Proteoomstudie van huidfibroblasten voor de identificatie ... · PCA Principle Component Analysis...
90
Proteoomstudie van huidfibroblasten voor de identificatie van sleuteleiwitten in de pathogenese van aorta-aneurysma’s. Guillaume Vanden Weghe Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Bart Loeys Begeleidster: Marjolijn Renard Vakgroep: Pediatrie en Genetica Academiejaar 2009-2010
Transcript of Proteoomstudie van huidfibroblasten voor de identificatie ... · PCA Principle Component Analysis...
Proteoomstudie van huidfibroblasten voor de identificatie van
sleuteleiwitten in de pathogenese van aorta-aneurysma’s.
Guillaume Vanden Weghe
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Bart Loeys
Begeleidster: Marjolijn Renard
Vakgroep: Pediatrie en Genetica
Academiejaar 2009-2010
Proteoomstudie van huidfibroblasten voor de identificatie van
sleuteleiwitten in de pathogenese van aorta-aneurysma’s.
Guillaume Vanden Weghe
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Bart Loeys
Begeleidster: Marjolijn Renard
Vakgroep: Pediatrie en Genetica
Academiejaar 2009-2010
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor
consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk
gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te
vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
Datum:
Guillaume Vanden Weghe Prof. Dr. Bart Loeys
Inhoudsopgave
Samenvatting………. …………………………………………………………………...... 1
1. Inleiding………………………………………………………………………………... 2
1.1 Aorta-aneurysma……..…………………………….......................................... 2
1.1.1 Inleiding……………………………………………..……………… 2
1.1.2 Thoracale aorta-aneurysma ..………………………...……………... 2
1.1.2.1 Syndromale TAA……………………………………..…... 3
1.1.2.2 Niet-syndromale TAA ………………………….………… 3
1.1.3 Extracellulaire matrix………………………………………………..3
1.1.4 Fibrilline-1………………………………………………..………… 4
1.1.5 TGFβ mechanisme………………………………………………….. 4
1.2 Marfan syndroom……………………………………………………………...6
1.2.1 Inleiding…………………………………………………………….. 6
1.2.2 Epidemiologie…………………………………………………......... 6
1.2.3 Klinische manifestatie en diagnostische criteria……………............. 6
1.2.3.1 Cardiovasculair systeem…………………………….......... 6
1.2.3.2 Skeletaal systeem…………………………………………. 7
1.2.3.3 Oculair systeem…………………………………………… 7
1.2.3.4 Andere systemen………………………………………….. 7
1.2.4 Pathogenetische aspecten…………………………………………… 8
1.2.5 FBN1 mutatiespectrum……………………………………………... 8
1.3 Loeys-Dietz Syndroom……………………………………………………….. 9
1.3.1 Inleiding…………………………………………………………….. 9
1.3.2 Genetische aspecten………………………………………………… 10
1.3.3 Potentiële mechanismen voor de opregulatie van TGFβ signalisatie. 10
1.4 2-D DIGE……………………………………………………………………...12
1.4.1 Principe 2-D DIGE…………………………………………………. 12
2. Doelstelling ...……….…..……………………………………………………………... 18
3. Materiaal en methoden…………………………………….…………………………... 19
3.1 Patiëntenmateriaal…………………………………………………………….. 19
3.2 Celcultuur…………………………………………………………………….. 19
3.2.1 Celkweek…………………………………………………………… 19
3.2.2 Medium en cellen oogsten………………………………………….. 20
3.3 Precipitatie van eiwitten……………………………………………………… 20
3.3.1 Precipitatie van proteïnen uit cellen ………………………………... 20
3.3.2 Precipitatie van proteïnen uit medium……………………………… 20
3.3.3 2-D clean up kit……………………………………………………... 21
3.4 Optimalisatie van de precipitatie van extracellulaire eiwitten met zilver-
kleuring………………………………………………………………………. 21
3.5 2-D DIGE experiment………………………………………………………… 21
3.5.1 Dag 1: pre-rehydratatie strips………………………………………..22
3.5.2 Dag 2: labeling en IEF……………………………………………… 22
3.5.2.1 pH meting…………………………………………………. 22
3.5.2.2 CyDye labeling…………………………………………… 22
3.5.2.2.1 Stock dye oplossing……………………………... 22
3.5.2.2.2 Working Dye oplossing…………………………. 22
3.5.2.2.3 Minimal labeling……………………………….. 23
3.5.2.3 Voorbereiding op het laden van de stalen op de strips…….23
3.5.2.4 Scheiden van de proteïnen op basis van isoëlektrisch punt. 23
3.5.3 Dag 3: SDS…………………………………………………………. 24
3.5.3.1 Equilibratie van de IPG strips…………………………….. 24
3.5.3.2 Applicatie van de IPG strips op de SDS gels en SDS
elektroforese………………………………………………. 24
3.5.4 Dag 4: scannen……………………………………………… 24
3.5.5 DeCyder software analyse………………………………………….. 26
3.5.5.1 Image Loader……………………………………………... 27
3.5.5.2 DIA………………………………………………………... 27
3.5.5.3 Batch Processor…………………………………………… 27
3.5.5.4 BVA………………………………………………………. 28
3.5.5.5 EDA………………………………………………………. 29
4. Resultaten........................................................................................................................ 30
4.1 Optimalisatie precipitatiemethoden…………………………………………... 30
4.2 Optimalisatietest met clean-up kit……………………………………………. 31
4.3 Bepaling van confluentietijd………………………………………………….. 33
4.4 Albumine depletie…………………………………………………………….. 35
4.5 Experimenteel design…………………………………………………………. 36
4.5.1 Staalcombinaties……………………………………………………. 37
4.5.2 Dye-swap…………………………………………………………… 38
4.5.3 Interne standaard……………………………………………………. 38
4.5.4 IEF………………………………………………………………….. 38
4.5.5 SDS…………………………………………………………………. 39
4.6 Scannen en croppen……………………………………………………………39
4.7 Gelanalyse……………………………………………………………………..40
4.7.1 DIA…………………………………………………………………. 40
4.7.2 BVA………………………………………………………………… 43
4.7.3 EDA………………………………………………………………… 45
5. Bespreking…………………………………………………………………………….. 47
6. Referentielijst………………………………………………………………………….. 52
Bijlagen
Tabellen
Productsamenstellingen
Protocols
Figuren
Lijst met afkortingen
2-D DIGE 2 Dimensional Differential Gel Electrophoresis
AAA Abdominaal Aorta Aneurysma
ANOVA Analysis of Variance
AT Appearance Table
ATS Arterial Tortuosity Syndrome
BAV Biscupid Aortic Valve
BVA Biological Variation Analysis
cb Calcium bindend
CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-
propane sulfonate
CMGG Centrum voor Medische Genetica Gent
COFRADIC COmbined FRActional DIagonal
Chromatography
COL3A1 Collageen type 3 alfa1
CT Computed Tomography
CTGF Connective tissue growth factor
Da Dalton
DIA Differential In-gel Analysis
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMF Dimethylformamide
DMSO Dimethylsulfoxide
DOC Deoxycholaat
DTT Dithiotreitol
ECM Extracellulaire Matrix
EDA Extended Data Analysis
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EGF Epidermal Growth Factor
FBN1 Fibriline-1
FBS Foetal Bovine Serum
FCS Foetal Calf Serum
FTAA Familiale thoracale aorta-aneurysma
GLUT Glucose Transporter
IEF Isoëlektrisch focusing
IEP Isoëlektrisch punt
IPG Immobilized pH gradient
IS Interne standaard
I-Smad Inhibitor-Smad
LAP Latency Associated Peptide
LCC Large Latent Complex
LDS Loeys-Dietz syndroom
LOF Loss-of-function
LTBP Latent TGFβ Binding Protein
MAGP Microfibril-associated glycoprotein
MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-
Time Of Flight
MFS Marfan syndroom
MMP Matrix Metalloproteïnase
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent
MRI Magnetic Resonance Imaging
MS Massaspectrometrie
MT Match Table
NLS Natrium lauroyl sarcosinaat
P/S Penicilline/streptomycine
PBS Phosphate Buffered Saline
PCA Principle Component Analysis
PDA Patent Ductus Arteriosus
pI Isoëlektrisch punt
PMT Photo Multiplier Tubes
PT Protein Table
PTC mutatie Premature termination codon
PTPN11 Protein Tyrosine Phosphatase Non-receptor type
11
rpm Rotations per minute
R-Smad Receptor-Smad
SARA Smad anchor for receptor activation
SDS Natriumdodecylsulfaat
SDS-PAGE Sodium dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel
Elektroforesis
SLC Small Latent Complex
SLC2A10 Solute carrier 2A10
SMAD Sma en Mad gerelateerd proteïne
SMURF Smad Ubiquitin Regulatory Factor
ST Spot Map Table
TAA Thoracaal aorta-aneurysma
TB Transforming Growth Factor β binding protein
TCA Trichloor acetaat
TE buffer Tris/EDTA buffer
TF Transciptie Factor
TGFβ Transforming Growth Factor β
TGFβR1 Transforming Growth Factor β Receptor 1
TGFβR2 Transforming Growth Factor β Receptor 2
TSP-1 Thrombospondin-1
vEDS Ehlers-Danlos syndroom vasculair type
XML Extensible Markup Language
1
Samenvatting
In de westerse wereld zijn aortadissecties verantwoordelijk voor 1-2% van de totale
mortaliteit. In de loop der jaren zijn verschillende aorta-aneurysma syndromen
geïdentificeerd, zoals het Marfan syndroom (MFS) en het Loeys-Dietz syndroom (LDS).
Het syndroom van Marfan is een erfelijke bindweefselziekte. Het wordt voornamelijk
gekenmerkt door de betrokkenheid van 3 orgaansystemen: het skeletaal, het oculair en het
cardiovasculair systeem. MFS heeft een incidentie van 1/5000 en wordt autosomaal dominant
overgeërfd. Onderzoek heeft uitgewezen dat het veroorzaakt wordt door een mutatie in het
FBN1 gen dat codeert voor het fibrilline-1 proteïne.
Het Loeys-Dietz syndroom is een autosomaal dominant overerfbaar aorta-aneurysma
syndroom. Het wordt voornamelijk gekenmerkt door de aanwezigheid van 3 typische
kenmerken met name hypertelorisme, gespleten uvula/gespleten pallatum, arteriële tortuositeit
en aorta-aneurysma/dissectie. LDS wordt veroorzaakt door mutaties in de genen coderend
voor Transforming Growth Factor Beta Receptor 1 en 2 (TGFBR1 en TGFBR2,
respectievelijk).
Hier wordt getracht een vergelijkende analyse uit te voeren van de proteïnen die tot expressie
komen in zowel medium- als celfractie van fibroblastculturen van controles, MFS en LDS
patiënten. Hiervoor wordt er gebruikt gemaakt van de Two Dimensional Difference Gel
Electrophoresis (2-D DIGE) techniek. De 2-D DIGE techniek is gebaseerd op de fluorescente
labeling van proteïnen alvorens deze te scheiden in twee dimensies met behulp van
gelelektroforese. De bekomen gels worden vervolgens geanalyseerd met behulp van de
DeCyder software. Er konden geen proteïnen geïdentificeerd worden die differentieel tot
expressie komen in MFS, LDS en controle groep. Dit ten gevolge van te grote technische en
biologische variatie. Een herhaling van het experiment met behulp van de 2-D DIGE
techniek, of een alternatieve methode, dringt zich op.
2
1. Inleiding
1.1 Aorta-aneurysma
1.1.1 Inleiding
In de westerse wereld zijn aorta-aneurysma’s en dissecties verantwoordelijk voor 1-2% van
de totale mortaliteit en morbiditeit [1]. Aorta-aneurysma’s worden vaak veroorzaakt door
mediale degeneratie die leidt tot een verzwakking van de aortawand. De verzwakte aortawand
leidt op zijn beurt tot dilatatie en aneurysma-vorming. Een aneurysma kan uiteindelijk leiden
tot een dissectie en in het slechtste geval een ruptuur [2].
We onderscheiden thoracale (TAA) en abdominale aorta-aneurysma’s (AAA). De beide
groepen kunnen onderscheiden worden op basis van de locatie van het aneurysma ten
opzichte van het diafragma. TAA en AAA bevinden zich respectievelijk craniaal en caudaal
van het diafragma. Zowel genetische factoren als omgevingsfactoren spelen een rol bij het
ontstaan van aorta-aneurysma’s. De genetische factoren spelen een belangrijke rol in TAA,
terwijl AAA doorgaans veroorzaakt wordt door omgevingsfactoren zoals roken, hypertensie,
hyperlipidemie en atherosclerosis [3]. In deze thesis zal AAA niet verder besproken worden.
1.1.2 Thoracaal aorta-aneurysma
Thoracale aorta-aneurysma’s kunnen verschillende aortasegmenten omvatten (aortawortel,
aorta ascendens, aortaboog of aorta descendens). Zestig percent van TAA’s komt voor in de
aortawortel en/of de aorta ascendens, 40% in de aorta descendens, 10% in de
thoracoabdominale aorta en 10% in de aortaboog. De overlap tussen verschillende
percentages is te wijten aan de uitbreiding van het aneurysma naar meerdere locaties van de
aorta bij dezelfde patiënt. Zoals reeds in de inleiding vermeld, ontstaan TAA’s meestal door
mediale degeneratie, histologisch gekenmerkt door de vermindering van gladde spiercellen en
fragmentatie van de elastische vezels in de aortawand. Een degeneratie van de tunica media
veroorzaakt een verzwakking van de aortawand wat kan resulteren in aortadilatatie en -
aneurysma. Mediale degeneratie verergert met de leeftijd maar hypertensie versnelt dit proces
[4].
Er bestaan zowel syndromale (Marfan syndroom (MFS), Loeys-Dietz syndroom (LDS),
Ehlers-Danlos syndroom vasculaire type (vEDS), Arterial tortuosity syndroom (ATS), Turner
en Noonan syndroom) als niet-syndromale vormen van TAA (thoracale aorta-aneurysma in
3
combinatie met biscupide aortaklep (TAA+BAV) of patent ductus arteriosus (TAA+PDA) en
geïsoleerd familiale thoracale aorta-aneurysma (FTAA).
1.1.2.1 Syndromale TAA
Verschillende mutaties zijn al ontdekt die syndromale TAA veroorzaken. Een mutatie in het
FBN1 gen op 15q21.1 veroorzaakt het Marfan syndroom [5]. Een TGFBR2 of TGFBR1
mutatie veroorzaakt het Loeys-Dietz syndroom [6]. vEDS ontstaat door een mutatie in
COL3A1 [7]. ATS wordt verooraakt door een loss-of-function mutatie in SLC2A10 dat
codeert voor GLUT10 [8]. Het Noonan en Turner syndroom lijken op elkaar maar ontstaan
door een verschillend mechanisme. Noonan ontstaat door een mutatie in het PTPN11 gen [9]
en Turner door de afwezigheid van een tweede X-chromosoom [10].
1.1.2.2 Niet-syndromale TAA
Patiënten met het familiaal thoracale aorta aneurysma syndroom hebben geen
bindweefselabnomaliteiten en hebben een aorta-aneurysma op jongere leeftijd dan bij de
sporadische vorm. De voornaamste overervingsvorm van FTAA is autosomaal dominant maar
er is een variatie in expressie en penetrantie [11]. Verschillende loci zijn geïdentificeerd
waaronder op 5q13-14 en 11q23.2-q24 waarin nog geen mutatie werd geïdentificeerd
[11,12,13]. Deze loci veroorzaken zowel de familiale als de sporadische thoracale aorta
aneurysma met mediale degeneratie van de aortawand [13].
TAA kan voorkomen in combinatie met een biscupide aortaklep (BAV). BAV is een defect
aan de aortakleppen dat resulteert in de vorming van twee kleppen in plaats van drie. TAA in
combinatie met BAV wordt geassocieerd met aortadilatatie onafhankelijk van de
aanwezigheid van hemodynamische significante klep disfuncties. De aortadilatatie ontstaat
door mediale degeneratie van de aortawand [14].
Khau van Kien et al. deden een genetische analyse van een familie met TAA+PDA en
ontdekten dat TAA+PDA veroorzaakt wordt door een mutatie in het MYH-11 gen aanwezig
op 16p12.2-p13.13 [15].
1.1.3 Extracellulaire matrix
De extracellulaire matrix (ECM) biedt stevigheid en structuur aan weefsels zoals het
bindweefsel en het bot. De extracellulaire matrix bestaat uit onder meer collageen,
fibronectine, elastine en glycosaminoglycanen (GAG’s). De ECM wordt aangemaakt door
osteo- en fibroblasten. De afbraak van het ECM gebeurt door matrix proteasen [16].
4
In de extracellulaire ruimte polymeriseren fibrilline-1 monomeren tot paralelle bundels, de
microfibrillen [17]. De microfibrillen hebben een parelsnoervormig uitzicht [18].
Microfibrillen spelen een rol in de vorming van elastische vezels en zorgen voor de integriteit
en homeostase van zowel elastische als niet-elastische weefsels. Microfibrillen zijn
multidomein eiwitten en bevat naast fibrillinebundels ook latent TGFβ. Microfibrillen hebben
de capaciteit om de biologische beschikbaarheid van TGFβ te regelen. De proteïnen, die
TGFβ latent houden, kunnen reageren met verschillende moleculen uit de ECM [17]. In
figuur 1 (bijlage 4) kan je de schematische weergave zien van een fibrilline-1 molecule en de
opbouw van microfibrillen. De N-terminale zijde van het fibrilline-1 heeft als functie om te
aggregeren met andere fibrilline-1 proteïnen. Deze aggregatie wordt gestabiliseerd door
disulfidebruggen. De TB domeinen zorgen voor de intermoleculaire cross-linking [19]. Het
TB domein wordt hieronder verder besproken.
1.1.4 Fibrilline-1
Sakai et al. [18] identificeerden fibrilline-1 als belangrijkste component van de extracellulaire
matrix microfibril die aanwezig is in alle weefsels met fenotypische manifestaties van het
MFS. Fibrilline-1 wordt gecodeerd door het FBN1 gen dat gelegen is op chromosoom
15q21.1. Het gen bestaat uit 65 exonen en is 235 kb groot. Het genproduct is een
extracellulair glycoproteïn van 350 kDa [20,21,22,23]. Het humaan fibrilline-1 heeft een
modulaire structuur met 47 repeats van het zes-cysteïne bevattende epidermal-growth-factor
(EGF)-like motief waarvan 43 van het calciumbindend (cb) type (cb-EGF) zijn [24]. Verder
bevat het fibrilline-1 proteïne ook 7 acht-cysteïne/Transforming Growth Factor β (TGFβ)-
binding protein-like (TB) domeinen, een hybride domein en een proline-rijke regio (zie figuur
2 bijlage 4) [25]. Ongeveer 60% van de mutaties beschreven in het FBN1 gen zijn missense
mutaties. Meer dan 75% daarvan bevindt zich in de EGF domeinen van fibrilline-1 [17,26].
Fibrilline-1 reageert onder andere met versican [27], fibulines [19,28], elastine [29],
microfibril-associated glycoprotein (MAGP)-2 [30] en LTBP-1 [31].
1.1.5 TGFβ mechanisme
TGFβ’s (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3) zijn multifunctionele groeifactoren die een reeks cellulaire
gebeurtenissen kunnen induceren zoals proliferatie, celcyclusarrest, differentiatie, apoptose en
matrixdepositie [32].
De drie TGFβ’s worden gesynthetiseerd als homodimeer proproteine (proTGFβ) met een
massa van 75 kDa. De propeptide dimeren (=LAP) worden afgesplitst van matuur TGFβ in
5
het trans-golgi complex door furine-achtige enzymes. Hoewel LAP afgesplitst wordt van
TGFβ vormt LAP nog steeds een complex (SLC). LAP bindt covalent via disulfide bruggen
aan het Latent TGFβ Binding Protein (LTBP), met vorming van het Large Latent Complex
(LLC) [33,34,35].
LTBP behoort tot de LTBP/fibrilline familie die bestaat uit fibrilline-1 tot -3 en LTBP-1 tot -4
[36]. LTBP-1, -3 en -4 kunnen binden met LAP door disulfidebindingen maar enkel LTBP-1
en LTBP-3 maken een sterke binding met TGFβ. TGFβ kan niet geactiveerd worden als deel
uitmaakt van LCC [37,38]. De cellen secreteren het LCC in de extracellulaire ruimte waar de
N-terminale regio van LTBP covalent gecrosslinkt wordt met ECM proteïnen door de
werking van het transglutaminase enzyme [33].
De rol van de binding tussen het LCC en de extracellulaire matrix is tweeledig. Enerzijds
zorgt de binding ervoor dat TGFβ niet geactiveerd wordt waardoor controle van de TGFβ
activiteit in de matrix mogelijk is. Anderzijds zorgt de binding tussen het LCC en de ECM
ervoor dat TGFβ geconcentreerd wordt op specifieke plaatsen waardoor de controle van
biologische reacties efficiënter gebeurd [39]. Men spreekt pas van TGFβ activatie vanaf dat
TGFβ geen deel meer uitmaakt van het latent complex.
Thrombospondin-1 (TSP-1), integrines, pH en reactieve zuurstofradicalen zijn enkele van de
gekende factoren die TGFβ kunnen activeren door direct te interageren met LAP
[40,41,42,43]. De afbraak van LTBP door proteasen (plasmin, MMP-2 en MMP-9) zorgt voor
TGFβ vrijstelling. De afbraak van LAP is nog niet goed bestudeerd in context van TGFβ
activatie. [44,45]. De fysische condities zoals warmte en pH denatureren LAP maar niet
TGFβ [46].
