Ontwikkeling van een snelle LC-MS/MS methode voor het ...

Vakgroep Organische Chemie Onderzoeksgroep: Scheidingstechnieken

Ontwikkeling van een snelle LC-MS/MS methode voor het bestuderen van tryptofaan-depletie bij

patiënten met een chronische inflammatoire darmziekte

Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door

Pieter - Jan Sabbe

Academiejaar 2009-2010

Promotor: prof. dr. Patrick Sandra Copromotor: dr. Frédéric Lynen

Begeleider: Vivienne Malanchin

WOORD VOORAF

“Welcome to the exciting world of chemistry ...”, herinner ik me als de eerste woorden

die ik las toen ik 5 jaar geleden aan deze studie begon. ‘Exciting’ is deze trip doorheen

de wondere wereld der wetenschap op de Sterre zeker en vast geweest. Het is een periode

geweest van vallen en opstaan, een periode waar obstakels niet vreemd waren en waar wat

doorzettingsvermogen vereist was. Dit alles heeft geholpen tot het vormen van mezelf als

wetenschapper, maar ook als jongvolwassene ...

Graag zou ik Prof. Dr. P. Sandra, mijn promotor, bedanken voor de geboden kans om

deze thesis te kunnnen vervolmaken in zijn onderzoeksgroep.

Speciale dank aan de dienst gastro-enterologie van het UZ Gent, o.l.v. Dr. Harald Peeters,

voor het voorzien van de nodige plasmamonsters, die onontbeerlijk waren in het tot stand

komen van deze scriptie.

Frederic zou ik hartelijk willen bedanken voor zijn grote hoeveelheid geduld, zijn vele

verbeterwerk en zijn talloze antwoorden op mijn evenvele vragen.

Vivienne, grazie tante! Senza il tuo aiuto e i tuoi consigli, non avrei potuto scrivere questa

tesi.

Thomas voor zijn geweldige introductie in de wondere wereld van ‘den 2000’ en voor zijn

hoog rots-in-de-branding gehalte op het vlak van troubleshooting ervan.

i

I would also like to thank Kai for his elaborate work and extensive help he gave me on

statistics and chemometrics.

Seppe, Barbara en Julia, mijn lotsgenoten in het PARC. Bedankt voor de vele ontspanning

voor, tijdens en na de inspanning. Bedankt voor alles, Gracies per tot!

Graag zou ik alle andere collega’s van het PARC bedanken voor de fijne tijd gedurende

het ganse jaar.

Deze scriptie vormt niet enkel en alleen het sluitstuk van mijn studie, maar vormt ook het

eindpunt van een heel spannende periode als ‘student in Gent’. Ik zou mezelf niet zijn

indien ik hierbij sommige mensen niet zou bedanken.

De musketiers: Stijnie, Driesken, Tom en Montie. Bedankt voor de ongelofelijke periode

samen op de Sterre!

Gel, bro in crime, voor de vele LEGEN — wait for it — DARY nights in Gent!

Bobon als mijn vaste vriendin op donderdagavond!

Zus, Koenraad en de rest van mijn familie en vrienden voor hun onvoorwaardelijke steun.

Merci!

Als laatste, en evenzeer de belangrijkste, zou ik graag mijn ouders bedanken voor de

geboden kans om deze periode te mogen meemaken. Mama en Papa, zonder jullie zou me

dit nooit gelukt zijn! Bedankt voor alles!

The end is not near, it’s here!

Gent 20 mei 2010

ii

INHOUDSOPGAVE

Inleiding en doelstelling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v

1 Fundamentele aspecten van de chromatografie 3

1.1 Het begrip ‘Chromatografie’ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 Geschiedenis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3 Het chromatografisch proces . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.3.1 Differentiele migratie: schotelmodel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.3.2 Resolutie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.3.3 Bandverbreding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.4 Instrumentele aspecten van HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

1.5 Massaspectrometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.5.1 Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.5.2 Theoretische en instrumentele aspecten van LC-MS/MS . . . . . . . 25

2 Statistiek en chemometrie 35

2.1 Standaarddeviatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.2 Relatieve standaarddeviatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.3 Detectielimiet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.4 Significantie: de t-toets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.5 Principale componenten analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

iii

INHOUDSOPGAVE

2.6 Kleinste-kwadraten regressie (PLS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3 Literatuurstudie 43

3.1 Inleiding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.1.1 De ziekte van Crohn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.1.2 Colitis ulcerosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.2 Pathogenese van IBD. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.3 Tryptofaan-depletie en vermoeidheid bij IBD: een oorzakelijk verband? . . 48

3.3.1 Tryptofaan-depletie bij verhoogde IDO-activiteit . . . . . . . . . . . 49

3.3.2 Emotionele gevolgen van tryptofaan-depletie . . . . . . . . . . . . . 50

3.4 Chromatografische bepaling van tryptofaan en kynurenine: een overzicht. . 51

3.4.1 Gaschromatografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.4.2 Vloeistofchromatografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.4.3 Detectie van tryptofaan en kynurenine. . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.4.4 Monstervoorbereiding en kwantificatie. . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

4 Experimenteel Gedeelte 57

4.1 Algemene Experimentele Aspecten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.1.1 Chemicalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.1.2 Instrumentatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.1.3 Veiligheidsaspecten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.1.4 Ethische commissie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.2 Optimalisatie van de scheiding van de analieten op een Kinetex kolom. . . . 58

4.2.1 Bereiden van de stockoplossing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.2.2 Ontwikkelen van een gradient elutiemethode. . . . . . . . . . . . . . 59

4.3 Detectie van het testmengsel met de API 2000 massaspectrometer . . . . . 64

4.3.1 Optimalisatie van de MS-parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

4.4 Kwantificatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.4.1 Kynurenine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

4.4.2 Tryptofaan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

iv

INHOUDSOPGAVE

4.5 Monstervoorbereiding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

4.6 Batchsamenstelling en resultaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

5 Statische analyse 81

5.1 Distributie van data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

5.2 T-Toets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

5.2.1 Kynurenine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

5.2.2 Tryptofaan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

5.2.3 KYN/TRP-Ratio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

5.3 Principale componenten analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

5.4 Kleinste-kwadraten regressie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

6 Conclusie 91

Appendix 93

Afkortingen 99

v

INHOUDSOPGAVE

vi

Inleiding en doelstelling

De ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, de 2 meest uitgesproken voorbeelden van een chro-

nische inflammatoire darmziekte (Inflammatory Bowel Disease, IBD), treffen ongeveer 0,1

tot 0,2 % van de Belgische bevolking. In absolute cijfers betekent dit 10.000 tot 20.000

patienten in Belgie en tot 4 miljoen wereldwijd. De incidentie (het aantal nieuwe gevallen

per jaar) in Belgie bedraagt gemiddeld 4 tot 10 per 100.000 inwoners. Chronische ont-

stekingen op slijmvlies van het maagdarmkanaal ontstaan door het onophoudend werken

van het intestinale immuunsysteem. Deze ziekten verlopen via opstoten (opflakkeringen)

en remissies (een periode van tijdelijk herstel die soms enkele jaren kunnen duren). De

symptomen van IBD’s zijn vooral spijsverteringsklachten, gepaard gaande met buikpijn

en diarree. IBD’s kunnen ernstige gevolgen hebben voor de gezondheid, zoals sterk ge-

wichtsverlies, ondervoeding, groeiachterstand bij kinderen, ... Ondanks uitvoerige studies

en klinische ervaringen gedurende de afgelopen decennia, blijven de etiologische oorza-

ken verantwoordelijk voor deze afwijking onzeker en het verloop van de pathogenese blijft

onvolledig.

Net zoals bij andere chronische ziektes, is vermoeidheid een frequent geuite klacht bij

patienten met een inflammatoir darmlijden en tevens een van de belangrijkste symptomen

tijdens een opstoot van de ziekte. Opvallend is echter dat deze klacht ook nog prominent

aanwezig kan zijn wanneer er geen objectiveerbare ziekte-activiteit meer is. Deze chro-

nische vermoeidheid kan ernstige vormen aannemen en voor de patient als invaliderend

worden ervaren, met belangrijke psychosociale en professionele implicaties tot gevolg. Stu-

dies over vermoeidheid in inflammatoir darmlijden en de oorzaak ervan zijn echter schaars

tot onbestaande. Pogingen om de vermoeidheid bij IBD-patienten te koppelen aan ver-

stoorde mineraal- en vitamine-A concentraties (zoals bv. ijzer, foliumzuur, koper, zink,

Vit B1, Vit B12, ...) bleken weinig succesvol.

Dit project maakt deel uit van een ruimere studie in samenwerking met de dienst gastro-

enterologie van het UZ Gent o.l.v. Dr. Harald Peeters. Het doel van dit project bestaat

uit het ontwikkelen van een scheidingsmethode om de concentraties van tryptofaan en zijn

toxisch metaboliet kynurenine te bepalen in bloedplasma van IBD-patienten en controle-

personen. Het idee dat hierachter schuilt is dat de kynurenine/tryptofaan-verhouding de

activiteit van het enzyme Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) weerspiegelt. Eerder werd

aangetoond dat een verhoogde IDO-activiteit het gevolg is van het in werking treden van

het immuunssysteem bij IDB-patienten. IDO katalyseert de snelheidsbepalende stap in

het katabolische kynurenine-reactiepad van tryptofaan, met lagere tryptofaanconcentra-

ties (tryptofaan-depletie) en hogere kynurenineconcentraties als gevolg. Tryptofaan dient

als precursor voor serotonine (5-HT), een belangrijke centrale neurotransmitter. Verlaagde

serotonineconcentraties, als gevolg van tryptofaan-depletie, in combinatie met de toxische

activiteit van kynurenine (en zijn metabole producten) zouden een mogelijke verklaring

kunnen bieden voor de voortdurende vermoeidheid bij IBD-patienten.

Ontwikkeling van een snelle analysemethode — gebaseerd op omkeerfase LC-MS/MS —

voor niet-gederivatseerd tryptofaan en kynurenine in bloedplasma, in combinatie met een

weinig arbeidsintensieve monstervoorbereiding werden vooropgesteld. 149 plasmamon-

sters, waarvan 104 afkomstig van IBD-patienten en 45 controlepersonen, werden geleverd

door de dienst gastro-enterologie van het UZ Gent. De specificiteit en gevoeligheid van LC-

ESI-MS/MS werden optimaal benut om simultaan het tryptofaan- en kynureninegehalte in

het bloedplasma van de 149 monsters te bepalen. Nadien werd de bekomen data onderwor-

pen aan enkele standaard statische testen, zoals de t-toets, en enkele meer geavanceerde

chemometrische technieken, zoals principale componenten analyse en kleinste-kwadraten

regressie. In het ruimere kader van deze studie zal de IDO-activiteit, gebaseerd op de

bekomen resultaten tijdens deze thesis, gecorreleerd worden met vermoeidheidsstudies

uitgevoerd op de IBD-patienten.

HOOFDSTUK 1

FUNDAMENTELE ASPECTEN VAN DE CHROMATOGRAFIE

1.1 Het begrip ‘Chromatografie’

Chromatografie is in de loop der jaren uitgegroeid tot een grote verscheidenheid aan me-

thoden en toegepaste technieken waardoor het niet simpel is om een eenduidige, allesom-

vattende definitie te verschaffen. De International Union of Pure and Applied Chemistry

(IUPAC) geeft de volgende definitie (letterlijk vertaald uit het engels): “Chromatografie is

een fysische scheidingsmethode waarbij de te scheiden componenten verdeeld worden over

twee fases, waarvan een fase stationair is (stationaire fase) terwijl de andere fase (mobiele

fase) in welbepaalde richting beweegt. ”. [1] Volgens van Dale wordt chromatografie als

volgt omschreven: “scheidingsmethode voor mengsels (gas- of vloeistofmengsels) waarbij

deze door een adsorberende kolom worden geleid”. Een duidelijk onderscheid dient vooraf

gemaakt te worden tussen Analytische Chromatografie en Preparatieve Chromatografie.

Analytische Chromatografie is een micro-analytische methode waarbij de samenstelling

van een monster — doorgaans niet groter dan 10−2 g — zowel kwalitatief als kwantita-

tief onderzocht worden. Daarnaast wordt chromatografie, vooral vloeistofchromatografie,

toegepast voor het isoleren van zuivere verbindingen in grote hoeveelheden; een methode

die preparatieve chromatografie genoemd wordt. [2]

3

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie

1.2 Geschiedenis

Hoewel de Duitse kleurchemist Carl Runge voor het eerst in 1856 een scheiding van kleur-

stoffen - gebaseerd op een techniek die nu vergelijkbaar is met papierchromatografie -

publiceerde, wordt de Russiche Botanicus Mikhail Tswett (14 mei 1872 - 26 juni 1919) als

de vader van de Chromatografie beschouwd. Tswett scheidde in 1903 voor het eerst plan-

tenextracten (bladpigmenten) door gebruik te maken van een glazen kolom gepakt met

CaCO3 deeltjes en petroleumether (mengsel van laagkokende alifatische koolwaterstoffen)

als eluens. De plantenextracten zakten onder invloed van de zwaartekracht met het eluens

mee met als resultaat een serie van gekleurde banden op de kolom. Tswett kende elke

band toe aan een verschillende component van het plantenextract.[3] Dit vormde meteen

ook de basis voor de naam die hij aan de techniek gaf: Chromatografie. Etymologisch kan

‘chromatografie’ ontleed worden in het Griekse ‘chroma’ (kleur) en ‘graphein’ (schrijven)

en betekent dus letterlijk ‘kleurschrijven’. Dat de Russische betekenis van ‘Tswett’, kleur

is, zal echter wel niet geheel ontoevallig zijn.

Hoe baanbrekend Tswetts uitvinding ook was, veel erkenning van zijn tijdsgenoten kreeg

hij er niet voor. Mede door de publicatie van zijn doctoraatsverhandeling in het Russisch

werden zijn ideeen maar weinig verspreid waardoor de daaropvolgende 25 jaar de methode

niet evolueerde.[4] Zoals het echter vaak voorkomt in de geschiedenis kreeg Tswett pas

post mortem erkenning en vanaf 1930 werd kolomchromatografie een gevestigde techniek

in laboratoria over de hele wereld.

In 1931 werd nieuw leven in de chromatografie geblazen door Kuhn en Lederer.[5] Deze

biochemici slaagden erin om de eerste goede preparatieve scheiding van carotenoıden te

bekomen. Deze prestatie leverde hen in 1938 de Nobelprijs voor scheikunde op. Het was

deze scheiding die het begin betekende van een nieuwe periode waarin de chromatografie

een buitengewone bloei zou kennen.

Tot op dit moment werd enkel adsorptiechromatografie toegepast. Hierbij wordt de schei-

ding bekomen door een affiniteitsverchil van de componenten voor de stationaire fase

(een adsorbens). Het was wachten tot 1941 vooraleer de eerste scheiding gebaseerd op

vloeistof-vloeistof-verdelingschromatografie plaatsvond. Martin en Synge [6] realiseerden

4

1.2. Geschiedenis

een scheiding van carbonzuren door gebruik te maken van een met-water-beladen silica-

gelkolom als stationaire fase en chloroform als mobiele fase. Mede door dit experiment,

leverde hun onderzoek hen de Nobelprijs op in 1952. Vloeistofchromatografie bleef, vooral

door gebrek aan reproduceerbaarheid en automatisatie, weinig populair gedurende daar-

opvolgende decennia.

Als ‘uitvinders’ van de gaschromatografie, in de vorm waarin we die tegenwoordige in de

analytische chemie terugvinden, worden over het algemeen Martin en James naar voor

geschoven [2]. In 1952 werd de scheiding van een mengsel van lagere carbonzuren door

hen voor het eerst tot een goed einde gebracht. Hierbij werd het mengsel op een glazen

kolom, gevuld met diatomeeenaarde beladen met siliconenolie en stearinezuur, gebracht

en werd stikstofgas (N2) als mobiele fase gebruikt. De succesvolle scheiding betekende het

begin van een stormachtig zoeken naar nieuwe ontwikkelingen in de gaschromatografie en

tevens ook het startschot van de instrumentele scheidingsmethodes.

Na 1970 echter heeft ook de vloeistofchromatografie zich snel ontwikkeld tot een volwaar-

dige analytische scheidingstechniek. Aminozuuranalyse gebaseerd op ionenuitwisseling-

schromatografie [7] en de introductie van de eerste gelpermeatiechromatograaf (GPC) door

Waters Associates [8] worden beschouwd als de voorloper van de hedendaagse hoge perfor-

mantie vloeistofchromatografie (HPLC). In beide systemen werd de mobiele fase door een

kolom — bestaande uit kleine deeltjes — gepompt onder hoge druk. De eluerende fracties

werden continu gedetecteerd wat uiteindelijk resulteerde in een chromatogram bestaande

uit een reeks pieken uitgezet in functie van de tijd. Onder invloed van Csaba Horvath

en Joseph Huber werd eind jaren ‘60 de techniek verder ontwikkeld tot een volwaardig

systeem dat niet enkel alleen aminozuur- of polymeermengsels kon scheiden [9].

In 1941 stelde Martin al dat: “De meest efficiente scheidingen worden bekomen door ge-

bruik te maken van kolommen met kleine deeltjes en een groot drukinterval over de gehele

lengte van de kolom.” [10] Vanaf 1970 tot op heden was (en blijft) het een voortdurend

optimaliseren van HPLC als scheidingstechniek. Scheidingstijden werden, zoals Martin

had voorspeld, drastisch verlaagd door het ontwikkelen van pompen die hogere drukken

aankunnen en het fabriceren van kolommen met een steeds kleinere partikeldiameter.

5


De belangrijkste mijlpalen uit de geschiedenis van de Chromatografie werden samengevat

in Tabel 1.1.

Tabel 1.1: Geschiedenis van de chromatografie.

Wanneer? Wie? Wat?

1903 Tswett Eerste beschrijvingen van vloeistofchromato-grafie op basis van adsorptiefenomenen in eenkolom.

1931 Lederer, Kuhn et. al. Eerste belangrijke preparatieve scheidingen.1938 Izmailov, Shraiber Dunlaagchromatografie (TLC).1941 Martin, Synge Verdelingschromatografie (LC).1944 Consden, Gordon, Martin Introductie van papierchromatografie (PC)

dat nu hoofdzakelijk vervangen werd doorTLC.

1949 Spedding & Tompkins Ionenuitwisselingschromatografie1952 James, Martin Gas-vloeistofchromatografie (GC) als begin

van de instrumentele scheidingsmethodes.1952 Martin, Synge Nobelprijs voor Scheikunde1957 Golay Capillaire GasChromatografie (CGC)1958 Flodin, Porath Gel Permeatie Chromatografie (GPC)1962 Klesper Eerste introductie van een Superkritische

vloeistof als mobiele fase1966 Piel Hoge Performantie VloeistofChromatografie

(HPLC)1980 Jorgenson Capillaire Zone Elektroforese (CZE)1984 Terabe Micellaire Elektrokinetische Chromatografie

1.3 Het chromatografisch proces

Na injectie van het monster vindt scheiding op de kolom plaats via evenwichtinstelling

tussen twee verschillende fasen: een stationaire fase met een groot contactoppervlak en

een mobiele fase. In HPLC wordt gebruik gemaakt van een kolom die gepakt is met kleine

sferische deeltjes waarvan de diameter varieert tussen 1,5 en 5 µm. Deze deeltjes bestaan

meestal uit poreuze silica waarvan de binnenwand van deze porie bezet is met stationaire

fase, zoals weergegeven in Figuur 1.1. Afhankelijk van de scheidingsmode die aangewend

wordt, zal de stationaire fase verschillen. In dit werk wordt omkeerfase chromatografie

(Reversed Phase Chromatography, RPC) aangewend om de scheiding te bekomen. De

principes van de verschillende scheidingsmodes in HPLC worden uiteengezet in Tabel 1.2

6

1.3. Het chromatografisch proces

.

Figuur 1.1: Schematische voorstelling van een individueel silicadeeltje waarbij aan de wandvan de porie C18 -groepen verankerd werden als stationaire fase.

Tabel 1.2: Verschillende scheidingsmodes in HPLC.

Chromatografische schei-dingsmode

Scheidingsprincipe

Normaalfase Chroma-tografie (Normal PhaseChromatography, NPC)

De kolom is polair (bv. ongebonden silicaof polair gebonden functionele groepen zoalscyano-, amino- en diolgroepen) en de mobielefase is apolair (bv. hexaan, heptaan,...). Descheiding gebeurt op basis van polariteit waar-bij de meest polaire component de grootsteretentietijd heeft. NPC wordt hoofdzakelijkgebruikt voor monsters die onoplosbaar zijnin water; voor preparatieve HPLC en voor descheiding van isomeren.

Omkeerfase Chromatogra-fie (Reversed Phase Chro-matography, RPC)

De kolom is apolair (silica gemodificeerd metbv. C18 of C8 ) en de mobiele fase is een meng-sel van water en een organisch solvent (bv.acetonitril, methanol) en meestal een zuur ofbasisch additief. De scheiding gebeurt op ba-sis van hydrofobiciteit, waarbij de meest hy-drofobe (apolaire) componenten het meest ge-retenteerd zijn. RPC is de meest gebruiktemode in HPLC omwille van zijn brede toe-pasbaarheid en uitstekende reproduceerbaar-heid, vooral voor de analyse van wateroplos-bare monsters.

7


Hydrofiele interactieChromatografie (Hy-drophilic InteractionChromatography, HILIC)

De kolom is polair (silica of silica gemodifi-ceerd met amidegroep) en de mobiele fase be-staat uit een mengsel van water en hoofdza-kelijk organisch solvent (bv. acetonitril). HI-LIC wordt vooral gebruikt voor de analyse vanextreem polaire componenten die weinig gere-tenteerd zijn in RPC.

Size Exclusie Chroma-tografie (Size ExclusionChromatography, SEC)

Voor SEC wordt een inerte kolom bestaandeuit een hars of zeoliet gebruikt in combinatiemet een waterige of een organische mobielefase. De scheiding gebeurt op basis van degrootte/moleculair gewicht van de analietenen wordt het meest gebruikt voor de analysevan grote biomoleculen of synthetische poly-meren.

Affiniteitschromatografie(Affinity Chromato-graphy, AC)

De stationaire fase vertoont affiniteit voor wel-bepaalde componenten uit het mengsel op ba-sis van specifieke sleutel/slot-interacties die denatuurlijke activiteit nabootsen.

Ionenuitwisselingschroma-tografie (Ion ExchangeChromatography, IEC)

De kolom bevat een geladen groep die ana-lietionen van de tegengestelde lading kan bin-den. De mobiele fase is meestal een waterigezoutoplossing in combinatie met een buffer. InIEC worden monsterionen uitgewisseld met io-nen van de mobiele fase. IEC wordt gebruiktvoor het scheiden van ioniseerbare componen-ten zoals zuren en basen en vooral voor de ana-lyse van grote biomoleculen zoals proteınen enDNA.

