OPHELDERING VAN DE OPNAMEWEGEN VAN CBA ......AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de...

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Geneesmiddelenleer

Laboratorium voor Algemene Biochemie en Fysische Farmacie

Academiejaar 2008-2009

OPHELDERING VAN DE OPNAMEWEGEN VAN

CBA ABOL GENCOMPLEXEN IN RPE CELLEN

Stefanie DENOYETTE

Eerste Master in de Farmaceutische Zorg

Promotor

Prof. Dr. J. Demeester

Commissarissen

Dr. K. Tilleman

Dr. K. Remaut

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de

beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk

de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”

2 juni 2009

Promotor Auteur

Prof. Dr. J. Demeester Stefanie Denoyette

DANKWOORD

Hier wil ik iedereen bedanken die me heeft geholpen deze thesis tot een goed einde te brengen.

Eerst en vooral een dankwoordje voor Prof. Dr. S. De Smedt, Prof. Dr. J. Demeester en Prof. Dr.

K. Braeckmans voor het gebruik van de infrastructuur van hun laboratoria en in het bijzonder voor

Prof. Dr. K. Braeckmans voor het nalezen van deze thesis.

Daarnaast wil ik zeker ook mijn begeleider, ir. Dries Vercauteren, bedanken. Allereerst voor de

goede begeleiding, de goede samenwerking en de vele tijd en energie die hij in deze thesis heeft

gestoken. Daarnaast ook voor de vele leerrijke gesprekken en discussies die we samen hebben

gevoerd. Ook bedankt om af en toe je weekend op te offeren om de resultaten van een experiment te

komen uitlezen. Verder bedank ik hem zeker voor de moeite die hij heeft gedaan om met mij en mijn

wensen rekening te houden.

De collega’s in het labo en mijn collega thesisstudenten wil ik hier zeker nog bedanken voor de

gezellige, ontspannen en leerrijke sfeer tijdens het labowerk. Nog een bijzonder woordje voor

Hannelore Declercq waarmee ik samen heel wat experimenten heb uitgevoerd en tot een goed einde

heb gebracht. Bedankt voor je toffe persoonlijkheid en de zeer goede samenwerking.

Ook mijn mama, papa en zus verdienen hier een plaatsje. Ik wil hen zeker bedanken voor de steun

en de hulp tijdens deze zware en moeilijke periode. Ook een grote dankjewel voor mijn papa die tijd

heeft willen maken om deze thesis op tik- en spellingfouten te overlezen.

Bedankt allemaal!!!

Stefanie

INHOUDSOPGAVE

AUTEURSRECHT

DANKWOORD

INHOUDSOPGAVE

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

1. INLEIDING ............................................................................................................................... 1

1.1 GENTHERAPIE ................................................................................................................................ 1

1.1.1 Niet-virale vectoren ..................................................................................................................... 1

1.1.2 Polyplexen................................................................................................................................... 1

1.2 CELLULAIRE BARRIÈRES BIJ NIET-VIRALE GENTHERAPIE .................................................. 2

1.2.1 De plasmamembraan: opname door endocytose ........................................................................... 2

1.2.1.1 Fagocytose ............................................................................................................................ 3

1.2.1.2 Pinocytose ............................................................................................................................ 3

1.2.1.3 Opname van gencomplexen in de doelcel geschiedt via endocytose ....................................... 5

1.2.2 Endosomale escape van polyplexen en dissociatie van nucleïnezuren en het drager-polymeer ...... 5

1.2.3 Transport in het cytoplasma naar de kern ..................................................................................... 6

1.2.4 Kernmembraan: translocatie naar de kern..................................................................................... 6

1.3 STUDIE VAN ENDOCYTOSE VAN NIET-VIRALE GENCOMPLEXEN ....................................... 7

1.3.1 Merkers voor specifieke opnamewegen........................................................................................ 7

1.3.1.1 Transferrine .......................................................................................................................... 7

1.3.1.2 Lactosylceramide .................................................................................................................. 7

1.3.1.3 E. coli ................................................................................................................................... 8

1.3.1.4 10 kDa Dextraan ................................................................................................................... 8

1.3.2 Inhibitie van endocytotische opnamewegen m.b.v. chemische inhibitoren .................................... 8

1.3.3 Inhibitie van endocytotische opnamewegen m.b.v. siRNA ......................................................... 10

1.4 KLINISCHE CONTEXT ................................................................................................................. 11

2. DOELSTELLINGEN .............................................................................................................. 13

3. MATERIALEN EN METHODEN ......................................................................................... 14

3.1 BUFFERS EN MEDIA .................................................................................................................... 14

3.2 CELKWEEK ................................................................................................................................... 15

3.3 ISOLATIE VAN pDNA ................................................................................................................... 15

3.3.1 Gebruikte pDNA‟s..................................................................................................................... 15

3.3.2 Opzuivering pDNA ................................................................................................................... 16

3.4 OPZUIVERING VAN MRNA ......................................................................................................... 17

3.5 FLUORESCENT MERKEN VAN DNA: LABELLING MET YOYO®-1 IODIDE .......................... 17

3.6 AANMAAK VAN GENCOMPLEXEN ........................................................................................... 18

3.6.1 Aanmaak van CBA ABOL complexen ....................................................................................... 18

3.6.2 Aanmaak van siRNA lipoplexen ................................................................................................ 18

3.6.3 Aanmaak van DNA lipoplexen .................................................................................................. 19

3.6.4 Aanmaak van lPEI DNA complexen .......................................................................................... 19

3.7 KARAKTERISATIE VAN GENCOMPLEXEN MET BEHULP VAN DYNAMISCHE

LICHTVERSTROOIING ....................................................................................................................... 20

3.7.1 Bepaling van de deeltjesgrootte ................................................................................................. 20

3.7.2 Bepaling van de zeta potentiaal .................................................................................................. 20

3.8 TRANSFECTIE MET DE GENCOMPLEXEN EN AAV ................................................................ 21

3.8.1 Transfectie met CBA ABOL polyplexen .................................................................................... 21

3.8.2 Transfectie met siRNA lipoplexen ............................................................................................. 21

3.8.3 Transductie met AAV ................................................................................................................ 22

3.9 MICROSCOPIE ............................................................................................................................... 22

3.9.1 Transmissie microscopie: DIC ................................................................................................... 22

3.9.2 Confocale fluorescentie microscopie .......................................................................................... 22

3.9.3 Fixatie van cellen....................................................................................................................... 23

3.9.4 Fluorescent kleuren van actinenetwerk in adherente cellen ......................................................... 24

3.10 FLOW CYTOMETRIE .................................................................................................................. 24

3.10.1 Principe ................................................................................................................................... 24

3.10.2 Analyse met de flow cytometer ................................................................................................ 25

3.11 KWANTIFICATIE VAN DE HOEVEELHEID GEÏNTERNALISEERDE GENCOMPLEXEN MET

FLOW CYTOMETRIE .......................................................................................................................... 25

3.11.1 Incubatie met gencomplexen .................................................................................................... 25

3.11.2 Verwijdering van aan de plasmamembraan geassocieerde gencomplexen: quenchen ................ 25

3.12 BEHANDELING MET INHIBITOREN......................................................................................... 26

3.13 ACID WASH ................................................................................................................................. 26

3.14 BACK EXCHANGE ...................................................................................................................... 27

3.15 BCA PROTEIN CONTENT TEST ................................................................................................. 27

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE ............................................................................................ 28

4.1 KARAKERISERING VAN CBA ABOL POLYPLEXEN ................................................................ 28

4.1.1 Bepaling van de deeltjesgrootte m.b.v. DLS ............................................................................... 28

4.1.2 Bepaling van de zeta potentiaal m.b.v. DLS ............................................................................... 29

4.2 TRANSFECTIE-EFFICIËNTIE VAN pDNA CBA ABOL COMPLEXEN ...................................... 29

4.2.1 Effect van celtype ...................................................................................................................... 30

4.2.2 Effect van het dragermateriaal ................................................................................................... 31

4.2.3 Effect van plasmide ................................................................................................................... 31

4.2.4 Kinetiek van transfectie van pDNA CBA ABOL complexen ...................................................... 32

4.2.5 Kinetiek van transfectie van mRNA CBA ABOL complexen ..................................................... 34

4.3 OPNAMEKINETIEK VAN CBA ABOL COMPLEXEN ................................................................. 34

4.4 EFFECT VAN CHEMISCHE INHIBITOREN OP ENDOCYTOSE EN TRANSFECTIE VAN CBA

ABOL COMPLEXEN ........................................................................................................................... 35

4.4.1 Evaluatie van opname van humaan transferrine .......................................................................... 35

4.4.2 Evaluatie van opname van lactosylceramide .............................................................................. 37

4.4.3 Evaluatie van macropinocytose en fagocytose na controle van het effect van cytoD d.m.v.

actinekleuring .................................................................................................................................... 38

4.4.4 Evaluatie van opname van CBA ABOL complexen na toepassing van chemische inhibitoren..... 40

4.4.5 Evaluatie van transfectie met CBA ABOL complexen na toepassing van chemische inhibitoren. 42

4.5 EFFECT VAN SIRNA OP ENDOCYTOSE EN TRANSFECTIE VAN CBA ABOL COMPLEXEN43

4.5.1 Controle van downregulatie van siRNA ..................................................................................... 43

4.5.2 Evaluatie van opname van humaan transferrine .......................................................................... 44

4.5.3 Evaluatie van opname van lactosylceramide .............................................................................. 45

4.5.4 Evaluatie van opname van CBA ABOL complexen na siRNA ................................................... 46

4.5.5 Evaluatie van transfectie met CBA ABOL complexen na siRNA ............................................... 47

4.5.6 Evaluatie van opname en transfectie van lipoplexen ................................................................... 48

5. CONCLUSIES ......................................................................................................................... 49

6. LITERATUURLIJST .............................................................................................................. 51

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

AAV

Ago 2

AF488

AMD

ATP

BSA

CAV1

CBA ABOL

CDE

CHC

CLSM

cytoD

DLS

DMEM

DMSO

DNA

DNM2

EDTA

FBS

Fig.

FLO1

FS

GFP

GPI

hTf

LacCer

LB-medium

lPEI

lplx.

mBCD

mRNA

PBS

pDNA

Adeno geassocieerd virus

Argonaut 2

Alexafluor 488

Age related macular degeneration

Adenosine trifosfaat

Bovine serum albumine

Caveoline-1

Cystaminebisacrylamide 4-amino-1-butanol

Clathrine afhankelijke endocytose

Clathrine heavy chain

Confocale laser scanning microscopy

Cytochalasine D

Dynamic light scattering

Dulbecco‟s modified Eagle‟s medium

Dimethylsulfoxide

Desoxyribonucleic acid

Dynamine-2

Ethyleendiaminetetra-azijnzuur

Fetal bovine serum

Figuur

Flotilline-1

Voorwaartse lichtverstrooiing

Green fluorescent protein

Glycosylphosphatidylinositol

Humaan transferrine

Lactosylceramide

Luria Bertani medium

Lineair PEI

Lipoplexen

Methyl-β-cyclodextrine

Messenger ribonucleic acid

Phosphate buffered saline

Plasmide DNA

PEI

pplx.

