Omega-3- en -6-vetzuren bij de behandeling van kinderen en jongeren met ADHD
IN HOEVERRE KUNNEN NIET-VERESTERDE VETZUREN HET … · 2015. 11. 7. · Gedurende mijn ganse studie...
56
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2014 – 2015 IN HOEVERRE KUNNEN NIET-VERESTERDE VETZUREN HET INFLAMMATOIR KARAKTER VAN BOVIENE ENDOMETRIUMCELLEN BEÏNVLOEDEN? Een in vitro studie door Anita TILLEMAN Promotoren: Drs. E. Depreester Onderzoek uitgevoerd in het Prof. Dr. G. Opsomer kader van de Masterproef © 2015 Anita Tilleman
Transcript of IN HOEVERRE KUNNEN NIET-VERESTERDE VETZUREN HET … · 2015. 11. 7. · Gedurende mijn ganse studie...
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2014 – 2015
IN HOEVERRE KUNNEN NIET-VERESTERDE VETZUREN HET INFLAMMATOIR KARAKTER VAN
BOVIENE ENDOMETRIUMCELLEN BEÏNVLOEDEN?
Een in vitro studie
door
Anita TILLEMAN
Promotoren: Drs. E. Depreester Onderzoek uitgevoerd in het
Prof. Dr. G. Opsomer kader van de Masterproef
© 2015 Anita Tilleman
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of
volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk
uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor
enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig
vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2014 – 2015
IN HOEVERRE KUNNEN NIET-VERESTERDE VETZUREN HET INFLAMMATOIR KARAKTER VAN
BOVIENE ENDOMETRIUMCELLEN BEÏNVLOEDEN?
Een in vitro studie
door
Anita TILLEMAN
Promotoren: Drs. E. Depreester Onderzoek uitgevoerd in het
Prof. Dr. G. Opsomer kader van de Masterproef
© 2015 Anita Tilleman
VOORWOORD
Dit onderzoek werd uitgevoerd in het kader van de opleiding Master of Veterinary Medicine in de
Diergeneeskunde aan de Universiteit Gent. Het is het resultaat van het doorgronden van vele studies,
gecombineerd met het spenderen van veel tijd in het labo. Het zou echter niet hetzelfde geweest zijn
zonder de hulp en steun van een aantal mensen. Langs deze weg zou ik deze personen dan ook
graag bedanken.
Vooreerst wil ik een woord van dank richten tot mijn promotoren Drs. Elke Depreester en Prof. Dr.
Geert Opsomer. Het samen overleggen en bediscussiëren leidde ertoe dat er mogelijkheid was tot
optimalisatie van het onderzoek met zo het afleveren van een degelijk werk. Eveneens een dankjewel
aan Dr. Luisa Mateus die naar België kwam om haar ervaring met uterusexplanten met ons te delen.
Daarnaast wil ik ook iedereen van de verschillende labo’s bedanken die hebben bijgedragen tot het
onderzoek. Aan Petra Van Damme, Isabel Lemahieu en Marnik De Norre van de vakgroep
voortplanting, verloskunde en bedrijfsdiergeneeskunde, bedankt voor de bestellingen in het labo, de
bijsturing bij het uitvoeren van het protocol en de voorziening van de vloeibare stikstof. Aan de
vakgroep virologie, parasitologie en immunologie, bedankt voor de instructies bij de uitvoering van de
RNA-extractie en de PCR. Evenals een woord van dank aan het personeel van de vakgroep
Morfologie voor het maken van de histologische coupes.
Naast deze personen die rechtstreeks een invloed hebben gehad op dit werk, wil ik langs deze weg
ook mijn ouders, zussen en vrienden bedanken. Gedurende mijn ganse studie hebben ze mij
gesteund, in mij geloofd en me veel leuke momenten bezorgd. Zij zorgden ervoor dat de voorbije jaren
telkens opnieuw jaren waren om nooit meer te vergeten. Hierbij een speciaal woord van dank aan mijn
kotgenote Stephanie voor het nalezen van dit werk, maar bovenal voor de mooie tijd op kot.
Uiteraard ook een oprecht woord van dank aan alle professoren die me in al die jaren
diergeneeskunde hebben onderricht. Hun kennis en wetenschap die ze wisten over te brengen, kwam
niet enkel van pas in deze studie, maar vormt tevens de brede basis waarop ik uiteindelijk zelf mijn
toekomst zal moeten bouwen.
GEBRUIKTE AFKORTINGEN
AMP Antimicrobiële Peptiden
β-arr2 β-arrestin2
BCS Body Conditiescore
BHBA β-hydroxyboterzuur
DAL Diacyllipopeptiden
DAMP Damage Associated Molecular Pattern
DHA Docosahexaeenzuur
DSO Drogestofopname
EE Ether Extract
EPA Eicosapentaeenzuur
Eth Ethanol
FA Fatty Acid; Vetzuur
FABP Fatty Acid Binding Protein
FSH Follikel Stimulerend Hormoon
GH Groeihormoon
GPR120 G proteïne gekoppelde-receptor 120
IGF-I Insuline-like Growth Factor I
IКB Inhibitor of KappaB
IKKβ Inhibitory KappaB Kinase
IL Interleukine
JNK c-Jun N-terminal Kinase
LBP Lipopolysaccharide Binding Proteïn
LH Luteïniserend Hormoon
LPS Lipopolysaccharide
Med Medium
NDF Neutral Detergent Fiber
NEB Negatieve Energiebalans
NEFA Non-Esterified Fatty Acid
NFκB Nuclear Factor-kappaB
OA Oleic Acid; Oliezuur
PA Palmitic Acid; Palmitinezuur
PAMP Pathogen Associated Molecular Pattern
PMN Polymorfonucleairen
PRR Pattern Recognition Receptor
PVD Purulent Vaginal Discharge; Purulente vaginale uitvloei
RDP Rumen Degradable Protein; Pensbestendig eiwit
RUP Rumen Undegradable Protein; Pensonbestendig eiwit
SA Stearic Acid; Stearinezuur
TAB1 TAK1 Binding protein 1
TAK1 Transforming growth factor β Activated Kinase 1
TAL Triacyllipopeptiden
TLR Toll-like Receptor
TNF Tumor Necrosis Factor
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING .................................................................................................................................... 1
INLEIDING ............................................................................................................................................... 2
LITERATUURSTUDIE ............................................................................................................................. 3
1. DE TRANSITIEPERIODE ......................................................................................................... 3
1.1. DEFINITIE ............................................................................................................................. 3
1.2. NUTRITIONELE VERANDERINGEN – GEDAALDE DROGESTOFOPNAME .................... 3
1.2.1. Dierfactoren ................................................................................................................. 3
1.2.2. Samenstelling van het rantsoen .................................................................................. 4
1.2.3. Managementfactoren ................................................................................................... 5
1.2.4. Gevolgen van de gedaalde drogestofopname ............................................................ 6
1.3. ENDOCRINOLOGISCHE VERANDERINGEN ..................................................................... 8
1.3.1. Invloed op het hervatten van de ovariële cyclus en de vruchtbaarheid ...................... 9
1.3.2. Invloed op het vetmetabolisme .................................................................................. 10
2. ENDOMETRITIS ..................................................................................................................... 10
2.1. DEFINITIES ......................................................................................................................... 10
2.2. PATHOGENESE VAN ENDOMETRITIS ............................................................................ 11
2.2.1. Betrokken pathogenen .............................................................................................. 11
2.2.2. Inflammatoire pathway............................................................................................... 12
3. MOGELIJKE VERBANDEN TUSSEN DE METABOLE VERANDERINGEN POST PARTUM
EN ENDOMETRITIS ............................................................................................................... 16
3.1. INVLOED VAN NEFA’S OP DE INFLAMMATOIRE PATHWAY ........................................ 17
3.1.1. Omega-3 / omega-6 ratio .......................................................................................... 17
3.1.2. Activatie van de TLR-4 en de TLR-2 pathway door verzadigde vetzuren ................. 18
3.2. VERBAND MET CONDITIE ROND DE PARTUS ............................................................... 20
4. ENDOMETRIUMEXPLANTEN VERSUS CELCULTUREN .................................................... 21
ONDERZOEK ........................................................................................................................................ 23
1. HYPOTHESE .......................................................................................................................... 23
2. MATERIAAL EN METHODEN ................................................................................................ 23
2.1. COLLECTIE UTERUSEXPLANTEN ................................................................................... 23
2.2. INCUBATIE EN VERDERE COLLECTIE ............................................................................ 23
2.3. RNA-EXTRACTIE EN REVERSE TRANSCRIPTION ......................................................... 26
2.4. KWANTITATIEVE REAL-TIME PCR ................................................................................... 28
2.5. STATISTISCHE ANALYSE ................................................................................................. 29
2.6. HISTOLOGIE ....................................................................................................................... 29
3. RESULTATEN ........................................................................................................................ 29
3.1. EFFECT VAN ETHANOL, NEFA’S EN LPS OP DE EXPRESSIE VAN IL-1A, IL-1B, IL-6,
IL-8, IL-10 EN TNFα THV DE UTERUS .............................................................................. 29
3.2. HISTOLOGIE ....................................................................................................................... 35
BESPREKING ....................................................................................................................................... 38
REFERENTIELIJST .............................................................................................................................. 42
1
SAMENVATTING
Uteruspathologieën na de partus, zoals (sub)klinische endometritis, tasten de vruchtbaarheid van
melkkoeien aan en leiden tot economische schade op het bedrijf. De periode rond afkalven wordt
gekenmerkt door belangrijke endocrinologische en nutritioneel-metabole veranderingen waaronder de
zogenaamde negatieve energiebalans (NEB). Hierbij komen niet-verzadigde vetzuren (NEFA’s) in de
circulatie terecht, waarvan activatie van de inflammatoire cascade via de Toll-like receptoren eerder bij
muriene en humane cellen werd aangetoond. Dit, in combinatie met de link naar het metabool
syndroom bij de mens, leidde tot de hypothese dat chronische endometritis bij melkvee een gevolg
zou zijn van de NEB en de pro-inflammatoire staat waarbij de circulerende NEFA’s de inflammatoire
pathway ter hoogte van de uterus activeren.
Full-thickness uterusbiopten afkomstig van melkkoeien in stadium I van de oestruscyclus werden
geïncubeerd met de belangrijkste vetzuren die bij melkvee voorkomen tijdens de NEB, namelijk
oliezuur, palmitinezuur en stearinezuur. Daarnaast werden er ook explanten geïncubeerd met
lipopolysacchariden (LPS) als positieve controle en ethanol als vehikel controle. Op verschillende
tijdstippen werden stalen verzameld waarop vervolgens kwantitatieve real-time PCR werd toegepast
om de expressie van bepaalde genen in de biopten te bepalen. Vitaliteit van de biopten op de
verschillende tijdstippen werd beoordeeld op histologische coupes.
Er werden geen significante effecten aangetoond met betrekking tot een opregulatie van de
ontstekingsmediatoren IL-1A, IL-1B, IL-6, IL-8, IL-10 en TNFα zoals na activatie van de TLR-4 door
lipopolysacchariden.
Als besluit kon in deze in vitro studie dus geen activatie door NEFA’s vastgesteld worden van de
inflammatoire pathway die in gang gezet wordt na de binding van LPS van gramnegatieve kiemen met
de TLR-4. Verder onderzoek is nodig om na te gaan wat de oorzaak is van deze negatieve resultaten.
Naast de optie dat NEFA’s de boviene Toll-like receptoren niet kunnen activeren, is het mogelijk dat
het protocol moet aangepast worden. Het in oplossing brengen van de vetzuren in ethanol als vehikel,
evenals de uiteindelijke ethanolconcentraties in het incubatiemedium, zijn punten ter discussie.
2
INLEIDING
Men gaat er van uit dat tijdens een normale dracht het uteruslumen bij runderen steriel is. Na de
partus treedt in vrijwel 100% van de gevallen contaminatie op met bacteriën uit de omgeving en vanuit
de eigen microflora (Sheldon en Dobson, 2004; Földi et al., 2006; Sheldon et al., 2009a; Chapwanya
et al., 2012). De meerderheid van de koeien krijgt de infectie binnen de eerste 2 tot 3 weken na
afkalven onder controle, terwijl 20 tot 40% van de melkkoeien in de eerste week post partum een
metritis ontwikkelt. Bij 15 tot 20% van de dieren persisteert klinische uteruspathologie meer dan 3
weken post partum (klinische endometritis) en ongeveer 30% van de dieren ontwikkelt een
subklinische endometritis (Sheldon et al.; 2009a,b). De economische gevolgen hiervan voor de
veehouder zijn onder meer de directe therapeutische kosten (Goshen en Shpigel, 2006), de verlengde
tussenkalftijd, de verhoogde kans tot opruiming wegens het niet drachtig worden (Chastant-Maillard,
2011) en de lagere melkgift (Goshen en Shpigel, 2006).
In de praktijk wordt endometritis vaak behandeld met antibiotica, hoewel dit meestal niet leidt tot een
reductie van de tussenkalftijd. Een persistentie van de ontsteking ter hoogte van het endometrium in
de afwezigheid van bacteriën, zou zelfs een karakteristiek zijn van subklinische endometritis (Sheldon
et al., 2006). Vaccins zouden dan ook niet effectief zijn in de preventie van deze aandoening
(Machado et al., 2014) en de behandeling met antibiotica wordt sterk in vraag gesteld (Lefebvre en
Stock, 2012). Meer en meer komt men tot de conclusie dat een hyperinflammatoire reactie aan de
basis zou liggen van de pathofysiologie van een chronische endometritis (Chapwanya et al., 2009;
Herath et al., 2009; Fischer et al., 2010; Gabler et al., 2010). Anderzijds wordt het voorkomen van
(sub)klinische endometritis bij melkvee ook geassocieerd met de negatieve energiebalans (NEB) die
gezien wordt bij hoogproductieve dieren in de transitieperiode (Hammon et al., 2006; Dubuc et al.,
2010; Galvão et al., 2010; Kaufmann et al., 2010; Galvão et al., 2011; Galvão et al., 2012). Dieren die
in een vette conditie afkalven, hebben een lagere drogestofopname (DSO) in het begin van de
lactatie, maken een diepere NEB door en mobiliseren bijgevolg meer vet (Bines en Morant, 1983;
Treacher et al., 1986). Bij een diepere NEB komen dan ook grotere hoeveelheden niet-veresterde
vetzuren (NEFA’s) in de circulatie terecht. Op basis van in vitro studies gebruik makend van muriene
en humane cellen werd aangetoond dat verschillende vetzuren in staat zijn de Toll-like receptor 2 en 4
te activeren (Lee et al., 2001; Lee et al., 2004; Shi et al., 2006; Nguyen et al., 2007; Maloney et al.,
2009). Dit leidt tot de hypothese dat de NEB bij hoogproductieve dieren na afkalven de inflammatoire
cascade in het endometrium zou kunnen onderhouden met chronische endometritis tot gevolg. Het
doel van dit onderzoek is het achterhalen van de rol van de NEFA’s in de pathogenese van
endometritis om deze kennis vervolgens in te zetten voor eventuele therapeutische en preventieve
maatregelen in de droogstand en de transitieperiode.
3
LITERATUURSTUDIE
1. DE TRANSITIEPERIODE
1.1. DEFINITIE
De transitieperiode wordt gedefinieerd als de periode vanaf 3 weken voor, tot 3 weken na afkalven.
Het omvat dus de laatste weken van de droogstand en het begin van de lactatie met de partus als
overgang (Grummer, 1995). Deze periode wordt gekenmerkt door belangrijke endocrinologische en
nutritioneel-metabole veranderingen.
1.2. NUTRITIONELE VERANDERINGEN – GEDAALDE DROGESTOFOPNAME
Doorgedreven selectie naar steeds hogere melkproducties heeft geleid tot een disbalans tussen de
energiebehoefte na de partus en de mogelijkheid tot voldoende voederopname. Een daling in de DSO
werd reeds voor de partus door meerdere onderzoeksgroepen vastgesteld en houdt nog enige tijd aan
in het begin van de lactatie (Bertics et al., 1992; Huzzey et al., 2007). Verschillende factoren werken
hier op in (Figuur 2).
1.2.1. Dierfactoren
Onder meer de pariteit, de conditiescore, het aantal dagen dracht en de circulerende steroïdhormonen
spelen een rol.
Marquardt et al. (1977) stelden bij eerste en tweede kalfskoeien een reductie van de DSO van 25%
vast tijdens de 2 laatste weken voor de partus. Bij oudere dieren ging deze daling tot 52%. Onderzoek
door Hayirli et al. (2002) leidde tot vergelijkbare resultaten met daarenboven de vaststelling dat obese
dieren een grotere daling in DSO hebben (Figuur 1). Oorzaken van de gereduceerde DSO worden
onder andere gezocht bij de groeiende foetus en de drastische wijzigingen in de perifere concentraties
van steroïdhormonen rondom het moment van de partus (Ingvartsen en Andersen, 2000). De
groeiende foetus heeft de grootste impact op de DSO (Figuur 2). De toenemende volume-inname door
de baarmoeder in het abdomen zorgt immers voor een restrictie voor het pensvolume. Gezien de
groei van de foetus een gradueel verloop kent tijdens het laatste trimester van de dracht (Moe en
Tyrrell, 1972), en de gedaalde DSO pas op het laatste van de droogstand plaatsvindt, spelen er ook
andere factoren een rol. Veranderingen in circulerende steroïdhormonen vinden pas op het einde van
de dracht plaats en kunnen hierdoor meer in verband gebracht worden met de daling van de DSO. Op
het einde van de dracht is er een plotse stijging van oestrogenen in het bloed, welke door Green et al.