Chirale Chromatografie(Chiral Chromatography)

De stationaire fase vertoont verschillende in-teractie met de enantiomeren van een compo-nent met asymmetrische koolstofcentra.

1.3.1 Differentiele migratie: schotelmodel

Differentiele migratie (verschillende gemiddelde snelheid waarbij componenten doorheen de

kolom bewegen) vormt de basis van een chromatografische scheiding. Zonder een verschil in

migratiesnelheid kan een scheiding niet plaatsvinden [11]. Dit verschil in migratiesnelheid

komt tot stand doordat de componenten van het mengsel op een dynamische manier

verdeeld worden tussen de stationaire en de mobiele fase.

8


Volgens het schotelmodel (plate theory) kan een kolom opgedeeld worden in theoretische

schotels. Wanneer een analiet doorheen de kolom beweegt ondergaat het een reeks sorptie-

en desorptieprocessen tussen de stationaire en de mobiele fase. Dit is een dynamisch proces

dat gebeurt via tussenliggende evenwichtsinstellingen.

X(mobielefase)⇐⇒ X(stationairefase)

De schotellengte H is dan de kolomlengte die een component nodig heeft om een even-

wichtsinstelling met de mobiele fase te bereiken.

Figuur 1.2: Evenwichtsinstelling van solventen analietmolecules tussen de mobiele en destationaire fase. Het effect van dit dynamisch evenwicht is een verschil in migratiesnelheid.

Zoals in Figuur 1.2 te zien is, bevindt molecule X zich op elk moment evenveel in de

stationaire als in de mobiele fase. Molecule Z bevindt zich daarintegen meer in de stati-

onaire fase. Er kan dus gesteld worden dat molecule Z meer geretenteerd is en bijgevolg

trager door de kolom migreert. Het dynamische evenwicht en de migratiesnelheid van een

component zijn afhankelijk van de moleculaire structuur van de component, de chemische

samenstelling van zowel de mobiele als de stationaire fase en van de temperatuur.

9


1.3.2 Resolutie

De retentiefactor k

Wanneer een analietmolecule doorheen de kolom migreert, spreiden de molecules zich uit

over een bepaald volume in de kolom. Het volume in de kolom dat een soort component

van het mengsel bevat wordt een band genoemd. Wanneer een band uit de kolom elu-

eert en opgenomen wordt in het chromatogram wordt er van een piek gesproken. Een

chromatogram bevat zowel kwalitatieve (retentietijd) als kwantitatieve (piekoppervlakte)

informatie. Uit Figuur 1.3 kunnen enkele belangrijke parameters gehaald worden.

Figuur 1.3: Schematische voorstelling van een chromatogram: tr, t′r en t0 samen met wb,

wh en σ

• De retentietijd tr is de gemiddelde verblijftijd van het analiet in het systeem, startend

vanaf de injectie tot elutie en detectie. De retentietijd tr is componentspecifiek voor

een soort kolom onder welbepaalde omstandigheden en is bijgevolg een kwalitatief

criterium.

• De dode tijd t0 is de tijd die een niet weerhouden component nodig heeft om gede-

tecteerd te worden. Het is bijgevolg de tijd die de mobiele fase nodig heeft om het

systeem te doorlopen.

• De netto retentietijd t′r is de tijd dat de component in de stationaire fase verblijft.

10


De netto retentietijd kan als volgt berekend worden volgens vergelijking 1.1:

t′r = tr − t0 (1.1)

De lineaire snelheid u van de mobiele fase kan bepaald worden met de retentietijd tr en

de kolomlengte L volgens vergelijking 1.2:

u =L

tr(1.2)

De retentiefactor k (capaciteitsfactor) wordt gedefinieerd als de verblijftijd van de compo-

nent in de stationaire fase over de verblijftijd in de mobiele fase.

k =tr − t0t0

=t′rt0

(1.3)

Bij voorkeur wordt de k-waarde gebruikt om retentie aan te geven omdat deze waarde

dimensieloos is en bijgevolg onafhankelijk van de kolomparameters (lengte en diameter,

partikelgrootte).

Zoals eerder vermeld is de plaattheorie gebaseerd op een evenwichtsproces waarbij het

analiet dynamisch verdeeld wordt over de mobiele en de stationaire fase. Aan dit even-

wichtsproces kan de evenwichtsconstante K (soms ook verdelingscoefficient of distributie-

constante) toegekend worden (vergelijking 1.4).

K =cScM

(1.4)

Hierbij zijn cS en cM de concentratie (in mol/l) van het analiet in respectievelijk de

stationaire en de mobiele fase. De waarde van de evenwichtsconstante K wordt enerzijds

bepaald door de chemische structuur van het analiet en anderzijds door de chemische

natuur van de stationaire en de mobiele fase. Daar K een thermodynamische constante

is, is K ook temperatuursafhankelijk.

De evenwichtsconstante K en de retentiefactor k zijn gekoppeld volgens vergelijking 1.5:

K =QS/VSQM/VM

=QS × VMQM × VS

= kβ (1.5)

11


Hierbij zijn

QS = hoeveelheid (mol) van de component in de stationaire fase,

QM = hoeveelheid (mol) van de component in de mobiele fase,

VS = volume van de stationaire fase,

VM = volume van de mobiele fase.

De evenwichtsconstante K wordt zo opgesplitst in :

k = retentiefactor,

β = faseratio; kolomafhankelijke constante.

De selectiviteit α

Om twee opeenvolgende pieken goed van elkaar te kunnen onderscheiden is het noodza-

kelijk dat hun retentiefactoren, en bijgevolg dus ook hun distributiefactoren, voldoende

van elkaar verschillen. Een dimensieloze factor die het verschil in retentie tussen twee

pieken weergeeft is de relatieve retentieverhouding of selectiviteit α en wordt gegeven door

vergelijking 1.6.

α =k2k1

(1.6)

Hoe groter de selectiviteit, hoe groter het verschil in de retentietijd en hoe verder de

analietpieken van elkaar gelegen zijn. De selectiviteitsfactor α is voornamelijk afhankelijk

van de stationaire fase en de chemie van de te scheiden componenten. De resolutie van een

scheiding verbeteren gebeurt in de eerste plaats via de optimalisatie van de selectiviteit.

De efficientie: schotelgetal N

De efficientie van een chromatografische kolom is het vermogen van de kolom om piekver-

breding tegen te gaan en dus een hoge resolutie te leveren. Het theoretisch aantal platen

(schotels) is een maat voor de kolomefficientie. Een groter aantal platen geeft aanleiding

12


tot scherpere pieken en dus een betere scheiding. Uit een chromatogram (Figuur 1.3) kun-

nen de parameters gevonden worden die nodig zijn om het het schotelgetal N te berekenen.

N wordt berekend volgens

N =

(trσ

)2

= 5.54

(trwh

)2

= 16

(trwb

)2

(1.7)

In geval van een gaussiaanse piek geldt:

tr = retentietijd,

σ = halve breedte van de piek op 60.7 % van de hoogte van de piek,

wh = de breedte van de piek op halve hoogte (FWHM) ,

wb = de breedte van de piek aan de basis.

Wanneer de dode tijd in rekening gebracht wordt, wordt het effectieve plaatgetal Neff

bekomen:

Neff = 5.54

(tr′

wh

)2

(1.8)

De efficientie van een kolom is invers gerelateerd met de schotellengte (height equivalent

of a theoretical plate, H). H stelt hierbij de kortst mogelijke kolomlengte voor die vereist

is zodat een evenwicht zich kan instellen voor de verdeling van een analiet over de twee

fases. H kan berekend worden volgens vergelijking 1.9.

H =L

N(1.9)

Hoe kleiner de H-waarde is, hoe meer platen de kolom bevat. Een kolom met een hoger

aantal platen levert scherpere pieken en een betere resolutie.

Voor gepakte kolommen kan aangetoond worden dat H ≈ 2dp en dat bijgevolg :

N =L

2dp(1.10)

13


In dit werk werd gebruik gemaakt van een Kinetex-kolom (Phenomenex) waarvan de

lengte 5 cm is en de deeltjesgrootte 1,7 µm wat in principe een typische plaatgetal van

N = 13.888 zou opleveren. De Kinetex-kolom is gepakt met partikels bestaande uit een

harde kern van 1,25 µm en een poreuze buitenlaag van 0,23 µm, ook wel Halo-partikels ge-

noemd. De poreuze silicalaag vormt hierbij de stationaire fase, waardoor de diffusieafstand

een stuk korter is in vergelijking met klassieke poreuze deeltjes met dezelfde dimensies,

waardoor een snellere massastransfer verkregen wordt. Een snellere massatransfer resul-

teert in een verlaagde C-term (zie verder) waardoor een hogere efficientie bereikt wordt.

Snelle analyses kunnen met dit soort kolom verwezenlijkt worden omwille van de kleine

partikelgrootte (1,7 µm) en de unieke harde deeltjes technologie. Dit type materiaal ver-

eist minder tegendruk voor dezelfde efficientie, waardoor deze kolommen op conventionele

HPLC-apparatuur kunnen gebruikt worden [12]. Het berekende plaatgetal (N = 13.888)

bij dergelijke partikels is dus onderschat.

Resolutie Rs

De resolutie Rs is een maat voor de scheiding van twee componenten op een bepaalde kolom

(lengte, straal, stationaire fase, partikelgrootte) onder welbepaalde omstandigheden (aard

en snelheid van de mobiele fase, temperatuur, ...) [4]. De resolutie is componentafhankelijk

en kan berekend worden volgens :

Rs =tr2 − tr1

1/2(wb1 + wb2)(1.11)

Hierbij zijn tr1 en tr2 de retentietijd van beide signalen en wb1 en wb2 de breedte van de

piek aan de basis van beide signalen. Bij twee even grote pieken correspondeert Rs = 1, 50

met ongeveer een volledige scheiding.

Door invullen van vergelijking 1.3 , 1.6 en 1.7 in vergelijking in 1.11 wordt de basisver-

gelijking van de chromatografie bekomen :

Rs =1

4

√N

(α− 1

α

)(k

k + 1

)(1.12)

Deze basisvergelijking bevat alle relevante parameters van een chromatografische schei-

14


ding: kolomefficientie N, selectivititeitsefficientie α en retentiefactor k. Elke ingreep in

het scheidingsproces die N, α of k doen toenemen heeft een gunstig effect op de resolutie.

De selectiviteitsfactor α heeft de grootste invloed op de resolutie. α verhogen van 1, 05

tot 1, 10 resulteert bijna in een verdubbeling van Rs. De keuze van de stationaire fase

is dus essentieel in het ontwerp van de scheidingsmethode. Kolomefficientie heeft minder

invloed op de resolutie (a.g.v. de vierkantswortel in de vergelijking) dan de selectivi-

teitsfactor, maar optimalisatie van N levert betere scheidingen voor alle componenten op

waarbij optimalisatie van α doorgaans slechts een verbetering voor een piekpaar oplevert.

De retentiefactor k heeft slechts een geringe invloed op de resolutie voor k-waarden die

groter zijn dan 4. Optimalisatie van de retentiefactor kan gerealiseerd worden door de

hoeveelheid stationaire fase te verhogen of door de temperatuur te verlagen.

1.3.3 Bandverbreding

De kwaliteit van een chromatografische scheiding is sterk afhankelijk van de kolomef-

ficientie N die op zijn beurt verbonden is met de breedte van de eluerende pieken in het

chromatogram. Hoe groter de N-waarde is, des te scherper de pieken zijn en hoe beter

de resolutie. In het ideale geval heeft de elutiepiek een Gaussiaanse klokvorm, waarbij

het signaal symmetrisch rond het maximum is. De piek heeft een welbepaalde breedte,

uitgedrukt door de parameters σ, wh en wb (zie Figuur 1.3) [13].

De realiteit toont echter altijd een afwijking van het ideale geval. Intra- als extra-kolom

aspecten dragen bij tot bandverbreding (in het systeem) en leiden bijgevolg ook tot piek-

verbreding in het chromatogram. De piekbreedte neemt toe met de vierkantswortel van

zijn afgelegde afstand, waardoor de variantie σ2x lineair zal toenemen met de afgelegde weg

[14]. Mathematisch wordt dit:

H =dσ2xdL

(1.13)

De afwijking van de ideale Gauss-curve wordt vaak uitgedrukt door de variantie σ2 (bij

een curve met standaardafwijking σ). Zoals hoger vermeld is de efficientie van de kolom

evenredig met zijn lengte, waardoor het wenselijk is de afwijking uit te drukken in variantie

15


σ2 per eenheid van kolomlengte (zie vergelijking 1.14)

N =L2

σ2x(1.14)

Drie intra-kolom processen kunnen aanleiding geven tot intra-kolom bandverbreding. Deze

zijn: Eddy diffusie (A), longitudinale diffusie (B) en massatransfer (C).

Eddy diffusie (A)

Als gevolg van onregelmatigheden in de pakking van een kolom en door het gebrek aan

volledige uniformaliteit in de vorm en grootte van de silicadeeltjes kunnen verschillende

vloeipaden in de kolom ontstaan (Figuur 1.4 ). Analietmoleculen die tot een sneller vloei-

pad behoren elueren sneller dan andere moleculen waardoor een variatie in de retentietijden

optreedt. Hoe groter deze variatie, hoe groter de banden piekverbreding . Deze bijdrage

staat bekend als de Eddy diffusie en wordt gedefinieerd door de A-term:

A = 2λdp (1.15)

waarbij :

λ = stapelingsfactor,

dp = partikeldiameter.

Figuur 1.4: Schematische voorstelling van het Eddy Diffusie fenomeen

Daar variantie afhankelijk is van de lengte van de kolom (zie hoger) en de A-term een

kolomkarakteristiek is geldt :

16


σ2Eddy = 2λdpL (1.16)

Invullen in vergelijking 1.14 levert dit:

HEddy =σ2Eddy

L= 2λdp = A (1.17)

Deze bijdrage van de Eddy-diffusie tot plaathoogte en bijgevolg de bandverbreding is

afhankelijk van de grootte van de silicadeeltjes en het pakken ervan. Bij open tubulaire

kolommen kan deze term verwaarloosd worden.

Longitudinale diffusie

Als gevolg van verschillende concentratiezones in de mobiele fase zullen analietmoleculen

diffunderen vanuit hoog geconcentreerde naar laag geconcentreerde zones. Indien deze

diffusie radiaal verloopt heeft dit geen bijdrage tot bandverbreding, axiale diffusie daar-

integen wel. Axiale of longitudinale diffusie wordt afgebeeld in Figuur 1.5 en is gegeven

door:

B = 2γDM (1.18)

met

γ = obstructiefactor,

DM = diffusiecoefficient in de mobiele fase.

17


Figuur 1.5: Schematische voorstelling van de piekverbreding die optreedt als gevolg vanlongitudinale diffusie.

De B-term is afhankelijk van de kolomlengte L en de snelheid van de mobiele fase u.

Logischerwijs zullen analietmoleculen minder de kans hebben om te diffunderen bij een

snellere solventstroom dan bij een tragere. De variantie σ2diff wordt gedefinieerd door:

σ2diff =2λDML

u(1.19)

Analoog als voor A, wordt de bijdrage van de longitudinale diffusie aan de bandverbreding

gegeven door:

Hdiff =σ2diffL

=2λDM

u=B

u(1.20)

Hieruit blijkt dat een hogere snelheid van de mobiele fase en kleine diffusiecoefficienten

een gunstig effect hebben op de piekverbreding als gevolg van longitudinale diffusie.

Massatransfer

Een derde proces dat bijdraagt aan banden piekverbreding is massatransfer (C) tussen

de stationaire en de mobiele fase. Bij gepakte kolommen wordt bv. een onvolledige

evenwichtsinstelling bekomen doordat sommige analietmoleculen dieper in de porie van het

silicadeeltje penetreren dan andere (voor CM ). Hierdoor zullen sommige analietmoleculen

langer in het silicadeeltje verblijven dan andere waardoor die niet verder door de kolom

kunnen migreren en uiteindelijk elueren. Bij open tubulaire kolommen, die vooral in

18


gaschromatografie (GC) gebruikt worden, is piekverbreding door de massatransfer vooral

te wijten aan de trage diffusie doorheen de stationaire fase zelf. De massatransfer C kan

dus opgedeeld worden in twee verschillende processen met elk hun verschillende snelheid

(Vergelijking 1.21).

C = CM + CS (1.21)

Waarbij

• CM : het transport vanuit de mobiele fase naar het grensvlak tussen de mobiele en

de stationaire fase. Deze factor is afhankelijk van processen die plaatsvinden aan de

mobiele fase.

• CS : het transport vanuit de stationaire fase naar het grensvlak tussen beide fases.

Deze factor is afhankelijk van de afgelegde afstand in de stationaire fase en processen

eigen aan deze fase.

De variantie σ2massa en dus de piekverbreding nemen toe met de snelheid van de mobiele

fase u, daar er minder tijd is voor evenwichtsinstelling bij een hogere snelheid van de

mobiele fase.

σ2massa = CLu = (CM + CS)Lu (1.22)

Met behulp van vergelijking 1.14 wordt de bijdrage van de C-term aan de piekverbreding

gegeven door :

Hmassa =σ2massa

L=CLu

u= Cu (1.23)

van Deemter vergelijking

De totale bandverbreding is de som van de bijdragen geleverd door de Eddy diffusie,

longitudinale diffusie en massatransfer :

H = HEddy +Hdiff +Hmassa = A+B

u+ Cu (1.24)

19


Vergelijking 1.24 is beter bekend als de van Deemter vergelijking en beschrijft de piek-

verbreding in de kolom in functie van de snelheid van de mobiele fase. Figuur 1.6 is de

voorstelling van een van Deemter curve waarbij de plaathoogte in functie van de mobiele

fase snelheid u is weergegeven. De ‘eigenlijke curve’ in stippellijn is een combinatie van

de A-, B- en C-term en vertoont een minimum waar de efficientie maximaal is. Bijgevolg

is de snelheid van de mobiele fase optimaal bij het minimum van deze curve.

Figuur 1.6: Schematiche voorstelling van de invloed van de A, B en C-term op de vanDeemter curve.

De van Deemter vergelijking geeft de componenten weer die de oorzaak vormen van

de intra-kolom piekverbreding. Naast deze 3 termen zijn er nog een aantal factoren die

niet gerelateerd zijn aan de kolom, maar toch tot piekverbreding kunnen leiden. De

belangrijkste extra-kolom effecten zijn :

• Tubings, fittings, ... om de verschillende delen van het systeem met elkaar te ver-

binden. Ze bevatten een dood volume dat zo klein mogelijk gehouden moet worden

om piekverbreding te beperken.

• Injectie: het geınjecteerde volume wordt zo klein mogelijk gehouden (in dit werk : 5

µl) om het Gaussiaans karakter van de piek te behouden.

20

1.4. Instrumentele aspecten van HPLC

• Detectie: het volume van de doorstroomcel (flow cell) wordt in combinatie met de

responstijd zo klein mogelijk gehouden.

1.4 Instrumentele aspecten van HPLC

Figuur 1.7 geeft schematisch de opstelling van een HPLC-systeem weer. Volgende on-

derdelen zijn genummerd terug te vinden op de figuur en zijn essentieel in een modern

HPLC-systeem. Alle onderdelen zijn tevens terug te vinden in het systeem waarmee dit

werk tot stand gekomen is, nl. ‘Waters Alliance 2690’.

Figuur 1.7: Schematische voorstelling van een HPLC-systeem.

1. Solventfles : Een reservoir voor de mobiele fase is een simpel toch essentieel onder-

deel van een HPLC-systeem. Elke chromatgraaf bevat er tenminste 2, waarbij een

aparte fles voorzien is voor zowel de waterige als de organische fase (indien er met

omkeerfase LC gewerkt wordt). Vooraleer de mobiele fase de fles verlaat via een van

de kanalen wordt het gefilterd via een inlet-filter.

2. Verbindingskanalen: ‘Tubings’ en ‘Fittings’ worden gebruikt om de verschil-

lende componenten van het HPLC-systeem met elkaar te verbinden. Tubings zorgen

voor het transport van het analiet en de mobiele fase door het systeem. Tubings

vervaardigd uit PolyEther Ether Ketone (PEEK) worden vaak gebruikt omwille van

hun flexibiliteit en gebruiksvriendelijkheid. Bij drukken hoger dan 7000 psi (482

bar) worden tubings uit roestvrij staal gebruikt. Essentieel is de kleine interne dia-

21


meter van tubings om het extra-kolom volume zo klein mogelijk te houden en om

bandverbreding tegen te gaan.

3. Ontgassingssysteem: De aanwezigheid van luchtbellen in de mobiele fase kun-

nen leiden tot een drukverval in het systeem en bijgevolg weinig betrouwbare en

reproduceerbare metingen. Ontgassen van de mobiele fase vooraleer het in het sys-

teem geıntroduceerd wordt is dus noodzakelijk. Ontgassen kan vooraf gebeuren door

de mobiele fase in het ultrasoonbad te plaatsen, maar meestal gebeurt dit on-line.

On-line ontgassen is gebaseerd op de selectieve permeabiliteit van een tubing die

doorheen een geevacueerde kamer loopt. Het vacuum zuigt het opgeloste gas door-

heen de polymere wand van de tubing terwijl het solvent verder naar de mengpomp

wordt gezogen.

4. Pompsysteem & mengkamer: Een hoge druk pomp (tot 400 bar) levert de mo-

biele fase met een precies gecontroleerd debiet tot in de mengkamer. In de meng-

kamer worden de solventen gemengd in de gewenste verhouding en naar de kolom

gestuurd. Afhankelijk van het te analyseren mengsel kan gekozen worden voor een

isocratische elutie of voor een gradient elutie. Bij isocratische elutie blijft de mobiele

fase, ofwel een zuiver solvent ofwel een mengsel, onveranderd gedurende de analyse

[15]. Bij gradient-elutie verandert de samenstelling van de mobiele fase gedurende

de scheiding volgens een vooraf ingesteld schema. Het pompsysteem bestaat uit een

heen en weer bewegende zuiger (reciprocating piston) vervaardigd uit saffier of por-

selien, een rubberen afsluitring (pump seal), ventielen (check valve) en een motor

om de zuiger heen en weer te laten bewegen.

5. Injectiesysteem: Het injectiesysteem wordt gebruikt om een bepaalde hoeveelheid

van het analiet in de kolom te introduceren zonder een druk- of debietverval te

creeren. Hiervoor wordt een zeswegkraan gebruikt (Figuur 1.8). In de laadpositie

wordt de injectielus (loop) gevuld met het monster afkomstig van de injectienaald.

De injectielus wordt volledig gevuld en het overtollige analiet wordt naar het af-

valvat gestuurd. In deze positie is de kolom met de pomp verbonden waardoor er

22

1.4. Instrumentele aspecten van HPLC

voortdurend mobiele fase door de kolom stroomt, dit om uitdroging te verkomen.