Rho GTPase

RISC

RLC

RNA

RPE

siRNA

SS

Poly(ethyleen imine)

Polyplexen

Rho guanosine trifosfaat ase

RNA induced silencing complex

RISC loading complex

Ribonucleic acid

Retinaal pigment epithelium

Small interfering RNA

Zijwaartse lichtverstrooiing

Inleiding 1

1. INLEIDING

1.1 GENTHERAPIE

Bij gentherapie wil men een ziekte (kanker, aangeboren of verworven genetische defecten)

behandelen door nucleïnezuren in de cel te brengen. Deze nucleïnezuren moeten dan tot in de

celkern raken om zo tot expressie te komen. Mogelijke vormen voor nucleïnezuren die gebruikt

worden zijn antisense oligonucleotides (AONs), small interfering RNA (siRNA) en plasmide DNA

(pDNA). Deze nucleïnezuren kunnen echter niet zomaar in de bloedbaan worden ingebracht daar er

in het hele lichaam tal van nucleasen aanwezig zijn die de nucleïnezuren zouden hydrolyseren nog

voor ze hun doelcellen kunnen bereiken. Er is dan ook een speciale formulatie nodig voor deze

moleculen om ze veilig tot in de cel te kunnen brengen. Nucleïnezuren kunnen bovendien door hun

negatieve lading ook niet zomaar de hydrofobe plasmamembraan passeren. Bijgevolg moet deze

formulatie eveneens in staat zijn om de verschillende extracellulaire en intracellulaire barrières te

overwinnen (Remaut et al., 2007). Bij deze formulaties onderscheidt men virale en niet-virale

dragers. Virale dragers brengen echter grote risico‟s met zich mee: ze kunnen een immuunrespons

induceren tegen virale proteïnen, er bestaan limitaties in de grootte van het therapeutische DNA dat

kan geïnsereerd worden in het virion, er is recombinatie mogelijk met wild-type virussen en het is

geen sinecure om deze virale dragers op grote schaal te produceren aan farmaceutische graad

(Glover et al., 2005).

1.1.1 Niet-virale vectoren

Hieronder vallen types materialen. Als eerste onderscheiden we de kationische liposomen die

zijn opgebouwd uit een bilayer van fosfolipiden. Na complexatie met nucleïnezuren wordt hier vaak

over lipoplexen gesproken. Ten tweede hebben we de kationische polymeren. Deze vormen

partikels, net zoals de liposomen, door zelfassociatie met de negatief geladen nucleïnezuren en

worden daarna polyplexen genoemd (Remaut et al., 2007). Voor de bespreking van andere types

materailen zoals block-copolymeren, microcapsules en polymeer matrices wordt verwezen naar

Remaut et al. (2007).

1.1.2 Polyplexen

Klassieke polymeren die gebruikt worden in gentherapie zijn poly(L-lysine) (pLL),

poly(ethyleen imine) (PEI) en poly(amino ester)s. pLL echter is een relatief toxische molecule

waaraan enkele modificaties moeten worden uitgevoerd alvorens deze te kunnen gebruiken en

vertoont bovendien een relatief lage transfectie activiteit (Luten et al., 2008). PEI is een polymeer

met een grote buffercapaciteit over een breed pH gebied en heeft een hoge transfectie-efficiëntie

Inleiding 2

(Boussif et al., 1995). Poly (amino ester)s zijn hydrolyseerbare polymeren. Ze hebben een lage

cytotoxiciteit doordat ze niet accumuleren in de cel en vertonen ook een hoge transfectie-efficiëntie.

De hydrolyseerbaarheid zorgt echter voor instabiliteit extracellulair en snelle degradatie

intracellulair (Lin et al., 2007).

In dit onderzoek wordt er gebruik gemaakt van polyplexen (pplx.) voor de aflevering van het

therapeutisch DNA in de cel. Deze polyplexen zijn opgebouwd uit pDNA samen met een polymeer,

in ons geval cystaminebisacrylamide 4-amino-1-butanol (CBA ABOL) (Fig. 1.1). Dit polymeer is

een poly(amido amine) dat repetitieve disulfidebruggen bevat. Deze disulfidebruggen zijn nodig

voor de vrijstelling van het pDNA uit het polyplex. In een reductieve omgeving (zoals het

celcytoplasma waarin zich glutathion bevindt) worden deze bruggen gesplitst waardoor het

polymeer dan uit elkaar zal vallen en waardoor het pDNA vrij kan komen uit het partikel. Dit

proces gaat vrij snel door in het cytoplasma waardoor er een efficiënte vrijstelling is van het pDNA

en een hoge transfectie-efficiëntie. Ook draagt de hoge buffercapaciteit van het polymeer bij tot de

hoge transfectie-efficiëntie omdat dit een voordeel is bij het ontsnappen van de polyplexen uit de

endosomale vesikels (zie § 1.2.2). Door de stabiliteit van het polymeer extracellulair wordt het niet

afgebroken voor het zijn doelcellen heeft bereikt (Christensen et al., 2006; Lin et al., 2007).

FIGUUR 1.1: STRUCTUURFORMULE VAN CBA ABOL

1.2 CELLULAIRE BARRIÈRES BIJ NIET-VIRALE GENTHERAPIE

Wanneer niet-virale gencomplexen in contact gebracht worden met de doelcel worden in veel

gevallen de gencomplexen door de doelcel opgenomen via endocytose, waarna de complexen in een

intracellulair vesikel terechtkomen waaruit ze vervolgens moeten zien te ontsnappen. Vervolgens

moeten de complexen dissociëren opdat vrije nucleïnezuurmoleculen kunnen vrijgesteld worden in

het cytoplasma. Tenslotte moet in het geval van gentherapie, met plasmiden als therapeutisch

nucleïnezuur, het plasmide nog in de kern geraken alvorens transcriptie en translatie tot het

therapeutisch eiwit mogelijk is.

1.2.1 De plasmamembraan: opname door endocytose

Endocytose is de opname van macromoleculen, micropartikels of nanopartikels in de cel

waarbij membraangebonden vesikels gevormd worden die afgesplitst worden en vervolgens naar

Inleiding 3

het cytoplasma van de cel afgedreven worden. Endocytose kan ruwweg onderverdeeld worden in

fagocytose, dit is de opname van grote partikels in de cel, en pinocytose, wat de opname is van

vloeistoffen en moleculen opgelost in de vloeistof rond de cel (Connor & Schmid, 2003).

1.2.1.1 Fagocytose

Fagocytose (Fig. 1.2) vindt enkel plaats in bepaalde celtypes zoals de macrofagen, de

monocyten, de neutrofielen, de retinaal pigment epithelium (RPE) cellen, etc. Deze cellen

verwijderen op deze manier pathogenen, celdebris of in het geval van RPE de verouderde buitenste

segmenten van de fotoreceptoren (Strauss, 2005). De internalisatie start met het binden van

moleculen op het oppervlak van het partikel en op specifieke receptoren op de cellen. Hierdoor

komt een signaalcascade op gang in de cel. Deze cascade wordt gemedieerd door de familie van de

Rho guanosine trifosfaat ase (Rho GTPases). Door deze cascade wordt de actine assemblage gestart

en worden er protrusies gevormd op het celoppervlak die het op te nemen partikel zullen omsluiten

(Connor & Schmid, 2003).

1.2.1.2 Pinocytose

FIGUUR 1.2: OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE ENDOCYTOTISCHE OPNAMEWEGEN IN EEN

EUKARYOTISCHE CEL. VASTE PARTIKELS GROTER DAN 500 NM KUNNEN DOOR SOMMIGE CELLEN

OPGENOMEN WORDEN VIA FAGOCYTOSE, TERWIJL NANOPARTIKELS EN/OF MACROMOLECULEN

KUNNEN OPGENOMEN WORDEN VIA MACROPINOCYTOSE. RECEPTOR-GEMEDIEERDE ENDOCYTOSE

GESCHIEDT DIKWIJLS VIA CLATHRINE-AFHANKELIJKE ENDOCYTOSE EN GEEFT AANLEIDING TOT

COATED PITS VAN 150 – 200 NM. CLATHRINE-ONAFHANKELIJKE ENDOCYTOSE ONTSTAAT DIKWIJLS

TER HOOGTE VAN VLOEISTOF-GEORDENDE ZONES IN DE PLASMAMEMBRAAN. VEEL VAN DE

GEËNDOCYTEERDE MACROMOLECULEN KOMEN TERECHT IN DE SORTERENDE ENDOSOMEN

WAARIN DE CARGO‟S EN RECEPTOREN GEORDEND EN AFGESPLITST WORDEN OM NAAR HUN

VOLGENDE BESTEMMING GETRANSPORTEERD TE WORDEN (WIEFFER ET AL, 2009).

Inleiding 4

Macropinocytose (Fig. 1.2) wordt in veel celtypes gestimuleerd door groeifactoren en andere

signalen. Het komt voor in specifieke subdomeinen van de plasmamembraan. Ook hier speelt de

familie van de Rho GTPases een rol bij de signaaltransductie in de cel. Ze zorgt opnieuw voor de

inductie van de vorming van membraanuitsteeksels gedreven door actine, welke bijgevolg

essentieel is voor deze opnameweg (Lee & Knecht, 2004). De protrusies die gevormd worden noemt

men ook membraan ruffles. Deze ruffles gaan de vloeistof die zal worden opgenomen omsluiten om

vervolgens weer te fuseren met de plasmamembraan. Dit resulteert in grote endocytotische vesikels,

die ook wel de macropinosomen worden genoemd. Deze bevatten grote hoeveelheden van

extracellulaire vloeistof (Jones, 2007). Het eiwit dynamine is in dit geval niet betrokken in het

proces van de afsplitsing van de plasmamembraan (Meier & Greber, 2004; Gong et al., 2008).

Clathrine afhankelijke endocytose (CDE) komt voor in alle zoogdiercellen. Het wordt gebruikt

voor de opname van essentiële nutriënten voor de cel zoals de low density lipoproteïnen en het met

ijzer beladen transferrine. Daar transferrine specifiek wordt geïnternaliseerd via deze opnameweg

wordt het vaak als merker gebruikt voor clathrine afhankelijke endocytose. CDE is essentieel bij de

ontwikkeling van weefsels en organen, signaaltransductie en internalisatie van membraanpompen.

Tijdens CDE wordt een ligand gebonden op een hoge affiniteitsreceptor in de celmembraan die zich

in een coated pit bevindt. Deze coated pits worden gevormd door de binding van cytosolische coat

proteïnen waarvan de voornaamste clathrine is. Daarna gaan deze coated pits invagineren, zich

afsplitsen van de celmembraan, wat gemedieerd wordt door dynamine-2 en endocytische vesikels

vormen die omgeven zijn door clathrine en het receptor-ligand complex in de cel brengen (Connor

& Schmid, 2003; Gong et al., 2008).