(1994) bij schapen negatief werd gecorreleerd met de voederopname. Het onderliggend mechanisme
zou erin bestaan dat oestrogenen via de hypothalamus de voederopname remmen. Muir et al. (1972)
toonden dit effect reeds aan bij melkkoeien en kwamen daarenboven tot de bevinding dat toediening
van progesteron deze oestrogeeninvloed deels kan compenseren. De daling in DSO vangt echter
reeds aan voor de stijging in serumconcentraties van oestrogenen (Dewhurst et al., 2000). Hieruit blijkt
dat nog andere factoren een rol spelen bij de regulatie van de voederopname op het einde van de
4
dracht: onder meer leptine en insuline, nutriënten en hun metabolieten en feedback signalen vanuit de
lever bij oxidatie van NEFA’s zouden een invloed hebben (Ingvartsen en Andersen, 2000).
Fig. 1. Werkelijke en voorspelde gemiddelde drogestofopname (% van lichaamsgewicht) in functie van
aantal dagen voor de partus bij vaarzen (—, ▴), koeien (—, ■) en obese koeien (- -, ●). (uit Hayirli et
al., 2003)
Opvallend is dat de daling in DSO nog enige tijd na de partus aanhoudt en daardoor achterblijft op de
behoefte voor melkproductie die veel sneller stijgt na het afkalven (Huzzey et al., 2007; Figuur 4).
1.2.2. Samenstelling van het rantsoen
Het vezelgehalte in het droogstandrantsoen heeft een duidelijke invloed op de DSO. Uit onderzoeken
van Olsson et al. (1998), Hayirli et al. (2002) en Grummer et al. (2004) blijkt dat de DSO voor de
partus negatief gecorreleerd is met het vezelgehalte (neutral detergent fiber; NDF) van het rantsoen.
Op de meeste commerciële bedrijven bevat het droogstandrantsoen 40% of meer NDF. Reduceren
van het vezelgehalte van 40% naar 30% gedurende de laatste 3 weken van de dracht, doet de DSO
stijgen met ongeveer 0,4% van het lichaamsgewicht (Grummer et al., 2004). Voor een rund van 600
kg betekent dit een toename van ongeveer 2,4 kg drogestof. Voor deze negatieve correlatie kunnen
twee oorzaken gevonden worden. Enerzijds is de opname van hoogvezelig voer gelimiteerd door de
vulcapaciteit van de pens. Anderzijds verloopt de verwerking van voeder met een hoog vezelgehalte
trager met een minder snelle lediging van de pens waardoor dan ook minder snel plaats vrijkomt voor
bijkomend voeder (Grummer et al., 2004).
De hoeveelheid aan pensbestendig (rumen degradable protein; RDP) en onbestendig eiwit (rumen
undegradable protein; RUP) in het rantsoen zou gedurende de laatste drie weken van de dracht een
significant effect uitoefenen op de DSO, maar is gering ten opzichte van de invloed van het
vezelgehalte (Hayirli et al., 2002; Grummer et al., 2004).
Toename van het vetgehalte (ether extract; EE) resulteerde bij onderzoek door Grummer et al. (2004)
in een duidelijke afname van de DSO. Hierbij werden ook pariteitsverschillen opgemerkt waarbij de
grootste afname gezien werd bij vaarzen. Een mogelijke verklaring ligt bij de rantsoenverschillen van
de melkgevende dieren versus het jongvee. Het voederen van vetten gebeurt meer bij lacterende
dieren dan bij de opfok van het jongvee waarbij weinig tot geen vet in het voeder aanwezig is.
5
Lacterende dieren zijn dus meer aangepast aan toevoeging van vet in het rantsoen en zijn bijgevolg
toleranter aan een verhoogd vetgehalte (Grummer et al., 2004).
Fig. 2. Relatief aandeel (%) van drachtstadium, pariteit, body conditiescore en voedersamenstelling in
de verminderde drogestofopname bij runderen tijdens de droogstand (naar Hayirli et al., 2002).
1.2.3. Managementfactoren
Naar management toe is er vooral onderzoek uitgevoerd naar factoren die de DSO bij lacterende
dieren beïnvloeden. Hieronder vallen onder meer overbezetting, groepsveranderingen,
rantsoenveranderingen, waterkwaliteit, aantal voederplaatsen en andere zaken die eveneens gelden
bij dieren die worden drooggezet en vervolgens afkalven en in lactatie gaan (Grant en Albright, 1995;
Grummer et al., 2004).
Een andere managementfactor is de duur van de droogstand. Grummer et al. (2004) vergeleken de
DSO gedurende de transitieperiode bij runderen die 0, 28 en 56 dagen droog stonden. Hierbij kregen
de runderen met 0 en 28 dagen droogstand een hoog-energetisch rantsoen voor lacterende dieren
zonder NaHCO3 teneinde het gehalte aan kationen te verlagen en aldus het risico op hypocalcemie te
reduceren. De runderen met 56 dagen droogstand, kregen een laag-energetisch dieet gedurende de
eerste 28 dagen, gevolgd door een matig-energetisch dieet gedurende de volgende 28 dagen. Na
afkalven werden alle dieren gevoederd met een hoog-energetisch rantsoen. Wegens de
rantsoenverschillen tussen de dieren met 28 en 56 dagen droogstand, betreft het hier eigenlijk meer
een vergelijking tussen strategieën van droogzetmanagement dan enkel de duur van de droogstand.
De dieren met 56 dagen droogstand hadden ten opzichte van de dieren met 28 dagen droogstand
(hoog-energetisch dieet) een lagere DSO, maar hadden een minder diepe val bij de partus (Figuur 3).
Runderen die niet hadden drooggestaan, hadden de grootste DSO zowel voor als na de partus. Voor
de partus is dit te verklaren door de hogere energiebehoefte wegens de voortgezette lactatie. Een
directe reden voor de hogere DSO na de partus is niet duidelijk, gezien de productie zelfs lager was
na de partus dan bij dieren die wel een periode van droogstand hadden gekend. De hoeveelheid
triacylglycerolen in de lever was in het begin van de lactatie het laagst bij dieren zonder droogstand,
wat verklaard kan worden door de voortgezette excretie van niet-veresterde vetzuren via de uier. Later
56,1%
10,0%
9,7%
1,2%
1,3% 6,4%
15,3%
Factoren met een invloed op de DSO
Drachtstadium
Pariteit
Body conditiescore
Pensonbestendig eiwit
Pensbestendig eiwit
Vetgehalte (EE)
Vezelgehalte (NDF)
6
in de lactatie hadden dieren met 4 weken droogstand eveneens lagere hoeveelheden triacylglycerolen
in de lever, wat wijst op een verschil in energiebalans met dieren die 8 weken droog staan (Grummer
et al., 2004).
Fig. 3. Drogestofopname tijdens de transitieperiode van koeien met een droogstandperiode van 56
(○), 28 (□) of 0 (∆) dagen. Koeien met 56 dagen droogstand werden gevoederd met een laag-
energetisch dieet gedurende de eerste 28 dagen, een matig-energetisch dieet gedurende de volgende
28 dagen en een hoog-energetisch dieet na afkalven. De andere groepen kregen constant een hoog-
energetisch dieet (uit Grummer et al., 2004).
Naast de duur van de droogstand, speelt ook het overmatig voederen van de dieren tijdens de
droogstand een belangrijke rol. Het leidt immers tot overmatige vervetting in vergelijking met koeien
die een beperktere opname van energie kennen en resulteert in een vettere lichaamsconditie op het
moment van afkalven (Rukkwamsuk et al., 2000). Voornamelijk dieren die in een vette conditie
afkalven hebben een lagere DSO in het begin van de lactatie, komen in een diepere negatieve
energiebalans terecht en gaan bijgevolg meer vet mobiliseren wat leidt tot een grotere afname van de
body conditiescore (BCS) (Bines en Morant, 1983; Treacher et al., 1986; Bernabucci et al., 2005). Dit
komt overeen met de bevinding van Grummer et al. (2004) dat dieren met een hoog-energetisch dieet
tijdens de droogstand een grotere afname van DSO kennen rond de periode van afkalven.
1.2.4. Gevolgen van de gedaalde drogestofopname
Voornamelijk wanneer de dieren in lactatie komen, gaat de energiebehoefte voor onderhoud en
lactatie de energieopname overschrijden met een energiedeficit tot gevolg. Dit wordt weergegeven als
de zogenaamde periode van negatieve energiebalans (Figuur 4). In deze periode zal het dier zijn
reserves aanspreken wat resulteert in lipolyse en proteolyse (Zurek et al., 1995; Contreras en Sordillo,
2011).
DM
I (k
g/d
)
Day Relative to Calving
7
Fig. 4. Schematische voorstelling van de energiebehoefte (zwarte lijn), de energieopname (blauwe lijn)
en de energiebalans (rode lijn) bij hoogproductief melkvee voor en na afkalven (gescheiden door de
verticale volle lijn). NEB = negatieve energiebalans; PEB = positieve energiebalans (naar Bossaert,
2010).
Proteolyse vindt voornamelijk plaats tijdens de eerste 2 weken na de partus en levert aminozuren die
als substraat dienen voor de gluconeogenese en de synthese van melkeiwitten (Ingvartsen 2006).
Lipolyse wordt, behalve door het energiedeficit, bijkomend gestimuleerd door een reeks hormonale
veranderingen bij transitiedieren (zie 1.3.). In het vetweefsel gebeurt lipolyse onder invloed van lipases
die triglyceriden, ook wel triacylglycerolen genoemd, in het vetweefsel kataboliseren tot glycerol en
NEFA’s. Deze NEFA’s bestaan voornamelijk uit palmitinezuur (C16:0), stearinezuur (C18:0) en
oliezuur (C18:1n9c) en komen in de circulatie terecht waar het grootste deel aan albumine wordt
gebonden (Rukkwamsuk et al., 2000; Leroy et al., 2005; Contreras en Sordillo, 2011). De toename
aan circulerende NEFA’s wordt gevolgd door een verhoogde opname van de vetzuren in de lever
(Bell, 1979; Rukkwamsuk et al., 2000). Eens in de lever kunnen NEFA’s drie verschillende pathways
volgen (Herdt, 2000; Ingvartsen, 2006; Meyer, 2010; Deprez, 2012; Figuur 5). Bij een eerste mogelijke
pathway is er volledige oxidatie in de mitochondriën en de peroxisomen waarbij via de Krebscyclus
koolstofdioxide en energie wordt gegenereerd. Of vetzuren al dan niet in de mitochondriën geraken, is
afhankelijk van het enzyme carnitine palmityl transferase 1 (CPT1) (Herdt, 2000). Het enzyme CPT1
wordt geremd door malonyl-CoA dat uit citraat ontstaat, dat op zijn beurt in de Krebscyclus
gegenereerd wordt bij voldoende glucose aanvoer. Bij gebrekkige voorziening van glucose, zoals in
het geval van de NEB bij transitiekoeien, ontstaat er weinig malonyl-CoA en worden de vetzuren dan
ook in de mitochondriën opgenomen en afgebroken tot acetyl-CoA. Wanneer er voldoende
oxaloacetaat voorhanden is, zal het acetyl-CoA volledig verwerkt worden in de Krebscyclus met
vorming van koolstofdioxide en energie. Het oxaloacetaat is echter vooral voorbehouden voor de
productie van glucose zodat acetyl-CoA in geval van glucosetekort onvolledig verwerkt wordt en in de
mitochondriën tot acetoacetaat wordt omgevormd. In het cytosol wordt een groot deel van het
acetoacetaat vervolgens omgezet naar twee andere ketolichamen, namelijk β-hydroxyboterzuur
(BHBA) en aceton. Dit is de ketogenese en is de tweede mogelijke weg die de vetzuren kunnen
volgen. Bij onvoldoende verwerking van vetzuren in de mitochondriën volgen de vetzuren een derde
8
pathway, namelijk reësterificatie tot triacylglycerolen. Een deel van de triacylglycerolen wordt samen
met apoproteïnes, cholesterol en fosfolipiden in lipoproteïnes ingebouwd, waarvan de very low density
lipoproteins (VLDLs) het belangrijkste deel uitmaken. De triacylglycerolen kunnen zo onder de vorm
van deze VLDLs de lever verlaten en in de circulatie terechtkomen. In het geval van de diepe NEB
post partum worden meer triacylglycerolen gevormd dan afgegeven, waarbij de synthese van de
apoproteïnes de beperkende factor is (Marcos et al., 1990). De snelle stijging van estradiol in het
bloed vlak voor afkalven stimuleert de triglyceridenstapeling ter hoogte van de lever door toename van
de synthese ervan enerzijds en een verminderde secretie van VLDL’s anderzijds (Goff, 2006).
Hierdoor gaan veel veresterde vetzuren opgestapeld worden in de lever met leververvetting tot gevolg.
Dit leidt tot het zogenaamde fat cow syndrome, synoniem voor het fatty liver syndrome. Hierbij zijn de
dieren vatbaarder voor ziektes rond de periode van afkalven zoals lebmaagverplaatsing, aan de
nageboorte blijven staan, metritis en mastitis (Morrow, 1976; Rukkwamsuk et al., 1999). Recentere
studies (Gustafson et al., 2007; Bertoni et al., 2008) legden reeds een verband tussen afkalven in een
vettere conditie en een algemene inflammatoire toestand in het puerperium, wat op zijn beurt werd
geassocieerd met een hogere prevalentie van ziektes na afkalven. Naast de drie genoemde metabole
wegen die de vrijgestelde NEFA’s kunnen volgen, zou een onveranderde biliaire excretie van de
vetzuren ook tot de mogelijkheden behoren (Ingvartsen, 2006).
Fig. 5. Verband tussen vetmetabolisme in het vetweefsel, de lever en de uier. ‘+’ geeft stimulerende
effecten aan. GH = groeihormoon; catech = cathecholamines; NEFA = non-esterified fatty acid; TG =
triglyceriden; VLDL = very low density lipoprotein; CPT-1 = carnitine palmityl transferase 1 (naar
Drackley, 1999).
1.3. ENDOCRINOLOGISCHE VERANDERINGEN
De transitieperiode wordt gekenmerkt door een reeks endocrinologische veranderingen die naast het
bepalen van de hervatting van de normale ovariële cyclus, ook zijn invloed heeft op het
vetmetabolisme (Opsomer et al., 1998; Butler, 2003; Contreras en Sordillo, 2011). Hierbij speelt de
9
ontkoppeling van de somatotrope as bij hoogproductieve dieren na afkalven een belangrijke rol (Lucy,
2008).
1.3.1. Invloed op het hervatten van de ovariële cyclus en de vruchtbaarheid
Typisch bij hoogproductieve dieren is een stijging van het groeihormoon (GH) na de partus. De
receptoren voor dit hormoon (GHR) bevinden zich voornamelijk in de lever en in het vetweefsel. Ter
hoogte van de lever resulteert binding van het GH aan de GHR enerzijds in een toegenomen
gluconeogenese en anderzijds in de synthese van de insuline-like growth factor I (IGF-I) (Herdt, 2000;
Contreras en Sordillo, 2011).
De gestegen gluconeogenese resulteert in een hogere beschikbaarheid van glucose voor de synthese
van lactose waardoor de melkproductie ondersteund wordt. De toestand van insulineresistentie die
typisch bij hoogproductieve dieren voorkomt, zorgt eveneens voor een hogere beschikbaarheid van
glucose voor de lactogenese (Lucy, 2008).
IGF-I zorgt samen met insuline voor een toename van het aantal gonadotropinereceptoren ter hoogte
van de ovaria (Beam en Butler, 1999; Frajblat, 2000). De gonadotropines (luteïniserend hormoon; LH
en follikel stimulerend hormoon; FSH) stimuleren op hun beurt de expressie van de type I IGF receptor
en zorgen voor een verhoogde synthese van IGF-I door de granulosacellen. Dit leidt tot een toename
van de effecten van FSH en LH met positieve invloed op de ovariële ontwikkeling en op de productie
van steroïden (Lucy, 2008; figuur 6). Kort voor afkalven is er echter een daling van het aantal GHRn
ter hoogte van de lever. Als gevolg hiervan is er een verminderde productie van IGF-I met een
gedaalde negatieve feedback naar de hypothalamus en een toename van de concentratie aan GH in
de circulatie. Dit wordt de ontkoppeling van de somatotrope as [GH – GHR – IGF-I] genoemd en
resulteert in een steady-state concentratie van het GH en een lagere hoeveelheid aan circulerend
IGF-I (Webb et al., 1999; Lucy, 2008). Dit valt samen met de lage insulinespiegel tijdens de NEB
(Frajblat, 2000). Het resultaat is dus een betere melkproductie, maar eveneens een reductie van de
ovariële respons op gonadotropines met een verlengd interval tussen de partus en de hervatting van
de ovariële cyclus (Frajblat, 2000; Butler, 2005).
Fig. 6. Verband tussen de somatotrope as [GH – GHR – IGF-I] en de functie van de ovaria bij
hoogproductieve koeien. Inwerking van GH op de lever leidt tot een toename van de hoeveelheid
10
circulerend IGF-I. Dit hormoon werkt in op de ovaria, waarbij een synergistisch effect met LH en FSH
ontstaat. Hierdoor worden de ovariële ontwikkeling en de productie van steroïden gestimuleerd. De
synthese en vrijstelling van IGF-I ter hoogte van de lever is tijdens de NEB echter verlaagd door een
ontkoppeling van de somatotrope as, wat leidt tot een reductie van de ovariële respons op
gonadotropines (Uit Lucy, 2008).
1.3.2. Invloed op het vetmetabolisme
In de transitieperiode wordt vet gemobiliseerd onder de vorm van NEFA’s en ketonen die als
energiebron fungeren voor de perifere weefsels. Dat laat aanvoer van glucose naar de foetus en naar
de uier voor synthese van lactose toe (Contreras en Sordillo, 2011). Deze lipolyse wordt ten tijde van
de negatieve energiebalans opgedreven door verschillende endocrinologische veranderingen die zich
op dat moment voordoen. De lage glucose- en insulinespiegels, de verhoogde insulineresistentie in
het vetweefsel en andere perifere weefsels, de toegenomen plasmaconcentraties van
catecholamines, groeihormoon en glucocorticoïden, allen stimuleren ze de vrijstelling van glycerol en
NEFA’s uit het vetweefsel in de periode van de NEB (Contreras en Sordillo, 2011) (Figuur 5).
