Fragmentocyten -betekenis en standaardisatie

ASO Annelies Fraeyman

02/03/2010

Overzicht

• Aanleiding CAT

• Fragmentatie hemolyse

• Definitie fragmentocyt & bruikbaarheid – Studie OLV

• Detectieprincipes (celteller/flagging, microscopie, …)

• Telling– Studie OLV

• Betekenis fragmentocyten: casussen

• Rondvraag Vlaamse labo’s

• Conclusie

Aanleiding CAT onderzoek

1. Geen consensus over de definitie voor schistocyten- Geen standaardisatie v/d identificatie

2. Geen consensus over telling & rapportering intra- en interindividuele variatie

3. FRC vaak in kleine aantallen aanwezig belangrijke statistische variatie i/d telling

4. Moeilijke standaardisatie v/h beoordelingsgebied in het uitstrijkje

5. Betekenis schistocyten?

Fragmentatie hemolyseHemolytische anemie, Microangiopathische vorm

Fragmentatie van RBC - mechanismen

• Hitte– 49°C in vitro, soms 46°C bij erfelijke vormen van

hemolytische anemie

– brandwonden

• Mechanisch– Mars hemoglobinurie, trombectomie,

cardiopulmonaire bypass, extra-corporele hemodialyse, kunstkleppen, DIC, TTP-HUS, …

• Osmotisch

Mechanische destructie van RBC

1. Vaatwandruptuur → schuifspanning ↑

2. Inflammatie vaatwand → fibrinevorming

Mechanisme fragmentatie

Hoofdzakelijk via “afsnijden” door fibrinedraden (TMA)

Micro-sfero-schistocyten aan uiteinden vh uitstrijkje

Fragmentatie hemolyse = vorm van intravasculaire hemolyse

• Toename vrij Hb in plasma

• Vrij Hb in urine (hemoglobinurie)

• Hemosiderine in urine (hemosiderinurie)

Micro/Macroangiopathische hemolytische anemie

• Mechanische beschadiging van RBC i/d circulatie

→ intravasculaire hemolyse & fragmentocyten

– TTP

– HUS

– DIC → urgenties

– Fu BM-Tx TTP

– (Pre)eclampsie

– maligne hypertensie

– scleroderma renal crisis

– intravasculaire voorwerpen (bv. kunstkleppen,…)

Definitie fragmentocyt

Not “clear cut”!

Definitie?

• Schistocyt “shistos” (Gr.) = “verdeeld, deelbaar, afgescheiden"

“schizein” (Gr.) = “knippen, klieven, scheiden“

gefragmenteerde RBC

• Vaak samen met andere poikylocyten zoals acantocyten, keratocyten, sferocyten en echinocyten (ook geassocieerd met fragmentatie)

Definities

• Dacie & Lewis– Fragmentatie = “conditie” met 3 typen cellen

1. Kleine fragmenten in verschillende vormen soms met scherpe uiteinden of hoeken, soms met ronde contour, meestal diep gekleurd, maar soms bleek (tgv Hb verlies)

2. Grotere cellen: onregelmatige of ronde contour waarvan fragmenten afgesplitst zijn. Hieronder vallen “helmcellen”.

3. Normale ongefragmenteerde volw RBC en reticulocyten

• B.Bain– Fragmenten van RBC gevormd door fragmentatie van

abnormale cellen. Bij mechanische schade vaak coëxistentie met keratocyten. Veel schistocyten zijn puntig.

• Wintrobe– RBC in de vorm van een sikkel, helm, driehoek en/of

microsferocyten

• Hoffbrand– Geen definitie!

Definitie?

• Consensus?• Vaak discrepantie tss theorie en praktijk• intra- en interlabo variatie

Consensus report French Group of

Cellular Haematology (= ref. orgaan v/d French Society of Haematology)

• fragmenten in de vorm van een driehoek, sikkel, helm

• met een recht snijvlak (dus kleinere RBC dan initieel)

• minstens 2 hoeken

= gevolg van in vivo fragmentatie door fibrine draden

Referentiebeelden

Voorbeelden schistocyten

driehoek helm sikkel

kattekop chapeau de gendarme

Géén schistocyten - vbn

RBC met stekels RBC met gat

Bite cell staafvormig

Twijfelachtige schistocyten - vbn

Bruikbaarheid definitie?

Korte enquête

Definitie schistocyt(French Group of Cellular Hematology)

= RBC fragmenten in de vorm van een driehoek, sikkel, helm

met een recht snijvlak

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Welke afgebeelde RBC afwijkingen voldoen volgens u aan de definitie?