Om het monster te introduceren in de kolom wordt de kraan 60◦ gedraaid naar de

injectiepositie. In deze stand stuurt de pomp de mobiele fase door de loop naar de

kolom waardoor het analiet samen met de mobiele fase op de kolom terecht komt.

Figuur 1.8: Laadpositie (links) en injectiepositie (rechts) van de zeswegkraan.

6. De kolom & kolomoven: De kolom is het hart van het HPLC-systeem. De kolom

bestaat uit een stalen omhulsel waarin silicadeeltjes gepakt zijn. De porien van elk

silicadeeltje bevat de stationaire fase, bv. een octadecyl-groep (C18). In dit werk

werd gebruik gemaakt van een kolom gepakt met 1,7 µm Kinetex C18-deeltes. Om

de scheiding van het mengsel onder controle te houden is temperatuurcontrole van

de kolom noodzakelijk. Een constante temperatuur wordt bekomen door de kolom

in een kolomoven te plaatsen.

7. Detectiesysteem: Een detector wordt gebruikt om de gescheiden banden te visua-

liseren wanneer ze uit de kolom elueren en dusdanig het chromatogram te construe-

ren. Verschillende detectiesystemen zijn beschikbaar op de markt met elk hun eigen

voor- en nadelen. Enkele voorbeelden zijn UV-VIS detectie, Massaspectrometrie,

fluorescentie-detectie (FLD), elektrochemische detectie, corona discharge detectie,

light scattering detectie, ... In dit werk werd massaspectrometrie (MS) gebruikt

23


als detectiesysteem. De principes van deze detector worden uitvoerig beschreven in

sectie 1.5 .

8. Datasysteem: Een datasysteem met de nodige software is nodig om de elektronische

signalen te verzamelen en om te zetten tot een bruikbaar chromatogram. In dit werk

werd gebruik gemaakt van het Analyst 1.4 - pakket van Applied Biosystems

In Figuur 1.9 is een afbeelding weergegeven van de gebruikte opstelling waarmee dit werk

tot stand gekomen is.

Figuur 1.9: Opstelling: Waters Alliance 2695 gekoppeld aan een API 2000 massaspectro-meter van Applied Biosystems.

1.5 Massaspectrometrie

1.5.1 Principe

Massaspectrometrie (MS) is een analytische detectietechniek waarbij de gevormde gasvor-

mige ionen van een monster gescheiden worden volgens hun verhouding van massa over

lading, om vervolgens gedetecteerd en gekwantificeerd te worden. Als resultaat wordt

een massaspectrum verkregen waarbij de absolute of relatieve intensiteit (in tellen) van de

geproduceerde ionen in functie van hun massa over lading (m/z) uitgezet wordt. Een mas-

saspectrum levert informatie over de moleculaire massa van het analiet en kan, desgewenst,

ook structurele informatie geven uit het fragmentatiepatroon. De massaspectrometer is de

24

1.5. Massaspectrometrie

afgelopen eeuw geevolueerd tot een hoogtechnologisch systeem. In zijn meest elementaire

vorm bestaat de massaspectrometer uit :

• de ionenbron: productie van gasvormige ionen

• de massa-analysator: analyseert en scheidt de ionenbundel volgens hun m/z− ratio.

Een magneetsector scheidt de geproduceerde ionen in de ruimte, een time-of-flight

(TOF) zondert de verschillende moleculen af volgens hun vluchttijd in de zoge-

naamde flighttube en een quadrupoolfilter treedt op als massafilter. Elk systeem

heeft zijn eigen voor- en nadelen waarbij de kostprijs vaak de bepalende factor is.

• het detectiesysteem: zet de ionenbundel om in een meetbaar signaal

Naast deze essentiele onderdelen zijn een geschikt monsterintroductie- en ionisatiesysteem

(de interface), een systeem om de overgang van atmosferische druk naar hoog vacuum te

overbruggen en een dataverwerkingsysteem onontbeerlijk.

Gekoppeld aan een HPLC-systeem wordt er gesproken van een ‘hyphenated technique’

waarbij twee populaire opstellingen vaak onderscheiden worden: LC-MS en LC-MS/MS.

Wanneer over LC-MS gesproken wordt, wordt het HPLC systeem gekoppeld aan een enkel-

voudige MS (single stage detector). Hierbij wordt de ionaire vorm van elk analiet, meestal

het geprotoneerde moleculaire ion, gemeten en geregistreerd. Bij LC-MS/MS wordt de

HPLC gekoppeld met Tandem-MS. Hierbij worden ionen twee maal geanalyseerd, waar-

bij na de eerste massaselectie fragmentatie van het analietion plaatsvindt. In dit werk

werd geopteerd voor LC-MS/MS daar deze modus operandi toelaat om in zeer complexe

mengsels — zoals plasma — zeer selectief bepaalde molecules kwantitatief te bepalen.

1.5.2 Theoretische en instrumentele aspecten van LC-MS/MS

In Figuur 1.10 wordt een vereenvoudigde weergave gegeven van de gebruikte massaspec-

trometer, nl. de API 2000 van Applied Biosystems.

25


Figuur 1.10: Schematische voorstelling van de API 2000 massaspectrometer van AppliedBiosystems.

LC-MS interface: Atmosferische druk electrospray ionisatie (AP-ESI)

De ontwikkeling van een robuuste interface om het eluens van een HPLC te introduceren

in de MS, in combinatie met met een relatief hoge ionisatie efficientie, is de belangrijkste

factor voor het hedendaagse succes van LC-MS. John B. Fenn en Koichi Tanaka werden dan

ook de Nobelprijs chemie toegekend in 2002 voor de ontwikkeling van de ESI-interface [16].

Omdat een MS-detector slechts functioneert onder hoog-vacuum moeten de geıoniseerde

analietmoleculen in de gasvormige toestand voorkomen. Dit is de taak van de interface.

Vandaag worden nog bijna uitsluitend ionisatiebronnen bij atmosferisch druk gebruikt

(Atmospheric Pressure Ionisation, API). De twee bekendste zijn de elektrospray (ESI) en

de atmosferische druk chemische ionisatiebron (APCI). In dit werk werd ESI aangewend

en bijgevolg wordt enkel deze interface besproken [11, 17].

Figuur 1.11: Ionenbron

26


Het eluens, afkomstig van het HPLC-apparaat of via directe injectie met een spuit, wordt

naar de ionenbron geleid onder atmosferische druk (Figuur 1.11). Het proces waarbij

gasvormige analietionen gevormd worden bij ESI is nog steeds een onderwerp van dis-

cussie. Algemeen kan het proces van electronspray ionisatie in vijf verschillende stappen

omschreven worden. [18]

1. Ionisatie in oplossing.

Hoewel dit niet noodzakelijk is voor ESI wordt de beste gevoeligheid verkregen wan-

neer er al ionen gevormd worden in de eluensstroom. Door een optimale solvent-,

buffer- en dus pH-keuze worden reeds ionen gevormd in de oplossing. Ionaire analiet-

moleculen zijn makkelijker in staat om te ‘verdampen’ uit de geladen druppeltjes dan

neutrale moleculen. Componenten die nog niet geıoniseerd zijn in oplossing kunnen

ook geanalyseerd worden omdat verneveling van het monster, desolvatatie van het

gegenereerde aerosol en ionevaporatie in staat zijn een sterke elektrische lading op

het oppervlak van de druppeltjes te creeren, wat ionisatie van de analietmoleculen

teweeg brengt [15].

2. Verneveling

Verneveling ontstaat wanneer de analietoplossing in de ionisatiekamer geıntroduceerd

wordt. Geladen solventdruppeltjes worden gecreeerd door het aanleggen van een

sterk elektrisch veld op de tip van het capillair (tot 6000 V) — waar het eluens naar

gekanaliseerd wordt — enerzijds, en de sterke afschuifspanning van het verstuivergas

anderzijds [19]. Deze druppeltjes hebben een diameter van ongeveer 2 µm en bevat-

ten circa 100.000 ladingen. Afhankelijk van het teken van de aangelegde spanning

(positieve of negatieve modus) worden ionen van tegengestelde polariteit preferen-

tieel naar het oppervlak van de druppel getrokken. Resultaat is een fijne nevel van

geladen druppeltjes, m.a.w. een elektrospray (Figuur 1.12).

27


Figuur 1.12: Schematische voorstelling van het elektronspray fenomeen

3. Coulomb fissie: desolvatatie van geladen druppeltjes.

Vooraleer de gevormde ionen de massa-analysator binnentreden moeten de omrin-

gende solventmoleculen verwijderd worden. Een tegenstroom van verwarmd droog-

gas (N2) verdampt de solventmoleculen en zorgt voor een stijging van de lading/volume-

ratio binnenin de druppeltjes. De druppeltjes zullen kleiner worden totdat de elektro-

statische Coulombkracht groot genoeg is om de oppervlaktespanning te overwinnen,

op dit moment is de Rayleigh limiet bereikt. De Rayleigh desintegratie limiet is de

maximum lading dat een druppeltje kan bevatten bij constant volume. Wanneer deze

limiet overschreden wordt onstaat er een explosie van de druppeltjes (Figuur 1.13).

Wat volgt is een cascade van druppelexplosies waardoor steeds kleinere druppels

gevormd worden, een proces dat beter bekent staat als Coulomb fissie.

Figuur 1.13: Schematische voorstelling van de desolvatatie via Coulomb fissie.

28


4. Vormen van ionen: ion evaporatie model (IEM) en geladen residu model

(CRM)

Er zijn twee belangrijke theorien die de finale productie van gasfase ionen beschrij-

ven: het ion evaporatie model en het geladen residu model. Welk model het nauwst

aansluit bij de werkelijkheid is de dag van vandaag nog steeds een punt van discus-

sie. IEM postuleert dat de ionen direct vrijgesteld worden in de gasfase vanuit de

druppeltjes. Bij de steeds kleiner wordende druppeltjes zal een moment komen dat

de gecreeerde veldsterkte door de ionen aan het oppervlak, de oppervlaktespanning

overschreidt. Op dit moment vindt desorptie van de ionen plaats en ontstaan naakte

analietionen in de gasfase. Figuur 1.14 geeft schematisch het IEM-proces weer.

Figuur 1.14: Schematische voorstelling van de elektrosprayvorming: ionevaporatie.

Een alternatief model wordt beschreven in het geladen residu model (CRM). CRM

stelt dat de fissiecascade blijft doorgaan tot een druppeltje gemiddeld een analietion

bevat. Het uiteindelijke analietion in de gasfase wordt bekomen waneer de resterende

solventmoleculen verdampt zijn. De ladingen die het druppeltje bevatte, worden

vanaf dan gedragen door het analietion.

5. Gasfasereacties

Protontransfer- en ladingsuitwisselingsreacties kunnen plaatsvinden bij het transport

van de moleculen door de ionisatiekamer. Zoals hoger vermeld bevindt de ionisa-

tiekamer zich bij atmosferische druk waardoor duizenden van deze reacties kunnen

plaats vinden a.g.v. botsing van de analietmoleculen in de API-bron.

29


De orifice plaat (Figuur 1.10) introduceert de analietionen in een intermediaire vacuum

regio waarna ze via de skimmer in het hoog-vacuum regio van de massa-analysator gestuurd

worden.

ESI is een zeer zachte ionisatietechniek waarbij nagenoeg geen fragmentatie ontstaat en

het is vandaag tevens ook de interface voor LC-MS die de hoogste ionisatie-efficientie en

dus de grootste gevoeligheid oplevert.

De massa-analysator: de quadrupool

De quadrupoolmassa-analysator bestaat uit vier evenwijdige geleidende cilindervormige

staven. De tegenover elkaar liggende staven zijn elektrisch met elkaar verbonden, waarbij

de elektrodenparen op een gelijke, doch tegengestelde, potentiaal gebracht worden. De

potentiaal bestaat uit een radiofrequentiecomponent (RF, wisselspanning) en een gelijk-

spanningcomponent (DC) waarbij hun RF/DC-ratio constant blijft. Zoals op Figuur 1.15

weergegeven is, beweegt de ionenbundel door de quadrupoolfilter naar de detector. De

aangelegde spanning beınvloedt het traject van de ionenbundel waarbij enkel ionen met

een bepaalde m/z-ratio de detector bereiken. Andere ionen hebben een onstabiel traject

en botsen met een van de quadrupoolstaven. Deze methode laat toe om een welbepaalde

m/z-waarde te volgen of een m/z-interval te doorlopen door voortdurend de RF- en DC-

voltages aan te passen.

Figuur 1.15: De quadrupoolanalysator

30


De belangrijkste voordelen van de quadrupoolmassaspectrometer zijn de relatief hoge snel-

heid waarmee het massaspectrum kan geconstrueerd worden (een scan duurt ongeveer 0,1

- 0,5 s, afhankelijk van de ingestelde scanrange), de mogelijkheid om te werken bij relatief

hoge drukken, de instrumentele eenvoud en bijgevolg de relatief lage kostprijs [18]. Een

nadeel van de quadrupoolmassaspectrometer is dat de massaresolutie zich beperkt tot een

atomaire eenheid (amu) en dat hoge resolutie MS met quadrupooltoestellen bijgevolg niet

mogelijk is.

Tandem Massaspectrometrie

De in dit werk aangewende en tevens een van de meest gebruikte tandem massaspectro-

meters is de triple quadrupool (QQQ). Dit instrument bestaat uit twee massa-analysators

(Q1 en Q3) gescheiden door een botsingscel (Q2). Door specifieke monsterionen te frag-

menteren en deze dochterionen te identificeren kan structurele informatie over het analiet

bekomen worden. Tandem-MS wordt vaak gebruikt, zoals in dit werk, voor de kwanti-

tatieve analyse van specifieke componenten te detecteren in complexe mengsels (plasma,

urine,...) op basis van hun specifiek en karakteristiek fragmentatiepatroon. De botsings-

cel is gevuld met een botsingsgas (in dit werk N2) waar moederionen, geselecteerd door

Q1, mee zullen botsen en fragmenteren. De geproduceerde dochterionen worden gefilterd

door Q3 tot dat ze uiteindelijk de detector bereiken. Door drie quadrupolen te koppelen

wordt de selectiviteit en de gevoeligheid sterk verbeterd ten opzichte van een enkelvoudige

quadrupool.

De detector: Elektronenvermenigvuldiger

Het laatste onderdeel van de massaspectrometer is de detector. De detector genereert

een elektrisch signaal wanneer het door een ion geraakt wordt en versterkt dit tot een

bruikbaar signaal voor het dataverwerkingssyteem. Meestal is de massaspectrometer uit-

gerust met een elektronenvermenigvuldiger (electron multiplier, EM) als detectiesysteem.

De elektronenvermenigvuldiger bestaat uit een aantal opeenvolgende dynodes (een aan-

tal elektrodes tussen de anode en de kathode van de elektronenvermenigvuldiger) waarop

steeds een hogere potentiaal aangebracht werd. Wanneer een ion invalt op de kathode van

31


de EM worden een aantal secundaire elektronen vrijgesteld. Deze elektronen worden door

het potentiaalverschil versneld naar de daaropvolgende dynode waar een nieuwe botsing zal

plaats vinden. Bij deze botsing wordt een veelvoud aan nieuwe elektronen vrijgesteld die

opnieuw zullen botsen met de volgende dynode. Dit vermenigvuldigingseffect voorzaakt

uiteindelijk een elektronenlawine die makkelijker gemeten kan worden.

Modes voor dataverwerking in MS en tandem-MS.

Voor het verkrijgen van data bij gebruik van een enkelvoudige quadrupool kunnen twee

verschillende modes onderscheiden worden:

• TIC: total ion current

De TIC-modus is beter bekend als de scan modus. Hierbij worden complete spectra

herhaaldelijk opgenomen in een gedefineerd massabereik. Spectra moeten snel op-

genomen worden om zeker te zijn dat een spectrum volledig in de chromatografische

piek ligt. Wanneer bijvoorbeeld in het massabereik van 50 tot 500 dalton gescand

wordt bij lage resolutie, zal er 10 ms per massa-eenheid gespendeerd worden. Gedu-

rende deze periode (dwell time) worden alle ionen geteld die de detector bereiken.

Om de gevoeligheid te verhogen kan het massabereik verkleind worden of de dwell

time verhoogd worden.

• SIM: Single Ion monitoring

Wanneer de beoogde componenten gekend en goed gekarakteriseerd zijn wordt SIM

aangewend. Maximale gevoeligheid wordt verkregen doordat de volledige meettijd

gespendeerd wordt om een, of meerdere, m/z waardes te meten.

Wanneer een triple quadrupool (QQQ) gebruikt wordt, zijn er doorgaans 4 verschillende

scanmodi ter beschikking die toelaten om heel wat informatie over de molecules te verza-

melen of om zeer gevoelig metingen uit te voeren.

• Dochter (product) ion scan

De eerste quadrupool wordt gebruikt om de ionen van interesse met een welbepaalde

massa te selecteren. Deze ionen worden gefragmenteerd in de botsingscel en erna

32


gescheiden volgens m/z in de Q3-analysator. Het resulterende massaspectrum levert

informatie over het fragmentatiepatroon van de vooraf gekozen precursor ionen [17].

Figuur 1.16: Dochter (product) ion scanmodus.

• Ouder (precursor) ion scan

In deze modus wordt de eerste quadrupool (Q1) in scan modus geplaatst en de derde

quadrupool zodanig ingesteld dat slechts ionen met een welbepaalde m/z waarde de

detector bereiken. Een signaal wordt enkel en alleen maar waargenomen wanneer

ionen zowel door Q1 als Q3 doorgelaten worden, wanneer dus het gewenste doch-

terion gevormd wordt (Figuur 1.17). Deze modus laat toe om bv. specifiek klasses

moleculen te detecteren die gekwantiseerd worden door gekende fragmentaties (bv.

fosfolipiden).

Figuur 1.17: Ouder (precursor) ion scanmodus.

• Neutraal verlies (neutral loss) scan

Naast fragmentatiereacties kunnen ook moleculen met specifieke functionele groepen

reorganisatiereacties ondergaan in de ionenbron van de massaspectrometer. Deze

reorganisatiereacties kunnen ook plaatsvinden in tandem-MS waarbij de neutral loss

scanning modus toelaat om fragmentaties te detecteren waarbij een welbepaalde

33


hoeveelheid massa verloren gaat (bv. verlies van CO2, - 44 amu). De kennis hiervan

kan van groot belang zijn bij de structuuranalyse van ongekende componenten. In

deze modus worden de massa-analysator zowel voor als na de botsingscel in de scan

modus geplaatst.(Figuur 1.18)

Figuur 1.18: Neutral loss scanmodus.

• Multiple Reaction Monitoring (MRM)

In de MRM-mode worden beide massa-analysatoren statisch ingesteld op een be-

paalde m/z-waarde. Specifiek geselecteerde ionen worden naar de botsingscel ge-

bracht, waarna specifiek geselecteerde dochterfragmenten de elektronenvermenigvul-

diger bereiken (Figuur 1.19). Deze uiterst gevoelige methode kan enkel aangewend

worden wanneer vooraf de te onderzoeken componenten gekend zijn. MRM wordt,

net zoals in dit werk, gebruikt om de aanwezigheid van een component in een ma-

trix ondubbelzinnig te bevestigen, bv. het tryptofaangehalte in bloedplasma. Merk

op dat naast deze zeer hoge specificiteit van de QQQ-MS, de retentietijden van de

molecules voor een extra bevestiging van hun identiteit zorgt.

Figuur 1.19: Multiple Reaction Monitoring modus

34

HOOFDSTUK 2

STATISTIEK EN CHEMOMETRIE

In dit werk werd gebruik gemaakt van enkele typische statistische basistoepassingen en

enkele meer geavanceerde chemometrische technieken zoals principale componentenanalyse

en regressie-analyse. De term Chemometrie werd in 1974 geıntroduceerd door de Zweedse

organische scheikundige Svante Wold [20]. Hij definieerde het kernachtig als volgt : “

Chemometrie is de tak van de chemie die zich bezig houdt met de analyse van chemische

data (extraheren van informatie uit deze data) en die er voor zorgt dat deze experimentele

data zoveel mogelijk bruikbare informatie bevat (experimentele design). ”. In wat volgt

wordt een kort overzicht gegeven van statistiek en chemometrie die gebruikt werden in het

kader van deze studie.

2.1 Standaarddeviatie

De standaarddeviatie, ook wel standaardafwijking genoemd, is een maat voor de spreiding

van een variabele. In dit werk omvat dit piekoppervlaktes (in tellen) of retentietijden (in

minuten). De standaarddeviatie wordt gedefineerd als de wortel uit de variantie en kan

berekend worden via:

S =

√∑ni=1(xi − x)2

n− 1(2.1)

35

Hoofdstuk 2. Statistiek en chemometrie

Hierbij zijn :

n = het aantal experimenten

xi = piekoppervlak of retentietijd van de individuele meting

x = de gemiddelde waarde van de piekoppervlaktes of van de retentietijden.

2.2 Relatieve standaarddeviatie

De relatieve standaarddeviatie (RSD, relatieve standaardafwijking), in publicaties vaak

weergegeven als CV (coefficient of variation), geeft de percentuele verhouding van de

standaarddeviatie ten opzichte van het gemiddelde. De RSD-waarde wordt bekomen via

vergelijking 2.2:

RSD =S

x× 100% (2.2)

2.3 Detectielimiet

De detectielimiet (Limit of detection, LOD) is de laagste concentratie die een signaal

geeft dat significant verschilt van het signaal van een blanco monster. De detectielimiet

wordt soms verkeerdelijk verward met gevoeligheid (sensitivity), wat slaat op de rich-

tingscoefficient van de kalibratiecurve. De LOD kan op verschillende manieren berekend

worden:

36

2.3. Detectielimiet

• Het kleinste signaal dat onderscheiden kan worden van de ruis, waarbij de signaal-

tot-ruis verhouding (signal-to-noise, S/N, gemeten zoals op Figuur 2.1) S/N = 3

algemeen als LOD beschouwd wordt [11]. Algemeen wordt Limit of Quantitation

(LOQ) beschouwd als S/N = 10.

Figuur 2.1: Berekenen van de signaal-tot-ruis verhouding op een chromatogram.

• De EPA (Environmental Protection Agency) stelt dat LOD’s moeten bepaald worden

door herhaling van een analyse van een standaardoplossing van het analiet. Vervol-

gens wordt voor het analiet de standaardafwijking berekend en deze vermenigvuldigd

met 3, wat de LOD oplevert [21].

• De LOD kan ook geextraheerd worden uit de opgestelde kalibratiecurve. Hierbij

wordt er gebruik gemaakt van de richtingscoefficient en de standaardafwijking op de

respons (oppervlakte) [11]. LOD kan bekomen worden via:

LOD =3, 3× σS′

(2.3)

Hierbij zijn :

σ = standaardafwijking van de kalibratiecurve

S′ = richtingscoefficient

In dit werk werd gebruik gemaakt van de methode weergeven op Figuur 2.1 om LOD en

LOQ te bepalen.

