-antigeen binding en kunnen een

inflammatoire reactie opwekken wanneer ze binden aan glomerulaire capillairen en andere bloedvaten

(Wellenberg et al., 2004). Typische symptomen die gezien worden bij dit syndroom zijn anorexie,

depressie, koorts en necrotiserende vasculitis die de dermale en subcutane huid aantast met

onderhuidse bloedingen tot gevolg. Rode tot paarse maculae of papulae op de achterbenen en/of

perianale regio kunnen aanwezig zijn (Figuur 4). Bij autopsie zien we vergrote nieren met

puntbloedingen, fibrinonecrotiserende glomerulitis met non-purulente interstitiële nefritis (Figuur 5).

Andere pathogenen die PDNS of gelijkaardige letsels kunnen veroorzaken zijn Pasteurella multocida

(P. multocida ), combinaties van PCV2 met PRRSv, vlekziekte, Actinobacillus suis (A. suis),

exsudatieve epidermatitis, Afrikaans of klassieke varkenspest. De nierletsels kunnen ook wijzen op

salmonellose (Chae, 2005).

Fig.3 Varken (links) met PMWS naast klinisch gezond

varken (rechts) (uit

http://www.merial.nl/Dierhouders/Varkens/Pages/circovirus.

aspx).

Fig.4 en 5 Varken (links) met PDNS vaak gelokaliseerd t.h.v. de (achter)poten en oren. Nier (rechts) met puntbloedingen

en witte spots (uit http://www.gezondevarkens.be/content/porcien-circovirus-type-2-geassocieerde-aandoeningen-pcvd).

9

Het Porcine respiratoire disease complex (PRDC) kenmerkt zich door trage groei, hogere

voederconversie, vermageren, koorts, hoesten en dyspnee. Co-infecties kunnen gemakkelijk

pneumonie veroorzaken zoals PRRSv, influenza-virus, P. multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae

(A. pleuropneumoniae) en M. hyopneumoniae. PCV2 kan een rol spelen in het PRDC en wordt af en

toe geïsoleerd. Microscopisch kan een broncho-interstitiële pneumonie met peribronchale en

peribronchiolaire fibrose ontstaan. Het is moeilijk aan te tonen dat PCV2 de primaire oorzaak is van

het PRDC, het virus moet aanwezig zijn in de letsels en er mogen geen letsels zijn in de lymfoïde

weefsels (i.t.t. bij PMWS). (Ségales et al., 2004; Chae, 2005).

Er zijn verschillende aanwijzingen dat PCV2 ook voor reproductiestoornissen kan zorgen. Johnson et

al. (2002) hebben dit via een proef met PCV2 inoculatie bewezen: 37 foetussen werden intramusculair

(IM) geïnjecteerd door de baarmoederwand via laparotomie van de zeugen en er werden

abnormaliteiten (mummificatie, doodgeboorte) vastgesteld. Park et al. (2005) hebben 6 drachtige

zeugen 3 weken voor werpen geïnfecteerd: 3 aborteerden en 3 wierpen te vroeg (park et al., 2005).

Anders dan PRRSv die de placenta doorkruist tijdens de late dracht kan PCV2 tijdens de hele dracht

aanslaan (Chae, 2005). Afhankelijk van het tijdstip van infectie ziet men klinisch abortus, mummificatie

en doodgeboorte.

Verder wordt PCV2 ook nog geassocieerd met granulomateuze enteritis (inflammatie en

lymfocytendepletie in de Peyerse platen), exsudatieve epidermitis, necrotiserende lymfadenitis en

congenitale tremor. Bij deze laatste is er echter nog controversie over het feit of PCV2 het oorzakelijk

agens is (Chae, 2005).

2.1.5 Diagnose, behandeling en preventie

Voor het beschikbaar komen van commerciële vaccins, werden problemen met PCV2 vooral onder

handen genomen via aanpassing van het management. Echter door het opkomen van verschillende

vaccins kon het virus beter onder controle gehouden worden. Dit wil niet zeggen dan men verder geen

aandacht aan het management moet geven: co-infecties moeten allereerst vermeden worden,

eventueel door gebruik van vaccins tegen andere agentia. Liefst is er een minimaal contact tussen

verschillende groepen varkens en moeten zieke varkens verwijderd worden. Verder moet men

aandacht schenken aan ontworming, ventilatie en desinfectie. Er dient hierbij rekening gehouden te

worden met het feit dat PCV2 ook via het sperma kan overgedragen worden. Vaak gaat het aantal

geïnfecteerde dieren en hun virale load gepaard met daling van maternale antistoffen. In een

populatie waar het virus aanwezig is worden meeste dieren geïnfecteerd, slechts enkele kunnen

PMWS vertonen. Tegenwoordig ziet men vooral subklinische infecties gepaard gaande met slechtere

productieresultaten (Zimmerman et al., 2012). Aangezien het virus vaak aanwezig is in de omgeving

krijgen de biggen meestal een passieve immuniteit via de maternale antistoffen. Het belang van een

goede colostrumopname mag dus niet onderschat worden. McKeown et al. (2005) toonden aan dat

10

het level maternale antistoffen tegen PCV2 een zeer belangrijke factor in de respons op PCV2.

Hoogst waarschijnlijk is er een positief verband tussen het level antistoffen en de bescherming van de

big tegen het virus. Vanaf zeven weken kunnen deze maternale antistoffen terug dalen.

Om te kunnen spreken van PMWS moeten drie criteria aanwezig zijn:

1) Typische symptomen (groeivertraging, dyspnee, vergrootte lieslymfeknopen of icterus)

2) Karakteristieke histopathologische letsels in de lymfeweefsels

3) Aanwezigheid van PCV2 in deze letsels (lymfeweefsels en andere aangetaste organen)

(Chae, 2012)

De werkzaamheid van vaccins kan ook met deze criteria beoordeeld worden. Een bedrijf waar PCV2

aangetoond is via PCR of serologie zonder klinische symptomen kan men zien als een subklinisch

geïnfecteerd bedrijf. Er zijn een aantal methodes ontwikkeld voor de diagnose van PCVD, in situ

hybridisatie en immunohistochemie worden vaak gebruikt om PCV2 aan te tonen in aangetaste

weefsels. PCV2 kan ook teruggevonden worden in de myocardcel van (gemummificeerde) foetussen

na abortus. Het is ook belangrijk om de hoeveelheid virus te bepalen, o.a. met kwantitatieve PCR (de

hoeveelheid virus aanwezig zou gerelateerd zijn aan de mate van microscopische letsels en zou

hoger zijn bij klinisch geïnfecteerde dieren dan subklinische geïnfecteerde dieren. Voor de grens

tussen PMWS en subklinische infectie wordt 107 DNA kopieën/ml voorgesteld (Olvera et al., 2004)).

Kwalitatieve PCR daarentegen kan niet aangeven of PCV2 de primaire oorzaak is van de problemen.

Serologische testen (IPMA, seroneutralisatie) kan ook uitgevoerd worden (men kan kijken naar de

seroconversie), maar men constateert dat hetzelfde patroon van antistoffen kan voorkomen bij zowel

bedrijven met PMWS problemen als bij bedrijven zonder deze problemen. Wel kan gekeken worden

wanneer maternale antistoffen dalen om vaccinatiestrategie aan te passen (Zimmerman et al., 2012).

Men kan eigenlijk een onderscheid maken tussen individuele diagnose of groepsdiagnose. Deze

laatste moet voldoen aan twee criteria: significante stijging in sterfte na spenen en wegkwijners en

betrouwbare diagnose van PMWS in minstens 1/5 van de biggen post mortem (Grau-roma et al.,

2011).

2.1.6. Vaccinatie tegen PCV

Er is geen twijfel aan het belang van PCV2 en de noodzakelijkheid om hiertegen te vaccineren op

probleembedrijven. Echter klinische symptomen zijn vaak het topje van de ijsberg, subklinische PCV2-

infectie zal meestal ook een negatieve impact hebben op de productieresultaten (Maes, 2012). Pas in

2004 werd het eerste commerciële PCV2 vaccin gebruikt in Frankrijk en Duitsland. Ondertussen zijn

er een viertal vaccins op de markt. Vaccinatie werd eerst ingezet om PMWS te bestrijden, maar het

werkt ook voor andere Porcine circovirus associated diseases (PCVAD). De klinische vorm komt

tegenwoordig minder voor, toch kan vaccinatie een hulp zijn om ook de subklinische vorm onder

controle te houden. Verder zal blijken dat alle commerciële vaccins effectief zijn en productieresultaten

kunnen verbeteren. Verbetering van dagelijkse groei, voederconversie en mortaliteit zijn voordelen na

11

vaccinatie. Uiteindelijk wordt ook het antibioticagebruik gereduceerd als secundaire bacteriële infecties

vermeden kunnen worden en wordt het dierenwelzijn verhoogd (Kixmöller et al., 2008; Grau-roma

2011; Chae, 2012; Segalés et al. 2013).

In 2006, meer dan tien jaar na de identificatie van het virus, was het eerste vaccin CIRCOVAC®

(MERIAL, Lyon, Frankrijk) beschikbaar in bijna heel Europa en Canada. CIRCOVAC is een

geïnactiveerd PCV2 vaccin gebaseerd op een olie-adjuvans (TS61: paraffine olie). Als hulpstof is

thiomersal aanwezig (zie verder). Het vaccin werd eerst gebruikt voor gelten en zeugen, later ook voor

biggen, evenwel aan een lagere dosis. Als primovaccinatie krijgen gelten 2x1 dosis van 2ml met een

interval van drie of vier weken (tweede vaccinatie moet minimum twee weken voor dekken gebeuren).

Dit wordt gevolgd door een boostervaccinatie met één dosis minimum twee weken voor het werpen.

Zeugen krijgen ook 2x1 dosis met drie tot vier weken interval (de tweede vaccinatie minimum twee

weken voor het werpen). Revaccinatie gebeurt elke dracht minimum twee tot vier weken voor het

werpen. Na overdracht van passieve antistoffen door colostrum opname van de big is de duur van de

immuniteit ongeveer vijf weken. Om biggen te vaccineren moeten deze ouder zijn dan drie weken en

dan krijgen ze 1 dosis van 0.5 ml. Bij deze actieve immunisatie van biggen is de aanvang twee weken

na vaccinatie en heeft een duur van ten minste 14 weken. (www.ema.europa.eu). Enkel dit vaccin is

geregistreerd om ook zeugen en gelten te vaccineren i.t.t. de overige vaccins die enkel dienen voor

biggen. Vaccinatie via zeugen bespaart werk voor de varkenshouder i.t.t. vaccinatie van alle biggen.

Uiteraard moet de opname van colostrum voldoende zijn om goede bescherming te bekomen (Chae,

2012).

Verder zijn nog sub-unit vaccins beschikbaar. INGELVAC CIRCOFLEX® (Boehringer Ingelheim), en

PORCILIS PCV® (MSD). Deze zijn gebaseerd op een open reading frame 2 (ORF2 zie eerder)

proteïne. Dit bevat een belangrijk epitoop om een immuunrespons op te wekken. (Chae, 2012).

SUVAXYN PCV® (Zoetis) is een recombinant PCV2 vaccin. Het bevat de genetica van een niet-

pathogene PCV1 maar met het belangrijke ORF2 capsied gen van PCV2. Via dit gen is er expressie

van het ORF2 proteïne zodat een immuunreactie kan ontstaan. Vaccins gebaseerd op het PCV1

genotype werken ook goed tegen PCV2 wegens het bestaan van kruisimmuniteit (Chae, 2012; Fraile

et al., 2012a). Een overzicht van de verschillende vaccins wordt in Tabel 1 weergeven:

12

VACCINS BESTANDDEEL ADJUVANS DIERSOORT DOSIS en

POSOLOGIE

CIRCOVAC® Geïnactiveerd

PCV2

Lichte paraffine

olie

Gelten

Zeugen

Biggen

2x 2ml +

1x2ml IM

2x 2ml +

1x2ml IM

1x 0.5ml IM

INGELVAC

CIRCOFLEX®

Porcine

Circovirus type

2 ORF2

antigeen

Carbomeer Biggen vanaf

twee weken

1x 1ml IM

PORCILIS PCV® Porcine

circovirus type 2

ORF2 antigeen

Dl -α-

tocoferylacetaat

en

lichte paraffine

olie

Biggen vanaf

3 weken OF

biggen vanaf

3 dagen én

op 3 weken

1x of 2x 2ml

IM

SUVAXYN PCV® Inactivated

recombinant

PCV1

expressing the

PCV2 ORF2

protein

Sulfolipo-

cyclodextrin

en

Squalane

Biggen vanaf

3 weken

1x 2ml IM

BIGGEN

Twee belangrijke effecten worden gezien bij immunostimulatie: de aanmaak van neutraliserende

antistoffen (NAs) en IFN-γ. Specifieke NAs tegen PCV2 spelen een hoofdrol in de bescherming tegen

PMWS en worden geïnduceerd door de beschikbare vaccins. Een stijging van NAs gaat gepaard met

een daling van de viremie en met daling van PCVAD onder experimentele omstandigheden. Een

chimeer PCV1/PCV2 vaccin zorgt voor een hogere NA titer vergeleken met subunit vaccins. Er is

geen verschil in NAs tussen een subunit of een geïnactiveerd vaccin. Één enkele dosis zou wel een

lagere NA titer geven dan een dubbele dosis (Meerts et al., 2005; Fort et al., 2007; Fort et al 2009b;

Tabel 1: Verschillende beschikbare vaccins tegen PCV2

13

Fraile et al., 2012a; Chae, 2012). Vaccinatie zorgt ook voor PCV2 specifieke IFN-γ–secreterende

cellen. IFN-γ is een cytokine dat celgemedieerde respons reguleert en zorgt voor differentiatie van

naïeve CD4 T cellen naar T-helper-1 (Th1) cellen. Deze specifieke cellen worden ook gevonden na

natuurlijke infectie. De reductie van PCV2 in het bloed gaat samen met de opkomst van deze Nas en

IFN-γ–secreterende cellen. Deze immuunreacties worden ook gezien als maternale antistoffen nog

aanwezig zijn. De duur van de immuniteit is ongeveer 12-13 weken na een eerste immunisatie (Meerts

et al., 2005; Fort et al., 2009b; Chae, 2012).

De meeste vaccins worden bij biggen gebruikt. De werking van het vaccin wordt beschreven in

verschillende studies. Kixmöller et al. (2008) hebben een proef uitgevoerd met 1519 biggen op een

bedrijf waar PMWS werd vastgesteld. De 3 weken oude biggen werden in twee groepen verdeeld: de

ene groep werd gevaccineerd, de andere kreeg een placebo (injectie met carbomeer adjuvans zonder

PCV2 proteine). Men zag bij de gevaccineerde dieren een verlaagde PCV2 infectiedruk en kortere

duur van de viremie. Verder was er een stijging van het lichaamsgewicht met 4.84 kg, reductie van

53% sterfte en significant minder klinische tekenen van PMWS. Opmerkelijk zag men na PCR

onderzoek van longstaaltjes (longweefsel werden genomen aan de rand van eventuele letsels) een

lager aantal co-infecties met PRRSv en Mycoplasma hyorhinis. Fort et al. (2009b) infecteerde biggen

met enkel PCV2 onder experimentele omstandigheden. Er werd een daling van viremie gezien met

42.0% tot 86.1% na 1 enkele dosis met verschillende vaccins. Bij Fraile et al. (2012a) waren er

gelijkaardige resultaten als bij voorgaande studies: minder klinische symptomen en sterfte en een

hoger gemiddelde dagelijkse groei.

De werkzaamheid van Circovac is ook bewezen door een proef van Heiβenberger et al. (2013).

Biggen van drie weken oud gehuisvest op een bedrijf met PCVD problemen kregen een enkele dosis.

Het effect van vaccineren beoordeelde men op basis van mortaliteit, de aanwezigheid van magere

biggen en de groei. Er was een verbetering van deze parameters. Er was ook een daling van het

specifieke PCV2 DNA (na analyse van sera met qPCR) bij gevaccineerde dieren. Vaccineren was ook

belangrijk om de infectiedruk te doen dalen op populatieniveau. Fraile et al. (2012a) hebben een

significante daling van PCV2 in feces gevonden (naast een daling in serum). Deze daling is belangrijk

om ook de infectiedruk in de stal te doen dalen. Dit werd ook gezien in een proef van Fort et al. (2008)

samen met daling van de uitscheiding via de neus. Een opkomst van viremie vermeed men na

vaccinatie van biggen die besmet werden met 4 verschillende PCV2 isolaten met verschillende

afkomst en genotype.

ZEUGEN

Men kan ook de zeugen vaccineren i.p.v. de biggen. Zo kunnen de biggen een passieve immuniteit

verkrijgen via het opnemen van colostrum. Aangezien veel bedrijven seropositief zijn, worden

antistoffen geproduceerd en via biest overgedragen. Het is evident dat er voldoende opname van

colostrum moet zijn voor een goede bescherming. Het risico op het krijgen van PMWS bij biggen van

zeugen met lage antistoffen (IPMA < of = 1/20) is drie keer hoger vergeleken met biggen van zeugen

met een hoge titer (Pejsak et al., 2010; Grau-Roma et al., 2011). Vaccineren van zeugen kan ook

14

verbeterde reproductieresultaten geven (Kekarainen et al., 2010). Dit werd ook gezien op een bedrijf

met PMWS: na vaccineren (Circovac) van de zeugen zag men minder terugkomers en lager

abortuspercentage vergeleken met de periode van tijdens en voor de uitbraak. Hier waren er ook

gelijkaardige positieve effecten op productieparameters bij de biggen (Pejsak et al., 2010). Na

vaccineren van zeugen was er een verhoogde titer van anti-PCV2 IgG antistoffen in het colostrum.

Groot voordeel hierbij is dat vaccineren van de zeugen minder arbeidsintensief is dan vaccineren van

de biggen. Onder veldomstandigheden was de dagelijkse groei voor spenen bij biggen van

gevaccineerde zeugen groter t.o.v. biggen van niet gevaccineerde zeugen die zelf een actieve

immuunrespons moesten opbouwen (Chae, 2012). Er zou ook overdracht zijn van een maternale

PCV2-specifieke cellulaire immuunrespons van de zeug naar haar nakomelingen (Oh et al., 2012).

Men kan zich afvragen wat nu de beste vaccinatiestrategie kan zijn. In een proef op een bedrijf met

PMWS werden drie vaccinatieprotocollen uitgetest (Circovac): vaccinatie van zeugen, vaccinatie van

biggen en vaccinatie van beide. De productieparameters van de opgevolgde biggen (groei,

voederconversie (VC), mortaliteit en slachtgewicht) waren na vaccinatie, gelijk welk protocol er

aangewend werd, terug even goed of zelfs beter als voor de uitbraak. Dit laatste kan erop wijzen dat

er eerder een subklinische infectie aanwezig was. Na vaccinatie van beide groepen (zeugen en

biggen) was groei het best. Vaccineren van zeugen toonde een lagere mortaliteit vóór het spenen. Er

was geen verschil in voederconversie merkbaar tussen de drie groepen (echter wel een verbetering

vergeleken met tijdens de uitbraak) (Pejsak et al., 2010).

Algemeen kan uit deze verschillende onderzoeken volgende zaken vastgesteld worden: bij bedrijven

waar er een vroege infectie met PCV2 bestaat is vaccineren van zeugen aangeraden, indien er een

latere infectie is, wordt vaccinatie van biggen aangeraden (Chae, 2012). Naast het beslissen welke

vaccinatiestrategie kan gebruikt worden, moet ook nagedacht worden over hoelang men kan

vaccineren. Het is erg moeilijk ervoor te zorgen dat een bedrijf volledig seronegatief wordt én blijft.

Hiervoor moeten, naast vaccineren, grondige inspanningen op vlak van management geleverd

worden. In een proef van Feng et al. (2014) constadeerde men dat er een jaar na de laatste vaccinatie

op een bedrijf terug opflakkering was van PCV2. Hiervoor werd een jaar lang PCV2 ELISA en qPCR

uitgevoerd op bloedstalen van biggen en zeugen. Het aantal positieve bloedstalen waren 8%, 0.9% en

3,5% PCV2 voor, tijdens en na een massavaccinatie respectievelijk. Er moet vermeld worden dat hier

geen extra inspanningen op vlak van bioveiligheid na het stoppen van de vaccinatie werden genomen

(Feng et al, 2014).