Caveolae gemedieerde endocytose wordt gekarakteriseerd door caveolae. Caveolae zijn

flesvormige invaginaties van de plasmamembraan. Ze komen voor op veel verschillende celtypes

waar ze telkens een andere vorm hebben. Op de plasmamembraan begrenzen ze zones die rijk zijn

aan cholesterol en sfingolipiden waarin veel signaalmoleculen en receptoren voorkomen. De

flesvorm wordt bekomen door het eiwit caveoline-1, een integraal membraanproteïne, dat op

cholesterol in de plasmamembraan bindt. Caveoline-2 kan de vorming van caveolae niet induceren,

maar vormt wel oligomeren met caveoline-1 als dit in de cel aanwezig is. Caveoline-3 komt enkel

voor in spiercellen (Mora et al, 1999). Caveoline-1 doet aan zelfassociatie in de vorm van een

haarspeld waardoor tenslotte een dunne laag van caveoline wordt bekomen op het oppervlak van de

membraaninvaginaties. Het is de haarspeld die de flesvorm van de membraan zal stabiliseren

(Pelkmans & Helenius, 2002; Connor & Schmid, 2003; Gong et al., 2008).

Onder clathrine en caveoline onafhankelijke endocytose vallen verschillende opnamewegen die

nog niet allemaal even duidelijk gekarakteriseerd zijn. Zo is er glycosylphosphatidylinositol (GPI)

Inleiding 5

aangerijkte endocytose welke een opnameweg is die niet afhankelijk is van dynamine maar wel van

actine en verantwoordelijk zou zijn voor fluid phase uptake (Gong et al., 2008). Daarnaast is er

flotilline-1 afhankelijke endocytose die dynamine onafhankelijk is. Het belangrijkste kenmerk is het

flotilline-1 dat voornamelijk wordt teruggevonden t.h.v. de plasmamembraan (Glebov et al., 2006).

Dynamin/RhoA/cortactin afhankelijke endocytose is verantwoordelijk voor de opname van de

interleukine-2 receptor (Mayor & Pagano, 2007). Als laatste wordt hier nog vernoemd arf6

afhankelijke endocytose welke ook een dynamine onafhankelijke opnameweg is (Gong et al.,

2008).

1.2.1.3 Opname van gencomplexen in de doelcel geschiedt via endocytose

De manier van opname van gencomplexen is allereerst afhankelijk van het celtype dat de

gencomplexen moet opnemen. Verder zijn de minst optimale wegen van opname voor onze

complexen fagocytose en macropinocytose omdat deze vesikels eens geïnternaliseerd in de cel niet

zuur genoeg worden voor de vrijstelling van de gencomplexen (zie § 1.2.2). De opname van

gencomplexen kan verder zowel via clathrine afhankelijke als onafhankelijke endocytose

plaatsvinden. Interactie van gencomplexen met de cel is meestal niet specifiek maar gebaseerd op

een elektrostatische interactie tussen het gencomplex en de plasmamembraan (Midoux et al., 2008).

1.2.2 Endosomale escape van polyplexen en dissociatie van nucleïnezuren en het drager-

polymeer

Bij polyplexen speelt een sterke buffercapaciteit (rond de pH 6.5) van de kationische drager-

polymeren dikwijls een belangrijke rol. Deze eigenschap zou namelijk aan de basis liggen van de

endosomale disruptie. Deze disruptie start met de verzuring van het endosoom waarbij protonen in

deze endosomen worden binnengepompt. De protonen die binnenkomen in het endosoom worden

geneutraliseerd door het polymeer want zij gaan binden met het uiterste rechtse tertiaire

stikstofatoom (Fig. 1.1). Samen met deze protonen komt er ook Cl- en water binnen in het

endosoom om de elektroneutraliteit en osmolariteit gelijk te houden. Door de neutralisatie van de

protonen daalt de pH niet in het endosoom en blijft er een instroom van protonen, samen met Cl-

ionen en water. Dit water zal ervoor zorgen dat het endosoom opzwelt en op een gegeven moment

zal barsten door de zeer hoge osmotische druk. Het is op dat moment dat de pplx. worden

vrijgesteld. Dit effect staat in de literatuur bekend als het „proton sponge effect‟ (Boussif et al.,

1995; Akinc et al., 2005). Na vrijstelling van de gencomplexen in het cytoplasma is het voor een

succesvolle transfectie nodig dat de nucleïnezuren vrijgesteld worden van hun drager. In het geval

van CBA ABOL gebeurt dit aan de hand van de besproken cystamine-disulfidebruggen in de

poly(amido amine)s. Deze disulfidebruggen worden gereduceerd in het cytoplasma door het

Inleiding 6

aanwezige reductans glutathion. Hierdoor wordt de disulfidebrug verbroken en valt het polymeer

uiteen en wordt het therapeutisch DNA vrijgesteld in het cytoplasma. Deze reductie van de

disulfidebruggen kan niet plaatsvinden binnen het endosoom omdat er geen thiolaat anionen kunnen

gevormd worden door de aanwezige lage pH. Deze anionen zijn essentieel voor de reductie (Yang et

al., 2006). Andere degradeerbare polymeren bevatten dikwijls esterbindingen die intracellulair

gehydrolyseerd kunnen worden (Lin et al., 2007; Luten et al., 2008).

1.2.3 Transport in het cytoplasma naar de kern

Wanneer de gencomplexen zich nog in het intracellulaire vesikel bevinden is het transport van

de complexen uitsluitend te wijten aan de beweging van de endosomale compartimenten. Deze

worden getransporteerd via endosomale vesikels die bewegen door het cytoplasma over de

microtubuli met behulp van de motorproteïnen dyneine, die transport in de richting van de kern

bevordert, en kinesine, die transport in de richting van de plasmamembraan bevordert (Murray &

Wolkoff, 2003). Passieve diffusie van endosomale vesikels doorheen het cytoplasma komt bijna niet

voor daar het cytoplasma vol zit met celorganellen en het actine en microtubuline netwerk en deze

de diffusie verhinderen (Dauty & Verkman, 2005).

Naakt DNA kan zowel passief als actief tot aan de kern gebracht worden. Bij actief transport

wordt voornamelijk gebruik gemaakt van het microtubuline netwerk waarbij het pDNA interageert

met dyneine dat fungeert als motorproteïne dat zich over de microtubuli kan verplaatsen. Passieve

diffusie is echter sterk beperkt door het actineskelet en microtubuline netwerk in het cytoplasma die

de vrije beweging van de plasmiden verhinderen (Vaughan & Dean, 2006).

1.2.4 Kernmembraan: translocatie naar de kern

De kernmembraan bestaat uit een dubbele membraan elk bestaand uit een dubbele

fosfolipidelaag. Op sommige plaatsen bevinden er zich eiwitcomplexen die door beide membranen

heen lopen en op die manier een verbinding vormen tussen de intra- en extranucleaire ruimte. Deze

worden de nuclear pore complexes genoemd en spelen een belangrijke en actieve rol bij het

transport ván en náár de nucleus. Ionen en kleine proteïnen tot 40 kDalton (vb. siRNA is ongeveer

14 kDa groot) kunnen passief door deze kanalen diffunderen. Voor grotere moleculen is energie en

een signaalafhankelijk mechanisme nodig. Het is bijgevolg makkelijker om kleine DNA fragmenten

tot in de kern te brengen dan grote. Voor grote moleculen is een nucleair lokalisatiesignaal nodig.

De grootste hoeveelheid plasmide DNA krijgt men echter in de kern wanneer de cel deelt. De

nucleaire membraan wordt dan tijdelijk afgebroken en het plasmide kan bij de nieuwe synthese van

deze membraan worden ingesloten in de kern. De tijd tussen het vrijstellen van het plasmide uit zijn

Inleiding 7

drager en de celdeling dient dan ook zo klein mogelijk te zijn. Dit om degradatie van het plasmide

door nucleasen te voorkomen (Van der Aa et al., 2006).

1.3 STUDIE VAN ENDOCYTOSE VAN NIET-VIRALE GENCOMPLEXEN

Door bepaalde endocytotische opnamewegen te inhiberen proberen we te achterhalen hoe de

onderzochte gencomplexen worden opgenomen in eukaryote cellen. Met deze kennis hopen we dan

nieuwe opportuniteiten te creëren door met lagere dosissen complexen en meer efficiënte

internalisatie minstens gelijkaardige transfectie-efficiëntie te verkrijgen. De inhibitie van

endocytotische opnamewegen kan bewerkstelligd worden door enerzijds chemische inhibitoren en

anderzijds m.b.v. siRNA.

1.3.1 Merkers voor specifieke opnamewegen

Om de opname van complexen te beschrijven wordt gebruik gemaakt van specifieke merkers

voor een bepaalde endosomale opnameweg. Het is beschreven voor deze macromoleculen dat zij

specifiek door bepaalde opnamewegen zouden worden opgenomen.

1.3.1.1 Transferrine

Van transferrine is geweten dat het uitsluitend via clathrine gemedieerde endocytose wordt

opgenomen. De functie van transferrine is om niet haem ijzerionen in de cel te brengen. De receptor

voor transferrine bevindt zich uitsluitend in de clathrine gecoate pits in de celmembraan. Na binding

met de receptor en internalisatie wordt het verder getransporteerd naar de sorting endosomes (Huth

et al., 2006). Door de verzuring in deze endosomen komt het ijzer vrij van het complex. Het

transferrine met de receptor wordt nu recycleerd naar de plasmamembraan waar het transferrine zal

loskomen van de receptor onder invloed van de extracellulaire pH (Widera et al, 2003).

1.3.1.2 Lactosylceramide

Lactosylceramide (LacCer) behoort tot de klasse van de glycosfingolipiden. Het wordt

opgenomen via een caveolae gemedieerd mechanisme en is daardoor een merker voor clathrine

onafhankelijke en caveolae afhankelijke endocytose (Sharma et al., 2003). De opname is

afhankelijk van dynamine (Marks et al., 2005). Fluorescent gemerkte analogen kunnen worden

gebruikt bij de studie van deze opnamewegen (Puri et al., 2001).

Inleiding 8

1.3.1.3 E. coli

Escherichia coli staat door zijn grootte van ongeveer 1µm bekend als een merker voor

fagocytose. Het is niet mogelijk dat de bacterie via pinocytose wordt opgenomen door de cel omdat

deze daar te groot voor is. Voor de studie naar fagocytose wordt fluoresceïne gemerkt E.coli

gebruikt zodat analyse met flow cytometrie mogelijk is (Wan et al., 1993).

1.3.1.4 10 kDa Dextraan

Dextraan is een vertakt polysaccharide dat verschillende moleculaire gewichten kan aannemen

afhankelijk van zijn grootte. Doordat het niet adsorbeert op het celoppervlak kan het gebruikt

worden om cultuurmedium fluorescent te labelen als we een dye aan het dextraan bevestigen. Het

kan dan ook gebruikt worden als merker voor de opname via macropinocytose (zie § 1.2.1.2)

waarbij vloeistoffen worden opgenomen door de cel (Swanson, 1989).

1.3.2 Inhibitie van endocytotische opnamewegen m.b.v. chemische inhibitoren

Chlorpromazine is een molecule die interageert met clathrine. Hierdoor komt clathrine los van

de plasmamembraan en associeert het met de late endosomen. Het gevolg is dat er geen clathrine

meer voorhanden is ter hoogte van de plasmamembraan wat CDE onmogelijk maakt aangezien er

geen coated pits meer gevormd kunnen worden. Chlorpromazine wordt dan ook voornamelijk

gebruikt voor studies van clathrine gemedieerde endocytose (Wang et al., 1993; Huth et al., 2006;

Ivanov, 2008).