37


2.4 Significantie: de t-toets

De t-toets wordt gebruikt om te achterhalen of het verschil tussen 2 waarden of 2 normaal

verdeelde groepen (bv. IBD-patienten en controlepersonen) significant verschillend zijn,

of dat het verschil tussen beide waarden te wijten is aan toevallige variatie [22].

De t-toets werd in 1908 ontwikkeld door William Sealy Gosset. Daar deze statistische

methode door zijn werkgever (Guinness) als bedrijfsgeheim beschouwd werd, werd Gosset

verplicht zijn werk te publiceren onder zijn pseudoniem: ‘Student’. Vandaar wordt de

t-toets soms vernoemd als de Student t-test.

In dit werk wordt gebruik gemaakt van de t-toets voor 2 onafhankelijke steekproeven.

Hierbij wordt er veronderstelt dat de steekproeven afkomstig zijn van populaties waarvan

de standaarddeviaties niet gelijk zijn. Wanneer de nulhypothese stelt dat de populatiege-

middelden gelijk zijn :

H0 = µ1 = µ2 (2.4)

dan kan de t-waarde als volgt berekend worden:

t =(x1 − x2)√

s1n1

+ s2n2

(2.5)

waarbij het aantal vrijheidsgraden gelijk is aan:

df =(s21n1

+s22n1

)2

s41n21(n1−1)

+s42

n22(n2−1)

(2.6)

De propabiliteit dat de bekomen waarde voor t groter is dan de getabeleerde waarde (voor

een 95% confidentie-interval, bij een zelfde aantal vrijheidsgraden) wordt uitgedrukt door

de significantie. Indien de significantie groter is dan 5%, anders geformuleerd P (|t| ≥

t0) ≥ 0, 05, dan kan gesteld worden dat verschil tussen de 2 waarden of groepen te wijten

is aan toevallige variatie. Is P (|t| ≥ t0) < 0, 05, dan moet de nulhypothese H0 verworpen

worden.

38

2.5. Principale componenten analyse

2.5 Principale componenten analyse

Principale componenten analyse (Principal Component Analysis, PCA) is een chemome-

trische techniek met als doel de hoeveelheid data te reduceren door p oorspronkelijk ver-

anderlijken Xj te vervangen door p nieuwe veranderlijken Zi, die principale componenten

(PC) genoemd worden. Enkele voorwaarden waaraan de PC’s moeten voldoen zijn [20]:

• De PC’s zijn lineaire combinaties van de oorspronkelijke veranderlijken.

• De eerste principale component heeft de grootste variantie, gevolgd door de tweede

principale component, de derde principale component, ... De p-de principale com-

ponent heeft dus de laagste variantie en bevat bijgevolg het minst informatie.

• De variabelen van de data moeten gecorreleerd zijn.

• De principale componenten vertonen geen overlapping van informatie.

De principale componenten Zi worden als volgt opgebouwd :

Z1 = a11X1 + a12X2 + a13X3 + ...+ a1nXn

Z2 = a21X1 + a22X2 + a23X3 + ...+ a2nXn

enz. (2.7)

De coefficienten zijn zo opgebouwd dat de nieuwe PC: Z1, Z2 ... niet meer gecorreleerd

zijn in tegenstelling tot de oorspronkelijke variabelen. Reductie van het aantal variabelen

kan nu bekomen worden door de laatste PC’s, met minst variate en dus informatie, weg

te laten vallen.

39


Figuur 2.2: Grafische weergave van de opbouw van de principale componenten in PCA

Figuur 2.2 geeft dit principe weer voor 2 variabelen en bijgevolg 2 principale componenten,

zoals in dit werk. Figuur 2.2 a geeft de opbouw van de principale componenten weer

(gestreepte lijn). Merk op dat beide PC’s orthogonaal opgebouwd zijn. Figuur 2.2 b

geeft de datapunten en hun projectie t.o.v. PC1 en PC2. Er kan waargenomen worden

dat de projectie op PC1 (niet gevulde stippen) meer variabiliteit, en bijgevolg dus ook

meer informatie bevat dan PC2. Hierdoor is het mogelijk om de variabelen X1 en X2 te

reduceren naar Z1. In het algemeen kan het aantal variabelen n teruggebracht worden op

2 tot 3 principale componenten, met een minimaal verlies aan informatie. [22]

2.6 Kleinste-kwadraten regressie (PLS)

Kleinste-kwadraten regressie (Partial Least Squares, Projection to Latent Structures, PLS)

is een chemometrische regressie-methode die, net zoals bij PCR (Principal Component Re-

gression), het aantal oorspronkelijke predictor variabelen probeert te reduceren. In PLS

moet een onderscheid gemaakt worden tussen predictor en respons variabelen. Hier kun-

40

2.6. Kleinste-kwadraten regressie (PLS)

nen concentraties als predictor variabele naar voor geschoven worden (de oorspronkelijke

onafhankelijk veranderlijke) en de piekoppervlakte als respons variabele. PLS zal het

oorspronkelijk aantal predictor variabelen reduceren door er lineaire combinaties van te

maken. In PLS worden predictor variabelen, die een hoge mate van correlatie met de

respons variabele vertonen, extra gewicht gegeven in de lineaire combinatie. Dit om-

dat ze efficienter zouden zijn in het voorspellen van de regressie-vergelijking. Zo worden

uiteindelijk lineaire combinaties van de predictor variabelen bekomen die in hoge mate

gecorreleerd zijn met de respons variabelen, en tevens ook de variabiliteit bij de predictor

variabelen verklaren. Zoals bij andere datareductiemethodes (bv. PCA, PCR) is het doel

om uiteindelijk minder lineaire combinaties te gebruiken dan het oorspronkelijk aantal

variabelen. De statische achtergrond van PLS behoort niet tot het terrein van deze studie.

We beperken ons in deze thesis enkel tot interpretatie van de PLS-output na interactie

met de hier bekomen data [22].

41


42

HOOFDSTUK 3

LITERATUURSTUDIE

3.1 Inleiding

De ziekte van Crohn en colitis ulcerosa zijn de twee belangrijkste chronische aandoenin-

gen van het maagdarmkanaal. Deze chronische inflammatoire darmziektes worden in het

Engels gebundeld onder de term: ‘Inflammatory Bowel Disease (IBD)’. De beide aandoe-

ningen onderscheiden zich vooral van elkaar op vlak van de locatie en de aard van de

ontstekingsreactie. De ziekte van Crohn kan het volledige maagdarmkanaal, van mond tot

anus, aantasten terwijl colitis ulcerosa enkel de dikke darm viseert (Figuur 3.1). Microsco-

pisch gezien wordt colitis ulcerosa enkel in de slijmvlieslaag van de darmwand teruggevon-

den, terwijl de ziekte van Crohn de volledige darmwand kan aantasten [23] (Figuur 3.2).

De beide aandoeningen steken vaak voor het eerst tussen het twintigste en het dertigste

levensjaar de kop op, waarbij de meerderheid van de patienten een chronische aandoening

ontwikkelen. Hoewel de precieze oorzaak van het syndroom nog steeds een raadsel is,

worden erfelijke en omgevingsfactoren steeds meer naar voor geschoven [24]. Genetisch

onderzoek heeft aangetoond dat aanwezigheid van IBD bij de familie nog steeds de be-

langrijkste onafhankelijke factor is om de ziekte te ontwikkelen [25]. Deze oorzaak wordt

meer en meer aangevuld met factoren inzake de omgeving van de patient. Factoren zoals:

woonplaats, etniciteit, levensstijl (passief en actief roken, overmatige inname van suikers,

appendectomie, ...) blijken een invloed te hebben op de ontwikkeling van een van de aan-

43

Hoofdstuk 3. Literatuurstudie

doeningen. In wat volgt wordt een kort overzicht gegeven van de belangrijkste factoren

van beide aandoeningen.

Figuur 3.1: De aangetaste delen van het maagdarmkanaal bij de ziekte van Crohn (links)en colitis ulcerosa (rechts)

3.1.1 De ziekte van Crohn

De ziekte van Crohn werd voor het eerst ontdekt door de Duitse chirurg Wilhelm Fabry in

1623, maar werd in 1932 volledig beschreven en genoemd naar de Amerikaanse geneesheer

Burril B. Crohn [25]. Zoals hoger al vermeld werd is de ziekte van Crohn een chronische

ontsteking van het maagdarmkanaal, waarbij vooral het laatste deel van de dunne en

de dikke darm getroffen worden. De ziekte van Crohn heeft een uiterst grillig verloop.

De aandoening kan varieren van een snelle uitbreiding naar andere darmgedeeltes in de

accute fase, tot een relatief rustig beeld dat door de jaren heen weinig klachten geeft

en bijgevolg weinig behandeling nodig heeft. De belangrijkste kenmerken van de ziekte

van Crohn zijn ontstekingen van het darm-slijmvlies in combinatie met diepe zweren.

Ontstoken (geınflammeerde) plaasten kunnen vanzelf genezen waarbij een littekenweefsel

achterblijft dat de darmwand dikker en de darmdoorgang nauwer maakt. Wanneer zweren

echter door de darmwand heen groeien produceren zij een kleverig ontstekingsvocht aan de

buitenkant van de darm, waardoor verklevingen tussen het aangetaste deel van de darm

en de buikholte kunnen ontstaan. Via deze verklevingen kan de ontsteking tot in andere

organen doordringen waardoor ongewenste verbindingen, fistels ontstaan. Omdat de darm

ontlasting en bacterien bevat kan het lang duren vooraleer een dergelijke fistel geneest [26].

44

3.1. Inleiding

De belangrijkste symptomen van de ziekte zijn terug te brengen tot de ontstekingen zelf ,

die in ernstige gevallen pijn in de buik, koorts, vermagering en krampaanvallen veroorza-

ken. Omdat ontstoken weefsel veel proteınerijk vocht afscheidt, blijft bij deze aandoening

veel vocht in de darmen en worden voedingstoffen slecht opgenomen. Diarree, soms met

bloed en slijm, en voedingstekorten zijn hiervan het gevolg. Klachten die niet afdoende

behandeld worden kunnen leiden tot vermagering en verklevingen. Mogelijke gevolgen zijn

dat een deel van de dunne darm afgesloten raakt, een obstructie-ileus, waarvoor operatief

ingrijpen noodzakelijk kan zijn.

Om tot de diagnose ziekte van Crohn te komen worden volgende klinische onderzoeken

verricht: lichamelijk onderzoek waarbij vooral de buik en de anus bestudeerd wordt, bloed-

en urineonderzoek, coloscopie, echografie , radiologie, ... [27] Een specifiek dieet is niet

nodig, hoewel de voeding een belangrijk aspect vormt om de lichamelijke conditie op

peil te houden. Vooral vezelrijke producten, met voldoende vochtinname om constipatie

te verkomen, zijn belangrijk. Behandeling van de ziekte van Crohn bestaat uit ontste-

kingsremmende medicijnen zoals 5-Aminosalicylaat (5-ASA) en corticosteroıden; immu-

nosuppresieve middelen zoals azathioprine of ledertrexaat en anti-TNF-α antilichamen

(infliximab of adalimumab) [23].

3.1.2 Colitis ulcerosa

Colitis ulcerosa werd voor het eerst beschreven door de Britse arts Sir Samuel Wilks in

1859 [25]. Colitis ulcerosa vindt zijn etymologische oorsprong in het Latijn, nl. colitis

(ontsteking van de dikke darm) ulcerosa (zweren), of dus een volledige ontsteking van de

dikke darm gepaard gaande met verzwering. Colitis ulcerosa is een chronische ontsteking

van het slijmvlies (mucosa) van de dikke darm. Kenmerkend zijn meerdere oppervlakkige

zweren — ook wel ulcera genoemd — die beperkt blijven tot de slijmvliesbekleding (Figuur

3.2). Meestal begint de ontsteking in de endeldarm, het laatste stukje darm voor de

anus, maar ze kan zich uitbreiden naar de volledige dikke darm. Een levensgevaarlijke

complicatie van de ziekte kan ontstaan bij ernstige ontsteking en verzwering met koorts,

belangrijke bloeding, uitzetting en dreigende perforatie van de darm tot gevolg (toxisch

megacolon)[27].

45


Figuur 3.2: Aantasting van de darmwand bij de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa.

De belangrijkste klachen bij patienten die lijden aan colitis ulcerosa zijn langdurige en

frequente diarree-aanvallen (vrijwel altijd met bloed in de stoelgang), buikkrampen, ver-

moeidheid en koorts. Andere symptomen die kunnen wijzen op colitis ulcerosa zijn bloed-

armoede en vermagering. Periodes met deze klachten gaan vaak weer over waardoor arts

en patient denken dat een gewone buikgriep genezen is. Wanneer deze symptomen echter

langdurig en frequent aanwezig zijn, moet altijd aan de diagnose colitis ulcerosa gedacht

worden. Diagnose van colitis ulcerosa komt tot stand via lichamelijk onderzoek van o.a.

de anus en de buik, bloed- en urineonderzoek, coloscopie en echografie [26].

De behandeling van de aandoening is gebaseerd op het onderdrukken van de onsteking

van het slijmvlies van de dikke darm, de darm tot rust te brengen en zo de functie van

de dikke darm te herstellen. Een specifiek dieet is niet nodig, hoewel voeding van groot

belang is om de fysieke conditie op peil te houden. Net als bij de ziekte van Crohn is is

vezelrijk voedsel in combinatie met voldoende vocht belangrijk. Wanneer de ontsteking

echter actief is, is licht verteerbaar voedsel aangeraden.

Behandeling van colitis ulcerosa gebeurt analoog als de ziekte van Crohn. Middelen zoals

5-ASA en corticosteroıden worden gebruikt om de ontsteking van het slijmvlies af te rem-

46

3.2. Pathogenese van IBD.

men, terwijl azathioprine de werking van het immuunsysteem (mogelijks de oorzaak van

de ziekteverschijnselen) onderdrukt [23]. Soms is operatief ingrijpen nodig bij patienten

waarvan de de dikke darm volledig ontstoken is, de darmwand extreem uitgezet is of ge-

perforeerd dreigt te raken. Indien een operatieve ingreep bij colitis ulcerosa onvermijdelijk

is, wordt steeds de volledige dikke darm verwijderd en een tijdelijk ileostoma, een kunst-

matige afvoerweg voor de vloeibare inhoude van de darm, aangelegd. Na genezing wordt

het stoma meestal weggenomen en wordt een nieuwe verbinding (via een ileo-anale pouch)

met het anaal kanaal gemaakt.

3.2 Pathogenese van IBD.

De pathogenese (stapsgewijze ontstaan en ontwikkeling van een ziekte of aandoening) van

de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa zijn nog altijd niet precies bekend. Wel zijn er een

aantal bevorderende factoren zoals familiaal risico en omgevingsfactoren (zie hoger) ont-

dekt. De meest doorslaggevende bewijzen van een genetische oorsprong van de aandoening

werden geleverd door concordantiestudies bij tweelingen. De concordantie (het risico dat

de twee leden van een tweeling elk de ziekte krijgen) voor een eeneiige tweeling bedraagt

58% voor de ziekte van Crohn en 17% voor colitis ulcerosa. Bij een dizygotische tweeling

bedroeg dit maar respectievelijk 15% en 5% [28]. Dit duidelijk verschil tussen eeneiige en

twee-eiige tweelingen wijst op de belangrijke rol van genetische factoren bij het ontstaan

van de ziekten. Dat meer dan de helft van de eeneiige tweelingen geen chronische darm-

ziekte ontwikkelt wanneer hun tweelingsbroer of -zus er wel aan lijdt, ook al hebben ze

precies hetzelfde erfelijk materiaal, bewijst de rol van de omgevingsfactoren [29]. Deze be-

vindingen leidde in 2001 tot het ontdekken van het gevoeligheidsgen NOD2/CARD15 voor

de ziekte van Crohn, gelegen op chromosoom 16, een bevestiging dat IBD’s gedeeltelijk

genetisch bepaald zijn [30].

De tegenwoordig meest aanvaarde hypothese is dat een IBD-aandoening het resultaat is

van een overbodige en overdreven immuunrespons van het darmslijmvlies (mucosa) op sym-

biotische saprofyten (darmflora)[25]. Antigenen afkomstig van symbiotische darmbacterien

kunnen het immuunsysteem op verschillende manieren op gang zetten. Het verschijnsel

47


waarbij myeloıde dendritische cellen uit de mucosa verkeerdelijk deze symbiotische bac-

terien als pathogenen beschouwen, is een van deze manieren. Experimenteel bewijs werd

hiervoor geleverd doordat aangetoond werd dat in muizenmodellen IBD-aandoeningen

nooit ontwikkeld werden in bacterie-vrije omgevingen [23]. De verkeerdelijke inschatting

van deze dendritische cellen (deel uitmakend van het aangeboren immuunsysteem) scha-

kelt ook het verworven immuunsysteem aan waardoor een cascade aan ontstekingsreacties

ontstaan. Wanneer dit immuunsysteem in werking treedt ontstaat een verhoogde secretie

van inflammatoire signaalproteınes, cytokines genaamd. Verschillende cytokines spelen

een belangrijke rol bij de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa [23]:

• Interleukines (IL) : IL-4, IL-5, IL-12, IL-13

• Interferonen (IFN): IFN-γ

• Tumor Necrosis Factor (TNF) : TNF-α

Bij een ontsteking wisselen de verschillende lymfocyten (verschillende types witte bloed-

cellen) cytokines uit om hun acties op elkaar af te stellen. Deze pro-inflammatoire eiwitten

— waaronder TNF-α en IFN-γ — bevorderen in het algemeen de ontstekingsreactie, wat

in se heilzaam is voor het organisme. Bij aandoeningen zoals de ziekte van Crohn en colitis

ulcerosa slaat het immuunsysteem echter op hol en wordt de ontsteking chronisch, ook al

heeft ze geen enkel nut meer. Het afweersysteem keert zich tegen het lichaam, waarbij

de cytokines zoals TNF-α en IFN-γ het ontstekingsproces bevorderen. Organen worden

aangetast, verzwering vindt plaats, fistels groeien, ... m.a.w. een chronische inflammatoire

darmziekte (IBD) is het gevolg.

3.3 Tryptofaan-depletie en vermoeidheid bij IBD: een oor-zakelijk verband?

Een chronische darmaandoening kent over het algemeen een zeer grillig verloop bestaande

uit acute periodes van inflammatie en periodes van remissie zonder objectiveerbare ziekte-

activiteit. Vermoeidheid is een van de belangrijkste symptomen tijdens de ziekte. Deze

vermoeidheid kan uiteraard prominent zijn tijdens actieve ziekte-opstoten doch kan ook

48

3.3. Tryptofaan-depletie en vermoeidheid bij IBD: een oorzakelijk verband?

opvallend aanwezig blijven tijdens episodes van remissie (waarbij de patient geen enkele

andere klacht van de darmziekte ondervindt). De onderliggende oorzaak van deze ver-

moeidheid (zeker in geval van inactieve ziekte) is onduidelijk en onverklaard. Een mogelijke

hypothese hiervoor is een verhoogde activiteit van het enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase

(IDO) door de cytokines IFN-γ en TNF-α.

3.3.1 Tryptofaan-depletie bij verhoogde IDO-activiteit

Indoleamine 2,3-dioxygenase, kortweg IDO (Figuur 3.3), is een intracellulair enzym dat

tryptofaandegradatie katalyseert via het kynurenine-reactiepad [31]. Tryptofaan (Figuur

3.3) — een natuurlijk voorkomend, essentieel aminozuur — dient enerzijds als precur-

sor van de belangrijke centrale neurotransmitter serotonine (5-hydroxytriptamine, 5-HT

Figuur 3.3) en wordt anderzijds gemetaboliseerd tot kynurenine (Figuur 3.3) via het IDO-

reactiepad (Figuur 3.4 ).

Figuur 3.3: Belangrijke structuren.

IDO speelt een sleutelrol in immunologische processen zoals infectie, autoimmuniteit, al-

lergische reacties en chronische ontsteking [32]. De groep van Wolf [33] ontdekte voor het

49


eerst dat cytokines zoals IFN-γ en TNF-α een stimulerende activititeit voor IDO bezitten.

Bijgevolg stelden Wolf et al. [33] dat IBD-patienten te kampen hebben met een overmatige

expressie van het IDO-enzyme. Een verhoogde IDO-activiteit leidt op zijn beurt tot een

verlaagde concentratie van tryptofaan, een tryptofaan-depletie, en een verhoogde concen-

tratie van zijn toxisch metaboliet kynurenine. Meten van de kynurenine/tryptofaan-ratio

levert informatie op over de IDO-activiteit en dus de mate van inflammatie van het maag-

darmkanaal. Terwijl Wolf et al. dit testte op biopsien (secties) van het darmslijmvies, werd

dit door onder andere Yamada et al. en Forrest et al. bevestigd voor bloedplasma [34, 35].

Deze bevindingen werden ondersteund door Torres et al. voor coeliakie (gluten-allergie)

[36] en door Schefold et al. voor CKD (chronische nieraandoening) [32].

Figuur 3.4: Metabolisatie van tryptofaan tot serotonine enerzijds (boven) en kynurenineanderzijds (onder).

3.3.2 Emotionele gevolgen van tryptofaan-depletie

IFN-α wordt vaak gebruikt als geneesmiddel tegen hepatitis C en kanker [37], hoewel

bijwerkingen zoals: slaperigheid, irriteerbaarheid, futteloosheid, ... echter onvermijdbaar

50

3.4. Chromatografische bepaling van tryptofaan en kynurenine: een overzicht.

zijn. Net zoals IFN-γ en TNF-α, stimuleert IFN-α de activiteit van IDO. Het effect van een

verhoogde IDO-activiteit op de gemoedstoestand van de patient is tweeledig. Enderzijds

leidt de overstimulatie van IDO tot een tryptofaan-depletie, wat een lagere concentratie

van serotonine (5-HT) in de hersenen teweeg brengt. Een tekort aan serotonine in de

synaptische spleet kan een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van vermoeidheidsver-

schijnselen en depressie [38]. Anderzijds werd aangetoond dat verschillende metabolieten

gevormd langs het kynurenine-reactiepad, neurotoxische effecten hebben met neurode-

gradatie tot gevolg. Zo spelen 3-hydroxy kynurenine en quinolinezuur (quinolinic acid),

weergegeven in Figuur 3.4 een belangrijke rol bij de ontwikkeling van depressie en de

bijkomstige symptomen [37].

Samenvattend kan gesteld worden dat de verhoogde IDO-activiteit via cytokines zoals

IFN-γ en TNF-α, als gevolg van het geactiveerde immuunsysteem door de chronische

darminflammatie, leidt tot een depletie van het tryptofaangehalte in bloedplasma. Meten

van de kynurenine/tryptofaan-ratio weerspiegelt de IDO-activiteit en kan een mogelijke

verklaring geven voor de vermoeidheidsverschijnselen bij IBD-patienten.