Na de activatie van TGFβ zal de TGFβ signaalweg starten met de binding van het ligand,
TGFβ op TGFβ receptor 2 [47]. TGFBR2 wordt vervolgens geautofosforyleerd waardoor
TGFBR1 gerekruteerd en getransfosforyleerd wordt. TGFBR1 en TGFBR2 zijn
transmembranaire serine/threonine kinase receptoren. De receptoren bestaan uit een klein
cysteïne-rijk extracellulair domein, een transmembranaire regio en een intracellulair kinase
domein [48]. TGFBR1 zal op zijn beurt Smad2 en Smad3 (R-Smad) phosphoryleren en
activeren. R-Smad zal vervolgens binden op Smad4 (co-Smad) waarna dit complex
getransloceerd wordt naar de nucleus. In de nucleus zal dit complex binden met transcriptie
cofactoren en een geactiveerd transcriptie complex vormen. Dit complex initieert transcriptie
en translatie voor specifieke genactivatie of -repressie (zie figuur 3 bijlage 4) [47].
Door een mutatie in FBN1, TGFBR1 of TGFBR2 zal de resulterende opregulatie van TGFβ
signalen fragmentatie in de elastische vezels brengen maar veroorzaken ook een verlies aan
6
elastine in de tunica media van de aorta. Dit heeft als gevolg dat de aorta zal dilateren en er
later dissectie kan optreden op de plaats van de dilatatie [49].
1.2 Marfan syndroom
1.2.1 Inleiding
Het Marfan Syndroom (MFS, MIM #154700) is een autosomaal dominante pleiotrope
bindweefselaandoening veroorzaakt door mutaties in het gen coderend voor het cysteïnerijk
extracellulair matrix glycoproteïne fibrilline-1 [50]. De diagnose is gebaseerd op een
combinatie van majeure en mineure klinische criteria in functie van verschillende
orgaansystemen, zoals gedefinieerd in de Ghent nosology [51]. MFS wordt voornamelijk
gekenmerkt door de betrokkenheid van 3 orgaansystemen: het cardiovasculair, skeletaal en
oculair systeem. Andere betrokken systemen zijn de longen, de huid en de dura mater [51].
Onderzoek naar een MFS muismodel heeft geleid tot de identificatie van een verstoorde
TGFβ (Transforming Growth Factor β) signalisatieweg. TGFβ is een cytokine dat betrokken
is bij tal van cellulaire processen zoals celgroei, inflammatie, matrix synthese, apoptose...[52]
1.2.2 Epidemiologie
Het MFS komt wereldwijd voor met een incidentie van 1/5000-10000 [53]. De
levensverwachtingen van patiënten met MFS is 2/3 van de normale gemiddelde
levensverwachting. Er is een normale levensverwachting met huidige therapie [54]. In 90%
van de gevallen is de doodsoorzaak van cardiovasculaire oorsprong (aortadissectie, hartfalen
of hartklepdeficiëntie) [55].
1.2.3 Klinische manifestatie en diagnostische criteria
Volgens de Ghent Nosology (1996) [51] wordt de diagnose van MFS in een indexpatiënt
gesteld wanneer minstens 2 verschillende orgaansystemen ernstig aangetast zijn en een derde
orgaansysteem mild aangetast is. Indien een causale FBN1 mutatie geïdentificeerd wordt in de
indexpatiënt of er een positieve familiale anamnese is, dan volstaat de aanwezigheid van één
majeur criterium in een orgaansysteem en de betrokkenheid van een tweede orgaan om de
diagnose te stellen.
1.2.3.1 Cardiovasculair systeem
Zoals reeds eerder vermeld is het cardiovasculair systeem één van de systemen die aangetast
kunnen zijn bij MFS patiënten. De meest voorkomende cardiale manifestatie is een
7
verdikking van de mitralisklep en de tricuspidalis klep, deze verdikking is soms geassocieerd
met prolaps van deze kleppen. Bij kinderen met een vroege en ernstige vorm van het MFS
kan insufficiëntie van de mitralisklep tot congestief hartfalen, pulmonaire hypertensie en
premature dood leiden [52]. Cardiomyopatische dilataties komen ook voor bij MFS. De
vasculaire betrokkenheid wordt gekarakteriseerd door de aanwezigheid van een thoracale
aortadilatatie die afhankelijk van de diameter een verhoogd risico kan hebben op dissectie
[55]. Aorta-aneurysma’s en dissecties zijn de belangrijkste doodsoorzaak bij MFS patiënten
[52].
1.2.3.2 Skeletaal systeem
Disproportionele botgroei van de lange beenderen is het meest opvallende kenmerk van het
MFS. Ribovergroei veroorzaakt anterieure thoraxvervormingen waardoor het sternum
anterieur (pectus carinatum) of posterieur (pectus excavatum) gericht is. Door een overgroei
van de ledematen kan de verhouding van de armspan tot lichaamslengte meer dan 1,05 zijn.
Andere eenvoudig vast te stellen criteria zijn de “thumb sign” en “wrist sign”. Een positief
thumb sign betekent dat de patiënt een vuist kan maken waarbij de duim voorbij de ulnaire
zijkant komt. Een positief wrist sign wil zeggen dat de duim en pink overlappen wanneer deze
rond de andere pols een cirkel vormen. Gewrichtshypermobiliteit kan leiden tot ligamenteuze
schade, ontwrichtingen, chronische gewrichtspijn en premature arthrose. Het skeletaal
systeem is betrokken indien twee van de majeure criteria of 1 van de majeure criteria in
combinatie met minstens 2 mineure criteria aanwezig zijn bij de patiënt [51].
1.2.3.3 Oculair systeem
De betrokkenheid van het oculair systeem kenmerkt zich in 60% van de gevallen door de
aanwezigheid van ectopia lentis. Ectopia lentis is een dislocatie van de lens waardoor deze uit
haar ophangapparaat wordt verplaatst. Ernstige en vroeg optredende myopie, platte cornea,
toegenomen axiale oogbollengte, hypoplastische iris en ooglidspieren zijn additionele
mogelijk voorkomende kenmerken en kunnen leiden tot blindheid.
Het oculair systeem is betrokken als minstens 2 van de mineure criteria aanwezig zijn [51].
1.2.3.4 Andere systemen
Andere systemen die betrokken zijn in MFS zijn de dura mater, de huid en het pulmonaal
systeem en worden als mineure criteria beschouwd. Durale ectesie de verwijding van de
durale zak en kan leiden tot lumbale rugklachten. Het komt voor in 92% van de MFS
8
patiënten en er is geen verband gevonden tussen aorta dilataties en durale ectesie [56].
Patiënten met MFS hebben een normaal huidstructuur en –elasticiteit. Het meest
voorkomende kenmerk met betrekking tot de huid is de striae atrophica (huidstriemen). Striae
komen bij ongeveer 60% van de MFS patiënten voor [52,57]. Door thoraxmisvormingen
kunnen verschillende complicaties ontstaan in het pulmonair systeem zoals pneumothorax,
pulmonair emphyseem en dysfunctie; gedeeltelijk veroorzaakt door een alveolair
septatiedefect [51,52,57].
1.2.4 Pathogenetische aspecten
Neptune et al. ontdekten dat fibrilline-1 een belangrijke rol speelt in de regulatie van de TGFβ
activatie [58]. Indien er een defect ontstaat in het fibrilline-1 gen, zal er een grote
hoeveelheid TGFβ vrijgesteld worden in de matrix en dit leidt tot een toegenomen TGFβ
signalisatie [17,59,60]. Deze hypothese werd bevestigd door twee studies. Neptune et al. [58]
toonden bij fibrilline-1 deficiënte muismodellen aan dat longabnormaliteiten veroorzaakt
worden door een dysregulatie van TGFβ activatie en signalisatie. Het perinataal toedienen van
TGFβ neutraliserende antilichamen corrigeert het alveolair septatie defect. De tweede studie
van Habashi et al. [61] toonden aan dat een aorta-aneurysma bij MFS muismodellen
geassocieerd is met toegenomen TGFβ signalisatie en kan voorkomen worden door TGFβ
antagonisten zoals TGFβ neutraliserende antilichamen of angiotensine II type 1 receptor
antagonist (losartan). Dit was voldoende om spontane aortadilataties, fragmentatie van
elastische vezels en Smad2 activatie te verminderen.
Chaudhry et al. [59] ontdekten dat fibrilline-1 de biologische beschikbaarheid van TGFβ1
reguleert. De vrijstelling van TGFβ via fibrilline-1 is onafhankelijk van proteolyse,
verandering in expressie van TGFβ of zijn receptoren. Het fibrilline-1 sequentiefragment, dat
met TGFβ kan binden, bindt specifiek op een fibrilline-1 proteïne door sterke interactie met
de fibrilline-1 N-terminale regio. Door deze interactie zal de associatie van de
carboxyterminale regio van LTBP-1 met fibrilline-1 geïnhibeerd worden en zal LCC
vrijgesteld worden van microfibrillen. Dit heeft als gevolg dat LLC gaat ontbinden en TGFβ
kan geactiveerd worden (zie figuur 4 bijlage 4) [59].
1.2.5 FBN1 mutatiespectrum
Faivre et al. [24] onderzochten 1013 patiënten met MFS ten einde op zoek te gaan naar een
fenotype-genotype correlatie. Daarbij onderzochten ze ook de types mutaties die voorkomen
in het FBN1 gen (zie figuur 5 bijlage 4). Zesenvijftig percent van de mutaties die MFS
9
veroorzaken zijn missense mutaties. Eenenzestig percent van de missense mutaties ontstaan
door substitutie van een cysteïne. De meeste mutaties zijn gelokaliseerd in het EGF domein
(74%) en 15% bevindt zich in het 8-cysteïne/TB domein. In de 5’ regio van het FBN1 gen
komen 29% van de mutaties voor en in de 3’ regio zijn het er 37%. Twintig percent van de
mutaties komen voor in exonen 24-32 [24]. Een mutatie in deze regio zal resulteren in een
ernstige en vroege vorm van MFS [62]. Van de populatie met MFS heeft 17% een frameshift
mutatie, 14% een nonsense mutatie, 11% een splice site mutatie en 2% een inframe deletie of
insertie [24]. Tijdens het stageonderzoek werd patiënten met missense en nonsense mutaties
onderzocht.
1.3 Loeys-Dietz Syndroom
1.3.1 Inleiding
Het Loeys-Dietz syndroom (LDS) (MIM #609192) is een bindweefselaandoening die
fenotypisch overlapt met MFS en het vasculair Ehlers-Danlos syndroom (vEDS). We
onderscheiden LDS type I en LDS type II. LDS type I wordt voornamelijk gekarakteriseerd
door de aanwezigheid van een typische triade van aorta-aneurysma en arteriële tortuositeit,
hypertelorisme en bifide uvula en gespleten verhemelte. Andere bevindingen zijn
craniosynostose, structurele hersenafwijkingen, mentale retardatie, congenitale
hartafwijkingen en arteriële aneurysma’s en dissecties. LDS type II onderscheidt zich van
type I door de afwezigheid van craniosynostosis en hypertelorisme [63]. De vasculaire
pathologie in LDS is agressiever dan bij MFS en komt op jongere leeftijd tot uiting. De
oorzaak van de hoge mortaliteit en morbiditeit in LDS zijn de aorta-dilataties en -dissecties in
de sinussen van Valsalva. Arteriële aneurysma’s kunnen ter hoogte van alle vertakkingen van
de aorta aanwezig zijn waaronder de arteria subclavicula, renalis, hepatica, en coronaris. De
prevalentie van LDS is onbekend [64].
10
Figuur 6: Magnetische resonantie angiografie toont een bilateraal carotis aneurysma en
arteriële tortuositeit [65].
Histologisch onderzoek van aortaweefsels van LDS patiënten toonde fragmentatie aan van
elastische vezels en verlies aan elastine evenals een accumulatie van amorfe
matrixcomponenten in de tunica media. Er is ook een verminderde aanwezigheid van gladde
spiercellen en een toegenomen hoeveelheid van collageen in de aortawand. Dit werd ontdekt
bij jonge kinderen met LDS wat suggereert dat het gaat om een defect in de elastogenese in
plaats van een secundair elastische vezelafbraak [6,63].
1.3.2 Genetische aspecten
LDS wordt autosomaal dominant overgeërfd en veroorzaakt door een mutatie in het TGFBR1
of het TGFBR2 gen. Deze genen coderen respectievelijk voor Transforming Growth Factor
Beta Receptor 1 en Transforming Growth Factor Beta Receptor 2. TGFBR2 bevindt zich op
locus 3p22 en TGFBR1 op locus 9q33-q34. Er bestaat geen fenotypisch verschil tussen
individuen met mutatie in TGFBR1 of TGFBR2. Mutaties clusteren zich in het intracellulair
serine-threonine kinase domein van beide receptoren. Eerder werd echter al splice-site mutatie
in het extracellulair domein en een nonsense mutatie in het laatste exon van de TGFβ receptor
2 kunnen LDS geïdentificeerd [6,63].
Verwacht wordt dat mutaties in deze receptor genen een suppresie van TGFβ-signaalweg
zouden veroorzaken. Loeys et al. toonden echter een toegenomen hoeveelheid phospho Smad
2 (de gefosforyleerde en actieve vorm van Smad2), CTGF en collageen aan in aortaweefsel
van LDS patiënten ten opzicht van de controleweefsels. Deze bevindingen duiden op een
opregulatie van de TGFβ pathway. Dit paradoxaal gegeven is tot op heden nog niet
opgeklaard [63].
1.3.3 Potentiële mechanismen voor de opregulatie van TGFβ signalisatie.
TGFBR1 mutaties komen bij 1/3 van de LDS patiënten voor terwijl 2/3 van de patiënten een
TGFBR2 mutatie hebben [49]. Het exact mechanisme voor de opregulatie van TGFβ
signalisatie is nog niet ontrafeld maar er zijn verschillende potentiële mechanismen.
1. Mutante receptoren vereenvoudigen ligand binding [66].
2. Verandering van de dynamiek van receptor stabiliteit.
De endocytose en recyclage/degradatie van TGFβ receptoren is een belangrijk mechanisme in
de regulatie van TGFβ signalisatie. De internalisatie van TGFβ gebeurd door clathrin of
11
caveoline gemedieerde signalisatie. Door interactie van het mutant TGFBR2 met Smad
Anchor for Receptor Activation (SARA) zal het clathrin gemedieerd endocytotisch
mechanisme geactiveerd worden. Hierdoor zal de receptor gerecycleerd worden en een
propagatie onstaan van het signaal.
Het caveolin gemedieerd endocytotisch mechanisme ontstaat door interactie van Smad7 met
het mutant TGFBR2 complex. De receptoren worden geïnternaliseerd door caveolin. De
ubiquitine ligasen Smurf1 en 2 worden gerekruteerd waardoor de receptoren proteasomaal
afgebroken worden. Hierdoor zal er een attenuatie ontstaan van het TGFβ signaal (zie figuur 7
bijlage 4). LDS kan ontstaan door het mutante TGFBR2 die mogelijk meer interageert met
SARA en minder met Smad7 [67].
3. Alternatieve pathways
Het derde mechanisme is gebaseerd op de aanwezigheid van niet-functionele TGFβ
receptoren. De signalisatie wordt geïnhibeerd door mutaties in de receptor kinase domein
(TGFβR2/ TGFβR1/beide). Het ligand-receptor complex kan nog steeds functioneren door te
interageren met andere proteïnen. Hierdoor zullen downstream signalen gestuurd worden
waardoor een alternatieve pathway ontstaat die aneurysma’s kan vormen (zie figuur 8 bijlage
4) [47].
12
1.4 2-D DIGE
Figuur 9: schematische weergave van het verloop van het 2-D DIGE experiment [68]
1.4.1 Principe 2-D DIGE technologie
In dit stageonderzoek werd een vergelijkende analyse uitgevoerd van proteïnen die tot
expressie komen zowel in de medium- als de celfractie van fibroblastculturen van gezonde
controles, MFS en LDS patiënten. Hiervoor maakten we gebruik van de Two Dimensional
Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) techniek. De 2-D DIGE techniek is gebaseerd op
de fluorescente labeling van proteïnen alvorens deze te scheiden in twee dimensies met
behulp van gelelektroforese.
Het grootste voordeel van de 2-D DIGE techniek ten opzichte van de klassieke 2-D
gelelektroforese is de mogelijkheid om verschillende stalen op eenzelfde gel te laden
(multiplexing), waardoor het gebruik van een interne standaard mogelijk gemaakt wordt. Er
kunnen namelijk tot 3 verschillende CyDye DIGE fluorochromen in combinatie geladen
13
worden op 1 gel. Dit laat toe om een patiëntenstaal, een controlestaal en een interne standaard
te laden op eenzelfde 2-D gel. De interne standaard is een pool van alle stalen die binnen het
experiment gebruikt worden en bevat daardoor elk proteïne. De interne standaard wordt
gebruikt om de overlappende eiwitpatronen tussen elke gel te normaliseren waardoor het
probleem van inter-gelvariatie, een inherent probleem van standaard 2-D analyses, opgelost
wordt. Dit laat nauwkeurige kwantificatie van verschillen in proteïnenexpressie tussen stalen
toe [69,70,71]. De hoeveelheid van elk proteïne spot wordt gemeten als een ratio tot de
corresponderen spot van de interne standaard. Dit heeft als gevolg dat zowel accurate
kwantitatieve als spot berekeningen mogelijk zijn. Op figuur 10 kan men het verschil in
gelelektroforese met en zonder interne standaard zien. In het voorbeeld ziet men vier
verschillende stalen en een interne standaard op elke gels. De omcirkelde spots in de
diagrammen stellen de hoeveelheid van een proteïne met en zonder normalisatie voor. De
interne standaard linkt de gels met elkaar zodat gel tot gel variatie verdwijnt en de biologische
variatie statistisch significant zichtbaar wordt. Foutieve conclusies worden gemaakt indien de
interne standaard niet gebruikt wordt [72].
Figuur 10: Vergelijking van gelelektroforese met en zonder interne standaard. In het
voorbeeld zonder interne standaard zijn 4 gels aanwezig die geen interne standaard
bevatten. Indien men enkel naar de omcirkelde spot kijkt, kan men besluiten dat de spot
in gel 3 en 4 een hoger expressie heeft, met gel 4 de hoogste expressie. Indien men het
voorbeeld bekijkt met interne standaard kan men 2 gels zien die geladen zijn met Cy2,
Cy3 en Cy5 gelabelde proteïnen. De interne standaard is een pool van alle stalen van het
experiment. Door de gels te normaliseren naar de interne standaard kan men zien dat
14
enkel de omcirkelde spot van staal 3 een lager proteïne expressie heeft dan de andere
stalen [72].
Labeling:
De CyDye DIGE fluorochromen zijn 3 oplosbare kleurstoffen (Cy2, (3-(4-
Carboxymethyl)phenylmethyl)-3’-ethyloxacarbocyanine halide N-hydroxysuccinimidyl ester;
Cy3, 1-(5-Carboxypentyl)-1’-propylindocarbocyanine halide N-hydroxysuccinimidyl ester en
Cy5, 1-(5-Carboxypentyl)-1’-methylindodicarbocyanine halide N-hydroxysuccinimidyl ester
[72]) die dezelfde massa (500 Da) en lading (+1) bezitten. Dit betekent dat eenzelfde proteïne
ongeacht het gelabeld is met Cy2, Cy3 of Cy5, zal migreren naar dezelfde plaats in de gel. Dit
elimineert de intra-gel variatie. De fluorochromen worden gekenmerkt door een grote
sensitiviteit (125 pg). Zilverkleuring heeft een sensitiviteit van 200 pg proteïnen en laat niet
toe dat verschillende stalen, waartussen nog een onderscheid moet kunnen gemaakt worden,
op eenzelfde gel geladen worden. Om deze redenen wordt zilverkleuring enkel gebruikt voor
het optimalisatieproces. De CyDye’s hebben een reactieve NHS-ester groep en zijn
ontworpen om covalent op de epsilon aminogroep van lysine te binden via een amidebinding
(zie figuur 11). De fluorochromen binden ongeveer 1-2% van lysineresidu’s in het proteïne.
Om die reden noemt men dit type van labeling “minimal labeling”. Het lysine aminozuur
bevat een intrinsieke +1 lading bij neutrale of zure pH. CyDye DIGE fluorochromen bevatten,
net zoals lysine, ook een +1 lading. Dit is nodig om veranderingen in het isoëlektrisch punt
(pI) te voorkomen bij binding van de CyDye’s op lysine. Binding van de CyDye’s op de
proteïnen verhoogt het moleculair gewicht van het proteïne op gel met ongeveer 500 Da.
[68,71].
Figuur 11: schematische voorstelling van de labelingsreactie [68].
15
Scheiding proteïnen
Twee dimensionele gelelektroforese scheidt eiwitten in een eerste dimensie op basis van hun
iso-elektrisch punt en vervolgens in de tweede dimensie op molecuulmassa. De scheiding op
basis van het iso-elektrisch punt gebeurt door middel van een gelstrip met een
geïmmobiliseerde pH gradiënt (3-10). De gradiënt ontstaat door de incorporatie van een
gradiënt van buffers in de polyacrylamide gel. De proteïnen worden op de zure zijde van de
gelstrip geladen met behulp van cups. Na het aanleggen van een elektrische stroom zullen de
zure eiwitten aan de basische zijde van de gel dissociëren en een negatieve lading krijgen en
door het elektrische veld migreren naar de positieve pool. De eiwitten stoppen met migreren
op een punt in de gel waar de negatieve ladingen geneutraliseerd worden zodat het proteïne
geen netto lading meer heeft, dit is het isoëlektrisch punt van het eiwit. Hetzelfde scenario
geldt voor de basische proteïnen. Om proteïnen in de tweede dimensie te scheiden, kan men
gebruik maken van SDS-PAGE (Sodium dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel
Elektroforesis). Polyacrylamide heeft als functie proteïnen te scheiden volgens hun moleculair
gewicht door het vormen van een netwerk van fibrillen. De kleinste eiwitten zullen sneller
door dit netwerk migreren en daarom onderaan in de gel terug te vinden zijn. SDS heeft als
functie proteïnen te denatureren en zwaar negatief te laden zodat de scheiding enkel op basis
van het moleculair gewicht gebeurt en niet op basis van de lading van het proteïne [73].