CytoD is een molecule die de polymerisatie van het actinenetwerk verhindert. CytoD capteert

de actinefilamenten waardoor geen assemblage van het netwerk meer mogelijk is en dit uiteindelijk

leidt tot disassemblage van het netwerk (Sampath & Pollard, 1991). Aangezien het actinenetwerk

een essentiële rol invult bij fagocytose, macropinocytose, clathrine afhankelijke endocytose en

caveolae gemedieerde endocytose worden deze opnameroutes geïnhibeerd door cytoD (Connor &

Schmid, 2003; Gong et al, 2008; Ivanov, 2008).

Methyl-β-cyclodextrine (mBCD) is een cyclisch heptasaccharide dat complexen vormt met

cholesterol. Hierdoor wordt er cholesterol uit de plasmamembraan onttrokken (Ivanov, 2008). De

cholesterolrijke microdomeinen die nodig zijn bij onder andere caveolae gemedieerde endocytose

en flotilline gemedieerde endocytose verdwijnen (Huth et al., 2006). mBCD blokkeert ook de

invaginatie van clathrine coated pits en inhibeert ook clathrine gemedieerde endocytose (Rodal et

al., 1999). Tevens is de afhankelijkheid van cholesterol tijdens macropinocytose reeds beschreven.

Wanneer cholesterol wordt weggenomen uit de membraan kunnen de membraanprotrusies nodig bij

macropinocytose niet meer gevormd worden doordat het actinenetwerk zich niet meer kan

Inleiding 9

reorganiseren (Grimmer et al., 2002). Dit alles wijst op het gebrek aan specificiteit van deze

inhibitor.

Tyrosine kinases zijn betrokken bij de signaaltransductie van caveolae (via de fosforylatie van

caveoline-1) en de internalisatie van de caveolaire vesikels. Genisteïne is een inhibitor van tyrosine

kinases en zal internalisatie van caveolaire vesikels inhiberen. Door de inhibitie van de tyrosine

kinases wordt ook een lokale disruptie van het actineskelet veroorzaakt en wordt er verhinderd dat

dynamine op de plaats van de endocytose kan komen. Deze acties zijn echter nodig bij caveolae

gemedieerde endocytose, welke wordt stilgelegd door genisteïne (Pelkmans & Helenius, 2002;

Vercauteren et al., 2009).

Nocodazol bindt intracellulair snel aan de microtubuli subunits. Hierdoor verhindert het zeer

snel de repolymerisatie van de microtubuli en wat uiteindelijk tot depolymerisatie van dit netwerk

leidt. Het gevolg is dat er geen microtubuli meer kunnen gevormd worden door de cel (Saunders &

Limbird, 1997). Doordat er geen microtubuli meer zijn kan het transport van de endosomale

vesikels niet meer doorgaan. Zo kan geen verzuring optreden van sorting endosome tot late

endosome (Bayer et al., 1998). Het is voornamelijk de vrijstelling uit de endosomen die wordt

verhinderd.

Dynasore is een niet competitieve inhibitor die de GTPase activiteit van dynamine (waarbij

guanosinetrifosfaat wordt gehydrolyseerd) inhibeert. Ook inhibeert dynasore de zelfassemblage van

dynamine wat voor een verminderde activiteit van dynamine zal zorgen. De graad van inhibitie is

dosisafhankelijk. Het dynamine is essentieel voor de afsnoering van de vesikels bij clathrine

gemedieerde endocytose en caveolae gemedieerde endocytose (Gong et al., 2008). Dynamine komt

ook tussen bij fagocytose (Connor & Schmid, 2003) en sommige CIE opnamewegen zoals Rho A

afhankelijke endocytose (Gong et al., 2008). Al deze opnamewegen worden bijgevolg stilgelegd

door dynasore. Wat betreft flotilline afhankelijke endocytose bestaat er twijfel over de

afhankelijkheid van dynamine voor deze opnameweg (Macia et al., 2006).

Bafilomycine A1 is een molecule die de verzuring van de endosomen en de lysosomen

verhindert. Het is een inhibitor die niet specifiek de opname verhindert. De verzuring wordt

verhinderd doordat bafilomycine A1 een vacuolaire adenosinetrifosfaat-ase (ATPase) stillegt. Dit

enzym pompt in normale omstandigheden protonen binnen in de celorganellen die verzuurd worden

waarbij ATP wordt verbruikt. Dit binnenpompen van protonen speelt een belangrijke rol bij de

vrijstelling van de polyplexen uit de endosomen. Het is voornamelijk de endosomale vrijstelling die

verhinderd wordt en niet de endocytose (Crider et al., 1994; Bayer et al., 1998).

Inleiding 10

TABEL 1.1 : OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE INHIBITOREN EN DE OPNAMEWEGEN DIE ZE

INHIBEREN. CDE= CLATHRINE AFHANKELIJKE ENDOCYTOSE, CIE= CLATHRINE EN CAVEOLINE

ONAFHANKELIJKE ENDOCYTOSE, MP= MACROPINOCYTOSE

Inhibitor Endocytotische opnamewegen die geïnhibeerd

worden

Chlorpromazine CDE

Cytochalasine D (cytoD) CDE, Caveolae gemedieerde endocytose, MP,

fagocytose en sommige CIE

Methyl-β-cyclodextrine Cholesterol afhankelijke endocytose

Genisteine Caveolae-gemedieerde endocytose

Nocodazol /

Dynasore CDE, caveolae-gemedieerde endocytose,

fagocytose en sommige CIE

Bafilomycine A1 /

1.3.3 Inhibitie van endocytotische opnamewegen m.b.v. siRNA

siRNA is een kleine (slechts 21 nucleotiden lang) dubbelstrengige ribonucleic acid (RNA)

molecule (Fig. 1.3A). Wanneer deze in de cel wordt gebracht zal ze, net zoals dat het geval is bij

viraal dubbelstrengig RNA, worden gesplitst in 2 enkelstrengige stukken door DICER (een

endonuclease). Eén van de twee enkelstrengige RNA moleculen wordt gebonden in het RNA

induced silencing complex (RISC) en is complementair met het messenger ribonucleic acid

(mRNA) dat codeert voor het eiwit dat we willen downreguleren (Fig. 1.3B). Dit RNA zal door

complementariteit met elkaar gaan binden. De cel zal hierna weer herkennen dat er dubbelstrengig

RNA aanwezig is en zal dit als vreemd beschouwen. Het argonaut 2 (Ago 2) eiwit, dat een deel is

van het RISC, zal vervolgens knippen in de mRNA molecule. Hierdoor verliest het mRNA zijn

polyadenosinestaart en het 5‟ cap uiteinde die normaal zorgen voor de stabiliteit van de molecule in

het cytoplasma. Het gevolg hiervan is dat het mRNA zal worden afgebroken door de aanwezige

RNAses in het cytoplasma. We kunnen van deze strategie gebruik maken om de expressie van een

specifiek gen stil te leggen door siRNA dat complementaire sequenties tegen het doeleiwit mRNA

bevat, in de cel te brengen. De downregulatie van het proteïne hangt niet alleen af van de afbraak

van het mRNA maar ook van de halfwaardetijd van het eiwit. Bij een eiwit met een korte

halfwaardetijd zullen de effecten van de downregulatie sneller optreden (Kurreck J, 2009).

Inleiding 11

FIGUUR 1.3: STRUCTUUR SIRNA EN SCHEMATISCHE

VOORSTELLING RNA INTERFERENCE (RNAi) A: HIER

ZIEN WE DAT ER 19 NUCLEOTIDEN COMPLEMENTAIR

ZIJN MET ELKAAR EN DAT ER AAN ELKE ZIJDE 2

NUCLEOTIDEN “OVERHANG” IS. ER IS OOK AANGEDUID

WAAR HET RNA ZAL GESPLITST WORDEN. B: HET SIRNA

KOMT BINNEN IN DE CEL EN KOMT TERECHT IN HET RISC

LOADING COMPLEX (RLC). HIERBIJ WORDT DE SENSE

STRENG VAN HET RNA VERWIJDERD. DE ANTISENSE

STRENG WORDT VERVOLGENS DOORGEGEVEN AAN HET

RISC COMPLEX. DIT RISC WORDT DOOR DE ANTISENSE

STRENG GELEID TOT BIJ HET MRNA WAAR ER DAN DOOR

COMPLEMENTARITEIT WORDT GEBONDEN. VERVOLGENS WORDT DIT DUBBELSTRENGIG STUK

GEKLIEFD DOOR HET AGO2 EIWIT (KURRECK J, 2009).

1.4 KLINISCHE CONTEXT

De studies in dit project worden uitgevoerd op cellen van het retinale pigment epithelium (RPE

cellen). Dit is een monolaag van gepigmenteerde, gepolariseerde epitheelcellen die deel uitmaken

van de bloed/retina barrière. Ze liggen met hun apicale membraan aan tegen de fotoreceptoren en

met hun basolaterale membraan tegen het Bruch‟s membraan (Fig. 1.4). Dit Bruch‟s membraan

scheidt de RPE cellen af van het gefenestreerde endothelium van de choriocapillaris. De cellen zijn

lateraal met elkaar verbonden via tight junctions zodat slechts weinig moleculen tussen de cellen

door tot bij de fotoreceptoren kunnen diffunderen (Strauss, 2005).

FIGUUR 1.4: ANATOMIE VAN HET OOG.

HET RETINAAL PIGMENT EPITHELIUM IS DE

LAAG CELLEN VAN DE RETINA DIE HET

DICHTST LIGT BIJ DE CHORIOIDEA (KENNIS

P., 2008)

Deze RPE cellen nemen nutriënten zoals vetzuren, glucose en retinol op uit het bloed en geven

deze af onder de vorm van o.a. retinal aan de fotoreceptoren. De RPE cellen zijn ook

verantwoordelijk voor de ionsamenstelling in de subretinale ruimte wat belangrijk is voor de

exciteerbaarheid van de fotoreceptoren. Daarnaast fagocyteren de RPE cellen de buitenste

segmenten van de fotoreceptorcellen en voeren dit af. Ionen, water en metabolische eindproducten

worden door de RPE cellen van de fotoreceptorcellen naar het bloed gebracht. RPE cellen scheiden

ook een aantal groeifactoren af die zorgen voor het behoud van de structuur van de choriocapillaris

en de fotoreceptorcellen. Een verlies van één van de functies van de retinale cellen kan leiden tot

degeneratie van de retina, verlies van de visuele functie en uiteindelijk blindheid (Strauss, 2005).

Inleiding 12

Er zijn heel wat genetische defecten mogelijk in deze cellen die dan de oorzaak zijn van

verschillende ziekten zoals vb retinitis pigmentosa, age related macular degeneration (AMD),…

AMD is een ziekte die leidt tot onomkeerbaar zichtverlies. De ziekte wordt gekenmerkt door het

vormen van drusen welke afzettingen zijn van amorf materiaal tussen de RPE cellen en het Bruch‟s

membraan. De vorming van deze drusen blijkt genetisch te zijn voorbestemd. Ook ontstaat er basaal

een opstapeling van niet afgebroken materiaal die door de RPE cellen wordt uitgescheiden. Dit

belet het transport van voedingsstoffen van en naar de RPE cellen vanuit de choriocapillaris. Verder

wordt de ziekte ook nog gekenmerkt door neovascularisatie ter hoogte van de choriocapillaris

(Nowak, 2006). Vele genetische defecten kunnen aan de oorsprong liggen van retinitis pigmentosa.