3.4 Chromatografische bepaling van tryptofaan en kynurenine:een overzicht.

3.4.1 Gaschromatografie

Gezien de hoge polariteit van aminozuren in het algemeen, tryptofaan en kynurenine

specifiek, en hun lage ontbindingstemperaturen is gaschromatografie (GC) geen goede

techniek om aminozuren te analyseren. Mits derivatisatie, met behulp van bv. silylatie

of verestering-acylatie, kunnen de polaire functies echter gemaskeerd worden en is GC-

analyse wel mogelijk. Verestering-acylatie voor tryptofaan, met ethyl- of propylchlorofor-

maat, worden gebruikt voor aminozuuranalyse gebruik makende van GC-FID of GC-MS.

Phenomenex heeft op basis van propylchloroformaat een kit gecommercialiseerd waarmee

derivatisatie van aminozuren mogelijk is. Nadelen hiervan zijn tijd en prijs. LC-MS is

lijkt veel logischer voor analyses van aminozuren in bloedplasma.

51


3.4.2 Vloeistofchromatografie

Om redenen aangehaald in de vorige paragraaf is in het overgrote deel van de literatuur,

waarbij al-dan-niet tryptofaan en/of kynurenine simultaan geanalyseerd werden, gebruik

gemaakt van omkeerfase LC. Snelheid, efficientie en betrouwbaarheid van die methode

werden daarbij dikwijls als grootste voordelen naar voor geschoven [39]. Scheidingen op

C18 - kolommen [40, 41, 42, 34, 43, 44, 39, 45, 46], met een grote verscheidenheid aan ko-

lomdimensies, en C8-kolommen [47] werden gemeld. Petritis et al. beschreef onder andere

het gebruik van een Hypercarb-kolom. Deze kolom met actieve kool werd aanvankelijk in

dit werk ook gebruikt, daar de hoge retentie op die kolommen de analyse van niet gederiva-

tiseerde aminozuren toelaat [41, 48]. De groep van Amirkhani publiceerde een methode op

basis van een capillaire C18 -kolom [46]. De betrouwbaarheid en robuustheid van capillaire

LC is echter heel wat minder goed in vergelijking met de klassieke kolomdimensies. Voor

een uitgebreid onderzoek, zoals in deze scriptie, lag het gebruike van conventionele om-

keerfase LC dan ook voor de hand. Als mobiele fase werd in de literatuur, afhankelijk van

het detectiesysteem, gekozen voor fosfaat- [40, 44], acetaat- [42, 43, 45, 47] en ammonium-

formaatbuffers [34] of voor typische omkeerfase chromatografie solventen zoals H2O met

mierezuur (FA) [46] of heptafluorboterzuur (HFBA) [41], als waterige fase, in combinatie

met methanol (MeOH) [34, 44] of acetonitril (ACN) [40, 41, 42, 46, 47] of een combinatie

ervan [43] als organische fase. Niet vluchtige buffers worden achterwege gelaten (behalve

door Yamada et al. [34]), wanneer massaspectrometrie (MS) als detectiesysteem werd

aangewend. Dit omdat de ionisatiebronnen in LC-MS anders zeer snel vervuild zouden

geraken met verlies van gevoeligheid en niet reproduceerbare piekoppervlaktes als gevolg.

Afwisselend werd gekozen voor een isocratisch [40, 42, 45] of een gradient [34, 43, 41] elu-

tieprogramma. Gradient elutie is echter veel beter voor analyse van plasma, daar gebruik

van een isocratische methode zeer snel tot proteıneprecipitatie in de kolom kan leiden, wat

de kolom na enige tijd waardeloos zou maken.

3.4.3 Detectie van tryptofaan en kynurenine.

De voorgestelde methodes in de literatuur verschilden vaak van elkaar op vlak van ge-

bruikte detectiesysteem. Elk systeem heeft zijn eigen voor- en nadelen, maar vaak is de

52


beschikbaarheid en aankoopprijs een bepalende factor. De origine van de monsters is

hierbij ook van belang daar dit tot grote verschillen in noodzakelijke gevoeiligheid van de

methode kan leiden. Verschillende methodes werden beschreven.

De groep van Tcherkas [44] en Maneglier [40] gebruikten beiden elektrochemische detectie.

Maneglier et al. gebruikte coulormetrische detectie zonder derivatisatie, terwijl Tcherkas

et al. verschillende aminozuren, waaronder tryptofaan, elektrochemisch detecteerde na

OPA-derivatisatie. Maneglier et al. schoven de zeer hoge specificiteit en verminderde

fluorescentieproblemen als grootste voordelen van hun ontwikkelde methode naar voor.

Een steeds voorkomend probleem met elektrochemische detectie zijn modificaties die aan

de elektrode kunnen optreden (electrode foaling) tijdens de analyse van complexe monsters

zoals bloedplasma. Dit leidt dikwijls tot weinig reproduceerbare kwantitatieve resultaten.

De groep van Petritis [41] ging origineel te werk. Ze slaagden erin om niet gederivatiseerde

aminzuren en metabolieten te detecteren met een ELSD-detector (Evaporative Light Scat-

tering Detection) via ion-interactie chromatografie. Het gebruik van het ionparend reagens

HFBA als additief voor de waterige mobiele fase, zoals in dit werk, werd hier naar voor

geschoven. De ELSD-detector is echter niet zo gevoelig (state of the art ELSD detectors

hebben een detectielimiet van 1 µg/ml), wat een probleem vormt voor de analyses in dit

werk, waar er vaak onder het ppm-niveau (µg/ml) moet gekwantificeerd worden.

Vaak werden UV-VIS en Fluorescentiedetectie, apart [45, 47, 39] of gekoppeld aan elkaar

[42, 43, 49] als detectiesysteem naar voor geschoven. Het voordeel van beide detectoren

aan elkaar te koppelen is een verhoogde selectiviteit van detectie. Slecht enkele amino-

zuren bevatten een chromofore of fluorofore groep (waaronder tryptofaan) waardoor niet

alle aminozuren via UV of FLD (Fluorescentiedetectie) bepaald kunnen worden. Nadeel

aan het gebruik van dergelijke spectrometrische methodes is dat derivatisatie bijna steeds

noodzakelijk is indien men zich niet wil beperken tot enkel de analyse van hoge concen-

traties. Na derivatisatie is overlap met andere pieken, met verkeerde kwantificaties tot

gevolg, steeds mogelijk waardoor deze detectie niet mogelijk is in dit werk. Het gebrek

van een sterk chromofore of fluorofore groep zorgt ervoor dat deze extra functionele groep

voorafgaand aan de scheiding (pre-kolom derivatisatie) of detectie (post-kolom derivatisa-

53


tie) chemisch verankerd moeten worden aan het tryptofaan of kynurenine. Dansyl chloride

[50] en o-phthalaldehyde (OPA)[43, 44] zijn de meest gebruike reagentia voor pre-kolom

derivatisatie. De aminozuren die gederivatiseerd worden met OPA of dansylchloride zijn

ook hydrofober en worden daarom veel beter geretenteerd op klassieke C18-kolommen bij

omkeerfase LC. In Figuur 3.5 is de reactie van tryptofaan met OPA in aanwezigheid van

2-mercaptoethanol weergegeven. Voordelen zijn een verhoogde gevoeligheid en selectivi-

teit. Kynurenine is niet fluorescerend waardoor derivatisatie ofwel een gekoppelde UV-

Fluorescentie detector nodig zijn voor detectie [45]. Nadelen van alle methodes waarbij

derivatisatie gebruikt worden zijn: arbeidsintensief, tijdrovend, mogelijk extra bron van

onzuiverheden, instabiliteit en variabiliteit als gevolg van onvolledige derivatisatie [51, 41].

Keuze van het al dan niet derivatiseren van tryptofaan en kynurenine is dus deels arbitrair

gezien de vele beschreven mogelijkheden.

Figuur 3.5: Derivatisatie van tryptofaan met o-phthaalaldehyde en 2-mercaptoethanol

In dit werk werd er, zoals verder uiteengezet, gezocht naar een methode die toeliet om

zeer betrouwbaar kynurenine en tryptofaan te kwantificeren in complexe monsters zoals

bloedplasma. Er werd tevens geopteerd om de monstervoorbereiding zo eenvoudig moge-

lijk te houden (zie verder). LC-MS/MS is vandaag de methode die toelaat om dit alles

uit te voeren voor grote hoeveelheden monsters. De selectiviteit van de methodologie is

uniek daar de moleculen gekarakteriseerd worden door retentietijd en specifieke fragamen-

tatiepatronen. Bovendien is analyse met LC-MS/MS op ng/ml niveau volkomen mogelijk,

wat ook inhoudt dat de kwantificatie van kynurenine en tryptofaan, die op µg/ml-niveau

voorkomen in bloed, uiterst betrouwbaar wordt. Het grootste nadeel van een LC-MS/MS

methode zijn de kostrpijs en de grotere ontwikkelingstijd die nodig is om een methode op

54


punt te stellen.

Als laatste, en tevens ook in dit werk gebruikte, detector wordt ESI-MS/MS aangehaald

[34, 46]. Indien de niet gederivatiseerde moleculen geretenteerd zijn op de kolom is deri-

vatisatie in dit soort scheidingsmethode niet nodig omdat de gevoeligheid geleverd wordt

door de MS-detector. Specificiteit, gevoeligheid, selectiviteit en simultaan meten zijn

sterke voordelen waardoor deze detector ideaal is om analietmoleculen in een complexe

biologische matrix, zoals bv. plasma, te meten. Beide groepen maakten gebruik van de po-

sitieve modus om de moleculen te meten in combinatie met ‘Multiple Reaction Monitoring’

(MRM) om de hoogste gevoeligheid te behalen.

3.4.4 Monstervoorbereiding en kwantificatie.

In dit werk werd het doel voorop gesteld om tryptofaan- en kynurenineconcentraties te

meten in bloedplasma. Het is dus gewenst om de nodige monstervoorbereiding hier op

uit te voeren. Proteıneprecipitatie, van hoofdzakelijk humaan serum albumine (HSA), is

noodzakelijk om o.a. de gebruiksperiode van de kolom hoog te houden. Neerslaan van

de proteınes met HClO4 [40], TCA (gechloreerd azijnzuur) [42, 45, 46], TFA (Trifluo-

razijnzuur) [34], methanol [44] werden voorgesteld, waarna centrifugatie gedurende enkele

minuten volgde. Marklova et al. voerde een vast fase extractie (SPE) uit als monstervoor-

bereiding.

De voorgestelde methodes beperken zich niet enkel tot plasma als biologische matrix. De

literatuur vermeldt dat deze methodes ook gebruikt werden voor andere biologische matri-

ces zoals: urine, serum, hersenvocht (cerebrospinal fluid), supernatans van gecultiveerde

cellen, enz. [44, 34].

Verschillende methodes van kwantificatie werden voorgesteld. De literatuur vermeldt

vooral externe kalibratie [40, 34, 49] zonder gebruik van een interne standaard. Kali-

bratie met 3−nitro− l− tyrosine als interne standaard werd voorgesteld door Laich et al.

[42]. De groep van Amirkhani [46] stelde standaardadditie voor als kalibratiemethode, dit

om matrixeffecten op de elektrospray-respons te onderdrukken. De keuze van een gedeute-

reerde interne standaard zoals die in dit werk gebruikt wordt, in combinatie met MS-MS,

laat echter de meest betrouwbare kwantifcatie toe.

55


56

HOOFDSTUK 4

EXPERIMENTEEL GEDEELTE

4.1 Algemene Experimentele Aspecten

4.1.1 Chemicalien

De gebruikte chemicalien L-tryptofaan en DL-Kynurenine (95% zuiver) waren beide af-

komstig van Sigma Aldrich. De gebruikte interne standaard L-tryptofaan-indool-d5 werd

verkregen bij Isotec. De solventen (LC-MS kwaliteit) water, methanol en acetonitril zijn

afkomstig van Biosolve. Heptafluoroboterzuur (HFBA) van Fluka werd gebruikt. 149

plasmamonsters, waarvan 104 afkomstig van IBD-patienten en 45 als controlestaal, wer-

den geleverd door de dienst gastro-enterologie van het UZ Gent. Plasmamonsters werden

bewaard bij −12◦C in de diepvriezer van het laboratorium. De data werden verwerkt

met Analyst Software (versie Analyst 1.4) en met Chemstation software (Agilent). Verder

werd Microsof Excel 2007, SPSS 16 en Matlab 7 gebruikt voor de statistische analyses.

4.1.2 Instrumentatie

De chromatografische analyses werden uitgevoerd op een Agilent 1200 series en een Al-

liance 2690 van Waters. De gebruikte kolom is een Phenomenex Kinetex C18-kolom, 50

mm en 2,1 mm interne diameter en een partikelgrootte van 1,7 µm. Om de hoofdkolom te

beschermen werd een Security Guard (Phenomenex) prekolom gebruikt. Detectie op het

Alliance HPLC-systeem vond plaats met een API 2000 massaspectrometer (Applied Bio-

57

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte

systems Sciex Instruments) en een UV-detector voor de Agilent 1200. Directe injectie in

de massaspectrometer vond plaats met een spuitpomp afkomstig van KR Analytical LTD.

Plasmamonsters werden bereid met pipetten afkomstig van ThermoScientific (Finepipette

10 - 100 µl en 100 - 1000 µl), een vortexmixer afkomstig van LAB-LINE instruments en een

Galaxy 16DH centrifuge van VWR. Voor het filteren van het supernatant, afkomstig van

het plasma, werden polyvinylideen (PVDF) spuitfilters (0,45 µm) van GRACE gebruikt.

4.1.3 Veiligheidsaspecten

L-tryptofaan is licht irriterend bij contact met de huid en ogen en door inname of inhalatie.

Kynurenine kan irriterend zijn bij inname en inhalatie of bij contact met huid of ogen.

Acetonitril is schadelijk bij inhalatie of inname en kan irritatie veroorzaken bij contact met

de huid. Acetonitrile is tevens licht ontvlambaar. Methanol is giftig bij inhalatie, opname

door de mond en contact met de huid. Methanol is licht ontvlambaar, kan elektrostatisch

opgeladen worden met kans op ontsteking. HFBA veroorzaakt brandwonden in contact

met huid, ogen en luchtwegen. Inname kan zware irritatie veroorzaken met braken tot

gevolg. Gebruik van een labojas, handschoenen, veiligheidsbril en werken in een trekkast

waren dus aangewezen.

4.1.4 Ethische commissie

Het ruimer kader van deze studie werd goedgekeurd door de onafhankelijke Commissie voor

Medisch Ethiek verbonden aan het UZ Gent na consultatie van de lokale commissies voor

Medische Ethiek verbonden aan de ziekenhuizen waar deze studie doorging. Deze studie

werd uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de goede klinische praktijk (ICH/GCP) en de

verklaring van Helsinki (versie 2000) opgesteld ter bescherming van mensen deelnemend

aan klinische studies.

4.2 Optimalisatie van de scheiding van de analieten op eenKinetex kolom.

Voor de scheiding van het testmengsel bestaande uit L-tryptofaan (TRP), kynurenine

(KYN), L-tryptofaan-idool-d5 (TRP-D5) en aanvankelijk kynureninezuur (kynurenic acid,

58

4.2. Optimalisatie van de scheiding van de analieten op een Kinetex kolom.

KYNA) werd gebruik gemaakt van een Kinetex C18 - kolom ( 50 × 2.1 mm, 1.7 µm; Phe-

nomenex, Torrance, USA). Deze kolom werd uiteindelijk gekozen boven de Hypercarb

kolom (Thermoscientific, 100 × 4.6 mm) en Waters XBridge C8-kolom (4,6 × 100 mm)

wegens slechte piekvorm als gevolg van een slechte efficientie (laag aantal platen). Er wordt

niet gesteld dat deze scheiding niet mogelijk is op dit soort kolommen, enkel niet op deze

voor handen. Bovendien kunner er vraagtekens geplaatst worden bij het gebruik van een

Hypercarb-kolom voor de kwantitatieve analyse van TRP en KYN in grote reeksen bloed-

monsters. De zeer hoge retentie die deze kolommen vertonen voor hydrofobe componenten

leidt daarbij gemakkelijk tot irreversibele binding op de fase wat leidt tot problemen met

de reproduceerbaarheid van de retentietijden en dus tot een algemene verlaging van de

robuustheid van de methode.

De scheiding van het testmengsel werd geoptimaliseerd op de Agilent 1200 series HPLC,

met UV als detectiesysteem. Eens de scheiding op punt stond, werd er overgeschakeld

naar de Alliance 2690 van Waters in combinatie met de API 2000 massaspectrometer om

de verwachte lagere detectielimieten in bloedplasma te bereiken. Het voordeel hiervan

is dat, eens overgeschakeld op MS-detectie, het elutiepatroon gekend was en meteen in

MRM-mode gemeten kon worden.

4.2.1 Bereiden van de stockoplossing

Om de geconcentreerde stockoplossing te bereiden werd telkens 0,02 g TRP, KYN en TRP-

D5 afgewogen en opgelost in 20 ml van een (50/50) H2O/MeOH-mengsel om een stock-

concentratie van 1000 ppm te verkrijgen. De TRP- en TRP-D5-oplossing, losten volledig

op na enkele minuten in het ultrasoonbad. Het KYN-mengsel loste enkel op na toevoeging

van een druppel geconcentreerd HCl. De stockoplossingen van 1000 ppm werden gebruikt

voor het maken van testmengsel en kalibratiestandaarden. De stockoplossingen werden

regelmatig opnieuw gemaakt en bewaard in de koelkast.

4.2.2 Ontwikkelen van een gradient elutiemethode.

Zoals hoger vermeld, werd aanvankelijk gebruik gemaakt van een UV-detectie systeem om

TRP, TRP-D5 en KYN te scheiden. In de literatuur werden verschillende absorbantiegolf-

59


lengtes voorgesteld: 254 nm, 280 nm, 363 en 390 nm. Uiteindelijk gaf 254 nm voor TRP

en KYN het beste resultaat, met 254 nm als absorptiemaximum voor kynurenine. Een

testmengsel bestaande uit 10 ppm van elke component werd gebruikt om de scheidings-

methode te ontwikkelen. Verschillende mobiele fases werden getest: methanol/water, me-

thanol/water (+ 0,1 % mierenzuur), methanol/water (+ 0,1% HFBA), acetonitril/water

(+ 0,1% HFBA) en acetonitril/water (+ 0,5% HFBA). Aanvankelijk bestond het idee om

zoveel mogelijk methanol i.p.v. acetonitril te gebruiken, wegens de hoge acetonitrilprijzen.

Wegens de minder goede scheidingen moest van dit idee afgestapt worden. Uiteindelijk

bleek de laatste optie: ACN/H2O (+ 0,5% HFBA) de meest belovende. HFBA als ionen-

parend reagens werd weerhouden toen de hypercarb-kolom getest werd, en bleek mooie

piekvormen te geven. Het debiet werd getest op 0,2 en 0,35 ml (hoger kon niet wegens

de kolomdimensies) waarbij uiteindelijk voor 0,2 ml werd gekozen om de overschakeling

op het andere HPLC-systeem mogelijk te maken. Dit laatste systeem beperkt het gebruik

van hoge debieten in die zin dat er onder de 400 bar gewerkt moet worden. Aanvanke-

lijk werd een gradient elutie uitgevoerd met als initiele condities 90/10 water (+ 0,5 %

HFBA)/ACN. Deze condities werden initieel 2 minuten aangehouden en vervolgens werd

naar een samenstelling van 10/90 water(+ 0,5 % HFBA) /ACN geevolueerd in 10 minuten.

Meteen erna werd naar de initiele condities teruggekeerd in 3 minuten tijd. Het elutiepro-

gramma en het bekomen chromatogram zijn respectievelijk weergegeven in Figuur 4.1 en

Figuur 4.2.

60


Figuur 4.1: Gradient elutieprogramma voor scheiding van het testmengsel.

Figuur 4.2: Chromatogram van het testmengsel gescheiden volgens de gradientmethodeweergegeven in Figuur 4.1.

Dit gradientprogramma leverde een basislijnscheiding op voor alle componenten (inclusief

KYNA). Zoals op Figuur 4.2 kan opgemerkt worden overlappen de TRP en TRP-D5 piek

hoofdzakelijk, wat wegens hun vrijwel identieke chemische samenstelling te verwachten

61


viel. Toch kan opgemerkt worden dat beide pieken niet volledig overlappen. Dit sug-

gereert de zeer hoge kolomefficientie die met de Kinetex 1,7 µm deeltjes bekomen kan

worden. Hoewel deze gradientmethode een goede scheiding oplevert kan deze methode

verder geoptimaliseerd worden. Volgende punten zijn van belang:

• Gedurende de eerste 10 minuten werd een vlakke basislijn verkregen, zonder enige

chromatografische activiteit. Er moet getracht worden de pieken vroeger te laten

elueren en een lagere k-waarde te verkrijgen.

• Deze scheiding werd op Agilent 1200 verkregen bij een druk van maximum 240 bar

bij 0,2 ml/min. Het Waters systeem kan slechts bij maximaal 400 bar geopereerd

worden, wat weinig ruimte over laat voor een lineaire versnelling van het debiet. Om

deze reden is het nuttig om reeds in dit stadium de retentietijden te verkorten.

• In het voorgestelde gradientprogramma werd geen schoonmaakprocedure ingebouwd.

Bij analyse van plasma is het noodzakelijk om gedurende een bepaalde tijd 100 %

organische fase door de kolom te laten lopen, vooraleer te herconditioneren. Dit is

noodzakelijk om zeker te zijn dat de kolom contaminatievrij is vooraleer een nieuwe

analyse te beginnen.

Na verschillende gradientmethodes te testen werd uiteindelijk volgende gradientmethode

gebruikt. De initiele condities bedragen 90/10 water(+ 0,5 % HFBA)/ACN en worden 1

minuut aangehouden. Vervolgens wordt in 5 minuten naar 70/30 water(+0,5 %HFBA)

/ACN gegaan, om daarna in 1 minuut naar 10/90 water(+ 0,5 % HFBA)/ACN te berei-

ken. Deze samenstelling wordt gedurende 1 minuut aangehouden. Direct daarna wordt

de schoonmaakprocedure ingebouwd waarbij gedurende 3 minuten 100 % ACN door de

kolom stroomt. Daarna wordt de kolom gedurende 12 minuten geherconditioneerd. Een

dergelijke lange equilibratie is nodig ook bij zo’n korte kolom om reproduceerbare resulta-

ten te bekomen. Een schematische weergave van het gradientprogramma alsook van het

bekomen chromatogram worden weergegeven in Figuur 4.3 en Figuur 4.4.

62


Figuur 4.3: Optimalisatie van het gradient elutieprogramma voor de scheiding van hettestmengsel.

Figuur 4.4: Chromatogram van het testmengsel gescheiden volgens de geoptimaliseerdegradient elutiemethode.

