Reversibiliteit amfetamine geïnduceerde agitatie in de hond...modellen waarbij het volledige...

Reversibiliteit amfetamine geïnduceerde agitatie in de hond

Afstudeerverslag

Versienr.: 1.0Student: Lodewijk ToonenE-mail: [email protected]: Janssen PharmaceuticaDatum: Augustus 2009Begeleidende docent: Ans Arets

Reversibiliteit amfetamine geïnduceerde agitatie in de hond

Afstudeerverslag

Avans HogeschoolAcademie voor de Technologie van Gezondheid en Milieu

Naam Student: Lodewijk ToonenStudentnummer: 1121642Opleiding: Biologie en Medische Laboratoriumtechniek Minor: ProefdierkundeE-mail Adres Student: [email protected]

Naam Bedrijf: Janssen PharmaceuticaAfdeling: Neuroscience Adres: Turnhoutseweg 30, Beerse (België)Website: www.janssenpharmaceutica.be

Naam begeleider: Dhr. D. SmetsE-mail adres begeleider: [email protected] projectleider/mentor: Dr. H. BorghysE-mail adres projectleider/mentor: [email protected] begeleidende docent: Mw. Drs. J.M.C. AretsE-mail adres begeleidende docent: [email protected]ördinator: Mw. Dr. J.M.J. WilminkE-mail adres Stagecoördinator: [email protected]

Voorwoord

Dit afstudeerverslag is geschreven als afsluiting van de 4 jarige bachelor opleiding Biologie en medische laboratoriumtechniek, met de minors histologie en proefdierkunde. De afstudeerstage is uitgevoerd op de afdeling neurowetenschappen van Janssen Pharmaceutica te Beerse, België. Tijdens de periode maart-juli 2009 heb ik meegewerkt op het in vivo gedeelte van deze afdeling en een indruk gekregen van allerlei aspecten die komen kijken bij het werken met diermodellen. Graag wil ik mijn mentor dr. Herman Borghys bedanken voor deze kans en zijn inhoudelijke steun. Voor de verdere inhoudelijke hulp en suggesties bedank ik drs. Ellen Clessens. Ook mijn stagebegeleider Dirk Smets wil ik bedanken voor zijn goede dagelijkse begeleiding en bijsturing waar nodig. Tot slot bedank ik Els Weltens, Sofie Tombeur en Robert Mostmans voor het aanleren van verschillende proefdierkundige technieken en verdere begeleiding.

Summary

In this report a novel animal model based on the dopamine hypothesis of schizophrenia is described. The goal of the study was to evaluate the reversibility of amphetamine induced agitation in Beagle dogs. This model is similar to previously described locomotory studies in rats, where rats are dosed with amphetamine to produce an agitated state. The underlying principle of these studies is based on the fact that amphetamine greatly increases the amount of dopamine released in the mesolimbic system of the brain. Since dopamine is one of the primary neurotransmitters related to schizophrenia, the construct validity of these models is considered to be reasonably high. Some substances can however have limited or bad kinetic distribution in rodents, and thus not be properly tested in rats. Also, some substance related side-effects have been known to be only detectable in the non-rodent species. In these cases the tested canine model could potentially be used as an alternative method for detecting antipsychotic activity of substances. For this model to be of added value, it has to provide a good predictive validity. For the experiment 12 Marshall Beagle dogs (6 male and 6 female) were selected based on their relatively low locomotory activity. The dogs were divided into 2 groups and dosed once per week. An actiwatch (sleep analysis system) was placed around the dogs necks before dosing and locomotion was registered continuously during an 8 hour period. The animals were subcutaneously dosed with 2,5 mg/kg amphetamine half an hour after dosing with a known antipsychotic. Observations were done at 75 and 45 minutes before dosing with amphetamine and 1, 2, 4 and 6 hours after dosing. The body temperature was also measured at these time intervals. Observations were done for 1 min. in front of the cage and for 10 min. through camera’s (undisturbed). During the observation periods stereotypical behavior caused by amphetamine was scored. Two doses of haloperidol, olanzapine and risperidone were tested in this manner. The doses for these antipsychotics were based on ED50 values from previous conditioned avoidance response experiments. Results were compared to the maximum agitation; a value obtained from dosing with amphetamine without antipsychotic. The results indicate that all tested antipsychotics are able to produce a lower state of locomotion as well as lower body temperature and stereotypy compared to dosing with amphetamine. While these results confirm the viability of the mechanisms of the model, no clear statements can be made about the predictive validity yet. This would require further investigation of more dosages of antipsychotics, tested in a higher number of dogs.

Samenvatting

In dit verslag is een farmacologisch non-rodent diermodel voor het testen van antipsychotica beschreven. Het doel van de studie was om de reversibiliteit van amfetamine geïnduceerde agitatie te evalueren. Het diermodel is gebaseerd op de dopamine hypothese van schizofrenie en is vergelijkbaar met eerdere studies in ratten, waarbij ratten in een geagiteerde staat worden gebracht door het doseren met amfetamine. Hierbij wordt getest in hoeverre stoffen in staat zijn deze agitatie op te heffen, hetgeen een indicatie geeft in de antipsychotische werking van deze stoffen. Het mechanisme van deze studies is gebaseerd op het feit dat amfetamine de hoeveelheid dopamine in o.a. het mesolimbische systeem van de hersenen sterk verhoogt. Van de neurotransmitter dopamine is bekend dat deze een rol speelt bij de etiologie van schizofrenie. Sommige stoffen kunnen een slecht kinetisch profiel hebben in knaagdieren. Ook is bekend dat sommige stoffen bijwerkingen vertonen in non-rodents, maar niet in knaagdieren. In deze gevallen kan het geteste model in de hond toegepast worden om de antipsychotische werking van stoffen te evalueren. Het is daarom van belang dat het diermodel een goede predictieve waarde heeft; dus een goed vermogen om de antipsychotische werking van stoffen aan te tonen. Voor het experiment werden 12 Marhall Beagles (6 mannetjes en 6 vrouwtjes) geselecteerd op lage bewegingsactiviteit. Deze dieren werden verdeeld in 2 groepen van 6 en een maal per week gedoseerd. Om de nek van de dieren werd een actiwatch apparaat geplaatst, welke de mate van beweging van de honden continu registreerde gedurende een periode van 8 uur. De honden werden met een bekend antipsychoticum gedoseerd en een half uur later werd 2,5 mg/kg amfetamine gedoseerd. De honden werden 75 en 30 min. voor het doseren van amfetamine geobserveerd en 1, 2, 4 en 6 uur na dosering. Tijdens deze observaties werd de mate van stereotypie en de lichaamstemperatuur genoteerd. Observaties geschiedde voor het hok gedurende 1 min. per hond en via een camera. Op deze manier zijn 2 dossisen van haloperidol, olanzapine en risperidone getest. De dosissen voor deze stoffen waren gebaseerd op gevonden ED50 waarden van conditioned avoidance response experimenten met honden.Uit de resultaten blijkt dat de drie geteste antipsychotica allen in staat zijn om de effecten van amfetamine te verminderen. Dit geldt voor zowel de verhoogde mate van beweging als voor de verhoogde lichaamstemperatuur en stereotypie. Deze resultaten zijn volgens de verwachting, maar er kan nog geen goede uitspraak gedaan worden over de predictieve waarde van het model. Hiervoor moeten meerdere dosissen antipsychotica getest worden.