2. ENDOMETRITIS
2.1. DEFINITIES
Endometritis wordt in enge zin gedefinieerd als een ontsteking van het baarmoederslijmvlies (Jochems
en Joosten, 2012). Men onderscheidt hierbij klinische endometritis van subklinische endometritis
(Tilleman, 2014).
Klinische endometritis houdt in dat het baarmoederslijmvlies ontstoken is (endometritis), waarbij dit
klinisch kan worden vastgesteld, maar systemische ziektetekens afwezig zijn. Bij het opstellen van
diagnostische criteria werd door LeBlanc et al. (2002) gekeken naar purulente uitvloei en een
vertraagde involutie, op te merken via rectaal onderzoek. Zo werden een purulente uteriene uitvloei of
een cervixdiameter van > 7,5 cm op dag 21 na afkalven of later, of mucopurulente uitvloei na 26
dagen post partum in verband gebracht met een verminderde reproductie en als diagnostisch
beschouwd voor klinische endometritis.
Subklinische endometritis onderscheidt zich van klinische endometritis door het feit dat er tijdens het
algemeen klinisch onderzoek geen afwijkingen kunnen worden vastgesteld. Uit de anamnese blijkt wel
dat de dieren moeilijker drachtig worden. De diagnose wordt gesteld aan de hand van het aantal
polymorfonucleaire cellen (PMN) aanwezig in een uteriene spoeling of in een staal, genomen via
cytobrush. Door verschillende onderzoeksgroepen worden hierbij heel uiteenlopende afkapwaarden
gebruikt, gaande van > 5% PMN tot > 25% afhankelijk van het tijdstip na afkalven waarop het staal
wordt genomen. Daarenboven wordt de staalname uitgevoerd via ofwel een cytobrush, ofwel een
uteriene spoeling. Door Sheldon et al. (2006) werd voorgesteld om > 18% PMN, 21 – 33 dagen post
partum, of > 10% PMN, 34 – 47 dagen post partum als grenswaarden vast te leggen voor een koe met
subklinische endometritis. Hierbij werd gebruik gemaakt van de spoelingstechniek.
11
2.2. PATHOGENESE VAN ENDOMETRITIS
Tijdens een normale dracht is het uteruslumen een steriele omgeving. Na afkalven wordt de uterus
gecontamineerd met bacteriën die afkomstig zijn van zowel de omgeving, als van de eigen microflora
(Földi et al., 2006; Sheldon et al., 2009a; Chapwanya et al., 2012). Chapwanya et al. (2012) toonden
deze contaminatie post partum aan via bacteriologisch onderzoek op endometriale swabs bij 13
koeien. Vijftien dagen na afkalven waren alle swabs positief. Volgens Sheldon et al. (2009a) zou
contaminatie van het intra-uteriene milieu optreden bij bijna 100% van de dieren na de partus (Figuur
7). Of er al dan niet een infectie optreedt, is afhankelijk van zowel de betrokken pathogenen, als van
gastheerfactoren.
2.2.1. Betrokken pathogenen
Verschillende technieken worden toegepast om de bacteriën bij (endo)metritis te identificeren. Terwijl
men vroeger gebruik maakte van cultivatie van uterussecreet, gaat men nu meer en meer over naar
cultuuronafhankelijke technieken op moleculair niveau, meer bepaald het DNA (Santos et al., 2011;
Machado et al., 2012; Santos en Bicalho, 2012; Peng et al., 2013). PCR-Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis (DGGE) en sequenering van het DNA behoren hierbij tot de mogelijkheden. Voordeel
hierbij is dat eveneens kiemen die niet groeien onder standaard incubatiecondities geïdentificeerd
worden en men eveneens naar specifieke virulentiegenen op zoek kan gaan (Santos et al., 2011). Tot
de pathogenen die bij endometritis teruggevonden worden in de uterus, behoren onder meer
Escherichia coli, Trueperella pyogenes, Prevotella species, Fusobacterium necrophorum en
Bacteroides species (Ruder et al., 1981; Williams et al., 2007; Herath et al., 2009; Sheldon et al.,
2009a). E. coli blijkt de meest prominente bacterie te zijn bij dieren die (endo)metritis ontwikkelen in de
eerste week na afkalven (Williams et al., 2007; Herath et al., 2009). Dit wordt gevolgd door een switch
naar T. pyogenes, waarbij een voorafgaandelijke infectie met E. coli het endometrium gevoeliger
maakt voor deze kiem (Williams et al., 2007).
Fig. 7. Incidentie van bacteriële uterusinfectie (stippen,
bronafhankelijk) en ziekte (gekleurde zones) post partum
bij melkvee (uit Sheldon et al., 2009a).
12
Naast deze bacteriën wordt de prevalentie van het Boviene herpesvirus 4 (BoHV-4) ook geassocieerd
met pathologie van de uterus post partum (Czaplicki en Thiry, 1998). Tropisme voor het endometrium
werd reeds aangetoond door Donofrio et al. (2007). De lipopolysacchariden, afkomstig van de Gram-
celwand van E. coli, zijn in staat de IE2 promotor van het viraal genoom te activeren met snelle
replicatie van het virus en snelle celdood van de geïnfecteerde cellen tot gevolg (Donofrio et al.,
2008).
Daartegenover staat de stelling dat een persistentie van de inflammatie ter hoogte van het
endometrium in de afwezigheid van bacteriën, een karakteristiek zou zijn van subklinische
endometritis (Sheldon et al., 2006). Recent onderzoek van Machado et al. (2014) staaft deze stelling.
Deze onderzoeksgroep voerde onderzoek uit naar mogelijke vaccinatie ter bescherming tegen
(endo)metritis. Puerperale metritis werd gediagnosticeerd op 6 ± 1 dagen in lactatie. Koeien met
metritis hadden een waterige roodbruine stinkende uitvloei in combinatie met een rectale temperatuur
hoger dan 39,5°C. De diagnose van klinische endometritis werd gesteld op 35 ± 3 dagen in lactatie
door middel van een uteriene spoeling waaraan telkens een score van 0 tot 2 werd gegeven. Hierbij
stond 0 gelijk aan de afwezigheid van (muco)purulent secreet in de uitgespoelde vloeistof, duidde 1 op
de aanwezigheid van bloed zonder pus en werd 2 gegeven aan stalen met pus. De diagnose van
klinische endometritis werd gegeven aan de koeien waarbij het staal een score 2 kreeg. Hierbij
toonden ze aan dat vaccinatie geen effect heeft op het voorkomen van klinische endometritis, wat
suggereert dat de rol van bacteriën in deze pathologie niet primeert. Daartegenover werkt subcutane
vaccinatie met geïnactiveerde bacteriële componenten van E. coli, F. necrophorum en T. pyogenes
wel beschermend tegen puerperale metritis, waarbij pathogene kiemen wel een duidelijke rol spelen.
2.2.2. Inflammatoire pathway
De aangeboren immuniteit vormt de belangrijkste manier om infectie, volgend op contaminatie van de
uterus, te vermijden of te overwinnen (Sheldon et al., 2009a; LeBlanc, 2012). Verschillende niet-
specifieke defensiemechanismen spelen een rol bij de eliminatie van micro-organismen die de uterus
na afkalven contamineren. Bacteriële clearance bestaat in de eerste plaats uit contracties van het
myometrium, waarbij bacteriën samen met necrotische weefsels en andere voedingsbodems voor
kiemen na het afkalven worden uitgedreven. Daarnaast zal de cervix zich sluiten en zal het
endometrium na de partus regenereren, welke beiden een fysische barrière vormen. Stijging van de
zuurtegraad in de uterus en de fagocytose van bacteriën door neutrofielen reduceren tevens de kans
op bacteriële invasie (Chastant-Maillard, 2011).
Het endometrium bevat evenals de stromacellen, de zogenaamde pattern recognition receptors
(PRRs). Binding van bepaalde sterk geconserveerde moleculen van aanwezige kiemen (pathogen-
associated molecular patterns; PAMPs) aan deze receptoren geeft aanleiding tot een cascade met
productie van ontstekingsmediatoren tot gevolg (Davies et al., 2008; Turner et al., 2012; Figuur 8). De
belangrijkste kiemen in de postpartum periode zijn de Gram- kiem E. coli en de Gram+ kiem T.
pyogenes (zie 2.2.1.). Lipopolysacchariden en peptidoglycanen vormen de belangrijkste PAMPs van
Gram- kiemen waarmee ze aan de PRRs Toll-like receptor 4 (TLR-4), respectievelijk nod-like
receptoren 1 en 2 (NOD-1 en -2) binden. De belangrijkste pathway in de pathologie van endometritis
13
is deze na herkenning door TLR-4 (Figuur 8). Lipoteichoïnezuren en diacyllipopeptiden van Gram+
kiemen hebben de heterodimeer TLR-2/6 als receptor, terwijl triacyllipopeptiden door de heterodimeer
TLR-1/2 herkend worden. Binding aan de nod-like receptoren (NLR) is voor Gram+ kiemen
daarentegen kiemafhankelijk (Kumagai en Akira, 2010; Turner et al., 2012; Turner et al., 2014). Het
endometrium, dat epitheel-, stroma-, endotheel- en immuuncellen bevat, brengt mRNA voor de
meeste van deze receptoren tot expressie (Turner et al., 2012; Turner et al., 2014). Na de
receptorbinding volgt dus een cascadereactie die resulteert in de productie van cytokines,
chemokines, acutefase-eiwitten, antimicrobiële peptiden en prostaglandine E2 (Figuur 8). Hieronder
worden enkel de translatieproducten besproken waarnaar onderzoek werd gedaan in deze studie.
IL-1A Dit interleukine speelt op verschillende niveaus een rol. Vooreerst stimuleert het de
contracties van het myometrium via een verhoging van de calciumspiegel in het bloed.
Hierdoor verloopt de expulsie van debris en kiemen efficiënter. Daarnaast leidt het tot
vasodilatatie waardoor ontstekingscellen beter ter plaatse komen en hun functie kunnen
uitoefenen in geval van een infectie (Singh et al., 2008).
IL-1B Galvão et al. (2011) vermelden dat dit cytokine samen met tumor necrosis factor-α (TNFα),
de expressie van IL-8 op het vasculair endotheel verhoogt. Dit leidt tot attractie van
neutrofielen en macrofagen. Daarnaast zouden ze ook zorgen voor activatie van die cellen
met een betere fagocytose en afdoding van de kiemen tot gevolg. Naast deze lokale effecten
zijn ze ook in staat koorts te induceren, het zijn zogenaamde endogene pyrogenen
(Fiorentino et al., 1991; Janeway et al., 1999).
TNFα Naast de functies, hierboven vermeld bij IL-1B, is dit cytokine belangrijk voor de activatie van
apoptose (Ksontini et al., 1998).
IL-6 Dit is samen met IL-1 en TNFα een pro-inflammatoir cytokine. Het wordt vroeg in het
ontstekingsproces geproduceerd en induceert de productie van acutefase-eiwitten, die
voornamelijk in de lever gevormd worden (Chapwanya et al., 2009). IL-6 bevordert tevens de
maturatie van neutrofielen in de acute fase van de ontsteking en zorgt vervolgens voor een
switch naar een inflammatie die door macrofagen wordt gedomineerd (Kaplanski et al.,
2003). Dit gebeurt indirect via de opregulatie van het MCP-1, een monocyt chemokine
(Galvão et al., 2011). Door Singh et al. (2008) wordt daarenboven een inductie van de
expressie van oxytocine-receptoren op de endometriumcellen aan dit interleukine
toegeschreven.
IL-10 In tegenstelling tot de voorgaande interleukines, is dit een anti-inflammatoir cytokine dat
gesecreteerd wordt door Th2-cellen en de productie van cytokines door geactiveerde
macrofagen inhibeert (Fiorentino et al., 1991; Janeway et al., 1999; Herath et al., 2009).
IL-8 Dit interleukine behoort tot de groep van de chemokines. Het zorgt voor het aantrekken van
polymorfonucleairen naar de plaats van ontsteking (Singh et al., 2008; Chapwanya et al.,
2012). In een eerste stap zorgt het ervoor dat de leukocyten overgaan van het rollen over
het endotheel tot een stabiele binding. Vervolgens leidt dit chemokine de leukocyten naar de
plaats van infectie door het vormen van een concentratiegradiënt in het weefsel met
stijgende concentratie naar de plaats van infectie toe (Janeway et al., 1999).
14
Fig. 8. Schematische weergave van de intracellulaire cascade die in gang gezet wordt na infectie met
E. coli ter hoogte van de uterus, samen met invloeden van vetzuren die in de literatuur werden
teruggevonden. Het resultaat van deze activatie is gentranscriptie met productie van prostaglandine
E2, antimicrobiële peptiden (AMPs), chemokines en cytokines tot gevolg (naar Janeway et al., 2005;
Kumagai en Akira, 2010; Oh et al., 2010; Turner et al., 2014).
VETZUREN??
15
Galvão et al. (2011) vonden kort na de partus een te zwakke of uitgestelde inflammatoire reactie. In de
literatuur komt men echter meer en meer tot de conclusie dat er in geval van endometritis een
overactivatie is van het pro-inflammatoire systeem. Het gaat hierbij veeleer over een uit de hand
gelopen ontstekingsreactie dan louter over een infectie (Chapwanya et al., 2009; Herath et al., 2009;
Fischer et al., 2010; Gabler et al., 2010) (Tabel 1).
Tabel 1. Vergelijking van de genexpressie ter hoogte van de uterus bij koeien met endometritis ten
opzichte van gezonde runderen in de periode na afkalven. Vergelijkende studie van de resultaten van
verschillende onderzoeksgroepen. De significante bevindingen worden aangegeven met een *P <
0,05 (uit Tilleman, 2014).
0 1 wk 2 wk 3 wk 5 wk 7 wk
Receptoren
TLR4↑ (2*)
TLR 1-3= (2)
TLR 5-10= (2)
NOD 1= (2)
TLR 4↑ (1)
TLR 6↑ (1)
TLR 10↑ (1)
Intracellulaire
cascade
NFκB1↑ (1)
Cytokines TNFα↓ (5)
IL-6↑ (5*)
IL-1A↑ (2*)
IL-1B↓ (5)
IL-1B↑ (2*)
IL-1R2↑ (2*)
IL-10 = (2)
IL1A/IL10↑ (2)
IL1B/IL10↑ (2)
TNFα↓ (5)
IL-1A↑ (1)
IL-1B↑ (4*)
IL-6↑ (1, 4*)
IL-12A↑ (1*)
TNFα↓ (1)
TNFα↑ (4*)
IFNγ↑ (1)
IL-1B↑ (3*)
IL-6↑ (3)
TNFα↑ (3*)
IL-1B↑ (5) IL-1B↑ (5)
IL-6↑ (5*)
Chemokines
CXCL5↑ (4*)
IL-8↑ (1, 4*)
CXCL5↑ (3*)
IL-8↑ (3)
IL-8↑ (5*)
Prostaglandine PTGER2= (2)
PTGER4= (2)
PTGS2↑ (4*) PTGS2 = (3)
Antimicrobiële
proteïnen
TAP↑ (1*)
DEFB5↑ (1*)
Onderzoeksgroep N Beoordeling endometritis / afkapwaarde (sub)klinische endometritis
(1) Chapwanya et al., 2009 13 uteriene spoeling en histologie: % PMN en erge >< milde graad van inflammatie
(2) Herath et al., 2009 28 klinische endometritis: PVD 3 wkPP bij manipulatie van de genitale tractus
subklinische endometritis: > 10% PMN 35 dPP via uteriene spoeling
(3) Fischer et al., 2010 27 klinische endometritis: PVD 21-27 dPP bij rectale palpatie van de uterus
en vaginoscopie
subklinische endometritis: > 5% PMN 21–27 dPP via cytobrush
(4) Gabler et al., 2010 5 klinische endometritis: PVD 3 wkPP bij palpatie van de uterus en vaginoscopie
subklinische endometritis: > 5% PMN 31 dPP via cytobrush
(5) Galvão et al., 2011 28 endometritis: ≥ 10% PMN 5 wkPP via uteriene spoeling
≥ 8% PMN 7 wkPP via uteriene spoeling
16
3. MOGELIJKE VERBANDEN TUSSEN DE METABOLE VERANDERINGEN POST PARTUM EN
ENDOMETRITIS
De periode van negatieve energiebalans die de melkkoeien doormaken, gaat gepaard met lipolyse
waarbij de hoeveelheid NEFA’s en ketonen in de circulatie een maat zijn voor de graad van de NEB
die de koe doormaakt (Grummer et al., 2004) (zie 1.2.4.). Stijging van deze parameters werd tevens in
verband gebracht met het voorkomen van uteruspathologieën na de partus (Tabel 2).
Tabel 2. Vergelijking van nutritionele en metabole parameters bij koeien die metritis, klinische
endometritis en subklinische endometritis ontwikkelen t.o.v. gezonde runderen in de periode na
afkalven. Vergelijkende studie tussen verschillende onderzoeksgroepen. De * duiden de NIET-
significante bevindingen aan (*P > 0,05), alle andere bevindingen zijn significant (P < 0,05) (naar
Tilleman, 2014).