63


Op Figuur 4.4 is een basislijnscheiding te zien van de componenten: KYN, Kynurenine-

zuur (Kynurenic Acid, KYNA) en TRP (overlappend met TRP-D5) in respectievelijke

elutievolgorde. De bepaling van de KYNA-concentratie werd later achterwege gelaten.

KYNA-concentratie is niet nodig om de IDO-activiteit te bepalen en, alhoewel interes-

sant, werd bijgevolg de bepaling van die component weggelaten uit tijdsoverwegingen en

omdat dit ook niet gevraagd werd door de onderzoeksgroep van Dr. H. Peeters. Alle

analyses werden uitgevoerd bij 30◦C met een injectievolume van 5 µl. Het bekomen

gradientprogramma werd gebruikt op de Waters Alliance 2690 om de plasmamonsters te

analyseren.

4.3 Detectie van het testmengsel met de API 2000 massa-spectrometer

In dit stadium werd er overgeschakeld naar massaspectroscopische detectie. Bloedplasma

is een complexe biologische matrix waardoor coelutie van andere componenten met KYN

of TRP niet ondenkbaar is. De extra selectiviteit en de lagere detectielimieten geleverd

door de MRM-modus van de massaspectrometer leveren heel wat extra voordelen op, en

maken, zoals hoger uiteengezet, van de massaspectrometer de meest geschikte detector om

het bloedplasma te analyseren. Vooraleer de detectie met de MS optimaal is, moeten echter

verschillende parameters aangaande de vorming van de elektrospray door de ESI-bron en

de massaselectie door de quadrupoolfilter aangepast worden.

4.3.1 Optimalisatie van de MS-parameters

Voor de optimalisatie van KYN, TRP en TRP-D5 werd gebruik gemaakt van een oplossing

van 10 µg/ml (10 ppm) verdund uit de bereide 1000 ppm stockoplossing. Elke component

werd via infusie (bij 10 µl/min) met een spuitpomp naar de ionenbron geleid.

Componentafhankelijke parameters

De componentafhankelijke parameters (instellingen voor de quadrupoolfilter) werden hand-

matig geoptimaliseerd via de ‘ramp’ optimalisatiemethode. Het ‘rampen’ van een para-

meter is een procede waarbij een experiment meerdere malen wordt uitgevoerd waarbij

64

4.3. Detectie van het testmengsel met de API 2000 massaspectrometer

een welbepaalde parameter telkens wordt aangepast. Het experiment wordt herhaald tot

een optimum gevonden wordt voor de te ‘rampen’ parameter. De betekenis van deze

componentafhankelijke parameters wordt in wat volgt kort toegelicht:

• CAD Gas (CAD)

De CAD parameter controleert de druk van het botsingsgas in de botsingscel tijdens

Q3 MS en MRM.

• Declustering Potential (DP) De DP parameter controleert de spanning op de

orifice-plaat, wat een invloed heeft op het declusteren van ionen tussen de orifice

en de skimmer. Het wordt gebruikt om solventclusters te minimaliseren die kunnen

achterblijven op monsterionen nadat ze de vacuumkamer zijn binnengegaan en —

indien gewenst— om ionen te fragmenteren. Hoe hoger de spanning, hoe hoger

de energie die aan de ionen gegeven wordt, des te hoger de kans op (ongewenste)

fragmentatie.

• Focusing Potential (FP)

De FP-parameter controleert de spanning die wordt aangelegd op de focusing ring

lens. De FP helpt om ionen te focusseren door de skimmer regio van de MS interface.

Het kan fragmentatie induceren in de interface, net zoals de DP.

• Collision Cell Entrance Potential (CEP)

De CEP parameter wordt gebruikt om ionen te focusseren en te versnellen in de

botsingscel (Q2). CEP speelt een rol bij Q1- en MRM-type scans en is massa-

afhankelijk.

• Collision Cell Exit Potential (CXP)

De CXP parameter wordt gebruikt om ionen te focusseren en te versnellen uit de

botsingscel (Q2). CXP speelt een rol bij Q3 en MRM type scans en is massa-

afhankelijk.

65


• Collision Energy (CE)

De CE parameter controleert het potentiaalverschil tussen Q1 en Q2 voor MRM

type scans. Dit is de hoeveelheid energie die de percursorionen ontvangen bij het

versnellen in de Q2 botsingscel, waar ze botsen met het gas en fragmenteren.

In Figuur 4.5 zijn de geoptimaliseerde componentafhankelijke parameters van KYN, TRP

en TRP-D5 weergegeven.

Figuur 4.5: De componentafhankelijke parameters van KYN, TRP en TRP-D5.

Bronafhankelijke parameters

De bronafhankelijke parameters werden geoptimaliseerd via split infusie. Hierbij werd met

behulp van een T-stuk (de splitter) een debiet van 50 µl/min afkomstig van de directe

infusie (spuit) met het analietmengsel, gecombineerd met een stroom van 150 µl/min

(90/10 water (+ 0,5% HFBA)/ACN) afkomstig van de HPLC naar de MS gestuurd (zonder

kolom). De invloed van deze parameters werd bestuurd door de parameters systematisch

handmatig te varieren tot een maximale intensiteit voor het mengsel bekomen werd. De

aanbevolen verticale positie van de ionenbron bedroeg 3 en de aanbevolen horizontale

positie 5.

• Gas 1 (GS1)

De GS1 parameter controleert het verstuivergas. Het verstuivergas helpt kleine

druppeltjes te genereren van de sample stroom en beınvloedt de stabiliteit en de

gevoeligheid van de spray.

• Gas 2 (GS2)

De GS2 parameter controleert het droog- of turbogas. Het wordt gebruikt om de

66


neveldruppeltjes te helpen verdampen en om zo het solvent te verhinderen monste-

rionen in de gasfase te produceren.

• Temperature (TEM)

De TEM-parameter controleert de temperatuur van het turbogas in de ionenbron.

Het wordt gebruikt om het solvent te helpen verdampen om zo monsterionen in de

gasfase te produceren.

• Curtain Gas (CUR)

De CUR parameter controleert het curtain gas dat tussen de curtain plaat en de

orifice plaat stroomt. Het verhindert dat solventdruppeltjes de ionenoptica bin-

nendringen en contaminatie veroorzaken. Deze parameter moet zo hoog mogelijk

genomen worden zonder gevoeligheid te verliezen.

• Ionspray Voltage (IS)

De IS parameter controleert de spanning die aangelegd wordt op de tip van de

ionenbron die het monster ioniseert. Deze spanning hangt af van de polariteit van

de analieten en beınvloedt de stabiliteit van de spray en de gevoeligheid.

• Interface Heater (ihe)

De interface heater kan aan- of uitgeschakeld worden. Door de interface te verwar-

men, wordt het ionsignaal gemaximaliseerd en wordt contaminatie van de ionenop-

tica verhinderd. De interface plaat wordt tot 100 ◦C verwarmd.

In Figuur 4.6 worden de geoptimaliseerde bronafhankelijke parameters weergegeven.

Figuur 4.6: Bronafhankelijke parameters voor het testmengsel.

Na invullen van de optimale parameters werden volgende TIC-massaspectra bekomen.

67


Figuur 4.7: TIC-spectrum van Kynurenine.

Het massaspectrum van kynurenine geeft een basispiek bij 208,9 amu ([M +H]+). 191,9

amu zal waarschijnlijk het belangrijkste dochterion vormen, terwijl 231,1 amu het Na+-

adduct van kynurenine vormt ( [M + H]+ + 22 amu). Het verlies van 17 amu komt

waarschijnlijk overeen met het verlies van NH+3 , maar kan ook te wijten zijn aan het

verlies van OH+ van het moleculair ion.

Figuur 4.8: TIC-spectrum van tryptofaan.

Het massaspectrum van tryptofaan geeft een basispiek bij 205,0 amu ([M + H]+). 188,0

amu zal meer dan waarschijnlijk het belangrijkste dochterion vormen, terwijl 227 amu het

Na+-adduct van tryptofaan vormt ( [M +H]+ + 22 amu). Het verlies van 17 amu komt

68


waarschijnlijk overeen met het verlies van NH+3 , maar kan ook te wijten zijn aan het verlies

van OH+ van het moleculair ion.

Figuur 4.9: TIC-spectrum van gedeutereerd tryptofaan.

Het massaspectrum van gedeutereerd tryptofaan geeft een basispiek bij 210,0 amu ([M +

H]+). 192,0 amu zal meer dan waarschijnlijk het belangrijkste dochterion vormen, terwijl

232,0 amu het enkele Na+-adduct van TRP-D5 vormt ( [M +H]+ + 22 amu) en 254,0 het

dubbele Na+-adduct ([M + H]+ + 2× 22 amu). 248,0 vormt het K+-adduct ([M + H]+

+ 38 amu) van TRP-D5. Merk op dat het moleculair ion van TRP-D5 een fragment van

18 amu verliest i.p.v. 17 amu in het geval van de niet-gedeutereerde component. Dit

suggereert dat er toch ook protonen van de NH2 of de OH groep gedeutereerd zijn. Dit

was enerzijds verwonderlijk daar het tryptofaan in principe enkel op de indool-structuur

gedeutereerd was. Anderzijds lijkt het helemaal denkbaar dat er toch ook uitwisseling van

de protonen plaats gevonden heeft, daar er met deze protonen het makkelijkst uitgewisseld

kan worden.

Na uitvoeren van een dochterscan op KYN, TRP en TRP-D5 werden volgende massaspec-

tra verkregen. Het verlies van 18 amu is hierbij ook de meest voorkomende fragmentatie.

69


Figuur 4.10: Dochterscan van kynurenine met 209,2 als precursorion en 192,1 als belang-rijkste dochterion.

Figuur 4.11: Dochterscan van tryptofaan met 205,2 als precursorion en 188,2 als belang-rijkste dochterion.

70


Figuur 4.12: Dochterscan van gedeutereerd tryptofaan met 210,2 als precursorion en 192,1als belangrijkste dochterion.

Op basis van de uitgevoerde dochterscans en automatische massa-optimalisatie werd vol-

gend MRM-schema bekomen (Figuur 4.13).

Figuur 4.13: Bekomen MRM-schema voor de analyse van KYN, TRP en TRP-D5.

De massaspectrometer wordt nu als zo goed mogelijk afgesteld beschouwd om zo gevoelig

mogelijk het testmengsel en de bloedplasmamonsters te analyseren. Figuur 4.14 toont het

chromatogram dat bekomen werd door gebruik te maken van de geoptimaliseerde gradient

elutiemethode (Figuur 4.3) en de ontwikkelde MRM-methode. De herhaalbaarheid voor

deze ontwikkelde methode werd getest door een tienvoudige injectie van het testmengsel.

Zoals de tabel in Figuur 4.15 weergeeft wordt een goede herhaalbaarheid (RSD ≤ 5%)

verkregen voor zowel het piekoppervlak als de retentietijd van KYN, TRP en TRP-D5.

71


Figuur 4.14: Chromatogram bekomen via de geoptimaliseerde scheidingsmethode voorLC-MS/MS voor een testmengsel van 10 µg/ml van KYN, TRP en TRP-D5.

Figuur 4.15: Herhaalbaarheidsanalyse voor KYN, TRP en TRP-D5 voor de bekomenscheidingsmethode.

Om te testen of de methode ook werkt op bloedplasma werd plasma, na staalvoorbereiding,

geınjecteerd op de kolom. Figuur 4.16 en Figuur 4.17 geeft het bekomen chromatogram

weer van een bloedplasmamonster van een positieve IBD-patient.

72


KYN

TRP & TRP-D5

Figuur 4.16: Chromatogram na scheiding van plasmamonster op LC-MS/MS van eenIBD-patient (1).

KYN

TRP & TRP-D5

Figuur 4.17: Chromatogram na scheiding van plasmamonster op LC-MS/MS van eenIBD-patient (23).

73


Volgende opmerkingen kunnen hierbij gemaakt worden:

• De retentie bleek op het Alliance-systeem een stuk hoger te zijn in vergelijking met

het Agilent-systeem. Dit is mogelijks het gevolg van verschillen in de effectieve

gradientsamenstelling in beide systemen. Het Agilent-systeem maakt gebruik van

een binaire pomp in combinatie met hoge druk menging. In het Alliance-systeem

daarentegen worden de solventen gemengd voor de pomp (lage druk menging). Dit

kan leiden tot discrepanties in de bekomen chromatogrammen.

• Elutievolgorde blijft onveranderd in vergelijking met scheiding op Agilent 1200. Be-

vestiging werd geleverd door MS-spectra.

• Kynurenine vertoont schijnbaar 2 pieken in het spectra. Dit is te wijten aan het

kleine massatransitieverschil van KYN ( 209,2→ 192,1) en TRP-D5 ( 210,2→ 192,1).

De massaspectrometer veronderstelt kynurenine te meten, terwijl het eigenlijk de

interne standaard is. Deze these werd bevestigd doordat deze piek niet verscheen bij

gebruik van norvaline als interne standaard. Door de voorafgaande scheiding op de

kolom vormt dit echter geen probleem. Deze massatransitie werd echter behouden

om geen verlies in gevoeligheid te verkrijgen bij detectie van KYN en TRP-D5.

• Noteer dat tussen Figuur 4.16 en Figuur 4.17 een retentieverschil van ca. 10 %

optreedt. Dit is te wijten aan het feit dat opnames met een tijdsverschil van enkele

weken uitgevoerd werden. De specificiteit van MS/MS compenseert ruimschoots

voor dit fenomeen.

4.4 Kwantificatie

Bij uitzetten van het analytisch signaal (piekoppervlak in tellen) in functie van de concen-

tratie van het analiet wordt een kalibratiecurve bekomen. In deze scriptie werd gebruikt

gemaakt van interne kalibratie als kwantificatiemethode. Een inwendige standaard (IS) is

74

4.4. Kwantificatie

een component die aan het monster wordt toegevoegd om te corrigeren voor verliezen tij-

dens monstervoorbereiding (proteıneprecipitatie) en het chromatografisch proces. Keuze

van de inwendige standaard is belangrijk en moet aan volgende criteria voldoen

• De inwendige standaard moet qua structuur zo goed mogelijk op de te bepalen

component lijken.

• De inwendige standaard mag niet met de analieten reageren.

• De inwendige standaard mag niet van nature aanwezig zijn in het monster.

Veelal wordt gekozen voor een gedeutereerde vorm van het analiet. In dit werk werd

gekozen voor de gedeutereerde versie van tryptofaan: tryptofaan-indool-d5. Om de con-

centratie van kynurenine en tryptofaan te bepalen werd de interne standaard toegevoegd

om te corrigeren voor verliezen tijdens de proteıneprecipitatie en om fluctuaties in de ESI-

MS gevoeligheid op te vangen. De piekoppervlakte van kynurenine en tryptofaan wordt

gedeeld door het piekoppervlak van de interne standaard en externe kalibratie wordt uit-

gevoerd op deze relatieve piekoppervlakken. Gezien de chemische similariteit tussen KYN

en TRP-D5 kan er verondersteld worden dat deze interne standaard ook geschikt is voor

correctie van deze component. De resultaten verder bekomen in dit werk bevestigen ook

deze keuze. Zo wordt er bv. weinig verschil gemeten tussen de resultaten bekomen met

en zonder I.S.-correctie, wat aantoont dat de methodologie sowieso reeds zeer robuust is.

Om de kalibratiecurve op te stellen, werden alle metingen in drievoud uitgevoerd; hieruit

kon RSD (%) bepaald worden. Er werd een lineair verband (y = ax + b) gezocht tussen

de relatieve piekoppervlakte en de concentratie voor een concentratiebereik van 0,5 tot

100 µg/ml, een relevant interval in vergelijking met concentratiewaarden gekend uit de

literatuur.

4.4.1 Kynurenine

In Figuur 4.18 is de opbouw van de kalibratiecurve voor kynurenine weergegeven. De re-

latieve piekoppervlakte (piekoppervlakte KYN / piekoppervlakte TRP-D5) werd uitgezet

75


in functie van de KYN-concentratie. Een zeer goede lineariteit, weerspiegeld door de cor-

relatiefactor (R2 = 0, 9997), werd bekomen in het beoogde gebied. Een behoorlijk goede

herhaalbaarheid (% RSD) werd bekomen; RSD ≤ 5% werd in de meeste gevallen bekomen.

Figuur 4.18: Opstellen van kalibratiecurve van kynurenine via relatieve piekoppervlakte.

In Figuur 4.19 werd het signaal weergegeven van kynurenine met een concentratie van 0,5

µg/ml. Dit chromatogram werd gebruikt om LOD en LOQ te bepalen van KYN zoals

weergegeven in Figuur 2.1, waarbij LOD overeenkomt met S/N = 3 en LOQ overeenkomt

met S/N = 10. Op deze manier werd LOD = 0,102 µg/ml en LOQ = 0,342 µg/ml.

Figuur 4.19: Bepalen van LOD (S/N = 3) en LOQ (S/N = 10) voor kynurenine.

76

4.4. Kwantificatie

4.4.2 Tryptofaan

In Figuur 4.20 is de opbouw van de kalibratiecurve voor tryptofaan weergegeven. De

relatieve piekoppervlakte (piekoppervlakte TRP / piekoppervlakte TRP-D5) werd uitgezet

in functie van de TRP-concentratie. Een zeer goede lineariteit, weerspiegeld door de

correlatiefactor (R2 = 0, 9927), werd bekomen in het vooropgestelde gebied. In het laag

concentratie gebied werd een matige tot minder goede herhaalbaarheid gehaald. In het

hogere concentratiegebied, van toepassing voor TRP, werd een goede herhaalbaarheid

bekomen met RSD ≤ 5%.

Figuur 4.20: Opstellen van kalibratiecurve van tryptofaan via relatieve piekoppervlakte.

In Figuur 4.21 werd het signaal weergegeven van tryptofaan met een concentratie van 0,5

µg/ml. Dit chromatogram werd gebruikt om LOD en LOQ te bepalen van TRP zoals

weergegeven in Figuur 2.1, waarbij LOD overeenkomt met S/N = 3 en LOQ overeenkomt

met S/N = 10. Op deze manier werd LOD = 0,119 µg/ml en LOQ = 0,396 µg/ml,

wat ruim onder de verwachte TRP-concentraties valt. Op een analoge manier werd dit

uitgevoerd voor TRP-D5 wat een LOD = 0,068 µg/ml en LOQ = 0,228 µg/ml, ruim

77


onder het niveau van de gebruikte 10 µg/ml.

Figuur 4.21: Bepalen van LOD (S/N = 3) en LOQ (S/N = 5) voor Tryptofaan

De concentratie van tryptofaan en kynurenine werd bepaald door de relatieve piekopper-

vlakte in de gevonden lineariteitsvergelijking voor tryptofaan en kynurenine in te vullen

(x = y−ba ).

4.5 Monstervoorbereiding

Vooraleer chromatografische analyses van de reele monsters uitgevoerd werd, is de mon-

stervoorbereiding een zeer belangrijke en vaak ook moeilijke, tijdsrovende stap. Bij de

monstervoorbereiding van bloedplasma is de belangrijkste stap verwijderen van proteınes,

zoals humaan serum albumine (HSA). Deze proteınen kunnen de reproduceerbaarheid van

de methode ondermijnen daar ze kunnnen co-elueren met de analieten die bestudeerd wor-

den en zo via competitieve ionisatie de gevoeligheid voor de analietmoleculen onderdruk-

ken. Vaste fase extractie of solid phase extraction (SPE) is een veel gebruikte methode,

maar werd als te tijdrovend beschouwd voor deze grote hoeveelheid monsters (ongeveer

500, daar elk monster in triplicaat diende behandeld te worden). In de literatuur werden

verschillende alternatieven voorgesteld. Een drievoudige overmaat methanol, een dubbele

overmaat acetonitril, een dubbele overmaat koude methanol en 10 Volume% TCA (gechlo-

reerd azijnzuur) als precipiterend reagens, werden uitgeprobeerd. Uiteindelijk bleek een

drievoudige overmaat methanol de beste resultaten te geven.

78

4.6. Batchsamenstelling en resultaat

Alle monsters werden als volgt bereid:

1. Het plasma wordt verdeeld in 3 gelijke volumes (aliquots) van 50 µl.

2. 50 µl interne standaardoplossing wordt bij het plasma gepipetteerd.

3. 300 µl methanol wordt toegevoegd om de proteınes neer te slaan.

4. Het monster wordt gedurende enkel minuten gemixed met een vortex-mixer.

5. Het monster wordt vervolgens gecentrifugeerd gedurende 10 minuten bij 12.000

RPM.

6. Het supernatant wordt gefilterd op een PVDF-filter (0,45 µm) en in een microvial

gebracht.

4.6 Batchsamenstelling en resultaat

Na de methode-ontwikkeling volgde, tijdens deze scriptie, een lange periode van monster-

voorbereiding en analyse. Een batch werd gevuld met 20 plasmamonsters, telkens vooraf

gegaan door een verse kalibratiereeks. Na analyse van de kalibratiereeks werd de kolom

twee maal gespoeld met 100 % ACN gedurende 23 minuten. Deze spoelprocedure werd ook

uitgevoerd na analyse van de 3 aliquots van elk plasmamonster. Uiteindelijk na analyse

van alle 149 monsters, integratie en kwantificatie werden de TRP- en KYN-concentraties

gemeten. Alle resultaten zijn terug te vinden in de bijgevoegde appendix, achteraan in deze

thesis. De interpretate van deze resultaten wordt in het volgende hoofdstuk besproken.

79


80

HOOFDSTUK 5

STATISCHE ANALYSE

Het bekomen van de KYN- en TRP-concentraties vormt niet het eindpunt in deze scriptie.

In wat volgt worden verschillende statische methodes, gaande van standaardtoepassingen

zoals de t-toets tot meer geanvanceerde technieken zoals PCA en PLS, toegepast op de

bekomen data met als doel een onderscheid te kunnen maken tussen monsters afkomstig

van IBD-patienten en controlepersonen.

5.1 Distributie van data

In Figuur 5.1 worden de resultaten weergegeven van alle 149 monsters op basis van de

KYN- en TRP-concentratie. IBD-patienten worden voorgesteld door een vierkantje en

controlepersonen door een driehoekje. Op basis van Figuur 5.1 kan vastgesteld worden

dat er een duidelijk onderscheid kan gemaakt worden tussen beide groepen. IBD-patienten

bezetten hoofdzakelijk de lage concentratie gebieden (links onderaan de grafiek), terwijl

de controlemonsters hoofdzakelijk in het hoge concentratie gebied terug te vinden zijn.

Merk op dat elk resultaat de gemiddelde waarde is van de analyse van 3 analyses van elk

plasmamonster. De relatieve standaardafwijking van de resultaten wordt gegeven in de

appendix achteraan de thesis. Deze lage waarden lagen volledig in lijn met de verwachte

hoge robuustheid van de ontwikkelde methode.

