LAB-Analyse30 oktober 2008, De Kuip Rotterdam

Veranderende analysemethoden voor

TDM (geneesmiddelconcentraties in humane matrices)

en klinische en forensische toxicologie

Implementatie van de nieuwste technologieën. Van Risico naar Succes?’

Prof..dr. Donald R.A.Uges, ziekenhuisapothekerklinisch en forensisch toxicoloog – farmacoloog,

LABLAB--AnalyseAnalyse30 oktober 2008, De Kuip Rotterdam30 oktober 2008, De Kuip Rotterdam

Veranderende analysemethoden voor

TDM (geneesmiddelconcentraties in humane matrices)

en klinische en forensische toxicologie

Implementatie van de nieuwste technologieën. Implementatie van de nieuwste technologieën. Van Risico naar Succes?’Van Risico naar Succes?’

Prof..dr. Donald Prof..dr. Donald R.A.UgesR.A.Uges,, ziekenhuisapothekerziekenhuisapothekerklinisch en forensisch toxicoloog klinisch en forensisch toxicoloog –– farmacoloog,farmacoloog,

Taak laboratorium Apotheek UMCG

1. Kwaliteitscontrole grondstoffen farmacopee onderzoek2. Controle bereide en gekochte farmaceutische preparaten

chemisch, fysisch, bacteriologisch3. Therapeutic Drug Monitoring: analyse + adviezen4. Klinische en forensische toxicologie: analyse + adviezen5. Toegepaste research farmaceutisch, medische onderzoeker6. Specifiek chemisch onderzoek7. Praktisch onderwijs en voorlichting.

ISO 9000; CCKL (Raad v Accreditatie); GMP

UGES/161

Taak laboratorium Apotheek UMCGTaak laboratorium Apotheek UMCG

1. Kwaliteitscontrole grondstoffen 1. Kwaliteitscontrole grondstoffen farmacopee onderzoekfarmacopee onderzoek2. Controle bereide en gekochte farmaceutische preparaten2. Controle bereide en gekochte farmaceutische preparaten

chemisch, fysisch, bacteriologischchemisch, fysisch, bacteriologisch3. 3. TherapeuticTherapeutic Drug Monitoring: Drug Monitoring: analyse + adviezenanalyse + adviezen4. Klinische en forensische toxicologie: 4. Klinische en forensische toxicologie: analyse + adviezenanalyse + adviezen5. Toegepaste research5. Toegepaste research farmaceutisch, medische onderzoekerfarmaceutisch, medische onderzoeker6. Specifiek chemisch onderzoek6. Specifiek chemisch onderzoek7. Praktisch onderwijs en voorlichting.7. Praktisch onderwijs en voorlichting.

ISO 9000; CCKL (Raad v Accreditatie); GMPISO 9000; CCKL (Raad v Accreditatie); GMP

UGES/161

Titreren in lab. apotheek UMCGTitreren in lab. apotheek UMCG UGES/4382

LCMSMS apotheek UMCG LCMSMS apotheek UMCG UGES/4384

Klinisch farmaceutische bio-analyses:

1. Therapeutic Drug Monitoring (T.D.M.)met als doel farmacotherapiebewaking of instellen,.

Concentraties in bloed bepalen van geneesmiddelen(metabolieten), door medisch handelen in de patiënt

2. Klinisch en forensisch toxicologiehet opsporen en/of kwantificeren, van stoffen in risicovolle concentraties die mogelijk onverwacht,accidenteel of intentioneel in de mens zijn geraakt.

3. Vervolgens in alle gevallen:Kinetische berekening, interpretatie en advies uges/4431

Klinisch farmaceutische Klinisch farmaceutische biobio--analysesanalyses::

1. Therapeutic Drug Monitoring (T.D.M.)1. Therapeutic Drug Monitoring (T.D.M.)met als doel met als doel farmacotherapiebewaking of instellen,farmacotherapiebewaking of instellen,..

Concentraties in bloed bepalen van Concentraties in bloed bepalen van geneesmiddelengeneesmiddelen(metabolieten),(metabolieten), door door medisch handelenmedisch handelen in de patiëntin de patiënt

2. Klinisch en forensisch toxicologie2. Klinisch en forensisch toxicologiehet het opsporenopsporen en/of en/of kwantificerenkwantificeren, van stoffen in , van stoffen in risicovolle concentraties die mogelijk risicovolle concentraties die mogelijk onverwacht,onverwacht,accidenteelaccidenteel of of intentioneelintentioneel in de mens zijn geraakt.in de mens zijn geraakt.

