hoe en wat!hoe en wat!

STIPSTIP ==SSystematische ystematische TToxicologische oxicologische IIdentificatie dentificatie PProcedure.rocedure.Geboren in 1992, maar leeft nu meer dan ooit!Geboren in 1992, maar leeft nu meer dan ooit!

STIP

Het STIP systeem is ontwikkeld doorhet laboratorium van de voormaligeCentrale Ziekenhuis Apotheek in Den Bosch.

Het begon allemaal met identificatie m.b.v.retentietijd en de ratio verhouding tussen de golflengte 223/204 en 245/204 nm.

Om het niet te lang te maken slaan we de eerste tien jaar over…….

Wat was er rond het jaar 2002?-Lichrospher RP18e HPLC kolom 125-4 mm 5 μ.-DAD = Diode Array Detector.-STIP Search zoekprogramma (vroeger MDD).-Nu STIP-Beta

-Kolom, Reverse/Kation-exchange met Lichrospher RP18e kolom 125x4 mm 5 μ STIP eluens met STIP factor.-Diode Array Detector, 190-370 nm.-Gestandaardiseerde zure en basische extracties of de experimentele SPE extractie.-STIP beta, een standalone zoekprogrammam.b.v een convert zo goed mogelijk passend gemaakt voor andere merken DAD’s.

Het systeem bestaat tegewoordig uit:

Deze zaken gaan we stuk voor stuk bespreken en de belangrijkste punten toelichten.

Op deze manier krijg je inzicht in STIPen proberen we duidelijk te maken dat het een robuust systeem is.Robuust, maar met een aantal specifieke onderdelen zoals de kolom, de eluens bereiding, de extractie en tenslotte gezond verstand omeen conclusie te trekken met behulp van het STIP beta zoekprogramma.

STIP is geen werk,

maar een uitdagend spel !

KOLOM en ELUENS.KOLOM en ELUENS.

De 2 eenheid…De 2 eenheid…

Bij STIP maken we gebruik van mixed-mode Chromatografie:reverse en kation exchange chromatografie m.b.v. -Kolom: Lichrospher Rp18e 125x4 mm, 5μ met de C18(reverse) actieve Silanol-groepen(kation-exchange). -Eluens: 530 ml water, 146 μl Triethylamine, 705 x STIP-factor μl Fosforzuur 85% naar pH:3.3 met 10% KOH. -Hier 470 ml acetonitril (lichrosolv kwaliteit) toevoegen.Goed mengen, niet filtreren, kort ultra sonic en natuurlijk rondpompen……zuinige brabanders.(ooit wel 1-2 maand)

De kolom pakking: C18 en Si-OH.Twee chromatografie technieken zorgen voor retentie door:-Allerlei krachten (hydrophobic) met de C18 en bindingen in de component.-Kation exchange in zuur milieu. De kalium ionen afkomstig van KOH beinvloeden de Rt.-Er zijn in het eluens, ongeladen zure en neutrale stoffen en met de H+ geprotoneerde alifatische stikstoffen van de basische stoffen.

De kolom pakking: C18 en Si-OH.

-530 ml water (om de zouten in op te lossen.)-146 μl Triethylamine. (”Competing Base”)-705 x (STIP-factor) μl Fosforzuur 85%: (Voor zuur milieu) -De STIP-factor (om het verschil in de hoeveelheid actieve silanol-groepen per kolom te compenseren)-Naar pH:3.3 met 10% KOH (Hoe meer fosforzuur hoe meer KOH.) gelijke pH bij spectrum.-Hierna 470 ml acetonitril. (anders komt er niets af)Goed mengen, niet filtreren. Kort Ultrasone en natuurlijk rondpompen……

Het STIP-eluens:

Wat en Waarvoor?

Verschil fosforzuur= verschil kalium = verschil chromatogram!(basische stoffen

Let op hoeveelheid fosforzuur boven aan het chromatogram staat!!!

600 μl

400 μl

900 μl

500 μl

800 μl

700 μl

300 μl

Het test-chromatogram wordt bij de kolom mee geleverd.

Capillair beinvloed piekhoogte en scherpte. Boven 2x diameter onder!

Het STIP bestand is opgebouwd door 2x25μl monster in een 20 μl loop te injecteren.

Het onderstaande artikel over “loop filling” geeft aan dat dit nodig is voor optimaal vulling van de loop en reproduceerbaarheid van injecties.

M.b.v. van de STIP-configuratie kan men aanpassingen maken voor afwijkende injecties.

Diode Array.Diode Array.

Ook hier wordt de sterkte van de ketting Ook hier wordt de sterkte van de ketting bepaald door de zwakste schakel…bepaald door de zwakste schakel…

Bijna alle merken DAD zijn te gebruiken als ze een asci-file kunnen leveren. Chloorpromazine is een goede controle!

Een paar apart…….Een paar apart…….

Zuur-base Liquid/Liquid extractie.Zuur-base Liquid/Liquid extractie.

