SPOTTEN MET BLOED - nvkc.nl - The Matrix... · Sinds 2000 onderdeel van het Nederlandse neonatale...

SPOTTEN MET BLOED

Ir. Mariëtte T. Ackermans, PhDAnalytisch Chemica

Laboratorium voor EndocrinologieAcademisch Medisch Centrum

Amsterdam

DISCLOSURE

Burgers’ Zoo – 17-11-2015

(Potentiële) Belangenverstrengeling Geen

Laboratory of Endocrinology

Monster dilemma


Dried Blood Spot

Voordelen:

• Patiënt kan eenvoudig thuis zelf bloed afnemen

• Monster kan via reguliere post naar lab gestuurd

• Klein monstervolume (belangrijk voor o.a. neonaten)

Nadelen:

• Gevoeligere meetmethoden nodig vanwege kleine

monstervolumina

• Validatie DBS ten opzichte van conventionele bloedafname

(effecten matrix zoals HT en bloedvolume)


Adrenogenitaal syndroom (AGS)

Sinds 2000 onderdeel van het Nederlandse neonatale

screeningsprogramma


AGS screening: Hielprik

Interpretatie afhankelijk van zwangerschapduur

Actie:

• 17-hydroxyprogesteron afwijkend: verwijzing naar kinderarts

• 17-hydroxyprogesteron dubieus: 2e hielprik aanvragen


AGS screening in AMC (2012)

Neonaten

n=35087

Negatief

n=35057

Dubieus

n=29Positief

n=1

Dubieus

n=0Positief

n=2

Negatief

n=21

1ste Hielprik

2de Hielprik (n=23)

Verwezen

n=3

Geen aktie

n=35078

Verwezen

n=6


Diagnostiek

Synacthen test:

Bepaling van cortisol na synacthen

In eerste monster ook:

17-OHP, testosteron, androsteendion,

ACTH en PRA

Monster volume: 1 mL bloed

O

O

HO

H

H

H

17-OHP

O

O

H

H

H

Androsteendion


Nadelen immunoassays

• Kruisreactiviteit ten gevolge van non-specifieke binding

• Aparte immunoassays nodig voor 17-OHP en androsteendion

O

O

OHHO

HO

H

H

H

O

O

HO

H

H

H

O

O

HO

H

H

H

OH

17-OHP

Cortisol

11-Deoxycortisol


LC-MSMS versus immunoassays

Voordelen:

• Kruisreactiviteit is geen issue

• Meerdere componenten kunnen in één run gemeten worden

• Lineaire bereik is groter

• Kan worden gezien als gouden standaard

Nadelen:

• Er is meer monstervoorbereiding nodig (matrix effect)

• Apparatuur is duurder en complexer

• Analist moet meer geschoold worden/zijn


2nd Tier test eerste hielprik

Voordelen:

• Geen tweede hielprik nodig (voordeel voor de neonaat en

sneller)

• Minder vals positieven

• Minder ongerustheid ouders

Voordat we dit in gebruik kunnen nemen is een analytische en

klinische validatie nodig.


LC-MSMS methode

Monstervoorbewerking:

DBS: extractie met acetonitril/H2O

Interne Standaarden: deuterium gelabelde steroïden

LC-MSMS

Kolom: Acquity HSS T3 (50x2.1mm, 1.7 µm)

Mobiele fase:

A: 2 mM Ammonium acetaat/H2O + 0.1% mierenzuur

B: 2 mM Ammonium acetaat/methanol + 0.1% mierenzuur

0.6 mL/min, gradiënt: 40 tot 64% B

Detectie: MS/MS Waters Xevo TQ-S


Chromatogram standaard


Chromatogram Hielprik (♂, 41.5 w, 3664 g)


Chromatogram Hielprik (♂, 41.5 w, 3664 g)

11-deoxycorticosteron


Extractie recovery

Component Extractie recovery

d3-testosteron 86% 72%

d8-17-hydroxyrogesteron 78% 68%

d7-androsteendion 72% 62%

d4-cortisol 88% 76%

d8-corticosteron 80% 69%


Matrix effect

Component Matrix effect

testosteron -6%

17-hydroxyrogesteron 5%

androsteendion 6%

11-deoxycortisol 8%

cortisol 10%

cortison 18%

corticosteron 2%

21-deoxycortisol 9%

11-deoxycorticosteron -7%


Analytische validatie

Lineariteit

COR : 1-1000 nmol/L

DAND, TST, CCN : 1-100 nmol/L

11-DOCL, 21-DOCL, OHP, CN: 1-500 nmol/L

Stabiliteit

DBS: Tenminste 3 weken op KT, 4°C of -20 °C

Ge-extraheerde spots: 2 dagen bij 10 °C

Precisie

Intra-assay CV <8%;

Total-assay CV <8%

LLOQ

<1 nmol/L voor alle

componenten

COR:cortisol, DAND:D4-androstenedion; TST:testosteron; CCN:corticosteron, 11-DOCL:11-deoxycortisol

21-DOCL:21-deoxycortisol, OHP:17-hydroxyprogesteron, CN:cortison


Vergelijking met OHP Immunoassay van

de screening

Referentie

populatie

Neonaten

met bewezen

21-

hydroxylase

deficiëntie


Klinische validatie: referentiewaarden


Steroidprofiel kinderen met afwijkende

AGS screening

♦ Referentie populatie ■ Neonaten met bewezen AGS


Steroidprofiel kinderen met afwijkende

AGS screening

♦ Neonaten met afwijkende 1ste hielprik ■ Neonaten met bewezen 21-hydroxylase deficiëntie


Biosynthese 21-deoxycortisol


Conclusie

De LC-MSMS methode kan worden gebruikt als 2nd tier test voor AGS

21-Desoxycortisol is een goede marker voor AGS. De 8 neonaten die

bewezen 21-hydroxylase deficiëntie hebben konden op basis van de 21-

desoxycortisol geïdentificeerd worden uit de groep met 94 dubieuze of

afwijkende eerste hielprik

Door de 2nd tier test voor dubieuze en afwijkende eerste hielprik screening

van AGS te gebruiken:

• Is er geen tweede hielprik nodig (voordeel voor de neonaat en sneller)

• Zijn er minder vals positieve uitslagen

• Is er minder ongerustheid ouders


Acknowledgements

An RuiterErik Endert

Anita Boelen

Hedi Claahsen

Nationale screeningslabs:

Marja van Veen (AMC)

Marella Bouva (RIVM)

Johan Timmers (Elisabeth Ziekenhuis Tilburg)

Carolien van Rijswijk (IJsselland Ziekenhuis,

Capelle a/d IJssel)

Gerda Beltman (Isala Klinieken, Zwolle)

SPOTTEN MET BLOED - nvkc.nl - The Matrix... · Sinds 2000 onderdeel van het Nederlandse neonatale...

Documents

Transcript of SPOTTEN MET BLOED - nvkc.nl - The Matrix... · Sinds 2000 onderdeel van het Nederlandse neonatale...