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Oplossing: consensus >75% Biologen (n=24)Groupe français d’hématologie cellulaire (Delphi methode)

Rondvraag definitie

• Aantal deelnemers n=18– Experts: 4 hematologen

– Assistenten: 4

– MLT’s: 10

• Resultaten– Totaal: gemidd 17 op 38; range 6-29

– Experts: gemidd 21 ; range 10-29

– Assistenten: gemidd 20.7 ; range 10-28

– MLT’s: gemidd 14.3 ; range 6-27

– 14 van de 38 FRC door >50% deelnemers herkend (37%)

– 12 van de 38 FRC door 1/3 niet herkend (31.6%)

• Veel gemaakte opmerking: volgens “buikgevoel” zou men meer FRC tellen dan obv definitie

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Oplossing: score +/- antwoorden• Door meer dan 50% herkend

• Door 1/3 niet herkend

Detectie fragmentocyt

Detectiemogelijkheden

• Microscopie

• Sysmex

– RET channel

• ADVIA 120

– Grootte ≥ BPL

– Brekingsindex ≠ BPL

Celtellers:

review nodig owv veel VP

Sysmex Roche XE-2100

• Kleine RBC zonder RNA in RET kanaal

MVR

MVR

Discriminator celteller: 100

Relatie tss FRC% (Celteller) en andere parameters

Advia 120 analyser - Bayer

• Partikels met grootte ≥ BPL– Kleiner dan 30fL, laserhoek 2-3°

• Andere brekingsindex dan BPL, nl. > 1,4– ≠ densiteit, laser 5-15°

• Treshold: 10 000/µL

• Bevat niet alleen FRC: VP 0,2-0,3%

Speciale software voor digitale beelden

• Daling inter-morfologist variatie

• Criteria: opp, circulariteit, verhouding l/b, diameter equivalent

• Correctie achteraf

Detectie - besluit

• Blijft gelinkt aan de morfologie!– Dus microscopie = noodzakelijk

• Klinische context = gewenst– Neonati, prematuren: FRC = fysiologisch

Telling FRC

Telling

• Stabiliteit FRC% op Tk

– toename van 14% /24h

Enquête FGH: vb. van rondgestuurd beeld

• Aantal FRC?

Antwoorden enquête FGH: #getelde schistocyten

Studie fragmentocyten

Studie opzet

• 165 stalen– Controlegroep: 20 NL– Pathologische groep

• 8 TTP-HUS• 29 kunstkleppen, waarbinnen 24 metalen

kleppen & 5 bioprothesen• 22 dialyse• 10 neonati• 29 IZ• 47 “ziek”

– (patiënten van oncologie, algemene heelkunde, nefrologie, patiënten met ferriprive anemie, myelofibrose, myelodysplasie, HbS trait, VKF, MVP, …)

Studie opzet

• Celteller Sysmex– CBC + RET channel– Flag?– FRC 10*6/µL, FRC%, RBC fragm

• Automatische microscoop Cellavision DM96– 9 velden omzetten in een volume

• Correlatie met bloedplaatjestelling

– Visuele telling schistocyten op 9 velden door 1 persoon (daling variatie): echte FRC (recht snijvlak) en TW FRC

• Cut-off? Wanneer rapporteren?– oa rondvraag

• Betekenis schistocyten– Significant verschil tss groepen?

correlatie plaatjestelling Celteller - Cellavision

y = 1.1005x + 4.9175

R2 = 0.871

0

100

200

300

400

500

600

700

0 100 200 300 400 500 600

aantal plaatjes 9 velden Cellavision

aa

nta

l p

laa

tje

s C

elt

elle

r (x

10

*3/µ

L)

Lineair (BPL celteller vs # in 9 velden

Cellavision)

BPL telling

• Lineair verband tss #BPL in 9 velden (Cellavision) met #BPL 10*3/µL (Celteller)

Histogram - som alle FRC

controlegroep

Box Whisker plot - som alle FRC

2

17

7

50.5

9

1314.5

rr Neo Z Kl TTP D IZ NLNeo 0 0 0 1 0 0 0Zi 0 0 1 1 1 0 1Kl 0 1 0 1 0 1 1TTP 1 1 1 0 1 0 1Di 0 1 0 1 0 1 1IZ 0 0 1 0 1 0 1NL 0 1 1 1 1 1 0

Significantieniveau 0,05/7= 0,007

Histogram - som alle FRC

Cut-off = 7 FRC

ROC curve - som alle FRC

Cut-off = 7 FRC

Cut-off

• Hoeveel schistocyten zijn aanwezig bij fragmentatie hemolyse?