Inhoudsopgave

1 INLEIDING ........................................................................................................... 7

2 ACHTERGRONDINFORMATIE ................................................................................ 8

3 DOEL .................................................................................................................. 15

4 MATERIAAL EN METHODE ................................................................................... 16

5 RESULTATEN ...................................................................................................... 19

6 CONCLUSIE ........................................................................................................ 32

7 DISCUSSIE ........................................................................................................ 33

L. Toonen: Reversibiliteit van amfetamine geïnduceerde agitatie in de hond

1 Inleiding

Diermodellen welke gebruikt worden om menselijke aandoeningen te bestuderen omvatten modellen waarbij het volledige syndroom wordt nagebootst, of modellen waarbij specifieke symptomen tot uiting komen. Een model wordt voor deze toepassing gedefinieerd als een experimentele opstelling voor het bestuderen van een bepaald fenomeen of aandoening in 1 of meerdere diersoorten. Veelal zijn deze modellen dieren welke een menselijke aandoening in een bepaalde mate benaderen. [1]In het geval van psychische stoornissen is het lastig om een diermodel te ontwikkelen welke het volledige syndroom simuleert. Dit komt omdat psychische stoornissen worden gekarakteriseerd door een significante mate van heterogeniteit en een complex klinisch verloop waarbij verschillende aspecten een rol spelen. Om deze reden zijn de pogingen om een volledig syndroomdiermodel te ontwikkelen tot dusver weinig succesvol geweest. Diermodellen die wel veel toegepast worden in onderzoek naar schizofrenie zijn modellen welke systematisch de werking van antipsychotische behandelingen aantonen. Hierbij wordt het gemanipuleerde diergedrag gebruikt om enkel de effectiviteit van bekende therapeutische stoffen te testen en op deze manier kan leiden tot de ontdekking van gerelateerde farmacotherapieën. Omdat het enige doel van deze benadering het voorspellen van therapeutische activiteit is, wordt het principe achter deze aanpak “farmacologisch isomorfisme” genoemd. [2]In deze categorie van farmacologische modellen zijn verschillende veel gebruikte submodellen. Bij deze studie wordt 1 van deze modellen geëvalueerd; het zogenaamde dopamine agonist model. Het achterliggende principe van dit model is gebaseerd op de dopamine hypothese van schizofrenie, welke ervan uitgaat dat een verhoogde dopamine concentratie bijdraagt aan de symptomen van schizofrenie. In de studie worden beaglehonden gedoseerd met amfetamine en een bekend therapeutisch farmacon voor de behandeling van schizofrenie. De amfetamine zal zorgen voor een verhoogde concentratie dopamine in o.a. het mesolimbisch systeem van de hersenen, terwijl de therapeutische stof dit effect zal verminderen (dopamine antagonisme). In de studie werden eerste generatie antipsychotica getest, zoals haloperidol, alsmede twee van de nieuwere atypische antipsychotica zoals risperidone en olanzapine. De indeling van dit verslag is als volgt:In hoofdstuk 2 staat achtergrondinformatie over betrokken diermodellen en mechanismen van de biologische processen.In hoofdstuk 3 wordt het doel van de studie beschreven. In hoofdstuk 4 wordt de werkwijze van de experimentele handelingen beschreven.In hoofdstuk 5 worden de resultaten besproken.Tot slot wordt in hoofdstuk 6 de voorlopige conclusie van het onderzoek beschreven en in hoofdstuk 7 de discussie.

24-10-2011 Pagina 7 van 35


2 AchtergrondinformatieIn dit hoofdstuk wordt de benodigde informatie gegeven over de betrokken biologische processen/mechanismen welke van toepassing zijn bij het dopamine agonist diermodel.

2.1 SchizofrenieSchizofrenie is een psychische aandoening die voorkomt bij 1 procent van de bevolking in alle culturen. De aandoening komt evenveel voor bij mannen en vrouwen, maar komt bij vrouwen vaak later tot uiting dan bij mannen. Schizofrenie wordt gekarakteriseerd door positieve en negatieve symptomen. De positieve symptomen hebben betrekking op: hallucinaties, denkbeeldige stemmen die met of over de persoon praten en delusies die vaak paranoïde zijn. De negatieve symptomen zijn o.a.: sociale isolering/terughouding, verminderde motivatie/initiatiefname, verminderderde cognitie en verstoorde emoties. Er is bekend dat een voorgeschiedenis van schizofrenie in de familie een belangrijke risicofactor is, maar duidelijke oorzaken van schizofrenie zijn moeilijk vast te stellen. Vooral omgevingsfactoren tijdens het opgroeien zijn belangrijk in het al dan niet schizofreen worden. Schizofrenie is geclassificeerd met 5 subtypes, afhankelijk van de mate van aanwezigheid van de symptomen. Voor de behandeling van schizofrenie zijn al rond 1960 medicijnen beschikbaar. Vroeger waren deze gebaseerd op dopamine antagonisten, welke de conventionele antipsychotica worden genoemd. Meer recentelijk zijn de medicijnen gebaseerd op gemengde neuroreceptor antagonisten en worden de atypische antipsychotica genoemd.[3] Er moet vermeld worden dat alle tot dusver bekende medicatie voor schizofrenie een significante mate van bijwerkingen vertoont, meer informatie hierover volgt vanaf 2.8.

2.2 Validatie van diermodellenBij dierproeven is de bruikbaarheid van de resultaten grotendeels afhankelijk van de keuze van het diermodel. Afhankelijk van het type onderzoek en diermodel zullen verkregen resultaten in meer of mindere mate extrapoleerbaar zijn. Er zijn geen duidelijke ‘regels’ voor het kiezen van diermodellen en extrapolatie naar andere diersoorten of de mens, anders dan wat uit ervaring al bekend is. Wel wordt er de laatste jaren een zwakte/sterkteanalyse gebruikt voor verschillende diermodellen. Bij deze analyse wordt op wetenschappelijke wijze de waarde van een diermodel bepaald. Dit wordt een validatieproces genoemd. Bij het validatieproces worden drie begrippen gebruikt: face validity, construct validity en predictive validity.Face validity omschrijft in hoeverre de fenomenologie/ziekteverschijnselen van het diermodel overeenkomen met mens. Construct validity omvat de mate van overeenkomst in de pathofysiologie en etiologie tussen het diermodel en de mens. Predictive validity geeft aan in hoeverre het diermodel een goede voorspelbaarheid geeft voor de mens, dus of het effect op een behandeling in het diermodel en de mens gelijk zijn. Geen enkel diermodel zal volledig overeenkomen met het ziekteproces in de mens. Het is dan ook belangrijk om te weten wat de sterke en zwakke punten van het diermodel zijn om een verantwoorde keuze te kunnen maken. Los van bovenstaande criteria zijn er ook allerlei praktische en ethische beperkingen welke bijdragen aan het opstellen van een dierexperiment.[4]

2.3 Dopamine agonist modelBij onderzoek naar schizofrenie worden farmacologische diermodellen met een farmacon geïnduceerde staat veel gebruikt. Bij deze modellen wordt een aspect of symptoom van schizofrenie kunstmatig geïnduceerd in een dier. Het achterliggende principe van deze aanpak is, in het geval van schizofrenie, gebaseerd op 1 van de volgende 3 tot dusver bekende hypothesen: de dopamine hypothese, de serotonine-dopamine hypothese en de glutamate hypothese. De hier beschreven studie is

24-10-2011 Pagina 8 van 35


gebaseerd op de dopamine hypothese, waarbij amfetamine wordt gebruikt om de vrijgave van dopamine te verhogen. Oorspronkelijk werd alleen de dopamine hypothese van schizofrenie in diermodellen gebruikt omdat de stereotypie die waargenomen werd bij de gedoseerde dieren vergelijkbaar lijkt met die van mensen met schizofrenie (face validity). Recentelijk is echter gebleken dat deze vergelijking in farmacologisch opzicht onvolledig is en dat het gaat om 2 verschillende neurobiologische fenomenen. Daarnaast zorgt amfetamine voor een hyperactiviteit in dieren, wat geen symptoom van schizofrenie is. Daarnaast moet vermeld worden dat de face validity bij het, zoals hier beschreven, acuut toedienen van antipsychotica in een diermodel geen face validity vertoont met de situatie in de mens. Dit is omdat antipsychotische werking van de medicijnen in de mens pas optreedt na dagen of weken van dagelijkse toediening. Het feit dat het dopamine agonist model dus niet ‘echte’ schizofrene stereotypie kan opwekken, betekent echter niet dat het model niet bruikbaar is om de effectiviteit van schizofreniemedicijnen te testen. De amfetamine geïnduceerde effecten in knaagdieren, zoals stereotypie en hyperactiviteit, kunnen goed worden gebruikt om te kijken hoe effectief een medicijn is qua dopaminergene behandeling na acute toediening. De construct validity van deze experimenten is gegrond in het feit dat dopamine een prominente rol speelt bij schizofrenie. Omdat hier een model wordt onderzocht dat gericht is op dopamine hypothese, is de construct validity m.b.t. de dopamine hypothese van schizofrenie dus goed. [5]