Deze leiden allen tot stoornissen in het retinaal pigment epithelium. Door een accumulatie van

afvalstoffen wordt de retina verstoord (Berson, 1993). Naast de betrokkenheid bij vele genetische

ziekten, winnen deze cellen aan interesse als potentieel target voor gentherapie omwille van hun rol

in de secretie van essentiële groeifactoren. RPE cellen fungeren als een secretieplatform die

therapeutische getransfecteerde eiwitten kunnen aanmaken en uitscheiden en op die manier lokaal

in de retina een geneesmiddel kunnen vrijstellen. Dit alles maakt van deze cellen een interessant

doel voor gentherapie (Strauss, 2005).

Er wordt in dit project gebruik gemaakt van een model-cellijn nl. de ARPE 19 cellen. Deze

continue cellijn werd bekomen in 1986 uit de ogen van een 19-jarig slachtoffer van een

verkeersongeval (Dunn et al., 1996). In enkele gevallen maken we ook gebruik van D407 RPE

cellijn. Het is een spontaan getransformeerde cellijn die werd bekomen uit een primaire cultuur van

humane RPE cellen (Davis et al., 1995).

Doelstellingen 13

2. DOELSTELLINGEN

In het kader van gentherapie wordt gebruik gemaakt van vectoren om therapeutisch DNA te

verpakken, dit ter bescherming en aflevering van het DNA aan de doelcel. Deze vectoren moeten

aan specifieke eigenschappen voldoen om de extra- en intracellulaire barrières te overwinnen. Eén

van de barrières die moet worden overwonnen is de opname (endocytose) van de complexen in de

doelcellen. Hoewel virale vectoren tot nog toe het meest efficiënt zijn, wordt er niettemin veel

onderzoek gedaan naar niet-virale vectoren, zoals polymeren en lipiden, die veiliger zijn en

gemakkelijker te produceren. In deze thesis wordt als niet-virale drager gekozen voor het

bioreduceerbare polymeer cystaminebisacrylamide 4-amino-1-butanol (CBA ABOL). Dit

kationische polymeer kan spontaan complexen vormen van typisch 100 nm groot met plasmide

DNA. Concreet zal de opname onderzocht worden van deze complexen in doelcellen van het

retinaal pigment epithelium (RPE). RPE cellen bevinden zich helemaal achteraan het oog als laatste

cellaag van de retina. Ze zijn een interessant doelwit voor oculaire gentherapie aangezien deze

cellen dikwijls genetische defecten bevatten en tegelijk ook een secretieplatform kunnen zijn van

therapeutisch getransfecteerde eiwitten. In een finale applicatie zou men de gencomplexen kunnen

toedienen via subretinale injectie. De eerstvolgende stappen in het verdere transfectiepad zijn dan

de aanhechting en internalisatie van de complexen in de RPE cellen. Om deze beide aspecten in

detail te kunnen bestuderen, maken we gebruik van een in vitro model-cellijn van het RPE.

Aangezien er veel verschillende endocytotische opnamewegen zijn in een cel willen we o.a.

uitmaken welke van deze opnamewegen door de complexen gebruikt worden om binnen te komen

in de cel. Alvorens we de opname kunnen bestuderen zullen we eerst de complexen karakteriseren

(grootte en oppervlaktelading) en zullen we het transfectie-protocol met deze complexen

optimaliseren (o.a. incubatietijd met de complexen, tijdstip van endosomale vrijstelling en tijdstip

van hoogste transgene expressie). In de feitelijke studie naar de endocytose van de CBA ABOL

pplx. gaan we de strategie hanteren om selectief endocytotische opnamewegen te inhiberen,

enerzijds met chemische inhibitoren, anderzijds met siRNA. Deze zijn gericht tegen eiwitten die

specifiek bij een bepaalde endocytotische opnameweg betrokken zijn. Op die manier zullen we het

aandeel van de verschillende betrokken opnamewegen in de internalisatie van de complexen in RPE

cellen evalueren. In eerste instantie gaan we we controle-experimenten uitvoeren om na te gaan

welke opnamewegen specifiek worden geïnhibeerd door deze moleculen. In tweede instantie zullen

we daadwerkelijk de opname en ook de transfectie-efficiëntie van de complexen bestuderen na

toepassing van deze inhibitie-protocols. Dit zal ons stap voor stap eigenschappen onthullen van de

endocytotische opnameweg(en) die betrokken zijn bij de internalisatie van CBA ABOL-DNA

complexen in RPE cellen.

Materialen en methoden 14

3. MATERIALEN EN METHODEN

3.1 BUFFERS EN MEDIA

Cultuurmedium voor ARPE-19 en D407

- Dulbecco‟s Modified Eagle Medium (DMEM) F12 (Invitrogen, Merelbeke, België)

- 10% Fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen, Merelbeke, België)

- 1% penicilline-streptomycine (100 U/ml Penicillin & 100 μg/ml Streptomycin)

(Invitrogen, Merelbeke, België)

- 1% 2 mM L-glutamine (Invitrogen, Merelbeke, België)

Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer

- 20 mM Hepes (Sigma Aldrich, Bornem, België)

- Breng op pH 7,4 met 4M NaOH (VWR, Leuven, België)

Flow buffer

- 1% Bovine Serum Albumine (BSA) (Sigma Aldrich, Bornem, België)

- 0,1% Natrium azide (Sigma Aldrich, Bornem, België)

- In Phosphate Buffered Saline (PBS) (Invitrogen, Merelbeke, België)

Super broth medium (LB medium) (500ml)

- 2.5g NaCl (Merck, Overijse, België)

- 10g Yeast extract (Lab M Limited, Lancashire, United Kingdom)

- 16g Tryptone (Lab M Limited, Lancashire, United Kingdom)

- 5 ml NaOH (1M) (VWR, Leuven, België)

Acid wash buffer

- 0,2 M ijsazijn (Sigma Aldrich, Bornem, België)

- 0,2 M NaCl (Riedel de Haën, Seelze, Duitsland)

- pH 2,5

HMEM-G+I

- MEM zonder glucose (Invitrogen, Merelbeke, België)

- Hepes gebufferd (20mM) (Sigma Aldrich, Bornem, België)

- 5 mM natriumazide (Sigma Aldrich, Bornem, België)

Back exchange buffer

- HMEM-G+I

- 5% defatted Bovine Serum Albumine (Sigma Aldrich, Bornem, België)

Lysis buffer

- 50 mM Tris base (Sigma Aldrich, Bornem, België)

- 150 mM NaCl (Riedel de Haën, Seelze, Duitsland)


- 1% Triton X-100 (Sigma Aldrich, Bornem, België)

- pH 8

- per 10 ml: 1 tablet protease inhibitoren (Complete mini protease inhibitor tablets, Roche,

Vilvoorde, België)

3.2 CELKWEEK

De cellijnen D407 (University of South Carolina School of Medicine, Columbia, USA) en

ARPE-19 (ATCC LGC Standards, Teddington, UK) worden opgekweekt in cultuurmedium (zie §

3.1) in weefselcultuurflessen. Deze worden in een incubator bij 37°C en 5% CO2 geplaatst.

Om de cellen in cultuur te houden mogen de cellen in principe niet meer dan 80-90% confluent

zijn (dit is wanneer 80-90% van het oppervlak van de weefselcultuurfles is ingenomen door cellen).

Hiervoor worden bijgevolg de cellen losgemaakt en een deel van de cellen overgebracht in een

nieuwe cultuurfles. De procedure begint met een wasstap met PBS zonder Ca2+

en zonder Mg2+

(dit

omdat hierdoor reeds Ca2+

en Mg2+

worden onttrokken van de celadhesiemoleculen zoals de

cadherines die Ca2+

nodig hebben in hun functie) om de dode cellen weg te wassen. Vervolgens

wordt 0,05% trypsine/ 0,02% EDTA (Invitrogen, Merelbeke, België) toegevoegd (EDTA zit hierbij

omdat dit divalente kationen zal onttrekken aan de celadhesiemoleculen waardoor de cellen sneller

los zullen komen) en dit laten we enkele minuten inwerken tot de cellen los zitten. Als de cellen los

zitten wordt de werking van het trypsine stilgelegd door cultuurmedium toe te voegen (trypsine

inhibitoren in serum). In een volgende stap worden de cellen gecentrifugeerd in een swing-out

centrifuge (7 min bij 300g) en geresuspendeerd in een nieuwe hoeveelheid cultuurmedium. Hierna

kan de celconcentratie in deze celsuspensie worden geteld met behulp van trypaanblauw (0,4%,

Sigma Aldrich, Bornem, België) en een Bürker telkamer. Trypaanblauw kan enkel binnendringen in

dode cellen waardoor tijdens deze telling een onderscheid kan worden gemaakt tussen dode en

levende cellen. Na deze telling worden de cellen in een nieuwe cultuurfles gebracht (27000

cellen/cm²) en worden ze opnieuw opgekweekt bij 37°C tot opnieuw een confluente cultuur wordt

bekomen.

3.3 ISOLATIE VAN pDNA

3.3.1 Gebruikte pDNA’s

De pDNA‟s waarmee in deze thesis worden gewerkt zijn het gwiz-GFP plasmide (Aldevron,

Fargo, USA), het EGFPN-1 plasmide (Clontech, Saint-Germain-en-Laye, Frankrijk) en het

pGL4.13 plasmide (Promega, Leiden, Nederland) (Fig. 3.1). Deze eerste twee coderen voor het


green fluorescent proteïn (GFP). De laatste zorgt voor de expressie van luciferase. In elk van de drie

gevallen gaat het hier over reportereiwitten.

FIGUUR 3.1 VERSCHILLENDE PLASMIDEN GEBRUIKT IN DEZE THESIS. A HET GWIZ GFP PLASMIDE,

B HET EGFPN1 PLASMIDE C HET PGL4.13 PLASMIDE. A EN B GEVEN AANLEIDING TOT HET

FLUORESCENTE GFP. C GEEFT AANLEIDING TOT LUCIFERASE, EEN NIET FLUORESCENT EIWIT.

(http://www.genlantis.com/objects/catalog/Product/extras/P040400.pdf,

http://www.pkclab.org/PKC/vector/pEGFPN1.pdf,

http://www.promega.com/catalog/catalogproducts.aspx?categoryname=productleaf_1627&ckt=1)

3.3.2 Opzuivering pDNA

Om grote hoeveelheden pDNA op te zuiveren wordt gebruik gemaakt van Qiafilter plasmid

giga kit (Qiagen, Venlo, Nederland). Hittecompetente DH10B E. coli bacteriën (Promega, Leiden,

Nederland) die getransformeerd zijn met pDNA van interesse worden opgekweekt in LB-medium in

aanwezigheid van het juiste antibioticum (kanamycine (Calbiochem, Nottingham, UK) in geval van

gwiz GFP of EGFPN1 en ampicilline (Duchefa Biochemie, Haarlem, Nederland) in geval van

pGL4.13). Na een nacht incubatie in LB-medium (zie § 3.1) bij 37°C onder constant schudden,

wordt de cultuur gecentrifugeerd (15 min bij 4°C en 6000 × g) waardoor de getransformeerde

bacteriën geconcentreerd in de pellet kunnen teruggevonden worden. Vervolgens worden de

bacteriën geresuspendeerd en gelyseerd met bovenvernoemde kit. Het lysaat dat hierdoor wordt

bekomen, wordt gefilterd om het celdebris te verwijderen van het pDNA dat zich in de waterige

oplossing bevindt. In een volgende stap wordt de waterige oplossing op een kationische kolom

gebracht waarop het pDNA zal worden gebonden. Na enkele wasstappen wordt het pDNA dan van

de kolom gehaald en geprecipiteerd met isopropanol en 70% ethanol. Daarna wordt het pDNA

geconcentreerd in Hepes buffer.