Literatuur Studie OLV

NL (n=20) Mean 0,05%

PV 58%, cut off < 0,5%

Mean 2.4 10*3/µL (=0,053%); SD 2 (range 0-7, median 2)

TTP-HUS (n=6)

Mean 8,4% (range 1- 18%) Mean 117 10*3/µL (= 2,6%); SD 112 (range 29-265, median 50)

Dialyse (n=22)

Mean 0,05%, PV 80-100% Mean 9 10*3/µL (= 0,2%); SD 6 (range 1-24, median 7)

Kleppt (n=9) Mean 0,18% (range 0,2-0,3%), PV 80-100%,

Mean 12 10*3/µL (= 0,26%); SD 19 (range 1-105, median 9)

IZ (n=29) Mean 30 10*3/µL (= 0,66%); SD 32.5 (range 3-146, median 17)

“ziek” (n=47) Mean 27 10*3/µL (= 0,6%); SD 34 (range 2-189, median 13)

Neonati (n=10)

Mean 24 10*3/µL (= 0,53%); SD 40.8 (range 1-137, median 14.5)

Controle populatie

• Literatuur

– bovengrens = 0,2% = 9.10*3/µL

• OLV studie

– 7 FRC in 9 velden = 7.10*3/µL

“TTP” populatie

• TTP

– Literatuur: > 1% of ≥ 2 schistocyten/veld (100x) is suggestief voor TTP-HUS = 45 .10*3/µL

– OLV studie: mediaan = 50,5 .10*3/µL

Histogram - som echte FRC

controlegroep

Box Whisker plot - som echte FRC per groep rr Neo Z Kl TTP D IZ NL

Neo 0 0 0 1 0 0 0Zi 0 0 0 1 0 0 1Kle 0 0 0 1 0 1 1TTP 1 1 1 0 1 1 1Di 0 0 0 1 0 0 1IZ 0 0 1 1 0 0 1NL 0 1 1 1 1 1 0

Significantieniveau 0,05/7= 0,007

Histogram - som echte FRC

Cut-off = 4.5 FRC

ROC curve - som echte FRC

Cut-off = 4.5 FRC

Histogram - ratio FRC/BPL

TTP-HUS groep

controlegroep

Box Whisker plot - Ratio FRC/BPL

6.4 7.74.8

160

4.2

14

0.7

Correlatie microscopie –waarden celteller?

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 20 40 60 80 100 120

#F

RC

Ce

lte

lle

r (1

0*6

/µL

)

aantal FRC in 9 velden (DM96)

DM96 vs SYS #FRC 10*6/µL

DM96 vs SYS #FRC …

0

1

2

3

4

5

6

0 20 40 60 80 100 120

% F

RC

Celt

eller

aantal FRC in 9 velden (DM96)

DM96 vs SYS %FRC

DM96 vs SYS …

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 20 40 60 80 100 120

Fra

g C

elt

ell

er

aantal FRC in 9 velden (DM96)

DM96 vs SYS Frag

DM96 vs SYS …

Flagging?

Sensitiviteit flagging 35%

Specificiteit flagging 89%

PPV 85%

NPV 44%

False positive rate 11%

False negative rate 65%

LR - 1

LR + 3

FRC>7 FRC =of<7 totaal

flag 28 5 33,0

geen flag 52 41 93,0

totaal 80 46 126,0

FRC op rapport in Glims?

Sensitiviteit rapportering 59%

Specificiteit rapportering 95%

PPV 97%

NPV 44%

False positive rate 5%

False negative rate 41%

LR - 0

LR + 12

Power 1

FRC>7 FRC =of<7 totaal

FRC op rapport 35 1 36

geen FRC op rapport 24 19 43

totaal 59 20 79

Betekenis Fragmentocyt

Casus 1

• Dame, °1961

• VG: ethylproblematiek + levercirrose• Bij opname:

– algemene achteruitgang, BWZ daling, respiratoire achteruitgang– Trombopenie met diffuse bloedingen ovv epistaxis, melena, …– Ac. nierinsufficiëntie

• IZ: sepsis met E. coli, koorts, neurologische symptomen, verdere plaatjesdaling