Nadat de gels gescand zijn met de Typhoon Imager 9400 worden de gelbeelden geanalyseerd
met behulp van de DeCyder software. Het programma bevat algoritmen dat de co-detectie van
spots, die verschillend gelabeld zijn, kan bewerkstelligen. De software laat geautomatiseerde
detectie, achtergrond correctie, kwantificatie, normalisatie en inter-gel matching toe [68]. Het
programma vergelijkt de beelden van de patiënten en de controles en berekent, met behulp
van de ANOVA en t-test, de significantie van het verschil in expressieniveau van de spots.
Een spotpickingslijst wordt automatisch door de software gegenereerd en de spots kunnen met
behulp van een robot of manueel uit de gel geïsoleerd worden. Na trypsine digestie kunnen de
spots finaal geïdentificeerd worden met behulp van Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionisation-Time Of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie [69,70].
Er wordt een onderscheid gemaakt tussen een analytische gel en een preparatieve gel. Op de
analytische gel wordt 50 µg gelabelde proteïnen geladen en de gel dient om de spots te
analyseren. De preparatieve gel bevat 300 µg niet-gelabelde proteïnen en wordt gebruikt voor
massaspectrometrische (MS) analyse.
Er zijn enkele nadelen verbonden aan de 2-D DIGE technologie. (1) Verschillende
proteïnenspots kunnen bestaan uit verschillende proteïnen. (2) Hetzelfde proteïne kan
16
voorkomen in verschillende spots door post-translationele modificaties. (3) Gelmatching en
het manueel verwijderen van artefacten tijdens beeldanalyse is arbeidsintensief. (4) Lage
spotresolutie door hoge pI waarden. (5) Het is moeilijk om grote en hydrofobe proteïnen te
scheiden in de 1ste
dimensie. (6) Sterk zure of basische proteïnen zijn moeilijk zichtbaar op de
gels [74].
Figuur 12: Schematische weergave van de verschillende stappen van de 2-D DIGE
techniek. Na de bereiding van de proteïnen zullen deze gelabeld worden met Cy2, Cy3 of
Cy5. De drie stalen (controle, patiënt en interne standaard) worden samengevoegd en
vervolgens gescheiden in een eerste dimensie volgens hun iso-elektrisch punt en in de
tweede dimensie volgens hun moleculair gewicht. De gels worden ingescand en
geanalyseerd met behulp van de DeCyder software. Informatie komt uit GE Healtcare
presentatie workshop [68].
DeCyder co-detectie en matching met interne standaard
De DyCyder software maakt gebruik van 4 modules (DIA, BVA, Batch Processor, EDA). De
Differential In-gel Analysis (DIA)-module detecteert en kwantificeert de eiwitspots op het
cumulatief beeld (Cy3- en Cy5-beeld) van eenzelfde gel. Deze co-detectie verzekert dat alle
spots vertegenwoordigd zijn op beide beelden. DIA berekent de proteïne abundantie per spot
17
in elk beeld en geeft dit weer als een ratio. Andere functies van DIA bestaan uit achtergrond
substractie en normalisatie. De data wordt vervolgens verwerkt in de Biological Variation
Analysis (BVA) module. Deze module gaat na of de verschillen gevonden in 1 gel consistent
zijn en voorkomen in de andere gels. Dit laat toe om eiwitexpressie kwantitatief te vergelijken
tussen meerdere gels. In deze module wordt gebruik gemaakt van de interne standaard om de
resultaten te normaliseren. BVA genereert een lijst met differentieel tot expressie komende
spots met voor elke spot de statistische waarde van een t-test of ANOVA test. Additioneel
kunnen moleculair gewicht en isoëlektrisch punt van de proteïnespots bepaald worden en een
spotpickinglijst opgesteld worden. De derde module is de Batch Processor. De Batch
Processor is een geautomatiseerde module, die de DIA en de BVA modules combineert.
Extended data analysis (EDA) is de vierde module en is de uitbreiding van statistische opties
zoals Principle component Analysis (PCA), Pattern analysis en Discriminant analysis [72].
Figuur 13: Schematische weergave van de 4 modules van de DeCyder software. De
gelbeelden worden eerst door DIA verwerkt. Na het aanmaken van een XML bestand
zullen de DIA bestanden verwerkt worden door BVA. Vervolgens wordt uit BVA XML
bestanden aangemaakt zodat deze samen met de XML bestanden uit DIA verwerkt
kunnen worden in de XML toolbox. De Batch Processor overkoepelt de DIA en BVA
zodat deze de gelbeelden automatisch kunnen verwerken [68].
18
2. Doelstelling
In de loop der jaren zijn de genetische oorzaken van verschillende erfelijke aorta-aneurysma
syndromen, zoals MFS en LDS geïdentificeerd. Toch blijft voor verschillende andere niet-
syndromale vormen van thoracale aorta-aneurysma’s (TAA) de precieze genetische oorzaak
onbekend. De rol die FBN1 en TGFBR2 spelen in de moleculaire mechanismen die de
agressieve fenotypes mediëren in het Marfan en Loeys-Dietz syndroom is nog niet volledig
ontrafeld. Voor het onderzoeken naar de genetische basis van aorta-aneurysma’s gebruikt men
MFS en LDS gezien deze het dichtst aansluiten bij de pathogenese van aorta-aneurysma’s.
Het doel van dit project is om na te gaan welke intra- en extracellulaire eiwitten differentieel
tot expressie komen in fibroblasten van MFS en LDS patiënten t.o.v. controles, dit met behulp
van de 2-D DIGE techniek. Kennis van deze eiwitten zou ons meer inzicht kunnen
verschaffen in de pathogenese van aorta-aneurysma’s.
In de toekomst moet de identificatie van differentieel geëxpresseerde proteïnen door Tandem
Massa Spectrometrie verder onderzocht worden. Functionele studies moeten helpen een idee
te vormen welke cellulaire processen gecontroleerd worden door deze differentieel
geëxpresseerde proteïnen en ontregeld zijn bij afwezigheid van expressie bij aorta-
aneurysma’s.
19
3. Materiaal en Methoden
3.1 Patiëntenmateriaal
Huidfibroblasten van zowel normale individuen als MFS en LDS patiënten zijn ter
beschikking in het Centrum voor Medische Genetica Gent. De normale individuen werden
geselecteerd op basis van leeftijd en geslacht van de patiënten. De patiënten met MFS worden
onderverdeeld naargelang het type mutatie, missense of nonsense, in het FBN1 gen. De
patiënten met LDS worden ingedeeld naargelang ze een mutatie hebben in TGFBR1 of
TGFBR2. Voor elke categorie worden 6 stalen gebruikt zodat de biologische variatie in
rekening kan gebracht worden. De TGFBR2 groep werd niet in het experiment geïncludeerd
gezien er onvoldoende patiëntenmateriaal verzameld kon worden.
Indeling groepen:
6 FBN1 nonsense MFS + 6 controle
6 FBN1 missense MFS + 6 controle
6 TGFBR1 LDS + 6 controle
Totaal: 36 stalen.
Zowel de intracellulaire als de extracellulaire proteïnen worden onderzocht om meer inzicht te
krijgen in de pathogenese van deze syndromen.
3.2 Celcultuur
3.2.1 Celkweek
Alle cellijnen werden opgegroeid als monolaag culturen in Dulbecco’s Modified Eagle
Medium (DMEM) x1 met 10% foetaal kalfserum in aanwezigheid van antibiotica, bij 37°C en
5% CO2. Het cultuurmedium wordt om de 2 à 3 dagen ververst. Zodra de culturen confluent
zijn, worden ze gesplitst met trypsine/EDTA. Trypsine verbreekt de verbindingen tussen de
cellen onderling en tussen de cellen en de cultuurfles. EDTA is een calcium chelator. Per
individu worden 2 T75 cultuurflessen verzameld voor de isolatie van intra- en extracellulaire
proteïnen.
Materiaal:
Bereid cultuurmedium (samenstelling zie bijlage 2)
Huidfibroblasten
Trypsine/EDTA (Gibco®, Invitrogen™)
20
Verseen (Gibco®, Invitrogen™)
Protocol: zie bijlage 3F
3.2.2 Medium en cellen oogsten
Achtenveertig uur nadat de cellen 100% confluent gegroeid zijn, worden de cellen
achtereenvolgens gewassen met PBS, sucrose-tris oplossing en serum- en fenolrood-vrij
medium. Vervolgens zullen zowel de cellen als het medium geoogst worden.
Materiaal:
PBS (Gibco®, Invitrogen™)
250 mM sucrose/10mM Tris (samenstelling zie bijlage 2)
Fenolrood- en serum-vrij medium (Gibco®, Invitrogen™) (samenstelling zie
bijlage 2)
Trypsine/EDTA (Gibco®, Invitrogen™)
Protocol : zie bijlage 3G
3.3 Precipitatie van eiwitten
3.3.1 Precipitatie van proteïnen uit cellen
Materiaal:
M-PER reagens (Therma Scientific®)
Protease inhibitor complete tabletten (Roche®)
Phosphatase inhibitor (Sigma)
PBS (Gibco®, Invitrogen™)
250 mM Sucrose/10 mM Tris (samenstelling zie bijlage 2)
Protocol: zie bijlage 3H
3.3.2 Precipitatie van proteïnen uit medium
Na optimalisatie (zie resultaten sectie 4.2 Optimalisatietest met clean-up kit) werd er voor de
precipitatie van proteïnen uit het medium geopteerd voor de TCA-LS precipitatiemethode.
Materiaal:
2% natrium lauroyl sarcosinaar (NLS) (Fluka Analytical®)
100% trichlooracetaat (TCA) (Sigma-Aldrich®)
Tetrahydrofuraan (THF) (Sigma®)
TE buffer + 0,1% Tween20 (samenstelling zie bijlage 2)
21
Protocol: zie bijlage 3I
3.3.3 2D Clean up kit (GE healthcare)
De intracellulaire proteïnen zijn in lage concentratie opgelost in M-PER buffer en de
extracellulaire proteïnen werden na TCA-LS precipitatie opgelost in TE buffer. Beide buffers
laten toe om de concentratie van de proteïnen te meten met de Nanodrop. Voor de 2D DIGE
analyse dienen de proteïnen echter opgelost te worden in een ureumbuffer (verder rehydratatie
buffer genoemd). De 2D Clean-up kit wordt gebruikt om de proteïnen opnieuw te
precipiteren, deze kit geeft goede resultaten na 2D scheiding en wordt aangeraden door GE
Healthcare.
Materiaal:
Precipitant (GE Healthcare)
Coprecipitant (GE Healthcare)
Gedistilleerd water
Wasbuffer (GE Healthcare)
Wasadditief (GE Healthcare)
Rehydratatiebuffer (samenstelling zie bijlage 2)
25x protease inhibitor oplossing (samenstelling zie bijlage 2)
Phosphatase inhibitor (Sigma®)
Protocol: zie bijlage 3J
3.4 Optimalisatie van de precipitatie van extracellulaire eiwitten met zilverkleuring
De precipitatie van proteïnen uit het cultuurmedium werd nog niet eerder uitgevoerd en het
proces diende bijgevolg nog geoptimaliseerd te worden. Om de precipitatiemethode te
beoordelen werden proteïnen na isolatie gescheiden volgens klassieke 2D gevolgd door
zilverkleuring van de gels.
Materiaal:
Fixing oplossing 30% ethanol (samenstelling zie bijlage 2)
Sensitizing oplossing (samenstelling zie bijlage 2)
Zilveroplossing (samenstelling zie bijlage 2)
Developping oplossing (samenstelling zie bijlage 2)
Stop oplossing (samenstelling zie bijlage 2)
Bewaringsoplossing (samenstelling zie bijlage 2)
Protocol: zie bijlage 3K
22
3.5 2-D DIGE experiment
3.5.1 Dag 1: pre-rehydratatie strips
De Immobiline DryStrips moeten gerehydrateerd worden vóór de scheiding van proteïnen op
basis van isoëlektrisch punt (verder IEF genoemd). De gebruikte strips hebben een pH
gradiënt van 3 tot 10 en zijn 24 cm lang. De rehydratatie van de strips kan gebeuren in aan- of
afwezigheid van de stalen. Voor dit experiment hebben we ervoor gekozen om de stalen ná
rehydratatie van de strips te laden met behulp van sample cups.
Materiaal:
Destreak solution (GE Healthcare)
IPG buffer (GE Healthcare)
24 cm Immobiline Drystrips (GE Healthcare)
Immobiline DryStrip Cover fluid (GE Healthcare)
Protocol: zie bijlage 3L
3.5.2 Dag 2: labeling en IEF
3.5.2.1 pH meting
Indien de pH waarde van de proteïnestaal afwijkt van pH 8,0-9,0 moet de zuurtegraad
aangepast worden met behulp van natriumhydroxide (1M). De pH van de stalen werd bepaald
met behulp van pH indicator strips (Sigma-Aldrich®).
3.5.2.2 CyDye labelling
3.5.2.2.1 Stock dye oplossing
CyDye’s (Cy2, Cy3 en Cy5) zijn fluorochromen en moeten na levering nog gereconstituteerd
worden met vers dimethylformamide (DMF) (<3 maand oud, 99,8% anhydrous) tot een
concentratie van 1 nmol/µl.
Materiaal:
CyDye DIGE fluorochromen (Cy2, Cy3, Cy5) (GE Healthcare)
DMF (Sigma®)
Protocol: zie bijlage 3M
3.4.2.2.2 Working Dye oplossing
Materiaal:
23
DMF (Sigma®)
Protocol: zie bijlage 3N
3.5.2.2.3 Minimal labeling
Bij de minimal labeling-methode zal 3% van het aanwezige lysine aminozuren in de proteïnen
gelabeld worden met de CyDye fluorochromen. Om de labelingsreactie stop te zetten wordt
lysine (10mM) toegevoegd, daar deze overmaat aan lysine zal binden aan de CyDye’s. De
totale concentratie is 400 pmol CyDye per 50 µg proteïne. De gelabelde stalen kunnen tot 3
maand bewaard worden bij -80°C in het donker.
Materiaal:
CyDye werkoplossing
10 mmol/L lysine (samenstelling zie bijlage 2)
Protocol: zie bijlage 3O
3.5.2.3 Voorbereiding op het laden van de stalen op de strips
De stalen worden samengevoegd zoals bepaald in het experimenteel design (zie resultaten
sectie 4.5.1 Staalcombinaties) en verdund met een 2x lyse buffer. Indien het volume kleiner is
dan 100 µl verdunnen we het staal verder in een 1:1 oplossing van rehydratatie buffer en 2x
lyse buffer. Als de proteïnen te geconcentreerd aanwezig zijn, kunnen ze immers aggregeren
en precipiteren alvorens ze gescheiden worden.
Materiaal:
2x rehydratatie buffer (samenstelling zie bijlage 2)
rehydratatie buffer
1:1 mengsel
2x lyse oplossing (samenstelling zie bijlage 2)
Protocol: zie bijlage 3P
3.5.2.4 Scheiden van de proteïnen op basis van isoëlektrisch punt (IEF)
Het doel van de IEF stap is om de proteïnen te scheiden in de eerste dimensie volgens hun
isoëlektrisch punt.
Materiaal:
Elektrode pads (GE Healthcare)
Immobiline DryStrips (GE Healthcare)
24
Elektroden (GE Healthcare)
Cup loader (GE Healthcare)
PlusOne Immobiline DryStrip Cover Fluid (GE Healthcare)
Protocol: zie bijlage 3Q
3.5.3 Dag 3: SDS
3.5.3.1 Equilibratie van de IPG strips
Indien de IEF stap langer dan 30 minuten voor de aanvang van de equilibratie van de strips
afgelopen is moeten de gediffundeerde proteïnen gerefocused worden gedurende 15 minuten
bij 8000 V. De strips worden vervolgens geëquilibreerd in buffers die respectievelijk DTT en
iodoacetamide bevatten. DTT wordt gebruikt om de disulfide bindingen te verbreken van de
proteïnen. Iodoacetamide verhindert brugvorming door te binden met cysteïne. De strips
mogen niet langer dan 30 minuten in de equilibratie buffers geïncubeerd worden, dit zou tot
elutie van de proteïnen kunnen leiden.
Materiaal:
Equilibratie buffer (samenstelling zie bijlage 2)
DTT (GE Healthcare)
Iodoacetamide (Sigma®)
Protocol: zie bijlage 3R
3.5.3.2 Applicatie van de IPG strips op de SDS gels en SDS elektroforese.
Na de equilibratie van de IPG strips zijn de proteïnen klaar voor scheiding in de 2de
dimensie
op basis van moleculair gewicht.
Materiaal:
Agarose (sealing solution) (samenstelling zie bijlage 2)
Gedistilleerd water
0,1% SDS (samenstelling zie bijlage 2)
Anode buffer (GE Healthcare)
Kathode buffer (GE Healthcare)
Protocol: zie bijlage 3S
3.5.4 Dag 4: scannen
De gels worden gescand met de Typhoon Gel Imager 9400 (GE Healthcare) zodat de beelden
nadien met de DeCyder software verwerkt kunnen worden. De Typhoon is een zeer gevoelige
25
variabele-mode gel imager die in staat is om fluorescente Cy2, Cy3 en Cy5 signalen te
detecteren aan de hand van 3 lasers (respectievelijke golflengte van 488 nm, 532 nm en 633
nm). Op figuur 14 is een samenvatting weergegeven van het scanningsproces.
Figuur 14: Software workflow en Scanner Control Interface. 1. Selecteren scanregio,
2. Selecteren fluorescentie, 3. Parameters en gebruikte laser instellen, 4. Selecteren
scanoriëntatie, 5. Selecteren press sample, 6. Selecteren focal plane, 7. Commentaar
toevoegen, 8. Selecteren pixelgrote, 9. Selecteren DIGE file naam formaat, 10.
Selecteren tray setting, 11. Tray editor [68].
1. Scanregio: 1B-10M
2. Acquisition mode: fluorescentie
3. Parameters en gebruikte lasers: zie figuur 15
4. Scanoriëntatie:
5. Press sample: aangevinkt zodat de scanner druk op de glasplaten kan uitoefenen zodat
deze niet verschuiven tijdens het scannen.
6. Focal plane: “+3 mm”
26
7. Commentaar: geen
8. Pixelgrote: De optimale Photo Multiplier Tubes (PMT)-waarden worden met behulp
van de “Trial and Error”-methode vastgesteld bij een resolutie van 1000 µm pixels.
Het eigenlijke scannen van de gels gebeurt bij een resolutie van 100 µm.
9. DIGE File Naming Format: aangevinkt zodat het bestand in de juiste formaat staat
voor de DeCyder software.
10. Tray setting: “User select” om zelf aan te duiden waar de gel ligt.
De glasplaten waarin de gels aanwezig zijn, hebben laag fluorescente eigenschappen. Het
voordeel hiervan is dat de gels niet uit de glasplaten moeten gehaald worden om te scannen,
met een verminderd risico op beschadiging van de gels tot gevolg.
Figuur 15: Fluorescence Setup voor Typhoon 9410. Selecteer de sensitivity checkbox
zodat elke scan beschouwd wordt als een aparte scan. Selecteer de gepaste emissie filter
uit de Emission Filter lijst voor elk kanaal. Pas de PMT waarden aan volgens de Trial en
Error methode [68].
Protocol: zie bijlage 3T
3.5.5 DeCyder software analyse
De analyse van de gelbeelden gebeurt met de DeCyder software. DeCyder bestaat uit 4
modules (DIA, BVA, Batch Processor en EDA).
27
3.5.5.1 Image Loader
De Image Loader heeft als functie om gelbeelden in de DeCyder programma in te laden.
Alvorens de gels in te laden dienen deze echter nog gecropt te worden. Croppen is het
selecteren van het spotpatroon waardoor het omringend spotloze zone niet in de modules
verwerkt wordt.
Protocol: zie bijlage 3U
3.5.5.2 DIA
DIA wordt gebruikt voor intra-gel analyse. Deze analyse dient voor zowel spotdetectie als
normalisatie van Cy3 en Cy5 gelbeelden in vergelijking met het Cy2 beeld (IS). Voordat men
met de spotdetectie begint moet men eerst achtergrondsubstractie doen. Na spotdetectie wordt
de differentiële aanwezigheid van de proteïnen weergegeven als de genormaliseerde volume
ratio (Cy3:Cy2 en Cy5:Cy2). Men moet tijdens de DIA analyse rekening houden dat
stofdeeltjes en andere artefacten vals positieven geven. Daarvoor moet elk gedetecteerde spot
gecontroleerd worden. Door gebruik te maken van de “proteïn“ en “exclusion filter” kan dit
tijdrovend proces sneller gebeuren. De volgende parameters worden gebruikt: spothelling
>1.0, area <350, piekhoogte <350 en volume <100000. Deze parameters werden bekomen
door de spot te bekijken met de hoogste of laagste waarde van elke parameter. Indien deze
spot een artefact zou zijn, wordt de volgende spot bekeken totdat men een echte proteïnenspot
tegenkomt [71].