2.4 Conditioned avoidance responseDe antipsychotica dosissen die in dit experiment gebruikt zijn, waren gebaseerd op eerdere resultaten van een conditioned avoidance response (CAR). In dit geval is gebruik gemaakt van de jumping box. De jumping box voor honden is een kooi die bestaat uit 2 compartimenten gescheiden door een luik. De vloer van de kooi bestaat uit roosters waarmee een elektrische schok toegediend kan worden. In de kooi kan 1 hond per keer geplaatst worden. Wanneer het experiment gestart wordt, zal gedurende 5 seconden een buzzer klinken. De bedoeling is dat de hond binnen deze 5 seconden van het ene compartiment naar het andere springt via het luik, dat automatisch tegelijk met de buzzer ontgrendeld wordt. Tijdens 1 jumping box trial zal deze buzzer 10 maal klinken, zodat de hond dus 10 keer van compartiment wisselt. Wanneer de hond niet binnen de 5 seconden buzzertijd springt, wordt een elektrische schok toegediend. In normale condities zal dit de hond stimuleren om alsnog van compartiment te wisselen. Wanneer de hond springt tijdens de buzzer is dit een avoidance response, tijdens de stroom een escape response en als de hond helemaal niet springt, heet dit een missed escape. De honden zijn dusdanig geconditioneerd dat deze in controle omstandigheden maximaal 1 van de 10 maal per trial een escape response vertonen. Bij een experiment wordt een trial uitgevoerd voor dosering (pre) en op: 1, 2, 4, 6 en 24 uur na dosering van teststof. Het verlies van avoidance response is het criterium waarmee het effect van de gedoseerde stof wordt vastgesteld. Via dit principe kan een effective dose (ED-50) worden vastgesteld. De ED-50 is dan de dosis waarbij de helft van de honden meer dan 2x per trial, onafhankelijk van tijdstip, een escape response vertoont. [6] Bij dit type conditioned response experimenten gebaseerd op de avoidance methode is bekend dat een stof met antipsychotische werking een selectieve inhibitie van de avoidance response veroorzaakt. Dit houdt in dat een antipsychoticum bij het juiste dosisgebied zorgt dat de avoidance response geremd wordt, maar de escape response door de stimulus behouden blijft. Bijna alle andere stoffen die niet antipsychotisch werken, hebben niet deze dosismarge die alleen de avoidance, maar niet de escape onderdrukken. Dit effect is veelvuldig toegepast als diermodel van CAR met ratten om het antipsychotische potentieel van stoffen te testen. Er is gebleken dat dit model een hoge predictive validity heeft, dit wordt bewezen door de positieve correlatie tussen de ED-50 van antipsychotica in de CAR-

24-10-2011 Pagina 9 van 35


test en de klinische dosis van deze stoffen als dagelijkse toediening bij schizofrene patiënten. [7] De predictive validity is echter niet perfect; er zijn stoffen (LSD, morfine) die vals positieve resultaten opleveren en dus de CAR specifiek kunnen onderdrukken. Vals negatieve stoffen zijn nog niet bekend omdat alle antipsychotica de CAR onderdrukken. De face validity van dit diermodel is minder goed, omdat CAR geen symptoom of disfunctie van schizofrenie simuleert. De construct validity in verhouding tot de antipsychotische medicijnen zou betekenen dat het onderdrukken van CAR in bepaalde mate analoog zou zijn aan het blokkeren van de pathosfysiologische mechanismen verantwoordelijk voor schizofrenie. Recentelijk bewijs suggereert dat de rol van bepaalde dopamine pathways inderdaad een rol kan spelen bij het selectief onderdrukken van CAR.

2.5 AmfetamineAmfetaminen zijn structureel geclassificeerd als 1 een fenyl ring, een dubbele koolstofketen tussen de fenylring en de stikstof groep, een α-methyl groep en een primaire aminogroep (zie figuur 1). Amfetamine is beschikbaar in verschillende vormen. Wanneer in dit verslag amfetamine (AMF) wordt genoemd, wordt het standaard dl-amfetamine bedoeld. Dit is een racemisch mengsel van d-amfetamine en l-amfetamine.

Figuur 1: Moleculaire structuren van dopamine en amfetamine [9]

Amfetamine kwam in 1937 op de markt in tabletvorm. Gebruik van amfetaminen vond veelvuldig plaats gedurende de tweede wereldoorlog, waarbij het gebruikt werd om vermoeidheid te voorkomen en alertheid te versterken. Meer recentelijk wordt amfetamine gebruikt als therapie voor ADHD; na toediening wordt bij deze aandoening namelijk een verbetering in impulscontrole en concentratie vastgesteld, evenals een vermindering van irritatie en sensorische overstimulatie. Amfetaminen worden ook gebruikt bij de behandeling van slapeloosheid en als aanvulling bij antidepressiva. [8]Amfetamine is een psychostimulant welke gebruikt wordt bij de behandeling van o.a. ADHD, slaapstoornissen en obesitas. Fysiologische korte termijn effecten kunnen sterk variëren afhankelijk van de dosis en de toedieningswijze. Bij therapeutische doseringen van amfetamine zijn de meest voorkomende bijwerkingen: verminderde eetlust, verhoogde motivatie, verandering in slaappatroon, maagklachten, onregelmatige hartslag, hoofdpijn en een lichte mate van verwarring.Bij hoge doseringen kunnen er o.a. tremoren, rusteloosheid, verandering in slaappatroon, angstaanvallen, misselijkheid, tachycardie, onregelmatige hartslag, euforie, hallucinaties, psychose, uitputting/vermoeidheid, paranoia en versnelde ademhaling optreden. [9]

2.6 Mechanisme van amfetamine De dopamine active transporter (DAT) is een transmembraan eiwit dat de neurotransmitter dopamine bindt en zorgt voor de heropname ervan uit de synaptische spleet. Wanneer er binding plaatsvindt tussen dopamine en DAT, vindt een conformationele verandering plaats, waardoor natrium en chloride ionen van buiten de cel in het cytosol worden gebracht. DAT is aanwezig in het synaptische gebied van dopaminerge neuronen in gebieden van de hersenen waar dopamine signalering veelvuldig voorkomt. Dit zijn de zgn. dopaminerge circuits, namelijk: mesostriatale, mesolimbische en mesocorticale pathways.

24-10-2011 Pagina 10 van 35


Dopamine heeft een functie in verschillende cognitieve functies, zoals “beloning”. DAT bewerkstelligt de regulatie van dit signaal. DAT is een eiwit dat dopamine naar de lagere concentratie binnen de cel transporteert. Het meest geaccepteerde model voor de monoamine transporter functie is het model waarbij natriumionen binden aan het extracellulaire domein van de transporter voordat dopamine kan binden. Wanneer dopamine vervolgens bindt, kunnen de natrium- en chloridenionen aan de intracellulaire deel van de transporter weer los komen. Studies met radioactief gelabeld dopamine tonen aan dat de dopamine transporter dezelfde werking heeft als andere monoamine transporters, in de zin dat er 1 neurotransmitter molecuul over het membraan wordt getransporteerd en 1 of 2 natrium ionen. Chloride ionen zijn nodig om te voorkomen dat er een te hoge positieve lading ontstaat binnen de cel. De transportratio is volledig afhankelijk van de natriumgradiënt.[9]

Voor het functioneren van de diffusie/omgekeerd transport modellen is het cruciaal dat AMF een substraat is voor de dopamine transporter. Bewijs dat amfetamine analoge substraten zijn voor de dopamine transporter kwam van elektrofysiologische studies met Xenopus oocyten welke expressie hadden van de dopamine transporter.AMF veroorzaakte hierbij een dopamine efflux in neuronale culturen en heterologe cellen welke via 2 mechanismen. De eerste is een snelle manier waarbij in korte stoten van een aantal milliseconden lang dopamine wordt vrijgegeven via kanalen. De 2e is een langzamere uitwisseling variant. De snelle vrijgave van dopamine is ongeveer verantwoordelijk voor 1 tiende van de totale hoeveelheid vrijgekomen dopamine. Opvallend is dat deze vrijgave echter wel het meest overeenkomt met vesiculaire vrijgave; zowel in grootte en timing. Het is hierdoor mogelijk dat deze route verantwoordelijk kan zijn voor de psychostimulerende werking van amfetaminen. [9]Nog meer bewijs dat AMF een substraat analoog is voor de plasmamembraan dopamine transporter komt van bevindingen waarbij werd vastgesteld dat amfetamine de activiteit van striatale dopamine transporters remt door competitie met dopamine voor dezelfde bindingsplaats. Er is dus een grote hoeveelheid bewijs dat AMF een substraat analoog is van dopamine. Dit komt waarschijnlijk door de grote overeenkomsten in de moleculaire structuur van deze 2 stoffen (zie figuur 1).