-2 wk - 1 wk 0 1 wk 2 wk 3 wk 4 wk 5 wk 6 wk
Drogestofopname ↓ (1, 1, 2) ↓ (1, 1, 2) ↓ (1, 1, 2) ↓ (1, 1, 2) ↓ (1, 1, 2) ↓ (1, 1, 2) ↓ (1, 1) ↓ (1, 1)
Wateropname ↓ (2) ↓ (2) ↓ (2) ↓ (2) ↓ (2) ↓ (2)
NEFA ↑ (1, 1)
= (3)
↑ (1, 1, 4,
4, 4, 5,
5
↑ (1, 1, 4,
4, 4, 6*,
6, 8, 8)
= (3)
↑ (1, 1, 4,
4, 7, 8)
= (3)
↑ (1, 1, 4,
4)
= (3)
↑ (1, 1)
↑ (1, 1)
= (3)
↑ (6*, 6)
= (3)
BHBA
= (5)
↑ (6, 8)
↑ (1, 1, 6*,
8)
= (5)
↑ (1, 1,
6*)
↑ (1, 1)
↑ (1, 1)
= (5)
° Specifiek met betrekking tot primiparen (in tegenstelling tot multiparen)
Onderzoeksgroep N Beoordeling (endo)metritis / afkapwaarde (sub)klinische endometritis
(1) Hammon et al., 2006 83 metritis: waterige stinkende uteriene uitvloei, ongeacht rectale temp, ≤ 14 dPP
klinische endometritis: PVD bij vaginoscopie, 3-4 wkPP
subklinische endometritis: > 25% PMN 3-4 wkPP via uteriene spoeling
(2) Huzzey et al., 2007 101 metritis: waterige stinkende vaginale uitvloei of PVD ≤ 3 wkPP
(3) Burke et al., 2010 78 endometritis: > 6% PMN 6 wkPP via cytobrush
(4) Dubuc et al., 2010 1 295 metritis: stinkende vaginale uitvloei met systemische ziektetekens ≤ 20 dPP
klinische endometritis: PVD 7 wkPP bij onderzoek met een metricheck apparaat
subklinische endometritis: ≥ 6 PMN 7 wkPP via cytobrush
(5) Kaufmann et al., 2010 209 klinische endometritis: PVD 5 wkPP bij vaginoscopie
subklinische endometritis: > 18% PMN 5 wkPP via cytobrush
(6) Galvão et al., 2010 80 metritis: waterige stinkende vaginale uitvloei en rectale temp > 39,5 °C, ≤ 14 dPP
subklinische endometritis: ≥ 10% PMN 6 wkPP via uteriene spoeling
(7) Galvão et al., 2011 28 endometritis: ≥ 10% PMN 5 wkPP via uteriene spoeling
≥ 8% PMN 7 wkPP via uteriene spoeling
(8) Galvão et al., 2012 42 metritis: waterige stinkende vaginale uitvloei en rectale temp ≥ 39,5 °C, ≤ 14 dPP
endometritis: ≥ 10% PMN 6 wkPP via uteriene spoeling
17
De NEFA’s die tijdens de NEB in de circulatie terechtkomen na vrijstelling uit het vetweefsel bestaan
voornamelijk uit de verzadigde vetzuren palmitinezuur (C16:0) en stearinezuur (C18:0), en het mono-
onverzadigde oliezuur (C18:1n9c) (Rukkwamsuk et al., 2000; Leroy et al., 2005; Contreras et al.,
2010). Daarnaast worden ook veranderingen waargenomen in de vetzuurprofielen van andere
vetfracties in de circulatie, namelijk de fosfolipiden, de cholesterolesters en de triglyceriden (Contreras
en Sordillo, 2011).
Het onderliggend mechanisme voor het verband tussen de NEB en de hyperinflammatoire reactie die
bij endometritis gezien wordt, is tot op heden nog niet conclusief. Wel kunnen er meerdere
verklaringen gevonden worden in de literatuur waarbij de NEFA’s die vrijkomen bij de lipolyse een
sleutelrol spelen.
3.1. INVLOED VAN NEFA’S OP DE INFLAMMATOIRE PATHWAY
3.1.1. Omega-3 / omega-6 ratio
Door Lock et al. (2009) werd een verband waargenomen tussen het stadium in de lactatie of de
droogstand, en de concentratie aan ω3-vetzuren in de rode bloedcelmembranen. Hierbij werden de
hoogste concentraties gezien bij droogstaande koeien en daalde de ω3-fractie in het begin van de
lactatie. Analoog hieraan stelden Douglas et al. (2007) in de periode na afkalven een daling vast van
ω3-vetzuren in de leverfosfolipiden. Deze bevindingen wijzen op mogelijke verschillen in de ω3-status
afhankelijk van de fysiologische toestand van het dier. De belangrijkste omega-3 vetzuren zijn
linoleenzuur (C18:3n3) dat voornamelijk in lijnzaad terug te vinden is, en docosahexaeenzuur (DHA;
C22:6n3) en eicosapentaeenzuur (EPA; C20:5n3) waarvan visolie een belangrijke bron is. De
verhouding van ω3- tot ω6-vetzuren zou mogelijks een invloed hebben op de inflammatoire respons
bij het melkvee (Contreras en Sordillo, 2011) waarbij ω3-vetzuren een anti-inflammatoire en ω6-
vetzuren een overwegend pro-inflammatoire werking zouden hebben. Er werden reeds meerdere anti-
inflammatoire effecten aan omega-3 vetzuren toegeschreven.
Circulerende vetzuren worden via passieve diffusie of via binding met hun carboxylaatgroep (R-COO-)
aan vetzuurbindende proteïnen (FABPs) opgenomen in het cytosol van cellen (Storch en McDermott,
2009). In het cytosol kunnen ze na activatie door het fatty acyl-CoA synthetase in fosfolipiden worden
ingebouwd via het endoplasmatisch reticulum en het Golgi apparaat (McArthur et al., 1999). Een
hogere concentratie van de ω3-vetzuren in de fosfolipiden in de celmembranen resulteert in een
gedeeltelijke vervanging van het arachidonzuur (C20:4n6). Hieruit volgt een verminderde
aanwezigheid van het substraat voor de productie van arachidonzuurafgeleide mediatoren waaronder
prostaglandines en leukotriënen die overwegend pro-inflammatoire effecten hebben (Calder, 2005).
Onderzoek door Lee et al. (2003) op een monocytencellijn bij muizen (RAW 264.7) toonde aan dat
DHA en EPA de lipopolysaccharide- of lipopeptide-geïnduceerde activatie van de TLR-4,
respectievelijk de TLR-2, kunnen inhiberen. Hierbij oefenen de ω3-polyonverzadigde vetzuren hun
effect uit via de TLR zelf of geassocieerde moleculen. Dit staat tegenover de activatie van deze
18
receptoren door verzadigde vetzuren (Lee et al., 2001; Lee et al., 2003; Nguyen et al., 2007; Maloney
et al., 2009) (zie 3.2.2.).
Oh et al. (2010) linkte de anti-inflammatoire werking van ω3-vetzuren aan de G proteïne-gekoppelde
receptor 120 (GPR120). Dit onderzoek werd eveneens uitgevoerd op de monocytencellijn RAW 264.7,
maar tevens op adipocyten. De GPR120 komt in hoge mate tot expressie in mature adipocyten en
macrofagen waarbij binding van ω3-vetzuren enerzijds leidt tot inhibitie van de ontsteking en
anderzijds tot een verhoogde insulinegevoeligheid ter hoogte van de adipocyten (Oh et al., 2010).
Modulatie van de ontstekingsreactie gebeurt via onderdrukking van het pro-inflammatoire systeem en
activatie van het anti-inflammatoire systeem waar onder meer het IL-10 deel van uitmaakt. Suppressie
van de ontsteking verloopt via een inhibitie van de fosforylatie van IKKβ en JNK na associatie van β-
arrestin2 met het cytoplasmatisch domein van de G proteïne-gekoppelde receptor. Na internalisatie
van dit complex, kan dat β-arrestin2 inwerken op het TAK1 binding protein 1 (TAB1) waardoor de
associatie van dit TAB1 met het Transforming growth factor β Activated Kinase 1 (TAK1) verhinderd
wordt. Hierdoor wordt ubiquitinisatie met activatie van dit enzyme geïnhibeerd, met als gevolg dat de
signalisatie via IKKβ en JNK en de transcriptie van pro-inflammatoire genen niet doorgaat (Oh et al.,
2010; Figuur 8).
Chronische ontsteking ter hoogte van de weefsels is een belangrijke oorzaak van het ontstaan van
insulineresistentie (zie 3.3.). Het anti-inflammatoire effect dat ontstaat via de GPR120 ter hoogte van
de macrofagen en vetcellen verhoogt dan ook de insulinegevoeligheid. De toegenomen
insulinegevoeligheid is het resultaat van een toegenomen translocatie van de glucosetransporter 4
(GLUT4) naar de plasmamembraan van de vetcellen (Oh et al., 2010).
3.1.2. Activatie van de TLR-4 en de TLR-2 pathway door verzadigde vetzuren
De lipopolysacchariden (LPS) van gramnegatieve kiemen interageren met de TLR-4 waarna activatie
van de inflammatoire pathway volgt (zie 2.2.2.; Figuur 8). Cruciaal voor de toxische werking van de
LPS is het lipidA gedeelte. Het lipidA deel van E. coli, die een belangrijke rol speelt in de ontwikkeling
van (endo)metritis na afkalven, is een β 1’-6 verbonden disaccharide of glucosamine dat geacyleerd is
met R-3-hydroxylaureaat of –myristaat op posities O-2, O-3, O-2’ en O-3’, en gefosforyleerd is op
posities 1 en 4’. De drie hydroxylgroepen van de verzadigde vetzuren zijn op hun beurt verder
geacyleerd met laurinezuur, myristinezuur of palmitinezuur (Raetz, 1990). Bij deacylatie van deze
gekoppelde verzadigde vetzuren, verliest het lipidA zijn endotoxische werking, waaruit blijkt dat deze
vetzuren een belangrijke rol spelen in de herkenning en activatie van de TLR-4 (Lee et al., 2001). Uit
het onderzoek van Lee et al. (2001) blijken laurinezuur (C12:0) en palmitinezuur (C16:0) de meest
potente inductoren te zijn van de expressie van COX-2 door muizenmacrofagen (RAW 264.7 cellijn).
De inductie van dit enzyme die een rol speelt bij de productie van prostanoïden, gebeurt via activatie
van het NFКB na activatie van de TLR-4 of hiermee geassocieerde moleculen (Lee et al., 2001).
Meerdere andere studies toonden reeds de activatie van de TLR-4 pathway aan door verzadigde
vetzuren zoals palmitinezuur en stearinezuur (Shi et al., 2006; Nguyen et al., 2007; Maloney et al.,
2009). Deze onderzoeken werden uitgevoerd op 293T cellen (embryonale nier) (Lee et al., 2004; Shi
et al., 2006), RAW264.7 cellen (Lee et al., 2001; Shi et al., 2006; Nguyen et al., 2007), 3T3-L1
19
adipocyten (Shi et al., 2006) en humane endotheelcellen (Maloney et al., 2009). Zowel de IKKβ- als de
JNK pathway wordt hierbij geactiveerd (Lee et al., 2001; Shi et al., 2006; Nguyen et al., 2007; Shankar
et al., 2011).
Analoog aan de TLR-4, die lipopolysacchariden herkent als onderdeel van de celwand van Gram-
kiemen, wordt de TLR-2 geactiveerd door triacyl-lipopeptiden (Gram- bacteriën) en diacyl-lipopeptiden
(Gram+ bacteriën en Mycoplasma) via dimerisatie met de TLR-1, respectievelijk de TLR-6 (Turner et
al., 2014). Deze pathways kunnen eveneens geactiveerd worden door verzadigde vetzuren met
productie van pro-inflammatoire cytokines en chemokines tot gevolg (Lee et al., 2004; Nguyen et al.,
2007; Figuur 8). Deze pattern recognition receptoren worden onder meer door de epitheelcellen en de
stromacellen ter hoogte van de uterus tot expressie gebracht (Herath et al., 2009; Turner et al., 2012;
Turner et al., 2014). Hoewel de Toll-like receptoren heel geconserveerde moleculen zijn, vertoont het
extracellulaire domein een duideijke divergentie tussen species wat een weerspiegeling is van de
betrokkenheid bij herkenning van PAMPs van meerdere microbiële organismen (Figuur 9). Het
behoud van het genoom bedraagt voor TLR-1, TLR-2 en TLR-6 tussen Bos taurus en Mus musculus
slechts 75% tot 78% en tussen B. taurus en Homo sapiens 84% tot 88% (Turner et al., 2014). Wat de
TLR-4 betreft, vertoont de nucleotidensequentie van B. taurus 65,2% en 76,3% gelijkenis met dit van
M. musculus, respectievelijk H. sapiens (Asahina et al., 2003). De aminozuursequentie van B. taurus
vertoont een gelijkenis van 65% (Werling en Jungi, 2003) - 72,5% (Asahina et al., 2003) en 72%
(Werling en Jungi, 2003) - 79,9% (Asahina et al., 2003) met de sequentie van M. musculus en H.
sapiens.
Fig. 9. Fylogenetische verwantschap van de extracellulaire domeinen van de TLRs bij zoogdieren. De
lengtes van de verschillende aftakkingen stellen de graad van afwijking voor tussen de verschillende
species. De pijlen geven aftakkingen van Bos taurus en Mus musculus weer. De TLR-1/6/10 familie is
omcirkeld (uit Werling et al., 2009).
20
Mutaties die zich bevinden ter hoogte van het extracellulair domein van de receptor, dat gekenmerkt
wordt door leucine-rijke herhalingen (LRR; leucine-rich repeat), kunnen reeds de specificiteit of de
affiniteit van de receptor-ligand binding aantasten (Smirnova et al., 2000). Polymorfisme in de Toll-like
receptor genen binnen eenzelfde species en tussen species onderling, wordt geassocieerd met een
verschillende reactie op lipopolysacchariden van verschillende microbiële bronnen en met een
predispositie voor een aantal ziekten (Werling et al., 2009). Een verschil in reactie is niet beperkt tot
enkel de lipopolysacchariden, zo is er geen reactie van zowel de boviene als de equine TLR-4 op
taxol, een ligand van de muriene TLR-4 (Lizundia et al., 2008).
3.2. VERBAND MET CONDITIE ROND DE PARTUS
De body conditiescore van dieren in de transitieperiode wordt door meerdere onderzoeksgroepen in
verband gebracht met het voorkomen van pathologieën na de partus. Naar analogie met het metabool
syndroom bij de mens, zouden vettere dieren zich in een zogenaamde pro-inflammatoire staat
bevinden. In tijden van een positieve energiebalans zoals in de droogstand, gaan de vetreserves
aangevuld worden. Overmatige vervetting moet men echter voorkomen. De invloed op de DSO met
het doormaken van een diepere NEB waarbij een grotere hoeveelheid aan NEFA’s in de circulatie
komt, werd reeds besproken (zie 1.2.3.). Daarnaast leidt overmatige vervetting tot een zogenaamde
pro-inflammatoire toestand (De Koster en Opsomer, 2012).
Vetcellen die hypertrofisch worden ten gevolge van triglyceridenstapeling, gaan het chemokine MCP-
1, het monocyt chemotactisch proteïne 1, vrijstellen. Dat chemokine induceert de infiltratie van
macrofagen in het vetweefsel die vervolgens geactiveerd worden met productie van pro-inflammatoire
cytokines waaronder TNFα en IL-6 (Gustafson et al., 2007; Nguyen et al., 2007; Hirai et al., 2010;
Figuur 10). Het TNFα interfereert onder meer met de insulinesignalisatie, waarbij het via het kinase
JNK serinefosforylatie van proteïnen zoals het insuline receptor substraat-1 (IRS-1) induceert. De
inhibitie van de signalisatie leidt tot een toestand van verhoogde insulineresistentie, onvoldoende
remming van de lipolyse en verhoogde vrijstelling van NEFA’s (Csehi et al., 2005). Deze vetzuren
kunnen op hun beurt de Toll-like receptoren activeren met opnieuw productie en vrijstelling van pro-
inflammatoire cytokines (zie 3.2.2.). Op deze manier wordt een vicieuze cirkel gecreëerd, resulterend
in een algemene pro-inflammatoire toestand en insulineresistentie.
21
Fig. 10. Wanneer vetweefsel ‘obees’ wordt, gaan macrofagen infiltreren. Het vetweefsel gaat meer
inflammatoire adipokines en NEFA’s vrijstellen, terwijl de secretie van anti-inflammatoire adipokines
afneemt (naar Hirai et al., 2010; De Koster en Opsomer, 2012).
4. ENDOMETRIUMEXPLANTEN VERSUS CELCULTUREN
Bij het gebruik van celculturen kunnen studieresultaten beïnvloed worden, enerzijds door verstoring
van de weefselarchitectuur en anderzijds door de vrijstelling van zogenaamde damage-associated
molecular patterns (DAMPs).
Het behouden van de weefselarchitectuur is belangrijk voor paracriene, autocriene en endocriene cel-
cel en cel-matrix interacties. Deze interacties zijn onderdeel van de normale fysiologie en hangen af
van de architectuur en de positie van de cellen ten opzichte van elkaar (Vogel en Sheetz, 2006). Het
produceren van in vitro celculturen resulteert echter wel in een verstoring van de normale
weefselarchitectuur. Bovendien worden hierbij de cellen ontkoppeld van matrixinvloeden terwijl
extracellulaire matrixcomponenten wel essentieel zijn voor de differentiatie en functie van de epitheel-
en stromacellen. Een alternatief om het probleem van deze cel-matrixinteracties weg te werken, is het
gebruik van endometriumexplanten, wat ook reeds ontwikkeld werd bij rundvee (Herath et al., 2006).
Bij deze studie van Herath et al. (2006) werden explanten gecreëerd van 1 mm3 met behulp van een
hakmachine. Het maken van dergelijke kleine explanten heeft tot doel de perfusie van voedingsstoffen
en zuurstof te promoten, maar tevens wordt hierbij de architectuur verstoord.
Naast het probleem met de verstoring van de weefselarchitectuur, is er mogelijks een vrijstelling van
damage-associated molecular patterns (DAMPs) (Chen en Nuñez, 2010). Ten gevolge van trauma
gaan de cellen deze endogene moleculen vrijstellen die vervolgens door het immuunsysteem herkend
worden. Gezien de reactie eveneens leidt tot de productie van cytokines en chemokines en het
aantrekken van ontstekingscellen, wordt gedacht dat ze dezelfde receptoren en pathways activeren
als de PAMPs. De hypothese achter ons onderzoek verwijst naar de mogelijke activatie van de
inflammatoire pathway door de vetzuren zoals na binding van bacteriële componenten (PAMPs) aan
22
de PRRs. Analoog hieraan zouden de DAMPs de ontstekingscascade dus in gang zetten met een
steriele inflammatie tot gevolg. In dit geval kan er dus confounding optreden, waarbij men geen
onderscheid kan maken tussen de etiologie van de geproduceerde ontstekingsmediatoren.
Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van een ex vivo model van intact endometriumweefsel als explant
door Borges et al. (2012). Voor onderzoek naar de aangeboren immuniteit en ontsteking bij
postpartum koeien, maakt men gebruik van uteri in stadium I van de oestruscyclus. Hierbij worden
lage basale progesteron- en oestrogeenspiegels waargenomen zoals bij koeien na de partus
(Kornmatitsuk et al., 2004). Ireland et al. (1980) stelden vast dat de bepaling van het cyclusstadium
betrouwbaar kan op basis van uitwendige aspecten van het ovarium en transsectie van de ovariële
structuren waarbij voornamelijk het corpus luteum van belang is (Tabel 3). De correlatie tussen de
geschatte en de werkelijke dag van de oestruscyclus was hierbij 0,81 (P < 0,01). Het bepalen van
progesteronconcentraties wordt zo vervangen door visuele aspecten zodat men kan gebruikmaken
van slachthuispreparaten.
Tabel 3. Classificatie van de corpora lutea gedurende de oestuscyclus bij vaarzen (uit Ireland et al.
1980).
Stadia van oestruscyclus
Kenmerken I (d 1-4) II (d 5-10) III (d 11-17) IV (d 18-20)
Corpus luteum
Uitwendig rood, recent
geövuleerd,
ovulatieplaats niet
bedekt met epitheel
ovulatieplaats
bedekt met epitheel,
apex van corpus
luteum rood of bruin
tan of oranje lichtgeel tot wit
Inwendig rood, af en toe met
bloed gevuld, cellen
losjes
georganiseerd
rood of bruin ter
hoogte van de
apex, voor de rest
oranje
oranje oranje tot geel
Diameter 0,5 – 1,5 cm 1,6 – 2 cm 1,6 - 2 cm <1 cm
Vaatstelstel ter
hoogte van het
oppervlak van het
corpus luteum
niet zichtbaar algemeen beperkt
tot de periferie
cfr. stadium II, maar
uiteindelijk raakt
ook de apex laat in
dit stadium bedekt
niet zichtbaar
Follikels >10 mm
in diameter
afwezig aanwezig aan- of afwezig aanwezig
23
ONDERZOEK
1. HYPOTHESE
De bevinding dat verschillende vetzuren via de Toll-like receptoren de inflammatoire cascade kunnen
in gang zetten, in combinatie met de link naar het metabool syndroom bij de mens, kan leiden tot de
volgende hypothese: ‘Chronische endometritis bij melkvee is een gevolg van de NEB en de
zogenaamde pro-inflammatoire staat waarbij de circulerende NEFA’s de inflammatoire pathway ter
hoogte van de uterus activeren’. Deze hypothese kan ook een verklaring geven voor de stelling van
Sheldon et al. (2006) dat het persisteren van de inflammatie ter hoogte van het endometrium in de
afwezigheid van bacteriën, een karakteristiek zou zijn van subklinische endometritis.
Belangrijke opmerking hierbij is dat de bevindingen door de meeste onderzoeksgroepen het resultaat
zijn van onderzoek op muriene en humane cellen. Deze gegevens kan men dan ook niet zonder meer
extrapoleren naar andere species waaronder het rund. Ze zijn wel de basis voor het uitvoeren van
dergelijke onderzoeken bij deze diersoort.
2. MATERIAAL EN METHODEN
2.1. COLLECTIE UTERUSEXPLANTEN
Alle chemische producten en media werden aangekocht bij Sigma (Bornem, België), tenzij anders
vermeld.
De procedure voor het maken van de uterusexplanten werd eerder beschreven door Borges et al.
(2012). Verscheidene uteri werden in het slachthuis beoordeeld, waarbij uteri in stadium I van de
oestruscyclus verzameld werden (Tabel 3). Ze werden bewaard in gecrusht ijs tot ze verder konden
bewerkt worden in het labo. Na het wassen van de uitwendige oppervlakken met 70% alcohol, werden
2 swabs genomen van de uterushoorn ipsilateraal van het ovarium waar recent een ovulatie
plaatsvond. Na een snelle kleuring (Diff-Quick) van de uitstrijkjes werd de cytologie gecontroleerd om
een reeds aanwezige inflammatie uit te sluiten. Bij afwezigheid van een ontstekingsbeeld, gekenmerkt
door minder dan 3% polymorfonucleaire cellen op cytologie, werd deze uterushoorn inwendig
gespoeld met Dulbecco’s phosphate-buffered saline solution (D-PBS). Na het longitudinaal openen
van de uterushoorn, werd het blootgestelde endometrium opnieuw gewassen met Dulbecco’s
phosphate-buffered saline solution (D-PBS), aangevuld met 50 IU/ml penicilline, 50 µg/ml
streptomycine en 2,5 µg/ml amphotericine B. Met behulp van steriele biopsie punches (8 mm
diameter) (Stiefel Laboratories Ltd, High Wycome, UK) werden full-thickness explanten gecollecteerd
ter hoogte van het intercarunculair weefsel, waarna deze onmiddellijk werden overgebracht in Hank’s
balanced salt solution (HBSS) waaraan 50 IU/ml penicilline, 50 µg/ml streptomycine en 2,5 µg/ml
amphotericine B werd toegevoegd. Na 5 minuten werden ze nog tweemaal gewassen in dit medium.
2.2. INCUBATIE EN VERDERE COLLECTIE
Onder steriele condities (klasse II biologisch veiligheidskabinet) werden de explanten overgebracht in
12-well weefselcultuur platen. Elke well werd gevuld met 3,0 ml compleet medium (Roswell Park
24
Memorial Institute medium (RPMI 1640)), gesupplementeerd met 10% hitte-geïnactiveerd,
endotoxinevrij foetaal bovien serum (Sigma, Bornem, België), 50 IU/ml penicilline, 50 µg/ml
streptomycine en 2,5 µg/ml amphotericine B. Vervolgens werd per well een explant toegevoegd met
de endometriale zijde aan het oppervlak waarna de explanten voor 30 minuten geïncubeerd werden in
een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 bij 37°C. Na deze rustperiode van 30 minuten werden
ethanol 99%, NEFA-oplossingen en LPS toegevoegd aan het cultuurmedium volgens een
verschillende studieopzet. Palmitinezuur (PA, C16:0), stearinezuur (SA, C18:0) en oliezuur (OA, cis
C18:1n9c) werden hierbij opgelost in pure ethanol (Vel/Merck Eurolab, Zaventem, België).
Rukkwamsuk et al. (2000) en Leroy et al. (2005) deden reeds onderzoek in vivo naar welke NEFA’s
tijdens de negatieve energiebalans in de circulatie terechtkomen en aan welke concentraties.
Palmitinezuur, stearinezuur en oliezuur bleken hierbij de belangrijkste te zijn.
In de eerste studieopzet werd een kinetiekstudie uitgevoerd waarbij PA, SA en OA aan de explanten
afzonderlijk en gecombineerd werden toegevoegd aan de maximale serumconcentraties die tijdens de
NEB werden teruggevonden door Rukkwamsuk et al. (2000) en Leroy et al. (2005) (Tabel 4).
Daarnaast werden eveneens explanten geïncubeerd met pure ethanol (vehikel controle) en werden
explanten ongemoeid gelaten (negatieve controle) (Tabel 4). Staalname gebeurde op tijd (t) = 0 – 1,5
– 3 – 6 – 12 – 24 – 48 – 72 h. Van elke reeks werden telkens 2 explanten per tijdstip gecollecteerd
(snap-freezing in vloeibare stikstof met overbrenging naar -80°C na minimum 3 h). De tijdstippen zijn
gebaseerd op een kinetiekstudie van Swangchan-Uthai et al. (2012) die aantoonden dat expressie na
1 uur incubatie van endometriumcellen met lipopolysacchariden reeds leidde tot een verhoogde
expressie van TNFα, gevolgd door toegenomen expressie van IL-1B na 6 uren incubatie. Deze
onderzoeksgroep werkte met celculturen die bovendien enkel met lipopolysacchariden werden
geïncubeerd. Onze eerste studieopzet was dan ook meteen bedoeld als een kinetiekstudie. Voor
histologie (hematoxyline-eosinekleuring) werden stalen op formaldehyde 4% verzameld op t = 48 – 72
h en eveneens op t = 0 – 24 h voor de negatieve controlegroep.
Wegens de afwezigheid van significante verschillen tussen de verschillende groepen, werd besloten
een tweede studieopzet op te starten waarbij eveneens explanten zouden geïncubeerd worden met
lipopolysacchariden als positieve controle. In de tweede studieopzet werd gekozen voor de
gecombineerde toevoeging van PA, SA en OA aan een concentratie gelijk aan tweemaal en tienmaal
de fysiologische serumconcentraties (Rukkwamsuk et al., 2000; Leroy et al., 2005; Tabel 4). Naast
incubatie met NEFA-oplossingen, werden ook explanten met Standard LPS van E. coli K12
(InvitrogenTM
, Gent, België) geïncubeerd als positieve controle en met ethanol 99% als vehikel
controle. Eveneens werden biopten gehouden in zuiver medium als negatieve controle (Tabel 4).
Staalname gebeurde op dezelfde wijze als bij de eerste studieopzet op t = 0 – 6 – 12 – 24 h. Op al
deze tijdstippen werden eveneens stalen op formaldehyde 4% gecollecteerd voor histologie.
25
Tabel 4. Overzicht per studieopzet van de verschillende incubatiegroepen met bijhorende tijdstippen
(u) van collectie voor snap-freezing gevolgd door overbrenging naar -80°C na minimum 3 h.
Tijdstip (u)
Studieopzet 1
0 Medium
1,5 Medium
(negatieve
controle)
Medium +
ethanol
99%
(1,76%)
(vehikel
controle)
Medium +
SA (0,276
mmol/l)
Medium +
PA (0,264
mmol/l)
Medium +
OA (0,42
mmol/l)
Medium +
SA (0,276
mmol/l) +
PA (0,264
mmol/l) +
OA (0,42
mmol/l)
3 Medium
(negatieve
controle)
Medium +
ethanol
99%
(1,76%)
(vehikel
controle)
Medium +
SA (0,276
mmol/l)
Medium +
PA (0,264
mmol/l)
Medium +
OA (0,42
mmol/l)
Medium +
SA (0,276
mmol/l) +
PA (0,264
mmol/l) +
OA (0,42
mmol/l)
6 Medium
(negatieve
controle)
Medium +
ethanol
99%
(1,76%)
(vehikel
controle)
Medium +
SA (0,276
mmol/l)
Medium +
PA (0,264
mmol/l)
Medium +
OA (0,42
mmol/l)
Medium +
SA (0,276
mmol/l) +
PA (0,264
mmol/l) +
OA (0,42
mmol/l)
12 Medium
(negatieve
controle)
Medium +
ethanol
99%
(1,76%)
(vehikel
controle)
Medium +
SA (0,276
mmol/l)
Medium +
PA (0,264
mmol/l)
Medium +
OA (0,42
mmol/l)
Medium +
SA (0,276
mmol/l) +
PA (0,264
mmol/l) +
OA (0,42
mmol/l)
24 Medium
(negatieve
controle)
Medium +
ethanol
99%
(1,76%)
(vehikel
controle)
Medium +
SA (0,276
mmol/l)
Medium +
PA (0,264
mmol/l)
Medium +
OA (0,42
mmol/l)
Medium +
SA (0,276
mmol/l) +
PA (0,264
mmol/l) +
OA (0,42
mmol/l)
48 Medium
(negatieve
controle)
Medium +
ethanol
99%
(1,76%)
(vehikel
controle)
Medium +
SA (0,276
mmol/l)
Medium +
PA (0,264
mmol/l)
Medium +
OA (0,42
mmol/l)
Medium +
SA (0,276
mmol/l) +
PA (0,264
mmol/l) +
OA (0,42
mmol/l)
72 Medium
(negatieve
controle)
Medium +
ethanol
99%
(1,76%)
(vehikel
controle)
Medium +
SA (0,276
mmol/l)
Medium +
PA (0,264
mmol/l)
Medium +
OA (0,42
mmol/l)
Medium +
SA (0,276
mmol/l) +
PA (0,264
mmol/l) +
OA (0,42
mmol/l)
26
Tijdstip (u)
Studieopzet 2
0 Medium
(negatieve
controle)
Medium +
ethanol
99%
(1,76%)
(vehikel
controle)
Medium +
SA (0,552
mmol/l) +
PA (0,528
mmol/l) +
OA (0,84
mmol/l)
Medium +
SA (2,76
mmol/l) +
PA (2,64
mmol/l) +
OA (4,2
mmol/l)
Medium +
LPS (1
mg/l)
(positieve
controle)
6 Medium
(negatieve
controle)
Medium +
ethanol
99%
(1,76%)
(vehikel
controle)
Medium +
SA (0,552
mmol/l) +
PA (0,528
mmol/l) +
OA (0,84
mmol/l)
Medium +
SA (2,76
mmol/l) +
PA (2,64
mmol/l) +
OA (4,2
mmol/l)
Medium +
LPS (1
mg/l)
(positieve
controle)
12 Medium
(negatieve
controle)
Medium +
ethanol
99%
(1,76%)
(vehikel
controle)
Medium +
SA (0,552
mmol/l) +
PA (0,528
mmol/l) +
OA (0,84
mmol/l)
Medium +
SA (2,76
mmol/l) +
PA (2,64
mmol/l) +
OA (4,2
mmol/l)
Medium +
LPS (1
mg/l)
(positieve
controle)
24 Medium
(negatieve
controle)
Medium +
ethanol
99%
(1,76%)
(vehikel
controle)
Medium +
SA (0,552
mmol/l) +
PA (0,528
mmol/l) +
OA (0,84
mmol/l)
Medium +
SA (2,76
mmol/l) +
PA (2,64
mmol/l) +
OA (4,2
mmol/l)
Medium +
LPS (1
mg/l)
(positieve
controle)
2.3. RNA-EXTRACTIE EN REVERSE TRANSCRIPTION
Totaal RNA werd geëxtraheerd door middel van een combinatie van de Trizolmethode met de
RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Benelux B.V., Venlo, Nederland). Na crushen van de stalen, werd in een
eerste fase de methode toegepast met Trizol® (InvitrogenTM
, Gent, België). Het gecrushte staal werd
in 1,5 ml Trizol gebracht en gehomogeniseerd met behulp van een hand-held homogenizer. Verdere
isolatie gebeurde met behulp van choloroform en 100% isopropanol. De bekomen pellets werden
hierna tweemaal gewassen met 70% ethanol waarna ze geresuspendeerd werden in RNase-vrij
water. Voor verdere RNA-extractie werd gebruikgemaakt van de RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Benelux
B.V., Venlo, Nederland) volgens de instructies van de fabrikant. Bepaling van de concentratie en de
zuiverheid van het geëxtraheerde RNA werd uitgevoerd gebruikmakende van een NanoDrop® (ND-
1000 Spectrophotometer, NanoDrop Technologies Inc, Delaware, USA). Alle stalen hadden een
A260/280 absorbantieratio tussen 1,9 en 2,1. De integriteit van het RNA werd vervolgens voor alle stalen
bepaald met behulp van ExperionTM
RNA StdSens Analysis Kit (Bio-Rad, Bio-Rad Laboratories, Inc.,
Life Science Group Belgium) en gekwantificeerd door middel van een RNA Quality Index (RQI) op een
schaal van 1 (sterke fragmentatie van het RNA) tot 10 (intact RNA). Voor de interpretatie wordt
gewerkt met 3 categorieën: tussen 7 en 10 is er een aanvaardbare kwaliteit, tussen 4 en 6 is de
27
kwaliteit mogelijk nog aanvaardbaar en tussen 1 en 3 is de kwaliteit onvoldoende. In het onderzoek
hadden alle stalen een RNA Quality Index (RQI) hoger dan 7,4 (Figuur 11).
Na kwantificatie en kwalificatie, werd het RNA van alle stalen tot een concentratie van 250 ng/µl
gebracht en bewaard bij -80°C tot verder gebruik. Op basis van het geëxtraheerde RNA werd
vervolgens complementair DNA (cDNA) aangemaakt met behulp van een iScriptTM
cDNA Synthesis
Kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Life Science Group Belgium) volgens de richtlijnen van de fabrikant.
Dit cDNA werd dan als template gebruikt voor de polymerase chain reaction (PCR).
Fig. 11. Voorbeeld van een RNA-scheiding met behulp van Experion waarbij een ladder en 12 stalen
worden geanalyseerd. Op de klassieke gelelektroforese (Boven) zijn er telkens twee banden duidelijk
zichtbaar (aangeduid met een zwart kader). Deze twee banden zijn afkomstig van de 18S ribosomale
eenheid en van de 28S ribosomale eenheid. Per staal wordt eveneens een grafiek weergegeven met
op de x-as de tijd die het RNA-fragment nodig heeft om een bepaalde afstand af te leggen en op de y-
as de fluorescentie (Midden – ladder; Onder – staal). Deze fluorescentie is een maat voor de
concentratie van het RNA waarbij er een rechtevenredig verband bestaat tussen beide. De
verschillende pieken op de grafiek geven dus verhoudingsgewijs de concentratie weer van de RNA-
fragmenten met verschillende grootte.
28
2.4. KWANTITATIEVE REAL-TIME PCR
Voor de kwantitatieve Real-Time PCR werden primersequenties ontwikkeld met PrimerBlast (Tabel 5).