Protocol: zie bijlage 3V
3.5.5.3 Batch Processor
De Batch Processor is een automatische module die zowel DIA als BVA omvat. De Batch
processor voert spot detectie, kwantiteitbepaling en gel-tot-gel matching automatisch uit. Zo
is het mogelijk om een grote hoeveelheid gels te verwerken zonder tussenkomst van de
gebruiker. Het aanmaken van een batch lijst kan onderverdeeld worden in twee activiteiten:
(1) DIA batch lijst setup. Laden van spotmap paren (patiëntbeeld-controlebeeld) voor co-
detectie in DIA. (2) BVA batch lijst set up. Spotmap attributen stipuleren voor de taken van
BVA. Na het laden van de spotmap paren moeten de gelbeelden toegewezen worden. Men
kan kiezen tussen control, treated en standard. De volgende stap is een functie toewijzen naar
elke gel. Men kan kiezen tussen Analysis (A) en Master (M). Alle beelden worden als
Analysis aangeduid. Eén beeld zal Master zijn en dit is het beeld waar alle andere beelden
28
mee gematcht zullen worden. Het Master beeld wordt manueel gekozen en is het beeld met de
meeste spots. Nadat het programma gelopen heeft kan men de volgende stappen uitvoeren in
het BVA module.
Protocol: zie bijlage 3W
3.5.5.4 BVA
BVA wordt gebruikt voor inter-gel analyse en bevat 4 modi, nl. Spot Map Table (ST), Match
Table (MT), Protein Table (PT) en Appearance Table (AT). Elke modi bevat dezelfde layout:
Image view, Table view, 3D view en Graph view. ST bevat een beeld en een Table view. De
tabel geeft zowel de informatie weer afkomstig van de Batch Processor als het aantal
gematchte en gedetecteerde spots. MT bevat gegevens over gel tot gel matching van
verschillende spots en biedt de gebruiker de mogelijkheid om matches te bevestigen. De MT
bestaat uit een Image View, 3D View en Table View. Matches uit de Table View bestaan uit
twee types. Auto Level 1 (hoge probabiliteit van correcte match) en Auto Level 2 (lage
probabiliteit van correcte match). Om Matches te bevestigen vergelijkt men een spot van
beeld met het Masterbeeld. Men bekijkt de omgeving van de spot zowel in 2D als in 3D.
Indien dit overeenkomt, wordt deze spot vergeleken met de andere gels en vervolgens
geconfirmeerd. Dit wordt gedaan voor 5 willekeurig gekozen level 1 spots en 10 level 2 spots
Deze spots zouden echte proteïne spots zijn. Indien de meerderheid van deze 15 spots niet
correct zijn, is het nodig om landmarking uit te voeren. Na het landmarken van de gels
worden de overblijvende spots automatisch gematcht. Landmarken laat toe om manueel
proteïnenspots te matchen om de accuraatheid van gel-tot-gel matching te verbeteren. De
gematchte proteïnenspots worden vervolgens manueel bevestigd voor alle gels. Het doel van
deze stap is een algemeen overzicht te krijgen van matching accuraatheid. Een ander
mogelijkheid om de accuraatheid van matching te bepalen, is het vergelijken van match
vectoren. PT toont een tabel met elk gematchte spot van alle beelden van het experiment. PT
geeft de proteïnen weer die een significant verschil in expressie vertonen tussen controles en
patiënten [71].
Protocol: zie bijlage 3X
29
3.5.5.5 EDA
Extended Data Analysis (EDA) vindt proteïnenspots met gelijkaardig expressie profielen en
groepeert de stalen volgens gemeenschappelijk expressiepatroon. EDA analyse bestaat uit de
volgende stappen: setup, berekeningen, resultaten en interpretatie. Setup wordt gebruikt om
gegevens te importeren uit BVA bestanden. Verschillende BVA bestanden kunnen hierdoor
met elkaar vergeleken worden. Vervolgens worden deze gegevens berekend om nadien de
resultaten te kunnen analyseren. Biologische informatie en context uit verschillende databases
zoals Pubmed, Pathways, UniProt en Gene Ontology zijn geïntegreerd in EDA. De proteïnen
uit de resultaten kunnen verder bestudeerd worden in de gegeven databases.
Differential Expression Analysis wordt gebruikt om significant geëxpresseerde proteïnen te
vinden door gebruik te maken van t-test en ANOVA-test. Principal Components Analysis
identificeert outliers in de gegevens die kunnen ontstaan door mismatches. Pattern analysis
vindt patronen terug zonder rekening te houden met de variabelen. Discriminant analysis
identificeert markers en creëert “classifiers” om onbekenden te classificeren [68].
Protocol: zie bijlage 3Y
30
4. Resultaten
4.1 Optimalisatie precipitatiemethoden
Precipitatiemethode voor intracellulaire proteïnen werd reeds getest, maar deze voor
extracellulaire nog niet. De optimalisatie van de precipitatiemethode is belangrijk voor een
goede scheiding te krijgen van proteïnen. We verkiezen de precipitatiemethode die de hoogste
concentratie aan proteïnen precipiteert en waarbij ook zoveel mogelijk laag abundante
eiwitten geïsoleerd worden uit het medium. De eiwitconcentratie werd gemeten met behulp
van de Nanodrop en spotpatronen van eenzelfde staal, geprecipiteerd op verschillende
manieren, werden geanalyseerd door middel van zilverkleuring.
In eerste instantie werd 1 controle staal op drie verschillende wijzen geprecipiteerd. Er werd
geopteerd om TCA-LS, TCA-DOC en aceton gevolgd door TCA te testen. Volgens Chevallet
et al.[75] zijn deze de beste methoden om mediumproteïnen te precipiteren met voorkeur voor
TCA-LS. In figuur 16 ziet men foto’s van de eerste optimalisatie test van mediumfractie.
Aceton-TCA werd toegepast zowel met als zonder clean-up kit herprecipitatie. Per gel werd
25 µg proteïnen geladen. De kwaliteit van de spotpatronen werd door herprecipitatie
verbeterd en de streaking van de proteïnen verminderd. De proteïnen van de gel die behandeld
werd met aceton precipitatie vertoonde weinig duidelijke spots in tegenstelling tot TCA-DOC
precipitatie. TCA-LS precipitatie vertoonde echter het beste resultaat. Bij het vergelijken van
aceton-precipitatie met en zonder clean-up kit zien we dat behandeling met clean-up kit een
duidelijker spotpatroon geeft. Hieruit kunnen we nog niet besluiten welke de beste
precipitatiemethode is. Wel kunnen we afleiden dat precipitatie gevolgd door clean-up kit een
beter spotpatroon weergeeft.
31
Figuur 16: 2-D gel gescheiding volgens isoëlektrisch punt en moleculair gewicht. (A)
Spotpatroon van TCA-Aceton precipitatie op gel. (B) Spotpatroon van aceton-TCA
gevolgd door 2-D clean up kit precipitatie op gel. (C) Spotpatroon van TCA-DOC
precipitatie op gel. (D) Spotpatroon van TCA-LS precipitatie op gel.
4.2 Optimalisatietest met clean-up kit
De tweede optimalisatietest gebeurde eveneens met TCA-LS, TCA-DOC en aceton-TCA
maar elke methode werd gevolgd door een herprecipitatie met clean-up kit. Er werd 25 µg
proteïnen geladen per laan in de 1D gel (figuur 17). Dit werd gedaan om de
precipitatiemethoden te beoordelen op basis van abundantie in proteïnen. De aceton-TCA
precipitatie vertoonde duidelijke scheiding van bandjes maar deze waren minder intens dan
bij de andere precipitatiemethoden. Dit ontstaat door een groter verlies aan proteïnen tijdens
de precipitatiestap. De clean-up kit werd gebruikt ten einde betere spotpatronen en zuivere
eiwitmengelingen te bekomen. Nadat de proteïnen behandeld zijn met de clean-up kit wordt
de concentratie gemeten met de Nanodrop. Alhoewel de 2-D quant kit van GE Healthcare
ontworpen is voor stalen opgelost in ureum, werkte deze niet naar behoren. Andere methoden
voor het bepalen van de concentratie eiwitten, zoals bichinconinic acid (BCA) en Bradford
hadden het probleem dat ureum aanwezig was. Deze methoden gaven een verkeerde
concentratie weer van de stalen bij UV spectroscopie. Nadat we konden vaststellen dat de 3
precipitatiemethoden in staat zijn om proteïnen te precipiteren, werden dezelfde stalen
gebruikt (250 µg per gel) voor het lopen van de 2D gels (figuur 18). De gels waarvan de
proteïnen geprecipiteerd werden met TCA-LS en TCA-DOC vertoonden een goede scheiding
32
van spots met weinig streaking. De aceton precipitatie had een lage opbrengst. Na deze test
werd besloten met TCA-LS verder te gaan gezien de spots abundanter en duidelijker zijn dan
bij TCA-DOC en aceton-TCA precipitatie.
Figuur 17: 1D Coomassie gekleurde gel voor TCA-DOC, TCA-LS en aceton precipitatie.
33
Figuur 18: 2-D gel scheiding volgens isoëlektrisch punt en moleculair gewicht. Alle
stalen van de gels zijn behandeld met clean-up kit. (A) Zilverkleuring en TCA-LS
precipitatie van een controle staal. De omcirkelde spots zouden albumine (pI 4,7 [76], 69
kDA [77]) kunnen zijn. (B) Zilverkleuring en TCA-DOC precipitatie van een controle
staal. Er is duidelijke vertikale streaking. (C) Zilverkleuring en aceton precipitatie van
een controle staal. De ladder is hier uitgelopen.
4.3 Bepaling van confluentietijd
In een volgende stap werd bepaald wat de optimale incubatietijd is van de cellen na
confluentie. Immers, cellen starten met de productie van matrixeiwitten nadat de exponentiële
groeifase beëindigd is. Eenzelfde controle werd 4 maal opgegroeid tot de cellen 100%
confluent waren. Vervolgens werd het medium na 1, respectievelijk 3, 5 en 10 dagen
vervangen door serum- en fenol-vrij medium (24u lang). De precipitatie gebeurde met TCA-
LS gevolgd door een behandeling met de clean-up kit. 90 µg proteïnen werden op de gels
geladen.
Cellen na 1 dag confluentie vertonen minder spots dan cellen na 3 dagen confluentie (zie
figuur 19). Bij de gel van cellen na 5 dagen confluentie is de kleuring mislukt. Cellen na drie
dagen confluentie toonden spotpatronen die vergelijkbaar zijn met de vorige test van TCA-
LS.
34
Figuur 19: 2-D gel scheiding volgens isoëlektrisch punt en moleculair gewicht. Bij elke
gel zijn de cellen gedurende 24u bewaard in serum-vrij medium voor precipitatie. De
gels zijn geladen met 90 µg proteïnen. (A) TCA-LS precipitatie 1 dag na confluentie. (B)
precipitatie 3 dagen na confluentie. (C) TCA-LS precipitatie 10 dagen na confluentie.
Omwille van het feit dat de kleuring van één van de gels mislukt was, herhaalden we dit
experiment met 130 µg proteïnen per gel. De gel waarvan de cellen geïncubeerd zijn tot 1 dag
na het 100% confluentie tijdstip gaf een goed en duidelijk spotpatroon weer. De
proteïnenspots waren aanwezig en duidelijk gescheiden. De gels met cellen geïncubeerd tot 3
en 5 dagen na confluentie gaven een incompleet patroon. De gel met 5 dagen confluentie
vertoont bovendien ook nog streaking. De gel met cellen geïncubeerd tot 10 dagen na
confluentie gaf een duidelijk spotpatroon weer maar met aanwezigheid van streaking. Die gel
gaf echter meer spots aan dan bij de gel met 1 dag confluentie. Een mogelijke reden hiervoor
is dat cellen, die te lang in confluentie zijn, apoptotische processen in gang brengen door
proteïnen te produceren die betrokken zijn in afbraak (figuur 20). Uiteindelijk heeft men
geopteerd om cellen 2 dagen lang te laten groeien na confluentie en vervolgens 48u te
incuberen in serum- en fenol-vrij medium. De reden is als volgt. In het eerste experiment van
deze sectie had de gel met 3 dagen confluentie een duidelijker spotpatroon dan bij de gel met
1 dag confluentie. Bij herhaling van het experiment vertoonde de gel met 1 dag confluentie de
meest duidelijke spots en was er geen zichtbaar verschil tussen de gel met 3 en 5 dagen
confluentie.
35
Figuur 20: 2-D gel gescheiding volgens isoëlektrisch punt en moleculair gewicht. Bij elke
gel zijn de cellen gedurende 24u bewaard in serum-vrij medium voor precipitatie. De
gels zijn geladen met 130 µg proteïnen. (A) TCA-LS precipitatie 1 dag na confluentie.
(B) TCA-LS precipitatie 3 dagen na confluentie. (C) TCA-LS precipitatie 5 dagen na
confluentie. (D) TCA-LS precipitatie 10 dagen na confluentie.
4.4 Albumine depletie
De AminoLink® Plus Immobilization Kit (Thermo Scientific) is gebaseerd op het principe
van affiniteitschromatografie. De kit maakt gebruik van agarose beads die aldehyde
functionele groepen bevatten. Deze groepen reageren spontaan met de primaire amines
(-NH2) van proteïnen. Er ontstaat een stabiel secundair amine in de aanwezigheid van natrium
cyanoboorhydride (NaCNBH3). De bindingsaffiniteit is groter dan 80% onafhankelijk van pI
of moleculair gewicht. Eens immunoglobulines geïmmobiliseerd zijn, kan de vaste fase
gebruikt worden voor scheiding van specifieke proteïnen zoals albumine. Het protocol voor
albumine depletie kan geraadpleegd worden in bijlage 3D en 3E (Thermo Scientific) [78].
Het gebruik van albumine depletie werd getest omdat albumine andere proteïnen
overschaduwt en een groot deel uitmaakt van de proteïneconcentratie. Dit heeft nefaste
gevolgen voor analyse van weinig abundante eiwitten. Deze zouden dan moeilijk of niet
gedetecteerd kunnen worden. In de kit worden albumine specifieke IgG gebonden. BSA
wordt op de kolom toegevoegd om zo albumine uit het medium te filteren voor precipitatie.
36
De spot die op 67 kDa en pI 4,7 heeft, is minder ambudant aanwezig na albumine depletie.
Op basis daarvan en van kleurintensiteit vermoeden we dat dit albumine is [76]. Opmerkelijk
is dat andere spots minder zichtbaar zijn op de gels. Door het groot verlies aan proteïnen door
depletie kon er maar 50 µg proteïne geladen worden. Men moet wel rekening houden dat in
het vorig experiment 130 µg proteïne gebruikt werd. Hierdoor kan men deze twee
experimenten niet vergelijken. Uit de foto’s van figuur 21 kan men concluderen dat albumine
depletie niet gebruikt wordt voor het 2-D DIGE experiment wegens een te groot verlies aan
proteïnen tijdens depletie.
Figuur 21: Bij elke gel zijn de cellen gedurende 24u bewaard in serum-vrij medium voor
precipitatie. De gels zijn geladen met 50 µg proteïne met depletie van BSA. (A) TCA-LS
precipitatie 1 dagen na confluentie. (B) TCA-LS precipitatie 3 dagen na confluentie. (C)
TCA-LS precipitatie 5 dag na confluentie. (D) TCA-LS precipitatie 10 dagen na
confluentie.
4.5 Experimenteel design
Deze sectie beschrijft het concept van het experimenteel design. Niet-2D DIGE analyses
hebben het probleem van experimentele en biologische variatie. Deze variaties zullen verder
in de sectie bespreking aan bod komen. Er zijn enkele belangrijke punten die in rekening
gebracht moeten worden om de echte biologische variatie te determineren. Biologische
variatie moet beschouwd worden als biologische significante verschillen als gevolg van
testcondities:
37
1) de behoefte van biologische replicates.
2) opbouw van de gepaste experimenteel design en analyse.
3) het includeren van de interne standaard op elke gel.
Het is aangeraden dat biologische replicates van elke groep gebruikt wordt. Hoe meer
biologische replicates, hoe meer staal afhankelijke variaties in rekening gebracht worden, hoe
betekenisvoller de resultaten. Dit zorgt voor een accurate meting waarvan het resultaat
significant boven de basislijn van de biologische variatie ligt. Zonder gebruik te maken van
replicates zullen de resultaten biologisch niet relevant zijn. Er zal dan geconcludeerd worden
dat de verschillen door experimentele variatie ontstaan. In het experiment is de experimentele
variatie laag dankzij de interne standaard en analyse methode [68].
4.5.1 Staalcombinaties
Om de pathogenese van aorta-aneurysma’s beter te begrijpen gebruikt men MFS en LDS.
Deze syndromen werden vergeleken met een controle groep om zo differentieel
geëxpresseerde proteïnen te bepalen. Dit is enkel mogelijk als men de groepen efficiënt
indeelt volgens syndroom en mutatie. Men heeft twee grote groepen, nl. MFS en LDS. Elke
groep wordt onderverdeeld in 2 subgroepen. Bij MFS heeft men subgroep nonsense FBN1
mutatie en subgroep missense FBN1 mutatie. Bij LDS heeft men subgroep TGFBR1 mutatie
en subgroep TGFBR2 mutatie. Elke subgroep wordt gematcht met een controle groep. Voor
elke subgroep zijn 6 patiëntstalen gebruikt die gematcht zijn volgens geslacht en leeftijd voor
zowel medium- als celfractie (zie figuur 22 en bijlage 1 tabel 1).
Figuur 22: Indeling van de stalen in 4 groepen. De patiëntenstalen worden vergeleken
met hun gematchte controles. De verschillende groepen worden vervolgens met elkaar
vergeleken.
38
4.5.2 Dye-swap
CyDye’s hebben elk een verschillend moleculair gewicht. Dit heeft als gevolg dat proteïnen
met laag moleculair gewicht een kleine shift ondergaan op de gel. Om dit probleem op te
lossen, wordt er dye-swapping toegepast. In het experiment heeft men de helft van elke groep
(bijv. nonsense FBN1 mutatie bij MFS) met Cy3 gelabeld en de andere helft met Cy5.
Uiteraard wordt de controle groep op eenzelfde manier gelabeld maar met het ander
fluorochroom (zie bijlage 1 tabel 2). Deze techniek zal matching van spots vergemakkelijken
en het proteïnenshift probleem wegwerken.
4.5.3 Interne standaard
De interne standaard moet op elke gel aanwezig zijn zodat deze geanalyseerd kan worden
door de DeCyder software. Het gebruik van oplosbare CyDye DIGE fluorochromen geeft de
mogelijkheid om tot 3 verschillend gelabelde proteïnenstalen te scheiden op eenzelfde 1ste
en
2de
dimensie gel. Dit geeft de opportuniteit om een in-gel standaard te includeren voor elk
proteïne in het experiment op elke gel. De interne standaard ontstaat uit een pool van alle
stalen van het experiment die gelabeld zijn met Cy2. De interne standaard wordt vervolgens
samen met elk staal op elke gel geladen. Dit wil zeggen dat ieder proteïne van elk staal in de
interne standaard aanwezig zal zijn.
Dit brengt enkele voordelen met zich mee:
a) accurate kwantificatie- en spotberekeningen zijn mogelijk tussen gels.
b) de betrouwbaarheid stijgt bij het matchen van gels.
c) flexibiliteit van statistische analyse is afhankelijk van het verband tussen twee
stalen.
d) scheiding van experimentele variatie van biologische variatie [68].
4.5.4 IEF
Voor de voorbereiding op IEF wordt er verwezen naar materiaal en methoden sectie 3.4.1 tot
3.4.2.1. De proteïnen kunnen vervolgens gescheiden worden in de eerste dimensie. Deze
scheiding is gebaseerd op isoëlektrisch punt. De scheiding gebeurt op een 24cm lange strip
die een pH gradiënt heeft van 3 tot 11. De zure proteïnen met een laag pI en basische
proteïnen met een hoog pI zullen respectievelijk ter hoogte van pH 3-6 en pH 8-11 aanwezig
zijn.
39
4.5.5 SDS
De strips worden vervolgens geëquilibreerd in buffers die respectievelijk DTT en
iodoacetamide bevatten. DTT wordt gebruikt om disulfide bindingen te verbreken van de
proteïnen. Iodoacetamide verhindert brugvorming door te binden met cysteïne. De strips
kunnen vervolgens op de gels geladen worden zodat de proteïnen in de tweede dimensie
gescheiden kunnen worden. Deze scheiding is mogelijk doordat SDS het pI neutraliseert van
de proteïnen om zo enkel scheiding op moleculair gewicht mogelijk te maken. Na scheiding
zijn de gels klaar om gescand te worden nadat ze grondig gespoeld zijn met gedistilleerd
water. Dit is nodig om zo veel mogelijk stofdeeltjes van de gelplaat te verwijderen [68]
4.6 Scannen en croppen
Het scannen werd twee maal voor elke gel uitgevoerd. Bij de eerste scanning is “Press
Sample” niet aangevinkt. “Press Sample” zorgt voor het aandrukken van de gelplaten tijdens
het scannen zodat de gelplaten niet verschuiven. Bij de tweede gelscanning werd “Press
Sample” wel aangevinkt (zie figuur 14). Bij elke scanning werden de PMT waarden volgens
de “Trial and Error”-methode gevonden (zie bijlage 1 tabel 3). Na het inscannen van de gels
met de Typhoon Imager moeten de beelden gecropt worden. Croppen is het selecteren van het
spotpatroon waardoor het omringend spotloze zone niet in de modules verwerkt wordt. Dit
vergemakkelijkt de berekeningen voor de DeCyder software (zie figuur 23).