In de literatuur is er nog veel discussie over het al dan niet interfereren van maternale antistoffen met

vaccinatie, al dan niet afhankelijk van het gebruikte vaccin. Aangezien veel bedrijven seropositief zijn

geven zeugen antistoffen mee via hun colostrum aan de biggen. Fraile et al. (2012a) hebben

aangetoond dat de aanwezigheid van een hoge maternale immuniteit op het moment van vaccineren

interfereerde met de opbouw van een actieve humorale respons. Echter als men louter keek naar

PCV2-geassocieerde letsels en virus in serum en feces, dan zag men geen effect van deze

interferentie. Ook Fort et al. (2009b) bekwamen gelijkaardige resultaten: aanwezigheid van een hoge

IPMA (immunoperoxidase monolayer assay) titer interfereerde met opbouw van humorale respons.

15

Een proef van Kixmöller et al. (2008) (zie eerder) toont aan dat de reductie in viremie na vaccinatie

van biggen (3 weken oud) niet wordt beïnvloed door de aanwezigheid van maternale antistoffen. De

antistoffentiter werd bepaald op de dag van vaccinatie en zeugen werden ingedeeld in drie groepen

op basis van de hoeveelheid aanwezige antistoffen. Verder werd ook beschreven dat vaccineren zorgt

voor PCV2 specifieke neutraliserende antistoffen, ook al is er aanwezigheid van maternale antistoffen

(Fort et al., 2008). Anderzijds kunnen maternale antistoffen de B-cel respons verhogen via de

complement-cascade door aanwezigheid van antigeen-antistof complexen (Fraile et al., 2012a). De

complement cascade bestaat uit een reeks plasma-eiwitten die met elkaar reageren om infectie te

bestrijden, het is onmisbaar voor de lichaamsbescherming. Bij activatie ontstaat een ketenreactie die

cellen of binnendringende organismen kan verwijderen (vb. via opsonisatie en fagocytose). Het zorgt

verder ook voor controle van de ontstekingsreactie en voor verwijderen van antigeen-antistof

complexen. Vorming van C5b kan via een klassieke en alternatieve manier en leidt tot porie-vorming

in de celmembraan zodat cellyse kan onstaan (Janeway et al., 2001).

2.2. Enterotoxigene Escherichia coli

2.2.1. Inleiding

Neonatale diarree in de kraamstal wordt hoofdzakelijk veroorzaakt door de zogenaamde

enterototoxigene Escherichia coli (ETEC) stammen. Deze vorm van diarree komt meestal voor bij

biggen tussen dag nul en dag vier. Escherichia coli (E. coli), behorende tot de familie van de

Enterobacteriaceae, is een Gram-negatief staafje en is obligaat symbiotisch, facultatief pathogeen.

Escherichia coli (E. coli) stammen worden ingedeeld in verschillende serotypes. Deze indeling gebeurt

op basis van antigenen. Er zijn dan ook verschillende antigenen aanwezig waaronder LPS (O

antigeen), kapsel (K antigeen), flagellen (H antigeen) en fimbriële antigenen (Zutic et al., 2010). Deze

bacterie is gevoelig aan zonlicht, uitdroging en aan de meeste desinfectantia. De kiem kan overleven

in organisch materiaal. E. coli kan ook deel uit maken van de normale darmflora. Naast neonatale

diarree kan ETEC ook diarree veroorzaken bij oudere zuigende biggen en bij gespeende biggen. De

ziekte wordt vooral gezien als het evenwicht tussen maternale immuniteit en infectiedruk verstoord

wordt. Oorzaken van daling van de maternale immuniteit kunnen zijn: porcine hypogalactie syndroom

(PHS,) eersteworp zeugen, laag geboortegewicht van de biggen, infecties met andere kiemen,

overbezetting,.. De infectiedruk zal al snel stijgen wanneer enkele biggen diarree vertonen in het

kraamhok en bij onvoldoende hygiëne. Doordat er ook vaak resistentie tegen E. coli wordt

waargenomen is het belang van een correcte vaccinatie niet te onderschatten (Haesebrouck et al.,

2004; Zimmerman et al., 2012b).

16

2.2.2 Epidemiologie

Via de moederzeug of via de besmette omgeving in het kraamhok komen de pasgeboren biggen

meteen in contact met de kiem, zelfs nog voor ze starten met de opname van colostrum. Zeker bij een

continu systeem en/of een zeer vuile omgeving zijn de kansen op een uitbraak aanzienlijk groot. Bij

klinisch gezonde varkens komt de kiem voor in het distaal deel van de dunne darm en in de dikke

darm, zij zijn dan de besmettingsbron voor hun biggen.

Biggen kunnen ook zelf drager zijn van ETEC stammen in de dikke darm, maar deze kunnen

onderdrukt worden zolang er lactogene immuniteit aanwezig blijft. Na spenen valt deze immuniteit weg

en kan de kiem toch klinische symptomen veroorzaken. Dit is de zogenaamde speendiarree (Nagy en

Fekete, 1999, Nagy en Fekete, 2005; Zimmerman et al., 2012b).

2.2.3. Pathogenese

Opname van de kiem gebeurt peroraal. Wanneer de big de uterus verlaat komt het al meteen terecht

in een gecontamineerde omgeving en wordt E. coli al opgenomen nog voor ze beginnen zuigen. Met

behulp van hun fimbriae hechten de kiemen zich vast aan de enterocyten (zie Figuur 6). Deze

interactie vormt dan ook de eerste stap in de pathogenese. Daarna vermeerderen ze en vormen ze

enterotoxines die de oorzaak zijn van de diarree. De structuur van de mucosa blijft echter wel intact

(i.t.t. virale infecties). ETEC stammen bezitten twee belangrijke virulentiefactoren: adhesiefactoren en

enterotoxines.

Indien de gastheer over bepaalde specifieke bindingsplaatsen bezit kan er een specifieke adhesie

plaatsvinden van de kiem aan deze mucosale epitheelcellen met behulp van fimbriae. De

bindingsplaatsen zijn glycanen (suikers) op eiwitten (glycoproteïnen) of sphingolipiden (glycolipiden)

Fig 6. Aanhechtingsfactoren van ETEC (uit

https://www.pig333.com/e-coli/escherichia-coli-

infections-in-pigs-1-of-2_9414/).

Fig 7. Infectie met E. coli. Waterige inhoud in de dunne darm en

maag gevuld met melk (uit Riising et al., 2005).

17

(Coddens et al., 2009; Melkebeek et al., 2012; Johansson et al.,2014). De meest voorkomende zijn F4

(K88), F5 (K99), F6 (987P) en F41. Het meest komt F4 voor en deze wordt onderverdeeld in F4ab

(K88ab), F4ac (K88ac) en F4ad (K88ad) (Van den Broeck et al., 2000). Sommige stammen

produceren meer dan één van deze adhesines. Het al dan niet voorkomen van receptoren is voor

enkele fimbriae afhankelijk van de leeftijd. Receptoren voor vb. F5 fimbriae komen enkel voor bij zeer

jonge dieren, waardoor F5+ ETEC enkel neonatale diarree veroorzaakt, terwijl receptoren voor F18

nog niet volledig aanwezig zijn voor dag 20 zodat E. coli met F18 fimbriae vaak pas diarree

veroorzaakt na spenen (Coddens et al., 2007). Het is ook voor twee fimbriae genetisch gerelateerd, nl

de F4 en F18 fimbriae: men moet opletten voor heterozygote biggen afkomstig van een gevoelige

beer en een ongevoelige zeug die niet in staat is biest te produceren met specifieke antistoffen voor

de biggen (Sellwood et al., 1975; Bertschinger et al., 1993; Nagy en Fekete, 1999; Nagy en Fekete,

2005; Zimmerman et al., 2012b).

Enterotoxines zijn extracellulaire proteïnes of peptides (exotoxines) aangemaakt door de ETEC

stammen. De mechanismes bestaan niet uit het veroorzaken van pathologische letsels aan de darm,

ze zorgen wel voor functionele veranderingen aan de darm. Men kent twee groepen enterotoxines:

thermolabiele (LT) en thermostabiele (STa, STb en EAST1). LT is een eiwit met hoog moleculair

gewicht dat sterk antigenisch is (mogelijkheid tot vaccin zie verder). Dit exotoxine activeert het

andenylaat cyclase complex t.h.v. de enterocyten waardoor er meer secretie van Cl- en HCO3- en

minder absorptie is van Na+ ionen. Als resultaat verkrijgt men verlies van water. Het STa toxine

activeert het guanylaatcyclase complex waardoor de productie van cyclisch guanosine monofosfaat

gestimuleerd wordt. Dit zorgt voor gelijkaardige effecten als LT (Nagy en Fekete, 1999; Nagy en

Fekete, 2005). STa is minder actief in darmen van oudere biggen (verschil in concentratie van

receptoren), daarenboven moet dit toxine continu aanwezig zijn om een effect uit te oefenen terwijl het

LT toxine, eens het adenylaat cyclase geactiveerd is, er blijvende activatie is totdat de cel sterft (Loos

et al., 2012; Loos et al., 2013). STb binding aan de cel zorgt voor activatie van een pertussis toxin-

gevoelig GTP-binding regulatorisch protein, Gαi3 protein, waardoor er een intracellulaire toename van

calcium optreedt die aanleiding geeft tot secretie van Cl- ionen in het darmlumen. De toename van de

intracellulaire Ca2+-concentratie leidt ook tot productie van serotonine en van prostaglandine E2

(PGE2) met water en electrolieten verlies tot gevolg (Rousset et al., 1998, Nagy en Fekete, 2005). De

thermostabiele enterotoxines kunnen moeilijk in vaccins gebruikt worden aangezien ze een laag

moleculair gewicht hebben en daardoor weinig immunogeen zijn (i.t.t. andere exotoxines

geproduceerd in het bacteriële plasma) (Haesebrouck et al., 2004).

Stammen die enkel neonatale diarree veroorzaken bezitten F5 (K99), F6 (978P) en/of F41 fimbriae.

Ze vormen vooral Sta en koloniseren het ileum en het achterste deel van het jejunum. Ze zijn niet

hemolytisch. Stammen die diarree veroorzaken van geboorte tot spenen bezitten F4 en/of F18 en

produceren LT, Sta, STb, en/of EAST1. Ze koloniseren het jejunum en ileum en kunnen hemolytisch

zijn. Biggen zijn meer gevoelig aan F5 en F6 positieve ETEC tijdens de eerste levensdagen, maar

worden dan geleidelijk resistent (Haesebrouck et al., 2004; Kim et al., 2010).

18

2.2.4. Symptomen en letsels

Al enkele uren na de partus kunnen de symptomen zichtbaar zijn. Morbiditeit (30-80%) en mortaliteit

(tot meer dan 70%) zijn sterk variabel. Sterfte kan waargenomen worden nog voor er sprake is van

diarree. Erge secretie leidt ook tot metabole acidose. Men ziet een waterige, wit-gele diarree en

volgend daarop een dehydratatie van de biggen (zie Figuur 7). Men ziet ook een sterk gewichtsverlies,

verzonken ogen en een blauwe, grijsachtige huid. Anus, vulva en staartpunt kunnen er rood en

ontstoken uitzien door het contact met de faeces. Microscopisch kan men de adhesie van E. coli aan

de epitheliale cellen zien. Bij autopsie ziet men een dilatatie van de dunne darm met waterige inhoud,

gedilateerde maag met onverteerde melk en letsels ten gevolge van de dehydratatie (Nagy en Fekete,

1999; Zimmerman et al., 2012b). Men kan vaak meteen aan ETEC denken enkel op basis van

klinische symptomen en anamnese, met name wanneer de diarree voorkomt vlak na de partus. Na

isolatie van ETEC uit de dunne darm van gestorven biggen of via rectale swab uit levende biggen kan

men tot een diagnose komen. Verdere diagnose kan ook gebeuren via het aantonen van kolonisatie

met histopathologie, via immunohistochemie of indirecte immunofluorescentie. Op autopsie kunnen de

weefsels er gedehydrateerd uitzien, de maag kan opgezet zijn (met onverteerde melk), de dunne darm

is gedilateerd en bevat waterige inhoud. Bij microscopie ziet men adhesies aan het epitheel van

jejunum en ileum (indien het met F4 of F18 fimbriae te maken heeft). Er zijn ook verhoogde aantallen

neutrofielen en macrofagen aanwezig in de lamina propria. Als men de differentiaal diagnose opstelt

kan men denken aan andere bacteriële infecties: Clostridium perfringens type A en C, Clostridium

difficile. Enkele virussen kunnen ook diarree geven: rotavirus en porcine epidemische diarree (PED).

Bij oudere biggen in de kraamstal kan Isospora suis ook vetdiarree veroorzaken. Bacteriële oorzaak

zal eerder resulteren in een basale pH van de faeces i.t.t. een virale oorzaak door verlies van

bicarbonaat. Indien men de kiem kan isoleren dienen ook de adhesiefactoren en enterotoxines

aangetoond te worden. Heden ten dage wordt meer gebruikgemaakt van genotype analyse via DNA

hybridisatie en PCR. Hiermee kunnen ook de virulentiefactoren bepaald worden (Nagy en Fekete,

1999; Nagy en Fekete, 2005; Zimmerman et al., 2012b).

2.2.5. Behandeling en preventie

Belangrijk bij de behandeling is om de dehydratatie tegen te gaan. Men kan overgaan tot parenterale

vochttherapie door een isotonische fysiologische zout- of glucoseoplossing (op lichaamstemperatuur)

subcutaan of intraperitoneaal in te spuiten. Perorale vochttherapie kan via electrolytenoplossing (met

glucose en aminozuren). Er wordt vaak ook gestart met een antimicrobiële behandeling (best na

aanleggen van een antibiogram). Volgens AMCRA worden volgende antimicrobiële middelen

aangeraden:

19

Eerste

keuze

Het is niet aangeraden om de biggen standaard te behandelen op een probleembedrijf

wegens de stijgende resistentie gedurende de laatste jaren. Voorkomen van de ziekte is

de boodschap.

Tweede

keuze colistine, gentamicine, lincomycine + spectinomycine, procaïne benzylpenicilline +

neomycine.

Derde

keuze trimethoprim + sulfonamiden, oxytetracycline, danofloxacine, enrofloxacine,

marbofloxacine.

Men moet de verspreiding tussen verschillende nesten zoveel mogelijk proberen tegen te gaan. Dit

lukt best in een gecompartimenteerde kraamstal. Ook kan men best afzonderlijk werkmateriaal en

kledij voorzien. Goede reiniging en desinfectie van het kraamhok en werken volgens het all-in-all-out

(AIAO) principe. Er moet ook aandacht geschonken worden aan de temperatuur. Lage

omgevingstemperatuur (<25°C) in het kraamhok kan een grote impact hebben. De peristaltiek is

verminderd en passage van bacteriën en beschermende antistoffen is verminderd. Hierdoor stijgt de

concentratie van E. coli in de darm. Verder kan men in theorie ook immunotherapie toepassen. Men

kan monoclonale antistoffen, dierlijk plasma of eierdooier met antistoffen geven ter preventie van de

adhesie (Nagy en Fekete, 2005; Virdi et al., 2013).

Wanneer het evenwicht verstoord wordt tussen infectiedruk en bescherming via passieve immuniteit

verkrijgt men problemen met neonatale diarree. Het is geweten dat zeugen bescherming kunnen

doorgeven aan hun biggen indien ze voldoende antistoffen tegen E. coli aanmaken. De ernst van de

infectie is afhankelijk van de antistoftiter die de zeug kan doorgeven aan haar biggen. Het colostrum

bevat niet-specifieke (bactericide) en specifieke factoren (IgG, IgA). Wanneer de zeugen niet in

contact komen met de kiem worden geen specifieke antistoffen geproduceerd. Antistoffen kunnen

gericht zijn tegen oppervlakteantigenen zoals F4, F5, F6, F18 en F41. Tijdens de eerste levensdagen

is vooral een goede colostrumopname van belang, die de big voorziet van IgG. Er moet een

voldoende opname zijn gedurende de eerste 12-24 uur na de geboorte, voor het sluiten van de

darmbarrièrre. Na deze colostrale immuniteit krijgt de lactogene, lokale immuniteit de bovenhand met

IgA (Nagy en Fekete, 2005; Zimmerman et al., 2012b).

Verder kan het ook helpen om oudere zeugen samen met jongere zeugen te huisvesten zodat deze

laatste in contact komen met de kiemen aanwezig op het bedrijf. In de praktijk brengt men ook vaak

drachtige zeugen in contact met (inhoud van) dunne darmen van biggen met diarree. Er kan een

cultuur bekomen worden door ze in melk te brengen. Men kan echter wel vragen stellen over de

bioveiligheid omdat ook andere kiemen meegekweekt kunnen worden. Daarenboven verhoogt dit het

risico op infectie van de biggen met E. coli met speendiarree tot gevolg. Zo kan speendiarree op een

bedrijf worden onderhouden. De efficiëntie van orale immunisatie werd in 1974 reeds bevestigd via

een proef waarbij een aantal levende E. coli kiemen aan drachtige zeugen gegeven werden. Wanneer

biggen geïnfecteerd werden met de homologe enteropathogene stammen was er een sterke reductie

20

in kliniek i.t.t. niet geïmmuniseerde zeugen (Kohler, 1974). Ook via genetische selectie van biggen die

geen receptoren bezitten voor F4 fimbriae kan men colibacillose bestrijden (Coddens et al., 2008).

2.2.6. Vaccinatie

Het doel is dat zeugen nadat ze gevaccineerd worden tijdens de dracht op het goede tijdstip

maternale immuniteit doorgeven aan hun biggen. Het gevolg van vaccineren is dat de specifieke

antistoffen in het colostrum stijgen en daardoor een bepaald niveau van passieve immuniteit voorzien

wordt ter hoogte van de dunne darm van de big om kolonisatie te voorkomen (Osek et al., 1994).

Meestal wordt met geïnactiveerde vaccins gewerkt. De nieuwere vaccins bevatten gezuiverde

adhesiefactoren en eventueel het LT enterotoxine of bevatten een aantal serotypes met

adhesiefactoren. Primo-vaccinatie bestaat uit twee injecties met drie tot zes weken tussentijd. De

laatste injectie gebeurt twee tot zes weken voor de partus. Deze vaccins hebben vooral als doel het

IgG gehalte in het colostrum te verhogen. Voorwaarde is wel dat er voldoende biest geproduceerd en

opgenomen wordt. Vaccinatie van eersteworpszeugen kan zeker een groot voordeel bieden (Nagy en

Fekete, 2005; Riising et al., 2005). Deze bescherming is minder efficiënt bij oudere biggen en helpen

niet tegen speendiarree. Een infectie met ETEC is een niet-invasieve gastrointestinale infectie

waardoor zeker na spenen de mucosale (lactogene) immuniteit belangrijker is dan systemische

(colostrale) immuniteit. De passieve immuniteit daalt wanneer de big ouder wordt en op het moment

van spenen valt de lactogene immuniteit volledig weg zodat de big gevoelig wordt aan

darmpathogenen. Er is eigenlijk nood aan een oraal vaccin dat zorgt voor een actieve mucosale

immuniteit (Melkebeek et al., 2013).

Parenterale vaccinatie van drachtige zeugen zorgt voor een hogere productie van antistoffen die

geconcentreerd worden in het colostrum. De lokale immuniteit in de darm wordt minder gestimuleerd

zodat er geen echte stijging is van IgA in de melk. Vaccins tegen neonatale diarree zijn dus beperkter

effectief tegen diarree bij oudere, nog zuigende biggen en niet tegen speendiarree. Indien men hier

ook een zekere vorm van bescherming zou willen bereiken moet gezocht worden naar vaccins die de

lokale mucosae kunnen stimuleren (Haesebrouck et al., 2004). Er zijn enkele mogelijkheden wat

betreft gebruik van parenterale vaccinatie. Één daarvan is werken via ISCOM (immune stimulating

complexes). Dit bestaat uit een matrix met enkele membraancomponenten en antigenen (subunits of

fimbriae) in, waardoor een icosahedrische structuur wordt gevormd die doorneen de celmembraan kan

gaan (Morein et al., 1987). Naast parenterale toediening kan men ook werken met zogenaamde in-

feed vaccins die levende of dode bacteriën bevatten. Deze stimuleren het GALT systeem (gut-

associated lymphoid tissue) zodat een belangrijke lokale afweer door middel van IgA voorzien wordt.

Zo kan een lactogene immuniteit bekomen worden voor de eerste 10-14 dagen. Echter het verkrijgen

van een licentie voor deze orale vaccins is vaak een probleem in vele landen en het is vaak moeilijk

om een goede stabiliteit van het antigeen te bekomen (moet passeren langs maag, darmen..). Een

alternatieve vorm is het geven van darminhoud (feedback methode), maar deze methode houdt, zoals

hoger vermeld wel risico’s in (Nagy en Fekete, 1999) en kan speendiarree onderhouden.