3. 3. Vervolgens in alle gevallen:Vervolgens in alle gevallen:Kinetische berekening, interpretatie en advies Kinetische berekening, interpretatie en advies uges/4431

1. Serum / bloed:1. Serum / bloed: farmacokinetiek, dynamiek ; huidige situatiefarmacokinetiek, dynamiek ; huidige situatie

2. Speeksel:2. Speeksel: FarmacodynamischeFarmacodynamische situatie, niet situatie, niet invasiefinvasief..

Veelal niet genoeg volume. Veelal niet genoeg volume. pHpH / / pKpK afhankelijk.afhankelijk.

DOA test in verkeer, op werk, in clubs: ad DOA test in verkeer, op werk, in clubs: ad hochoc..

3. Urine:3. Urine: Screening misbruik. Gebruik laatste dagen. Screening misbruik. Gebruik laatste dagen.

Voldoende volume, vervalsing, Voldoende volume, vervalsing, deglucuroniderendeglucuronideren

4. Pleisters:4. Pleisters: DOA laatste week; Therapietrouw DOA laatste week; Therapietrouw

5. Haren:5. Haren: Afhankelijk lengte: 1 à 1,5 cm / maand; duurAfhankelijk lengte: 1 à 1,5 cm / maand; duur

6. Meconium:6. Meconium: DOA in baby van moederDOA in baby van moeder

7. 7. LiquorLiquor of weefselof weefsel: Locaal: cytostatica MTX, antibiotica TBC: Locaal: cytostatica MTX, antibiotica TBC

Matrix keuze klinische toxicologieMatrix keuze klinische toxicologie UGES/4211

1.1. HPLC / STIP : HPLC / STIP : serum: serum: screening en direct kwantitatief screening en direct kwantitatief

2. LCMSMS: serum:serum: (mogelijk aanwezige ) bekende stoffen

2. 2. ImmunoassayImmunoassay: : serum:serum: paracetamol, TCA, paracetamol, TCA, benzo’sbenzo’s

Urine:Urine: opiaat , opiaat , cocainecocaine, amfetaminen, methadon, THC, amfetaminen, methadon, THC

3. GLC: 3. GLC: Bloed, urine:Bloed, urine: alcoholen,alcoholen, orgorg. oplosmiddel, aceton, GHB. oplosmiddel, aceton, GHB

4. ICP of AAS: bloed, serum, urine: metalen: lithium, kalium

5. GCMS: serum, urine: screening, confirmatie; forensisch

6. UV/VIS: serum : broom; 2.4.D, salicylaat, thiocyanaat

7. DLC: urine: (zelden): laxantia, diuretica screening

Meest gebruikte technieken in toxicologieMeest gebruikte technieken in toxicologieUGES/4213

1. Zeer uitgebreide bibliotheken aanwezig 1. Zeer uitgebreide bibliotheken aanwezig (>150.000 stoffen)(>150.000 stoffen)

2. Kwalitatief en kwantitatief; goede reproduceerbaarheid2. Kwalitatief en kwantitatief; goede reproduceerbaarheid

3. Zeer groot scheidend vermogen en gevoeligheid3. Zeer groot scheidend vermogen en gevoeligheid

4. Meeste stoffen detecteerbaar4. Meeste stoffen detecteerbaar ((niet UV / VIS afhankelijk)niet UV / VIS afhankelijk)

5. Meestal 5. Meestal derivatiserenderivatiseren noodzakelijknoodzakelijk, , tijdrovendtijdrovend

6. Extractie gelijk HPLC; uitgebreider dan LCMSMS6. Extractie gelijk HPLC; uitgebreider dan LCMSMS

7. Vereist analytische en chemische kennis en inzicht7. Vereist analytische en chemische kennis en inzicht

8. Interne standaarden duur en moeilijk verkrijgbaar8. Interne standaarden duur en moeilijk verkrijgbaar

VoorVoor-- en en nana--delen GC/MSdelen GC/MS

UGES/4215

1. Zeer gevoelig en specifiek Vooral met quadrupool MSMS

2. Flexibel: geschikt voor veel geneesmiddelen, ook in 1 run

3. Groot lineair bereik 103 à 4 ; piek en dal spiegels

4. Eenvoudige snelle extractie;

5. Korte run tijden., gradiënt, korte kolom

6. Duur apparaat; incl. gradiënt LC + injector: k€ 2,5

Bij TDM en tox is LCMS nauwelijks beter dan LC-DAD

7. Relatief hoge CV ( 5 – 15%)

8. Gevaar op ion suppressie of enhancement, en adducten

9. Nog geen bruikbare LCMSMS-bibliotheek verkrijgbaar.

10. Te veel vertrouwen in en verwachting van LCMSMS

VoorVoor-- en en na na –– delen LCMSMSdelen LCMSMS UGES/4217

HalfwaardetijdHalfwaardetijd: : lnln 2 / k = 0.69 / k; k = lnC2 / k = 0.69 / k; k = lnC11 -- lnClnC22 / (t/ (t22 -- tt11))