Figuur 23: Croppen van een gelbeeld. Links: gelbeeld volgens de scanner ontvangen.
Rechts: gecropte gelbeeld.
40
4.7 Gelanalyse
De gecropte beelden moeten volgens de DeCyder software geanalyseerd worden. DeCyder
bevat 4 modules: DIA, BVA, Batch Processor en EDA. Tijdens de analyse van de gelbeelden
met de DeCyder software zijn er verschillende problemen aan het licht gekomen. Op de gels
moeten duidelijke spots aanwezig zijn zonder horizontale of verticale streaking. Op de gels
(figuur 24) kan men zien dat er verticale streaking aanwezig is. Dit komt door SDS depletie
tijdens de 2de
dimensie elektroforese. Dit kon verholpen worden door meer SDS (0,2%) toe te
voegen in de bovenste bufferkamer. SDS veroorzaakt denaturatie van proteïnen zodat de
proteïnen enkel op moleculair gewicht gescheiden kunnen worden [68].
Figuur 24: vertikale streaking.
4.7.1 DIA
Differential In-gel Analysis heeft als functie om proteïnenspots te detecteren en beeldparen te
kwantificeren in eenzelfde gel.
Tijdens de DIA analyse moet men normaal een rode Gausscurve zien die overlapt met de
blauwe Gausscurve. De blauwe curve stelt de normale verdeling voor van spots. De rode
curve presenteert de werkelijke verdeling van de spots, met op de X-as de log volume ratio en
op de Y-as het maximum volume van elke spot en het aantal spots. Op figuur 26 ziet men
geen mooie rode Gausscurve maar eerder pieken die de blauwe curve doorkruisen. Deze
verhogingen en verlagingen geven aan dat de verdeling van spots niet evenredig is.
Een tweede probleem gedetecteerd bij DIA is de detectie van teveel spots. Normaal zou men
ongeveer 2500 spots moeten detecteren terwijl we tijdens het experiment vaak ruim 5000
spots opmerken. Dit komt door stofpartikels op de gels die als spots worden aanzien. Deze
41
foutieve spots worden aangeduid als een hoge piek met steile helling en klein spotoppervlakte
(zie figuur 25). De stofpartikels in de gel tussen de glasplaten konden niet voorkomen worden
gezien men geprecaste gels gebruikte. Deze stofpartikels ontstaan door een fout van de
fabrikant. Althans kunnen stofpartikels op de gelplaten weggespoeld worden met gedistilleerd
water.
Figuur 25: Links: 3D weergave van een proteïnenspot. Rechts: 3D weergave van een een
stofdeeltje [68].
Bij de tweede scanning had men een gemiddelde van 2109 spots voor celfractie en 2197 spots
voor mediumfractie. De t-test (a=0,05) kon geen significant verschil (P=0,10) aantonen in
hoeveelheid spots tussen medium- en celfractie. Het medium- en celfractie van MFS had
respectievelijk een gemiddelde van 2207 en 2112 spots. De t-test (a=0,05) kon geen
significant verschil (P=0,17) aantonen in hoeveelheid spots tussen het medium- en celfractie
van MFS. Het medium- en celfractie van TGFBR2 had respectievelijk een gemiddelde van
2187 en 2105 spots. De t-test (a=0,05) kon geen significant verschil (P=0,37) aantonen in
hoeveelheid spots tussen het medium- en celfractie van TGFBR2.
Ten slotte, bij DIA moeten de spots van elk beeld op eenzelfde gel samenvallen. Dit was hier
niet steeds het geval mogelijks door het niet aanvinken van “Press Sample” tijdens de
scanprocedure. Bij het herscannen van de gels met de aangevinkte “Press Sample” was dit
probleem opgelost. Door een te groot interval tussen het lopen van de gel en het scannen
waren de proteïnen gediffundeerd. Proteïnen die diffunderen in gel kunnen de gelanalyse
bemoeilijken omdat weinig abundante proteïnen oplossen in hoog geconcentreerde proteïnen.
42
Figuur 26: DIA beelscherm van strip 75745 na de eerste scanning. Op bovenstaande
figuur is de Table View, 3D View, Spotmap View en Histogram View weergegeven. In
Spotmap View (links boven) worden de geëxcludeerde spots weergegeven in roze. De
groene spots zijn deze die binnen de 2 SD regio vallen. De rode spots vallen buiten de 2
SD regio. De scatter parameter staat hier op maximum volume. Op de Histogram View
(rechts boven) ziet men de Gausscurve en het aantal gedetecteerde spots (5433). Links
onder wordt de 3D View weergegeven. De in roze aangeduide spot is de spot die in Table
View aangeklikt werd. Table View (rechts onder) bevat de lijst van alle gedetecteerde
spots met de daarbij horende informatie zoals volume ratio, helling en oppervlakte.
43
Figuur 27: Spotmap weergave bij DIA. Het probleem van “Press Sample” wordt hier
aangelicht. De linker spotmap is de weergave van Cy5 gelabelde proteïnen en de rechter
spotmap van Cy3 gelabelde proteïnen voor dezelfde gel (strip 75743). Elke spot heeft een
centraal punt. Indien men de omcirkelde spots vergelijkt met dezelfde spots van de
andere spotmap, kan men zien dat het centraal punt verplaatst is. Dit komt doordat
“Press Sample” niet aangevinkt was alvorens te scannen.
4.7.2 BVA
Biological Variation Analysis dient om multipele beelden te matchen van verschillende gels
om statistische berekeningen uit te voeren op proteïneëxpressie niveau.
De gebruikte test is de ongepaarde t-test en de eenzijdige ANOVA-test. De reden hiervoor is
dat men over twee verschillende groepen (controle en patiënt) beschikt en elk individu van
een groep gematcht is volgens leeftijd en geslacht met de andere groep. Bij het uitvoeren van
de ANOVA-test moeten de spots een waarde hebben tussen 0 en 0,001 om significant te zijn.
De reden om 0,001 als grens te kiezen is dat de grote hoeveelheid gedetecteerde spots
gemakkelijk vals positieve resultaten kunnen geven. De ANOVA- en t-test geven 0
significante differentiële spots bij alle mediumfracties (MFS FBN1 nonsense, missense en
LDS TGFBR2 groep vs controles) van het experiment en alle celfracties van de 2 MFS
subgroepen. De celfracties van de TGFBR2 groep bevatten 27 significante spots bij de t-test
(a=0,05) en geen significante spots bij de ANOVA-test (<0,001). Uiteindelijk zou een nul
44
waarde niet mogelijk zijn aangezien men al louter door toeval verwacht dat een aantal spots
een verschil in expressie zou vertonen. Indien men de grens op 0,01 zet, zijn er nog steeds te
weinig proteïnen significant. Bij alle groepen behalve de celfracties van de TGFBR2 groep (5
spots) konden geen significante spots gedetecteerd worden. Opnieuw verwachten we meer
significante spots wegens de hierboven vermelde reden.
Figuur 28: t-test uitgevoerd in BVA. 27 van de 1296 proteïnen zijn significant
verschillend bij TGFBR2 celfractie.
Een kwaliteitscontrole voor het 2-D DIGE experiment is het bepalen van vectoren. Vectoren
zijn aanwijspunten waarvan de locatie van de spot van het match beeld overeenkomt met het
master beeld. In het experiment op de gelbeelden van TGFBR2 en MFS celfracties (zie figuur
29) zijn de vectoren lang. Na het normaliseren van gelbeelden moeten de vectoren normaal
kort zijn. Dit komt door een slechte wrapping van de gelbeelden. Wrapping is het vervormen
van het gelbeeld zodat de spots met elkaar gematcht kunnen worden.
45
Figuur 29: Strip 75746 die gematcht is met master strip 75741. Op het beeld van strip
75746 kan men lange vectoren zien. De vectoren geven de positie weer van de
overeenkomende spots van de master.
4.7.3 EDA
EDA is een statistische module. Wij hebben in deze module enkel gebruik gemaakt van de
Principal Component Analyse. De Principal Component Analysis laat toe om na te gaan of er
clusters van gelbeelden gevormd worden waardoor men zou kunnen besluiten dat bepaalde
groepen van elkaar onderscheiden zijn (bijv. patiënten versus controles). Het is een methode
die de hoeveelheid gegevens vermindert door bepaalde belangrijke componenten te definiëren
die een percentage van de totale variantie voorstelt van de data set. Het eerste principal
component bevat de grootste hoeveelheid variantie van de gegevens. Het tweede principal
component bevat de tweede grootste variantie enz… [68]
Na het aanmaken van de workspace onder “Setup” werd er op “Automatic” gedrukt bij “Base
Set”. Deze functie zorgt voor normalisatie van gegevens, proteïnen- en spotmap- filtering. Na
het drukken van “Calculations” werd er op Principal Component Analysis, “Add to list” en
“Calculate” gedrukt. Bij “Number of components to calculate” wordt de waarde 5 gegeven.
Het is zelden dat men een grotere waarde invult aangezien de eerste 5 de meeste variantie
bedekken (figuur 30). Bij ons experiment kan men onder “Results” zien dat de clusters
onafhankelijk van de groepen zijn (figuur 31). Men kan geen verschil waarnemen tussen
controle, MFS groepen en de TGBFR2-groep zowel voor medium als celfractie.
46
Figuur 30: Principal Components Analysis van EDA onder “Calculations”.
Figuur 31: Principal Component Analysis bij EDA onder “Results”. Links: score plot
van proteïnen. De cirkel is de 95% significantie grens van de spots. De spots buiten de
cirkel zijn outliers die ofwel sterk geëpresseerde eiwitten zijn ofwel mismatches. Rechts:
ruwe vergelijking tussen proteïnen en spotmaps. Het is een schatting welke proteïnen op
of neer gereguleerd zijn in de verschillende spotmaps. Er zijn geen clusters gevormd.
47
5. Bespreking
In de westerse wereld zijn aortadissecties verantwoordelijk voor 1-2% van de totale
mortaliteit [1]. In de loop der jaren zijn verschillende aorta-aneurysma syndromen
geïdentificeerd, zoals het Marfan syndroom (MFS) en het Loeys-Dietz syndroom (LDS).
Onderzoek heeft uitgewezen dat MFS veroorzaakt wordt door een mutatie in het FBN1 gen
[5] en LDS door mutaties in TGFBR1 en TGFBR2 [6]. Het doel van het onderzoek is meer
inzicht verschaffen in de pathogenese van aorta-aneurysma’s. Hier wordt getracht een
vergelijkende analyse uit te voeren van proteïnen die tot expressie komen in zowel medium-
als celfractie van fibroblastculturen van controles, MFS en LDS patiënten. Hiervoor wordt er
gebruikt gemaakt van de Two Dimensional Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE)
techniek. De 2-D DIGE techniek is gebaseerd op de fluorescente labeling van proteïnen
alvorens deze te scheiden in twee dimensies met behulp van gelelektroforese [68]. De
bekomen gels worden vervolgens geanalyseerd met behulp van de DeCyder software. De
interpretatie van de resultaten werd bemoeilijkt door een gebrek aan significant differentieel
tot expressie komende proteïnen. Dit kan verklaard worden door technische en biologische
variatie.
Technische variatie ontstaat door omgevingsfactoren tijdens het
uitvoeren van het experiment. In het experiment is de technische variatie voornamelijk de gel-
tot-gel variatie. Deze variatie ontstaat door een verschil in elektroforese condities, een
verschil in 1ste
dimensie strips en 2de
dimensie gels, gel-distortie en variatie van gebruiker tot
gebruiker. De gel-tot-gel variatie kan normaal vermeden worden door de inclusie van een
interne standaard in elke gel. Dit is enkel mogelijk met de 2-D DIGE technologie [68].
Tijdens het experiment verliep de isolatie van cellen niet simultaan. Dit komt doordat niet alle
cellen in het begin voorhanden waren. Als gevolg gebeurde de celcultuur met het beschikbaar
celmateriaal en moest de rest later in cultuur gebracht worden. In de toekomst zal de celkweek
gestart moeten worden indien elke patiëntstaal beschikbaar is. Tijdens het celkweekproces
verliep de behandelingen van cellen, waaronder het oogsten van cellen, door verschillende
personen. Als gevolg waren de cellen op een ander manier behandeld waardoor er een
gebruiker tot gebruiker variatie ontstaat.
Na het oogsten van cellen en medium moeten de proteïnen geprecipiteerd worden. De
precipitatie van cellen was reeds op punt maar van medium hadden we zelf getest welke de
beste precipitatiemethode was. Er werd geopteerd om TCA-LS, TCA-DOC en aceton gevolgd
48
door TCA als precipitatiemethoden te testen voor het medium. Aceton-TCA werd toegepast
zowel met als zonder clean-up kit herprecipitatie. Deze test werd uitgevoerd om een eerste
indruk te krijgen van de spotpatronen die na precipitatie ontstaan. Indien aceton-TCA gevolgd
door clean-up kit herprecipitatie minder duidelijke spotpatronen weergaf, kon men al
besluiten welke precipitatiemethode (TCA-LS) gebruikt kon worden voor het 2-D DIGE
experiment. Dit is echter niet het geval. Een nieuwe test werd uitgevoerd waarbij elke
precipitatiemethode gevolgd werd door een clean-up kit herprecipitatie. In deze test was de
ladder uitgelopen bij de aceton-TCA precipitatie. Dit had als gevolg dat sommige spots door
de ladder moeilijk zichtbaar zijn.
Bij de bepaling van de optimale confluentie tijd was de eerste poging mislukt. De kleuring
van de gel van cellen na 5 dagen confluentie is mislukt. Dit kwam doordat de stop oplossing
voor de zilveroplossing op de gel toegevoegd werd. Hierdoor werden de proteïnen niet
aangekleurd en was de gel niet voor interpretatie vatbaar. Bij herhaling van het experiment
kon men besluiten dat de cellen 2 dagen confluent na confluentie geoogst worden.
Een test werd uitgevoerd om te bepalen indien albumine depletie de concentratie van
albumine zou verminderen zonder de concentratie van andere proteïnen te veranderen. Deze
test had het probleem dat men na depletie een te kleine concentratie proteïnen kreeg waardoor
de spots minder duidelijk aanwezig zijn. In de toekomst zal albumine depletie voor het 2-D
DIGE experiment niet uitgevoerd worden. Algemeen zal elke behandeling een verlies aan
proteïnen veroorzaken. Afhankelijk van de behandeling zal het verlies al-dan-niet groot zijn.
Tijdens de optimalisaties werd bij een aantal van de gels vertikale streaking waargenomen
(zie figuur 24). Dit kan in de toekomst vermeden worden door meer SDS (0,2%) te gebruiken
in de bovenste en onderste bufferkamer van de 2-D DIGE tank [68].
Nadat de proteïnen met CyDye’s gelabeld zijn kunnen deze gescheiden worden volgens
isoëlektrisch punt (IEF) en moleculair gewicht (SDS). Vervolgens worden de gelplaten
gescand. Tijdens de eerste scanning werd “Press Sample” niet aangevinkt. Dit heeft als
gevolg dat de scanner geen druk op de gelplaat uitoefent tijdens het scannen. Op de
gelbeelden worden verschoven spots waargenomen (figuur 27). Deze technische variatie kan
verholpen worden door “Press Sample” aan te vinken. Tijdens de tweede scanning werd dit
toegepast maar de proteïnen werden gediffundeerd. Dit is het gevolg van een groot
tijdsinterval tussen de eerste en tweede scanning van de gels doordat gels eerst geanalyseerd
werden.
Tijdens de eerste scanning was er een overvloed van spots gedetecteerd. Dit kwam door
stofdeeltjes die door de software als spot beschouwd werden. Door het overvloedig spoelen
49
van de gelplaten met gedistilleerd water en grondig droogvegen met stofvrije doekjes kan dit
probleem geminimaliseerd worden. Door gebruik te maken van de exclusionfilter in de DIA
module kon het aantal vals positieve spots dalen. Echter waren niet alle spots effectief
proteïnenspots. Door in de toekomst elke spot te controleren op vals positiviteit kan men alle
stofdeeltjes uit het gelbeeld verwijderen waardoor het matchen van proteïnenspots veel
efficiënter gebeurd. Hierdoor zullen de resultaten representatiever zijn voor het experiment.
Na de DIA analyse wordt de BVA analyse uitgevoerd. Tijdens deze analyse werd er
opgemerkt dat de vectoren bij sommige gels lang waren. Dit is te wijten aan het spotpatroon
van de gels. Doordat het spotpatroon van een gel verkeerdelijk gematcht wordt met een
andere gel, zullen de vectoren lang worden. Dit kan verholpen worden door het landmarken
van spots. Echter na landmarken zijn de vectoren bij enkele gels lang. In de toekomst kan dit
verholpen worden door spots te landmarken die ver uit elkaar verwijderd zijn [68].
Bepaalde proteïnen kunnen niet gedetecteerd worden met de 2-D DIGE techniek. Zo zullen
sterk zure en basische eiwitten niet op de gel aanwezig zijn gezien deze gedurende de
scheiding in de eerste dimensie buiten de pH grenzen vallen (pH 3-11) van de Immobiline
strip. Weinig abundante proteïnen worden niet gedetecteerd door de 2D DIGE techniek. Dit
nadeel ontstaat doordat een deel van de proteïnen opgelost worden in hoog geconcentreerde
eiwitten. Een tweede reden is het verlies aan proteïnen bij iedere bewerking van de stalen.
Sterk hydrofobe proteïnen worden niet gescheiden in de eerste dimensie gezien we werken
met een hydrofobe Immobiline strip. In de toekomst kunnen sterk hydrofobe proteïnen
gescheiden worden door gebruik te maken van hydrofiele Immobiline strips. Ten slotte
worden lysine-vrije proteïnen niet gedetecteerd. Dit is het gevolg van lysine specifieke
labeling van de fluorochromen. Dit probleem kan verholpen worden door CyDye DIGE
fluorochromen te gebruiken die een actieve maleimide reactieve groep bevatten. Deze
fluorochromen zijn ontwikkeld om covalent met de thiol groep van cysteïne te binden [79].
Tijdens het experiment werd dit niet gebruikt gezien weinig proteïnen lysine-vrij zijn.
Biologische variatie is de intrinsieke variatie tussen de stalen onderling. Deze variatie kan niet
weggewerkt worden bij alle 2D gelelektroforese systemen. In dit experiment werd per groep 6
stalen gebruikt om de biologische variatie te minimaliseren. Indien men in elke groep meer
stalen zou gebruiken, zal de biologische variatie een minder belangrijke rol spelen [68].
Geïnduceerde biologische verandering, maw dat wat we willen meten, zijn de verschillen
geïntroduceerd door bijvoorbeeld ziektestatus, behandeling met medicijnen,… In dit project is
het de bedoeling om differentieel geëxpresseerde proteïnen tussen controle- en patiëntengroep
50
te bepalen. Door gebruik te maken van 6 patiënten per groep kan men zich de vraag stellen
indien dit wel genoeg is voor de interpretatie van resultaten. Humane weefsels van
verschillende individuen verschillen van elkaar door de aanwezigheid van single nucleotide
polymorphisms (SNP’s). Door gebruik te maken van minimum 6 stalen per groep worden
deze SNPs in rekening gebracht. Het gebruik van een minimum aantal stalen wordt niet
aangeraden. Indien er een fout ontstaat bij een van deze stalen worden de resultaten niet
interpreteerdbaar wegens te lage power.
Tijdens de celkweek ontstond het probleem dat er een verschil in passages was. Dit
beïnvloedt de celgroei doordat vers geïsoleerde cellen sneller delen dan cellen die
verschillende passages ondergaan hebben. Aan een aantal van de aspecten van de biologische
variatie kan tegemoet gekomen worden. Zo kunnen de stalen zo geselecteerd worden dat deze
allen ongeveer eenzelfde aantal passages hebben ondergaan. De isolatie van cellen gebeurt
simultaan indien de celgroei bij elke staal gelijkaardig verloopt. In het praktijk is dit niet
evident gezien de groeisnelheid van elke celstaal verschillend is.
Een bijkomend biologische variatie die opgemerkt werd tijdens het experiment is een verschil
in celgroei van individu tot individu. Tijdens het experiment kon niet elke groep geanalyseerd
worden. Door de te trage groei van een staal kon men het experiment niet blijven uitstellen.
Dit heeft als gevolg dat de TGFBR1 groep niet in het experiment geïncludeerd wordt.
De precipitatie met TCA-LS en het scheiden van proteïnen volgens eerste en tweede dimensie
verliep volgens protocol en hadden geen aanpassingen nodig. Echter bij elke pricipitatie van
eenzelfde staal verkegen we een verschillend concentratie aan proteïnen. Dit werd
veroorzaakt door een technische variatie in precipitatie. Door preciezer tewerk te gaan, kan
deze variatie geminimaliseerd worden. Echter meer ervaring in de 2D DIGE techniek zou
vereist zijn voor betere resultaten.