De concentratie van het opgezuiverd pDNA wordt bepaald met behulp van de Biochrom 4060

Spectrofotometer (Pharmacia LKB, Uppsala, Zweden). Hiervoor wordt een 1/50 verdunning

gemaakt van het pDNA in Hepes buffer en wordt de absorbantie gemeten bij 260 nm. Daarna kan

de concentratie worden berekend aangezien een absorbantie van 1 bij 260 nm overeenkomt met 50


µg dubbelstrengig DNA per ml. De opgezuiverde pDNA oplossing wordt vervolgens aangelengd

met Hepes buffer tot een concentratie van 1 µg/µl.

3.4 OPZUIVERING VAN MRNA

De opzuivering begint met het extra opzuiveren van plasmide DNA m.b.v. QIAquick PCR

purification kit (Qiagen, Venlo, Nederland). Hiervoor wordt kortweg telkens 12 µg plasmide

(pGEM4Z-GFP-A64 voor GFP) per kolommetje gebonden, gewassen en geëlueerd in 30 µl

nuclease vrij water (Applied Biosystems/Ambion, Austin, USA).

In de volgende stap wordt het pDNA overnacht gelineariseerd bij 37°C. Hiervoor wordt 28 µl

van de pDNA oplossing, na de beschreven opzuivering, 6 µl nucleasevrij water, 4 µl appropriate

buffer en 2 µl restrictie enzym (Spel voor GFP plasmide) samengevoegd. Hierna wordt het

gelineariseerde pDNA opnieuw opgezuiverd met de QIAquick PCR purification kit. Hierna wordt

het gelineariseerde pDNA opnieuw opgezuiverd met de hierboven beschreven QIAquick PCR

purification kit en finaal geresuspendeerd in 20 µl nuclease vrij water. Ter desactivatie van RNasen

wordt er nog 1 U/µl RNase inhibitor toegevoegd.

Tenslotte volgt de eigenlijke productie van in vitro overgeschreven mRNA. Daarvoor wordt

gebruik gemaakt van de T7 mMessage kit for in vitro transcription of capped mRNA (Applied

Biosystems/Ambion, Austin, USA). In een eerste stap wordt 6 µl buffer, 30 µl nucleotide mix, 10 µl

nucleasevrij water, 9 µl gelineariseerd plasmide (cfr. vorige paragraaf) en 5 µl T7 RNA polymerase

samengevoegd en gedurende 3u geïncubeerd bij 37°C. Vervolgens wordt er 3 µl DNase toegevoegd

voor 10-15 min, waarna het mRNA wordt geprecipiteerd door toevoeging van 30 µl nucleasevrij

water en 25 µl LiCl precipitation solution en een 2u durende incubatie bij -20°C. Na

centrifugatie (15 min bij 4°C aan 14000rpm) wordt het supernatans verwijderd en wordt de mRNA

pellet gewassen met 1 ml 70% ethanol. Tenslotte wordt de mRNA pellet geresuspendeerd in

nucleasevrij water met 1 U/ml RNase inhibitor tot een concentratie van 1 µg/µl (abs260=1 ~40 µg/ml

enkelstrengig mRNA).

3.5 FLUORESCENT MERKEN VAN DNA: LABELLING MET YOYO®-1 IODIDE

“YOYO®-1 iodide (excitatie = 491, emissie = 509, Invitrogen, Merelbeke, België) behoort tot

de dimere cyanine kleurstoffen. Het heeft een zeer hoge affiniteit voor de nucleïnezuren en toont na

intercalatie (stabiele interactie) in dubbelstrengige nucleïnezuren 100 tot 1000 keer meer

fluorescentie. Voor het fluorescent merken van het pDNA wordt YOYO®-1

toegevoegd aan het

DNA in een verhouding van 1 molecule per 10 baseparen gedurende 1u. Voor het maken van 10 μg

gemerkt pDNA komt dit praktisch overeen met het toevoegen van 50 μl 0,2 μg/μl pDNA bij 150 μl


10 μM YOYO®-1 oplossing.” (Kennis, 2008) In een volgende stap wordt het gelabelde pDNA

opgezuiverd van niet geïntercaleerd YOYO®-1 iodide. Dit doen we door 0,1 volumes 5 M NaCl

(Riedel de Haën, Seelze, Duitsland) en 2 volumes ijskoude ethanol (100%) (Sigma Aldrich,

Bornem, België) toe te voegen aan het YOYO®-1 pDNA mengsel. Dit mengsel wordt dan 30 min

bij -80°C geplaatst en dan 10 min afgecentrifugeerd bij 14000 rpm. De pellet van fluorescent

gelabeld DNA wordt geresuspendeerd met Hepesbuffer (zie § 3.1) tot een concentratie van 1 µg/µl.

3.6 AANMAAK VAN GENCOMPLEXEN

3.6.1 Aanmaak van CBA ABOL complexen

De CBA ABOL polyplexen worden spontaan gevormd door elektrostatische

aantrekkingskrachten wanneer we het pDNA of mRNA en het kationische CBA ABOL polymeer

(Research Group on Polymer Chemistry and BioMaterials, universiteit van Twente, Nederland)

samenbrengen in Hepes buffer. In de praktijk komt het erop neer dat we 100 µl CBA ABOL

stockoplossing (5 mg/ml) verdunnen in 733 µl Hepes buffer. Het pDNA of mRNA wordt 20 maal

verdund in Hepes (10 µl pDNA of mRNA stockoplossing van 1 µg/µl wordt toegevoegd aan 190 µl

Hepes). In een volgende stap wordt 800 µl van de polymeerverdunning toegevoegd aan de pDNA

of mRNA oplossing, er wordt 10 seconden gevortext en daarna laten we de polyplexen zich

gedurende 30 minuten vormen. Om polyplexen fluorescent te merken wordt er gebruik gemaakt van

pDNA dat YOYO®-1 is gelabeld.

3.6.2 Aanmaak van siRNA lipoplexen

TABEL 3.1 OVERZICHT VAN SEQUENTIE VAN GEBRUIKTE SIRNA’S. ALLE SIRNA‟S WERDEN

GELEVERD DOOR DHARMACON, LAFAYETTE, USA BEHALVE PGL3 DAT WERD GELEVERD DOOR

EUROGENTEC, SERAING, BELGIË

siRNA

tegen

Sequentie siRNA

tegen

Sequentie

CHC UAAUCCAAUUCGAAGACCAAU FLO1 AGAUGCACGGAUUGGAGAA

CAV1 CUAAACACCUCAACGAUGA

GCAAAUACGUAGACUCGGA

GCAGUUGUACCAUGCAUUA

GCAUCAACUUGCAGAAAGA

DNM2 GGCCCUACGUAGCAAACUA

GAGAUCAGGUGGACACUCU

CCGAAUCAAUCGCAUCUUC

GAGCGAAUCGUCACCACUU

pGL3 CUUACGCUGAGUACUUCG

In deze thesis wordt gebruik gemaakt van 4 verschillende siRNA‟s tegen 4 verschillende

proteïnen die een belangrijke rol spelen in de endocytotische processen in een cel. Deze zijn


clathrine heavy chain (CHC), caveoline-1 (CAV1), dynamine-2 (DNM2) en flotilline-1 (FLO1).

Voor de siRNA‟s CAV1 en DNM2 wordt gebruik gemaakt van een pool met 4 sequenties, terwijl

voor de andere een specifieke sequentie wordt besteld. Voor de negatieve en positieve controles

wordt gebruik gemaakt van het siRNA pGL3. Dit siRNA heeft luciferase als target wat niet in deze

cellen voorkomt en kan dan ook als mock gebruikt worden.

Voor de productie van siRNA complexen wordt gebruik gemaakt van RNAiMAX

Lipofectamine (Invitrogen, Merelbeke, België). Eerst wordt 7 µl RNAiMAX verdund in 243 µl

OptiMEM. Dit laten we 10 min incuberen bij kamertemperatuur. Ondertussen verdunnen we de

siRNA stock (50 µM) in OptiMEM zodat in totaal 250 µl wordt bekomen. Hoeveel siRNA gebruikt

wordt hangt af van de concentratie die we op de cellen wensen aan te brengen. Voor de

downregulatie van CHC wordt een concentratie van 50 pmol per well in een 6 well plaat gebruikt

(uiteindelijke concentratie in de well = 16.6 nM). Voor de downregulatie van CAV1, DNM2 en

FLO1 wordt een concentratie van 150 pmol per well in een 6 well plaat gebruikt. Voor de negatieve

en positieve controles wordt gebruik gemaakt van mock siRNA (pGL3) bij een concentratie van 50

pmol. De siRNA verdunning wordt aan de RNAiMAX toegevoegd en er wordt zacht op en neer

gepipetteerd. Dit laten we 20 tot 30 min incuberen bij kamertemperatuur.

3.6.3 Aanmaak van DNA lipoplexen

Voor de productie van lipoplexen (lplx.) wordt gebruik gemaakt van Lipofectamine 2000

(Invitrogen, Merelbeke, België). De Lipofectamine 2000 wordt eerst 1:25 verdund in OptiMEM

(Invitrogen, Merelbeke, België). Dit laten we dan 5 min incuberen bij kamertemperatuur zoals

beschreven in de instructies van de producent. Ondertussen wordt het pDNA 1:50 verdund in

OptiMEM. Vervolgens wordt 750 µl Lipofectamine verdunning bij 750 µl pDNA verdunning

gevoegd en wordt het geheel 20 min geïncubeerd bij kamertemperatuur. De complexen zijn tot 6u

na aanmaak stabiel.

3.6.4 Aanmaak van lPEI DNA complexen

Voor de aanmaak van lPEI complexen maken we gebruik van het commerciële Exgen 500

(Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Duitsland). Eerst wordt 5 µl pDNA stock oplossing (1 µg/µl)

toegevoegd aan 495 µl 150 mM NaCl. Dit wordt vervolgens zeer goed gemengd. Daarna wordt 19,8

µl Exgen 500 toegevoegd aan deze pDNA verdunning. We vortexen 10 sec en laten het geheel 10

min staan bij kamertemperatuur voor gebruik.