21

Er worden pogingen ondernomen om de IgA titer bij zeugen en hun biggen te doen stijgen. Dit kan

gerealiseerd worden na multivalente vaccinatie van drachtige zeugen met o.a. een oraal vaccin dat als

primer en/of booster gegeven wordt (naast de gewone intramusculaire vaccinatie). Men ziet een

stijging van zowel IgA en IgG in het serum van de nakomelingen, zowel de lokale als de systemische

immuniteit werden gestimuleerd. Na infectie met een virulente E. coli stam is er bij de biggen met

verhoogde immuniteit geen verhoogde sterfte of symptomen van diarree (Hur en Lee., 2013).

De werkzaamheid van geïnactiveerde vaccins t.o.v. colibacillose werd ook getest bij een proef met

2472 drachtige zeugen. Er zijn acht verschillende vaccins getest, die allemaal intramusculair gegeven

worden. Effect van vaccinatie wordt aangetoond via percentage biggen met diarree, percentage

sterfte, gemiddeld gewicht op spenen en algemene gezondheidstatus. Alle vaccins hebben een

positief effect, echter er zijn ook verschillen op te merken. De beste resultaten worden gezien bij de

nakomelingen na vaccinatie van de drachtige moederzeug met een vaccin dat gezuiverde K88, K99,

987P fimbriae en de B subeenheid van het LT enterotoxine bevat (de B subeenheid heeft echter geen

werking als adjuvant i.t.t. het volledige toxine (Norton et al., 2012)). De combinatie van een

antitoxische en antifimbriale immuniteit werken synergistisch. Bij een groep wordt er ook een verschil

waargenomen in het percentage van biggen met diarree van twee groepen biggen: de ene groep

afkomstig van zeugen gevaccineerd met een dosis van 2ml heeft veel meer diarree dan een andere

groep afkomstig van zeugen gevaccineerd met hetzelfde vaccin, echter met een dosis van 4ml (Osek

et al., 1994).

Verschillende proeven bewijzen reeds het succes van vaccinatie. Oorspronkelijk werd eerst

gebruikgemaakt van vaccins met een cultuur van ETEC stammen van een aantal o-serogroepen (bij

Gram-negatieve bacteriën bestaat de buitenste membraan vooral uit lipopolysacchariden die uit drie

bestanddelen bestaan: Lipid A, een oligosaccharide-kern en polysaccharide O-antigenen (Yanhong et

al., 2015)). Na toevoeging van fimbriae (via hitte-shock laten deze de cel los en na centrifugatie

bekomt men de fimbriae) zag men dat het vaccin nog effectiever werd. Zelfs enkel en alleen fimbriae

kunnen reeds bescherming induceren (Riising et al., 2005). In 1973 werd ook al het effect van

vaccinatie via gebruik van F4 fimbriae succesvol aangetoond. Via de biest worden antistoffen dan

doorgegeven. Ze geven echter alleen bescherming ter hoogte van de darm bij zogende biggen, deze

bescherming verdwijnt dan ook bij het spenen. De goede antigenische eigenschap van fimbriae wordt

verklaard door het feit dat ze bestaan uit goed presenteerbare proteïnes aan het bacteriële oppervlak

waar het immuunsysteem goed kan op reageren. Fimbriae zijn noodzakelijk voor de belangrijke

adhesie-stap bij kolonisatie van de darm (Woon en Bunn, 1993). Ondertussen weten we dat de

polymere natuur van de fimbriae en hun stabiele structuur belangrijk zijn voor hun immunogeniciteit.

Niet alle fimbriae zijn immers goed antigenen (Van den Broeck et al., 2000; Melkebeek et al., 2013).

In een proef wordt de werkzaamheid van het vaccin Neocolipor bekeken via opvolgen van

lichaamsgewicht (op dag 1, 7, 14, 21), mortaliteit en percentage biggen met diarree. In de

onbehandelde groep worden meer biggen met diarree op dag één gezien en een hogere mortaliteit

gedurende de eerste levensweek, vergeleken met de behandelingsgroep. Hierbij werden enkel biggen

van eersteworpszeugen opgenomen in de proef. (Michelle-Fong et al., 2013). Een vaccin gebaseerd

22

op gewijzigde ETEC virulentiefactoren F4ac, F4ab, F5, F6 en LT werd getest bij een groep van elf

jonge zeugen. Er is een controlegroep (met een lage/seronegatieve level van antistoffen) aanwezig.

Het percentage biggen van gevaccineerde zeugen die geen klinische symptomen vertonen is 66,7-

87,5% i.t.t. amper 0,0-28,0% van de biggen van niet-gevaccineerde zeugen (Riising et al., 2005).

Zoals eerder vermeld kunnen ETEC stammen meer dan één type fimbriae-antigenen uitdrukken.

Runnels et al. (1987) hebben nagekeken of een vaccin met o.a. antigeen F41 bescherming bood

tegen stammen die K99+ produceerden al dan niet samen met de productie van F41+. Dit was niet

het geval. F41+ vaccinatie bood alleen bescherming tegen stammen die enkel F41 antigeen

aanmaken.

Er zijn twee belangrijke vaccins op de markt om neonatale diarree te voorkomen: Neocolipor

(MERIALl) en Porcilis Porcoli DF® (MSD Animal Health). Het zijn geïnactiveerde vaccins die

gezuiverde adhesiefactoren of een beperkt aantal E.coli-serotypes met de adhesiefactoren bevatten

met eventueel ook het LT-enterotoxine. Na vaccinatie van drachtige zeugen met Neocolipor verkrijgen

de biggen een passieve immuniteit door opname van colostrum met adhesine specifieke antistoffen.

Via neutralisatie wordt kolonisatie van de kiem aan het ileum voorkomen, deze worden dan verder

geëlimineerd via de normale peristaltiek nog vóór er toxines gevormd worden. Neocolipor bestaat uit

het geïnactiveerde E. coli met volgende adhesiefactoren: F4ab, F4ac, F4ad, F5, F6, F41. De injectie

gebeurt IM en het adjuvans bestaat uit thiomersal en Aluminiumhydroxide. Primovaccinatie gebeurt 2x

met een dosis van 2ml, de eerste op 5-7 weken, de tweede 2 weken voor werpen. Hervaccinatie

gebeurt 2 weken voor iedere worp. Porcilis Porcoli DF bestaat uit E. coli adhesines: F4ab, F4ac, F5,

F6 en ook het LT toxine. Zeugen/gelten krijgen 2x1 dosis (2ml) zes tot acht weken voor de worp,

gevolgd door een tweede vaccinatie vier weken later. Revaccinatie bestaat uit 1 dosis twee tot vier

weken voor werpen.

Er bestaan ook twee combinatievaccins (geïnactiveerde subunit vaccins) tegen E. coli met Clostridium

perfringens en/of Clostridium novyi (PORCILIS COLICLOS en SUISENG . Een overzicht van de

verschillende vaccins wordt weergegeven in Tabel 2 (http://www.cbip-vet.be).

23

VACCINS

BESTANDDEEL

ADJUVANS

DIERSOORT

DOSIS en POSOLOGIE

NEOCOLIPOR®

Geïnactiveerd E.

coli

(adhesiefactoren

F4, F5, F6, F41

Thiomersal

Al(OH)3

Zeugen 2 x 2 ml, 1ste vac 5-7

w, 2de vac 2 w voor

werpen.

Revac: 1 x 2 ml 2 w

voor werpen

PORCILIS

PORCOLI DF®

E. coli adhesine

(F4ab, F4ac, F5,

F6, LT toxoid

dl-alfa-tocopherol

acetaat

Zeugen 2 x 2 ml, 1ste vac 6 tot

8 w voor werpen, 2de

vac 4 w later.

Revac:1 x 2 ml, 2-4 w

voor werpen.

PORCILIS

COLICLOS®

E. coli (F4ab,

F4ac, F5, F6, LT

toxoïd),

Clostridium

Perfringens C

beta toxoïd

dl-alfa-tocopherol

acetaat

Zeugen Primair: 1 dosis 6-8 w

voor het werpen, 2de

dosis na 4 weken.

Revaccinatie: 1 dosis 2-

4 w voor het werpen

SUISENG®

E. coli fimbriaal

adhesine (F4ab,

F4ac, F5, F6,

LT-

enterotoxoïd),

Toxoïd van

Clostridium

perfringens C en

van Clostridium

novyi

aluminiumhydroxide,

ginseng-extract

Zeugen Primovac

Su: 2 x 1 dosis (2 ml)

op 6 w en 3 w voor de

worp

Revac:

Su: 1 dosis (2

ml)/dracht 3 w voor de

worp

2.3. Combineren van vaccins

De serologische respons na het combineren van vaccins werd tot dusver nog maar beperkt

onderzocht. Vaak gebeurt onderzoek via trial and error om tot een bepaalde conclusie te komen. Het

is dan ook moeilijk om verschillende combinaties te vergelijken met elkaar en er moet opgelet worden

bij het extrapoleren van bepaalde resultaten. Toch is het belangrijk te weten hoe veilig het is bepaalde

vaccins te combineren, temeer omdat dit in praktijk veelvuldig voorkomt. De capaciteit van het

immuunstelsel is niet oneindig en er kunnen ook nevenreacties ontstaan. Koorts kan abortus

Tabel 2: Verschillende beschikbare vaccins tegen neonatale diarree

24

induceren wat zeker niet gewenst is. Resultaten kunnen ook afhangen van het bijhorende adjuvans.

De vraag is dan ook welke rol dit adjuvans heeft in het opwekken van de immuunrespons. In de

literatuur is er hier en daar een proef te vinden die de effectiviteit van simultane vaccinaties bekijkt.

Vaak gaat het hier over bepaalde combinaties die vaak toegepast worden in de praktijk. Resultaten bij

andere diersoorten kunnen eventueel ook gebruikt worden om tot bepaalde inzichten te komen.

Kristensen et al. (2004) hebben de antistoffenrespons onderzocht na vaccinatie tegen 3

ademhalingspathogenen: Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella multocida en Actinobacillus

pleuropneumoniae. In deze proef werden drachtige zeugen gevaccineerd. Er is een duidelijk verschil

bij zeugen en hun nakomelingen qua antistoffen in vergelijking met de niet gevaccineerde

controlegroep. In deze proef werd ook naar de antistoffen gekeken bij de nakomelingen die via

passieve immuniteit worden doorgegeven. Daarbij komend hebben ze gekeken naar het verschil in

antistoffenopbouw tussen enkele of simultane vaccinatie: er werd geen verschil waargenomen op het

tijdstip van werpen bij de zeugen en in het serum van de 3-weken-oude nakomelingen. Verder werd

ook gelet op andere zaken zoals daling van de eetlust, verhoogde temperatuur, abortus, urticaria,

zwelling en roodheid. Vier zeugen hadden een afwijkende voedselopname maar die kwamen niet uit

één specifieke groep, één zeug had een lokale zwelling. Twaalf uur na de eerste vaccinatie was het

aantal zeugen met koorts (cutoff 38.7°C) hoger in de simultane groep dan in de groepen die het

vaccin apart kregen. Er was geen verschil in aantal levend geboren biggen tussen de groepen.

In een andere klinische studie werd de veiligheid en efficiëntie van een simultane vaccinatie getest bij

biggen. De biggen werden verdeeld in drie groepen: een controle groep (geen vaccinatie), een groep

die enkel Porcilis M. Hyo® kreeg en een derde groep die zowel Porcilis PRRS

® als Porcilis M. Hyo

kreeg. Er werd gekeken naar de lokale reacties, temperatuur, voedselopname en algemene

gezondheid als parameters voor de veiligheid, hier was geen significant verschil waargenomen tussen

de groepen die een vaccin kregen (Pommier et al.). Drexler et al. (2010) hebben de gecombineerde

PRRSv en M. hyopneumoniae vaccinatie onderzocht bij biggen t.o.v. het toedienen van 1 van beide

vaccins (er werd gebruikgemaakt van een levend gewijzigd PRRS vaccin gebaseerd op de Europese

stam). Hiervoor werd o.a. de viremie gemeten na infectie met M. hyopneumoniae of PRRSv. Er was

geen verschil op vlak van aantal eenheden virus tussen de gevaccineerde groepen (wel meer virus bij

controle groep). Men kan dus concluderen dar er geen interferentie of nadelige effecten zijn wanneer

de twee vaccins samen gegeven worden.

Een andere studie vergeleek de gelijktijdige toediening van twee vaccins tegen M. hyopneumoniae en

PCV2 met de aparte toediening van beide producten bij zuigende biggen. 598 biggen werden in vijf

groepen verdeeld. Het vaccinatieschema is terug te vinden in Tabel 3. De M. hyopneumoniae en de

PCV2 antistoffentiter waren significant hoger in de gevaccineerde groepen. Eén big van groep A en

één van groep C vertoonden een lokale reactie. Na vaccinatie met M. hyopneumoniae en PCV2 werd

een positief effect gezien op de algemene gezondheidsstatus én simultane of gelijktijdige vaccinatie

had geen negatieve gevolgen. (Herbich et al., 2013).

25

Een andere studie over simultaan gebruik werd uitgevoerd op een groep van 1000 biggen verdeeld in

5 groepen en iedere big was, of niet gevaccineerd, of wel gevaccineerd tegen M. hyopneumoniae

en/of PRRSv. Er werd gekeken naar lokale reacties, morbiditeit, dagelijkse groei, mortalitieit.

Antistoffen werden onderzocht met ELISA. Het simultaan gebruik is hier ook even veilig en compatibel

als de enkelvoudige toediening (Stricker et al., 2013).

Zes weken oude biggen worden in een andere proef gevaccineerd tegen Mond- en klauwzeer

(geïnactiveerd, trivalent met een toegevoegd adjuvans), en/of tegen Klassieke Varkenspest (levend

vaccin). De antistoffenrespons tegen Mond- en klauwzeer werd niet beïnvloed als deze samen met

Klassieke Varkenspest werd gegeven. Men zag zelfs een hogere antistoffenrespons tegen Klassieke

Varkenspest bij de simultane vaccinatie t.o.v. de enkele toediening. Het saponine als adjuvans was

waarschijnlijk de oorzaak hiervan. Saponine (aanwezig in het Mond- en klauwzeervirus vaccin)

stimuleert de niet-specifieke immuunstimulatie en zou ook de B-cel respons versterken (De Clerck et

al., 1989). Ook bij konijnen werden simultane vaccinatieproeven uitgevoerd en daar concludeerde

men ook dat een bivalent vaccin (tegen Hemorhagische septicemie (Pasteurella multocida en Mond-

en Klauwzeer) een betere antistoffenrespons gaf en langer persisteerde dan monovalente vaccinatie.

Eiwitten van het Mond- en klauwzeervirus worden verwerkt door antigeen presenterende cellen en

stimuleren Th-cellen die dan cytokines produceren. Hoewel deze cytokines antigeen specifiek zijn is

hun werking echter niet specifiek, zodat deze cytokines ook de respons stimuleren van

Lipopolysacharide (LPS)-gestimuleerde-B-cellen (LPS afkomstig van Pasteurella multocida). Als

gevolg hiervan is er een langere en hogere antistoffenproductie. De cytokines geproduceerd na

contact met Mond- en klauwzeervirus stimuleren zowel de humorale als de cellulaire respons (Altaf et

al., 2012).

Er zijn talrijke proeven gebeurd bij andere diersoorten. Bij kalveren werd een simultane vaccinatie

uitgevoerd met een polyvalent vaccin (bevat P. multocida en Mannheimia haemolytica en heeft als

adjuvans Al(OH)3) en een bivalent Mond- en klauwzeer vaccin (met adjuvans Al(OH)3). Er werden

bloedstalen genomen om humorale immuniteit te bepalen. De initiële en maximale respons bij

enkelvoudige of simultane toediening bleef gelijk. De cellulaire immuniteit tegen Mond- en klauwzeer

werd ook bekeken en er werden opnieuw geen verschillen waargenomen (Elham et al., 2008). Een

andere proef met rundvee beschrijft een simultane vaccinatie met een vaccin tegen Mond- en

Tabel 3. Vaccinatieschema (uit Herbich et al., 2013)

26

klauwzeer en een vaccin tegen hemorragische septicemie (beide geïnactiveerde vaccins). De

serologische respons werd op 0, 21 en 35 dagen gemeten en er waren geen verschillen gezien tussen

samen of apart toedienen van vaccins. Verder werden ook geen overige neveneffecten gezien na

simultane vaccinatie (Joseph et al., 1984). Bij de mens wordt ook onderzoek gedaan naar reacties op

vaccineren. Via een studie onderzocht men het verschil van lokale en algemene lichaamsreacties op 1

of meerdere vaccins. Het percentage lokale reacties steeg van 45% naar 78% bij één respectievelijk

meerdere vaccins. Het percentage algemene reacties steeg van 25% naar 70% bij meer dan vier

vaccinaties (Falvo en Horowitz., 1994).

2.4. Werking adjuvans

2.4.1. Algemene werking

Adjuvantia zijn cruciale en onmisbare componenten in vaccins. Bij geïnactiveerde vaccins bepalen zij

vaak het verschil tussen het wel of niet opbouwen van een effectieve immuniteit. Het is dan ook geen

toeval dat het woord van het Latijnse adjuvare komt, wat helpen betekent. Ze verhogen de efficiëntie

van het vaccin en is er minder antigeen nodig waardoor het vaccin goedkoper kan geproduceerd

worden. Sommige stimuleren enkel bepaalde delen van het immuunstelsel, zodat het gebruik van

verschillende adjuvantia samen voor een bredere stimulatie zorgen. Er moet verder nog onderzoek

gebeuren om tot nieuwe inzichten te komen vb. omtrent het combineren ervan. Men kan namelijk vaak

enkel met ‘trial en error’ tot bepaalde conclusies komen (Levast et al., 2014).

Naïeve T-cellen kunnen, i.t.t. geheugen en effector-lymfocyten, moeilijk bewegen in niet-lymfoïd

weefsel. Het adjuvans kan ervoor zorgen dat het antigeen naar de drainerende lymfeknoop gebracht

wordt. Men kan de werking van een toegevoegd adjuvans eigenlijk vergelijken met dentritische cellen,

die soms als natuurlijke adjuvantia worden aangeduid. Onrijpe dendritische cellen zitten klaar in de

weefsels om antigeen op te nemen en te presenteren aan en naïeve T-cellen te activeren. Een aantal

adjuvantia veroorzaken ook necrose van spiercellen en intramusculair oedeem, geassocieerd met een

influx van neutrofielen. De immuunrespons zou gerelateerd zijn aan deze veroorzaakte

weefselschade. Dit werd o.a. gezien bij adjuvantia die aluminiumhydroxide (Al(OH)3) en minerale olie

bevatten (bespreking zie 2.4.2 en 2.4.3). De rol van de geactiveerde inerleukines wordt weergegeven

in Figuur 8. Inflammatoire cytokines afkomstig van macrofagen of andere immuuncellen t.h.v. de

injectieplaats hebben een cruciale rol in het opwekken van een primaire immuunrespons. Bij ISCOMs

ziet men dan weer geen effect van toediening van het adjuvans en kort na injectie wordt dit zelfs niet

meer teruggevonden. Als men vit D3 of tocopherol gebruikt zijn er ook geen lokale effecten waar te

nemen (Cox et al., 2006). De werking van een adjuvans moet opgesplitst worden in verschillende

eigenschappen die verder besproken worden, enkele voorbeelden zijn terug te vinden zijn in Tabel 4.

27

De werking van de verschillende adjuvantia kan men ruwweg indelen in 5 categorieën:

immunoregulatie, presentatie, targeting, depot-effect en inductie van cytotoxische T cellen. Elk

adjuvans heeft zijn eigen specifieke werking (zie Tabel 4),

Door het stimuleren van bepaalde cytokines kan men de immuunrespons gaan beïnvloeden, maar ook

via down-regulatie van bepaalde andere cytokines. Na binding van CD4+ met een antigeen-

presenterende cel (met MHCII) verkrijgt men een T-Helper-1 (Th1) cel (celgemedieerd

immuunrespons, geassocieerd met o.a. Il-2, TNFα, TNFβ en γ-IFN) of een T-Helper-2 (Th2) cel

(humorale immuunrespons, geassocieerd met Il-4,5,6,13) (Cox en Coulter, 1997). Naast Th1 en Th2

zijn er nog tal van andere T-helper cellen. Er is nog sprake van Th3 cellen die betrokken zijn bij

mucosale immuniteit (Iwasaki, 2007). Th9 cellen maken Il-9 (rol bij wormbesmetting) (Schmitt et al.,

2014). Ontstaan van Th17 na vaccinatie zorgt voor een onstekingsreactie (productie van o.a. Il-17 en

Fig 8. Invloed van interleukines na vaccinatie (uit http://www.invivogen.com/review-vaccine-adjuvants).