CC22 is de LOQ is de LOQ concentratieconcentratie op op tijdtijd tt22

Effect LOQ op Effect LOQ op halfwaardetijdhalfwaardetijd en en zero tolerancezero tolerance

UGES/ 4240

Financieel Financieel immunosuppressantsimmunosuppressants I.AI.A. . -- LCMSMSLCMSMSUGES/4224

€ 375.000excl. validatie

€ 100.000Bruto opbrengstExcl. dosis advies

à 35 punt à € 1.10± € 575.000

à 25 punt à € 1.10± € 400.000

OpbrengstenTotaal per jaar

€ 150.000€ 90.000€ 50.000€ 10.000

€ 290.000 / jaar€ 60.000€ 40.000€ 190.000

Analyse totaalanalistengebouw + energiereagentia

€ 50.00020% aanschaf € 250.000

afschrijving + onderhoud

€ 20.000 + Deel in reagensprijs,voor andere stoffen

Apparatuur Afschrijving +onderhoud

LCMSMSImmunoassay’sFPIA + EIA

Kosten per jaar± 15.000 bep. / jaar

1.1. Eén totaal LCMSMS systeem met gradiënt Eén totaal LCMSMS systeem met gradiënt elutieelutie

voor bijna alle belangrijke TDM geneesmiddelen (> 130)voor bijna alle belangrijke TDM geneesmiddelen (> 130)

2.2. Geen of minimale extractie procedure (werkbesparend)Geen of minimale extractie procedure (werkbesparend)

3.3. Grote Grote lineariteitlineariteit, met vereiste LOQ (, met vereiste LOQ (limit of limit of quantitationquantitation))

4.4. Flexibel, aantal stoffen samen, met zelfde interne standaardFlexibel, aantal stoffen samen, met zelfde interne standaard

5.5. Door de meeste analisten te gebruiken, ook in nacht Door de meeste analisten te gebruiken, ook in nacht

6.6. Voor Voor TDMTDM, spoed monsters en toxicologie, spoed monsters en toxicologie

7.7. Groot aantal bepalingen per dagGroot aantal bepalingen per dag

8.8. Minimaal risico op ion suppressie of versterkingMinimaal risico op ion suppressie of versterking

9.9. Automatisch zoeken naar de optimale parameters Automatisch zoeken naar de optimale parameters

DoelDoel voorvoor onzeonze LCLC--MSMS routine MSMS routine methodemethode

UGES/ 4430

Monster Monster voorbereidingvoorbereiding: : 100 100 µµL serum of L serum of standaardstandaard + 750 + 750 µµLL

interne interne standaardstandaard + + precipitatieprecipitatie + + extractieextractie mengselmengsel in in éééénn

(50 (50 µµg g cyanoimipraminecyanoimipramine / L methanol : / L methanol : acetonitrilacetonitril = 1 : 5; pH 6).= 1 : 5; pH 6).

Vortex 5 min; 30 min Vortex 5 min; 30 min bijbij --20 20 ooC, C, centrifugerencentrifugeren 5 min 11,000 rpm.5 min 11,000 rpm.

HeldereHeldere bovenlaagbovenlaag in in injectieinjectie vial; vial; InjecteerInjecteer 5 5 µµL inL in LCLC

LCLC--kolomkolom: : 5 cm * 2.1 mm (ID) C5 cm * 2.1 mm (ID) C18 18 Hypurity Aquastar Javelin ExprHypurity Aquastar Javelin Expr..

MobieleMobiele fasefase 5% buffer5% buffer ((ammonium ammonium acetaatacetaat 10g/L + 10g/L + azijnzuurazijnzuur

15ml/L + 15ml/L + trifluorazijnzuuranhydridetrifluorazijnzuuranhydride 2 ml/L water)2 ml/L water) en 95% water; en 95% water;

in 5 min tot 95% in 5 min tot 95% acetonitrilacetonitril en 5% buffer; flow 0.2 ml/min.en 5% buffer; flow 0.2 ml/min.