3.7 KARAKTERISATIE VAN GENCOMPLEXEN MET BEHULP VAN DYNAMISCHE

LICHTVERSTROOIING

3.7.1 Bepaling van de deeltjesgrootte

“DLS of „Dynamic Light Scattering‟ is een techniek waarmee men de grootte van nanopartikels

kan meten. Het principe van DLS steunt op het verband tussen de hydrodynamische diameter van

de nanopartikels en de snelheid van hun Brownse beweging. Hoe kleiner een deeltje is, hoe sneller

zijn Brownse beweging zal zijn. Als een laserstraal (633 nm, He-Ne laser, vermogen tot 2 mW)

door de suspensie van nanoscopische partikels wordt gestuurd, dan gaan de partikels in het staal het

licht verstrooien, waardoor de detector (Avalanche Photodiode), die het verstrooide licht onder een

hoek van ongeveer 160° waarneemt, fluctuaties in lichtintensiteit meet. De frequentie van deze

fluctuaties, wordt bepaald door de snelheid waarmee de deeltjes doorheen de laserstraal passeren en

door de snelheid van hun Brownse beweging. Deze is niet alleen afhankelijk van de

hydrodynamische diameter van de nanopartikels maar ook van de viscositeit, dichtheid en

temperatuur van het medium. Vervolgens wordt er een autocorrelatiecurve opgesteld waaraan een

vergelijking wordt gefit waaruit vervolgens de diffusiecoëfficiënt kan berekend worden. De

hydrodynamische diameter wordt uiteindelijk berekend aan de hand van de Stokes-Einstein

vergelijking:

Waarin d(H) = hydrodynamische diameter (m), k = constante van Boltzmann (1,38 . 10-23 JK-1), T

= temperatuur (K), η = viscositeit (Pa.s) en D = diffusiecoëfficiënt (m²/s).” (Kennis, 2008)

De gemiddelde hydrodynamische diameter wordt bepaald met de Zetasizer Nano ZS (Malvern,

Worcestershire, UK). Alle voorbereidingen gebeuren in een laminaire airflow kast omdat eventueel

stof in de suspensie ook licht verstrooit, hetgeen aanleiding zou geven tot foutieve resultaten. Voor

de bepaling van de grootte van de CBA ABOL polyplexen worden deze onverdund na aanmaak in

Hepes gemeten.

3.7.2 Bepaling van de zeta potentiaal

De zeta potentiaal is de maat voor de oppervlaktelading van de partikels. De eerste laag van

ionen rond een partikel, die men de Stern laag noemt, is een laag van ionen die zeer sterk op het

oppervlak van het partikel zijn gebonden. De volgende laag is een meer diffuse laag waarbij de

ionen niet zeer sterk gebonden zijn. In deze laag blijft de netto hoeveelheid ionen wel steeds gelijk.

De ionen binnen deze lagen bewegen mee met het partikel. De ladingspotentiaal die heerst op deze

tweede laag noemt men de zeta potentiaal. De grootte van de zeta potentiaal geeft de mate weer van


stabiliteit van het partikel in een colloïdale oplossing. Als partikels een grote zeta poteniaal hebben

zal er minder neiging zijn tot flocculatie van de partikels.

De zeta potentiaal wordt gemeten met Zetasizer Nano ZS (Malvern, Worcestershire, UK). Met

het toestel wordt de elektroforetische mobiliteit van de partikels gemeten. Dit is de snelheid van de

partikels wanneer een elektrisch veld wordt aangelegd.

Over de 2 elektroden in de zetacel wordt een potentiaal aangebracht. Hierdoor gaan de partikels

bewegen naar de pool met de omgekeerde lading (+ partikels bewegen naar de – pool). Vervolgens

wordt er laserlicht door het staal gestuurd. Het licht zal door de partikels verstrooid worden onder

een hoek van 17° en zo op de detector terecht komen. De intensiteit van het verstrooide licht zal

fluctueren waarbij de frequentie van de fluctuaties afhankelijk is van de snelheid van de deeltjes. Zo

wordt de elektroforetische mobiliteit bepaald en kan de zeta potentiaal worden berekend. Ook hier

wordt het staal voorbereid in een laminaire airflow kast om stof te vermijden.

3.8 TRANSFECTIE MET DE GENCOMPLEXEN EN AAV

3.8.1 Transfectie met CBA ABOL polyplexen

400 µl complexoplossing (zie § 3.6.1) (met gwiz GFP pDNA, voor de negatieve controle

pGL4.13 pDNA) wordt toegevoegd aan 1600 µl OptiMEM wanneer wordt getransfecteerd in een 6

well plaat. Na 2u worden de complexen weggewassen en wordt er cultuurmedium op het plaatje

gebracht. Na 24u wordt de transfectie uitgelezen met de flow cytometer (zie § 3.10). Hierbij wordt

de cel-geassocieerde fluorescentie van 30000 cellen gemeten. De drempelwaarde voor deze emissie

wordt via de negatieve controle ingesteld op 0,5%. Er kan van cellen die een hogere fluorescentie

vertonen dan deze drempelwaarde met 99,5% zekerheid gezegd worden dat deze een significant

hogere fluorescentie vertonen dan de negatieve controle. Fluorescentie wordt als een maat voor

transfectie gezien daar het GFP enkel wordt aangemaakt in cellen waarvan het plasmide tot in de

kern in geraakt en dit de essentie van transfectie is. Voor transfectie wordt dan ook steeds het

genormaliseerde % fluorescente cellen uitgezet omdat dit een maat is voor het aantal cellen dat GFP

aanmaakt en positief getransfecteerd is.

3.8.2 Transfectie met siRNA lipoplexen

500 µl lipoplexen (zie § 3.6.2) worden toegevoegd aan 2,5 ml cultuurmedium op de cellen in

een 6 well plaat. Er worden ook steeds cellen getransfecteerd met pGL3 siRNA want deze zullen

worden gebruikt als positieve en negatieve controle. Na 4u incubatie wordt er cultuurmedium op de

cellen gebracht. Na 24u worden de cellen gesplitst in nieuwe wells (1/3 van de oorspronkelijke well


wordt in een nieuwe well gedaan) omdat er anders een te hoge confluentie is voor de verdere

experimenten. 48u na transfectie kunnen experimenten worden aangevat.

3.8.3 Transductie met AAV

5 µl van de adeno geassocieerd virus (AAV) stock oplossing (109

PFU/ml) wordt samen met 2

ml OptiMEM op de cellen gebracht (in deze studie wordt dit op cellen gebracht die behandeld zijn

met siRNA). Het gaat hier om AAV met GFP in de cassette. Dit laten we 2u incuberen en

vervolgens wordt het AAV weggewassen en wordt er cultuurmedium op de cellen gebracht. Na 24u

worden de cellen losgemaakt en volgt analyse met de flow cytometer.

3.9 MICROSCOPIE

3.9.1 Transmissie microscopie: DIC

Differentiële interferentie contrastmicroscopie (DIC) zorgt ervoor dat er via microscopie een

driedimensionaal beeld wordt bekomen. Er wordt gebruik gemaakt van gepolariseerd licht, dat door

het staal wordt gestuurd. Afhankelijk van het medium waardoor het licht wordt gestuurd wordt het

licht gedraaid en valt het onder een andere hoek op de detector waardoor een 3D beeld wordt

bekomen. Het staal mag zich niet op plastiek bevinden want dit zal het licht depolariseren. DIC zal

ervoor zorgen dat een licht beeld van de te visualiseren structuur zal worden bekomen op een

donkere achtergrond, dit door het verschil in brekingsindex van de verschillende structuren in het

staal.

3.9.2 Confocale fluorescentie microscopie

“Confocale laser scanning microscopie (CLSM) is een vorm van fluorescentiemicroscopie waar

gebruik wordt gemaakt van een laser puntbron. Het van de laser afkomstige excitatielicht wordt via

een dichroïsche spiegel naar de objectieflens gestuurd en door deze laatste gefocusseerd in het staal

(Fig. 3.2). De fluorescente moleculen in het focuspunt worden zo sterk geëxciteerd, terwijl de

moleculen buiten het focuspunt veel minder intens belicht worden. Vanuit het focuspunt wordt

daarom de grootste hoeveelheid fluorescent licht geëmitteerd. Dit emissielicht wordt in alle

mogelijke richtingen uitgestuurd en een deel ervan zal doorheen de objectieflens terug de

dichroïsche spiegel bereiken. Deze dichroïsche spiegel wordt zo gekozen dat het emissielicht, in

tegenstelling tot het excitatielicht, niet gereflecteerd wordt, maar doorgelaten wordt in de richting

van de detector (een foto multiplier tube). De detector bevindt zich net achter een pinhole, waardoor

emissielicht dat afkomstig is van boven of onder het focusvlak in het staal (out-of-focus

emissielicht) tegengehouden wordt. De focus van dit licht zal namelijk voor of achter de pinhole


liggen zodat slechts een kleine fractie van dit licht doorheen de pinhole kan. Door de laserstraal in

een rasterpatroon te laten scannen wordt uiteindelijk een volledig 2D beeld van het staal gevormd.”

(De Visschere, 2007) Op deze manier wordt een fluorescentie-beeld bekomen met verhoogd

contrast, vergeleken met een conventionele epifluorescentie-microscoop. Bijkomend wordt het dan

mogelijk om op verschillende dieptes optische secties te nemen, loodrecht op het lichtpad van de

microscoop en deze te reconstrueren tot 3D-informatie.

FIGUUR 3.2 PRINCIPE VAN CLSM. EXCITATIELICHT

VAN DE LASER KOMT VIA EEN DICHROÏSCHE SPIEGEL

TOT BIJ HET STAAL. DEZE STUURT EMISSIELICHT UIT

DAT VIA DE OBJECTIEFLENS EN DE DICHROÏSCHE

SPIEGEL DOOR EEN PINHOLE OP DE DETECTOR VALT.

(KENNIS, 2008)

“In de beschreven experimenten wordt gebruik gemaakt van een C1 CLSM (Nikon,

Amstelveen, Nederland), uitgerust met een argon-ion laser die verantwoordelijk is voor de 488 nm

laser-excititatie-lijn en drie vaste-stof lasers die verantwoordelijk zijn voor excitatie-lijnen van 407

nm, 561 nm en 638 nm.” (Kennis, 2008) Voor de microscopie experimenten worden de cellen per

200000 uitgezaaid in collageen gecoate (fungeert als pseudo-extracellulaire matrix) MatTek

coverslip (1,5)-bottom petridishes (MatTek corporation, MA, USA) waarvan de bodem bestaat uit

een dekglaasje met optische karakteristieken die compatibel zijn met de hoger resolutie

microscopie-objectieven.

3.9.3 Fixatie van cellen

Als we de toestand van een cel willen vastleggen of het intracellulair transport willen stoppen

gaan we de cel fixeren door de eiwitten te crosslinken (dit met paraformaldehyde (Sigma Aldrich,

Bornem, België)) of door de eiwitten te precipiteren (dit met methanol (Fiers, Kuurne, België)).

Hiervoor worden de cellen eerst gewassen met PBS+ (Invitrogen, Merelbeke, België) en vervolgens

gefixeerd met 3% paraformaldehyde (15 min) of 99,85% methanol (5 min). Hierna wordt weer

gewassen met PBS+ en wordt een mounting medium op het draagglaasje aangebracht (Pro Long

Gold with Dapi (Invitrogen, Merelbeke, België)) “Dit mounting medium zorgt voor de bescherming

van de fluorescentie en een minimalisering van sferische abberaties doordat de refractieve index

van het mounting medium ongeveer dezelfde is als die van glas en de immersie olie.” (Kennis,

2008)


3.9.4 Fluorescent kleuren van actinenetwerk in adherente cellen

Cellen, uitgezaaid in MatTek collageen gecoate petridishes worden gefixeerd met 3%

paraformaldehyde (zie § 3.9.3). Daarna worden ze geïncubeerd met 50 mM NH4Cl (Sigma Aldrich,

Bornem, België) gedurende 10 min om de overblijvende reactieve eindstandige aldehydegroepen te

inactiveren. Er wordt dan gewassen met PBS+ en 5 min geïncubeerd met 0,2% Triton X-100 (Sigma

Aldrich, Bornem, België) ter permeabilisatie. We wassen opnieuw met PBS+ en voegen Image-iT

FX Signal Enhancer (Invitrogen, Merelbeke, België) toe aan elke petridish voor 30 min om

signaal/ruis verhouding te doen dalen zodat cellulaire doelen beter kunnen worden gevisualiseerd

(http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&entryPoint

=adirect&productID=I36933&messageType=catProductDetail). Hierna worden de cellen in de

petridish voor 30 min geïncubeerd met een 165 nM oplossing in PBS+ van AF488-gelabelde

falloïdine (Invitrogen, Merelbeke, België). Daarna wordt er gewassen met PBS+

en een mounting

medium op het draagglaasje aangebracht.