28

belangrijk voor mucosale immuniteit (Bielinska et al., 2010)). Een adjuvans bepaalt ook, naast het

verhogen van de immuunrespons, het isotype van IgG en de mate van de CD4+-celgemedieerde

immuunrespons. Dit is uiteraard geen zwart-wit situatie, toch zijn er adjuvantia met een sterke invloed

in één bepaalde richting. Aluminium-zouten zijn hierbij een goed voorbeeld, deze zorgen voor meer

dan 90% voor een Th2 respons. Bacteriële endotoxines en derivaten zorgen dan weer meer voor een

Th1 respons.

De antigeen-presentatie houdt in dat de volledigheid van het antigeen bewaard blijft en dat de

presentatie gebeurt aan de geschikte cellen. Bepaalde epitopen worden dus effectiever aan deze

cellen gepresenteerd. Er zijn 3 soorten interacties. De eerste is met de antigeen-presenterende cellen

(langerhans-cellen, dendritische cellen en macrofagen). Na opname van het antigeen en presentatie

via het major histocompatibility complex II (MHCII) kan er een binding ontstaan met CD4+ T cellen. De

tweede interactie bestaat uit het antigeen en de B-cel. De herkenning tussen beide gebeurt via

oppervlakte-antistoffen en het antigeen. Via endocytose wordt antigeen opgenomen, verwerkt in het

endolysosoom en de bekomen peptides worden opnieuw gepresenteerd op het oppervlakte m.b.v.

MHCII. Finaal kan een T-helper cel zo zorgen dat de B-cel een plasmacel wordt om antistoffen te

produceren. De laatste interactie verloopt via folliculaire dendritische cellen die zorgen voor een

reservoir van het antigeen. Wanneer peptides van een antigeen via MHCI worden blootgesteld aan

het oppervlakte kan een krachtige cytotoxische T-cel respons ontstaan. Het aanwezige adjuvans kan

hierbij helpen via interactie met celmembranen zodat antigeen in het cytosol opgenomen kan worden

voor verdere verwerking. De cytotoxische T-cellen (afkomstig van CD8 cellen) kunnen dan na binding

aan hun doelwitcel apoptose induceren van deze laatste (Cox en Coulter, 1997). Een overzicht van de

antigeenpresentatie en de rol van cytokines wordt weergeven in Figuur 8.

Targeting houdt in dat een adjuvans het antigeen kan leveren aan de immuun-effectorcellen, meestal

via antigeen-presenterende cellen (APC). Zonder dit mechanisme gaat veel antigeen verloren via

protease degradatie of via de lever. Dit kan vb. via vorming van aggregaten die makkelijker

opneembaar zijn of via verzadiging van Kupffercellen in de lever zodat deze het antigeen niet

verwijderen (Cox en Coulter, 1997).

Het depot-effect kan kort of lang zijn. Aluminiumzouten zorgen voor een kort depot-effect. Het

antigeen wordt gedurende kortere tijd ter plekke vast gehouden zodat er geen clearance door de lever

kan gebeuren. Een lang depot-effect wordt gezien bij synthetische polymeren zoals het absorbeerbare

polylactide coglycolide. Olie-in-water adjuvantia daarentegen hebben een minder goed depot-effect

(Cox en Coulter, 1997).

29

Adjuvans Immunomodulatie Targeting Presentatie CTL stimulatie Depot

Aluminium zouten

sterke Th2, IgE + - - + ST(a)

W/o emulsie zwakke Th1 en Th2

- - - of +++ (b) +++ ST

O/w emulsie Zwakke Th1 en Th2

+ +++ - -

Er gebeuren veel experimenten om na te gaan welk adjuvans nu bij welk vaccin past. Vaak kent men

de volledige werking van een adjuvans niet zodat dit moet uitgetest worden. De invloed op

antistofproductie en spierirritatie van drie adjuvantia (paraffine olie, Al(OH)3 en een op lecithine-

gebaseerd olie) met een bacterin voor bescherming tegen Actinobacillus pleuropneumoniae werden

met elkaar vergeleken. Met een interval van 30 dagen werden 432 biggen tweemaal gevaccineerd.

Bacterins met Al(OH)3 of met op 5% lecithine gebaseerde olie als adjuvans resulteerden in het minste

weefselirritatie. Bacterins met paraffine olie of met op meer dan 20% lecithine gebaseerde olie

veroorzaken meer weefselschade (er werd zelfs af en toe een granuloom of abces waargenomen).

Niet onbelangrijk is ook dat de biggen die een bacterin krijgen met Al(OH)3 adjuvans een lagere

antistoffen titer hebben dan de groepen biggen die een bacterin krijgen met paraffine olie of met een

op lecithine gebaseerde olie (Straw et al., 1991).

Men kreeg gelijkaardige resultaten in een andere studie met een subunit vaccin tegen Actinobacillus

pleuropneumoniae. Verschillende adjuvantia werden getest. Minerale olie (Marcol-52) zorgde voor de

opbouw van een effectieve immuniteit, maar bij bepaalde varkens traden weefselreacties op. Gebruik

van Al(OH)3 resulteert in een lagere antistoffenrespons (Willson et al., 1995). In een proef bij schapen

werd ook de werking van verschillende adjuvantia getest. Hierbij ziet men dat na het gebruik van een

Quil A formulatie er hogere concentraties van IgM, IgG1 en IgG2 worden gezien dan bij Al(OH)3

(Rothel et al., 1998). Een proef eveneens bij schapen uitgevoerd onderzocht het effect van het soort

adjuvans met een Mond- en klauwzeer vaccinatie. Men ziet dat Montanide ISA206 (olie adjuvans) een

hogere en langere immuniteit gaf dan Al(OH)3 (Selim et al., 2010).

Tabel 4 Karakteristieken van enkele adjuvantia (uit Cox and Coulter, 1997).

ST(a), korte termijn (<2 week); (b) Goede CTL respons enkel voor uitwendig toegediende eiwitten

http://europepmc.org/abstract/med/2303384/?whatizit_url_Species=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=715&lvl=0



30

2.4.2. CIRCOVAC®

Circovac bevat ondermeer thiomersal, dit is een organische mercurial stof die in vaccins gebruikt

wordt. Thiomersal valt in het lichaam uiteen in ethylkwik en natriumthiosalicylaat. Het gebruik ervan is

omstreden en reeds vaak verboden. Er kunnen na blootstelling ook overgevoeligheidsreacties

ontstaan (http://www.fda.gov). Thiomersal wordt gebruikt om contaminatie van bacteriën, en

schimmels te voorkomen.Het is algemeen bekend dat ethylkwik en methylkwik nefro- en neurotoxisch

kan zijn, weliswaar in hogere dosis dan in het vaccin. (Hessel, 2003; Weisser et al., 2004). Verder

bevat het vaccin geïnactiveerd porcine circovirus type 2 (PCV2) in een olieachtig adjuvans. TS6, het

hoofdadjuvans van Circovac is een olie in water (O/W) emulsie die lichte-minerale olie (paraffine olie)

bevat. Het is een mineraalolie die geen dierlijke vetten bevat en bestaat uit organische

koolwaterstoffen met actieve paraffine-contaminanten. Algemeen gezien zullen olie adjuvantia het

antigeen beschermen tegen neutralisatie door humorale factoren of andere cellen die lichaamsvreemd

materiaal meteen vernietigen. Een deel van de minerale emulsie blijft aanwezig op de plaats van

injectie, een deel draineert echter wel snel naar de regionale lymfeklieren. Het nodige antigeen wordt

via deze minerale olie, dat optreedt als een beschermlaag, getransporteerd in het lymfesysteem en

Fig.10. Essentiële stappen van de werking van een adjuvans na vaccinatie.

(a) Na opname en transport is er presentatie door dendritische cellen in drainerende lymfeknoop. (b) Depot-effect. (c)

Activatie Pattern Recognition Receptors, zorgen voor cytokinevrijlating door aangeboren immuuncellen. (d) “Danger

signals” van beschadigd weefsel zorgen voor upregulatie van co-stimulerende molecules van APC. (e) Binding aan

Naïve T helper cel. (a), (b), (d) wordt door Al(OH)3 geïnduceerd. Olie-emulsies zorgen vooral voor (b) en (d). (uit Schijns,

2000).

31

stimuleert de antigeenproductie. Macrofagen spelen ook een rol in dit transportproces (Bijlsuiter

EMEA; Davenport en Arbor, 1961).

Olie in water (O/W) emulsies worden goed verdragen en tonen een lage viscositeit, ze induceren

echter wel een immuunrespons van korte duur. Ze worden geformuleerd met een kleine hoeveelheid

olie verspreid in de waterige fase. O/W emulsies zijn microdruppels van olie gestabiliseerd door

surfactants in een continue waterige fase. Ze zorgen voor een uitstekende antigeenpresentatie (in

tegenstelling tot Al-zouten) en voor matige targeting. De oliedruppels van een O/W emulsie associëren

minimaal met het antigeen. Een water in olie emulsie (W/O) resulteert echter in een hogere

immuunrespons dan O/W. Een W/O emulsie zorgt voor een depot-effect terwijl een O/W emulsie

eerder resulteert in een snelle verspreiding van het antigeen naar de drainerende lymfeknopen. Er is

interactie met de antigeenpresenterende cellen op de plaats van injectie en een betere efficiënte van

de antigeenpresentatie aan de T-cellen (Harold en Stills, 2005; Jansen et al., 2006). Een ander

typisch O/W adjuvans is MF59-adjuvans (dat o.a. squaleen olie druppels bevat, squaleen is een

precursor van cholesterol en andere steroïde hormonen). Er wordt verondersteld dat MF59 werkt via

chemokine immuunstimulatie om cellen aan te trekken uit de bloedbaan naar de plaats van injectie.

Ook het aantal antigeenpresenterende cellen worden hierdoor verhoogd. Wanneer afzonderlijke

componenten van MF59 worden toegediend bekomt men niet dezelfde effecten als wanneer men

gebruikmaakt van het gehele MF59-olie in water adjuvans (Calabro et al., 2013).

2.4.3. NEOCOLIPOR®

Aluminium componenten in vaccins, o.a. in NEOCOLIPOR, kunnen de opname door

antigeenpresenterende cellen stimuleren door te zorgen dat de concentratie antigeen ter hoogte van

de injectieplaats verhoogd wordt. Door de precipitatie en via elektrostatische krachten met het

antigeen wordt de eliminatie uitgesteld waardoor men een klein depot-effect verkrijgt. Het depot-effect

wordt in sommige studies echter in twijfel getrokken, sommige vermelden dat er een relatief snelle

opklaring gebeurt (Hogenesch, 2002). Na de eventuele depot-vorming en vorming van een

ontstekingsreactie t.h.v. de plaats van injectie is er een opname van het antigeen door

antigeenpresenterende cellen zoals macrofagen, dendritische cellen en B-cellen (Lambrecht et al.,

2009). Verder beïnvloeden ze de immuunrespons door directe en indirecte stimulatie van dendritische

cellen, chemokines en complementactivatie. Ze zijn echter niet in staat de belangrijke celgemedieerde

en cytotoxische T-cel respons te activeren. Effectieve bescherming tegen een brede waaier van

pathogenen vereist een Th1 en/of Th2 (humorale) immuunrespons. Het feit dat aluminiumhydroxide

amper het Th1 (celgemedieerd) type activeert heeft als gevolg dat men extra substanties kan

toevoegen voor een nog betere immuunstimulatie. Aluminiumbevattende vaccins kunnen dan ook

sterker gemaakt worden na toevoeging van co-adjuvantia. Aluminium bevattende adjuvantia

verdwijnen relatief snel, met een piekstijging in antistoffen drie weken na injectie (Harold en Stills,

2005).

32

Het begin van de immuunrespons gebeurt in de lymfeknopen die de plaats van vaccinatie draineren.

De dendritische cellen zorgen ervoor (via endocytose, pinocytose en fagocytose) dat antigeen de

lymfeknoop kan bereiken. Ze zorgen ook voor presentatie en activatie van naïeve antigeen-specifieke

T cellen. De activatie van deze cellen gebeurt niet op de plaats van injectie, wel in de drainerende

lymfeknopen. Al(OH)3 zou ook de expressie van MHII en andere verschillende co-stimulatoire

moleculen stimuleren op monocyten. Vele monocyten differentiëren dan ook in dendritische cellen.

Verder zorgt de injectie ook direct voor necrose, wat de dendritische cellen activeert. Dendritische

cellen helpen de CD4+ cellen om zich te vormen tot Th1 of Th2 cellen (Hogenesch, 2002).

De T-helper 2 immuunstimulatie waar Al(OH)3 voor zorgt is een antistof-gemedieerde respons met de

typische expressie van IL-4, IL-5 en IL-13 door de T-helper 2 cellen. (Hogenesch, 2002). Stimulatie

van de complementcascade door Al-adjuvantia is belangrijk voor o.a. de vorming van B-cellen. Verder

vond men dat co-administratie van IL-12 mét Al(OH)3 en antigeen bij muizen resulteerde in een

hogere antigeen-specifieke antistoffenrespons in vergelijking met alleen Al(OH)3 en het antigeen (Cox

en Coulter, 1997; Hogenesch, 2002). Al(OH)3 zorgt ook voor het opwekken van IL-1 (Schijns, 2000).

IL-1 is vaak een onmisbare factor voor de immuunrespons, afhankelijk van het species, met

bijhorende ontstekingsreactie. Het activeert de T-cellen, stimuleert verdere productie van cytokines en

in samenwerking met andere interleukines is er B-cel proliferatie. IL-1 heeft een belangrijke rol in de

niet-specifieke immuunrespons op weefselbeschadiging (er is effect op hepatocyten, endotheliale

cellen, fibroblasten enz.), IL-1β kan verder ook synthese induceren van cyclooxygenase-2 (COX-2),

type 2 fosfolipase A, Prastaglandine-E2, trombocyten-activerende factor en stikstofoxide. Hieruit kan

koort, hypotensie en vasodilatatie ontstaan. (Dinarello, 2009).

Aluminium heeft ook enkele nadelen: naast het feit dat er geen celgemedieerde of cytotoxische T-

celrespons is, is er bij bepaalde soorten antigeen een onvoldoende werking en is er soms een

tendens om IgE te produceren (deze laatste is soms de oorzaak van allergie). Door de afwezigheid

van de T-helper type 1 immuunrespons is het adjuvans minder goed bij gebruik in vaccins tegen tal

van virussen, intracellulaire bacteriën en enkele parasieten. Aluminium-adjuvantia worden reeds lang

gebruikt, echter het volledige mechanisme is lang niet gekend geweest en nog steeds niet alles is

geweten (Hogenesch, 2002). Wanneer een antigen met aluminium ingespoten wordt, worden cellen

van het aangeboren immuunsysteem aangetrokken na vrijlating van chemokines en cytokines door de

spiercellen. Bij weefselbeschadiging zou er ook een lokale vrijzetting zijn van urinezuur uit necrotische

cellen. Urinezuurkristallen zouden op hun beurt dan NALP3 inflammasoom (nucleotide-binding

oligomerization domain receptor, NOD-like receptor) activeren, dat een rol speelt in inflammatoire

proccessen. Na aankomst van de monocyten nemen deze het antigeen op en presenteren dit via

MHCI en MHCII op weg weg naar de drainerende lymfeknoop. Eenmaal in de lymfeknoop gaan de

rijpe dentritische cellen reageren met antigeen-specifieke T cellen die dan differentiëren in Th effector

cellen (Lambrecht et al., 2009).

33

3. MATERIAAL EN METHODES

3.1. Doel van de studie

Het doel van de studie is om te weten of het al dan niet gelijktijdig toedienen van vaccins invloed heeft

op de veiligheid en de opbouw van antistoffen. De studie werd goedgekeurd door de ethische

commissie van de faculteiten Diergeneeskunde en Bio-ingenieurswetenschappen, nummer 2014/117.

3.2. Bedrijf

Een varkensbedrijf werd uitgekozen waar 70 gezonde gelten geselecteerd werden voor de proef. Op

het bedrijf waren naast de opfokgelten nog melkkoeien aanwezig. Jonge fokgelten werden opgezet en

verkocht als fokzeug op een leeftijd van 220 dagen oud en 120-130 kg. De gelten waren afkomstig

van één ander bedrijf, gespecialiseerd in het kweken van fokzeugen, met een vier-wekensysteem. Op

het bedrijf werden strikte hygiënemaatregelen genomen. Er was eigen bedrijfskledij voorzien en

bezoekers werden gevraagd zich vooraf te douchen voor het betreden van de stal. Werkmateriaal

bleef in de stal aanwezig. Er was een speciaal krengenhuisje voorzien voor kadavers. De stal bestond

uit een tiental afdelingen met 180-200 dieren in elke afdeling. De gelten waren gehuisvest conform de

Europese richtlijnen en normen voor huisvestiging. Ze zaten per 14 in een hok waar voldoende

hokverrijking aanwezig was zoals kettingen en buizen. Er werd droogvoeder gegeven via

combibakken. Naast de voederbak was het drinkwater ter beschikking. De eerste vijf weken na opzet

kregen de gelten een commercieel biggenmeel, daarna werd overgeschakeld naar een specifiek

opfokmeel. Er was water ad libitum beschikbaar, het werd gezuiverd via lavastenen en bestond uit

regenwater dat gecombineerd werd met boorputwater. De dieren werden gehouden op een volrooster

en er werd gewerkt met kanaalventilatie, het bedrijf werkte ook met een luchtwasser. De gelten

hadden naast een Sanitel-nummer een tweede, goed leesbaar bedrijfsnummer.

3.3. Proefopzet

De gelten kregen geen vaccinaties als big en tijdens de proef werden geen andere vaccins

toegediend. Na spenen kregen de biggen ZnO in het speenvoeder en amoxicilline gedurende 2-3

weken. Na opzet in de varkensstal kregen de gelten levamisole toegediend via het drinkwater om de

vier-vijf weken. Voor de proef waren de gelten in dezelfde afdeling gehuisvest en opgesplitst in hokken

van 14 gelten. Hieruit volgde dat de gelten hetzelfde voeder en drinkwater krijgen. Ook zaken zoals

ventilatie, onderstaande mestkelder, lichtintensiteit, temperatuur, betreden van de afdeling door de

verzorger, waren hetzelfde voor de geselecteerde gelten. In één afdeling werden vijf hokken gekozen,

deze hokken waren in het midden van de afdeling zodat interferentie van binnenkomend zonlicht of

tocht via de deur werd voorkomen.

34

Voor de start van de proef werden binnen één hok telkens 14 gelten van 17 weken oud ad random

verdeeld in vier groepen via markering. Een overzicht van de vaccinatiegroepen is te zien in Tabel 5.

De gelten kregen volgende vaccinaties, telkens intramusculair (IM) in de nek (behalve de negatieve

controle groep):

- Groep 1, V1: kreeg een vaccinatie IM links tegen E. coli (Neocolipor). Gelten werden

gemarkeerd met blauw.

- Groep 2, V1+V2: Kreeg zowel een vaccinatie IM links tegen E. coli (Neocolipor) als een

vaccinatie IM rechts tegen PCV2 (Circovac). Gelten werden gemarkeerd met groen.

- Groep 3, V2: kregen een vaccinatie IM rechts tegen PCV2 (Circovac). Gelten werden

gemarkeerd met rood.

- Groep 4, C: kreeg geen vaccinatie en dient als controlegroep. Gelten werden gemarkeerd met

zwart.

Groep Vaccinatie Bloedname

Leeftijd 17w 20w 17w 20w 23w

1) V1 (n=20)

V1

V1

X

X

X

2) V1+V2 (n=20)

V1+V2

V1+V2

X

X

X

3) V2 (n=20)

V2

V2

X

X

X

4) Controle (n=10)

-

-

X

X

X

De gelten werden volgens dit protocol tweemaal gevaccineerd met drie weken tussentijd. De groepen

werden uiteraard behouden. Van de 70 gelten werd in totaal drie maal bloed genomen (210

bloedstalen in totaal) om de titer antistoffen tegen F4 en PCV2 te bepalen (Tabel 4). De bloedafname

gebeurde telkens net voor de geplande vaccinatie, met telkens drie weken tussentijd. De laatste

bloedafname was drie weken na de tweede vaccinatie. Voor het fixeren van de gelten werd een strop

van het eigen bedrijf gebruikt. Er werd gewerkt met 10 ml spuitjes (Terumo, 10 ml, Leuven, België)

met roze naald (Terumo, 18G, 50 mm, Leuven, België). Voor iedere gelt werd een nieuw spuitje met

nieuwe naald genomen. Het bloed werd opgevangen in serumbuizen (Vacutest serum, 9 ml, Kima,

Azergrande, Italië). De bloedstalen werden gecentrifugeerd bij 2000 rpm, gedurende een half uur. Het

serum werd bewaard in steriele eppendorfs (Safe-Lock Tubes 1.5 ml, Eppendorf®, Hamburg,

Duitsland) bij -20°C tot alle bloedstalen genomen waren. Stollingstijd van het bloed was ongeveer acht

uur.