81

Hoofdstuk 5. Statische analyse

Figuur 5.1: Distributie van 149 monsters op basis van KYN- en TRP-concentratie voorde IBD-patienten en de controlegroep.

Projectie van deze punten, zowel op de KYN- als de TRP-as, levert een distributie van de

monsters op onder de vorm van een histogram. Het histogram voor KYN is weergegeven in

Figuur 5.2, terwijl het histogram van TRP weergegeven is in Figuur 5.3. Uit de bekomen

histogrammen kunnen al enkele conclusies getrokken worden.

• Voor KYN kan er, op basis van de meest voorkomende waarde in het histogram, een

beter onderscheid gemaakt worden tussen IBD-patient en controlepersonen dan voor

TRP. Biologisch en biochemisch is dit aanvaardbaar aangezien TRP-concentraties

in het lichaam zo constant mogelijk gehouden worden, ongeacht de persoon, en

KYN een katabolisch product van TRP is waarvan de concentraties variabel geacht

worden.

• De spreiding (variantie) van de resultaten is groter voor TRP dan voor KYN.

• De spreiding (variantie) van de resultaten is groter voor controlepersonen dan voor

IBD-patienten.

82

5.1. Distributie van data

• Voor KYN is er een verschuiving naar de hogere concentraties voor de controleper-

sonen t.o.v. IBD-patienten. Dit ligt niet in lijn met de verwachtingen aangezien een

verhoogde IDO-activiteit bij IBD-patienten aanleiding geeft tot hogere KYN pro-

ductie. Uit deze bevindingen kan er geen sluitende conclusie getrokken worden, daar

de KYN/TRP-ratio een representatieve parameter van IDO-activiteit zou moeten

zijn.

Figuur 5.2: Distributie van kynurenine in IBD-patienten en controlepersonen. De x-asonderscheid op vlak van groep en de y-as op basis van concentratie (µg/ml). De z-as geefthet aantal weer bij elke concentratie.

In Figuur 5.4 is de distributie weergegeven van de KYN/TRP-ratio voor IBD-patienten en

controlemonsters. De these die in deze scriptie aangenomen wordt is dat de KYN/TRP-

ratio de activiteit van het IDO-enzyme weerspiegelt. Opregulatie van IDO, a.g.v. chroni-

sche inflammatie in het maagdarmkanaal, zou leiden tot een verhoogde KYN/TRP-ratio

bij IBD-patienten. Figuur 5.4 weerspiegelt weinig verschil tussen de distributie van de

ratio bij IBD-patienten en controlepersonen. De inverse these, hogere KYN/TRP-ratio

bij controlepersonen, dringt zich eerder op. Om meer sluitende conclusies te trekken werd

een T-test uitgevoerd.

83


Figuur 5.3: Distributie van tryptofaan in IBD-patienten en controlepersonen. De x-asonderscheid op vlak van groep en de y-as op basis van concentratie (µg/ml). De z-as geefthet aantal weer bij elke concentratie.

Figuur 5.4: Distributie van KYN/TRP-ratio in IBD-patienten en controlepersonen. Dex-as onderscheid op vlak van groep en de y-as op basis van concentratie (µg/ml). De z-asgeeft het aantal weer bij elke concentratie.

84

5.2. T-Toets

5.2 T-Toets

In dit onderdeel wordt een T-Toets voor 2 onafhankelijke steekproeven uitgevoerd. Er

wordt getest of er een significant verschil bestaat tussen de gemiddelde waarde van KYN,

TRP en KYN/TRP-ratio voor IBD-patienten en controlepersonen. De nulhypothese H0

stelt dat de gemiddelde concentratie (of ratio) voor KYN of TRP van de steekproef voor

IBD-patienten gelijk is aan dat voor controle personen. Wanneer de bekomen waarde

voor significantie (p-waarde) kleiner is dan een bepaalde kritische waarde, die ingesteld

wordt op 0,05 voor het gebruikte 95% significantie-interval, kan gesteld worden dat het

verschil in gemiddelde waarde voor elke groep niet te wijten is aan toevallige variatie. De

nulhypothese wordt m.a.w. verworpen. In Figuur 5.5 zijn de resultaten van de tweezijdige

T-toets voor 2 onafhankelijke steekproeven, berekend via SPSS 16, weergegeven. De T-

toets werd uitgevoerd wanneer er verondersteld werd dat varianties van beide groepen

(IBD-patient en controle) gelijk waren, alsook wanneer de varianties verschillend zouden

zijn.

Figuur 5.5: Resultaat van tweezijdige T-toets voor 2 onafhankelijke steekproeven voorKYN, TRP en hun ratio.

85


5.2.1 Kynurenine

Uit Figuur 5.5 blijkt dat de 104 IBD-patienten een gemiddelde KYN-concentratie hebben

van 0, 894252 ± 0, 3763 µg/ml terwijl de 45 controle patienten een gemiddelde KYN-

concentratie van 1, 784948 ± 0, 4070 µg/ml. De significantie, voor zowel gelijke als ver-

schillende variantie, geeft een waarde veel kleiner dan 0,05 aan. Hieruit blijkt dat H0

verworpen moet worden, en dat met 95% zekerheid gesteld kan worden dat variatie tussen

deze gemiddelde waardes niet te wijten is aan toeval. Zoals al bleek uit vorige paragraaf

kan er perfect onderscheid gemaakt worden tussen IBD-patient en controlepersoon op ba-

sis van KYN-concentratie. Er blijkt ook dat er een hogere KYN-concentratie gevonden

wordt voor controlemonsters dan voor monsters afkomstig van IBD-patienten.

5.2.2 Tryptofaan

Uit Figuur 5.5 blijkt dat de 104 IBD-patienten een gemiddelde TRP-concentratie heb-

ben van 9, 883463± 3, 1904 µg/ml terwijl de 45 controle patienten een gemiddelde TRP-

concentratie van 15, 20096 ± 6, 1285 µg/ml. De significantie, voor zowel gelijke als ver-

schillende variantie, geeft een waarde veel kleiner dan 0,05 aan. Hieruit blijkt dat H0

verworpen moet worden, en dat met 95% zekerheid gesteld kan worden dat variatie tussen

deze gemiddelde waardes niet te wijten is aan toeval. Zoals al bleek uit vorige paragraaf

kan er onderscheid gemaakt worden tussen IBD-patient en controlepersoon op basis van

TRP-concentratie, maar op een minder significante manier dan voor kynurenine. Dit blijkt

uit de hogere p-waardes (significantie). Er wordt een hogere TRP-concentratie gevonden

voor IBD-patienten dan voor monster afkomstig van controlepersonen.

5.2.3 KYN/TRP-Ratio

Uit Figuur 5.5 blijkt dat de 104 IBD-patienten een gemiddelde KYN/TRP-ratio heb-

ben van 0, 1002116 ± 0, 056470µg/ml terwijl de 45 controle patienten een gemiddelde

KYN/TRP-ratio hebben van 0, 129836 ± 0, 046035µg/ml. De significantie, voor zowel

gelijke als verschillende variantie, geeft een waarde kleiner dan 0,05 aan. Hieruit blijkt dat

H0 verworpen moet worden, en dat met 95% zekerheid gesteld kan worden dat variatie

86

5.3. Principale componenten analyse

tussen deze gemiddelde waardes niet te wijten is aan toeval. Nu kan met zekerheid gesteld

worden dat er onderscheid gemaakt worden tussen IBD-patient en controlepersoon op ba-

sis van KYN/TRP-ratio. Dit is echter op een heel wat minder significante manier dan voor

beide moleculen afzonderlijk, wat af te leiden valt uit de hogere p-waardes (significantie).

Wat echter ook blijkt, en niet overeenkomt met de gebruikte IDO-hypothese, is dat een

hogere KYN/TRP-ratio gevonden wordt voor controlepersonen dan voor plasmamonsters

afkomstig van IBD-patienten. Het idee van een hogere KYN/TRP-ratio bij IBD-patienten

blijkt dus niet te kloppen, uitgaande van deze data. Een vergelijkende studie met data van

controlepersonen uit de literatuur levert een grote gelijkenis op voor TRP-concentraties

(±15µg/ml) maar een afwijking voor KYN-concentraties (± 0, 4µg/ml). Dit resultaat

werd uitvoerig besproken met Dr. F. Lynen en mogelijke problemen zoals een verlaagde

gevoeligheid gedurende de analyseperiode, een fout bepaalde LOD,... konden telkens weer-

legd worden. In dit opzicht werd er verondersteld dat de bekomen data betrouwbaar zijn.

Verder is er geen informatie beschikbaar over de controlepersonen waardoor mogelijke

biologische of biochemische verklaringen eerder subjectief en wetenschappelijk incorrect

zouden zijn.

5.3 Principale componenten analyse

De statische achtergrond voor PCA werd eerder in Hoofdstuk 2 aangehaald. PCA is

een clustermethode die hoofdzakelijk gebruikt worden om data, afhankelijk van meerdere

variabelen, makkelijker te interpreteren en visueel voor te stellen. PCA vormt principale

componenten (PC1 en PC2) door combinaties te vormen van de oorspronkelijke variabelen

(KYN- en TRP-concentratie), waarbij de meeste variantie ( lees informatie) terug te vinden

is bij PC1. Gebruik maken van de ratio, een variabele dus, is bijgevolg voor PCA nutteloos

en tevens niet mogelijk. Aangezien er oorspronkelijk slechts 2 variabelen bepaald werden,

is datareductie hier overbodig. Het bekomen PCA-plot in Figuur 5.6 is bijgevolg een

genormaliseerde en geroteerde versie van Figuur 5.1.

87


Figuur 5.6: Principale Componenten Analyse opgebouwd uit de concentratievariabelenvoor IBD-patienten en controlepersonen.

Uit de bekomen PCA-grafiek kan vastgesteld worden dat het, behalve de veronderstelde

rotatie en normalisatie, weinig verschilt van de scatterplot bekomen in Figuur 5.1. Opnieuw

kan een verschil in regio’s waargenomen worden voor IBD-Patienten en controlepersonen,

waardoor classificatie van onbekende monsters (IBD-patient of niet) mogelijk is via PCA.

Zoals het PCA toekomt, is er duidelijk te zien dat er meer spreiding (onderscheid) waar

te nemen is op PC1 dan op PC2. Ook wordt bevestigd dat er meer variantie aanwezig

is bij de controlemonsters dan bij IBD-patienten. PCA maakt geen gebruik van een

groepsvariabele, het weet dus m.a.w. niet op voorhand welk monster tot de IBD-groep

behoort en welk monster tot de controlegroep behoort. PCA is dus een niet gesuperviseerde

methode. Aangezien dit op voorhand wel gekend is, wordt er — bij gebruik van PCA —

handige informatie niet gebruikt. Een gesuperviseerde methode biedt de oplossing en

wordt geleverd door kleinste-kwadraten regressie (PLS).

5.4 Kleinste-kwadraten regressie

Kleinste-kwadraten regressie (PLS) werd uitgevoerd op de concentratievariabelen van IBD-

patienten en controlepersonen. PLS maakt gebruik van formule 5.1 om voor elke monster

een responswaarde f te verkrijgen wanneer de KYN- en de TRP-concentratie in de verge-

88

5.4. Kleinste-kwadraten regressie

lijking ingevuld worden.

f = β1 + β2 × ConcKYN + β3 × ConcTRP (5.1)

Het PLS-procede (uitgevoerd met Matlab) zoekt vervolgens naar de beste β-coefficienten

voor vergelijking 5.1, wetende welke monster tot welke categorie behoort. Op voorhand

werd gesteld dat IBD-patienten een responswaarde -1 (zouden moeten) hebben, terwijl

controlepersonen een responswaarde +1 (zouden moeten) hebben. Uiteindelijk werd ver-

gelijking 5.2 als PLS-regressie vergelijking bekomen.

f = −2, 0123 + 1, 0477× ConcKYN + 0, 0346× ConcTRP (5.2)

Invullen van alle waardes voor de KYN- en TRP-concentratie levert voor elk monster een

responswaarde. Deze responswaarden werden uitgezet in Figuur 5.7.

Figuur 5.7: Responswaarde bekomen volgens vergelijking 5.2 uitgezet in functie van hetmonsternummer. De ideale responswaarde voor IBD-patienten bedraagt -1, terwijl dievoor controlepersonen +1 bedraagt.

89


Figuur 5.7 geeft de responswaarde van elk monster terug. -1 werd vooraf ingesteld als ide-

ale responswaarde voor IBD-patienten terwijl +1 de controlemonsters representeert. Het

gemiddelde van -1 en +1, vormt dus een grenswaarde voor de voorspelling. Wanneer van

een onbekend monster de KYN- en TRP-concentratie gekend zou zijn, zou aan de hand

van de responswaarde voorspeld kunnen worden tot welke groep het monster behoort.

Zoals op Figuur 5.7 te zien valt leveren de eerste 104 monsters, de IBD-patienten, hoofd-

zakelijk responswaarden in de buurt van -1 en de laatste 45 monsters, de controlepersonen,

hoofdzakelijk waarden op van +1. Voor IBD-patienten valt te zien dat er 7 monsters een

waarde hebben die groter is dan 0, waardoor deze verkeerdelijk als ’gezond’ aanzien kan

worden. Er is sprake van een valse negatieve waarde. Voor controlepersonen vallen er 9

waarden onder 0, waardoor er sprake is van 9 valse positieve waarden. Deze 9 personen

zouden verkeerdelijk als patient bestempeld worden volgens dit PLS-model. PLS vormt

dus een beter classificatiemodel is deze studie dan PCA.

90

HOOFDSTUK 6

CONCLUSIE

In deze scriptie werd intensief gezocht naar een snelle methode om op een simultane

manier de tryptofaan- en kynurenineconcentratie in bloedplasma te bepalen. Op deze

manier werd geprobeerd om een verband te leggen tussen tryptofaan-depletie, a.g.v. een

verhoogde IDO-activiteit (weerspiegeld door KYN/TRP-ratio), en blijvende vermoeidheid

bij patienten met een chronische inflammatoire darmziekte zoals de ziekte van Crohn en

colitis ulcerosa.

Een testmengsel bestaande uit kynurenine (KYN), tryptofaan (TRP) en een interne stan-

daard (tryptofaan-indoold5, TRP-D5) werd gescheiden volgens een gradient elutiemethode

op een Kinetex kolom. Verschillende mobiele fases en zure additieven werden getest, waar-

bij de beste scheiding verkregen werd met H2O (+ 0,5 % HFBA) en acetonitril. Er werd

gezocht naar een detectiemethode waar derivatisatie van de moleculen onnodig was. De

selectiviteit en gevoeligheid in MRM-modus, maakten van de massaspectrometer de ideale

detector om deze molecules te detecteren in een complexe biologische matrix als die van

bloedplasma.

Aangezien een grote hoeveelheid monsters (149 in triplicaat) voorbereid moest worden,

werd gezocht naar een zo eenvoudig mogelijke monstervoorbereiding. Proteıneprecipitatie

met een drievoudige overmaat methanol, gevolgd door homogenisatie en centrifgugatie

bleek een geschikte manier.

Interne kalibratie werd gebruikt als kwantificatiemethode. Kalibratiecurven werden op-

91

Hoofdstuk 6. Conclusie

gesteld op basis van relatieve piekoppervlakte (oppervlakte TRP of KYN / oppervlakte

TRP-D5) voor TRP en KYN. Voor KYN werd een heel goede herhaalbaarheid en line-

ariteit bekomen en een LOD van 0,102 µg/ml werd bereikt. Voor TRP werd een goede

herhaalbaarheid en lineariteit bekomen en een LOD van 0,119 µg/ml.

Na een lange periode van monstervoorbereiding en analyse van de plasmamonsters, ge-

paard gaande met de daarbij horende instrumentele problemen, werden uiteindelijk voor

alle 149 plasmamonster de KYN- en TRP-concentratie bepaald. De resultaten werden

geanalyseerd met statische methodes zoals t-toets, PCA en PLS. De kleinste-kwadraten

regressiemethode bleek de beste manier om een onderscheid te maken tussen beide groe-

pen, daar deze methode gesuperviseerd is. Uit de resultaten bleek echter, in tegenstelling

tot de IDO-hypothese, dat een hogere KYN/TRP-ratio waar te nemen valt bij contro-

lepersonen dan bij IBD-patienten. Uit een vergelijkende studie met de literatuur bleek

dat TRP-concentraties overeen komen maar KYN-concetraties veel hoger blijken in deze

steekproef. Een mogelijk probleem hierbij zou kunnen zijn dat iets te dicht bij de LOD van

KYN gemeten werd, wat op zijn beurt niet verklaart waarom de controlegroep significant

meer KYN meet. Een mogelijke biochemische of biologische verklaring kan niet geboden

worden door het gebrek aan informatie over de controlepersonen.

92

Bijlage . Appendix

APPENDIX

Resultaten

94

Bijlage . Appendix

96

Bijlage . Appendix

98

Bijlage . Afkortingen

AFKORTINGEN

100

Bijlage . Afkortingen

102

LIJST VAN FIGUREN

1.1 Schematische voorstelling van een individueel silicadeeltje waarbij aan de

wand van de porie C18 -groepen verankerd werden als stationaire fase. . . 7

1.2 Evenwichtsinstelling van solventen analietmolecules tussen de mobiele en

de stationaire fase. Het effect van dit dynamisch evenwicht is een verschil

in migratiesnelheid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.3 Schematische voorstelling van een chromatogram: tr, t′r en t0 samen met

wb, wh en σ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.4 Schematische voorstelling van het Eddy Diffusie fenomeen . . . . . . . . . . 16

1.5 Schematische voorstelling van de piekverbreding die optreedt als gevolg van

longitudinale diffusie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

1.6 Schematiche voorstelling van de invloed van de A, B en C-term op de van

Deemter curve. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.7 Schematische voorstelling van een HPLC-systeem. . . . . . . . . . . . . . . 21

1.8 Laadpositie (links) en injectiepositie (rechts) van de zeswegkraan. . . . . . . 23

1.9 Opstelling: Waters Alliance 2695 gekoppeld aan een API 2000 massaspec-

trometer van Applied Biosystems. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.10 Schematische voorstelling van de API 2000 massaspectrometer van Applied

Biosystems. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

1.11 Ionenbron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

103

Lijst van figuren

1.12 Schematische voorstelling van het elektronspray fenomeen . . . . . . . . . . 28

1.13 Schematische voorstelling van de desolvatatie via Coulomb fissie. . . . . . . 28

1.14 Schematische voorstelling van de elektrosprayvorming: ionevaporatie. . . . . 29

1.15 De quadrupoolanalysator . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

1.16 Dochter (product) ion scanmodus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

1.17 Ouder (precursor) ion scanmodus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

1.18 Neutral loss scanmodus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

1.19 Multiple Reaction Monitoring modus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.1 Berekenen van de signaal-tot-ruis verhouding op een chromatogram. . . . . 37

2.2 Grafische weergave van de opbouw van de principale componenten in PCA 40

3.1 De aangetaste delen van het maagdarmkanaal bij de ziekte van Crohn (links)

en colitis ulcerosa (rechts) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.2 Aantasting van de darmwand bij de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa. . . 46

3.3 Belangrijke structuren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

3.4 Metabolisatie van tryptofaan tot serotonine enerzijds (boven) en kynurenine

anderzijds (onder). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

3.5 Derivatisatie van tryptofaan met o-phthaalaldehyde en 2-mercaptoethanol . 54

4.1 Gradient elutieprogramma voor scheiding van het testmengsel. . . . . . . . 61

4.2 Chromatogram van het testmengsel gescheiden volgens de gradientmethode

weergegeven in Figuur 4.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

4.3 Optimalisatie van het gradient elutieprogramma voor de scheiding van het

testmengsel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

4.4 Chromatogram van het testmengsel gescheiden volgens de geoptimaliseerde

gradient elutiemethode. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

4.5 De componentafhankelijke parameters van KYN, TRP en TRP-D5. . . . . . 66

4.6 Bronafhankelijke parameters voor het testmengsel. . . . . . . . . . . . . . . 67

4.7 TIC-spectrum van Kynurenine. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

4.8 TIC-spectrum van tryptofaan. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

104

Lijst van figuren

4.9 TIC-spectrum van gedeutereerd tryptofaan. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

4.10 Dochterscan van kynurenine met 209,2 als precursorion en 192,1 als belang-

rijkste dochterion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.11 Dochterscan van tryptofaan met 205,2 als precursorion en 188,2 als belang-

rijkste dochterion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.12 Dochterscan van gedeutereerd tryptofaan met 210,2 als precursorion en

192,1 als belangrijkste dochterion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

4.13 Bekomen MRM-schema voor de analyse van KYN, TRP en TRP-D5. . . . . 71

4.14 Chromatogram bekomen via de geoptimaliseerde scheidingsmethode voor

LC-MS/MS voor een testmengsel van 10 µg/ml van KYN, TRP en TRP-D5. 72

4.15 Herhaalbaarheidsanalyse voor KYN, TRP en TRP-D5 voor de bekomen

scheidingsmethode. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

4.16 Chromatogram na scheiding van plasmamonster op LC-MS/MS van een

IBD-patient (1). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

4.17 Chromatogram na scheiding van plasmamonster op LC-MS/MS van een

IBD-patient (23). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

4.18 Opstellen van kalibratiecurve van kynurenine via relatieve piekoppervlakte. 76

4.19 Bepalen van LOD (S/N = 3) en LOQ (S/N = 10) voor kynurenine. . . . . . 76

4.20 Opstellen van kalibratiecurve van tryptofaan via relatieve piekoppervlakte. 77

4.21 Bepalen van LOD (S/N = 3) en LOQ (S/N = 5) voor Tryptofaan . . . . . 78

5.1 Distributie van 149 monsters op basis van KYN- en TRP-concentratie voor

de IBD-patienten en de controlegroep. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

5.2 Distributie van kynurenine in IBD-patienten en controlepersonen. De x-as

onderscheid op vlak van groep en de y-as op basis van concentratie (µg/ml).

De z-as geeft het aantal weer bij elke concentratie. . . . . . . . . . . . . . . 83

5.3 Distributie van tryptofaan in IBD-patienten en controlepersonen. De x-as

onderscheid op vlak van groep en de y-as op basis van concentratie (µg/ml).

De z-as geeft het aantal weer bij elke concentratie. . . . . . . . . . . . . . . 84

105

Lijst van figuren

5.4 Distributie van KYN/TRP-ratio in IBD-patienten en controlepersonen. De

x-as onderscheid op vlak van groep en de y-as op basis van concentratie

(µg/ml). De z-as geeft het aantal weer bij elke concentratie. . . . . . . . . . 84

5.5 Resultaat van tweezijdige T-toets voor 2 onafhankelijke steekproeven voor

KYN, TRP en hun ratio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

5.6 Principale Componenten Analyse opgebouwd uit de concentratievariabelen

voor IBD-patienten en controlepersonen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

5.7 Responswaarde bekomen volgens vergelijking 5.2 uitgezet in functie van het

monsternummer. De ideale responswaarde voor IBD-patienten bedraagt -1,

terwijl die voor controlepersonen +1 bedraagt. . . . . . . . . . . . . . . . . 89

106

BIBLIOGRAFIE

[1] L.S. Ettre. Nomenclature for Chromatography (IUPAC recommendations 1993). Pure

and Applied Chem, 65(4):819, 1993.