Een alternatieve methode om het doel van de masterproef te verwezenlijken is het gebruik van
Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture (SILAC). SILAC is een techniek
gebaseerd op massaspectrometrie die de verschillen in proteïne abundantie tussen stalen
bepaalt door gebruik te maken van niet-radioactieve isotope labeling. In eerste instantie is het
de bedoeling 1 patiënt en 1 controle afzonderlijk te labellen. Eén met Arginine 13 en één met
lysine 13 (SILAC labeling). Vervolgens zal men dit proteïnenmengsel na trypsinisatie
analyseren met MS. De proteïnen die dan duidelijk verschillend zijn in concentratie kunnen
eventueel nagekeken worden bij andere patiënten met behulp van western blot indien er
antilichamen voorhanden zijn. Het is onmogelijk alle patiënten en groepen
51
op deze wijze te analyseren, want dit is echter arbeidsintensief. Alvorens we dit
echter kunnen doen moet men eerst verschillende wasstappen uittesten om
de grote hoeveelheid serum albumine, die nog aanwezig is in de stalen, te
elimineren. Anders zal de MS voornamelijk albumine meten en zijn de andere proteïnen in
lagere concentratie aanwezig [80].
Het mag duidelijk zijn dat een dergelijke uitgebreide karakterisatie het creëren van inzicht tot
de pathogenese van aorta-aneurysma’s tot doel heeft. Verder gelijkaardig onderzoek zal nodig
zijn om tot gewenste wetenschappelijke inzichten te bekomen in de pathogenese van aorta-
aneurysma’s.
52
6. Referentielijst :
[1] Clouse WD, Hallett JWJ, Schaff HV (1998). Improved prognosis of thoracic aortic aneurysms: a population-
based study. JAMA, 280(22):1926-9.
[2] Isselbacher EM (2005). Thoracic and abdominal aortic aneurysms. Circulation, 111:816-828.
[3] Lederle FA, Johnson GR, Wilson SE, Chute EP, Littooy FN, Bandyk D, Krupski WC, Barone GW, Acher
CW, Ballard DV (2005). Prevalence and associations of abdominal aortic aneurysm detected through screening.
Ann Intern Med, 143:309.
[4] Guo D, Hasham S, Kuang SQ, Vaughan CJ, Boerwinkle E, Chen H, Abuelo D, Dietz HC, Basson CT, Shete
SS, Milewicz DM (2001). Familial thoracic aortic aneurysms and dissections. Circulation, 103:2461-2468.
[5] Dietz HC, Cutting GR, Pyeritz RE, Maslen CL, Sakai LY, Corson GM, Puffenberger EG, Hamosh A,
Nanthakumar EJ, Curristin SM, Stetten G, Meyers DA, Francomano CA (1991). Marfan syndrome caused by a
recurrent de novo missense mutation in the fibrillin gene. Nature 352:337-339.
[6] Loeys BL, Scharze U, Holm T, Callewaert BL, Thomas GH, Pannu H, De Backer JF, Oswald GL, Symoens
S, Manouvrier S, Roberts AE, Faravelli F, Greco A, Pyeritz RE, Milewicz DM, Coucke PJ, Cameron DE,
Braverman AC, Byers PH, De Paepe AM, Dietz HC (2006). Aneurysm syndromes caused by mutations in the
TGF-B receptor. The new England Journal of Medicine, 355(8):788-798.
[7] pepin M, Schwarze U, Superti-Furga A, Byers PH (2000). Clinical and genetic features of Ehlers-Danlos
syndrome type IV, the vascular type. N Engl J Med, 342:673-680.
[8] Coucke PJ, Willaert A, Wessels MW, Callewaert B, Zoppi N, De Backer J, Fox JE, Mancini GM, Kambouris
M, Gardella R, Facchetti F, Willems PJ, Forsyth R, Dietz HC, Barlati S, Colombi M, Loeys B, De Paepe A
(2006). Nat Genet, 38:452-457.
[9] Tartaglia M, Mehler EL, Goldberg R, Zampino G, Brunner HG, Kremer H, van der Burgt I, Crosby AH, Ion
A, Jeffery S, Kalidas K, Patton MA, Kucherlapati RS, Gelb BD (2001). Mutations in PTPN11, encoding the
protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nat Genet, (4):465-8.
[10] Lacro RV, Jones KL, Benirschke K (1988). Coarctation of the aorta in Turner syndrome: a pathologic study
of fetuses with nuchal cystic hygromas, hydrops fetalis, and female genitalia. Pediatrics, 81:445– 451.
[11] Rosenfield R (2001). Hypertension, aortic dilatation, and aortic dissection in Turner’s syndrome: a potential
lethal triad. Clin Endocrinol, 54:155-156.
[12] Jeremy RW, Huang H, Hwa J, McCarron H, Hughes CF, Richards JG (1994). Relation between age, arterial
distensibility, and aortic dilatation in the Marfan syndrome. Am J Cardiol, 74:369-373.
[13] Vaughan CJ, Casey M, He J, Veugelers M, Henderson K, Guo D, Campagna R, Roman MJ, Milewicz DM,
Devereux RB, Basson CT (2001). Identification of a chromosome 11q23.2-q24 locus for familial aortic
aneurysm disease, a genetically heterogeneous disorder. Circulation, 103:2469-2475.
[14] Fedak PW, De Sa MP, Verma S, Nili N, Kazemian P, Butany J, Strauss BH, Weisel RD, David TE (2003).
Vascular matrix remodelling in patients with biscupid aortic valve malformations: implications for aortic
dilatation. J Thorac Cardiovasc Surg, 126:797-806.
[15] Khau Van Kien P, Mathieu F, Zhu L, Lalande A, Betard C, Lathrop M, Brunotte F, Wolf JE, Jeunemaitre X
(2005). Mapping of familial thoracic aortic aneurysm/dissection with patent ductus arteriosus to 16p12.2-p13.13.
Epub, 12;112(2):200-206.
[16] Alberts B, Bray D, Hopkin K, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P (2004). Extracellular
Matrix and Connective Tissues. Cent Eur J Publ Health, 12(2): 175.
[17] Charbonneau NL, Ono RN, Corson GM, Keene DR, Sakai LY (2004). Fine tuning of growth factor signals
depends on fibrillin microfibril networks. Birth Defects Res C Embryo Today, 72:37-50.
[18] Sakai LY, Keene DR, Engvall E (1986). Fibrillin, a new 350-kD glycoprotein, is a component of
extracellular microfibrils. J Cell Biol, 103:2499-2509.
[19] Reinhardt DP, Sasaki T, Dzamba BJ, Keene DR, Chu ML, Gôhring W, Timpl R, Sakai LY (1996). A
fibrillin-1 and fibulin-2 interact and are colocalized in some tissues. J Biol Chem, 271(19):489-496.
[20] Corson GM, Chalberg SC, Dietz HC, Charbonneau NL, Sakai LY (1993). Fibrillin binds calcium and is
coded by cDNAs that reveal a multidomain structure and alternatively spliced exons at the 5 β end. Genomics,
17:476-84.
[21] Biery NJ, Eldadah ZA, Moore CS, Stetten G, Spencer F, Dietz HC (1999). Revised genomic organization of
FBN1 and significance for regulated gene expression. Genomics, 56:70–77.
[22] Reinhardt DP, Mechling DE, Boswell BA, Keene DR, Sakai LY, Bachinger HP (1997). Calcium determines
the shape of fibrillin. J Biol Chem, 272:7368-73.
[23] Reinhardt DP, Ono RN, Sakai LY (1997). Calcium stabilizes fibrillin-1 against proteolytic degradation. J
Biol Chem, 272:1231-36.
[24] Faivre L, Collod-Beroud G, Loeys BL, Child A, Binquet C, Gautier E, Callewaert B, Arbustini E, Mayer K,
Arslan-Kirchner M, Kiotsekoglou A, Comeglio P, Marziliano N, Dietz HC, Halliday D, Beroud C, Bonithon-
Kopp C, Claustres M, Muti C, Plauchu H, Robinson PN, Ade`s LC, Biggin A, Benetts B, Brett M, Holman KJ,
53
De Backer J, Coucke P, Francke U, De Paepe A, Jondeau G, Boileau C (2007). Effect of Mutation Type and
Location on Clinical Outcome in 1,013 Probands with Marfan Syndrome or Related Phenotypes and FBN1
Mutations: An International Study. The American Journal of Human Genetics, 81:454-466.
[25] Kaartinen V, Warburton D (2003). Fibrillin controls TGF-β activation. Nature Genetics, 33:331-332.
[26] Collod-Beroud G, Le Bourdelles S, Ades L, Ala-Kokko L, Booms P, Boxer M, Child A, Comeglio P, De
Paepe A, Hyland JC, Holman K, Kaitila I, Loeys B, Matyas G, Nuytinck L, Peltonen L, Rantamaki T, Robinson
P, Steinmann B, Junien C, Beroud C, Boileau C (2003). Update of the UMD-FBN1 mutation database and
creation of an FBN1 polymorphism database. Hum Mutat, 22(3):199-208.
[27] Isogai Z, Aspberg A, Keene DR, Ono RN, Reinhardt DP, Sakai LY (2002). Versican interacts with fibrillin-
1 and links extracellular microfibrils to other connective tissue networks. J Biol Chem, 277:4565-4572.
[28] Freeman LJ, Lomas A, Hodson N, Sherratt MJ, Mellody KT, Weiss AS, Shuttleworth A, Kielty CM (2005).
Fibulin-5 interacts with fibrillin-1 molecules and microfibrils. Biochem J, 388:1-5.
[29] Trask TM, Trask BC, Ritty TM, Abrams WR, Rosenbloom J, Mecham RP (2000). Interaction of
tropoelastin with the amino-terminal domains of fibrillin-1 and fibrillin-2 suggests a role for the fibrillins in
elastic fiber assembly. J Biol Chem, 275:24400-24406.
[30] Hanssen E, Hew FH, Moore E, Gibson MA (2004). MAGP-2 has multiple binding regions on fibrillins and
has covalent periodic association with fibrillin-containing microfibrils. J Biol Chem, 279, 29185-29194.
[31] Isogai Z, Ono RN, Ushiro S, Keene DR, Chen Y, Mazzieri R, Charbonneau NL, Reinhardt DP, Rifkin DB,
Sakai LY (2003). Latent transforming growth factor beta-binding protein 1 interacts with fibrillin and is a
microfibril-associated protein. J Biol Chem, 278:2750-2757.
[32] Massague J (1987). The TGF-β family of growth and differentiation factors. J Cell, 49, 437-438.
[33] Saharinen J, Taipale J, Keski-Oja J (1996). Association of the small latent transforming growth factor-beta
with an eight cysteine repeat of its binding protein LTBP-1. EMBO J, 15(2):245-253.
[34] Gleizes PE, Beavis RC, Mazzieri R, Shen B, Rifkin DB (1996). Identification and characterization of an
eight-cysteine repeat of the latent transforming growth factor-beta binding protein-1 that mediates bonding to the
latent transforming growth factor-beta1. J Biol Chem, 271:29891-29896.
[35] Miyazono K, Olofsson A, Colosetti P, Heldin CH (1991). A role of the latent TGF-beta 1-binding protein in
the assembly and secretion of TGF-beta 1. EMBO J, 10:1091-1101.
[36] Ramirez F, Pereira L (1999). The fibrillins. Int J Biochem Cell Biol, 31:255-259.
[37] Lawrence DA, Pircher R, Kryceve-Martinerie C, Jullien P (1984). Normal embryo fibroblasts release
transforming growth factors in a latent form. J Cell Physiol, 121:184-188.
[38] Dubois CM, Laprise MH, Blanchette F, Gentry LE, Leduc R (1995). Processing of transforming growth
factor beta 1 precursor by human furin convertase. J Bio. Chem, 70:10618-10624.
[39] Annes JP, Munger JS, Rifkin DB (2003). Making sense of latent TGFb activation. Journal of Cell Science,
116:217-224.
[40] Lyons RM, Keski-Oja J, Moses HL (1988). Proteolytic activation of latent transforming growth factor-beta
from fibroblast-conditioned medium. J Cell Biol, 106:1659-1665.
[41] Ribeiro SM, Poczatek M, Schultz-Cherry S, Villain M, Murphy-Ullrich JE (1999). The activation sequence
of thrombospondin-1 interacts with the latency- associated peptide to regulate activation of latent transforming
growth factor-beta. J Biol Chem 274:13586-13593.
[42] Munger JS, Huang X, Kawakatsu H, Griffiths MJ, Dalton SL,Wu J, Pittet JF, Kaminski N, Garat C,
Matthay MA (1999). The integrin alpha v beta 6 binds and activates latent TGF beta 1: a mechanism for
regulating pulmonary inflammation and fibrosis. Cell 96:319-328.
[43] Schultz-Cherry S, Murphy-Ullrich JE (1993). Thrombospondin causes activation of latent transforming
growth factor- beta secreted by endothelial cells by a novel mechanism. J Cell Biol, 122:923-932.
[44] Sato Y, Rifkin DB (1989). Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells:
activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule during co-culture. J Cell Biol, 109:309-
315.
[45] Yu Q, Stamenkovic L (2000). Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates
TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev, 14:163-176.
[46] Lawrence DA, Pircher R, Jullien P (1985). Conversion of a high molecular weight latent beta-TGF from
chicken embryo fibroblasts into a low molecular weight active beta-TGF under acidic conditions. Biochem
Biophys Res Commun, 133:1026-1034.
[47] Jones AJ, Spinale FG, Ikonomidis JS (2009). Transforming growth factor-β signaling in thoracic aortic
aneurysm development: a paradox in pathogenesis. Journal of vascular research, 46:119-137.
[48] Drera B, Ritelli M, zoppi N, Wischmeijer A, Gnoli M, Fattori R, Giacomo Calzavara-Pinton P, Barlati S,
Colombi M (2009). Loeys-Dietz syndrome type I and type II: clinical findings and novel mutations in two Italian
patients. Orphanet Journal of Rare Diseases, 4(24):1-5.
54
[49] Aalbrechts JJJ, van den Berg MP, Bergman JEH, du Marchie Sarvaas GJ, Post JG, van Unen H, Pals G,
Boonstra PW, Tintelen JP (2008). The many faces of aggressive aortic pathology: Loeys-Dietz syndrome.
Netherlands Heart Journal, 16(9):299-304.
[50] Strider D, Moore T, Guarini J, Fallin B, Ivey J, Kron Irving (1996). Marfan’s syndrome: a family affair. J
Vasc Nurs, 14:91-8.
[51] De Paepe A, Devereux RB, Dietz HC, Hennekam RCM, Pyeritz RE (1996). Revised diagnostic criteria for
the Marfan syndrome. Am J Med Genet, 62:417-426.
[52] Judge DP, Dietz HC (2005). Marfan’s syndrome. Lancet, 366 :1965-76.
[53] Pyeritz R, Heinz Furthmayr (1994). Marfan syndrome and other disorders of fibrillin. N Engl J Med,
12,330(19):1384-1385.
[54] Murdoch JL, Walker BA, Halpern BL, Kuzma JW, McKusick VA (1972). Life expectancy and causes of
death in the Marfan syndrome. N Engl J Med, 286:804-08.
[55] Silverman DI, Burton KJ, Gray J, Bosner MS, Kouchoukos NT, Roman MJ, Boxer M, Devereux RB,
Tsipouras P (1995). Life expectancy in the Marfan syndrome. Am J Cardiol, 75:157-60.
[56] Fattori R, Nienaber CA, Descovich B, Ambrosetto P, Bacchi Reggiani L, Pepe G, Kaufmann U, Negrini E,
von Kodolitsch Y, Franco Gensini G (1999). Importance of dural ectasia in phenotypic assessment of Marfan’s
syndrome. Lancet, 354: 910-13.
[57] Callewaert B, Malfait F, Loeys B, De Paepe A (2008). Ehlers-Danlos syndromes and Marfan syndrome.
Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 22(1):165-189.
[58] Neptune ER, Frischmeyer PA, Arking DA, Myers L, Bunton TE, Gayraud B, Ramirez F, Sakai LY, Dietz
HC (2003). Dysregulation of TGF- β activation contributes to pathogenesis in Marfan syndrome. Nature
Genetics, 33:407-411.
[59] Chaudhry SS, Cain SA, Morgan A, Dallas SL, Shuttleworth A, Kielty CM (2007). The Journal of Cell
Biology, 176(3):355-367.
[60] Dietz HC, Loeys B, Carta L, Ramirez F (2005). Recent progress towards a molecular understanding of
Marfan syndrome. Am J Med Genet C Semin Med Genet, 139: 4-9.
[61] Habashi JP, Judge DP, Holm TM, Cohn RD, Loeys BL, Cooper TK, Myers L, Klein EC, Liu G, Calvi C,
Podowski M, Neptune ER, Halushka MK, Bedja D, Gabrielson K, Rifkin DB, Carta L, Ramirez F, Huso DL,
Dietz HC (2006). Losartan, an AT1 antagonist, prevents aortic aneurysm in a mouse model of Marfan syndrome.
Science, 312:117-121.
[62] Putnam EA, Cho M, Zinn AB, Towbin JA, Byers PH, Milewicz DM (1996). Delineation of the Marfan
phenotype associated with mutations in exons 23–32 of the FBN1 gene. Am J Med Genet, 62:233–242.
[63] Loeys BL, Chen J, Neptune ER, Judge DP, Podowski M, Holm T, Meyers J, Leitch CC, Katsanis N, Sharifi
N, Xu FL, Myers LA, Spevak PJ, Cameron DE, De Backer J, Hellemans J, Chen Y, Davis EC, Webb CL, Kress
W, Coucke P, Rifkin DB, De Paepe AM, Dietz HC (2005). A syndrome of altered cardiovascular, craniofacial,
neurocognitive and skeletal development caused by mutations in TGFBR1 or TGFBR2. Nat Genet, 37:275-281.
[64] Loeys BL, Dietz HC (2008). Loeys-Dietz syndrome. Gene reviews (internet).
[65] Togashi Y, Sakoda H, Nishimura A, Matsumoto N, Hiraoka H, Matsuzawa Y (2007). A Japanese family of
typical Loeys-Dietz syndrome with a TGFBR2 mutation. Internal Medicine, 46(24):1995-2000.
[66] Denton CP, Abraham DJ (2001). Transforming growth factor-beta and connective tussue growth factor: key
cytokines in scleroderma pathogenesis. Curr Opin Rheumatol, 13(6):505-511.
[67] Di Guglielmo GM, Le Roy C, Goodfellow AF, Wrana JL (2003). Distinct endocytic pathways regulate
TGF-beta receptor signalling and turnover. Nat Cell Biol, 5:410–421.
[68] Amersham Biosciences (2002). Ettan DIGE User Manual 18-1164-40. Edition AA 1-386.
[69] Krogh M, Liu Y, Waldemarson S, Valastro B, James P (2007). Analysis of DIGE data using a linear mixed
model allowing for protein-specific dye effects. Proteomics, 7:4235–4244.
[70] Knowles MR, Cervino S, Skynner HA, Hunt SP, De Felipe C, Salim K, Meneses-Lorente G, McAllister G,
Guest PC (2003). Multiplex proteomic analysis by two-dimensional differential in-gel electrophoresis.
Proteomics, 3:1162–1171.
[71] Tannu NS, Hemby SE (2006). Two-simensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative
proteomics profiling. Nat Protoc, 1(4):1732-1742.
[72] Marouga R, David S, Hawkins E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel
analysis technology (2005). Anal Bioanal Chem 382:669-678.
[73] Kondo T, Hirohashi S (2006). Application of highly sensitive fluorescent dyes (CyDye DIGE Fluor
saturation dyes) to laser microdissection and two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) for
cancer proteomics. Nat Protoc, 1(6):2940-56.
[74] Molloy MP, Brzezinski EE, Hang J, McDowell MT, VanBogelen RA (2003). Overcoming technical
veriation and biologiscal variation in quantitative proteomics. Proteomics, 3(10)1895-1903.
[75] Chevallet M, Diemer H, Van Dorssealer A, Villiers C, Rabilloud T (2007). Toward a better analysis of
secreted proteins: the example of the myeloid cells secretome. Proteomics, 7(11):1757-1770.
55
[76] Nayak NC, Shin K (2008). Human serum albumin mediated self-assembly of gold nanoparticles into hollow
spheres. Nanotechnology 19:1-4.
[77] www.uniprot.org
[78] http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/20384.pdf
[79] Ge Healthcare. Ettan DIGE system user manual 18-1173-17. Edition AB 1-112.
[80] Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M (2002). Stable isotope
labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol
Cell Proteomics, 1:376-386.
[81] Kielty Cm, Badock C, Lee D, Rock MJ, Ashworth JL, Shuttleworth A (2002). Fibrillin: from microfibril
assembly to biomechanical function. Phil trans R Soc Lond B, 357:207-217.
I
Bijlagen
Bijlage 1: Tabellen
Tabel 1: patiëntcode met overeenkomende mutatie en mutatieplaats.
Patiënt code Type mutatie Locatie mutatie
MFS1 FBN1 nonsense p.Glu812X
MFS2 FBN1 nonsense p.Arg215X
MFS3 FBN1 nonsense p.Met2327Met fs78X
MFS4 FBN1 nonsense p.Cys1736X
MFS5 FBN1 nonsense p.Cys102X
MFS6 FBN1 nonsense p.Asp1766 fsX
MFS7 FBN1 missense p.Cys1055Tyr
MFS8 FBN1 missense p.Cys1339Tyr
MFS9 FBN1 missense p.cys685Trp
MFS10 FBN1 missense p.Cys557Tyr
MFS11 FBN1 missense p.Cys1140Phe
MFS12 FBN1 missense p.Cys684Arg
TGFBR2-1 TGFBR2 mutatie p.Arg528Cys
TGFBR2-2 TGFBR2 mutatie p.Tyr336Asn
TGFBR2-3 TGFBR2 mutatie p.Asp446Asn
TGFBR2-4 TGFBR2 mutatie p.Pro427Leu
TGFBR2-4 TGFBR2 mutatie p.Ala355Pro
TGFBR2-6 TGFBR2 mutatie p.Ala329Thr
Tabel 2: Studie design van het 2-D DIGE experiment.