Tabel (5): Overzicht van de verschillende vaccinatiegroepen tijdens de studie.

V1: Neocolipor®. V2: Circovac®. n= aantal dieren. X: bloedname.

35

3.4. De aangewende vaccins

3.4.1. NEOCOLIPOR®

Het vaccin Neocolipor bevat geïnactiveerde stammen van E. coli met bepaalde aanhechtingsfactoren.

Vaccinatie met Neocolipor kan een lichte verhoging van de lichaamstemperatuur van het dier

veroorzaken (minder dan 1,5°C gedurende een maximumduur van 24 uur). Wachttijd is nul dagen. Het

vaccin moet bewaard en getransporteerd worden aan een temperatuur tussen 2ºC en 8ºC. Het vaccin

mag niet in de diepvriezer bewaard worden en het moet beschermd worden tegen licht. Houdbaarheid

na het aanbreken van de injectieflacon is drie uur. Per dosis van 2 ml zijn volgende bestanddelen

aanwezig (1 SA.U: Hoeveelheid, voldoende om in cavia’s een agglutinatie-antilichaamtiter van 1 log

10 te verkrijgen) (http://bijsluiters.fagg-afmps.be/DownloadLeafletServlet?id=124861).

- E. coli aanhechtingsfactor F4 (F4ab, F4ac, F4ad), tenminste 2,1 SA.U

- E. coli aanhechtingsfactor F5, tenminste 1,7 SA.U



- Aluminium (als hydroxide) adjuvans: 1,4 mg.

3.4.2. CIRCOVAC®

Elke ml Circovac bevat als werkzaam bestanddeel 1,8 log10

Elisa Eenheden geïnactiveerd porcine

circovirus type 2. Als hulpstof bevat het vaccin 0,10mg thiomersal en als adjuvans 247 tot 250,5 mg

lichte paraffine olie.

Vaccinatie kan in uitzonderlijke gevallen een overgevoeligheidsreactie veroorzaken. Milde en

voorbijgaande lokale reacties kunnen optreden, deze bestaat vooral uit zwelling (tot gemiddeld 2 cm2)

en roodheid (tot gemiddeld 3 cm2), en in sommige gevallen oedeem (tot gemiddeld 17 cm

2). Deze

reacties verdwijnen spontaan na gemiddeld vier dagen. Post-mortem onderzoek van de injectieplaats

bij zeugen toont soms milde laesies, alsook necrose of fibrose. Binnen twee dagen volgend op de

injectie kan een gemiddelde verhoging van de rectale temperatuur (tot 1,4 °C) optreden. In zeldzame

gevallen is er een verhoging van de lichaamstemperatuur met meer dan 2,5 °C, die minder dan 24 uur

aanhoudt en kan een lichte apathie of een vermindering in eetlust opgemerkt worden die eveneens

verdwijnt. Zelden komt een voorbijgaande lichte apathie of een vermindering van eetlust voor.

Uitzonderlijk kan een abortus optreden na vaccinatie (www.ema.europa.eu). Het vaccin moet bewaard

en getransporteerd worden bij 2°C-8°C, tevens ook beschermen tegen licht en binnen drie uur na het

vermengen gebruiken. Wachttijd is nul dagen.

36

3.5. Onderzochte parameters

3.5.1. Anti-F4 antistoffentiterbepaling (ELISA)

De antistoffen tegen E. coli werden bepaald in het Laboratorium voor Immunologie van de faculteit

Diergeneeskunde te Merelbeke.

De serumstalen werden 1/15 verdund in het eerste cupje (kolom 1) en verder ½ uitverdund tot kolom

11, in kolom 12 werd enkel verdunningsvloeistof gedaan. De polysorp 96-well plaat werd gecoat met

α-F4 Mab (anti-F4 Monoklonaal Antibody), 1µg/ml en 100µl/cupje. De ongecoate cupjes werden

gecoat met met Bovine Serum Albumine (BSA) 1µg/ml. Na deze stap werd de plaat twee uur

geïncubeerd bij 37°C. De cupjes werden vervolgens geblokkeerd met 250 µl blokvloeistof

(Fosfaatbuffer PBS + 0,2% Tween®80 + 3% Bovine serum albumin BSA). Deze vloeistof werd aan alle

welletjes van de plaat toegevoegd. Na incubatie ‘s nachts in een koele kamer werd 3x gewassen met

wasvloeistof fosfaat gebufferde zoutoplossing + 0,2% Tween®20 (PBS + 0,2% TW20). In elk cupje

werd 100 µl toegevoegd van een F4 fimbriae oplossing (afkomstig van de F4 positieve bacterie Gis26)

aan een concentratie van 25 µg/ml. Deze fimbriae werden verdund tot deze 25 µg/ml oplossing in

verdunningsvloeistof bereikt (dit is PBS+ TW20 +3%BSA). Na 1 uur incubatie bij 37°C werd opnieuw

driemaal gewassen met wasvloeistof (PBS + 0,2% TW20). Als conjugaat werd een α-pig IgG H+L

HRP (horse radish peroxidase gelabeled secundair antibody) gebruikt aan een verdunning van 1/5000

en 100 µl per cupje. Na één uur incubatie bij 37°C werd opnieuw driemaal gewassen met wasvloeistof

(PBS + 0,2% TW20). Na toevoeging van 50µl ABTS per cupje (2,2'-Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-

6-sulfonic acid)-diammonium salt, een wateroplosbaar peroxidase substraat dat ervoor zorgt dat

eindproduct gemeten kan worden via groene kleurreactie) werd vervolgens 30 min geïncubeerd bij

37°C. Na 15 en 30 minuten werd de absorbantie van de lichtstraal gemeten met de spectrofotometer

bij 405 nm (OD of optische densiteit).

Alle ruwe data werden vervolgens bekeken in vergelijking met een berekende cut-off waarde: de

bekomen titer is de laagste waarde van de serumstalen die nog boven deze cut-off waarde uitkomt.

De cut-off waarde werd bekomen door het gemiddelde van het negatief serum van de verschillende

platen te nemen + 3x de standaard deviatie van deze negatieve stalen. Het negatief serum was

afkomstig van een varken waarvan geweten is dat de antistoffentiter laag was. Er werd eveneens een

positieve controle gebruikt: dit is serum van een varken met gekende hoge antistoftiter in bloed.

Tevens werden ook een tweetal ongecoate cupjes meegenomen om te zien of er een niet-specifieke

binding was doorgegaan.

37

3.5.2. Titerbepaling PCV2 (IPMA)

De PCV2 antistoffen werden bepaald in het laboratorium voor virologie van de faculteit

Diergeneeskunde te Merelbeke via Indirecte immunoperoxidase monolayer assay.

Eerst werd 100 µl paraformaldehyde (4%) in de droge platen gebracht met als doel de cellen te

fixeren. Hier werd gebruikgemaakt van de PK15 niercellijn. Na tien minuten werden de platen

afgeklopt en twee keer gewassen met een fosfaatbuffer (wPBS). Daarna volgde opnieuw een

fixatiestap met 100 µl methanol en waterstofperoxide (H2O2) (per 30ml methanol voegt men 1 ml

H2O2toe). Methanol werd gebruikt om de cellen te openen om zo de antistoffen te kunnen opnemen.

Na deze stap werden de platen opnieuw afgeklopt en tweemaal gewassen met wPBS. Vooraf werden

er twaalf verdunningen gemaakt van het serum. De eerste verdunning (1/10) bestaat uit 10 µl serum

met 90µl van een verdunningsbuffer (bestaande uit 89 ml zoute PBS, tien ml negatief geitenserum en

één ml zeepoplossing Tween). De volgende verdunning bestaat uit 25µl van de 1/10 verdunning met

75 µl verdunningsbuffer. Op deze manier werd doorgegaan voor de hele verdunningsreeks.

Nu werden deze primaire antistoffen toegevoegd (telkens 50 µl) bij de eerder genoemde cellen. Men

begon eerst met het toevoegen van de hoogste verdunningen (met minst aantal antistoffen) en

eindigde bij de verdunningen met de hoogste concentratie aan antistoffen. Deze werden gedurende

één uur op 37°C bewaard. Daarna werden de platen afgeklopt en gewassen met wPBS en Tween 80.

Na vijf minuten werden de secundaire antistoffen toegevoegd. Deze antistoffen, peroxidase-

geconjugeerde geit-anti-varken IgG’s (1:500), werden gebonden op de primaire antistoffen. Eén uur

later werden de platen afgeklopt en 2x gewassen met wPBS met Tween 80 bij 37°C. Tenslotte moest

de reactie zichtbaar gemaakt worden. Dit gebeurde door toevoeging van een 50 µl substraat dat

bestaat uit Na-acetaat buffer, AEC (0,080g 3-amino-9-ethylcabazole + 20 ml dimethylformamide) en

H2O2. Tenslotte werd het substraat na 20 minuten afgeklopt en werd 100 µl acetaat buffer toegevoegd

om de reactie te stoppen. Als er een reactie was, dan was er een rode kleurreactie ontstaan. Onder

Fig.11 Overzicht cupjes anti-F4 ELISA met verschillende verdunningen , positeve controle en negatief serum

38

een microscoop werden de platen bekeken en men ging op zoek naar de verdunning die geen

kleurreactie meer gaf. De verdunning net voor deze voorgenoemde bepaalde dan de antistoffentiter

van het serum (laatste kleurreactie te zien bij de 8ste

verdunning = titer van 163840).

3.5.3. Rectale temperatuur

Op 0 uur en op 24 uur na elke vaccinatie werd de rectale temperatuur van ieder varken gemeten. De

temperatuur werd gemeten met geijkte digitale thermometers.

3.5.4. Eetlust

Om een idee te hebben over de invloed van de vaccinatie op de eetlust van de varkens werd op 0 uur

en 24 uur na elke vaccinatie de buikvulling van ieder individueel varken visueel beoordeeld. Een score

van 0 werd gegeven wanneer de buik weinig was gevuld. Een score van 1 werd toegekend wanneer

een goede buikvulling werd gezien. Een score van 2 werd gegeven wanneer een zeer goede

buikvulling werd gezien.

3.5.5. Lokale huidreacties

Deze huidreacties werden ingedeeld volgens een 4-score schaal (afwezig, mild, matig, ernstig):

telkens op 0 uur, 1 uur, 6 uur, 24 uur en 72 uur na de eerste én tweede vaccinatie. Ook vlak voor de

derde bloedafname werd de huidscore bepaald (dag 42 na eerste vaccinatie). Deze scores waren

gebaseerd op een studie van Wilson et al. (1995) en de palpatie en observatie gebeurde telkens door

dezelfde persoon. Score 0 is een indicator voor normaal weefsel, score 1 werd gegeven aan letsels

met verdikking van 1-4cm³ met al dan niet verkleuring, score 2 werd gegeven aan letsels van 5-10 cm³

met al dan niet verkleuring, score 4 betekende een abces of nodulair letsel. Deze bovengenoemde

parameters (rectale temperatuur, eetlust, lokale huidreacties) werden telkens opgevolgd door dezelfde

persoon. Deze persoon was verschillend van de persoon die de vaccins toediende. Bijgevolg verliep

de studie blind.

Fig.12 Uitslag IPMA test PCV2 met rode kleurreactie (21/10/2014)

39

3.6. Statistische analyses

De onafhankelijke variabele was de parameter ‘groep’. Als onbekende variabelen of uitkomstvariabele

werden de temperatuur en de antistoffentiter op de verschillende tijdspunten als hoofdparameters

aangeduid. Daarnaast werden ook de huidscores en eetlustscore op de verschillende tijdspunten na

vaccineren en/of bloedafname tot de uitkomstvariabelen gerekend. Allereerst werden de

beschrijvende waarden van de data bekeken (Microsoft Excel, 2010). Vervolgens werd overgegaan

naar de statistische testen. De continue data (temperatuur en antistoffen titer) werden geanalyseerd

door middel van one way ANOVA. De data van de antistoffentiters werden log-getransformeerd om

normaal verdeelde data te verkrijgen. Om een ANOVA uit te voeren moet er homogeniteit zijn van

varianties. Dit werd bekeken door “levene statistic” (>0,01). Om groepen met elkaar te kunnen

vergelijken werd een “post-hoc test” uitgevoerd. Hier werd gekozen voor Scheffé, zodat alle groepen

onderling met elkaar konden vergeleken werden. Wanneer P < 0,05 was er een significant verschil

tussen twee groepen. Voor de parameter “temperatuur 2e vaccinatie op 24h” werd gebruikgemaakt

van een non-parametrische statistiek (hier: Kruskal-Wallis) omdat de voorwaarde voor het uitvoeren

van ANOVA niet voldaan was (Levene statistic <0,01). De parameters buikvulling en huidscore

werden getransformeerd naar binaire data (0 of 1). Voor buikvulling bleef 0 de score 0 behouden en 1

of 2 kreeg de score 1. Voor de parameter huidscore bleef score 0, 0 behouden en 1, 2 of 3 kreeg

score 1. De data werd geanalyseerd met logistische regressie. De analyses van de continue data

werden uitgevoerd in SPSS 22.0 (IBM SPSS Statistics for Windows, Version 22.0. Armonk, NY: IBM

Corp). De analyses van de binaire data werden uitgevoerd met R studio versie 3.1.2 (Boston,

Massachusetts).

4. RESULTATEN

4.1. Antistoffentiter en temperatuur (continue data)

ANTISTOFFENTITER TEGEN F4

Tijdens de eerste bloedafname op 17 weken werden geen significante verschillen in antistoffentiter

tussen de groepen waargenomen. Bij alle groepen kon men hierna een stijging waarnemen van de

antistoffentiter tegen F4 uitgezonderd bij de controlegroep die niet gevaccineerd werd. Groep 2

(combinatie van Neocolipor en Circovac) vertoonde een significant hogere titer in vergelijking met

groep 1 (enkel Neocolipor) en de overige groepen op 20 en op 23 weken leeftijd. Een vreemde

vaststelling was de antistoffentiter in groep 3 op 20 en op 23 weken. Deze groep kreeg enkel

Circovac, echter er werden toch antistoffen tegen F4 waargenomen. De antistoffentiter van groep 1

(Neocolipor) was enkel numeriek hoger in vergelijking met groep 3 (Circovac) op 20 weken en was

zelfs numeriek lager in vergelijking met groep 3 op 23 weken. Deze bovenstaande gegevens worden

40

geïllustreerd in Figuur 13 en weergegeven in Tabel 6.1. De non-log getransformeerde data kunnen

geraadpleegd worden in Tabel 7.

ANTISTOFFENTITER TEGEN PCV2

Tijdens de eerste bloedafname vertoonden de groepen geen significante verschillen in de

antistoffentiter tegen PCV2. Wanneer er gekeken werd naar de antistoffentiter gericht tegen PCV2

was er een stijging waar te nemen bij alle groepen, echter eveneens bij de negatieve controlegroep,

alhoewel de titer steeds significant het laagst bleef in de controlegroep op 20 weken. Op 23 weken

vond men de laagste antistoffentiter tegen PCV2 in de controlegroep, echter enkel met groep 3

(Circovac) was er een significant verschil. De antistoffentiter van groep 3 (Circovac) was telkens hoger

dan deze van groep 2 (Neocolipor+Circovac) op 20 en 23 weken, echter dit verschil was niet

statistisch significant op 20 en 23 weken. De log waarden van de antistoffentiter tegen PCV2 worden

geïllustreerd in Figuur 14 en weergegeven in Tabel 6.1. De non-log getransformeerde data kunnen

geraadpleegd worden in Tabel 7.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4 lo

g-w

aard

e a

nti

-F4

an

tist

off

en

tite

r

Leeftijd (weken)

Groep 1

Groep 2

Groep 3

Groep 4

17 20 23

Fig.13 Log-waarde antistoffentiter tegen de F4 fimbriae van E.coli

Eerste vaccinatie (bloedafname) op de leeftijd van 17 weken. Tweede vaccinatie (bloedafname) op de leeftijd van 20 weken.

Derde bloedafname vond plaats op de leeftijd van 23 weken.

Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie met Neocolipor en Circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac en

groep 4: controle groep, geen vaccinatie

Verschillende letters wijzen op een statistisch verschil (P<0.05) tussen de groepen

41

Groep Log F4

17 w

Log F4

20 w

Log F4

23 w

Log PCV2

17 w

Log PCV2

20 w

Log PCV2

23 w

1 1,59±0,38a

2,24±0,64a 2,89±0,31a 2,05±0,51a 4,01±1,05a 5,00±0,53ab

2 1,71±0,42a

2,79±0,57b 3,45±0,28b 2,41±0,90a 4,52±0,79ab 5,36±0,33ab

3 1,77±0,33a

2,10±0,53ac 2,95±0,39a 2,44±0,79a 4,83±0,61b 5,40±0,57a

4 1,93±0,30a

1,51±0,44c 1,.57±0,29c 2,38±0,64a 3,05±0,71c 4,85±0,42b

Wanneer de data van de temperaturen op 0 uur na de eerste vaccinatie werden bekeken (17 weken

leeftijd), zag men enkele significante verschillen tussen de groepen. Vervolgens zag men 24 uur na de

eerste vaccinatie en 0 uur na de tweede vaccinatie geen significante verschillen optreden tussen de

verschillende groepen. Op 24 uur na de tweede vaccinatie (20 weken) ziet men dat in de groepen die

Circovac kregen (groep 2: Circovac + Neocolipor en groep 3: Circovac) de temperatuur significant

hoger was in vergelijking met de andere twee groepen. Tussen groep 2 en groep 3 was er echter

geen significant verschil zichtbaar. Deze bovenstaande gegevens worden geïllustreerd in Figuur 15 en

weergegeven in Tabel 6.

0

1

2

3

4

5

6

loga

ritm

e v

an a

nti

sto

ffe

nti

ter

te

gen

PC

V2

Leeftijd (weken)

Groep 1

Groep 2

Groep 3

Groep 4

17 20 23

Fig.14 Logaritmische waarden van de antistoffentiter tegen PCV2 bij 70 gelten (4 groepen):

Eerste vaccinatie (bloedafname) op de leeftijd van 17 weken. Tweede vaccinatie (bloedafname) op de leeftijd van 20

weken. Derde bloedafname vond plaats op de leeftijd van 23 weken.

Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie met Neocolipor en circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac en

groep 4: controle groep, geen vaccinatie


Tabel (6.1): Overzichtstabel serum titers tegen F4 van E. coli en PCV2 van de vier groepen op

verschillende leeftijd

Verschillende superscripts in een kolom wijzen op een statistisch verschil (P<0.05) tussen de groepen Log F4: logaritme van de antistoffentiter gemeten tegen de F4 fimbriae van E. coli ± de standaard deviatie Log PCV2: logaritme van de antistoffentiter gemeten tegen PCV2 W: weken,T°: temperatuur, H: uur Groep: de verschillende groepen die deelnamen aan de studie. Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie met Neocolipor en Circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac, groep 4: controlegroep, geen vaccinatie.

42

Groep T (°C)

17 w

0h

T (°C)

17 w

24h

T (°C)

20 w

0h

T (°C)

20 w

24h

1 40,0 ±0,25ab 39,5± 0,24a 39,3± 0,20a 39,3± 0,22a

2 40,2± 0,22a 39,6± 0,24a 39,3± 0,22a 40,2± 0,83b

3 39,8± 0,29b 39,5± 0,25a 39,4± 0,24a 40,0± 0,68b

4 39,6± 0,22c 39,4± 0,21a 39,3± 0,31a 39,2± 0,25a

38,6

38,8

39,0

39,2

39,4

39,6

39,8

40,0

40,2

40,4

0 24 0 24

Tem

pe

ratu

ur

(°C

)

Uur na vaccinatie

Groep 1

Groep 2

Groep 3

Groep 4

Fig.15 De lichaamstemperaturen op 0 en 24 uur na beide vaccinatiedagen

Groep 1: vaccinatie tegen Neocolipor, groep 2: vaccinatie tegen Neocolipor en circovac, groep 3: vaccinatie

tegen Circovac en groep 4: controle groep, geen vaccinatie


Tabel (6.2): Overzichtstabel temperatuur in °C 0h en 24h na vaccinatie

Verschillende superscripts in een kolom wijzen op een statistisch verschil (P<0.05) tussen de groepen

T: temperatuur, h: uur, W: weken leeftijd

Groep: de verschillende groepen die deelnamen aan de studie. Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie met

Neocolipor en Circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac, groep 4: controlegroep, geen vaccinatie.