Amfetamine heeft verschillende effecten op de neurotransmitters vrijgave. Een hoge dosis van amfetamine beïnvloedt de balans van dopamine en noradrenaline in de hersenen op 4 manieren (zie figuur 2):

1. Amfetamine bindt aan het pre-synaptisch membraan van dopaminerge neuronen en zorgt voor vrijgave van dopamine uit de zenuwterminal.

2. Amfetamine kan interactie ondergaan met dopaminehoudende synaptische vesicles en zo zorgen voor meer vrije dopamine in de zenuwterminal.

3. Amfetamine binding aan monoamine oxidase, welke normaal zorgt voor de afbraak van dopamine. Remming hiervan zorgt dus voor het behouden van vrije dopamine in de zenuwterminal.

4. Binding aan de dopamine transporter, waardoor de werking hiervan omgekeerd wordt. Dit zorgt voor vrijgave van dopamine uit de zenuwterminal.

Een hoge dosis van amfetamine heeft een vergelijkbare werking op de noradrenaline neuronen door stimulatie van vrijgave en remming van opname van noradrenaline. [10]

24-10-2011 Pagina 11 van 35

Figuur 2: Mechanisme amfetamine bij de zenuwterminal en synaptische spleet(CNSforum.com)De invloed op dopamine is als volgt: Amfetamine bindt op het neuronmembraan (1), heeft invloed op de synaptische vesicles (2), remt monoamine oxidase (3) en beïnvloedt het dopamine her-opname eiwit (4).


De meest beschreven methode is die waarbij extracellulair amfetamine bindt aan de dopamine uptake transporter en zo de terminal in gevoerd wordt. De amfetamine dissocieert vervolgens in het cytosol, waardoor dopamine in het cytosol aan de transporter bindt en in de extracellulaire ruimte (synaptische spleet) terecht komt. Recentelijk is het “zwakke base model” geïntroduceerd. Omdat amfetaminen zwakke basen zijn, zou het kunnen dat deze de catecholamines uit de synaptische vesicles vrijmaken door de vesiculaire proton gradiënt te verstoren die voor vrije energie voor de catecholamines accumulatie zorgt. In dit model werkt de accumulatie ook met niet stimulerende zwakke basen. Het overtollige dopamine in het cytosol wordt wederom via de dopamine transporter in de

extracellulaire ruimte getransporteerd.

2.7 Dopamine receptorDopamine receptoren zijn metabotropische G-protein gekoppelde receptoren van het centrale zenuwstelsel, welke als ligand de neurotransmitter dopamine hebben. Dopaminereceptoren worden geassocieerd met motivatie, plezier, cognitie, geheugen, leervermogen en fijne motoriek.Op het moment dat dopamine gebonden wordt aan de dopamine receptor, zal dit zorgen voor activatie van het G-protein Gαs eiwit, welke zorgt voor de directe remming van cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) formatie. cAMP is verantwoordelijk voor de intracellulaire signaaltransductie. De plaatsgevonden reactie reguleert de natrium en calcium kanalen in het postsynaptische membraan die belangrijk zijn voor de eerder genoemde gradiënt voor het vrijkomen van neurotransmitters uit de zenuwterminal.

2.8 Conventionele en atypische antipsychoticaSchizofrenie is een chronische psychiatrische aandoening waarbij vooralsnog constante medicatie nodig is. Over de jaren heen zijn voor schizofrenie verschillende medicijnen gevonden. De eerste stoffen zoals thioridazine hadden heterogene receptorbindende eigenschappen. Deze groep medicijnen wordt tot de groep conventionele medicijnen met een lage potentie gerekend. Hierdoor moesten deze medicijnen in relatief hoge doseringen worden toegediend voordat er remming van de schizofrenie symptomen optrad. De volgende fase in conventionele medicijnontwikkeling ging uit van meer selectief bindende medicijnen, namelijk de selectieve D2 antagonisten als haldol welke minder cardiovasculaire bijwerkingen veroorzaakte. De conventionele medicijnen waren redelijk effectief in het bestrijden van de zgn. positieve symptomen, maar niet erg geschikt voor het verminderen van de negatieve schizofrenie symptomen Verder was dit type weinig bruikbaar voor de cognitieve symptomen (lage alertheid, verminderde executieve functie). Naast deze beperkingen in het bestrijden van symptomen, zorgen de conventionele medicijnen voor een aantal bijwerkingen. De meest

24-10-2011 Pagina 12 van 35


voorkomende bijwerkingen zijn de extrapiramidale symptomen (EPS). Het extrapiramidale systeem is het netwerk in de hersenen betrokken bij de coördinatie van bewegingen. De meest bekende EPS is in deze context tardieve dyskinesie van het gezicht. Dit gaat om: herhaaldelijk smakken, wenkbrauw optrekken, draaien van ogen etc. Bij langdurig gebruik van conventionele antipsychotica kunnen er potentieel irreversibele tardieve dyskinesie symptomen optreden. In 1960 werd clozapine ontdekt, welke de productie van atypische antipsychotica inluidde. De strikte definitie van atypie is in deze context het ontbreken van EPS. De ontdekking van clozapine zorgde voor meer inzicht in het farmacologische profiel van schizofrenie, omdat clozapine een lage affiniteit heeft voor dopamine D2 receptoren en toch een degelijk klinisch effect had. Clozapine had duidelijke voordelen t.o.v. de conventionele medicijnen, omdat er duidelijk minder EPS aanwezig was en in tegenstelling tot de conventionele medicijnen geen verhoogd niveau van prolactine in het bloed veroorzaakte. Deze effecten zijn dan ook rechtstreeks gerelateerd aan dopamine antagonisme. Later bleek echter dat clozapine ook in zeer geringe mate agranulocytose tot gevolg had, wat leidde tot een aantal doden en uiteindelijk tot een verbod op het medicijn. Na onderzoek bleek dat de hogere affiniteit voor serotonine 5-HT2 receptoren in verhouding tot de dopamine D2 receptoren van clozapine zorgde voor het unieke klinische profiel. Na deze ontdekking werden een nieuwe reeks medicijnen ontwikkeld gebaseerd op dit gecombineerd serotonine-dopamine principe, zoals: risperidone, olanzapine, quetiapine, sertindole, ziprasidone en zotepine. Ook werden een aantal selectieve 5-HT2 antagonisten zoals ritanserine geproduceerd om minder bijwerkingen te krijgen, het bleek echter dat deze reeks medicijnen niet effectief waren als antipsychotica.[11]

2.8.1 HaloperidolHaloperidol (haldol) werd in 1957 ontdekt door Janssen Pharmaceutica. Het is een 1e

generatie conventioneel antipsychoticum en anti-emeticum (tegen misselijkheid) en werkt door middel van dopamine antagonisme in de mesocortex en het limbische systeem van de hersenen. Haloperidol was gedurende lange tijd de gouden standaard voor de behandeling van verschillende psychotische problemen, totdat de 2e generatie neuroleptica verschenen. Haldol is een niet-selectief antipsychoticum en bindt aan dopamine D1 en D2, 5-HT2, histamine H1 en α2 adrenoreceptoren in de hersenen. Ook veroorzaakt het de dopaminergene werking in de nigrostriatale pathways, wat waarschijnlijk de reden is dat er veel EPS optrad na inname van het medicijn. Deze EPS symptomen omvatten pseudo-parkinsonisme, waarbij korte spiertrekkingen optreden. Haldol heeft ook verdovende eigenschappen en heeft een sterke werking tegen psychomotorische agitatie. Haldol heeft lichte antihistamine en anticholinergische eigenschappen, waardoor bijwerkingen als hypotensie, droge mond, constipatie, etc in lagere mate voorkomen dan bij andere antipsychotica zoals chlorpromazine. Andere bijwerkingen zijn tachycardia, impotentie en duizeligheid. Deze effecten worden veroorzaakt door de niet-selectieve interactie met de α-adrenoreceptor. De histamine H1 blokkerende werking veroorzaakt een lichte mate van verdoving en gewichtstoename.[11]