• RDW-CV *14.2 % • Wbc *12730 /µl • Rbc *2.76 10e6/µl • HGB *9.1 g/dl • Hct *25.5 % • MCV *92.4 fl • Trombocyt *75 10e3/µl• Kr 5.06 mg/dl • MDRD *9 ml/min/1.73m2• Haptogl 2.91 g/l• Bilto 1.1 mg/dl • Bildi 0.5 mg/dl • LDH 603 U/l • CRP 333.02 mg/l

Vermoeden TTP-HUS dag 3

Vermoeden TTP-HUS dag 3

# FRC in 9 velden = 50

Casus 2• Dame, °1962

• Spoedopname wegens– Algemene achteruitgang – Laatste 2 weken meer vermoeid, dysnpee d’effort,

malaise, …– Icterisch, witte sclera– Geen medicatie, geen VG

• Wbc *5420 /µl • Trombocyt *70 10e3/µl• Rbc *1.45 10e6/µl • RDW-CV *21.6 % • SIS_DM_Anis {<++} • SIS_DM_Poik {<++} • HGB *5.8 g/dl • Hct *16.4 % • MCV *113.1 fl • Retic 29.6 /1000_RBC

• D-Dimeren >5000 µg/l• Bilto 2.5 mg/dl • Bildi 0.5 mg/dl • LDH 11290 U/l • Haptogl <0.20 g/l • CRP 8.94 mg/l • Foliumz 1.4 µg/l • VIT B12 197 ng/l

• BM: Celrijk beenmerg met zeer celrijke mergbrokjes.Goed vertegenwoordigde myeloïde reeks met reuzenvormen, hypersegmentatie, ...Zeer sterke, megaloblastische rode reeks (uitgesproken megaloblastisch, kernbudding, bijkernen, abnormale kernaflijning). Relatief veel mitosefiguren.Enkele hypersegmentaire megakaryocyten. Meerdere gelyseerde cellen.

Megaloblastische anemie

Megaloblastische anemie

# FRC in 9 velden = 55

Betekenis FRC op IZ?

Correlatie #dagen op IZ en #FRC?

Correlatie #d op IZ en #FRC in 9 velden

y = -1.5372x + 34.489

R2 = 0.0492

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 5 10 15 20 25

#d op IZ

#F

RC

in

9 v

eld

en

correlatie #d op IZ en #FRC

Lineair (correlatie #d op IZ en #FRC)

Betekenis

• FRC = belangrijk → urgente therapie

– Bij micro- en macro-angiopathie

– Ikv verspreide trombosen tijdens trombotische micro-angiopathie (TMA)

– Oorzaak van hemolytische anemie tijdens TMA

bevestigen diagnose TMA

– Scoringssysteem voor BMT-TMA gebaseerd op aantal FRC (prognostisch belang)

Rondvraag FRC

Inhoud rondvraag

• 38 rondvragen verstuurd -18 antwoorden ontvangen (=47%)

• Definitie

• Detectie

– Manuele microscopie – aantal velden

– Automatische microscopie – aantal velden

– Andere methode?

• Manier van rapporteren: kwalitatief, (semi-) kwantitatief

Gebruikte definitie & rapportering in Vlaamse labo’s

• Defnitie– Geen consensus

– Vaak verwijzing naar handboeken

– Vaak opm dat standaardisatie moeilijk is

• 7 op 18 labo’s (=38%)hanteren een duidelijke definitie die analoog is aan die van FGH

• Rapportering ook niet gestandaardiseerd– Vaak rapportering obv “buikgevoel”

Wijze van opsporen & rapporteren FRC in Vlaamse labo’s

AANTAL RONDVRAGEN 38

aantal antwoorden 18

duidelijke definitie analoog aan FGH 7

aantal manuele microscopie 18

aantal velden 9.474

min aantal velden 5

max aantal velden 25

aantal automatische microscoop 1

aantal andere methode (flagging) 11

aantal kwalitatieve rapportering 6+2

aantal (semi)kwantitatieve rapporteringKwantitatieve rapportering indien veel FRC of

op aanvraag (anders enkel kwalitatief)

10+2

Besluit FRC

Besluit CAT

• Definitie = RBC fragmenten in de vorm van een driehoek, sikkel, helm met een recht snijvlak (dus kleiner dan oorspronkelijke RBC) & minstens 2 hoeken– Training in herkennen FRC

• Telling op aanvraag (aparte analyse): 9 velden automatische microscopie (= # per ± 2000 RBC, # .10*3/µL)

• Cut-off: 7 FRC .10*3/µL

• Rapportering: # 10*3/µL

• Rekening houden met klinische context

Bedankt voor uw aandacht!

Suggesties, opmerkingen, vragen?