3.10 FLOW CYTOMETRIE

3.10.1 Principe

“Flow cytometrie (flow: cellen in beweging, cyto: cellen, metry: meting) is een techniek voor

het tellen, bestuderen en sorteren van cellen. Praktisch wordt de celsuspensie opgezogen in een

capillair en door middel van een snelstromende sheat buffer verdund in een volgend capillair,

waardoor de cellen één voor één tegen een hoge snelheid (tot 3000 cellen per seconde) een laser-

lichtbundel passeren die loodrecht staat op het capillair. Enerzijds zal het laserlicht verstrooid

worden door de voorbijstromende cel (hetgeen resulteert in de voorwaartse en de zijwaartse

verstrooiing). Voorwaartse lichtverstrooiing (FS) is gecorreleerd aan de grootte van de cellen en de

zijwaartse verstrooiing (SS) aan de granulariteit van de passerende cel. Aan de hand van een

scatterplot, waarin SS wordt uitgezet in functie van FS, kan men specifiek selecteren naar de cellen

die een verwachte FS en SS vertonen, in overeenstemming met de controle-populatie. Anderzijds

zal het laserlicht aanwezige fluorochromen kunnen exciteren. Het strooilicht en het emissielicht,

afkomstig van de geëxciteerde fluoroforen, worden waargenomen door afzonderlijke fotogevoelige

detectoren. Bijgevolg kunnen, per cel, tezelfdertijd meerdere fysische en biochemische

karakteristieken gemeten worden. In dit werk wordt gebruik gemaakt van een Flow-cytometer van

de Cytomics FC500 Series (Beckman Coulter, Woerden, Nederland), uitgerust met een Argon-ion

laserlijn (488 nm) en met 5 verschillende detectiekanalen (525/15, 620, 675 en 755 nm).” (Kennis,

2008)


3.10.2 Analyse met de flow cytometer

Om de cel-geassocieerde fluorescentie te meten van een populatie cellen worden de cellen uit

de 6 well platen getrypsiniseerd met 500 μl 0,25% trypsine/EDTA (Invitrogen, Merelbeke, België)

totdat de cellen gesuspendeerd zijn. Dit trypsine wordt geïnactiveerd met 3 ml cultuurmedium. De

cellen worden 7 min gecentrifugeerd bij 300 g en de pellet wordt geresuspendeerd in 250 μl koude

flow buffer (zie § 3.1). Deze moet alle energetische processen stilleggen, omwille van de lage

temperatuur en omwille van de inhibitie van de mitochondriale respiratie door natriumazide. Bij

ieder experiment moet ook steeds een negatieve controle worden meegenomen (d.i. de

fluorescentie-achtergrondwaarde die van alle metingen wordt afgehouden of de distributie waarop

de drempelwaarde wordt gedefinieerd voor siginificant fluorescente cellen; die drempelwaarde is

dan de fluorescentiewaarde waarbij 0,5% van de populatie cellen in de negatieve controle een

fluorescentiewaarde bezitten, hoger dan deze drempelwaarde). Ook wordt een positieve controle

(dit zijn cellen die niet behandeld worden (geen inhibitor/siRNA)) meegenomen. Van elk staal

wordt de forward scatter, back scatter en emissie bij 525 nm gemeten van 30000 cellen. (Kennis,

2008)

3.11 KWANTIFICATIE VAN DE HOEVEELHEID GEÏNTERNALISEERDE

GENCOMPLEXEN MET FLOW CYTOMETRIE

3.11.1 Incubatie met gencomplexen

Voor de kwantificatie van de hoeveelheid opgenomen gencomplexen in de cellen wordt

gebruik gemaakt van flow cytometrie. We zaaien de cellen 1 dag op voorhand uit in een 6 well plaat

aan 150000 cellen per well. Na 24u worden de cellen gewassen en wordt 1600 µl serumvrij medium

(OptiMEM; Invitrogen, Merelbeke, België) op de cellen gebracht. Hieraan wordt dan 400 µl CBA

ABOL YOYO®-1 gelabeld pDNA complexen toegevoegd. We laten de polyplexen gedurende 2u op

de cellen en daarna worden de polyplexen weggewassen. Als negatieve controle worden cellen op

ijs voor 2u geïncubeerd met de polyplexen. Vervolgens wordt er gequencht (zie § 3.11.2).

3.11.2 Verwijdering van aan de plasmamembraan geassocieerde gencomplexen: quenchen

“Omdat er een significante hoeveelheid kationische gencomplexen ten gevolge van

elektrostatische interacties geassocieerd zijn met de negatief geladen proteoglycanen op de

plasmamembraan, maar niet zijn opgenomen door de cel, moeten we ervoor zorgen dat deze fractie

niet wordt geregistreerd tijdens de fluorescentiemetingen. Hiervoor worden de cellen die een

bepaalde tijd zijn blootgesteld aan de YOYO®-1 gencomplexen gewassen met PBS en gedurende 5

min geïncubeerd met een trypaanblauw oplossing (0,2% in PBS-) (Sigma Aldrich, Bornem, België),


een procedure die men quenchen noemt. Quenchen zal ervoor zorgen dat de fluorescentie van de

YOYO®-1 complexen die aan de membraan hangen, wordt uitgedoofd. Trypaanblauw absorbeert

selectief het emissielicht van de YOYO®-1 gemerkte plasmiden in de CBA ABOL polyplexen die

niet zijn opgenomen door de cellen, want deze hydrofiele molecule kan niet door de

plasmamembraan van levende cellen diffunderen. Op die manier wordt de resterende cel-

geassocieerde fluorescentie louter veroorzaakt door de geïnternaliseerde complexen. Na quenching

wordt het trypaanblauw weggewassen met 2 ml PBS- en worden de cellen geanalyseerd met flow

cytometrie (zie § 3.10).” (Kennis, 2008)

3.12 BEHANDELING MET INHIBITOREN

Om te weten te komen via welke endocytotische opnameweg de polyplexen binnenkomen in de

cel worden experimenten uitgevoerd met inhibitoren die bepaalde opnamewegen stil zullen leggen.

Voor deze studies worden er volgende concentraties en incubatietijden gebruikt om voldoende

inhibitie te hebben zonder dat er hoge toxiciteit optreedt voor de cellen. Alle inhibitoren werden

aangekocht bij Sigma Aldrich, Bornem, België behalve cytoD dat werd aangekocht bij Biosource,

Nivelles, België.

TABEL 3.2 OVERZICHT VAN CONCENTRATIE EN INCUBATIETIJD GEBRUIKT BIJ EXPERIMENTEN

MET INHIBITOREN.

Inhibitor Concentratie Incubatietijd (u)

Chlorpromazine 15 µg/ml 2

Genisteïne 400 µM 2

cytoD 5 µg/ml 1

Dynasore 80 µM 0.5

Nocodazol 10 µg/ml 1

Bafilomycine A1 200 nM 1

mBCD 3 mM 2

3.13 ACID WASH

Om aan de plasmamembraan gebonden transferrine (hTf) te verwijderen wordt een acid wash

uitgevoerd (Sonnichsen et al., 2000). Dit houdt in dat de cellen eerst tweemaal worden gewassen

met koude HMEM-G+I (zie § 3.1), daarna 1 min met koude acid wash buffer (zie § 3.1) worden

geïncubeerd en dan nog tweemaal worden gewassen met koude HMEM-G+I. Vervolgens wordt de

cel geassocieerde fluorescentie van 30000 cellen gemeten met FC, wat een maat is voor de

resterende werking van CDE.


3.14 BACK EXCHANGE

Na incubatie met 0,15 mM Bodipy® LacCer BSA complex (Invitrogen, Merelbeke, België)

ondergaan alle cellen een back exchange behandeling, om plasmamembraan gebonden, niet

geïnternalseerde LacCer weg te wassen (Marks et al., 2005). Hierin worden de cellen 1x gewassen

met HMEM-G+I bij 4°C en 6x voor 10 min bij 4°C met back exchange buffer (zie § 3.1). Tenslotte

wordt de cel geassocieerde fluorescentie van 30000 cellen gemeten met FC, wat een maat is voor de

resterende werking van CIE. Alle experimenten worden in drievoud uitgevoerd.

3.15 BCA PROTEIN CONTENT TEST

Om het gehalte aan proteïnen in een celsuspensie, waarin men a.h.v. Western Blot bepaalde

eiwitten wil detecteren, te bepalen wordt gebruik gemaakt van BCA Protein Assay Kit (Thermo

Scientific, Waltham, USA). Eerst worden cellen uit een 6 well plaat gelyseerd met 300 µl lysis

buffer (zie § 3.1). Dit laten we 5 min op ijs incuberen. Daarna wordt het lysaat overgebracht in een

eppje en afgecentrifugeerd (13000g, gedurende 10 min bij 4°C). Het supernatans wordt

overgebracht in een nieuw eppje. Voor de BCA test wordt van dit supernatans 25 µl overgebracht in

een 96 well plaat voor absorbantie metingen. Hieraan wordt 200 µl mastermix (50 volumes reagens

A uit de kit met 1 volume reagens B) toegevoegd. Dit wordt gedurende 30 min bij 37°C

geïncubeerd. Na afkoelen wordt de absorbantie gemeten bij 590 nm met een Victor wallac plate

reader.

Resultaten en discussie 28

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE

4.1 KARAKERISERING VAN CBA ABOL POLYPLEXEN

Alvorens te beginnen met de experimenten met inhibitoren en siRNA moeten we zeker zijn dat

de complexen de juiste eigenschappen hebben na vergelijking met voorgaande studies (Lin et al.,

2007). Daarom gaan we eerst na of de grootte en de zeta potentiaal voldoen aan de verwachtingen.

Afgaande op deze voorgaande studies verwachten we een grootte van 120 nm en een zeta potentiaal

van 40 mV. Deze testen moeten telkens worden uitgevoerd als er een nieuwe batch CBA ABOL

polymeer in gebruik wordt genomen omdat we er zeker van moeten zijn dat het polymeer steeds

hetzelfde gedrag vertoont bij complexatie.

4.1.1 Bepaling van de deeltjesgrootte m.b.v. DLS

Allereerst wordt de deeltjesgrootte bepaald van CBA ABOL complexen waarin

OPHELDERING VAN DE OPNAMEWEGEN VAN CBA ......AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de...

Documents

Transcript of OPHELDERING VAN DE OPNAMEWEGEN VAN CBA ......AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de...