43

Groep Titer F4

17 w Titer F4

20 w Titer F4

23 w Titer PCV2

17 w

Titer PCV2

20 w

Titer PCV2

23 w

1 59 ± 68 422 ± 581 972 ± 620 220 ± 254 68650 ±

149214 171520 ±

177420 2 81 ± 102 1181 ± 1289 3456 ± 2360 3262 ± 9393 92296 ±

146394 305152 ±

236784 3 76 ± 55 272 ± 456 1314 ± 1245 2818 ± 9252 145651 ±

190874 901120 ±

2392218 4 99 ± 39 51 ± 50 44 ± 22 1204 ± 3179 2992 ± 3955 99328 ±

68616

4.2. Buikvulling en huidscore (binaire data)

Er werden geen significante verschillen aangetroffen tussen de verschillende groepen op 0 en 24 uur

na beide vaccinatiedagen op respectievelijk 17 en 20 weken. Dus alle groepen vertoonden een goede

buikvulling na vaccinatie. De beschrijvende waarden kunnen teruggevonden worden in Tabel 8. Voor

de β0, β1 en odds ratio’s wordt verwezen naar bijlage 2 aangezien geen significante verschillen terug

te vinden waren.

Groep 17 w

0 h

17 w

24 h

20 w

0 h

20 w

24 h

1 90 100 100 100

2 100 95 100 90

3 90 95 100 90

4 90 100 100 100

Tabel (7): Overzichtstabel non-logaritmisch getransformeerde titer tegen F4 van E. coli en PCV2 van de vier groepen op verschillende leeftijd

F4: antistoffentiter gemeten tegen de F4 fimbriae van E. coli ± de standaard deviatie van de log titer

PCV2: antistoffentiter gemeten tegen PCV2

W: weken leeftijd



W: weken leeftijd

H: uur na vaccinatie

Een buikvulling score werd gegeven als volgt: 0 voor varkens met ongevulde buik, 1 voor varkens met goedgevulde buik op 0

h en 24 h na de eerste vaccinatie en de tweede vaccinatie. Groep: de verschillende groepen die deelnamen aan de studie.

Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie met Neocolipor en Circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac, groep

4: controlegroep, geen vaccinatie.

Tabel (8): Overzichtstabel beschrijvende waarden voor buikvulling (%)

44

Bij de controlegroep werden geen reacties links waargenomen. Bij groep 3 (die enkel rechts Circovac

kreeg) werd 1 uur na eerste vaccinatie en vlak voor tweede vaccinatie bij 5% van de gelten een

huidreactie waargenomen. Na vaccinatie links met Neocolipor werd 1h, 6h na eerste vaccinatie en 6h,

24h na tweede vaccinatie een huidreactie waargenomen bij 35-50% van de gelten. Wanneer de gelten

een simultane vaccinatie kregen zowel links als rechts werd 1h, 6h, 24h, 72h na eerste vaccinatie en

1h, 24h na tweede vaccinatie een huidreactie waargenomen bij 10-25% van de gelten. Bij dezelfde

groep hadden 60% van de gelten een huidreactie 6h na tweede vaccinatie. De huidscores rechts

werden ook bekeken. Bij de controlegroep werd enkel 1h na vaccinatie een huidreactie waargenomen

bij 10% van de gelten, de overige tijdstippen was dit steeds 0. Bij de groep die links de vaccinatie

kreeg werden geen huidreacties gezien. Verder werd bij de groep die langs beide kanten een

vaccinatie kreeg 1h, 72h na eerste vaccinatie en 1h na tweede vaccinatie bij 15-20% van de gelten

een reactie waargenomen. Op 6h, 24h na eerste vaccinatie en 72h na tweede vaccinatie werden

huidreacties gezien bij 50-60% van de gelten. Het hoogste percentage huidreacties zag men 6h en

24h na de tweede vaccinatie (85-90%). Tenslotte was er bij groep 3 1h, 72h na eerste vaccinatie en

1h na tweede vaccinatie een reactie te zien bij 5-20% van de dieren. 6h, 24h na eerste vaccinatie en

6h, 24h en 72h na tweede vaccinatie was er bij 40-70% van de gelten eveneens een reactie waar te

nemen. Resultaten van de huidscores zijn terug te vinden in Tabel 9 (links) en Tabel 10 (rechts).

Eerste vaccinatie

Tweede vaccinatie

Groep 17 w 0h

17 w 1h

17 w 6h

17 w 24h

17 w 72h

20 w 0h

20 w 1h

20 w 6h

20 w 24h

20 w 72h

23 w 0h

1 0 40 50 5 5 0 5 45 35 10 0

2 0 20 20 15 10 0 15 60 25 5 0

3 0 5 0 0 0 5 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabel 9: Huidscore (%) links in de vier groepen op verschillende tijdstippen na vaccinatie

Een huidscore werd gegeven als volgt: 0 voor geen huidletsel, 1 voor de aanwezigheid van een huidletsel (roodheid,

verhevenheid, papel,..). Deze score werd uitgevoerd op de dag van de eerste vaccinatie en tweede vaccinatie op

respectievelijk16 weken (w) en telkens op 19 w op 0, 1, 6, 24 en 72 h na vaccinatie.



W: weken leeftijd


45

Eerste vaccinatie

Tweede vaccinatie

Groep 17 w 0h

17 w 1h

17 w 6h

17 w 24h

17 w 72h

20 w 0h

20 w 1h

20 w 6h

20 w 24h

20 w 72h

23 w 0h

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 0 20 50 50 15 0 20 85 90 60 5

3 0 20 40 50 15 0 10 65 70 55 5

4 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Wat betreft de resultaten van de statistische analyse van de huidscores werden ook hier geen

significante verschillen gezien. De reden voor de discrepantie tussen de beschrijvende waarden en

het niet optreden van significante verschillen tussen de groepen is de zeer hoge standaarddeviatie die

voor veel parameters bekomen wordt. In Bijlage 1 kan de tabel met de uitkomsten van de logistische

regressie geraadpleegd worden.

Tabel 10: Huidscore (%) rechts in de vier groepen op verschillende tijdstippen na vaccinatie

Een huidscore werd gegeven als volgt: 0 voor geen huidletsel, 1 voor de aanwezigheid van een huidletsel (roodheid,

verhevenheid, papel,..). Deze score werd uitgevoerd op de dag van de eerste vaccinatie en tweede vaccinatie op

respectievelijk16 weken (w) en telkens op 19 w op 0, 1, 6, 24 en 72 h na vaccinatie.

Groep: de verschillende groepen die deelnamen aan de studie. Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie

met Neocolipor en Circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac, groep 4: controlegroep, geen vaccinatie.

W: weken leeftijd


46

5. BESPREKING

In de praktijk komt het courant voor dat verschillende vaccins samen gegeven worden omwille van

verschillende redenen. Het doel van deze studie was om na te gaan of hieraan nadelen verbonden

waren op vlak van veiligheid en meer specifiek of er interferentie was op vlak van de

antistoffenopbouw van twee bepaalde vaccins (met verschillend adjuvans) die simultaan gegeven

werden links en recht. Er werd ook rekening gehouden met eventuele neveneffecten. Hiervoor werd

onderzocht of de rectale temperatuur al dan niet stijgt na gelijktijdige toediening. In deze proef werden

verder ook buikvulling (parameter voor eetlust) en huidreactie geregistreerd. Alle parameters werden

blind bepaald. Er werd gebruikgemaakt van twee vaccins die vaak voorkomen in de praktijk:

Neocolipor (ter preventie van neonatale diarree) en Circovac (bescherming tegen infecties met PCV2).

De werkzaamheid van beide vaccins werd reeds voldoende bewezen.

Een proefopzet met de combinatie Circovac en Neocolipor werd bij ons weten nog niet eerder

uitgevoerd. Om te weten of er interferentie kan zijn is het belangrijk om de serologische respons op te

volgen aangezien dit ons een idee heeft over de mate van bescherming. Vele studies bewezen reeds

dat er geen nadeel was in antistoffenrespons wanneer meerdere vaccins samen gegeven werden. Het

is belangrijk te kijken hoe de vaccins gegeven worden, er kan een verschil zijn als deze op

verschillende plaatsen of samen op dezelfde plaats gegeven worden. Bij de meeste onderzochte

studies werden deze op verschillende plaatsen gegeven. Bij de proef van Kristensen et al. (2004) was

er geen nadeel in serologische respons wanneer drie vaccins samen gegeven werden. Er waren ook

geen nadelige effecten vastgesteld bij tal van andere studies (Herbich et al., 2013; Stricker et al.,

2013; De Clerck et al., 1989). Bij andere diersoorten werden ook gelijkaardige studies uitgevoerd met

opnieuw het resultaat dat er geen nadeel was in opbouw van antistoffen (Joseph et al., 1984; Elham

et al., 2008; Altaf et al., 2012). Natuurlijk moet men kritisch blijven en zijn niet alle resultaten zomaar

extrapoleerbaar naar andere situaties. Sommige combinaties kunnen niet vergeleken worden met

andere omwille van vb. verschillende adjuvantia aanwezig in het vaccin, een andere

gezondheidsstatus op het bedrijf enz. In deze proef werd de tweede vaccinatie (booster) aan dezelfde

zijde gegeven, echter in de praktijk zal dit vaak niet het geval zijn.

In deze studie werden de antistoffen opgevolgd tegen zowel E. coli als PCV2. Er werd geen nadeel

vastgesteld voor het opbouwen van antistoffen na de simultane vaccinatie t.o.v. enkelvoudige

toediening. Hoogstwaarschijnlijk was er dus geen interferentie in de opbouw van antistoffen tussen

beide vaccins. Het was zelfs zo dat er na simultane vaccinatie een significant hogere titer waar te

nemen was tegen E. coli drie weken na de eerste én na tweede vaccinatie in vergelijking met

enkelvoudige toediening van het vaccin. Bij vaccinatie met Circovac was de gemiddelde titer tegen

PCV2 na simultane vaccinatie lager dan na enkelvoudige toediening maar dit verschil was niet

significant. Dit komt waarschijnlijk door een tweetal varkens uit groep drie (enkelvoudige vaccinatie

tegen PCV2) die een extreem hoge titer hadden ontwikkeld tegen PCV2 en die het gemiddelde naar

boven trokken. Tijdens de proef is er hoogstwaarschijnlijk een veldinfectie geweest met PCV2. Uit de

resultaten bleek namelijk dat er een stijging was van antistoffen tegen PCV2 drie weken na de tweede

47

vaccinatie bij zowel de controlegroep als de groep die enkel een vaccin tegen E. coli kregen.

Nochtans werden de hygiënische voorschriften in acht genomen, maar dat neemt niet weg dat PCV2

vaak circuleert op de bedrijven. Op veel bedrijven kunnen antistoffen tegen PCV2 waargenomen

worden (Grau-Roma et al. 2011). Een gelijkaardig fenomeen werd vastgesteld bij de titer tegen E. coli.

Drie weken na de tweede vaccinatie was er een stijging van anti-F4 te zien bij de groep 3 die enkel

een vaccin tegen Circovac had gekregen, het verschil in titer was significant t.o.v. de controlegroep.

Door het vele contact tussen de onderzoekers en de varkens kan het zijn dat E. coli via mest meer

verspreid werd tijdens de proef. Immers voor het bepalen voor de huidreacties was er veel contact met

de varkens.

De groep die de combinatie van beide vaccinaties kreeg in deze proef had een significant hogere titer

tegen E. coli drie weken na eerste en na tweede vaccinatie dan de groep die een enkelvoudige

vaccinatie had gekregen. Dit resultaat werd ook vastgesteld in een gelijkaardige proefopzet waar

gevaccineerd werd tegen Mond- en klauwzeer en tegen Klassieke varkenspest. In deze laatste studie

werd gesuggereerd dat het adjuvans saponine, aanwezig in het Mond- en klauwzeervirus vaccin, de

oorzaak zou zijn van een hogere antistoffentiter tegen Klassieke Varkenspest (De Clerck et al., 1989).

Saponine kan zowel de celgemedieerde als humorale immuunrespons stimuleren zodat er een

bredere respons ontstaat, ook tegen Klassieke Varkenspest. Bij andere diersoorten werd ook soms

een hogere antistoffentiter gezien na simultane vaccinatie. Bij konijnen zag men dat eiwitten uit het

vaccin tegen Mond- en klauwzeer virus ervoor zorgden dat Th-cellen cytokines produceerden waarvan

hun werking niet specifiek was. Daardoor werden de door LPS (aanwezig in het andere vaccin)

geactiveerde B-cellen extra gestimuleerd waardoor hogere antistoffen opgebouwd werden die langer

aanwezig bleven (zie eerder) (Altaf et al., 2012).

Het vaccin Neocolipor bevat als adjuvans Al(OH)3. Dit adjuvans is weinig in staat de belangrijke

celgemedieerde (Th1) of cytotoxische T-cel respons te activeren. Effectieve bescherming tegen een

brede waaier van kiemen vereist een Th1 (T-Helper-1) en/of Th2 (humorale) immuunrespons (Harold

en Stills, 2005). In de literatuur zijn verschillende proeven te vinden bij varkens waar de werkzaamheid

van het adjuvans Al(OH)3 getest werd, over het algemeen werd een minder goede werking gezien in

vergelijking met andere adjuvantia (paraffine olie, minerale olie) gebruikt in de desbetreffende studies

(Straw et al., 1991; Willson et al., 1995). Gelijkaardige resultaten werden gezien bij andere diersoorten

(Rothel et al., 1998; Selim et al., 2010). Het vaccin Circovac bevat als adjuvans paraffine olie, het is

een olie-in-water emulsie (o/w). Bij enkele studies werd dit adjuvans vergeleken met Al(OH)3. Hier

kwam men vaak tot de vaststelling dat paraffine olie een relatief betere adjuvans-werking had (o.a.

een betere antigeenpresentatie). Een nadeel was dat er soms meer weefselreactie was. Dit weet men

aan de olie (Straw et al., 1991; Spickler en Roth, 2003; Calabro et al., 2013). Olie-in-water emulsies

worden over het algemeen goed verdragen en induceren een relatief kortere immuunrespons. Bij het

gebruik van o/w emulsie ziet men dat er een aantrekking en interactie is met antigeenpresenterende

cellen ter hoogte van de injectieplaats. Wanneer er drainage gebeurt naar de bijhorende lymfeknoop

verhoogt de efficiëntie van de antigeenpresentatie aan de aanwezige T-cellen. De o/w emulsie zou

ook type I interferon kunnen opwekken, een belangrijk cytokine in het immuunsysteem (Jansen et al.,

48

2006). Hoewel de nadruk bij o/w emulsie meer ligt op stimulatie van de Th2 cellen, kon men bij

Circovac ook opbouw van een celgemedieerde immuniteit aantonen. Hierdoor kan ook een bredere

immuunrespons ontstaan. (Charreyre et al., 2011). Het is bewezen dat Circovac resulteert in stimulatie

van neutraliserende antistoffen en interferon-γ-secreterende cellen. Deze laatste cellen spelen ook

een belangrijke rol in de celgemedieerde immuunrespons (Won Seo et al., 2014).

Al deze voorgaande gegevens zouden kunnen verklaren waarom er na simultane vaccinatie een

sterkere opbouw is van antistoffen tegen E. coli en dat er een bredere stimulatie is van het

immuunstelsel na simultane vaccinatie. Men kan zeggen dat de werking van Neocolipor mogelijk

versterkt wordt door (het aanwezig adjuvans in) Circovac. Het is mogelijk dat dit olie-adjuvans een

sterker stimulans is voor o.a. antigeen presenterende cellen dan het adjuvans Al(OH)3, met als gevolg

dat het vaccin Neocolipor hiervan ‘profiteert’. Daarbij komt dat Circovac ook de belangrijke

celgemedieerde immuniteit meer kan stimuleren i.t.t. Neocolipor.

Het is ook belangrijk om eventuele nevenwerkingen te onderzoeken. In een studie bij de mens met

toediening van verschillende vaccins werden meer neveneffecten en algemene klachten

waargenomen. Bij de proef van Kristensen et al. (2004) werd twaalf uur na eerste vaccinatie een

significant hogere temperatuur waargenomen in de groep die drie vaccins simultaan kreeg t.o.v. de

groepen die maar 1 vaccin kreeg. Het belang van lichaamstemperatuur als reactie op het vaccin mag

niet onderschat worden. Hoge temperaturen kunnen bij drachtige zeugen zorgen voor abortus, maar

kunnen algemeen ook zorgen voor lagere voederopname en mindere prestaties. Er zijn enkele

significante verschillen in temperatuur waargenomen in de meting vlak voor eerste vaccinatie. Dit kan

veroorzaakt worden door een stressreactie als gevolg van het eerste contact tussen de onderzoekers

en de varkens. De dag na eerste vaccinatie (24h) en vlak voor de tweede vaccinatie (0h) werden geen

significante temperatuurverschillen meer waargenomen tussen de verschillende groepen, dit kan te

wijten zijn aan het optreden van gewenning bij de gelten t.o.v. de onderzoekers zodat minder stress

ontstaat. Na de tweede vaccinatie (24h) hadden groep twee en drie (die beide Circovac kregen) een

hogere temperatuur dan groep één (die enkel Neocolipor kreeg) en de controlegroep vier. De bijsluiter

van Circovac vermeldt inderdaad dat er een tijdelijke verhoging kan optreden na vaccinatie. Dat er een

significant verhoogde temperatuur was na simultane vaccinatie met Circovac en Neocolipor in

vergelijking met enkelvoudige toediening van Neocolipor 24 uur na tweede vaccinatie (40,2 ± 0.83°C

versus 39,3 ± 0.22°C) mag dus ook niet uit het oog verloren worden. Als parameter voor

nevenreacties werd ook de buikvulling opgevolgd, hier werden geen significante verschillen

waargenomen. Op vlak van huidreacties werden ook geen significante verschillen gezien.

Oorspronkelijk werd een score gegeven van nul tot en met drie naar gelang de ernst van de letsels,

echter de scores twee en drie kwamen zelden voor. Voor de statistische verwerking van de gegevens

werden de niet binomiale data omgevormd naar binomiale data zodat hier gewerkt werd met score nul

en één.

Naast de eventuele verworven neveneffecten kunnen er andere nadelen gezien worden na simultane

toediening. Teveel vaccins op korte tijd zou het immuunsysteem misschien kunnen “overbelasten”.

Echter bij kinderen zag men dat het immuunsysteem een enorme capaciteit heeft om te reageren op

49

verschillende vaccins. Het zou zelfs zo zijn dat via verschillende vaccinaties er net een bescherming

optreedt om verzwakking van het immuunsysteem tegen te gaan (Offit et al., 2002). Andere grote

voordelen van simultane vaccinatie is dat de arbeidstijd van vaccineren, eventuele pijn en stress bij de

dieren gereduceerd worden. Tegenwoordig bestaat er ook een systeem om via één toediening twee

verschillende vaccins te geven via twee naalden op 1 spuit (Serena®, La Veterinaria Strumenti,

VIGODARZERE, Italië). Na inspuiting bereiken de antigenen echter dezelfde drainerende lymfeknoop

zodat de respons anders kan zijn in vergelijking met enkelvoudige toediening. Een studie die het effect

van het simultaan toedienen van meer dan twee vaccins nagaat zou eveneens interessant zijn. Het

kan ook interessant zijn om te onderzoeken of de duur van de serologische respons beïnvloed wordt

na simultane vaccinatie. Het is belangrijk voor de sector dat er verder onderzoek gebeurt naar

veiligheid en werkzaamheid bij het gelijktijdig toedienen van verschillende vaccins.

In dit onderzoek werd geen nadeel vastgesteld in de opbouw van antistoffen bij gelijktijdige toediening

van twee vaccins in vergelijking met enkelvoudige toediening. Na simultane vaccinatie was er zelfs

een significant hogere antistoffentiter (P<0.05) waar te nemen tegen F4 van E. coli drie weken na

eerste én na de tweede vaccinatie in vergelijking met enkelvoudige toediening. Er werd geen

significant verschil in eetlust en huidreactie waargenomen. Er was enkel een significant verhoogde

rectale temperatuur 24uur na tweede vaccinatie bij gelijktijdige toediening van Circovac en Neocolipor

in vergelijking met enkelvoudige toediening van Neocolipor.