[2] R.S. Deelder G.J. De Jong J.H.M. Van den Berg. Chromatografie. Heron-reeks, 1994

(tweede druk).

[3] M. Tswett G. Hesse. Michael Tswett’s Erste Chromatographische Schrift. Woelm,

page 37 S., 1954.

[4] Prof. Dr. P. Sandra. Scheidingstechnieken: Een Inleiding. Universiteit Gent, 2000-

2001.

[5] Richard Kuhn Edgar Lederer. Uber α - und β - Carotin. 1931.

[6] A.J. Martin R.L. Synge. A New Form of Chromatography Employing Two Liquid

Phases. Biochem J., 35:1358 – 1368, 1941.

[7] L.S. Ettre. LCGC., 243:390, 2006.

[8] L. S. Ettre. LCGC, 23:752, 2005.

[9] L.S. Ettre A. Zlatkis. 75 Years of Chromatography: A Historical Dialog. Elsevier,

Amsterdam, 1979.

[10] A. J. P. Martin R. L. M. Synge. Biochem J., 35:1358, 1941.

107

Bibliografie

[11] Lloyd R. Snyder Joseph J. Kirkland John W. Dolan. Introduction to Modern Liquid

Chromatography. John Wiley & Sons, 3rd edition, 2010.

[12] Michael Polet. Evaluatie van Onconventionele Microsferen in Geminiaturiseerde

Vloeistofchromatografie. Master’s thesis, Universiteit Gent, 2008-2009.

[13] D.H. Williams I. Fleming. Spectroscopic Methods in Organic Chemistry. McGraw-

Hill, Berkshire, 1995.

[14] Deidre Cabooter. Possibilities and Limitations of the Kinetic Plot Method to Compare

the Kinetic Performance of Chromatographic Seperation Methods and Colums. PhD

thesis, Vrije Universiteit Brussel, 2009.

[15] Jente Boelaert. Kwantitatieve Analyse van Cytostatica in Urine, Opstellen van een

Screeningsysteem. Master’s thesis, Universtiteit Gent, 2008-2009.

[16] John B. Fenn. Electrospray Wings for Molecular Elephants. Nobel Lecture, 2002.

[17] Robert E. Ardrey. Liquid Chromatography - Mass Spectrometry : An Introduction.

John Wiley & Sons, 2003.

[18] Robert D. Voyksner. Liquid Chromatography / Mass Spectrometry: The Techniques

of Electrospray and APCI. LCMS Limited, Raleigh, North Carolina, 2003.

[19] P. Kebarle M. G. Ikonomou, A. T. Blades. Investigations of the Electrospray Interface

for Liquid-Chromatography Mass-Spectrometry. Analytical Chemistry, 629:957, 1990.

[20] Prof. Dr. Karel Strijckmans. Chemometrie. Universiteit Gent, 2008-2009.

[21] T. Gorecki F. Lynen R. Szucs P. Sandra. Analytical Chemistry, 78:3186, 2006.

[22] J.N. Miller J.C. Miller. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry. Pear-

son/ Prentice Hall, 2005.

[23] Gerd Bouma Warren Strober. The Immunological and Genetic Basis of Inflammatory

Bowel Disease. Nature Reviews Immunology 3, 3:521, 2003.

108

Bibliografie

[24] R.J Xavier D.K. Podolsky. Unravelling the Pathogenis of the Inflammatory Bowel

Disease. Nature, 448:427–434, 2007.

[25] Daniel C Baumgart Simon R Carding. Inflammatory Bowel Disease: Cause and

Immunobiology. The Lancet: Gastroenterology, 369:1627–1640, 2007.

[26] http://www.ziekenhuis.nl/index.php?cat=animaties&action=show&movie=197.

[27] Daniel C Baumgart William J Sandborn. Inflammatory Bowel Disease: Clinical

Aspects and Established and Evolving therapies. The Lancet: Gastroenterology,

369:1641–157, 2007.

[28] C. Tysk E. Lindberg G. Jarnernot B. Floderus-Myrhed. Ulcerative colitis and Crohn’s

Disease in an Unselected Population of Monozygotic and Dizygotic twins. A Study

of Heritability and the Influence of Smoking. Gut, 29:990–996, 1988.

[29] H. Bouhdid. Chronische inflammatoire darmziekten [IBD’s]: Begrijpen en behandelen

(informatiebrochure).

[30] JP. Hugot M .Chamaillard H. Zouali et al. Association of NOD2 leucine-rich Repeat

Variants with Susceptibility to Crohn’s disease. Nature, 411:599, 2001.

[31] MW Taylor G. Feng. Relationship Between Inteferon-γ, Indoleamine 2,3-dioxygenase,

and Tryptophan-catabolism. FASEB Journal, 5:2516– 2522, 1991.

[32] Jorg C. Schefold Jan-Philip Zeden Christina Fotopoulou Stephan van Haehling Rene

Pschowski Dietrich Hasper Hans-Dieter Volk Christine Schuett Petra Reinke. In-

creased Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) Activity and Elevated Serum Levels of

Tryptophan Catabolites in Patients with Chronic Kidney Disease: A Possible Link

between Chronic Inflammation and Uraemic Symptoms. Nephrol Dial Transplant,

24:1901–1908, 2009.

[33] Anna Maria Wolf Dominik Wolf Holger Rumpold Alexander R. Moschen Arthur Ka-

ser Peter Obrist Dietmar Fuchs Gerald Brandacher Christiane Winkler Karel Geboes

109

Bibliografie

Paul Rutgeerts Herbert Tilg. Overexpression of Indoleamine 2,3-dioxygenase in Hu-

man Inflammatory Bowel Disease. clinical immunology, 113:47, 2004.

[34] Kazuo Yamada Takeshi Miyazaki Tomoko Shibata Nobumasa Hara Mikako Tsuchiya.

Simultaneous Measurement of Tryptophan and Related Compounds by Liquid Chro-

matography/ Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Journal of Chro-

matography B, 867:57–61, 2008.

[35] Caroline M. Forrest Philippa Youd Alan Kennedy Stuart R. Gould L. Gail Darlington

Trevor W. Stone. Purine, Kynurenine, Neopterin and Lipid Peroxidation Levels in

Inflammatory Bowel Disease. Journal of Biomedical Science, 9:436, 2002.

[36] M.I. Torres M.A. Lopez-Casado P. Lorite A. Rios. Tryptophan Metabolism and

Indoleamine 2,3-dioxygenase Expression in Coeliac Disease. Clinical and Experimental

Immunology, 148:419, 2007.

[37] Marieke C. Wichers Michael Maes. The Role of Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)

in the Pathophysiology of Interferon-α-induced Depression. Journal of Psychiatry

Neuroscience, 29:11, 2004.

[38] M. Maes R. Verkerk S. Bonaccorso W. Ombelet E. Bosmans S. Scharpe. Depressive

and Anxiety Symptoms in the Early Puerperium are Related to Increased Degra-

dation of Tryptophan into Kynurenine, a Phenomenon which is Related to Immune

Activation. Life Science, 71:1837, 2002.

[39] E. Marklova H. Makovickova I. Krakorova. Screening for Defects in Tryptophan

Metabolism. Journal of Chromatography A, 870:289, 2000.

[40] Benjamin Maneglier Christine Rogez-Kreuz Paulette Cordonnier Patrice Therond

Charles Advenier Dominique Dormont Pascal Clayette Odile Spreux-Varoquaux. Si-

multaneous Measurement of Kynurenine and Tryptophan in Human Plasma and Su-

pernatants of Cultured Human Cells by HPLC with Coulometric Detection. Clinical

Chemistry, 50:2166, 2004.

110

Bibliografie

[41] K. Petritis M. de Person C. Elfakir M. Dreux. Validation of an Ion-Interaction

Chromatography Analysis of Underivatized Amino Acids in Commercial Preparation

using Evaporative Light Scattering Detection. Chromatographia, 60:293, 2004.

[42] Andreas Laich Gabrielle Neurauter Bernhard Widner Dietmar Fuchs. More Rapid

Method for Simultaneous Measurement of Tryptophan and Kynurenine by HPLC.

Clinical Chemistry, 48:579–581, 2002.

[43] P. Presits I. Molnar-Perl. HPLC of Tryptophan and its Metabolites using Simulta-

neously UV, Native Fluorescence and Pre-Column Fluorescence Derivatzation. Chro-

matographia, 57:S–87, 2003.

[44] Y.V. Tcherkas L.A. Kartsova I.N. Krasnova. Analysis of Amino Acids in Human

Serum by Isocratic Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography with

Electrochemical Detection. Journal of Chromatography A, 913:303, 2001.

[45] Rui Wang Aiguo Tang. Simultaneous Determination of Dynurenine and Tryptophan

in Serum by High Performance Liquid Chromatography. Chinese Journal of Chro-

matography, 24:140, 2006.

[46] Ardershir Amirkhani Eva Heldin Karin E. Markides Jonas Bergquist. Quantitation of

Tryptophan, Kynurenine and Kynurenic acid in Human Plasma by Capillary Liquid

Chromatography -Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Journal of

Chromatography B, 780:381, 2002.

[47] Pi Lan-Gan Tang Ai-Guo Mo Xi-Ming Luo Xi bo Ao Xiang. More Rapid and Sensi-

tive Method for Simultaneous Determination of Tryptophan and Kynurenic Acid by

HPLC. Clinical Biochemistry, 42:420, 2009.

[48] Alberto dos Santos Pereira Pat Sandra. Reversed Phase Liquid Chromatographic

Seperation of 24 Underivatized Amino Acids and Detection by Evaporative Light

Scattering and Mass Spectrometry, Pfizter International Report.

[49] Ibolya Molnar-Perl. Tryptophan Analysis in Peptides and Proteins, mainly by Liquid

Chromatography. Journal of Chromatography, 763:1, 1997.

111

Bibliografie

[50] B.E. Leonard V. Neuhoff N.N. Osborne. British Journal of Pharmacology, 49:178,

1973.

[51] Min Yang Sterling A. Tomellini. An HPLC detection Scheme for Underivatized Amino

Acids based on Tryptophan Fluorescence Recovery. Analytical Chimica Acta, 409:45,

2000.

112

Development of a Fast LC-MS/MS Method to Study Tryptophan-Depletion in Patients Diagnosed with Inflammatory Bowel Disease

P.-J. Sabbea, V. Malanchina, F. Lynena , H. Peetersb and P. Sandraa

a Department of Organic Chemistry, Ghent University, Krijgslaan 281, S4-Bis, 9000

Ghent, Belgium b Department of Gastroenterology, Ghent University, De Pintelaan 185, K12, 9000

Ghent, Belgium

An accurate method was developed to determine tryptophan (TRP) and kynurenine (KYN) concentrations in human plasma of patients diagnosed with inflammatory bowel disease (IBD). Reversed phase liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) was used to obtain precise quantitative data based on internal standard calibration. By determining the KYN/TRP-ratio, which is representing the activity of Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), a new approach was investigated in an attempt to explain the constant sleepiness and apathy observed in IBD-patients. Deproteinized plasma was separated by gradient elution on a Kinetex C18-column. Detection was performed by mass spectrometry in the multiple reaction monitoring mode (MRM). Calibration curves with excellent linearity, good reproducibility and satisfactory LOD/LOQ-values were obtained for both KYN and TRP. Data of 104 IBD-patients and 45 controls were collected and subjected to chemometrical analysis. Although significant changes in the ratios of both concentrations were measured for both IBD-patients and controls, the proposed explanations for sleepiness of IBD-patients were not convincingly proven.

1. Introduction

Chron’s disease and ulcerated colitis are the most distinct variants of inflammatory bowel disease (IBD). Chronic inflammations on the mucosa of the gastrointestinal tract evolve due to the uncontrollable activity of the intestinal immune system (1) resulting in severe abdominal pain, loss of weight, fever, diarrhea, etc. However, the most common symptoms of Chron’s disease and ulcerated colitis are the continuous sleepiness and listlessness of the patient, even when the disease is in remission. Previous attempts to provide an explanation for this phenomenon remained unsuccessful.

In this project a new approach is evaluated where depleted tryptophan (TRP) levels, as a consequence of the upregulation of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), are considered to be a possible cause of sleepiness and apathy observed in IBD-patients. Tryptophan, a precursor of the central neurotransmitter serotonin (5-HT), is metabolized into kynurenine (KYN) in the presence of IDO (Figure 1). Elevated production of the cytokines IFN-γ and TNF-α, due to the unstopped activity of the intestinal immune system in IBD-patients, result in the overexpression of IDO and by this the activation of the kynurenine-pathway (2). Consequently KYN- levels increase, while depleted TRP-concentrations leads to decreased serotonin levels. This decreased levels of 5-HT and

higher concentrations of the KYN and its brain toxic metabolites are believed to be possible causes of the observed sleepiness and apathy in IBD-patients.

The objective of this project was to determine the KYN/TRP-ratio in the plasma of 104 IBD-patients and 45 controls. Methods using LC hyphenated with UV- (3), FLD -(4), ELSD -(5) and electrochemical detection (6) have been described. However these approaches cannot compete with the selectivity, sensitivity and robustness of LC-MS/MS for underivatized analytes in complex biological matrices such as plasma, especially for the analysis of large datasets such as were the case in this work (7).

The obtained data of both the IBD-patients (104 samples in triplicate) and the control group (45 samples in triplicate) were treated with various statistical tools including the t-test, principal component analysis (PCA) and partial least squares regression (PLS) .

Figure 1. (L)-Tryptophan, precursor of serotonin in healthy persons, is metabolized

into (L)-Kynurenine in case of upregulation of IDO.

2. Experimental 2.1 Materials

L-tryptophan and DL- kynurenine were purchased from Sigma. L-tryptophan-indole-

d5 was purchased from Isotec, while heptafluorobutyric acid (HFBA) was obtained from Fluka. Water (LC-MS purity), methanol (MeOH) and acetonitrile (ACN) were purchased from Biosolve. Chromatographic analysis was performed with a Kinetex C18-column (50 x 2.1 mm; p.s. 1.7 µm) purchased from Phenomenex, on the 1200 series of Agilent and the Alliance 2690 of Waters. Detection on the Alliance was performed with an API 2000 mass spectrometer of Applied Biosystems. 104 plasma samples of IBD patients and 45 controls were provided by the Department of Gastroenterology of the UZ Gent and were approved by the independent commission for Medical Ethics.

2.2 Standard and sample preparation

Stock solutions of 1000 µg/ml of TRP, KYN and TRP-D5 were prepared in a 50/50

MeOH/H2O mixture and stored in the fridge. Calibration solutions of 0.5, 1, 5, 10, 50 and 100 µg/ml were prepared from this stock solutions for every new batch.

Frozen plasma was thawed at room temperature. Each plasma sample was split into three aliquots (each 50 µl) and spiked with 50 µl of a 10 µg/ml solution of the internal standard (TRP-D5) and deproteinized by adding 300 µl of MeOH. The mixture was vortexed at high speed for 3 minutes and centrifuged for 10 min at 12000 RPM. The

supernatant was filtered with PVDF syringe filters (0.45 µm) and transferred to an inlet vial.

5 µl of the sample, stored at 4°C, was injected on the column which was thermostated at 30°C.

2.3 Chromatography

A gradient elution method was developed on the Agilent 1200 series and further

optimized for the Waters Alliance 2690. The best peak shapes were obtained with ACN/H2O (+ 0.5 % HFBA) as mobile phase. The initial conditions of the gradient elution program where set at 10/90 ACN/H2O (+ 0.5 % HFBA) and kept isocratic for 1 minute. A linear gradient was subsequently applied to 30/70 in 5 minutes, followed by a gradient up to 90/10 in 1 minute. This composition was held for 1 minute before cleaning the column at 100/0 for 3 minutes and re-equilibration for 12 minutes at initial conditions. In order to keep pressure under 400 bar, a flow rate of 0.2 ml/min was applied. A chromatogram of a standard mixture of 10 µg/ml separated with the presented gradient elution method on the Alliance 2690 is shown in Figure 2.

2.4 Mass spectrometry

Extra selectivity and low limits of detection provided by the multiple reaction monitoring (MRM) mode, make the MS the most suitable detector to screen KYN and TRP in a complex biological matrix like plasma. Parameters dependent on the analyzed components and electrospray formation were optimized via a ramping procedure. The mass spectrometer was operated in the positive ion mode and dwell time for all molecules was set at 150 ms. The first quadrupole was set to transmit the protonated molecular ions at m/z 205.2 for TRP, 210.2 for TRP-D5 and 209.2 for KYN. The protonated molecular ions were fragmented by collision-induced dissociation in the collision cell. The most abundant fragment ions; m/z 188.2 for TRP; m/z 192.1 for TRP-D5 and m/z 192.1 for KYN were selected for detection.

Figure 2. Chromatogram of a standard mixture of 10 µg/ml of KYN, TRP and TRP-D5

obtained after separation with the developed gradient elution and MRM detection method.

2.5 An posswerof th

3.1 FiguKYNwercorr0.10belo 3.2 FigulinerepeLODbelo

TSPPCC

Quantitatio

internal stasible lossesre constructhe unknown

Kynurenine

ure 3 (left) N for 0.5,

re obtained rected peak 02 µg/ml wow publishe

Tryptophan

ure 3 (righearity (as reatability (RD value waow publishe

Figure

TABLE I. ReprSample Patient 1 Patient 94 Control 1 Control 25

on

andard (I.S.,s of materiaed ranging ns.

e

depicts the1, 5, 10, 5as reflectedarea) below

while LOQ (ed KYN-con

n

ht) depicts represented RSD ≤ 5%) as 0.119 µged concentra

3. I.S. corr

resentative TRPKYN (µg/ml)

0,822 0,486 1,897 1,895

, TRP-D5) al during vafrom 0.5 to

3. Resu

e obtained c0 and 100

d by a correlw 5% respe(S/N = 10) ncentrations

the obtaineby the coin the inten

g/ml and LOations of TR

rected calib

P- and KYN-co) RSD

1,4,9,10

was used foarious sampo 100 µg/m

ults and Di

calibration cµg/ml are lation coeffectively. Th

was set at s in plasma

ed I.S. cororrelation fnded range OQ was 0.3RP in plasm

ration curve

oncentrationsD (%) ,307 ,732 ,904 0,626

for the quanple prepara

ml of each an

scussion

curve of KYplotted. Go

ficient of R²he obtained

0.342 µg/m(± 0,7 µg/m

rrected calibfactor R² =of TRP (±

396 µg/ml. ma (± 10 µg/

es of KYN

TRP (µg/ml)10,113 8,321

10,207 17,857

ntitative anaation steps. nalyte, for f

YN. The reood linearity² = 0,998 anvalue for L

ml. Both LOml).

bration cur= 0,999) al10 µg/ml) wBoth LOD

/ml).

(Left) and T

RSD (%)

5,0954,7887,886

10,957

alysis to corCalibration

further quan

elative peaky and repea

nd RSD%’s LOD (S/N =OD and LO

rve of TRPlong with were obtainand LOQ

TRP (right)

) Rat

0,00,00,1

7 0,1

rrect for n curves ntitation

k area of atability (for the

= 3) was OQ were

P. Good a good

ned. The are also

tio 81 58 86 06

All samples (149) were subsequently analyzed in series of about 20 – 25 samples. Each series was preceded by reconstruction of the calibration curves and each sample set (consisting of the 3 samples obtained from the three aliquots for each sample) was followed by a blank analysis. This to ensure maximal reliability of the method. 3.3 Data analysis Table I is giving some representative results for TRP- and KYN-concentrations, and the corresponding ratio of both values, for 2 IBD-patients and 2 controls. Figure 4.a is representing the distribution of the average value (of 3 aliquots) of TRP- and KYN-concentration for every sample, while Figure 4.b depicts the ratio-distribution for IBD-patients and controls.

Figure 4. (a) Distribution of IBD-patients and controls for KYN and TRP (left). (b)

Distribution of KYN/TRP-ratio for IBD-Patients and controls (right).

As seen in Figure 4.a a clear distinction can be made between IBD-patients and controls based on the concentration of both KYN and TRP, better than the distinction made in Figure 4.b based on the KYN/TRP-ratio. As depicted in Figure 4.b, higher ratios (postulated as higher IDO-activity) are observed in controls rather than in IBD-patients. This was not in correspondence with the original assumption. These findings were confirmed after data subjecting the data to a t-test. The KYN- and TRP-concentration as well as the KYN/TRP-ratio appeared to be significantly higher for controls than for IBD patients. The results of the t-test are tabulated in Table II.

For the chemometrical analysis, PCA and PLS, of the data we refer to the thesis.

TABLE II. t-test results for IBD-patient N Average conc.

(µg/ml) St. Dev. Sig.

KYN IBD-patient 104 0.894 0.376 4.76 . 10-26 Control 45 1.78 0.407 2.16 . 10-20 TRP IBD-Patient 104 9.88 3.19 1.09 . 10-10 Control 45 15.2 6.13 1.01 . 10-6 Ratio IBD-patient 104 0.101 0.0564 2.32 . 10-3 Control 45 0.129 0.0461 1.10 . 10-3

4. Conclusion

In the presented work the objective of developing a method for the analysis of underivatized tryptophan and kynurenine in plasma of IBD-patients and controls based on LC-MS/MS was achieved. The KYN/TRP-ratio was determined in 104 IBD-patients and 45 controls. Although significant distinction between IBD-patients and controls could be made, the hypothesis that sleepiness observed in IBD-patients could be the consequence of tryptophan depletion was not convincingly proven.

Acknowledgments

Analytical R&D, Pfizer Limited, Sandwich, Kent UK is gratefully acknowledged for providing the Alliance-API2000 LC-MS/MS system.

References

1. D.C. Baumgart and S.R. Carding, The Lancet: Gastroenterology, 369, 1627 (2007).

2. A.M. Wolf and D. Wolf, Overexpression of Indoleamine 2,3-dioxygenase in Human Inflammatory Bowel Disease, Clin Immunol, 113, 47 (2004).

3. R.Wang and A.Tang, Chinese J of Chromatogr , 24, 140 (2006) 4. Pi Lan-Gan and Tang Ai-Guo, Clin Biochem, 42, 420 (2009) 5. K. Petritis, Chromatographia, 60, 293 (2004) 6. Y.V. Tcherkas and L.A. Kartsova, J Chromatography A, 913; 303 (2001) 7. E. Gelpi, J Chromatogr A, 703, 59 (1995)

Ontwikkeling van een snelle LC-MS/MS methode voor het ...

Documents

Transcript of Ontwikkeling van een snelle LC-MS/MS methode voor het ...