24-10-2011 Pagina 13 van 35


2.8.2 RisperidoneRisperidone is een nieuwer type antipsychoticum, behorend tot de atypische oftewel second generation neuroleptica. Risperidone kan binden aan dopamine D2, 5-HT2 en α2 adrenoreceptoren in de hersenen. Risperidone heeft, in tegenstelling tot de eerste generatie neuroleptica, geen affiniteit voor de D1 receptoren. Een aantal van de bijwerkingen die bij de oudere typen neuroleptica aanwezig zijn, komen hierdoor minder voor bij risperidone. De bijwerkingen die er wel zijn, zoals tachycardia, impotentie en duizeligheid, worden geassocieerd met de niet-selectieve binding aan de α-adrenoreceptoren (zie figuur 3).[12]

2.8.3 OlanzapineOlanzapine is een atypisch antipsychoticum welke sinds 1996 gebruikt wordt bij de behandeling van schizofrenie. Olanzapine heeft een hogere affiniteit voor 5-HT2 receptoren dan voor D2 dopamine receptoren. Ook heeft olanzapine een lagere affiniteit voor histamine, cholinergische, muscarine en α-adrenogene receptoren. De effectiviteit van olanzapine komt waarschijnlijk ook door gecombineerd dopamine D2 en serotonine 5HT2 antagonisme.[11]

24-10-2011 Pagina 14 van 35

Figuur 3: Effecten van risperidone (CNSforum.com)De effectiviteit van risperidone komt door het blokkeren van dopamine D2 receptoren. De

bijwerkingen komen waarschijnlijk vooral door binding aan α-adrenoreceptoren.


3 Doel

Het doel van de studie was om de reversibiliteit van amfetamine geïnduceerde agitatie in de hond te evalueren. Voor het in dit verslag beschreven deel van de studie waren de concrete doelen:

- Vaststellen welke dosis van amfetamine een duidelijke en tolereerbare mate van agitatie opwekt in honden

- Vaststellen in hoeverre haloperidol, olanzapine en risperidone deze agitatie kunnen opheffen

Dit farmacologisch diermodel zal in essentie een aspect van schizofrenie simuleren in de hond d.m.v. dopamine agonisme. Het toedienen van hoge dosering amfetamine zal o.a. zorgen voor een verhoogde dopamine vrijgave in de hersenen van de dieren; waarvan met name het mesolimbisch systeem relevant is voor schizofrenie. De verhoogde concentratie van dopamine zorgt voor een geagiteerde staat, waarbij de hond een sterk verhoogde mate van locomotie en stereotypie zal laten zien en de lichaamstemperatuur zal stijgen. Wanneer er naast amfetamine een antipsychoticum (dopamine antagonist) wordt toegediend, zal dit de oorzaak van de agitatie tegengaan en zodoende de agitatie verminderen. Vanwege de complexiteit van schizofrenie en de enigszins beperkte betrouwbare klinische bevindingen bij studies met schizofreniepatiënten, is het lastig om een diermodel hiervoor goed te kunnen valideren. Door de aandacht te verschuiven naar één aspect van schizofrenie en niet het volledige syndroom is men in staat, zij het in beperkte mate, een nauwkeurigere extrapolatie tussen het diermodel en de mens te verkrijgen. De sterkte van deze mechanistische studie zal dus niet liggen in het ontdekken van medicijnen met andere of nieuwe mechanismen, maar meer in het betrouwbaar aantonen van dopamine antagonisten in een non-rodent species. Het nut van deze studie is dus ook afhankelijk van de eventuele vraag naar analyse in honden van dopamine-antagonisten of stoffen die anderszins inwerken op de dopamine pathway.

Wanneer blijkt dat het model een goede gevoeligheid/betrouwbaarheid heeft, zal het gebruikt worden wanneer er vraag is naar controle van centraal dopamine antagonisten en stoffen die inwerken op de dopamine pathway in een non-rodent diermodel. De vraag naar extra onderzoek in een non-rodent model komt wanneer er belangrijke species verschillen tussen de rat en hond worden vastgesteld. Deze verschillen kunnen gebaseerd zijn op:

- Een slechte kinetiek van het antipsychoticum in de rat- Belangrijke nevenwerkingen in de hond welke niet in de rat tot uiting komen,

waardoor het belangrijk is een veiligheidsmarge te bepalen in dezelfde species.

24-10-2011 Pagina 15 van 35


4 Materiaal en methodeIn dit hoofdstuk worden de gebruikte materialen en de werkwijze van de experimentele fase beschreven.

DierenDe gebruikte honden waren 12 Marshall Beagles geleverd uit Italië, waarvan 6 mannetjes en 6 vrouwtjes. De leeftijd van de dieren was rond de 2 jaar en de gewichten varieerde van ongeveer 7 tot 11 kg. Deze dieren werden sinds 2008 gebruikt in het amfetamine experiment en werden eerder daarvoor gebruikt in andere experimenten. Hierbij werd rekening gehouden met eerder gedoseerde stoffen door een voldoende lange wash-out periode toe te passen en de gezondheid van de honden te controleren door observaties en bloedanalyse. Identificatie van de honden geschiedde m.b.v. een oortatoeage.De dieren werden tijdens de experimentele fase individueel gehuisvest. De lichtcyclus was 12/12 u. De temperatuur lag tussen 15-24oC, de relatieve vochtigheid werd niet gecontroleerd.

Dierenwelzijn De studie is uitgevoerd in een AAALAC-erkend laboratorium. De faciliteiten van Janssen Pharmaceutica voldoen aan deze inspectie eisen en de dieren worden behandeld volgens de Europese [13] en Belgische richtlijnen [14].

Selectie dieren:Voor het selecteren van de dieren werden alle beschikbare honden getest op hun activiteitspatroon. Voor de studie werden de kalmste honden gekozen, zodat het contrast na toediening van amfetamine zo groot mogelijk was. Bij het selectieonderzoek werden de honden gedoseerd met saline en gecontroleerd met het actiwatch systeem.De honden welke werden gebruikt in de studie, voldeden aan de volgende eisen:

- De tijd in beweging was minder dan 75%- De totale activiteit was een score lager dan 200.000

ActiwatchDe actiwatch werd aan het begin van de dag om de nek van de dieren geplaatst. De actiwatch is een omni-directionele acceleratiemeter. Het actiwatch systeem wordt veel gebruikt bij mensen om inzicht te krijgen in: activiteit, slaappatroon, Parkinson onderzoek, respetoire medicijnen, psychiatrie, etc. [15]Omdat de actiwatch reeds veel gebruikt wordt voor het betrouwbaar monitoren en kwantificeren van beweging bij de mens, is het apparaat erg goed toe te passen om de mate van agitatie van de honden objectief vast te stellen.De meetresultaten van de actiwatch gaven inzicht in:

- De tijd in beweging, uitgedrukt in percentages- De totale activiteit, dit gaf een indruk van de intensiteit en hoeveelheid van

beweging

Dosering teststoffen:De antipsychotica werden gedoseerd volgens onderstaande tabel 1:

Teststof Route Dosis 1 Dosis 2Haloperidol Subcutaan 0,02 0,08Olanzapine Subcutaan 0,32 1,25Risperidone Subcutaan 0,04 0,16

Tabel 1: dosering teststoffen

24-10-2011 Pagina 16 van 35


De dosissen werden geselecteerd aan de hand van eerder uitgevoerde conditioned avoidance response experimenten met honden in de jumpingbox. De ED50 waarde uit deze experimenten werd gebruikt als richtlijn voor de gebruikte dosis (zie 2.4 voor toelichting).

Vervolgens werd aan de hand van de resultaten van deze dosis de 2e dosis bepaald, in deze 3 gevallen werd een factor 4 verschil gebruikt. Amfetamine werd steeds aan een dosis van 2,5 mg/kg toegediend. De dosis van amfetamine werd eerder bepaald aan de hand van dosisresponse curve.De 2 groepen van 6 dieren werden 1x per week gedoseerd (1 groep per dag).