ACTB, GAPDH, RPS29 en SDHA zijn de vier huishoudgenen die werden getest waarbij ACTB en
SDHA de grootste stabiliteit vertoonden in de uterusexplanten en bijgevolg werden weerhouden als
referentiegenen. Standaarden voor qPCR werden gemaakt volgens een verdunningsreeks van een
pool van alle stalen cDNA. Alle stalen werden per onderzocht gen in eenzelfde 96-wellplaat geladen
om variabiliteit te reduceren en onderlinge vergelijking van de stalen mogelijk te maken. In de tweede
studieopzet werd elk staal in duplo geladen als technische replicaten. Een zogenaamde no-template
control (NTC) met nuclease-vrij water werd ook in tweevoud opgenomen in elke analyse. De PCR
werd uitgevoerd op reactiemengsels bestaande uit SYBR® Green PCR Master Mix (10 µl), RNase-vrij
water (6 µl), 2 µl cDNA en 1 µl van 10 µM forward en reverse primer. Amplificatiecycli werden
uitgevoerd op een StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) onder volgende
condities: 95°C gedurende 20 seconden gevolgd door 40 cycli bij 95°C gedurende 5 seconden,
waarna op annealingtemperatuur (Tabel 5) voor 30 seconden en 95°C gedurende 15 seconden. Een
smeltcurve-analyse werd uitgevoerd op het einde van de reactie om de specificiteit van de primers te
verzekeren. Kwantificatie van de genexpressie werd uitgevoerd met behulp van de delta-Ct methode
waarbij de Q-waarde werd berekend als met ΔCt gelijk aan de laagste Ct waarde
van de reeks verminderd met de Ct waarde van het onderzochte staal. De Ct waarde (Cycle treshold)
geeft hierbij het aantal cycli weer waarna het signaal wordt gedetecteerd. Hoe lager de Ct waarde,
hoe groter de hoeveelheid doelwitnucleïnezuren die in het staal aanwezig is. De efficiëntie wordt
bepaald op basis van de standaardcurve die gebaseerd is op een verdunningsreeks met gekende
templateconcentraties. Uit de Q-waarde wordt de genormaliseerde Q-waarde (Norm Q) berekend met
normalisatiefactoren die bepaald worden aan de hand van de expressie van de huishoudgenen.
Tabel 5. Gentranscripten, primersequenties en annealingtemperatuur gebruikt voor de real-time PCR.
Gen Primersequentie Annealingtemperatuur (°C)
ACTB For 5’-GACATCCGCAAGGACCTCTA-3’
Rev 5’-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’
60
IL-1A For 5’-GCCCAGATCAGCACATTACA-3’
Rev 5’-TTCACTGCCTCCTCCAGATT-3’
60
IL-1B For 5’-AAGGCTCTCCACCTCCTCTC-3’
Rev 5’-TTTGGGGTCTACTTCCTCCA-3’
60
IL-6 For 5’-TCCTTGCTGCTTTCACACTC-3’
Rev 5’-CACCCCAGGCAGACTACTTC -3’
60
IL-8 For 5’-GTTGCTCTCTTGGCAGCTTT-3’
Rev 5’-GGTGGAAAGGTGTGGAATGT-3’
60
IL-10 For 5’-TGTATCCACTTGCCAACCAG-3’
Rev 5’-CAGCAGAGACTGGGTCAACA-3’
60
29
SDHA For 5’-ACATGCAGAAGTCGATGCAG-3’
Rev 5’-GGTCTCCACCAGGTCAGTGT-3’
60
TNFα For 5’-GCCCTCTGGTTCAGACACTC-3’
Rev 5’-AGATGAGGTAAAGCCCGTCA-3’
60
2.5. STATISTISCHE ANALYSE
Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van IBM SPSS Statistics 22. Two-way ANOVA
analyse werd gebruikt om het effect te testen van de incubatiegroep en het tijdstip als categorische
fixed factors en het explant als categorische random factor, op de genormaliseerde Q-waarde. Ook de
interactieterm van de groep met het tijdstip werd in acht genomen. Indien niet significant, werd deze
term niet meegenomen in het model. Bij een significant effect werd het wel opgenomen in het model,
maar konden verder geen Post-Hoc-Analyses uitgevoerd worden omwille van het beperkte aantal
waarnemingen per groep. De beschreven mean differences tussen de verschillende groepen per
tijdstip, werden bekomen door aparte two-way ANOVA analyses toe te passen per tijdstip.
2.6. HISTOLOGIE
De formaldehyde gefixeerde uterusbiopten werden ingebed in paraffine, waarna 5 µm dikke snedes
werden gemaakt. Na deparaffinisatie en rehydratatie werden de biopten gekleurd door middel van de
hematoxyline-eosinekleuring. Bij de microscopische beoordeling werd de vitaliteit van de
epitheelcellen ter hoogte van het endometrium en de kliercellen beoordeeld om apoptose- en/of
necrosegerelateerde expressie van bepaalde genen uit te sluiten en aanwezigheid van voldoende
vitale cellen te garanderen.
3. RESULTATEN
3.1. EFFECT VAN ETHANOL, NEFA’S EN LPS OP DE EXPRESSIE VAN IL-1A, IL-1B, IL-6, IL-8, IL-
10 EN TNFα THV DE UTERUS
Uterusexplanten afkomstig van uteri zonder ontstekingsbeeld op cytologie werden geïncubeerd met
pure ethanol (vehikelcontrole) en NEFA’s, andere werden ongemoeid gelaten als negatieve controle.
Daarenboven werden in de tweede studieopzet ook biopten geïncubeerd met lipopolysacchariden
(positieve controle). De hoeveelheid en kwaliteit van het geëxtraheerde totale RNA werd bepaald met
behulp van NanoDrop® en Experion en voldeed voor verdere analyse (zie 2.3.). De eerste studieopzet
was bedoeld als kinetiekstudie maar hierbij kon geen effect worden waargenomen van toevoeging van
NEFA’s. Opmerkelijk was het verloop van de expressie van de verschillende mediatoren in functie van
de tijd over alle incubatiemedia heen. Hierbij daalde de expressie van IL-10 en IL-6 na 3 tot 6 h, en
steeg de expressie van TNFα na 24 h, van IL-1A en IL-8 vanaf 6 tot 12 h na incubatie en van IL-1B
tussen 6 en 24 h waarna een daling te zien was. Bij het nakijken van de hematoxyline-
eosinekleuringen werd vastgesteld dat er op de coupes van 24 h en later cellen van de uterusklieren
apoptotisch en/of necrotisch werden. Om een beïnvloeding van het cytokineprofiel door apoptose
30
en/of necrose te reduceren, werd de tweede studieopzet beperkt tot 24 h na de incubatie. Daarnaast
werd de positieve controle ingevoerd waarbij explanten met lipopolysachariden van E. coli K12 werden
geïncubeerd om zeker te zijn dat de uterusexplanten effectief nog in staat waren te reageren. De
mRNA expressie, als respons op incubatie met de verschillende groepen (Tabel 4), is in de figuren
weergegeven als de genormaliseerde Q-waarde (Norm Q) (y-as) in functie van de tijd dat de incubatie
plaatsvond (y-as).
In de tabellen is de Post-Hoc-Analyse per groep weergegeven voor elke onderzochte
ontstekingsmediator. Incubatie met LPS leidde tot een significante toename van de mRNA expressie
van IL-1A, IL-8, IL-10 en TNFα ten opzichte van de negatieve controlegroep (medium) (*P < 0,05; **P
< 0,01). Incubatie met de vetzuren leidde niet tot een significante stijging van de expressie van de
genen die coderen voor de onderzochte ontstekingsmediatoren. Ze leidden zelfs tot een significante
daling van de mRNA expressie van IL-1B na 24 h incubatie en van IL-8 na 12 h incubatie (*P < 0,05).
IL-6 vertoonde op geen enkel tijdstip na incubatie een significant groepseffect. Belangrijk is op te
merken dat er significante verschillen zijn tussen de negatieve controle en de vehikelcontrole voor IL-
1B op alle tijdstippen en voor IL-8 op 12 h.
Er werden geen significante verschillen (P > 0,05) in mRNA expressie vastgesteld tussen de 2
biologische replicaten per incubatiegroep voor elk tijdstip (data niet weergegeven).
IL-1A
(I) Groep (J) Groep Mean Difference (I-J)
6u 12u 24u
10FFA 2FFA
eth
LPS
med
-,0026
-,0332
-,5352**
-,0486
-
-
-
-
-,0385
-,0056
-,1848*
-,0381
2FFA 10FFA
eth
LPS
med
,0026
-,0306
-,5326**
-,0461
-
-
-
-
,0385
,0330
-,1462
,0004
eth 10FFA
2FFA
LPS
med
,0332
,0306
-,5020**
-,0155
-
-
-
-
,0056
-,0330
-,1792*
-,0326
LPS 10FFA
2FFA
eth
med
,5352**
,5326**
,5020**
,4865*
-
-
-
-
,1848*
,1462
,1792*
,1466
31
IL-1B
(I) Groep (J) Groep Mean Difference (I-J)
6u 12u 24u
10FFA 2FFA
eth
LPS
med
-
-
-
-
-,0218
,0057
-,1853
-,3460
-,0056
,0114
-,1342*
-,1037*
2FFA 10FFA
eth
LPS
med
-
-
-
-
,0218
,0275
-,1635
-,3242
,0056
,0170
-,1287*
-,0981
eth 10FFA
2FFA
LPS
med
-
-
-
-
-,0057
-,0275
-,1910
-,3517*
-,0114
-,0170
-,1457*
-,1151*
LPS 10FFA
2FFA
eth
med
-
-
-
-
,1853
,1635
,1910
-,1607
,1342*
,1287*
,1457*
,0306
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
0 6 12 24
No
rm Q
Tijd (h) - Groep
IL-1A
Explant 1
Explant 2
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
0 6 12 24
No
rm Q
Tijd (h) - Groep
IL-1B
Explant 1
Explant 2
**
* * *
32
IL-6
(I) Groep (J) Groep Mean Difference (I-J)
6u 12u 24u
10FFA 2FFA
eth
LPS
med
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2FFA 10FFA
eth
LPS
med
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
eth 10FFA
2FFA
LPS
med
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
LPS 10FFA
2FFA
eth
med
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
IL-8
(I) Groep (J) Groep Mean Difference (I-J)
6u 12u 24u
10FFA 2FFA
eth
LPS
med
,0386
-,0696
-,4740*
-,0485
,0621
,0194
-,3943
-,5310*
-
-
-
-
2FFA 10FFA
eth
LPS
med
-,0386
-,1081
-,5126*
-,0871
-,0621
-,0427
-,4564
-,5932*
-
-
-
-
eth 10FFA
2FFA
LPS
med
,0696
,1081
-,4044
,0211
-,0194
,0427
-,4137
-,5505*
-
-
-
-
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
0 6 12 24
No
rm Q
Tijd (h) - Groep
IL-6
Explant 1
Explant 2
33
LPS 10FFA
2FFA
eth
med
,4740*
,5126*
,4044
,4255*
,3943
,4564
,4137
-,1368
-
-
-
-
IL-10
(I) Groep (J) Groep Mean Difference (I-J)
6u 12u 24u
10FFA 2FFA
eth
LPS
med
,0197
,0271
-,4670*
,0109
,0208
,0383
-,2235*
-,1039
,0106
-,0020
-,1169**
-,0300
2FFA 10FFA
eth
LPS
med
-,0197
,0074
-,4867*
-,0088
-,0208
,0175
-,2442*
-,1246
-,0106
-,0126
-,1275**
-,0406
eth 10FFA
2FFA
LPS
med
-,0271
-,0074
-,4941*
-,0162
-,0383
-,0175
-,2618*
-,1421
,0020
,0126
-,1149**
-,0280
LPS 10FFA
2FFA
eth
med
,4670*
,4867*
,4941*
,4779*
,2235*
,2442*
,2618*
,1196
,1169**
,1275**
,1149**
,0869**
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
0 6 12 24
No
rm Q
Tijd (h) - Groep
IL-8
Explant 1
Explant 2
*
* *
*
34
TNFα
(I) Groep (J) Groep Mean Difference (I-J)
6u 12u 24u
10FFA 2FFA
eth
LPS
med
-
-
-
-
,0044
,0119
-,1246**
-,0122
,0029
-,0037
-,0557**
-,0118
2FFA 10FFA
eth
LPS
med
-
-
-
-
-,0044
,0074
-,1290**
-,0166
-,0029
-,0067
-,0586**
-,0148
eth 10FFA
2FFA
LPS
med
-
-
-
-
-,0119
-,0074
-,1364**
-,0240
,0037
,0067
-,0519**
-,0081
LPS 10FFA
2FFA
eth
med
-
-
-
-
,1246**
,1290**
,1364**
,1124**
,0557**
,0586**
,0519**
,0438**
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
0 6 12 24
No
rm Q
Tijd (h) - Groep
IL-10
Explant 1
Explant 2
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
10
FFA
2FF
A
eth
LPS
med
0 6 12 24
No
rm Q
Tijd (h) - Groep
TNFα
Explant 1
Explant 2
**
*
** **
35
3.2. HISTOLOGIE
Staalname voor histologie werd voor de eerste studieopzet uitgevoerd op t = 48 – 72 h en op t = 0 –
24 h voor de negatieve controlegroep. Op de hematoxyline-eosinekleuringen werd de vitaliteit van de
glandulae uterinae beoordeeld op basis van de graad van apoptose en/of necrose. Hierbij werd vanaf
24 h een groot aandeel afstervende cellen vastgesteld (Figuur 12). Bij de tweede studieopzet werd
voor elke incubatiegroep per tijdstip van collectie een staal voor histologie genomen, namelijk op t = 0
– 6 – 12 – 24 h (Figuur 13).
Fig. 12. Hematoxyline-eosinekleuring van coupes afkomstig van uterusexplanten uit de eerste
studieopzet. Apoptose en/of necrose ter hoogte van de uterusklieren is duidelijk zichtbaar vanaf 24 h.
De coupes zijn geïdentificeerd volgens hun incubatiegroep (Med = medium; Eth = ethanol 99%; OA =
oliezuur; PA = palmitinezuur; SA = stearinezuur) en tijdstip (h). Balk = 100 µm.
36
37
Fig. 13. Hematoxyline-eosinekleuring van coupes afkomstig van uterusexplanten uit de tweede
studieopzet. De coupes zijn geïdentificeerd volgens de incubatiegroep (Med = medium; Eth = ethanol
99%; 2 FFA = tweemaal fysiologische concentratie FFA’s; 10 FFA = tienmaal fysiologische
concentratie FFA’s) en tijdstip (h). Balk = 100 µm.
38
BESPREKING
Zowel klinische als subklinische endometritis leidt tot grote economische verliezen in de
melkveehouderij (Goshen en Shpigel, 2006; Chastant-Maillard, 2011). In de pathologie van
endometritis na afkalven speelt E. coli een belangrijke rol, gevolgd door T. pyogenes (Williams et al.,
2007; Herath et al., 2009). Daarnaast zou subklinische endometritis gekarakteriseerd worden door een
persisterende ontstekingsreactie ter hoogte van het endometrium in de afwezigheid van kiemen
(Sheldon et al., 2006). Meerdere bevindingen hebben hierbij geleid tot de hypothese dat de
chronische endometritis bij melkvee een gevolg zou zijn van de NEB en de zogenaamde pro-
inflammatoire staat, waarbij de circulerende NEFA’s de inflammatoire pathway ter hoogte van de
uterus activeren. Het gevolg hiervan is dat er chronisch neutrofielen worden aangetrokken. Dit was
dan ook de hypothese van deze studie.
De lipopolysachariden (LPS) die onderdeel zijn van de celwand van gramnegatieve bacteriën
waaronder E. coli hebben een lipidA gedeelte dat cruciaal is voor de toxische werking van het LPS. Dit
lipidA bevat via acylatie laurinezuur, myristinezuur of palmitinezuur (Raetz, 1990). Deacylatie van deze
gekoppelde vetzuren leidt tot het verlies van de endotoxische werking van het lipidA (Lee et al., 2001).
Palmitinezuur (C16:0) is bovendien een vetzuur die bij hoogproductief melkvee naast stearinezuur
(C18:0) en oliezuur (C18:1n9c) in de hoogste concentraties voorkomt in de circulatie tijdens de NEB.
Daarnaast toonden reeds meerdere onderzoeksgroepen aan dat verzadigde vetzuren zoals
palmitinezuur en stearinezuur de inflammatoire pathway via de TLR-4 kunnen activeren in bepaalde
humane en muriene cellen (Lee et al., 2001; Shi et al., 2006; Nguyen et al., 2007; Maloney et al.,
2009). Deze receptor is samen met TLR-1/2 en TLR-2/6 van belang voor de herkenning van
componenten van de bacteriële wand en deze receptoren worden allen tot expressie gebracht door de
epitheelcellen en de stromacellen ter hoogte van de uterus bij melkkoeien (Herath et al., 2009; Turner
et al., 2012; Turner et al., 2014).
In de hier beschreven in vitro studie werden de drie belangrijkste NEFA’s bij hoogproductieve
melkkoeien (C16:0, C18:0 en C18:1n9c) toegevoegd aan uterusexplanten afkomstig van koeien in
stadium I van de oestruscyclus. In de eerste studieopzet werd geen effect waargenomen. Het
verkregen cytokinebeeld dat voor alle explanten dezelfde trend volgde, in combinatie met de apoptose
en/of necrose van de cellen die gezien werd op de histologische coupes, leidde tot de vraag of de
cellen nog effectief konden reageren en of het cytokinebeeld niet gerelateerd was aan de optredende
celdood. Daarom werd een tweede studieopzet opgestart met lipopolysacchariden als een positieve
controle gezien onderzoek door Swangchan-Uthai et al. (2012) heeft aangetoond dat celculturen
hierop reageren met de expressie van verschillende cytokines. De resultaten van de in vitro studie
tonen geen significante effecten aan met betrekking tot een opregulatie van belangrijke cytokines
zoals na activatie van de TLR-4 door lipopolysacchariden. Verklaringen voor de afwezigheid van een
significant effect bij runderen kunnen gezocht worden op verschillende niveaus.
39
In het protocol van de hier beschreven studie werden NEFA’s zonder meer opgelost in pure ethanol in
tegenstelling tot de methode van Shi et al. (2006) die op cellen van muizen wel een effect vonden,
waarbij palmitaat opgelost werd in 95% ethanol bij 60°C. Daarentegen werkte de onderzoeksgroep
van Leroy et al. (2005) eveneens met vetzuren die zonder opwarmen werden opgelost in pure
ethanol. In dit onderzoek werd een negatief effect vastgesteld van palmitinezuur en stearinezuur op
oöcytmaturatie, fertilizatie en deelsnelheid en blastocystopbrengst. Hieruit zou men kunnen afleiden
dat het oplossen van NEFA’s ook op kamertemperatuur kan doorgaan. In het onderzoek van Lee et al.