Oorsprong proteïnen IPG strip Sample Cy3 Sample Cy5 Sample Cy2
medium 75740 MFS 7 controle 7 interne standaard
medium 75741 controle 10 MFS 8 interne standaard
medium 75742 MFS 9 controle 9 interne standaard
medium 75743 controle 8 MFS 12 interne standaard
medium 75744 MFS 11 controle 6 interne standaard
medium 75745 controle 2 MFS 10 interne standaard
medium 75746 controle 13 TGFBR2-1 interne standaard
medium 75747 TGFBR2-2 controle 12 interne standaard
medium 75748 TGFBR2-3 controle 13 interne standaard
medium 75749 TGFBR2-4 controle 2 interne standaard
medium 75754 controle 7 TGFBR2-5 interne standaard
medium 75755 controle 11 TGFBR2-6 interne standaard
Cellen 78056 controle 7 MFS 7 interne standaard
Cellen 78057 MFS 8 controle 10 interne standaard
Cellen 86294 controle 9 MFS 9 interne standaard
Cellen 86295 MFS 10 controle 2 interne standaard
Cellen 86296 controle 6 MFS 11 interne standaard
Cellen 86297 MFS 12 controle 8 interne standaard
Cellen 86298 TGFBR2-1 controle 13 interne standaard
Cellen 86299 controle 12 TGFBR2-2 interne standaard
Cellen 86300 controle 13 TGFBR2-3 interne standaard
Cellen 86301 controle 2 TGFBR2-4 interne standaard
Cellen 78041 TGFBR2-5 controle 7 interne standaard
II
Cellen 78042 TGFBR2-6 controle 11 interne standaard
Tabel 3: IPG strips met de bijhorende PMT waarden bij de eerste scanning.
IPG strip PMT Cy2 PMT Cy3 PMT Cy5
75740 550 600 550
75741 550 580 550
75742 550 600 580
75743 500 580 550
75744 480 600 500
75745 500 550 550
75746 700 570 550
75747 525 550 580
75748 500 570 505
75749 510 530 510
75754 555 600 570
75755 540 650 630
78056 590 690 660
78057 660 770 830
86294 650 780 640
86295 620 685 695
86296 730 870 740
86297 700 780 790
86298 690 850 810
86299 680 770 750
86300 660 900 750
86301 680 900 680
78041 680 800 750
78042 720 770 770
Tabel 4: Volume ratio’s van de spots van de controle groep t.o.v. de patiëntengroep met
thresshold op 2 standaard deviaties. Aantal spots die gedetecteerd zijn worden hieronder
weergegeven per gel. Na het filteren worden deze geïncludeerde spots verder verwerkt.
IPG strip Aantal
gedetecteerde
spots
Aantal spots
geïncludeerd
Stijging van
spotvolume in
%
Gelijkaardig
spotvolume in
%
Daling van
spotvolume in
%
75740 2009 705 4.0 79.9 16.2
75741 2415 659 4.9 90.3 4.9
75742 2280 798 4.1 85.7 10.2
75743 2235 612 0.7 92.6 6.7
75744 2199 593 6.1 87.5 6.4
75745 2104 512 0.6 75.0 24.4
75746 1907 489 2.0 91.8 6.1
75747 2290 807 0.9 66.8 32.3
75748 2078 298 0.0 100.0 0.0
75749 2356 221 9.5 90.5 0.0
75754 2356 836 2.3 97.6 0.1
75755 2137 720 7.1 89.9 3.1
III
78056 2063 721 0.1 95.7 4.2
78057 2113 855 4.8 88.1 7.1
86294 2252 799 6.0 88.6 5.4
86295 2079 507 11.6 86.0 2.4
86296 2077 785 5.2 94.1 0.6
86297 2090 935 0.2 89.6 10.2
86298 2179 906 4.3 94.0 1.7
86299 2020 540 9.1 90.4 0.6
86300 1982 958 0.7 98.0 1.3
86301 2014 661 5.9 74.7 19.4
78041 2173 1296 3.2 95.1 1.7
78042 2266 803 5.1 77.1 17.8
IV
Bijlage 2: Productsamenstellingen
Bereid cultuurmedium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1x (Gibco®, Invitrogen™)
50 ml foetaal kalfsserum (FCS) (Gibco®, Invitrogen™)
5 ml penicilline/streptomycine (PS) (Gibco®, Invitrogen™)
5 ml kanamycine (Gibco®, Invitrogen™)
0,5 ml fungizone (Gibco®, Invitrogen™)
5 ml niet-essentiële aminozuren (Gibco®, Invitrogen™)
Fenolrood- en serum-vrij medium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium 1x (Gibco®, Invitrogen™)
5 ml penicilline/streptomycine (PS) (Gibco®, Invitrogen™)
5 ml kanamycine (Gibco®, Invitrogen™)
0,5 ml fungizone (Gibco®, Invitrogen™)
5 ml niet-essentiële aminozuren (Gibco®, Invitrogen™)
5 ml L-Glut (Gibco®, Invitrogen™)
250 mM sucrose/10mM Tris:
42,8 g sucrose (Sigma®)
0,6 g Tris (MP Biomedicals Inc.)
Leng aan tot 500 ml gedistilleerd water.
Steriliseer.
TE buffer + 0,1% Tween20
Tween20 (Polyoxyethyleensorbitaan monolauraat): 0,1 µl, eind concentratie 0,1%
Leng aan tot 100µl met TE buffer
0,1% SDS
Natrium Dodecyl Sulfaat: 1 g eind concentratie: 0,1%
Leng aan tot 1000 ml met gedistilleerd water.
10x SDS elektroforese running buffer
Tris (MW 121,14): 60,5 g eind concentratie: 25 mM
V
Glycine (MW 75,07): 288 g eind concentratie: 192 mM
SDS (MW 288,38): 20 g eind concentratie: 0,1%
Leng aan tot 20 liter met gedistilleerd water.
1M Tris-Cl pH8 buffer
Tris (MW 121,14): 121.1 g eind concentratie: 1,0 M
6 M HCl tot pH 8,8
Leng aan tot 1000 ml met gedistilleerd water.
Equilibratie buffer:
Tris-Cl (1.5M, pH 8,8): 7 ml eind concentratie: 50 mM
Ureum (MW 60.06): 72 g eind concentratie: 6M
Glycerol (87%, MW 92.09): 70 ml eind concentratie: 30%
SDS (MW 288.33): 4 g eind concentratie: 2%
Bromofenol blauw: 400 µl eind concentratie: 0.02%
Leng aan met gedestilleerd water tot 200 ml.
Bromofenol blauw oplossing:
Bromofenol blauw: 100 mg eind concentratie: 1%
Tris: 60 mg eind concentratie: 0.06%
Aanlengen tot 10ml met gedistilleerd water
Equilibratie oplossing 1:
DTT (MW 154.2): 1 g eind concentratie: 1%
Equilibratie buffer: 100 ml
Equilibratie oplossing 2:
Iodoacetamide (MW 185.0): 2.5 g eind concentratie: 2.5%
Equilibratie buffer: 100 ml
Rehydratatie oplossing:
Tris (1M): 182 mg eind concentratie: 30 mM
Thiourea (MW 76,12): 7,6 g eind concentratie: 2 M
Urea (MW 60,06): 21 g eind concentratie: 7 M
VI
CHAPS (GE Healthcare) (MW 614,89): 2 g eind concentratie: 4%
Aanlengen tot 50 ml met gedistilleerd water.
1M Magnesium acetaat:
Magnesium acetaat (MW 214,5): 0,018 g eind concentratie: 10 mM
Aanlengen tot 100 ml met gedistilleerd water.
Wasbuffer voor zilverkleuring:
100 mM TrisCl (100mM, pH 8,0): 5,0 ml eind concentratie 10 mM
Magnesium acetaat (1M): 0,25 ml eind concentratie: 5 mM
Aanlengen tot 50 ml met gedistilleerd water.
10 mM Lysine:
L-lysine (Sigma) (MW 182,6): 18 mg eind concentratie: 10 mM
Aanlengen tot 10 ml met gedistilleerd water
25x protease inhibitor oplossing:
Maak 25x protease inhibitor oplossing door 1 protease inhibitor complete tablet op te lossen
in 2 ml dH2O.
2x running buffer:
Tris (MW 121,14): 60,5 g eind concentratie: 25 mM
Glycine (MW 75,07): 288 g eind concentratie: 192 mM
SDS (MW 288,38): 20 g eind concentratie: 0,1%
Aanlengen tot 20 L met gedistilleerd water.
Agarose:
10x SDS elektroforese running buffer: 10 ml
Agarose: 0,5 g eind concentratie: 0,5%
Bromophenol blauw oplossing: 200 µl eindconcentratie: 0.02%
Gedistilleerd water tot 100 ml.
Voor gebruik moet agarose opgewarmd worden tot 95°C.
VII
2x lyse buffer:
CHAPS (MW 614.89): 1 g eind concentratie: 4%
Urea (MW 60.06): 10.5 g eind concentratie: 7 M
Thioureum: 3.8 g eind concentratie: 2M
Bromofenol blauw oplossing: 100 µleind concentratie: 0.04%
Leng aan met gedistilleerd water tot 25 ml.
Net voor gebruik toe te voegen:
DTT: 100 mg eindconcentratie: 2%
IPG buffer: 100 µl eindconcentratie: 2%
2x lyse buffer: 5 ml
Productsamenstellingen voor zilverkleuring:
Materiaal:
Ethanol
Glacial acetaat
Glycerol
Chemicaliën die tot de PlusOne Silver Staining Kit behoren
Reagentia:
Maak de volgende oplossingen met de hierboven vermelde producten.
250 ml oplossing is nodig per gel en per stap.
Nota: glutardialdehyde en formaldehyde moeten direct toegevoegd worden voor gebruik.
Reagentia Component en kwantiteit
Fixing oplossing 30% ethanol Ethanol 75 ml
Glacial acetaat 25 ml
Water tot 250 ml
Sensitizing oplossing Ethanol 75 ml
Natrium thiosulfaat (5%) 10 ml
Natrium acetaat (17 g) 1 pakje
Water tot 250 ml
Voor gebruik: voeg 1,25 ml
glutardialdehyde (25%)
Zilveroplossing Zilvernitraat oplossing (2,5%) 25 ml
Water tot 250 ml
VIII
Developping oplossing Natrium carbonaat (6,25 g) 1 pakje
Water tot 250 ml
Meng totdat het natriumcarbonaat
opgelost is.
Voor gebruik: voeg 0,2 ml formaldehyde
(37%) toe.
Stop oplossing EDTA-Na2, 2H2O (3,65 g) 1 pakje
Water tot 250 ml
Was oplossing water
Bewaringsoplossing Glycerol (87%) 25 ml
Water tot 250 ml
IX
Bijlage 3: Protocols
A. Protocol TCA-DOC precipitatie
Materiaal: 2% Natrium deoxycholaat (Sigma®)
100% trichlooracetaat (Sigma®)
Tetrahydrofuraan (Sigma®)
Rehydratatie oplossing (samenstelling zie bijlage 2)
Protocol TCA-DOC precipitatie
1. Koel 10 ml cultuurmedium op ijs in een 15 ml polypropyleen falcon.
2. Voeg 0,1% (10 µl) DOC toe en meng.
3. Voeg 7,5% (750 µl) TCA toe en meng.
4. Precipiteer op ijs gedurende 2 uur.
5. Centrifugeer aan 5000 x g gedurende 40 minuten op 4°C.
6.Verwijder voorzichtig het supernatans.
7. Voeg 2 ml voorgekoeld THF toe en vortex totdat de pellet volledig opgelost is.
8. Centrifugeer (zie stap 5).
9. Verwijder voorzichtig het supernatans.
10. Was de pellet met 2 ml THF.
11. Centrifugeer (zie stap 5).
12. Verwijder voorzichtig alle supernatans.
13. Los de pellet op in 95 µl rehydratatie oplossing.
14. Voeg 4 µl protease inhibitor oplossing (25x) toe en 1 µl phosphatase inhibitor.
B. Protocol aceton precipitatie
Materiaal:
Koude aceton (-20°C) (Sigma®)
Koude 95% ethanol (4°C) (Chem-Lab nv)
Rehydratatie oplossing (samenstelling zie bijlage 2)
Protocol: aceton precipitatie
1. Voeg aan 1 volume (5ml) cultuurmedium en 4 volumes (20 ml) koude aceton toe.
2. Centrifugeer gedurende 60 minuten bij 4°C aan 5000 rpm.
3. Verwijder supernatans.
4. Was 2 maal in ijsgekoelde 95% ethanol. Vortex.
5. Centrifugeer gedurende 40 minuten aan 5000 x g.
6. Laat de ethanol verdampen.
X
7. Laat de proteïnen in de rehydratatie buffer oplossen.
8. Voeg 2 µl protease inhibitor (25x) en 0,5 µl fosfatase inhibitor toe.
C. Concentratiemeting 2D Quant van TCA-LS, TCA-DOC en aceton precipitatie.
Materiaal:
Kleurreagens A (GE Healthcare)
Kleurreagens B (GE Healthcare)
BSA standaard oplossing (GE Healthcare)
Rehydratatie oplossing (samenstelling zie bijlage 2)
Precipitant (GE Healthcare)
Coprecipitant (GE Healthcare)
Koperoplossing (GE Healthcare)
Protocol: concentratiemeting 2D Quant
1. Meng 100 delen (310 µl) kleurreagens A met 1 deel (31 µl) kleurreagens B.
2. Maak standaardcurve in functie van BSA standaard oplossing.
Nummer epje 1 2 3 4 5 6
BSA 0 µl 5 µl 10 µl 15 µl 20 µl 25 µl
proteïne 0 µl 10 µl 20 µl 30 µl 40 µl 50 µl
Voeg x µl toe om tot 100 µl per epje te bekomen.
3. Maak epjes met staal: 5 µl/epje.
2 x 3 stalen onverdund.
2 x 3 stalen 50% verdund in rehydratatie oplossing.
2 x 3 stalen 10% verdund in rehydratatie oplossing.
4. Voeg 500 µl precipitant toe, vortex kort en incubeer 3 minuten op kamertemperatuur.
5. Voeg 500 µl coprecipitant toe en vortex kort.
6. Centrifugeer aan 13000 rpm gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
7. Decanteer de supernatans.
8. Centrifugeer kort aan 10 000 x g en verwijder supernatans volledig.
9. Voeg 100 µl koperoplossing en 400 µl gedistilleerd water toe. Vortex kort.
10. Voeg 1 ml kleurreagens mix toe.
11. Incubeer gedurende 15 tot 20 minuten op kamertemperatuur.
12. Lees absorbantie af bij 480 nm (binnen 40 minuten). Gedistilleerd water is referentie.
13. Maak standaardcurve om proteïneconcentratie te berekenen.
XI
D. Protocol voor immobilisatie een proteïne in de AminoLink kolom.
Materiaal:
Coupling Buffer (Thermo Scientific®)
Natrium cyanoboorhydride oplossing (Thermo Scientific®)
Quenching buffer (Thermo Scientific®)
Was oplossing (Thermo Scientific®)
Ontgast buffer (Thermo Scientific®)
Protocol: proteïnenstaal preparatie
1. Los 1-20 mg proteïne of 1-2 mg peptide in 2-3 ml Coupling Buffer op. Voor proteïnen die
al in oplossing zijn moet men de staal 4 voudig verdunnen in Coupling Buffer. Indien de
oplossing primaire amines bevat (Tris of glycine), moeten deze componenten verwijderd
worden gezien deze ook reageren met de proteïne-koppelingsreactie.
Protocol: proteïne immobilisatie reacties
1. Breng de AminoLink kolom op kamertemperatuur. Verwijder de bovenste en onderste dop
en collecteer de opslagoplossing in de opslagbuis. Laat de vaste fase (hars) niet droog
worden.
2. Voeg 6 ml Coupling Buffer toe.
3. Zet de onderste dop terug op de kolom en voeg 2-4 ml eiwitoplossing (verdund in
Coupling Buffer) aan de kolom. Bewaar 0,1 ml van de staal om koppelingsefficiëntie te
bepalen.
4. Voeg 10 µl natrium cyanoboorhydride oplossing toe per milliliter totaal volume (vaste fase
+ oplossing). Dit komt neer op 50mM NaCNBH3.
5. Zet de bovenste dop terug op de kolom en meng gedurende 6 uur op kamertemperatuur of
overnacht op 4°C. Het mengen gebeurd door rocking. Voor proteïnen gevoelig voor
schudden: meng gedurende 2 uur en laat vervolgens de kolom stationair gedurende 4 uur.
6. Verwijder de bovenste dop.
7. Verwijder de onderste dop en laat de inhoud lopen in een nieuwe opslagbuis.
8. Bewaar de uitloop en bepaald de koppelingsefficiëntie tijdens de kolom blokkingstappen.
Determineer de koppelingseffiëntie door proteïnenconcentraties van de niet gebonden fractie
te vergelijken met de startstaal (stap 3).
9. Was de vaste fase met 4 ml Coupling Buffer.
Protocol: blokkeer overige actieve sites
1. Was de vaste fase met 4 ml Quenching Buffer en zet de bovenste dop terug op de kolom.
2. Voeg 2 ml Quenching Buffer en 40 µl natrium cyanoboorhydride oplossing in de kolom
toe. Vervang de bovenste dop en meng zachtjes gedurende 30 minuten door rocking.
3. Verwijder de bovenste dop.
4. Verwijder de onderste dop, plaats de kolom in een nieuwe buis en laat drogen.
XII
Protocol: was kolom
1. Was de kolom met minstens 10 ml Was oplossing.
2. Was de vaste fase met 6 ml ontgast buffer. De buffer bevat 0,05% natriumazide of ander
bewaarmiddel. Zet de onderste dop terug op de kolom terwijl er nog 1 ml buffer boven de
vaste fase aanwezig is. Bewaar de kolom rechtstaand op 4°C.
E. Protocol voor affiniteitzuivering van proteïnen
Materiaal:
Binding/was buffer (Thermo Scientific®) (PBS)
Elutie buffer (Thermo Scientific®)
Neutralisatie buffer (Thermo Scientific®)
Protocol: affiniteit zuivering
1. Breng de affiniteitskolom op kamertemperatuur.
2. Verwijder de bovenste en onderste dop en laat de bewaaroplossing uit de kolom lopen.
3. Voeg 6 ml Binding/was buffer en laat het uit de kolom lopen.
4. Voeg staal aan kolom toe en laat het in de vaste fase lopen. Zet de doppen terug op de
kolom zodat de proteïnen langer in contact zijn met de vaste fase.
5. Verwijder de doppen en plaats de kolom in de opslagbuis. Was de kolom met 12 ml
Binding/was buffer.
6. Verdun de proteïnen met 8 ml elutie buffer. Collecteer in fracties van 1 ml. De pH kan
aangepast worden door gebruik te maken van 50 µl neutralisatie buffer per ml gecollecteerde
fractie. 7. Monitor de verdunning door absorbantie op 280 nm.
F. protocol voor celkweek
Protocol: cellen uit vloeibare stikstof opgroeien
1. Cellen uit vloeibare stikstof halen en ampule laten ontdooien tot er nog een klein
ijsklompje overblijft
2. Pipeteer 7,5 ml bereid medium met de cellen in een 15 ml falconbuis
3. Centrifugeer 10 minuten aan 1000 rpm
4. Supernatans afnemen
5. Pellet resuspenderen met 5 ml bereid medium en overbrengen naar T25 cultuurfles
6. Incubeer bij 37°C, 5% CO2
Protocol: celkweek
1. Ververs elke 2 à 3 dagen het medium door het oud medium af te nemen en vers medium
toe te voegen (5 ml voor T25, 10 ml voor T75).
Indien cellen confluent zijn, splits de cellen.
1. Neem het cultuurmedium af.
2. Breng 1.5 ml (T25) of 2,5 ml (T75) verseen in fles en spoel de cellaag.
XIII
3. Verwijder verseen en breng 1.5 ml (T25) of 2,5 ml (T75) trypsine/EDTA in fles en laat 10 minuten incuberen bij 37°C.
4. Klop de cellen los of schraap ze los met een police men.
5. Breng 1.2 ml of 2 ml over naar T75 of verwijder en voeg respectievelijk 5 of 10 ml vers
medium toe.
G. Protocol om medium en cellen te oogsten
Protocol: cellen wassen
1. 48 uur na confluentie medium afnemen en cellaag 3 x voorzichtig wassen met steriel
PBS.
2. Cellaag 3 x wassen met 250 mM sucrose/ 10 mM Tris
3. Cellen 3 x wassen met medium zonder serum en zonder fenolrood.
4. Cellen 48 uur incuberen in 10 ml van dit medium bij 37°C en 5% CO2.
Protocol: cellen oogsten
1. Voeg 2,5 ml trypsine/EDTA toe bij de cellen.
2. Incubeer 10 minuten in de incubator bij 37°C in 5% CO2.
3. Cellen loskloppen en afschrapen
4. Breng de celsuspensie in een 15 ml falcon op ijs.
5. Centrifugeer de cellen bij 4°C, 10 minuten op 1000 rpm.
6. Medium afzuigen, celpellet resuspenderen met 1 ml serum- en fenolrood-vrij medium en
vries in bij -20°C.
H. Protocol voor precipitatie van proteïnen uit cellen
Protocol: precipitatie van proteïnen uit cellen
1. Maak 25x protease inhibitor oplossing door 1 protease inhibitor complete tablet op te
lossen in 2 ml dH2O
Mix 500 µl M-PER met 40 µl 25x protease inhibitor oplossing en 10 µl phosphatase
inhibitor.