De wekelijkse dosering werd aan de hand van onderstaande tabel 2 uitgevoerd:Week Groep 1 Groep 2

1 Antipsychoticum A + saline* Antipsychoticum B + saline*2 Antipsychoticum A + amfetamine Antipsychoticum B + amfetamine3 Saline* + saline* Saline* + saline*4 Saline* + amfetamine Saline* + amfetamine

Tabel 2: Wekelijkse toediening teststoffen*Saline = controleoplossing van steriel fysiologisch zout (0,9 % NaCl)

Het toedienen van saline werd gedaan om te controleren of de honden nog volgens verwachting reageerden op de gedoseerde stof en niet een geconditioneerd gedrag lieten zien. Wanneer er saline + amfetamine gedoseerd werd, zou dit een ongeremde geagiteerde staat op moeten wekken. Antipsychoticum + saline laat het effect van alleen het antipsychoticum zien, wat dus EPS en licht verminderde activiteit kan zijn. Wanneer er 2 maal saline werd gedoseerd, zou het gedrag van de honden dicht bij de oorspronkelijke baseline moeten liggen. Als dit niet het geval zou zijn, kan het zijn dat de hond een geconditioneerde reactie laat zien, waardoor de hond niet meer gebruikt kan worden voor het experiment.

Testfase:Op de dag van dosering werden de 6 honden op honger gezet en individueel gehuisvest. Tijdens de loop van de dag werd de bewegingsactiviteit van de honden geregistreerd. Ook werden eventuele stereotypie of EPS symptomen vastgesteld door middel van observatieperiodes aan het hok en via camera’s. Bij elke observatie tijdstip werd ook de temperatuur rectaal gemeten. Bij de 2 pre-doseringsobervaties werd een baseline vastgesteld welke de bewegingsactiviteit van de honden in normale toestand vaststelde. Voor het dagschema zie tabel 4.

Tijdstip Handeling-90 min Actiwatch plaatsing-75 min Observaties + temp. Pre 1-50 min Observaties + temp. Pre 2-30 min Dosering antipsychoticum

of saline0 u Dosering amf. of saline1 u Observaties + temp.2 u Observaties + temp.4 u Observaties + temp.6 u Observaties + temp.6,5 u Actiwatch verwijderingTabel 2: Handelingen op dag van dosering

24-10-2011 Pagina 17 van 35


Observaties:De observaties werden gedurende 1 minuut gedaan voor het hok van de hond. De observaties via de camera’s werden gedaan door 10 minuten naar alle honden tegelijk te kijken op een televisiescherm. Tijdens de observatieperiodes werd vooral gelet op stereotypie. De mate van stereotypie is een indicator voor de activiteit van amfetamine. [16]

De criteria voor stereotiep gedrag waren:- herhaaldelijk voor- en achteruit lopen - cirkels lopen- schokkerige bewegingen zoals kopschudden

Dit gedrag werd gescoord in een schaal van 0 t/m 3, waarbij:0 = niet aanwezig1 = nauwelijks, af en toe2 = continu, alleen onderbroken door de hond te benaderen of te roepen3 = continu, niet onderbroken door de hond te benaderen of te roepen

24-10-2011 Pagina 18 van 35


5 Resultaten

In dit hoofdstuk worden de resultaten van de dosisbepaling van amfetamine en de testen met antipsychotica weergeven. De resultaten zijn voor elke groep weergegeven als de gemeten lichaamstemperatuur, actiwatch metingen (% in beweging + totale activiteit) en stereotypie observaties via de camera.

5.1 Amfetamine dosisbepalingIn grafiek 1 staan de gemeten lichaamstemperatuur na dosering met amfetamine voor de doserange finding.

Grafiek 1: lichaamstemperatuur amfetamine

Na toediening van amfetamine stijgt de lichaamstemperatuur van de honden, de hoogste waarde werd voor elke dosis gevonden op het 1u observatie tijdstip. In grafiek 2 en 3 zijn de resultaten van de actiwatch weergegeven.

Grafiek 2: Tijd in beweging amfetamine Grafiek 3: Totale activiteit amfetamine

De tijd in beweging wordt na dosering van amfetamine 100% bij elke dosis. Amfetamine bij een dosis van 2,5 mg/kg zorgt voor de hoogste totale activiteit. Bij een dosis van 5,0 mg/kg vermindert de totale activiteit door een te grote mate van stereotypie, wat duidt op een overdosis. Op basis van deze gegevens is gekozen om amfetamine bij een dosis van 2,5 mg/kg te gebruiken.

24-10-2011 Pagina 19 van 35

Dier nr.

12 2 1 1 1 12 0 1 1 1 1

11 1 1 1 11 1

10 10

9 9

8 8

7 7

6 6

5 5

4 4

3 3

2 2

1 1Tijd (u) -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6

T-30: salineT0: saline

score 0score 1score 2score 3

Dier nr.

12 2 3 3 2 2 12 1 3 3 3 2

11 1 3 3 2 2 11 3 3 3 2

10 2 2 2 1 10 3 3 3 2

9 2 2 2 1 9 3 3 2 2

8 2 2 2 1 8 3 3 2 2

7 2 2 1 1 7 3 3 2 2

6 1 1 1 6 3 3 2 2 6 3 3 3 3

5 1 1 1 5 3 3 2 2 5 3 3 3 3

4 1 1 1 4 3 3 2 2 4 3 3 3 3

3 1 3 2 2 2 1 3 3 3 3 2

2 2 2 2 2 1 2 3 3 3 2

1 1 2 2 2 1 1 3 3 2 2Tijd (u) -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6

T-30: salineT0: amfetamine


Amfetamine 1.25 mg/kg Amfetamine 2.5 mg/kg

Baseline 1 Baseline 2

Amfetamine 5 mg/kg


In diagram 1 staan de scores van stereotypie welke gevonden zijn bij de verschillende dosissen amfetamine via observatie met de camera’s. In de baseline vertonen de honden,

op 2 na, geen stereotypie. De mate van stereotypie werd beduidend hoger wanneer amfetamine werd gedoseerd. Bij 1,25 mg/kg hebben 2 honden na 1 en 2 uur een score 3 en 4 honden een score 2. Na 6 uur was de mate van stereotypie nog steeds hoger dan de baselines. Bij 2,5 mg/kg amfetamine was de mate van stereotypie aanzienlijk hoger dan de baselines en 1,25 mg/kg, hierbij vertoonden namelijk alle honden stereotypie gedurende de hele periode. Op het 1 en 2 uur tijdstip hadden 9/12 honden de maximale score.

Bij een dosis van 5,0 mg/kg is de mate va

24-10-2011 Pagina 20 van 35


n stereotypie nog hoger dan 2,5 mg/kg. De mate van st

24-10-2011 Pagina 21 van 35


ereotypie werd bij 5,0 mg/kg te uitgesproken en daaro

24-10-2011 Pagina 22 van 35


m is gekozen om deze dosis niet meer verder te testen

24-10-2011 Pagina 23 van 35


, waardoor er maar van 6 i.p.v. 12 honden meetwaarden

24-10-2011 Pagina 24 van 35


zijn.

Diagram 1: stereotypie amfetamine

5.2 HaloperidolIn grafiek 4 staan de gemeten lichaamstemperatuur na doseringen met haloperidol en amfetamine.

24-10-2011 Pagina 25 van 35


Grafiek 4: Lichaamstemperatuur haloperidol

De temperaturen zijn uitgezet als het verschil t.o.v. de prewaarden (1u voor doseren). Het grootste verschil is gevonden bij de dosis van enkel amfetamine, dit leverde namelijk een verhoging op van 2,0 oC na 1 uur. Haloperidol verminderde de temperatuurstijging door amfetamine op een dosisafhankelijke wijze. Bij 0,08 mg/kg haloperidol was het verschil t.o.v. de prewaardes na 2 uur 1oC, waar dit bij alleen amfetamine bijna 2oC zou zijn.In grafiek 5 en 6 staan respectievelijk de tijd in beweging en de totale activiteit.

Grafiek 5: Tijd in beweging haloperidol Grafiek 6: Totale activiteit haloperidol

De tijd in beweging werd bij alle honden na toediening van 2,5 mg/kg amfetamine 100% gedurende de gehele observatieperiode. Wanneer enkel 0,08 mg/kg haloperidol werd toegediend, daalde de tijd in beweging duidelijk t.o.v. de baselines tot onder de 20% (sedatie). Wanneer de combinatie van haloperidol + amfetamine werd gegeven, is te zien dat de tijd in beweging minder is dan bij enkel amfetamine, met een bewegingspercentage rond de 80% bij 0,08 mg/kg haloperidol. De totale activiteit geeft hetzelfde beeld. Het verschil van haloperidol in combinatie met amfetamine t.o.v. enkel amfetamine komt hierbij duidelijker naar voren.