(2001) wordt eveneens geen opwarming vermeld bij het oplossen van de vetzuren in ethanol en werd
een duidelijke inductie van de expressie van COX-2 vastgesteld in muriene RAW 264.7 cellen, waarbij
laurinezuur (C12:0) en palmitinezuur (C16:0) meest potent leken. Naast de methode van het oplossen
van de vetzuren in ethanol als vehikel, zou ook de finale ethanolconcentratie in het medium bij
incubatie een rol spelen. Maximumconcentraties voor ethanol in het medium waarbij geen effecten
optreden ter hoogte van de cellen, werden niet teruggevonden. Concentraties hoger dan 1% zouden
eventueel neveneffecten kunnen uitoefenen op celniveau, terwijl de finale concentratie in de
incubatiemedia van ons onderzoek 1,76% was. Niettegenstaande gelijkaardige concentraties reeds in
eerdere studies succesvol werden gebruikt (Leroy et al., 2005; Vanholder et al., 2005), zijn deze
mogelijks te hoog om het specifiek effect ter hoogte van Toll-like receptoren te kunnen aantonen. In
de onderzoeken van Leroy et al. (2005) en Vanholder et al. (2005) werd er immers geen upregulatie
van cytokines nagegaan. Uit biofysische studies in vitro is gebleken dat ethanol als acuut effect de
structuuropstelling van de membraanlipiden verstoort en zo de fluïditeit van de celmembranen
verhoogt (Sun en Sun, 1985). Dat ethanol op zich een effect kan hebben, zou de significante
verschillen tussen de negatieve controle en de vehikelcontrole voor IL-1B op alle tijdstippen en voor
IL-8 op 12 h na incubatie kunnen verklaren.
Om ethanol als eventueel beïvloedende factor te kunnen uitsluiten, kan gebuik gemaakt worden van
andere vehikels zoals onder meer beschreven door Strang et al. (1998). Deze onderzoeksgroep ging
het effect na van langketenige vetzuren op triglyceridenaccumulatie, gluconeogenese en ureagenese
in boviene hepatocyten. In dit onderzoek werd een 88,8 mM NEFA stockoplossing bereid door
vetzuren op te lossen in 0,1 N KOH tot een molaire ratio van 1:1,13 bij 60°C. Deze NEFA en KOH
stock bij 60°C werd geneutraliseerd met 1 N HCl en verdund met H2O tot een finale NEFA-oplossing
van 53,4 mM. Hieruit werden dan de incubatiemedia met verschillende concentraties aan NEFA’s
samengesteld.
Daarenboven werden de vetzuren in het onderzoek van Shi et al. (2006) geconjugeerd met bovien
serum albumine tot een 4:1 molaire ratio. Albumine fungeert in de circulatie als een transporter voor
vetzuren. Albumine-vetzuurcomplexen kunnen binden aan de albuminereceptor ter hoogte van de cel
waarbij de vetzuren meteen tot aan de celmembraan gebracht worden. Vetzuren zoals palmitinezuur
en stearinezuur kunnen zich echter snel verplaatsen doorheen de bilipidenlaag van cellen via
passieve diffusie (McArthur et al., 1999). Of albumine een functie heeft in het in oplossing brengen of
in oplossing houden van de vetzuren bij incubatietechnieken is onduidelijk.
40
Om meer zekerheid te hebben of onze techniek een rol speelt in de negatieve resultaten, zouden we
ons protocol nogmaals moeten optimaliseren in een derde studieopzet. Hierbij zouden we gebruik
moeten maken van hogere concentraties aan vetzuren in de stockoplossingen zodat er kleinere
volumes moeten toegevoegd worden aan het medium. Daarnaast moet het oplossen van de NEFA’s
in de ethanol bij 60°C gebeuren en moet er bovien serum albumine aan de mengsels worden
toegevoegd tot een 4:1 molaire ratio. Eventueel zou de methode van Strang et al. (1998) kunnen
toegepast worden (zie hoger).
Naast deze mogelijke invloeden die betrekking hebben op de uitvoering van het onderzoek, moet men
ook in rekening brengen dat de studies van Lee et al. (2001), Lee et al. (2004), Shi et al. (2006),
Nguyen et al. (2007) en Maloney et al. (2009) op muriene en humane cellen werden uitgevoerd.
Gezien de nucleotiden- en aminozuursequentie van de Toll-like receptoren bij deze species
verschillen vertoont met deze van de Bos taurus (Asahina et al., 2003; Werling en Jungi, 2003; Turner
et al., 2014), kan men geen conclusies uit deze onderzoeken zonder meer extrapoleren naar het rund.
Opmerkelijk is de bevinding van Lizundia et al. (2008) dat taxol de muriene TLR-4 kan binden, terwijl
de boviene en equine TLR-4 hiertegenover resistent zijn. Dit kan leiden tot de bevinding dat NEFA’s
zoals palmitinezuur bij de M. musculus de pathway na binding met TLR-4 wel kunnen activeren terwijl
dit niet zo is bij de B. taurus. Evenals de bevinding van Lee et al. (2001) dat het lipidA van
lipopolysacchariden bij muizen zijn toxische werking verliest bij deacylatie van de geacyleerde
vetzuren. Dit betekent echter niet dat de volledige toxiciteit aan deze vetzuren is toe te schrijven. De
vetzuren kunnen wel voldoende zijn om de TLR-4 in muizenmacrofagen (RAW 264.7) te activeren
(Lee et al., 2001), maar daarom niet per se de boviene TLR-4 die een andere 3D-strucuur en
aminozuuropbouw heeft (Asahina et al., 2003; Werling en Jungi, 2003).
Stel dat het negatieve resultaat van ons onderzoek te wijten is aan de proefopstelling en na
optimalisatie hiervan een positief resultaat wordt bekomen, kunnen meerdere therapeutische en
preventieve maatregelen opgesteld worden met toepassing in de droogstand en de transitieperiode.
De negatieve energiebalans waarbij de NEFA’s vrijgesteld worden in de circulatie, vangt reeds voor de
partus aan door de gedaalde drogestofopname en het ontstaan van een energiedeficit (zie 1.2.; Figuur
4). De samenstelling van het rantsoen en managementfactoren zoals onder andere het aantal
voederplaatsen, rantsoenveranderingen en de duur van de droogstand spelen hierbij een rol. Op de
meeste commerciële bedrijven bevat het droogstandrantsoen 40% of meer NDF. De meeste
transitiekoeien worden dus niet naar hun maximale DSO gevoederd waarbij een hogere opname kan
bewerkstelligd worden door bijvoorbeeld een reductie van het vezelgehalte van 40% naar 30%.
Uiteraard moet het nieuw samengesteld rantsoen nog voldoen aan de haalbare opnamecapaciteit van
de dieren, moet het evenwichtig zijn en moet het rekening houden met de behoeftes van het dier.
Anderzijds moet het rantsoen in de droogstand ook zo opgebouwd zijn dat de melkkoeien niet te vet
worden tegen het moment van afkalven. Obese koeien hebben niet alleen een lagere DSO in het
begin van de lactatie met een diepere NEB tot gevolg (zie 1.2.), maar zouden zich naar analogie met
het metabool syndroom bij de mens in een zogenaamde pro-inflammatoire staat bevinden (zie 3.2).
41
Hypertrofisch vetweefsel stelt pro-inflammatoire cytokines vrij, bevindt zich in een toestand van
verhoogde insulineresistentie en is gevoeliger voor lipolyse met een toegenomen afgifte van NEFA’s
in de circulatie (Figuur 10). Deze NEFA’s zouden vervolgens op hun beurt de inflammatoire pathway
kunnen activeren via de Toll-like receptoren.
De ontstekingsreactie die volgt op activatie van de Toll-like receptoren verloopt via de activatie van
IKKβ en JNK. Inhibitie van deze activatie door ω3-vetzuren werd aangetoond in de monocytencellijn
RAW 264.7 en adipocyten (Oh et al., 2010). Of dit anti-inflammatoir effect via de GPR120 een rol kan
spelen bij runderen, werd nog niet onderzocht. Wel werd er reeds aangetoond dat circulerende
vetzuren in de fosfolipiden van de celmembranen worden ingebouwd (zie 3.1.). Inbouw van ω3-
vetzuren leidt tot een gedeeltelijke vervanging van het arachidonzuur dat als substraat fungeert voor
de productie van de prostaglandines en leukotriënen die overwegend pro-inflammatoire effecten
hebben. Supplementatie met bronnen van ω3-vetzuren zoals visolie zou dus een beschermend effect
kunnen hebben tegen onder meer postpartum uteruspathologieën. Een verbetering van de
vruchtbaarheid is reeds beschreven bij melkvee (Jenkins en Bridges, 2007). Hierbij zorgen de
verhoogde synthese van de serie 3 prostaglandines en de inhibitie van de vorming van PGF2α dat de
regressie van het corpus luteum verhinderd wordt met betere vruchtbaarheidsresultaten tot gevolg.
Belangrijke opmerking hierbij is dat gesupplementeerde vetzuren onder de vorm van beschermde
vetten moeten toegediend worden om biohydrogenatie met verzadiging van de dubbele bindingen in
de pens te voorkomen, dit kan onder andere door incapsulatie van de onverzadigde vetzuren in
microbieel resistente omhulsels, of door verandering van de vetzuurstructuur tot calciumzouten of
vetzuuramiden die niet afgebroken worden door enzymes van microbiële oorsprong (Jenkins en
Bridges, 2007).
42
REFERENTIELIJST
Asahina Y., Yoshioka N., Kano R., Moritomo T., Hasegawa A. (2003). Full-length cDNA cloning of
Toll-like receptor 4 in dogs and cats. Veterinary Immunology and Immunopathology 96, 159-167.
Beam S.W., Butler W.R. (1999). Effects of energy balance on follicular development and first ovulation
in postpartum dairy cows. Journal of Reproduction and Fertility 54, 411-424.
Bell A.W. (1979). Lipid metabolism in liver and selected tissues and in the whole body of ruminant
animals. Progress in Lipid Research 18, 117-164.
Bernabucci U., Ronchi B., Lacetera N., Nardone A. (2005). Influence of body condition score on
relationships between metabolic status and oxidative stress in periparturient dairy cows. Journal of
Dairy Science 88, 2017-2026.
Bertics S.J., Grummer R.R., Cadorniga-Valino C., Stoddard E.E. (1992). Effect of prepartum dry
matter intake on liver triglyceride concentration and early lactation. Journal of Dairy Science 75,
1914–1922.
Bertoni G., Trevisi E., Han X., Bionaz M. (2008). Effects of inflammatory conditions on liver activity in
puerperium period and consequences for performance in dairy cows. Journal of Dairy Science 91,
3300-3310.
Borges Á.M., Healey G.D., Sheldon I.M. (2012). Explants of intact endometrium to model bovine
innate immunity and inflammation ex vivo. American Journal of Reproductive Immunology 67, 526-
539.
Bines J.A., Morant S.V. (1983). The effect of body condition on metabolic changes associated with
intake of food by the cow. British Journal of Nutrition 50, 81-89.
Bossaert P. (2010). The role of insulin in the energy conflict between milk production and ovarian
activity during the transition period of high-yielding dairy cows. Doctoraatsthesis Faculteit
Diergeneeskunde, Gent, p. 17.
Burke C.R., Meier S., McDougall S., Compton C., Mitchell M., Roche J.R. (2010). Relationships
between endometritis and metabolic state during the transition period in pasture-grazed dairy cows.
Journal of Dairy Science 93, 5363-5373.
Butler W.R. (2003). Energy balance relationships with follicular development, ovulation and fertility in
postpartum dairy cows. Livestock Production Science 83, 211-218.
Butler W.R. (2005). Relationships of negative energy balance with fertility. Advances in Dairy
Technology 17, 35-46.
Calder P.C. (2005). Polyunsaturated fatty acids and inflammation. Biochemical Society Transactions
33, 423-427.
Chapwanya A., Meade K.G., Doherty M.L., Callanan J.J., Mee J.F., O’Farrelly C. (2009).
Histopathological and molecular evaluation of Holstein-Friesian cows postpartum: toward an
improved understanding of uterine innate immunity. Theriogenology 71, 1396-1407.
Chapwanya A., Meade K.G., Foley C., Narciandi F., Evans A.C.O., Doherty M.L., Callanan J.J.,
O’Farrelly C. (2012). The postpartum endometrial inflammatory response: a normal physiological
43
event with potential implications for bovine fertility. Reproduction, Fertility and Development 24,
1028-1039.
Chastant-Maillard S. (2011). Speaking about genital inflammation rather than uterine infection.
European Buiatrics Forum, Marseille, 27-32.
Chen G.Y., Nuñez G. (2010). Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nature Reviews
Immunology 10, 826-837.
Contreras G.A., O’Boyle N.J., Herdt T.H., Sordillo L.M. (2010). Lipomobilization in periparturient dairy
cows influences the composition of plasma nonesterified fatty acids and leukocyte phospholipid
fatty acids. Journal of Dairy Science 93, 2508-2516.
Contreras G.A., Sordillo L.M. (2011). Lipid mobilization and inflammatory responses during the
transition period of dairy cows. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 34,
281-289.
Csehi S., Mathieu S., Seifert U., Lange A., Zweyer M., Wernig A., Adam D. (2005). Tumor necrosis
factor (TNF) interferes with insulin signaling through the p55 TNF receptor death domain.
Biochemical and Biophysical Research Communications 329, 397-405.
Czaplicki G., Thiry E. (1998). An association exists between bovine herpesvirus-4 seropositivity and
abortion in cows. Preventive Veterinary Medicine 33, 235-240.
Davies D., Meade K.G., Herath S., Eckersall P.D., Gonzalez D., White J.O., Conlan R.S., O’Farrelly
C., Sheldon I.M. (2008). Toll-like receptor and antimicrobial peptide expression in the bovine
endometrium. Reproductive Biology and Endocrinology 6, 53-64.
De Koster J., Opsomer G. (2012). Are modern dairy cows suffering from modern diseases? Vlaams
Diergeneeskundig tijdschrift 81, 71-80.
Deprez P. (2013). Inwendige ziekten van de grote huisdieren. Cursus Faculteit Diergeneeskunde,
Gent, p. 61-62.
Dewhurst R.J., Moorby J.M., Dhanca M.S., Evens R.T., Fisher W.J. (2000). Effects of altering energy
and protein supply to dairy cows during the dry period. Journal of Dairy Science 83, 1782-1794.
Donofrio G., Herath S., Sartori C., Cavirani S., Flammini C.F., Sheldon I.M. (2007). Bovine herpesvirus
4 is tropic for bovine endometrial cells and modulates endocrine function. Reproduction 134, 183-
197.
Donofrio G., Ravanetti L., Cavirani S., Herath S., Capocefalo A., Sheldon I.M. (2008). Bacterial
infection of endometrial stromal cells influences bovine herpesvirus 4 immediate early gene
activation: a new insight into bacterial and viral interaction for uterine disease. Reproduction 136,
361-366.
Douglas G.N., Rehage J., Beaulieu A.D., Bahaa A.O., Drackley J.K. (2007). Prepartum nutrition alters
fatty acid composition in plasma, adipose tissue, and liver lipids of periparturient dairy cows.
Journal of Dairy Science 90, 2941-2959.
Drackley J.K. (1999). Biology of dairy cows during the transition period: the final frontier? Journal of
Dairy Science 82, 2259-2273.
Dubuc J., Duffield T.F., Leslie K.E., Walton J.S., LeBlanc S.J. (2010). Risk factors for postpartum
uterine diseases in dairy cows. Journal of Dairy Science 93, 5764-5771.
44
Fiorentino D.F., Zlotnik A., Mosmann T.R., Howard M., O’Garra A. (1991). IL-10 inhibits cytokine
production by activated macrophages. The Journal of Immunology 147, 3815-3822.
Fischer C., Drillich M., Odau S., Heuwieser W., Einspanier R., Gabler C. (2010). Selected pro-
inflammatory factor transcripts in bovine endometrial epithelial cells are regulated during the
oestrous cycle and elevated in case of subclinical or clinical endometritis. Reproduction, Fertility
and Development 22, 818-829.
Földi J., Kulcsár M., Pécsi A., Huyghe B., de Sa C., Lohuis J.A.C.M., Cox P., Huszenicza G. (2006).
Bacterial complications of postpartum uterine involution in cattle. Animal Reproduction Science 96,
265-281.
Frajblat M. (2000). Metabolic state and follicular development in the postpartum lactating dairy cow.
Cornell University, 250p. Vermeld in Butler W.R. (2003). Energy balance relationships with follicular
development, ovulation and fertility in postpartum dairy cows. Livestock Production Science 83,
211-218.
Gabler C., Fischer C., Drillich M., Einspanier R., Heuwieser W. (2010). Time-dependent mRNA
expression of selected pro-inflammatory factors in the endometrium of primiparous cows
postpartum. Reproductive Biology and Endocrinology 8, 152-160.
Galvão K.N., Felippe M.J.B., Brittin S.B., Sper R., Fraga M., Galvão J.S., Caixeta L., Guard C.L., Ricci
C.L., Gilbert R.O. (2012). Evaluation of cytokine expression by blood monocytes of lactating
Holstein cows with or without postpartum uterine disease. Theriogenology 77, 356-372.
Galvão K.N., Flaminio M.J.B.F., Brittin S.B., Sper R., Fraga M., Caixeta L., Ricci A., Guard C.L., Butler
W.R., Gilbert R.O. (2010). Association between uterine disease and indicators of neutrophil and
systemic energy status in lactating Holstein cows. Journal of Dairy Science 93, 2926-2937.
Galvão K.N., Santos N.R., Galvão J.S., Gilbert R.O. (2011). Association between endometritis and
endometrial cytokine expression in postpartum Holstein cows. Theriogenology 76, 290-299.