ApparatuurApparatuur:: Finnigan TSQFinnigan TSQ®® tandem MSMS; Electron spray ;tandem MSMS; Electron spray ;

UMCG UMCG standaardstandaard gevalideerdegevalideerde LCMSMS LCMSMS methodemethodeUGES/4226

VoorbeeldVoorbeeld van van tailor madetailor made TDMTDM UGES/ 4429

• Jongen, 5, zware ventriculaire fibrillatie, 3 x 15 mg atenolol / dag• Klinisch effect verwaaloosbaar; cardioloog zond serum for TDM. • Geen gevalideerde atenolol assay, we gebruikte LC-MS/MS.• Sub-therapeutisch (172 µg/L) atenolol (ref. 200-600 µg/L),

overeenkomend met gebrek aan gewenst therapeutic effect.• Het atenolol drankje, bereid door locale apotheker, was 98.5%• We adviseerden de dosering te verhogen tot 4 x 20 mg atenolol• Cardioloog vond dit te hoog voor kind; schreef voor 4 x 15 mg• Atenolol spiegel nu 295 µg/L. Effect nam toe; maar niet voldoende. • Doktor verhoogde dosis tot 4 x 20 mg, conform ons TDM advies• Atenolol serum spiegel werd 560 µg/L, met adequate effect.

1. Alarmerend aantal 1. Alarmerend aantal cocaïnecocaïne geïntoxiceerdegeïntoxiceerde patiëntenpatiënten

2. Cocaïne aangetoond als 2. Cocaïne aangetoond als benzoylecgoninebenzoylecgonine in urine met FPIAin urine met FPIA

3. Symptomen meer 3. Symptomen meer anticholinergischanticholinergisch dan specifiek cocaïnedan specifiek cocaïne

Maar diverse cocaïne effecten hetzelfde als bij atropineMaar diverse cocaïne effecten hetzelfde als bij atropine

4. In drugspoeder 25% atropine in cocaïne aangetoond4. In drugspoeder 25% atropine in cocaïne aangetoond

5. We ontwikkelde atropine, cocaïne en 5. We ontwikkelde atropine, cocaïne en benzoylecgoninebenzoylecgonine assayassay

in plasma, gebaseerd op standaard LCMSMS methodein plasma, gebaseerd op standaard LCMSMS methode

6. Zes patiënten: 6. Zes patiënten: benzoylecgoninebenzoylecgonine, geen andere drugs in urine, geen andere drugs in urine

7. Atropine plasmaspiegels: 64; 32; 38; 27; 61 resp. 80 7. Atropine plasmaspiegels: 64; 32; 38; 27; 61 resp. 80 μgμg/L/L

8. Later zijn 2 andere gebruikers gestorven. Geen monsters.8. Later zijn 2 andere gebruikers gestorven. Geen monsters.

Met Atropine Met Atropine verontreinigdeverontreinigde cocaine casecocaine caseUGES/4228

Atropine M 289.4Atropine M 289.4 CocaineCocaine M 303.4M 303.4 BenzoylecgonineBenzoylecgonine M 289.3M 289.3

Clarke’sClarke’s AnalysisAnalysis of Drugs 3of Drugs 3rdrd EdEd

Atropine, Cocaine and Benzoylecgonine Atropine, Cocaine and Benzoylecgonine

UGES/4197

Atropine M 289.4Atropine M 289.4 Cocaine M 303.4Cocaine M 303.4

m/zm/z 124; 82; 94; 83; 42;124; 82; 94; 83; 42; 96; 103; 6796; 103; 67 // 82; 182// 82; 182;; 83; 105; 30383; 105; 303;; 77; 94; 9677; 94; 96

Atropine, Cocaine and Benzoylecgonine Atropine, Cocaine and Benzoylecgonine MSMS--spectraspectra

UGES/4198

Benzylecgonine M 289.3Benzylecgonine M 289.3

124; 82124; 82; 168; 77; 105; 168; 77; 105;; 42; 94; 8342; 94; 83

Clarke’s 3Clarke’s 3rd rd EdEd

1.1.

Asbest in 1908 Asbest in 1908 nognog

een reguliere een reguliere farmaceutische farmaceutische

hulpstofhulpstof..

Broom nog per Broom nog per kilo!kilo!

UGES/4323