Of de zure Of de zure SPESPE ( (SSolid olid PPhase hase EExtractie).xtractie).

Liquid/Liquid extractie

-1 ml serum, 1 ml acetonitril, 6 ml dichloormethaan, zuur en basisch extract.

-Zuur/base extract, schudden centrifugeren, afdraaien,scheiden, etc.

-Variatie en lagere recoveries.-Vuilere extracten.

-Storing van coffeïne en benzodiazepines in beide.-Ouderwets en traag…..maar wel STIP!

Zoek de verschillen:Zoek de verschillen:

SPE: Polar Plus speeddisk

-Spe kolom wassen, reageerbuis wisselen, indampen.

-Hoge(ca.100%) en reproduceerbare recoveries.

-Schone extracten (zelfs geschikt voor LCMS).

-Coffeïne en Benzos in A1 fase.

-Hypermodern, maar nog niet 100% voor STIP.

-Reeds getest voor ca. 200 TDM stoffen.

Liquid /liquid, verschillende recoveries-zuur: amo/flu/keto-basisch: diph/flu/chloor/clom

Het STIP testmengsel wordt als voorbeeld genomenen in serum gespiked.

Nu naar SPE met A1 en A2 als voorbeeld! Stel als 100%

Serum opbrengen met buffer ph:3.

Wassen met 3 ml water: Elueer met 3 ml A1 fase (100% acetonitril), zure en neutrale stoffen.

Indampen, oplossen in 100 μl eluens, 2x25 μl injecteren.

Elueer in schone buis met 3 ml A2 fase(3 ml NH3 25% in 97% acetonitril.),basische stoffen. Indampen, oplossen in 100 μl eluens en 2x25 μl injecteren.

Wat voorbeelden met STIP en SPE met de voordelen!

Psychofarmaca 1 en GEEN storing door benzo’s.

Hetzelfde voor psychofarmaca 2

Hetzelfde voor psychofarmaca 3

Betere recoveries en reproduceerbaarheid, vooral van de metaboliet.

Schone extracten met lage concentraties.

Toch netjes werken!

Bij basische Liquid/Liquid extractie van midazolam, storen vaak benzo’s en bv omeprazol + metabolieten! SPE is een snelle oplossing!

STIP beta STIP beta

““Het spel begint………”Het spel begint………”

STIP Search en STIP beta kunnen naast elkaar draaien

Zie hiervoor help.

Met read spectrum komen we in de map waar de exports zich

Inzoomen op spectrum voor kwantificering , handig bij pieken die schaal aflopen

Het zoekresultaat veld laat de

informatie zien van de bovenste keuze.

Let op de metaboliet!

Info opslaan bij de stof

Zelf copy van chromatogram als naslag werk

Drugs in hoofdletters en geneesmiddelen

Let op measure en normalised

Onder liberary kan men door het bestand bladeren voor de aanwezige informatie over de stoffen.

De STIP-doa stoffen zijn met hoofdletters vermeld.

Mass is gericht op de toekomst als naast spectrum en retentietijd er ook op bv ‘moedermassa’ gezocht kan worden.

M.b.v. de STIP-configuratie kunnen een aantal parameters tijdens gebruik worden aangepast. Als STIP beta opnieuw opgestart wordt, worden de default-waarden gebruikt.

Ook kan een andere bibliotheek bekeken worden indien aanwezig.

STIP beta is ontwikkeld voor geneesmiddel onderzoek in serum. Met de opgedane kennis en ervaring is sinds 2006 de STIP beta bestand uitgebouwd en toepasbaar gemaakt voor drugs-screening in urine. Deze screening wordt uitgevoerd m.b.v. een Solid Phase Extraction en met trager eluens. Het zoekprogramma kan gewoon op dezelfde manier gebruikt worden.

Let op :

STIP-doa maakt gebruik van een ander eluens met een “andere” kolom.

Stoffen staan in de STIP beta bestand.

Hier het testmengsel, overeenkomend met 1 mg/l drugs.

STIP en STIP-doa gebruiken beide het STIP beta programma.Dit pakket is als demo te downloaden op www.zanob.nl onder het kopje STIP.Hier staat nog meer informatie over toepassingen en gebruik van het STIP systeem.

STIP beta identificeert op retentietijd en spectrum.Conclusies dienen getrokken te worden door een analist door het samenvoegen van informatie verstrekt door STIP beta bv. halfwaarde tijden, aanwezige metabolieten, concentratie indicatie etc.

STIP beta is ontwikkeld voor tox-screening in ziekenhuizen.Echter in de loop der jaren is het tox-screenings systeem uitgegroeid tot een laboratorium systeem. Met de toepassing van de SPE alsextractie methodiek, is STIP heel goed te gebruiken voor TDM. Aangezien STIP semi-kwantitatieve concentraties berekend, is bij de TDM-toepassing een ijklijn of standaarden gewenst.

Voor meer vragen kunt u altijd terecht; C.Pijnenburg@zanob.nl

Met dank aan Jacob Diepenbroek, ZANOB