In diagram 2 staan de scores voor stereotypie welke zijn gevonden bij haloperidol.

24-10-2011 Pagina 26 van 35


Dier nr.

6 1 6 1 1 1 6 1 3 3 3 2

5 5 5 3 3 3 2

4 4 4 3 3 2 2

3 3 3 3 3 2 2

2 2 2 2 2 2 1

1 1 1 2 2 2 1Tijd (u) -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6

Dier nr.

6 1 2 2 2 3 6 1 1 6 3 3 3 2 2 6 2 3 3 2 2

5 0 1 0 1 1 5 5 2 2 2 2 1 5 2 2 1 1

4 0 1 0 0 0 4 4 1 2 2 2 1 4 1 1 1

3 0 0 0 0 0 3 3 0 1 1 1 1 3 1 1

2 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 1 2

1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1Tijd (u) -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6

T-30: saline of haloperidolT0: saline of amfetamine


Haloperidol 0.08 mg/kg+Amf 2.5 mg/kg

Baseline 1 Baseline 2 Amfetamine 2.5 mg/kg

Haloperidol 0.02 mg/kg Haloperidol 0.08 mg/kg Haloperidol 0.02 mg/kg+Amf 2.5 mg/kg

Diagram 2: stereotypie haloperidol

De mate van stereotypie is bij 0,02 mg/kg haloperidol hoger dan bij zowel 0,08 mg/kg en de baselines. Dit komt waarschijnlijk omdat haloperidol EPS veroorzaakt, waarvan sommige als stereotypie worden geclassificeerd. Bij 0,08 mg/kg haloperidol is echter de mate van sedatie hoger, waardoor de vastgestelde stereotypie minder werd. Wanneer haloperidol werd toegediend voor de amfetamine dosering, werd minder stereotypie vastgesteld. Bij 0,02 mg/kg haloperidol met amfetamine werd score 3 nog 2x vastgesteld op het 1 en 2 uur tijdstip, wat een duidelijke vermindering is t.o.v. de amfetamine controle. Bij 0,08 mg/kg haloperidol met amfetamine was de mate van stereotypie iets minder dan bij 0,02 mg/kg.

24-10-2011 Pagina 27 van 35


5.3 OlanzapineIn grafiek 7 staan de gemeten lichaamstemperatuur na dosering van de honden met olanzapine.

Grafiek 7: Lichaamstemperatuur olanzapine

De amfetamine en baseline controles zijn hier dezelfde als bij haloperidol. Wanneer olanzapine + amfetamine werd toegediend, steeg de lichaamstemperatuur minder sterk. Het temperatuurverschil t.o.v. de prewaarde blijft lager dan 1oC. In grafiek 8 en 9 staan respectievelijk de tijd in beweging en totale activiteit.

Grafiek 8: Tijd in beweging olanzapine Grafiek 9: Totale activiteit olanzapine

In tegenstelling tot haloperidol lijkt olanzapine in de hoge dosering (1,25 mg/kg) niet voor een vermindering van de tijd in beweging te zorgen t.o.v. de baseline waardes. Dit komt omdat olanzapine in principe geen sederende werking heeft.Bij olanzapine in combinatie met amfetamine is de tijd in beweging wel minder dan bij enkel amfetamine.

24-10-2011 Pagina 28 van 35


Dier nr.

6 1 6 1 1 1 6 1 3 3 3 2

5 5 5 3 3 3 2

4 4 4 3 3 2 2

3 3 3 3 3 2 2

2 2 2 2 2 2 1

1 1 1 2 2 2 1Tijd (u) -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6

Dier nr.

6 3 2 2 3 3 6 3 0 2 1 3 6 2 2 2 2 2 6 3 3 2 2 3

5 5 2 0 1 0 0 5 1 2 2 2 2 5 2 1 1 2 2

4 4 2 0 0 0 0 4 1 1 2 2 4 2 1 1 1 1

3 3 0 0 0 0 0 3 1 3 0 0 0 0 0

2 2 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0

1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0Tijd (u) -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6

T-30: saline of olanzapineT0: saline of amfetamine


Olanzapine 1.25 mg/kg+Amf 2.5 mg/kg


Olanzapine 0.32 mg/kg Olanzapine 1.25 mg/kg Olanzapine 0.32 mg/kg+Amf 2.5 mg/kg

Diagram 3: stereotypie olanzapine

De mate van stereotypie bij dosering van 0,32 mg/kg olanzapine lijkt iets hoger dan de baseline, maar dit kan ook komen doordat 1 hond deze dag stereotypie vertoonde zonder dosering (score 3 op -1 tijdstip). De stereotypie bij 1,25 mg/kg leverde vergelijkbare scores op. Wanneer olanzapine in combinatie met amfetamine werd toegediend, werd minder stereotypie vastgesteld dan bij enkel amfetamine. Bij 0,32 mg/kg en 1,25 mg/kg olanzapine in combinatie met amfetamine waren de scores voor stereotypie vergelijkbaar.

24-10-2011 Pagina 29 van 35


5.4 Risperidone In grafiek 10 staan de gemeten lichaamstemperatuur na dosering van de honden met risperidone. Voor deze reeks is een andere groep van 6 honden gebruikt dan bij haloperidol en olanzapine.

Grafiek 10: Lichaamstemperatuur risperidone

De lichaamstemperatuur stijgt met 2 oC na 1 uur van amfetamine toediening. De combinatie amfetamine + risperidone levert een vergelijkbaar temperatuurprofiel op als haldol en olanzapine; een vermindering van de amfetamine geïnduceerde temperatuurstijging.In grafiek 11 en 12 staan de tijd in beweging en totale activiteit.

Grafiek 11: Tijd in beweging risperidone Grafiek 12: totale activiteit risperidone

De tijd in beweging na toediening van risperidone daalt tot ongeveer 30% bij beide dosissen. Bij de tijd in beweging van risperidone is het verschil t.o.v. de baselines hierdoor het grootst van de geteste antipsychotica. Bij dosering in combinatie met amfetamine is het verschil tussen de dosissen groter; bij 0,16 mg/kg daalde de tijd in beweging tot ongeveer 70% waar deze bij 0,04 mg/kg niet lager dan 90% werd. Bij de totale activiteit is te zien dat risperidone bij een dosering van 0,16 mg/kg de amfetamine geïnduceerde beweging het meest lijkt tegen te gaan van de tot dusver geteste antipsychotica. Bij 0,16 mg/kg is de activiteit terug naar baselineniveau.

24-10-2011 Pagina 30 van 35


Dier nr.

6 2 1 1 1 6 1 1 6 3 3 3 2

5 1 1 5 5 3 3 2 2

4 4 4 3 3 2 2

3 3 3 3 3 2 2

2 2 2 3 3 2 2

1 1 1 2 2 2 1Tijd (u) -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6

Dier nr.

6 2 1 1 2 2 6 1 1 1 1 6 2 3 2 2 1 6 2 2 2 2 2

5 0 0 0 0 0 5 1 5 1 2 1 1 0 5 2 1 1 1

4 0 0 0 0 0 4 1 4 0 2 1 0 0 4 1 1

3 0 0 0 0 0 3 3 0 0 1 0 0 3

2 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0 0 0 2

1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1Tijd (u) -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6 -1 1 2 4 6

T-30: saline of risperidoneT0: saline of amfetamine


Risperidone 0.16 mg/kg+Amf 2.5 mg/kg


Risperidone 0.04 mg/kg Risperidone 0.16 mg/kg Risperidone 0.04 mg/kg+Amf 2.5 mg/kg

Diagram 4: Stereotypie risperidone

In diagram 4 staan de gevonden scores voor stereotypie bij risperidone. Risperidone heeft geen invloed op de mate van stereotypie t.o.v. de baselines. Wanneer risperidone in combinatie met amfetamine werd gedoseerd, ging de mate van stereotypie duidelijk omlaag. Bij 0,04 mg/kg risperidone + amf. werd score 3 nog maar 1x vastgesteld en bij 0,16 mg/kg risperidone + amf. kwam score 3 niet meer voor.