Goff J.P. (2006). Major advances in our understanding of nutritional influences on bovine health.
Journal of Dairy Science 89, 1292-1301.
Goshen T., Shpigel N.Y. (2006). Evaluation of intrauterine antibiotic treatment of clinical metritis and
retained fetal membranes in dairy cows. Theriogenology 66, 2210-2218.
Grant R.J., Albright J.L. (1995). Feeding behavior and management factors during the transition period
in dairy cattle. Journal of Animal Science 73, 2791-2803.
Green D.A., Brink D.R., Bauer M.L. (1994). Characterization of feed intake and estradiol-17β during
gestation and lactation in twin-bearing ewes. Small Ruminant Research 13, 153-158.
Grummer R.R. (1995). Impact of changes in organic nutrient metabolism on feeding the transition
dairy cow. Journal of Animal Science 73, 2820-2833.
Grummer R.R., Mashek D.G., Hayirli A. (2004). Dry matter intake and energy balance in the transition
period. The veterinary clinics of North America. Food animal practice 20, 447 -470.
Gustafson B., Hammarstedt A., Andersson C.X., Smith U. (2007). Inflamed adipose tissue: a culprit
underlying the metabolic syndrome and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular
Biology 27, 2276-2283.
45
Hammon D.S., Evjen I.M., Dhiman T.R., Goff J.P., Walters J.L. (2006). Neutrophil function and energy
status in Holstein cows with uterine health disorders. Veterinary Immunology and
Immunopathology 113, 21-29.
Hayirli A., Grummer R.R., Nordheim E.V., Crump P.M. (2002). Animal and dietary factors affecting
feed intake during the prefresh transition period in Holsteins. Journal of Dairy Science 85, 3430-
3443.
Hayirli A., Grummer R.R., Nordheim E.V., Crump P.M. (2003). Models for predicting dry matter intake
of Holsteins during the prefresh transition period. Journal of Dairy Science 86, 1771-1779.
Herath S., Fischer D.P., Werling D., Williams E.J., Lilly S.T., Dobson H., Bryant C.E., Sheldon I.M.
(2006). Expression and function of Toll-like receptor 4 in the endometrial cells of the uterus.
Endocrinology 147, 562-670.
Herath S., Lilly S.T., Santos N.R., Gilbert R.O., Goetze L., Bryant C.E., White J.O., Cronin J., Sheldon
I.M. (2009). Expression of genes associated with immunity in the endometrium of cattle with
disparate postpartum uterine disease and fertility. Reproductive Biology and Endocrinology 7, 55-
67.
Herdt T.H. (2000). Ruminant adaptation to negative energy balance. Influences on the etiology of
ketosis and fatty liver. The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice 16, 215-230.
Hirai S., Takahashi N., Goto T., Lin S., Uemura T., Yu R., Kawada T. (2010). Functional food
tartgeting the regulation of obesity-induced inflammatory responses and pathologies. Mediators of
inflammation 2010, 367838-367845.
Huzzey J.M., Veira D.M., Weary D.M., von Keyserlingk M.A.G. (2007). Prepartum behavior and dry
matter intake identify dairy cows at risk for metritis. Journal of Dairy Science 90, 3220-3233.
Ingvartsen K.L. (2006). Feeding- and management-related diseases in the transition cow.
Physiological adaptations around calving and strategies to reduce feeding-related diseases. Animal
Feed Science and Technology 126, 175-213.
Ingvartsen K.L., Andersen J.B. (2000). Integration of metabolism and intake regulation: a review
focusing on periparturient animals. Journal of Dairy Science 83, 1573-1597.
Ireland J.J., Murphee R.L., Coulson P.B. (1980). Accuracy of predicting stages of bovine estrous cycle
by gross appearande of the corpus luteum. Journal of Dairy Science 63, 155-160.
Janeway C.A.J., Travers P., Walport M. (1999). Immunobiology: the immune system in health and
disease. 4th Edition. Garland Publishing, New York, p. 289-356.
Janeway C.A.J., Travers P., Walport M., Shlomchik M. (2005). Immunobiology: the immune system in
health and disease. 6th Edition. Garland Science Publishing, New York, p. 203-240.
Jenkins T.C., Bridges W.C. (2007). Protection of fatty acids against ruminal biohydrogenation in cattle.
European Journal of Lipid Science and Technology 109, 778-789.
Jochems A.A.F., Joosten F.W.M.G. (2012). Zakwoordenboek der Geneeskunde. 30ste druk. Reed
Business, Amsterdam, p. 288.
Kaplanski G., Marin V., Montero-Julian F., Mantovani A., Farnarier C. (2003). IL-6: a regulator of the
transition from neutrophil to monocyte recruitment during inflammation. TRENDS in Immunology
24, 25-29.
46
Kaufmann T.B., Drillich M., Tenhagen B.A., Heuwieser W. (2010). Correlations between periparturient
serum concentrations of non-esterified fatty acids, beta-hydroxybutyric acid, bilirubin, and urea and
the occurrence of clinical and subclinical postpartum bovine endometritis. Veterinary Research 6,
47-52.
Kornmatitsuk B., Dahl E., Ropstad E., Beckers J.F., Gustafsson H., Kindahl H. (2004). Endocrine
profiles, haematology and pregnancy outcomes of late pregnant Holstein dairy heifers sired by
bulls giving a high or low incidence of stillbirth. Acta vet. scand. 45, 47-68.
Ksontini R., MacKay S.L.D., Moldawer L.L. (1998). Revisiting the role of tumor necrosis factor α and
the response to surgical injury and inflammation. Archives of Surgery 133, 558-576.
Kumagai Y., Akira S. (2010). Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of
Allergy and Clinical Immunology 125, 985-992.
LeBlanc S.J. (2012). Interactions of metabolism, inflammation, and reproductive tract health in the
postpartum period in dairy cattle. Reproduction in Domestic Animals 47, 18-30.
LeBlanc S.J., Duffield T.F., Leslie K.E., Bateman K.G., Keefe G.P., Walton J.S., Johnson W.H. (2002).
Defining and diagnosing postpartum clinical endometritis and its impact on reproductive
performance of dairy cows. Journal of Dairy Science 85, 2223-2236.
Lee J.Y., Plakidas A., Lee W.H., Heikkinen A., Chanmugam P., Bray G., Hwang D.H. (2003).
Differential modulation of Toll-like receptors by fatty acids: preferential inhibition by n-3
polyunsaturated fatty acids. Journal of Lipid Research 44, 479-486.
Lee J.Y., Sohn K.H., Rhee S.H., Hwang D. (2001). Saturated fatty acids, but not unsaturated fatty
acids, induce the expression of cyclooxygenase-2 mediated through Toll-like receptor 4. The
Journal of Biological Chemistry 276, 16683-16689.
Lee J.Y., Zhao L., Youn H.S., Weatherill A.R., Tapping R., Feng L., Lee W.H., Fitzgerald K.A., Hwang
D.H. (2004). Saturated fatty acid activates but polyunsaturated fatty acid inhibits Tolll-like receptor
2 dimerized with Toll-like receptor 6 or 1. The Journal of Biological Chemistry 279, 16971-16979.
Lefebvre R.C., Stock A.E. (2012). Therapeutic efficiency of antibiotics and prostaglandin F2α in
postpartum dairy cows with clinical endometritis: an evidence-based evaluation. The veterinary
clinics of North America. Food Animal Practice 28, 79-96.
Leroy J.L.M.R., Vanholder T., Mateusen B., Christophe A., Opsomer G., de Kruif A., Genicot G., Van
Soom A. (2005). Non-esterified fatty acids in follicular fluid of dairy cows and their effect on
developmental capacity of bovine oocytes in vitro. Reproduction 130, 485-495.
Lizundia R., Sauter K., Taylor G., Werling D. (2008). Host species-specific usage of the TLR4-LPS
receptor complex. Innate Immunity 14, 223-231.
Lock A.L., Preseault C.L., Dann H.M. (2009). Exploring the potential for using erythrocyte membranes
in the assessment of long-chain polyunsaturated fatty acid status of dairy cows. Ruminant
Physiology: Digestion, Metabolism and Effects of Nutrition on Reproduction and Welfare:
Proceedings of the XIth International Symposium on Ruminant Physiology, 584-586.
Lucy M.C. (2008). Micronutrients and their interaction with liver in supporting fertility in high producing
dairy cows. Division of Animal Sciences University of Missouri-Columbia, 1-11.
47
Machado V.S., de Souza Bicalho M.L., de Souza Meira Junior E.B., Rossi R., Ribeiro B.L., Lima S.,
Santos T., Kussler A., Foditsch C., Ganda E.K., Oikonomou G., Cheong S.H., Gilbert R.O., Bicalho
R.C. (2014). Subcutaneous immunization with inactivated bacterial components and purified
protein of Escherichia coli, Fusobacterium necrophorum and Trueperella pyogenes prevents
puerperal metritis in Holstein dairy cows. PLOS ONE 9, e91734.
Machado V.S., Oikonomou G., Bicalho M.L.S., Knauer W.A., Gilbert R., Bicalho R.C. (2012).
Investigation of postpartum dairy cows’ uterine microbial diversity using metagenomic
pyrosequencing of the 16S rRNA gene. Veterinary Microbiology 159, 460-469.
Maloney E., Sweet I.R., Hockenbery D.M., Pham M., Rizzo N.O., Tateya S., Handa P., Schwartz
M.W., Kim F. (2009). Activation of NF-κB by palmitate in endothelial cells; a key role for NADPH
oxidase-derived superoxide in reponse to TLR4 activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol 29, 1370-
1375.
Marcos E., Mazur A., Cardot P., Rayssiguier Y. (1990). The effect of pregnancy and lactation on
serum lipid and apolipoprotein B and A-I levels in dairy cows. Journal of Animal Physiology and
Animal Nutrition 64, 133-138.
Marquardt J.P., Horst R.L., Jorgensen N.A. (1977). Effect of parity on dry matter intake at parturition in
dairy cattle. Journal of Dairy Science 60, 929-934.
McArthur M.J., Atshaves B.P., Frolov A., Foxworth W.D., Kier A.B., Schroeder F. (1999). Cellular
uptake and intracellular trafficking of long chain fatty acids. Journal of Lipid Research 40, 1371-
1383.
Meyer E. (2010). Biochemie III. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, p. 8-13.
Moe P.W., Tyrrell H.F. (1972). Metabolizable energy requirements of pregnant dairy cows. Journal of
Dairy Science 55, 480-483.
Morrow D.A. (1976). Fat cow syndrome. Journal of Dairy Science 59, 1625-1629.
Muir L.A., Hibbs J.W., Conrad H.R., Smith K.L. (1972). Effect of estrogen and progesterone on feed
intake and hydroxyproline excretion following induced hypocalcemia in dairy cows. Jorunal of Dairy
Science 55, 1613-1620.
Nguyen M.T.A., Favelyukis S., Nguyen A., Reichart D., Scott P.A., Jenn A., Liu-Bryan R., Glass C.K.,
Neels J.G., Olefsky J.M. (2007). A subpopulation of macrophages infiltrates hypertrophic adipose
tissue and is activated by free fatty acids via Toll-like receptors 2 and 4 and JNK-dependent
pathways. The Journal of Biological Chemistry 282, 35279-35292.
Olsson G., Emanuelson M., Wiktorsson H. (1998). Effects of different nutritional levels prepartum on
the subsequent performance of dairy cows. Livestock Production Science 53, 279-290.
Oh D.Y., Talukdar S., Bae E.J., Imamura T., Morinaga H., Fan W., Li P., Lu W.J., Watkins S.M.,
Olefsky J.M. (2010). GPR120 is an omega-3 fatty acid receptor mediating potent anti-inflammatory
and insulin-sensitizing effects. Cell 142, 687-698.
Opsomer G., Coryn M., Deluyker H., de Kruif A. (1998). An analysis of ovarian dysfunction in high
yielding dairy cows after calving based on progesterone profiles. Reproduction in Domestic
Animals 33, 193-204.
48
Peng Y., Wang Y., Hang S., Zhu W. (2013). Microbial diversity in uterus of healthy and metritic
postpartum Holstein dairy cows. Folia Microbiol 58, 593-600.
Raetz C.R.H. (1990). Biochemistry of endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 59, 129-170.
Ruder C.A., Sasser R.G., Williams R.J., Ely J.K., Bull R.C., Butler J.E. (1981). Uterine infections in the
postpartum cow: II. Possible synergistic effect of Fusobacterium necrophorum and
Corynebacterium pyogenes. Theriogenology 15, 573-580.
Rukkwamsuk T., Geelen M.J.H., Kruip T.A.M., Wensing T. (2000). Interrelationship of fatty acid
composition in adipose tissue, serum, and liver of dairy cows during the development of fatty liver
postpartum. Journal of Dairy Science 83, 52-59.
Rukkwamsuk T., Kruip T.A.M., Meijer G.A.L., Wensing T. (1999). Hepatic fatty acid composition in
periparturient dairy cows with fatty liver induced by intake of a high energy diet in the dry period.
Journal of Dairy Science 82, 280-287.
Santos T.M.A., Bicalho R.C. (2012). Diversity and succession of bacterial communities in the uterine
fluid of postpartum metritic, endometritic and healthy dairy cows. PLOS ONE 7, e53048.
Santos T.M.A., Gilbert R.O., Bicalho R.C. (2011). Metagenomic analysis of the uterine bacterial
microbiota in healthy and metritic postpartum dairy cows. Journal of Dairy Science 94, 291-302.
Shankar K., Zhong Y., Kang P., Lau F., Blackburn M.L., Chen J.R., Borengasser S.J., Ronis M.J.J.,
Badger T.M. (2011). Maternal obesity promotes a proinflammatory signature in rat uterus and
blastocyst. Endocrinology 152, 4158-4170.
Sheldon I.M., Cronin J., Goetze L., Donofrio G., Schuberth H.J. (2009a). Defining postpartum uterine
disease and the mechanisms of infection and immunity in the female reproductive tract in cattle.
Biology of Reproduction 81, 1025-1032.
Sheldon I.M., Dobson H. (2004). Postpartum uterine health in cattle. Animal Reproduction Science 82,
295-306.
Sheldon I.M., Lewis G.S., LeBlanc S., Gilbert R.O. (2006). Defining postpartum uterine disease in
cattle. Theriogenology 65, 1516-1530.
Sheldon I.M., Price S.B., Cronin J., Gilbert R.O., Gadsby J.E. (2009b). Mechanisms of infertility
associated with clinical and subclinical endometritis in high producing dairy cattle. Reproduction in
Domestic Animals 44, 1-9.
Shi H., Kokoeva M.V., Inouye K., Tzameli I., Yin H., Flier J.S. (2006). TLR4 links innate immunity and
fatty acid-induced insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation 116, 3015-3025.
Singh J., Murray R.D., Mshelia G., Woldehiwet Z. (2008). The immune status of the bovine uterus
during the peripartum period. The Veterinary Journal 175, 301-309.
Smirnova I., Poltorak A., Chan E.K., McBride C., Beutler B. (2000). Phylogenetic variation and
polymorphism at the Toll-like receptor 4 locus (TLR4). Genome Biology 1, 1-10.
Storch J., McDermott L. (2009). Structural and functional analysis of fatty acid-binding proteins.
Journal of Lipid Research 50, S126-S131.
Strang B.D., Bertics S.J., Grummer R.R., Armentano L.E. (1998). Effect of long-chain fatty acids on
triglyceride accumulation, gluconeogenesis, and ureagenesis in bovine hepatocytes. Journal of
Dairy Science 81, 728-739.
49
Sun G.Y., Sun A.Y. (1985). Ethanol and membrane lipids. Alcoholism: Clinical and Experimental
Research 9, 164-180.
Swangchan-Uthai T., Lavender C.R.M., Cheng Z., Fouladi-Nashta A.A., Wathes D.C. (2012). Time
course of defense mechanisms in bovine endometrium in response to lipopolysaccharide. Biology
of Reproduction 87, 135-148.
Tilleman A. (2014). Endometritis bij melkkoeien: inflammatie in plaats van infectie? Masterproefthesis
Faculteit Diergeneeskunde, Gent, p. 3-20.
Treacher R.J., Reid I.M., Roberts C.J. (1986). Effect of body condition at calving on the health and
performance of dairy cows. Animal Production 43, 1-6.
Turner M.L., Cronin J.G., Healey G.D., Sheldon I.M. (2014). Epithelial and stromal cells of bovine
endometrium have roles in innate immunity and initiate inflammatory responses to bacterial
lipopeptides in vitro via Toll-like receptors TLR2, TLR1, and TLR6. Endocrinology 155, 1453-1465.
Turner M.L., Healey G.D., Sheldon I.M. (2012). Immunity and inflammation in the uterus. Reproduction
in Domestic Animals 47, 402-409.
Vogel V., Sheetz M. (2006). Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews
Molecular Cell Biology 7, 265-275.
Webb R., Garnsworthy P.C., Gong J.G., Robinson R.S., Wathes D.C. (1999). Consequences for
reproductive function of metabolic adaption to load. Anim. Sci. Occas. Publ. 24, 99-112. Vermeld in
Butler W.R. (2003). Energy balance relationships with follicular development, ovulation and fertility
in postpartum dairy cows. Livestock Production Science 83, 211-218.
Werling D., Jann O.C., Offord V., Glass E.J., Coffey T.J. (2009). Variation matters: TLR structure and
species-specific pathogen recognition. Trends in Immunology 30, 124-130.
Werling D., Jungi T.W. (2003). Toll-like receptors linking innate and adaptive immune response.
Veterinary Immunology and Immunopathology 91, 1-12.
Williams E.J., Fischer D.P., Noakes D.E., England G.C.W., Rycroft A., Dobson H., Sheldon I.M.
(2007). The relationship between uterine pathogen growth density and ovarian function in the
postpartum dairy cow. Theriogenology 68, 549-559.
Zurek E., Foxcroft G.R., Kennelly J.J. (1995). Metabolic status and interval to first ovulation in
postpartum dairy cows. Journal of Dairy Science 78, 1909-1920.