50

6. REFERENTIES

Allan G.M., Ellis, J.A. (2000). Porcine circoviruses: a review. Journal of Veterinary Diagnostic

Investigation 12, 3–14.

Allan G. M., McNeilly F., Ellis J., Krakowka S., Bøtner A., McCullough K., Nauwynck H., Kennedy S.,

Meehan B., Charreyre C. (2004).PMWS: Experimental model and co-infections. Veterinary

Microbiology, 98, 165-168.

Altaf I., Siddique M., Muhammad K., Irshad M., Khan M. Z., Anjum A. A., Kamran M. (2012). Antibody

response of rabbits to combined hemorrhagic septicemia and foot & mouth disease virus vaccine. The

Journal of Animal & Plant Sciences, 22, 501-504.

Bertschinger H.U, Stamm M, Voegeli P. (1993). Inheritance of resistance to oedema disease in pigs:

Experiments with Escherichia coli strain expressing fimbriae F107. Veterinary Microbiology 35, 79-89.

Bielinska A.U., Gerber M., Blanco L.P., Makidon P.E., Janczak K.W., Beer M., Swanson B., Baker J.R.

(2010). Induction of Th17 cellular immunity with a novel nanoemulsion adjuvant. Critical Reviews in

Immunology 30, 189–199.

Calabro S., Tritto E., Pezzotti A., Taccone M., Muzzi A., Bertholet S., De Gregorio E., O’Hagan D.T.,

Baudner B., Seubert A. (2013). The adjuvant effect of MF59 is due to the oil-in-water emulsion

formulation, none of the individual components induce a comparable adjuvant effect. Vaccine 31,

3363-3369.

Chae, C. (2005). A review of porcine circovirus 2-associated syndromes and diseases. The Veterinary

Journal 169, 326–336.

Chae C. (2012). Commercial porcine circovirus type 2 vaccines: Efficacy and clinical application. The

Veterinary Journal 194,151–7.

Chang H.W., Jeng C.R., Lin T.L., Liu J.J., Chiou M.T., Tsai Y.C., Chia M.Y., Jan T.R., Pang

V.F.(2006). Immunopathological effects of porcine circovirus type 2 (PCV2) on swine alveolar

macrophages by in vitro inoculation. Veterinary Immunology and Immunopathology 110, 207–219.

Charreyre C., Joisel F., Chapat L., El Garch H., Juillard V., Andreoni C., Maurin-Bernaud L., Chevalier

M., Goutebroze S., Too H. (2011). Some updates on pig immunology and immune responses to

CIRCOVAC®, an inactivated vaccine against Porcine Circovirus Type 2 (PCV2). 5th Asian Pig

Veterinary Society congress, Pattaya, Thailand, 2011.

Coddens A., Diswell M., Angstrom J., Breimer M.E., Goddeeris B.M., Cox E., Teneberg S. (2009).

Recognition of blood group ABH type 1 determinants by the FedF adhesin of F18- fimbriated

Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry 284 (15), 9714-9726.

Coddens A., Verdonck F., Mulinge M., Goyvaerts E., Miry C., Goddeeris B., Duchateau L., Cox E.

(2008). The possibility of positive selection for both F18+ Escherichia coli and stress resistant pigs

opens new perspectives for pig breeding. Veterinary Microbiology 126, 210-215.

Coddens A., Verdonck F., Tiels P., Rasschaert K., Goddeeris B.M., Cox E. (2007). The age-

dependent expression of the F18+ E. coli receptor on porcine gut epithelial cells is positively

correlated with the presence of histo-blood group antigens. Veterinary Microbiology 122, 332–341.

http://orbit.dtu.dk/en/persons/anette-boetner%2870ad6406-3b8c-4e50-95f5-b0f448fc69ea%29.html

51

Cox E., Verdonck F., Vanrompay D., Goddeeris B. (2006). Adjuvants modulating mucosal immune

responses or directing systemic responses towards the mucosa. Veterinary research 37, 511-539.

Cox J.C., Coulter A.R. (1997). Adjuvants: a classification and review of their modes of action. Vaccine

15, 248-56.

Darwich L., Segales J., Mateu E. (2004). Pathogenesis of postweaning multisystemic wasting

syndrome caused by porcine circovirus 2: an immune riddle. Archives of Virology 149, 857– 874.

Darwich L., Mateu E. (2012). Immunology of porcine circovirus type 2 (PCV2). Virus Research 164,

61-67.

Davenport F.M., Arbor A. (1961). Applied immunology of mineral oil adjuvants. The Journal of Allergy

32, 177-189.

De Clercq K., Koenen F., Strobbe R., Debecq J. (1989). Simultaneous vaccination of piglets against

foot-and-mouth disease and classical swine fever. Veterinary Microbiology 20, 215-221.

Dinarello C.A. (2009). Immunological and Inflammatory Functions of the Interleukin-1 Family. Annual

Review of Immunology 27, 519-550.

Drexler C.S., Witvliet M.H., Raes M., van de Laar M., Eggen A.A., Thacker E.L. (2010). Efficacy of

combined porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae

vaccination in piglets. The Veterinary Record. 166, 70–74.

Elham, Youssef A., Abeer, Mansour E. (2008). Simultaneous vaccination of cattle with polyvalent

pneumonic pasteurollosis vaccine and bivalent FMD vaccine (O & A). SCVMJ, XIII (2), 543-553.

Falvo C., Horowitz H. (1994). Adverse reactions associated with simultaneous administration of

multiple vaccines to travelers. Journal of General Internal Medicine 9, 255-260.

Feng H., Blanco G., Segalés J., Sibila M. (2014). Can Porcine circovirus type 2 (PCV2) infection be

eradicated by mass vaccination? Veterinary Microbiology 172, 92-99.

Finsterbusch T., Mankertz A. (2009). Porcine circoviruses-small but powerful. Virus Research. 143,

177–183.

Fort M., Olvera A., Sibila M., Segalés J., Mateu E. (2007). Detection of neutralizing antibodies in

postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)-affected and non-PMWS-affected pigs.

Veterinary Microbiology 125, 244–255.

Fort M., Sibila M., Allepuz A., Mateu E., Roerink F., Segalés J. (2008) Porcine circovirus type 2

(PCV2) vaccination of conventional pigs prevents viremia against PCV2 isolates of different genotypes

and geographic origins. Vaccine 26, 1063–1071.

Fort M., Sibila M., Perez-Martin E., Nofrarias M., Mateu E., Segalés J. (2009b). One dose of a porcine

circovirus 2 (PCV2) sub-unit vaccine administered to 3-week-old conventional piglets elicits cell-

mediated immunity and significantly reduces PCV2 viremia in an experimental model. Vaccine 27,

4031–4037.

Fraile L., Grau-Roma L., Sarasola P., Sinovas N., Nofrarias M., Lopez-Jimenez R., Lopez-Soria S.,

Silbila M., Segalés J. (2012a). Inactivated PCV2 one shot vaccine applied in 3-week-old piglets:

52

Improvement of production parameters and interaction with maternally derived immunity. Vaccine 30,

1986-1992.

Garcia A., De Sanctis J.B. (2013). An overview of adjuvant formulations and delivery systems. Acta

Pathologica, Microbiologica et Immunologica Scandinavica 1-11.

Grau-Roma L., Hjulsager C.K., Sibila M., Kristensen C.S., Lopez-Soria S., Enøe C., Casal J., Botner

A., Nofrarías M., Bille-Hansen V., Fraile L., Bækbo P., Segalés J., Larsen L.E. (2009). Infection,

excretion and seroconversion dynamics of porcine circovirus type 2 (PCV2) in pigs from post-weaning

multisystemic wasting syndrome (PMWS) affected farms in Spain and Denmark. Veterinary

Microbiology. 135, 272-282.

Grau-Roma L., Fraile L., Segalés J. (2011). Recent advances in the epidemiology, diagnosis and

control of diseases caused by porcine circovirus type 2. The Veterinary Journal 187, 23–32.

Haesebrouck F., Pasmans F., ChiersK. , Maes D., Ducatelle R., Decostere A. (2004). Efficacy of

vaccines against bacterial diseases in swine: what can we expect. Veterinary Microbiology, 100, 255–

268.

Halsey N.A. (2001) Combination Vaccines: Defining and Addressing Current Safety Concerns Clinical

Infectious Diseases 33(Suppl 4), S312–8.

Harold F., Stills Jr. (2005). Adjuvants and Antibody Production: Dispelling the myths associated with

Freund’s complete and other adjuvants. ILAR Journal 46, 280-293.

Heißenberger B., Weissenbacher-Lang C., Hennig-Pauka I., Ritzmann M., Ladinig A. (2013). Efficacy

of vaccination of 3-week-old piglets with Circovac® against porcine circovirus diseases (PCVD). Trials

in Vaccinology 2,1–9.

Herbich E., Heissenberger B., Ladinig A., Griessler A., Ritzmann M., Weissenbacher-Lang C., Hennig-

Pauka I. (2013). Field trial on the simultaneous vaccination against porcine circovirus type 2 (PCV2)

and Mycoplasma hyopneumoniae. Tierärztliche Praxis Großtiere 5, 279-288.

Hogenesch H. (2002). Mechanisms of stimulation of the immune response by aluminum adjuvants.

Vaccine 20, S34–S39.

Hur J., Lee J.H. (2013). Protection against neonatal Escherichia coli diarrhea by vaccination of sows

with a novel multivalent vaccine candidate expressing E. coli adhesins associated with neonatal pig

colibacillosis. Research in Veterinary Science 94, 198-204.

Iwasaki A. (2007). Mucosal Dendritic Cells. Annual Review of Immunology 25, 381-418.

Janeway C.A., Travers P., Walport M., Shlomchik M.J. (2001).The complement system and innate

immunity. Immunobiology 5th edition, chapter 2.

Jansen T., Hofmans M.P.M., Theelen M.J.G., Manders F., Schijns V.E.J.C. (2006). Structure- and oil

type-based efficacy of emulsion adjuvants. Vaccine 24, 5400–5405.

Johansson M.M., Coddens A., Benktander J., Cox E., Teneberg S. (2014). Porcine intestinal

glycosphingolipids recognized by F6-fimbriated enterotoxigenic Escherichia coli. Microbial

Pathogenesis 76, 51-60.

53

Johnson C.S., Joo H.S., Direksin C., Yoon K.J., Choi Y.K. (2002). Experimental in utero inoculation of

late-term swine foetuses with porcine circovirus type 2. Journal of veterinary diagnostic investigation

14, 507–512.

Joseph P.G., Hedger R.S. (1984). Serological response of cattle to simultaneous vaccinations against

foot-and-mouth disease and haemorrhagic septicaemia. The veterinary record 114, 494-496.

Karuppannan K. A., Jong M. H., Lee S., Zhu Y., Selvaraj M., Lau J., Jia Q., Kwang J. (2009).

Attenuation of porcine circovirus 2 in SPF piglets by abrogation of ORF3 function. Virology 383, 338–

347.

Kekarainen T., Montoya M., Dominguez J., Mateu E., Segalés J. (2008) Porcine circovirus type 2

(PCV2) viral components immunomodulate recall antigen responses. Veterinary Immunology and

Immunopathology 124, 41-49.

Kim J.Y., Kim J.H., Hur J., Lee J.H. (2010). Isolation of Escherichia coli from piglets in South Korea

with diarrhea and characteristics of the virulence genes. The Canadian Journal of Veterinary Research

71, 59-64.

Kixmöller M., Ritzmann M., Eddicks M., Saalmuller A., Elbers K., Fachinger V. (2008). Reduction of

PMWS-associated clinical signs and co-infections by vaccination against PCV2. Vaccine 26, 3443–

3451.

Kohler E. M. (1974) Protection of pigs against neonatal enteric colibacillosis with colostrum and milk

from orally infected sows. American Journal of Veterinary Research 35, 331–338.

Kristensen C. S., Andreasen M., Ersbøll A. K., Nielsen J. P. (2004). Antibody response in sows and

piglets following vaccination against Mycoplasma hyoopneumoniae, toxigenic Pasteurella multocida,

and Actinobacillus pleuropneumoniae. Canadian Journal of Veterinary Research 68, 66-70.

Lambrecht B.N., Kool M., Willart M. AM., Hammad H. (2009). Mechanism of action of clinically

approved adjuvants. Current opinion in immunology 21, 23–29.

Larochelle R., Bielanski A., Muller P., Magar R. (2000). PCR detection and evidence of shedding of

porcine circovirus type 2 in boar semen. Journal of Clinical Microbiology 38, 4629–4632.

Levast B., Awate S., Babiuk L., Mutwiri G., Gerdts V. , Sylvia V. D., Littel H. (2014). Vaccine

Potentiation by Combination Adjuvants. Vaccines 2, 297-322.

Loos M., Geens M., Schauvliege S., Gasthuys F., van der Meulen J., Dubreuil J.D., Goddeeris B.M.,

Niewold T., Cox E. (2012). Role of heat-stable enterotoxins in the induction of early immune

responses in piglets after infection with enterotoxigenic Escherichia coli. Plos One 7, e 41041.

Loos M., Hellemans A., Cox E. (2013). Optimization of a small intestinal segment perfusion model for

heat-stable enterotoxin A induced secretion in pigs. Veterinary immunology and immunopathology

152, 82-86.

Maes D. (2012). Subclinical porcine circovirus infection: What lies beneath. The Veterinary Journal

194, 9-9.

McKeown N.E., Opriessnig T., Thomas P., Guenette D.K., Elvinger F., Fenaux M., Halbur P.G., Meng

X.J. (2005). Effects of porcine circovirus type 2 (PCV2) maternal antibodies on experimental infection

of piglets with PCV2. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 12, 1347–1351.

54

Meerts P., Van Gucht S., Cox E., Vandebosch A., Nauwynck H.J. (2005). Correlation between type of

adaptive immune response against porcine circovirus type 2 and level of virus replication. Viral

Immunology 18, 333-341.

Melkebeek V., Goddeeris B.M., Cox E. (2013). ETEC vaccination in pigs. Veterinary Immunology and

Immunopathology 152, 37–42.

Melkebeek V., Rasschaert K., Bellot P., Tilleman K., Favoreel H., Deforce D., De Geest B.G.,

Goddeeris B.M., Cox E. (2012). Targeting aminopeptidase N, a new identified receptor for F4ac

fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunolgy 5, 635-645.

Michelle-Fong W.C., Choo P.Y., Ong B.L., Tee C.Y., Lee J.W., Ooi P.T. (2013). Effects of Escherichia

Coli vaccination in gilts on piglet performance in a farm in Perak. Jurnal Veterinar Malaysia 25, 7-10.

Moon H.W., Bunn T.O. (1993). Vaccines for preventing enterotoxigenic Escherichia coli infections in

farm animals. Vaccine 11, 213-220.

Morein B., Löugren K., Höglund S., Sundquist B. (1987). The ISCOM: An immunopotentiating

complex. Immunology Today 8, 333-338.

Nagy B., Fekete P.Zs. (1999). Enterotoxigenic Escherichia coli in farm animals. Veterinary Research

30, 259-284.

Nagy B., Fekete P.Zs. (2005). Enterotoxigenic Escherichia coli in veterinary medicine. International

Journal of Medical Microbiology 295, 443-454.

Norton E. B., Lawson L. B., Mahdi Z., Freytag L. C., Clements J. D. (2012). The A Subunit of

Escherichia coli Heat-Labile Enterotoxin Functions as a Mucosal Adjuvant and Promotes IgG2a, IgA,

and Th17 Responses to Vaccine Antigens. Infection and Immunity 80, 2426-2435.

Offit P.A., Quarles J., Gerber M.A., Hackett C.J., Marcuse E.K., Kollman T.R., Gellin B.G., Landry S.

(2002). Addressing Parents’ Concerns: Do Multiple Vaccines Overwhelm or Weaken the Infant’s

Immune System? Pediatrics 109-124.

Oh Y., Won Seo H., Han K., Park C., Chae C. (2012). Protective effect of the maternally derived

porcine circovirus type 2 (PCV2)-specific cellular immune response in piglets by dam vaccination

against PCV2 challenge. Journal of General Virology 93, 1556–1562.

Olvera A., Sibila M., Calsamiglia M., Segalés J., Domingo M. (2004). Comparison of porcine circovirus

type 2 load in serum quantified by a real time PCR in postweaning multisystemic wasting syndrome

and porcine dermatitis and nephropathy syndrome naturally affected pigs. Journal of Virological

Methods 117, 75–80.

Opriessnig, T., Patterson, A.R., Madson, D.M., Pal, N., Rothschild, M., Kuhar, D., Lunney, J.K., Juhan,

N.M., Meng, X.J., Halbur, P.G. (2009). Difference in severity of porcine circovirus type two-induced

pathological lesions between Landrace and Pietrain pigs. Journal of Animal Science 87, 1582– 1590.

Osek J., Truszczyński M., Tarasiuk K., Pejsak Z. (1994). Evaluation of different vaccines to control of

pig colibacillosis under large-scale farm conditions. Comparitive Immunology, Microbiology and

Infectious Diseases 18, 1-8.

55

Park J.S., Ha Y., Kwon B., Cho K.D., Lee B.H. Chae C. (2009). Detection of porcine circovirus 2 in

mammary and other tissues from experimentally infected sows. Journal of Comparative Pathology

140, 208–211.

Park J.S., Kim J., Ha Y., Jung K., Choi C., Lim J.K., Kim S.H., Chae C. (2005). Birth abnormalities in

pregnant sows infected intranasally with porcine circovirus 2. Journal of Comparative Pathology 132

(2-3),139-44.

Patterson A.R., Opriessnig T. (2010). Epidemiology and horizontal transmission of porcine circovirus

type 2 (PCV2). Animal health research reviews 11(2), 217-34.

Pejsak Z., Podgo´rska K., Truszczyn´ ski M., Karbowiak P., Stadejek T. (2010) Efficency of different

protocols of vaccination against porcine circovirus type 2 (PCV2) in a farm affected by postweaning

multisystemic wasting syndrome (PMWS). Comparitive Immunology, Microbiology and Infectious

Diseases. 33, e1–e5.

Pommier P., Keïta A., Pagot E., Smeets J. A field trial in France to assess the safety and the efficacy

against Mycoplasma Hyopneumoniae of simultaneous use of Porcilis PRRS and Porcilis M. Hyo in

piglets. Intervet Satellite Proceedings and Abstracts of the 5th International Symposium on Emerging

and Re-Emerging Pig Diseases 62 – 63.

Riising H.J., Murmans M., Witvliet M. (2005). Protection Against Neonatal Escherichia coli Diarrhoea

in Pigs by Vaccination of Sows with a New Vaccine that Contains Purifed EnterotoxicE. coli Virulence

Factors F4ac, F4ab, F5, F6 Fimbial Antigens and Het-labile E. coli Enterotoxin (LT) Toxoid. J. Vet.

Med. B. 52, 296-300.

Rothel J.S., Corner L.A., Lightowlers M.W., Seow H.F., McWaters P., Entrican G., Wood P.R. (1998).

Antibody and cytokine responses in efferent lymph following vaccination with different adjuvants.

Veterinary Immunology and Immunopathology 63, 167-183.

Rousset E., Harel J., Dubreuil D.J. (1998). Sulfatide from the Pig Jejunum Brush Border Epithelial Cell

Surface Is Involved in Binding of Escherichia coli Enterotoxin b. Infection and Immunity 66, 5650-5658.

Runnels P.L., Moseley S.L., Moon H.W. (1987). F41 pili as protective antigens of enterotoxigenic

Escherichia coli that produce F41, K99, or both pilus antigens. Infection and Immunity 55, 555.

Sanchez R. E., Jr., Meerts P., Nauwynck H.J., Ellis J. A., Pensaert M. B. (2004). Characteristics of

porcine circovirus–2 replication in lymphoid organs of pigs inoculated in late gestation or postnatally

and possible relation to clinical and pathological outcome of infection. Journal of veterinary diagnostic

investigation 16, 175–18.

Sarli G., Mandrioli L., Laurenti M., Laurenti M., Sidoli L., Cerati C., Rolla G., Marcato P.S. (2001)

Immunohistochemical characterisation of the lymph node reaction in pig post-weaning multisystemic

wasting syndrome (PMWS). Veterinary Immunology and Immunopathology 83, 53–67.

Schijns V. EJC (2000). Immunological concepts of vaccine adjuvant activitiy. Current opinion in

immunology 12, 456-463.

Segalés J. (2012). Porcine circovirus type 2 (PCV2) infections: Clinical signs, pathology and laboratory

diagnosis. Virus Research 164, 10– 19.