24-10-2011 Pagina 31 van 35


6 Conclusie

6.1 Dosisbepaling amfetamineVan de 3 geteste amfetamine dosissen (1,25; 2,5 en 5,0 mg/kg) gaf 5,0 mg/kg de grootste stijging in lichaamstemperatuur, maar 2,5 mg/kg de hoogste totale activiteit. Omdat beweging/activiteit de belangrijkste parameters van het experiment zijn en de mate van stereotypie te uitgesproken was bij 5,0 mg/kg, werd geconcludeerd dat 2,5 mg/kg de beste dosis was voor amfetamine.

6.2 AntipsychoticaHet doel van de studie was om vast te stellen in hoeverre de 3 geteste antipsychotica met 2 dosissen de amfetamine geïnduceerde agitatie in de hond konden opheffen. Hieronder staat per antipsychoticum wat het effect was wanneer deze werden gedoseerd, alvorens amfetamine toe te dienen:

Haloperidol:- Vermindert de temperatuurstijging- Vermindert de tijd in beweging met name bij 0,08 mg/kg (daling max. 20%) - Vermindert de totale activiteit- Vermindert de mate van stereotypie

Olanzapine:- Vermindert de temperatuurstijging- Vermindert alleen bij 1,25 mg/kg de tijd in beweging - Vermindert de totale activiteit bij 0,32 mg/kg en 1,25 mg/kg - Vermindert de mate van stereotypie

Risperidone: - Vermindert de temperatuurstijging alleen bij 0,16 mg/kg- Vermindert de tijd in beweging alleen bij 0,16 mg/kg- Vermindert de totale activiteit bij 0,04 mg/kg en 0,16 mg/kg- Vermindert de mate van stereotypie

Op basis van de tot nu toe gevonden resultaten kan gezegd worden dat het diermodel aan de verwachting voldoet; de amfetamine geïnduceerde agitatie wordt inderdaad verminderd door toediening van antipsychotica. Dit geldt voor alle drie van de geteste antipsychotica voor zowel de temperatuurstijging, als de tijd in beweging en totale activiteit. Tot dusver is de predictive validity van het model dus bevestigd, maar om de stoffen met elkaar te kunnen vergelijken op basis van een ED50, moet er nog een derde dosis getest worden. De data moet vervolgens statistisch verwerkt worden.

24-10-2011 Pagina 32 van 35


7 Discussie

Naar aanleiding van de gevonden resultaten kunnen een aantal uitspraken gedaan worden over beperkende en/of bemoeilijkende factoren van de studie. Een complicerende factor m.b.t. tot locomotie in dit onderzoek is het feit dat sommige antipsychotica in staat zijn om de mate van locomotie van de honden significant te verminderen t.o.v. baseline condities. Bij de huidige resultaten komt dit duidelijk naar voren bij haloperidol en risperidone. Het probleem dat door dit stofeffect ontstaat, is dat het een vals positieve indruk van dopamine antagonisme kan geven. Wanneer in dit geval de amfetamine geïnduceerde locomotie verlaagd wordt, kan dit ook gerelateerd zijn aan het ‘sederende’ effect van het antipsychoticum en dus niet perse aan een invloed op de dopamine pathway.

Een duidelijke praktische beperking welke van te voren al bekend was, is dat niet alle honden geschikt zijn voor gebruik in dit soort studies. Bij het vooronderzoek (hier niet beschreven) werd namelijk vastgesteld dat een deel van de honden niet voldeden aan de gestelde richtlijnen. Het probleem lag hierbij vooral in het feit dat deze honden een bewegingspercentage groter dan 75% of een totale activiteitscore hoger dan 200.000 hadden. Gebruik van deze honden zou zorgen dat de amfetamine geïnduceerde agitatie slechter vast te stellen zou zijn door een slecht contrast t.o.v. baseline. Naast het feit dat niet alle honden ‘rustig’ genoeg waren, moet er opgemerkt worden dat de variatie tussen de overgebleven dieren hoog was, hetgeen dan ook in sommige gevallen voor een hoge standaard error zorgde. Dit heeft echter niet perse een negatieve invloed op de betrouwbaarheid van de gemiddelde waarden, omdat de individuele reactie op de behandeling bij de honden wel degelijk vergelijkbaar was. Een hoge standaard error kan in de regel verminderd worden door het gebruik van meer honden, of door honden te selecteren die in baselinecondities meer vergelijkbare scores hebben voor alle parameters. Tijdens de studie viel ook op dat er honden waren welke stereotypie vertoonden zonder toediening van teststof of amfetamine. Een voorbeeld hiervan staat in diagram 2 op blz. 21 bij 0,02 mg/kg haldoperidol, waarbij scores 3, 2 en 1 stereotypie voorkomen op tijdstip -1 u. Normaal is de mate van stereotypie een goede indicator voor activiteit van amfetamine [16], mits de honden zonder doseren geen of weinig stereotypie vertonen. In dit geval vertoonde dus 3 van de 6 honden stereotypie alvorens te doseren, wat kan wijzen op conditionering. Hierdoor wordt het lastig om deze parameter nog te vergelijken met bijvoorbeeld de dosis 0,08 mg/kg haloperidol, waar op het -1 u tijdstip een hond score 1 stereotypie heeft. Verder is het zo dat doseren met amfetamine enige terughoudendheid vereist; er kan tolerantie/verslaving optreden. Omdat het bij deze studie enkel om het acuut effect van amfetamine gaat, is het een vereiste dat tolerantie bij de dieren voorkomen wordt. Dit was ook de reden dat er per groep maximaal 1 maal per week gedoseerd werd en regelmatig getest werd met saline of saline + amfetamine, zoals aangegeven in tabel 2. Ondanks deze beperkingen laat het model toe om het centraal D2 antagonisme van stoffen te testen. Hierbij moet men rekening houden met de beïnvloedende factoren en voldoende controles inbouwen, ook voor conditionering, om de data juist te kunnen interpreteren.

24-10-2011 Pagina 33 van 35


Lijst van afkortingen

AMF: dl-amfetaminecAMP: cyclisch adenosine monofosfaatCAR: conditioned avoidance responseDAT: dopamine active transporter ED-50: effective dose 50 EPS: extrapiramidale symptomen

24-10-2011 Pagina 34 van 35


Literatuurlijst

1. M.A. Geyer, A. Markou; animal models of psyciatric disorders, 1995 2. S. Mattysse; Animal models in psychiatric research, 19863. S.H. Schultz et al, Schizophrenia: a review, 20074. L.F.M. van Zutphen, Handboek proefdierkunde, elsevier 2003 ISBN: 97890352261595. I. Creese: Stimulants; neurochemical, behavioral, and clinical perspectives, 19836. S. Fielding, Industrial Pharmacology: neuroleptics, 19747. M.G. Wadenberg, The conditioned avoidance response test re-evaluated: is it a

sensitive test for the detection of potentially atypical antipsychotics?, 19998. D. Sulzer et al; Mechanisms of neurotransmitter release by amphetamines: a review,

20059. A.E. Fleckenstein et al, New insights into the mechanism of action of amphetamines,

2007 10.CNSforum.com, www.cnsforum.com/imagebank/item/Drug_neurolep_atypical/

default.aspx, geraadpleegd juli 2009 11.O. Agid et al, Emerging drugs for schizophrenia, 200812.S. Kapur et al, The D2 dopamine receptor occupancy of risperidone and its

relationship to extrapyramidal symptoms: a pet study, 199513.Council directive of November 24, 1986 (86/609/EEG) on the approximation of laws,

regulations and administrative provisions of the Member States regarding the protection of animals used for experimental and other scientific purposes.European Convention (ETS No. 123) for the protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes

14.Belgian Law (October 18, 1991): Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. Royal Decree of November 14, 1993 for the protection of laboratory animals.

15.Philips respironics, www.actiwatch.respironics.com, geraadpleegd juli 2009 16.S. R. Bareggi et al, stereotyped behavior and hyperthermia in dogs: correlation with

the levels of amphetamine and p-hydroxyamphetamine in plasma and CSF, 1978

24-10-2011 Pagina 35 van 35

Reversibiliteit amfetamine geïnduceerde agitatie in de hond...modellen waarbij het volledige...

Documents

Transcript of Reversibiliteit amfetamine geïnduceerde agitatie in de hond...modellen waarbij het volledige...