2. Cellen laten ontdooien en herpelleteren door 10 minuten te centrifugeren aan 2500 x g bij
4°C.
3. Supernatans verwijderen.
4. Cellen wassen met 1 ml PBS, op- en neerpipetteren en overbrengen naar 1.6 ml epje.
5. Cellen centrifugeren aan 2500 x g gedurende 10 minuten bij 4°C en supernatans
afzuigen.
6. Cellen wassen met 1 ml sucrose/Tris en centrifugeren aan 2500 x g gedurende 10
Protocol: medium oogsten
1. Medium overpipetteren in 15 ml falcon op ijs.
2. Medium centrifugeren bij 4°C, 5 minuten aan 1000 x g.
3. Breng supernatans over en vries in bij -20°C.
XIV
minuten bij 4°C en supernatans afzuigen.
7. Voeg 500 µl M-PER mix toe en pipetteer op en neer om pellet te resuspenderen.
8. Oplossing gedurende 10 minuten schudden.
9. Verwijder celdebris door centrifugatie aan 14000 x g gedurende 15 minuten.
10. Transfereer supernatans in nieuw 1.6 ml epje en meet de concentratie (nanodrop).
I. Protocol voor precipitatie van proteïnen uit medium
Protocol: precipitatie van proteïnen uit medium
1. Koel 10 ml cultuurmedium op ijs in een 15 ml polypropyleen falcon.
2. Voeg 500 µl NLS toe en meng.
3. Voeg 750 µl TCA toe en meng.
4. Precipiteer op ijs gedurende 2 uur.
5. Centrifugeer aan 10 000 x g gedurende 10 minuten bij 4°C.
6. Verwijder het supernatans.
7. Voeg 2 ml voorgekoeld THF toe en vortex totdat de pellet volledig opgelost is.
8. Centrifugeer (zie stap 5).
9. Verwijder het supernatans.
10. Herhaal stap 7-9
11. Laat de pellet zeer kort drogen aan de lucht.
12. Los de pellet op in 100 µl TE buffer (met 4µl protease inhibitor en 1 µl fosfatase
inhibitor) en pipeteer op en neer of indien nodig vortex.
13. Breng staal over naar een epje en vries in op -80°C.
J. Protocol voor 2D Clean up kit (GE healthcare)
Protocol: 2D Clean up kit
1. Voeg 300 µl precipitant toe aan maximum 100 µg proteïnen. Vortex en incubeer 15
minuten op ijs.
2. Voeg 300 µl coprecipitant toe en votex.
3. Centrifugeer de epjes 10 minuten aan minimum 12000 x g. Verwijder de epjes uit de
centrifuge zodra de centrifugatie afgelopen is en giet het supernatans af (doe dit snel om
heroplossing van de proteïnen te voorkomen).
4. Centrifugeer de epjes gedurende 1 minuut aan minimum 12000 x g. Verwijder zo snel
mogelijk de overgebleven vloeistof.
5. Voeg 40 µl coprecipitant toe zonder de pellet te verstoren. Laat 5 minuten incuberen.
6. Centrifugeer de epjes gedurende 5 minuten aan 12000 x g en verwijder vervolgens het
supernatans.
7. Voeg 25 µl gedistilleerd water toe en vortex (5 tot 10 seconden).
8. Voeg 1 ml wasbuffer toe (voorgekoeld -20°C) en 5 µl wasadditief. Vortex tot pellet
volledig verspreid is (lost niet op).
9. Incubeer 30 minuten bij -20°C. Vortex elke 10 minuten 20 à 30 seconden.
10. Centrifugeer 10 minuten aan 12000 x g.
11. Verwijder supernatans. Laat de pellet maximaal 5 minuten drogen aan de lucht.
XV
12. Resuspendeer de pellet in 45 µl (extracellulaire proteïnen) of 22.5 µl (intracellulaire proteïnen) rehydratatiebuffer.
13. Voeg 4 µl protease inhibitor (25x) toe en 1 µl phosphatase inhibitor (extracellulaire
proteïnen) of 2 µl en 0.5 µl respectievelijk voor intracellulaire proteïnen.
14. Centrifugeer 10 minuten aan 12000 x g en breng supernatans naar 1.6 ml epje. Stokeer
bij -80°C.
K. Protocol voor optimalisatie van de precipitatie van extracellulaire eiwitten met
zilverkleuring.
Protocol: zilverkleuring
1. Breng de gel in de fixing oplossing gedurende 120 minuten.
2. Verwijder de oplossing en voeg sensitizing oplossing toe en schud zachtjes gedurende 120
minuten.
3. Verwijder de oplossing en voeg gedistilleerd water toe en was 5 maal telkens gedurende 15
minuten.
4. Voeg de zilveroplossing toe en schud zachtjes gedurende 120 minuten.
5. Verwijder de oplossing en was twee maal met gedistilleerd water gedurende een minuut
telkens.
6. Voeg developing oplossing toe en schud zachtjes gedurende 4 tot 6 minuten. Breng de gel
over naar de stop oplossing vanaf de spots tot de gewenste intensiteit bereikt hebben.
7. Schud zachtjes gedurende 120 minuten.
8. Voeg bewaringsoplossing en schud zachtjes gedurenden 120 minuten.
9. Fotografeer de gels.
L. Protocol voor pre-rehydratatie strips
Protocol: pre-rehydratatie van de Immobiline DryStrips
1. Voeg 15 µl IPG buffer 3-11 NL toe aan 3 ml Destreak solution.
2. Stel de reswelling tray waterpas op (de tray moet proper en droog zijn).
3.Voor 24 cm strips, pipeteer 450 µl Destreak solution in elke groeve van de tray .
4. Verwijder de bescherming van de strips beginnend aan het zure uiteinde.
5. Plaats de strip met de gelzijde naar beneden in de tray met behulp van een pincet. Vermijd
luchtbellen.
6. Kijk na of het serienummer van de strip leesbaar is. Indien deze in spiegelbeeld liggen, ligt
het geloppervlak niet goed.
7. Pipeteer 3 ml cover fluid op de strip.
8. Doe dit ook voor de volgende strip (werk strip per strip).
9. Sluit het deksel van de tray en laat op kamertemperatuur overnacht incuberen (minstens 6-
7u).
M. Protocol voor stock dye oplossing
Protocol: stock dye oplossing
1. Neem CyDye uit -20°C en laat 5 minuten opwarmen op kamertemperatuur.
XVI
2. Neem wat DMF en breng in epje.
3. Neem uit dit epje 5 µl DMF en voeg toe aan 5 nmol CyDye.
4. Vortex goed gedurende 30 seconden.
5. Centrifugeer 30 seconden aan 12000 x g.
N. Protocol voor working Dye oplossing
Protocol: working Dye oplossing
1. Spin kort het epje met de dye stock.
2. Verdun 1 volume van de stock in 1,5 x volume DMF om een 400 pmol/µl oplossing te
bekomen.
O. Protocol voor Minimal labeling
Protocol: Minimal labeling van staal
1. Voeg een volume equivalent aan 50 µg proteïne toe in een epje.
2. Voeg 1 µl van de CyDye werkoplossing toe.
3. Mix en spin kort af. Laat 30 minuten incuberen op ijs in het donker.
4. Voeg 1 µl 10 mmol/L lysine toe om de reactie te stoppen. Mix en spin kort af en laat 10
minuten op ijs in het donker incuberen.
Protocol: Minimal labeling van interne standaard
1. Voeg een volume gepoolde interne standaard equivalent aan n x 50 µg proteïne toe in een
epje.
2. Voeg n µl Cy2 toe.
3. Mix en spin kort af, laat 30 minuten incuberen op ijs in het donker.
4. Voeg n µl 10 mmol/L lysine toe. Mix en spin kort af. Laat 10 minuten incuberen op ijs in
het donker.
P. Protocol voor de voorbereiding op het laden van de stalen op de strips
Protocol: voorbereiding op het laden van de stalen op de strips
1. Combineer gelabelde stalen en standaard zoals voorzien in het experimenteel design.
2. Voeg een even groot volume 2x lyse buffer toe en laat 10 minuten incuberen op ijs.
3. Indien nodig verdun de stalen met een 1:1 mengsel van rehydratatie oplossing (labeling
buffer) en 2x lyse buffer tot een minimum van 100 µl.
Q. Protocol voor het scheiden van de proteïnen op basis van isoëlektrisch punt (IEF)
Protocol: IEF
1. Bevochtig de elektrode pads met 125 µl gedistilleerd water.
2. Verwijder voorzichtig de Immobiline DryStrips van de Reswelling Tray zonder de gel te
beschadigen.
3. Laat de overtollige Immobiline DryStrip Cover Fluid van de strip lopen.
4. Plaats de Immobiline DryStrip met de gelzijde naar boven en met de basische zijde langs
XVII
de kathode van de Immobiline DryStrip holder. Het uiteinde van de gelstrip moet zeker 0.5 cm van lichte verhoging liggen, zodat de pads in contact komen met de gel.
5. Plaats de vochtige elektrode pads op beide uiteinden van de strip.
6. Plaats de elektroden op de elektrode pads. Zorg voor een goed contact met strip en metaal
aan de buitenzijde van de strip holder.
7. Plaats een cup loader op het zure uiteinde van de strip (anodische staal aplicatie), op 0.5 cm
van de pads. Zorg dat het zeer nauw aansluit, gebruik hiervoor de insertie tool.
8. Breng 100 ml PlusOne Immobiline DryStrip Cover Fluid (parafiene olie) op de Immobiline
DryStrip holder (manifold) rond de cups in de laantjes waar de strips liggen en de daarnaast
gelegen laantjes, zodat de olie de strips volledig bedekt. Breng de elektroden aan.
9. Kijk na of er geen lekken zijn, olie zou dan in de cup vloeien.
10. Tot 100 µl proteïne staal kan geladen worden in elke cup.
11. Pipeteer 20 µl parafiene olie op elke staal om verdamping te voorkomen.
12. Programma Ettan IPGphor :
Rehydratatietijd 0 u
Temperatuur 20°C
Stroom per strip 75 µA
Strip lengte 24 cm
pH gradient 3-11 NL
Stap 1 stap en hold 150 V 3 u
Stap 2 stap en hold 300 V 3 u
Stap 3 Gradiënt 1000 V 6 u
Stap 4 Gradiënt 8000 V 1 u
Stap 5 stap en hold 8000 V 3u
Totale tijd 16 u
R. Protocol voor equilibratie van de IPG strips
Protocol: bereid de equilibratie oplossing:
1. Ontdooi 200 ml equilibratie buffer bij kamertemperatuur.
2. Weeg 0,5 g DTT en 1,25 g iodoacetamide af.
Protocol: refocus IPG strips
1. 15 minuten 8000 V (enkel nodig als de strip langer dan 30 minuten na aflopen programma
in de IPGphor gezeten heeft).
Protocol: equilibratie van de IPG strips:
1. Verwijder de elektrodes, cups en pads van de manifold.
2. Giet de olie in een afvalreservoir.
3. Voeg 0,5 g DTT toe aan 100 ml equilibratie buffer, mix grondig en giet in de manifold.
4. Plaats de manifold op een orbitale schudder voor 15 minuten (30 rpm).
5. Giet na 15 minuten de buffer af.
6. Voeg 1,25 g iodoacetamide toe aan 100 ml equilibratie buffer, mix grondig en giet in de
manifold.
7. Schud gedurende 15 minuten (30 rpm).
XVIII
8. Giet na 15 minuten de buffer af.
S. Protocol voor de applicatie van de IPG strips op de SDS gels en SDS elektroforese.
Protocol: applicatie van de IPG strips op de SDS gels en SDS elektroforese.
1. Verhit de agarose in een verwarmblok tot 95°C.
2. Vul de onderste buffertank met 125 ml geconcentreerde anode buffer en vul aan tot 4.5 L
met gedistilleerd water
3. Breng in een maatcilinder 250 ml kathode buffer en vul aan tot 1.2 L met gedistilleerd
water
4. Giet een aantal ml milliQ water op de gelfront. Dit vergemakkelijkt de insertie van de strip.
5. Leg de cassette plat op de bench (grootste plaat onderaan), met de opening naar de
gebruiker toe.
6. Neem de strip met 2 pincetten vast en plaats op het uitstekend randje van de grootste
glasplaat. Geloppvervlak is naar boven gericht, zure uiteinde naar links.
7. Schuif de strip met een buigzaam latje tussen de glasplaten tot tegen de gel.
8. Draai de cassette 90° om het water te verwijderen.
9. Laat agarose afkoelen tot 50°C en pipeteer vervolgens 2 ml agarose tussen de glasplaten
om de strip op zijn plaats te houden en te zorgen voor een geleidelijke overgang van de
proteïnen uit de strip naar de gel. Pipeteer langzaam en vermijd luchtbellen.
10. Bevochtig de bescherming van de bovenste buffertank met 0,1% SDS.
11. Breng de glasplaten in de cassette carier en plaats in de tank.
12. Als er minder dan 6 gels worden gelopen, moeten blanco cassettes geplaatst worden.
13. Vul de bovenste buffertank met de 1,4 L runningbuffer.
14. Voeg 1x geconcentreerde runningbuffer in de onderste buffertank toe, om een
hydrostatische balans te creëeren.
15. Fast run:
Stap 1: 10 mA/gel, 76V, 1 Watt/gel, 1u
Stap 2: 50 mA/gel, 500 V, 8.5 Watt/gel, 4.5u
16. Check of het bromofenol blauw front van de gels gelopen is.
17. Stop de stroom en verwijder de bovenste buffertank. Neem de cassettehouder uit het
instrument.
18. Neem de glasplaten uit de houder, spoel met gedistilleerd water, droog met stofvrij doekje
en scan of bewaar ze in 1x runningbuffer in het donker bij 4°C tot de volgende dag.
T. Protocol om te scannen
Protocol: Gel scanning
1. Zet de Typhoon scanner aan.
2. Laat het toestel minstens 30 minuten opwarmen voor gebruik.
3. Start de Scanner Control software
Protocol: plaatsen van de Ettan DALT gel in de scanner
1. Spoel de glasplaten met gedistilleerd water en wrijf droog met stofvrije doekjes.
2. Plaats de grippers op de scanner en leg de glasplaat op de grippers.
XIX
U. Protocol voor Image Loader
Protocol: Image Loader
1. Open DeCyder software.
2. Klik twee maal op Image Loader.
3. Klik op “add…” om gels toe te voegen in het programma.
4. Selecteer alles en druk op “edit gel images”.
5. Pas het contrast en belichting aan en crop de gel door op “Perform Cropping” te klikken.
6. Doe dit voor elke gel en sla deze gels.
V. Protocol voor DIA
Protocol: DIA
1. Dubbel-klik de DeCyder DIA icoon om de DIA module te openen
2. Selecteer File:Create Workspace.
3. Dubbel klik op de beeldbestanden die door DIA verwerkt moeten worden.
4. Selecteer Process:Process Gel Images. Een nieuw venster “Process Gel Images” komt
tevoorschijn . 5. Vul de waarde 2500 in voor de verwacht aantal spots en druk op OK.
6. Na de DIA analyse komt het onderstaand beeld tevoorschijn. Hierop ziet men Image view,
Histogram view, 3D view en Table view. 7. Selecteer Process:Exclude Filter. Het venster “Exclude Filter” komt tevoorschijn.
8. Vul de waarden in volgens de hierboven beschreven methode en druk op OK.
9. Selecteer File:Save as en sla op.
W. Protocol voor Batch Processor
Protocol: Batch Processor
1. Klik dubbel op de DeCyder Batch Processor icoon.
2. Selecteer File:New Batch en selecteer de gelbeelden.
3. Breng de waarde 2500 in voor het aantal verwachte spots en vink “Yes” aan bij “Include in
BVA batch list?” en druk op OK.
4. Vul de filterparameters in de “Exclude Filter” venster en druk op OK.
5. Vanaf dat alle beelden geladen zijn druk op “Cancel”. De DIA batch lijst is opgesteld.
6. Druk op de BVA Batch List tab bovenaan. Klik dubbel op kolom “Group”. Vervolgens
krijgt men een “Spot Map Assignment” venster en kan men hier “Unassigned” vervangen
naar “control”,”treated” of “standard”. Druk op OK.
7. Selecteer een beeld als Master en open het “Spot Map Assignment” venster. Vink Master
aan.
8. Sla op door File:Save as te selecteren.
9. Selecteer Process:Run batch en druk op OK.
XX
X. Protocol voor BVA
Protocol: BVA
1. Dubbel klik op de DeCyder BVA icoon.
2. Selecteer File:Open Workspace en dubbel klik het BVA bestand dat gecreëerd werd door
de Batch Processor.
3. Selecteer de Spot Map Table icoon (ST) en selecteer View: Table View.
4. Dubbel klik op de Match Table icon (MT) en selecteer View: Match Table.
5. Zet de gegevens in tabel in volgorde door te klikken op “Type”.
6. Om een match te confirmeren klik je op de eerste spot van de tabel. Beslis indien de spot
overeenkomt met het Masterbeeld. Indien correct verander de Match Image door gebruik te
maken van Select Match Gel scroll down menu om de matching accuraatheid te testen op
andere gels. Indien correct confirmeer door “Confirm Match” knop te drukken. Indien niet
correct klik op de Break Match knop en kies de juiste spot en druk op “Add Match”.
7. Indien meerderheid van spots uit stap 6 niet correct: Landmarken (stap 8). Anders ga verder
naar stap 9.
8. Landmarken begint door de beelden op grote belichting en laag contrast te brengen totdat
men enkele spots te zien krijgen. Indien men vergelijkt met het Master beeld kan men zien dat
bepaalde overgebleven spots overeenkomen. Deze spots kan men landmarken door
“Landmark” aan te vinken en vervolgens de spots aan te klikken zowel op het Master beeld
als het geselecteerde match beeld.
9. Klik op PT icoon om de gematchte spots te zien in tabel.
10. Statistische berekeningen: selecteer Process:Protein Statistics.
11. In Populatie 1 venster selecteer control, in populatie 2 venster selecteer treated. Vink
“Student’s T-test” en “Average Ratio” aan.
12. Druk op Calculate.
Y. Protocol voor EDA
Protocol EDA
1. Klik een maal op EDA icoon.
2. Selecteer File:Create workspace. Kies het gewenste BVA bestand en druk op “Add…” en
vervolgens op “Create”.
3. Druk onder Step 3 – Base Set op “Automatic”.
4. Druk op “Calculations”.
5. Druk op Differential Expression Analysis en vink de volgende onderdelen aan:
onafhankelijke t-test, average ratio, apply false discovery rate en one way ANOVA-test. In de
eerste en tweede groep selecteer je respectievelijk control en treated. Druk vervolgens op
“Add List”.
6. Druk op Principle Components Analysis en op “Add to list”.
7. Druk op “Calculate”.
XXI
Bijlage 4: Figuren
Figuur 1: Fibrilline-1 moleculen vormen parelvormige microfibrillen met variabele
periodiciteit [81].
Figuur 2: Schematische weergave van fibrilline-1. Fibrilline-1 bestaat uit verschillende
domeinen met aan de C-terminus een N-glycosylatie site. Deze glycosylatie komt niet
enkel voor op de C-terminus. Zowel op de C- als de N-terminus is er een furin cleavage
site. De cbEGF domeinen zijn verspreid over heel het proteïne met onderbreking door
TB domeinen en prolinerijke regio’s [81].
XXII
Figuur 3: klassieke TGFβ signaalweg. Nadat TGFβ met TGFBR2 homodimeer bindt, zal
er autofosforylatie ontstaan en zal de TGFBR1 homodimeer gerekruteerd worden. Deze
zal op zijn beurt transfosforylatie ondergaan en R-Smad fosforyleren. R-Smad zal
binden met Co-Smad waardoor dit complex naar de nucleus getransloceerd zal worden.
Na het binden met transcriptie factoren (TF) zal er een geactiveerd transcriptie complex
ontstaan zodat transcriptie gestart kan worden [47].
XXIII
Figuur 4: TGFβ activatie door fibrilline-1 fragmenten. Het gesecreteerde LLC bindt met
fibrilline-1 microfibrillen via de carboxyterminale zijde van LTBP-1. Door proteolyse
van de microfibrillen zullen er fibrilline-1 fragmenten (PF10, oranje) ontstaan. Deze
fragmenten binden op de beads van de microfibrillen waardoor het LLC complex uit
elkaar valt en een activatie van TGFβ induceert [59].
Figuur 5: Types FBN1 mutaties die voorkomen bij MFS in percentage [24].
Figuur 7: Opregulatie van TGFβ signalisatie in aanwezigheid van receptormutaties. A.
Clathrine-gemedieerde signalisatie leidend tot receptorrecyclage. B. Caveoline-
gemedieerde pathway leidend tot proteasomale degradatie van TGFβ receptoren [47].
XXIV
Figuur 8: Potentieel mechanisme voor de opregulatie van TGFβ signalisatie in
aanwezigheid van niet-functionele receptoren. Door mutaties in de TGFβ receptoren
kunnen verschillende onbekende proteïnen gerekruteerd en gefosforyleerd worden.
Deze proteïnen vormen samen een complex waardoor Smad3 en/of andere proteïnen
geactiveerd worden [47].
![De gerechtvaardigde röntgenfoto...Referenties: - Berkhout WE. [The ALARA-principle. Backgrounds and enforcement in dental practices]. Ned Tijdschr Tandheelkd. 2015 May;122(5):263-70.](https://static.fdocuments.nl/doc/165x107/60c4204e673c0c7d7b72f516/de-gerechtvaardigde-rntgenfoto-referenties-berkhout-we-the-alara-principle.jpg)