Segalés J., Kekarainen T., Cortey M. (2013). The natural history of porcine circovirus type 2: from an

inoffensive virus to a devastating swine disease? Veterinary Microbiology 165,13–20.

56

Segales J., Rosell C., Domingo M. (2004) Pathological findings associated with naturally acquired

porcine circovirus type 2 associated disease. Veterinary Microbiology 98, 2137–149.

Selim A.M.A., Abouzeid N.Z., Aggour A.M., Sobhy N.M. (2010) Comparative study for immune efficacy

of two different adjuvants bivalent FMD Vaccines in Sheep. Journal of American Science 6, 1292-

1298.

Sellwood R., Gibbons R.A., Jones G.W., Rutter J.M.(1975). Adhesion of enteropathogenic Escherichia

coli to pig intestinal brush borders: the existence of two pig phenotypes. Journal of medical

microbiology 8, 405-411.

Schmitt E., Klein M., Bopp T. (2014). Th9 cells, new players in adaptive immunity. Trends in

Immunology 35, 61-68.

Spickler A.R., Roth J.A. (2003). Adjuvants in Veterinary Vaccines: Modes of Action and Adverse Effects. Journal of Veterinary Internal Medicine 17, 273–281.

Straw B.E., Shin S., Callihan D., Petersen M. (1991). Antibody production and

tissue irritation in swine vaccinated with Actinobacillus bacterins containing various adjuvants. Journal

of the American Veterinary Medical Association 196, 600-604.

Stricker T.M., Weissenbacher-Lang C., Ritzmann M., Ladinig A. (2013). A study to assess the

compatibility of simultaneous use of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (EU-type)

vaccine and Mycoplasma hyopneumoniae vaccine under field conditions. Berliner und Münchener

Tierärtzliche Wochenschrift 126, 189-196.

Tomas A., Fernandes L.T., Valero O., Segales J. (2008). A meta-analysis on experimental infections

with porcine circovirus type 2 (PCV2). Veterinary Microbiology 132, 260–273.

Van den Broeck W., Cox E., Oudegab B., Goddeeris B.M. (2000) The F4 fimbrial antigen of

Escherichia coli and its receptors. Veterinary Microbiology 71, 223-244.

Vincent I.E., Carrasco C.P., Herrmann B., Meehan B.M., Allan G.M., Summerfield A., McCullough K.C.

(2003). Dendritic cells harbor infectious porcine circovirus type 2 in the absence of apparent cell

modulation or replication of the virus. Journal of Virology 77, 13288-13300.

Vincent I.E., Balmelli C., Meehan B., Allan G., Summerfield A., McCullough K.C. (2007). Silencing of

natural interferon producing cell activation by porcine circovirus type 2 DNA. Immunology 120, 47–56.

Virdi V., Coddens A., De Buck S., Millet S., Goddeeris B.M., Cox E., De Greve H., Depicker A. (2013).

Orally fed seeds producing designer IgAs protect weaned piglets against enterotoxigenic Escherichia

coli infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 110, 11809-11814.

Wellenberg G.J., Stockhofe-Zurwieden N., de Jong M.F., Boersma W.J., Elbers A.R. (2004).

Excessive porcine circovirus type 2 antibody titres may trigger the development of porcine dermatitis

and nephropathy syndrome: a case-control study. Veterinary Microbiology 99, 203–214.

Willson P.J., Rossi-Campos A. Potter A.A. (1995). Tissue reaction and immunity in swine immunized

with Actinobacillus pleuropneumoniae vaccines. Can. J. Vet. Res. 59, 299-305.

57

Wognarkpet S., Pfeiffer D.U., Morris R.S., Fenwick S.G. (1999a). An on-farm study of the

epidemiology of Actinobacillus pleuropneumoniae infection in pigs as part of a vaccine efficacy trial.

Preventive Veterinary Medicine 39,1–11.

Won Seo H., Han K., Park C., Chae C. (2014). Clinical, virological, immunological and

pathological evaluation of four porcine circovirus type 2 vaccines. The Veterinary Journal 200, 65-70.

Yanhong L., Xianghe Y., Chitrita D., Pina M. F., David S. N., Robert W. L., Wei W., Liliana L., Lauren

B., Diana R., Magaly T., Narasimha H., Jianghong M. (2015). Escherichia coli O-Antigen Gene

Clusters of Serogroups O62, O68, O131, O140, O142, and O163: DNA Sequences and Similarity

between O62 and O68, and PCR-Based Serogrouping. Biosensors 5, 51-68.

Zimmerman J. J., Karriker L. A., Ramirez A., Schwartz K. J. en Stevenson G. W. (2012). Chapter 26:

Porcine Circoviruses. 405-417.

Zimmerman J. J., Karriker L. A., Ramirez A., Schwartz K. J. en Stevenson G. W. (2012b). Chapter 53:

Colibacillosis. 723-749.

Zutic J., Asanin J., Misic D., Dobrila D.J., Milic N., Asanin R., Stojanovic D., Zutic M. (2010). Isolation

of ETEC strains from piglets with diarrhea in the neonatal period and their typization based on somatic

and fimbrial antigens. Acta Veterinaria 60, 497-506.

http://bijsluiters.fagg-afmps.be/DownloadLeafletServlet?id=124861, 8/10/2014

www.cbip-vet.be/nl/texts/NSUOOOL1BL2o.php#Neonatale, 25/12/2014

www.ema.europa.eu/docs/nl_NL/document_library/EPAR_-

_Product_Information/veterinary/000114/WC500061517.pdf, 20/12/2014

http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/SafetyAvailability/VaccineSafety/UCM096228

www.invivogen.com/review-vaccine-adjuvants, 29/03/2015

www.merckmanuals.com/vet/generalized_conditions/porcine_circovirus_diseases/overview_of_porcin

e_circovirus_diseases.html, 21/03/2015

www.veearts.nl/2014/meer-vaccinaties-tegen-circo-en-mycoplasma/, 21/03/2015

IBM Corp. Released 2013. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 22.0. Armonk, NY: IBM Corp.

58

7. Bijlagen

Onafhankelijke variabele (x)

β 0 (intercept) β 1 ± SE OR P-waarde

L.huid.1e.vac. 0.h.binair

-2.657e+01 ± 7.963e+04

2 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1

3 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1

4 - 1 4.061e-14 ± 1.379e+05 1 1

3 - 2 3.787e-29 ± 1.126e+05 1 1

4 - 2 1.136e-28 ± 1.379e+05 1 1

4 - 3 7.573e-29 ± 1.379e+05 1 1

L.huid.1e.vac.

1.h.binair

-0.4055 ±

0.4564

2 - 1 -0.9808 ± 0.7217 0,375011 0.4670

3 - 1 -2.5390 ± 1.1229 0,078945 0.0812

4 - 1 -18.1606 ± 2062.6395 1,3E-08 1.0000

3 - 2 -1.5581 ± 1.1684 0,210536 0.4837

4 - 2 -17.1798 ± 2062.6395 3,46E-08 1.0000

4 - 3 -15.6216 ± 2062.6397 1,64E-07

1.0000

L.huid.1e.vac.

6.h.binair

-2.404e-15 ±

4.472e-01

2 - 1 -1.386e+00 ± 7.159e-01 0,250074 0.166

3 - 1 -1.957e+01 ± 2.405e+03 3,17E-09 1.000

4 - 1 -1.957e+01 ± 3.401e+03 3,17E-09 1.000

3 - 2 -1.818e+01 ± 2.405e+03 1,27E-08 1.000

4 - 2 -1.818e+01 ± 3.401e+03 1,27E-08 1.000

4 - 3 -7.763e-12 ± 4.165e+03 1

1.000

L.huid.1e.vac.

24.h.binair

-2.944 ± 1.026

2 - 1 1.210e+00 ± 1.202e+00 3,353485 0.696

3 - 1 -1.762e+01 ± 3.965e+03 2,23E-08 1.000

4 - 1 -1.762e+01 ± 5.607e+03 2,23E-08 1.000

3 - 2 -1.883e+01 ± 3.965e+03 6,64E-09 1.000

Bijlage 1: uitkomsten van de logistische regressie voor de huidscores

59

4 - 2 -1.883e+01 ± 5.607e+03 6,64E-09 1.000

4 - 3 -3.165e-12 ± 6.867e+03 1

1.000

L.huid.1e.vac.

72.h.binair

-2.9444 ±

1.0260

2 - 1 7.472e-01 ± 1.268e+00 2,111081 0.919

3 - 1 -1.762e+01 ± 3.965e+03 2,23E-08 1

4 - 1 -1.762e+01 ± 5.607e+03 2,23E-08 1

3 - 2 -1.837e+01 ± 3.965e+03 1,05E-08 1

4 - 2 -1.837e+01 ± 5.607e+03 1,05E-08 1

4 - 3 1.243e-13 ± 6.867e+03 1

1

R.huid.1e.vac.

0h.binair

-2.657e+01 ±

7.963e+04

2 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1

3 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1

4 - 1 4.061e-14 ± 1.379e+05 1 1

3 - 2 3.787e-29 ± 1.126e+05 1 1

4 - 2 1.136e-28 ± 1.379e+05 1 1

4 - 3 7.573e-29 ± 1.379e+05 1 1

R.huid.1e.vac.

1h.binair

-19.57 ±

2404.67

2 - 1 1.818e+01 ± 2.405e+03 78609255 1.000

3 - 1 1.818e+01 ± 2.405e+03 78609255 1.000

4 - 1 1.737e+01 ± 2.405e+03 34969961 1.000

3 - 2 1.066e-14 ± 7.906e-01 1 1.000

4 - 2 -8.109e-01 ± 1.193e+00 0,444458 0.885

4 - 3 -8.109e-01 ± 1.193e+00 0,444458

0.885

R.huid.1e.vac.

6.h.binair

-1.957e+01 ±

2.405e+03

2 - 1 1.957e+01 ± 2.405e+03 3,16E+08 1.000

3 - 1 1.916e+01 ± 2.405e+03 2,09E+08 1.000

4 - 1 -2.718e-11 ± 4.165e+03 1 1.000

3 - 2 -4.055e-01 ± 6.390e-01 0,666643 0.901

4 - 2 -1.957e+01 ± 3.401e+03 3,17E-09 1.000

4 - 3

-1.916e+01 ± 3.401e+03 4,77E-09

1.000

60

R.huid.1e.vac.

24.h.binair

-1.957e+01 ±

2.405e+03

2 - 1 1.957e+01 ± 2.405e+03 7,078061 1

3 - 1 1.957e+01 ± 2.405e+03 3,16E+08 1

4 - 1 -3.399e-11 ± 4.165e+03 1 1

3 - 2 2.487e-14 ± 6.325e-01 1 1

4 - 2 -1.957e+01 ± 3.401e+03 3,17E-09 1

4 - 3 -1.957e+01 ± 3.401e+03 3,17E-09

1

R.huid.1e.vac.

72.h.binair

-1.957e+01 ±

2.405e+03

2 - 1 1.783e+01 ± 2.405e+03 55395006 1

3 - 1 1.783e+01 ± 2.405e+03 5,947673 1

4 - 1 3.032e-12 ± 4.165e+03 1 1

3 - 2 -7.105e-15 ± 8.856e-01 1 1

4 - 2 -1.783e+01 ± 3.401e+03 1,81E-08 1

4 - 3 -1.783e+01 ± 3.401e+03 1,81E-08

1

L.huid.2evac.

0.h.binair

-2.157e+01 ±

6.537e+03

2 - 1 1.343e-11 ± 9.244e+03 1 1

3 - 1 1.862e+01 ± 6.537e+03 1,22E+08 1

4 - 1 1.350e-11 ± 1.132e+04 1 1

3 - 2 1.862e+01 ± 6.537e+03 1,22E+08 1

4 - 2 7.203e-14 ± 1.132e+04 1 1

4 - 3 -1.862e+01 ± 9.244e+03 8,19E-09

1

L.huid.2evac.

1.h.binair

-2.944 ± 1.026

2 - 1 1.210e+00 ± 1.202e+00 3,353485 0.696

3 - 1 -1.762e+01 ± 3.965e+03 2,23E-08 1

4 - 1 -1.762e+01 ± 5.607e+03 2,23E-08 1

3 - 2 -1.883e+01 ± 3.965e+03 6,64E-09 1

4 - 2 -1.883e+01 ± 5.607e+03 6,64E-09 1

4 - 3 -3.485e-12 ± 6.867e+03 1

1

L.huid.2evac.

6.h.binair

-0.2007 ±

0.4495

2 - 1 6.061e-01 ± 6.406e-01 1,833268 0.735

3 - 1 -1.937e+01 ± 2.405e+03 3,87E-09 1

61

4 - 1 -1.937e+01 ± 3.401e+03 3,87E-09 1

3 - 2 -1.997e+01 ± 2.405e+03 2,12E-09 1

4 - 2 -1.997e+01 ± 3.401e+03 2,12E-09 1

4 - 3 6.235e-12 ± 4.165e+03 1

1

L.huid.2evac.

24.h.binair

-0.6190 ±

0.4688

2 - 1 -4.796e-01 ± 6.975e-01 0,619031 0.878

3 - 1 -1.895e+01 ± 2.405e+03 5,89E-09 1

4 - 1 -1.895e+01 ± 3.401e+03 5,89E-09 1

3 - 2 -1.847e+01 ± 2.405e+03 9,52E-09 1

4 - 2 -1.847e+01 ± 3.401e+03 9,52E-09 1

4 - 3 8.352e-12 ± 4.165e+03 1

1

L.huid.2evac.

72.h.binair

-2.1972 ±

0.7454

2 - 1 -7.472e-01 ± 1.268e+00 0,473691 0.919

3 - 1 -1.837e+01 ± 3.965e+03 1,05E-08 1

4 - 1 -1.837e+01 ± 5.607e+03 1,05E-08 1

3 - 2 -1.762e+01 ± 3.965e+03 2,23E-08 1

4 - 2 -1.762e+01 ± 5.607e+03 2,23E-08 1

4 - 3 -6.416e-12 ± 6.867e+03 1

1

R.huid.2e.vac.

0.h.binair

-2.657e+01 ±

7.963e+04

2 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1

3 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1

4 - 1 4.061e-14 ± 1.379e+05 1 1

3 - 2 3.787e-29 ± 1.126e+05 1 1

4 - 2 1.136e-28 ± 1.379e+05 1 1

4 - 3 7.573e-29 ± 1.379e+05 1 1

R.huid.2evac.

1.h.binair

-1.957e+01 ±

2.405e+03

2 - 1 1.818e+01 ± 2.405e+03 78609255 1.000

3 - 1 1.737e+01 ± 2.405e+03 34969961 1.000

4 - 1 1.130e-11 ± 4.165e+03 1 1.000

3 - 2 -8.109e-01 ± 9.317e-01 0,444458 0.781

4 - 2 -1.818e+01 ± 3.401e+03 1,27E-08 1.000

4 – 3

-1.737e+01 ± 3.401e+03 2,86E-08

1.000

62

R.huid.2evac.

6.h.binair

-1.957e+01 ±

2.405e+03

2 - 1 2.130e+01 ± 2.405e+03 1,78E+09 1.000

3 - 1 2.019e+01 ± 2.405e+03 5,87E+08 1.000

4 - 1 -2.597e-11 ± 4.165e+03 1 1.000

3 - 2 -1.116e+00 ± 7.823e-01 0,327588 0.418

4 - 2 -2.130e+01 ± 3.401e+03 5,62E-10 1.000

4 - 3 -2.019e+01 ± 3.401e+03 1,7E-09

1.000

R.huid.2evac.

24.h.binair

-1.957e+01 ±

2.405e+03

2 - 1 2.176e+01 ± 2.405e+03 2,82E+09 1.000

3 - 1 2.041e+01 ± 2.405e+03 7,31E+08 1.000

4 - 1 4.309e-11 ± 4.165e+03 1 1.000

3 - 2 -1.350e+00 ± 8.909e-01 0,25924 0.364

4 - 2 -2.176e+01 ± 3.401e+03 3,55E-10 1.000

4 - 3 -2.041e+01 ± 3.401e+03 0

1.000

R.huid.2evac.

72.h.binair

-1.957e+01 ±

2.405e+03

2 - 1 1.997e+01 ± 2.405e+03 4,71E+08 1.000

3 - 1 1.977e+01 ± 2.405e+03 3,85E+08 1.000

4 - 1 -5.665e-12 ± 4.165e+03 1 1.000

3 - 2 -2.048e-01 ± 6.406e-01 0,81481 0.986

4 - 2 -1.997e+01 ± 3.401e+03 2,12E-09 1.000

4 - 3 -1.977e+01 ± 3.401e+03 2,59E-09

1.000

L.3e.bloedn.

22.12.14.binair

-2.657e+01 ±

7.963e+04

2 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1

3 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1

4 - 1 4.061e-14 ± 1.379e+05 1 1

3 - 2 3.787e-29 ± 1.126e+05 1 1

4 - 2 1.136e-28 ± 1.379e+05 1 1

4 - 3 7.573e-29 ± 1.379e+05 1 1

R.3e.bloedn.

22.12.14.binair

-2.057e+01 ±

3.965e+03

2 - 1 1.762e+01 ± 3.965e+03 44902319 1

3 - 1 1.762e+01 ± 3.965e+03 44902319 1

4 - 1 2.890e-11 ± 6.867e+03 1 1

63

3 - 2 1.066e-14 ± 1.451e+00 1 1

4 - 2 -1.762e+01 ± 5.607e+03 2,23E-08 1

4 - 3 -1.762e+01 ± 5.607e+03 2,23E-08

1

Onafhankelijke

variabele (x)

β 0 (intercept) β 1 ± SE OR P-waarde

buikvulling1evac

0h.binair

2.197e+00 ±

7.454e-01

2 - 1 1.737e+01 ± 2.405e+03 34969961 1

3 - 1 -3.328e-15 ± 1.054e+00 1 1

4 - 1 -2.293e-15 ± 1.291e+00 1 1

3 - 2 -1.737e+01 ± 2.405e+03 2,86E-08 1

4 - 2 -1.737e+01 ± 2.405e+03 2,86E-08 1

4 - 3 1.035e-15 ± 1.291e+00 1 1

Buikvulling.1e.vac.

24h.binair

2.057e+01 ±

3.965e+03

2 - 1 -1.762e+01 ± 3.965e+03 2,23E-08 1

3 - 1 -1.762e+01 ± 3.965e+03 2,23E-08 1

4 - 1 1.832e-08 ± 6.867e+03 1 1

3 - 2 2.132e-14 ± 1.451e+00 1 1

4 - 2 1.762e+01 ± 5.607e+03 44902319 1

4 - 3 1.762e+01 ± 5.607e+03 44902319

1

Buikvulling.2e.vac.

0.h.binair

2.657e+01 ±

7.963e+04

2 - 1 4.411e-06 ± 1.126e+05 1,000004 1

3 - 1 4.411e-06 ± 1.126e+05 1,000004 1

4 - 1 4.411e-06 ± 1.379e+05 1,000004 1

3 - 2 3.388e-21 ± 1.126e+05 1 1

4 - 2 2.541e-21 ± 1.379e+05 1 1

4 - 3 -8.470e-22 ± 1.379e+05 1 1

Buikvulling.2e.vac.

24h.binair

2.057e+01 ±

3.965e+03

2 - 1 -1.837e+01 ± 3.965e+03 1,05E-08 1

Onafhankelijke variabele = groepen. Groep 1: vaccinatie tegen Neocolipor®, groep 2: vaccinatie tegen Neocolipor® en

circovac®, groep 3: vaccinatie tegen Circovac® en groep 4: controle groep, geen vaccinatie

OR = EXP (β 1) = odds ratio P-waarde = overschrijdingskans

Bijlage 2: uitkomsten van de logistische regressie voor buikvulling

64

3 - 1 -1.837e+01 ± 3.965e+03 1,05E-08 1

4 - 1 -2.961e-09 ± 6.867e+03 1 1

3 - 2 1.066e-14 ± 1.054e+00 1 1

4 - 2 1.837e+01 ± 5.607e+03 95058210 1

4 - 3 1.837e+01 ± 5.607e+03 95058210 1

Onafhankelijke variabele = groepen. Groep 1: vaccinatie tegen Neocolipor®, groep 2: vaccinatie tegen Neocolipor® en

circovac®, groep 3: vaccinatie tegen Circovac® en groep 4: controle groep, geen vaccinatie

OR = EXP (β 1) = odds ratio P-waarde = overschrijdingskans

Verschil in veiligheid en opbouw van antistoffen tussen...

Documents

Transcript of Verschil in veiligheid en opbouw van antistoffen tussen...